WO2020004640A1 - Ｃｒｅｂｂｐ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物 - Google Patents

Ｃｒｅｂｂｐ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物 Download PDF

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crebbp
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rubinstein
genetically modified
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貴弘 佐藤
児島　将康
佳苗 大石
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • Rubinstein-Taybi syndrome is a multiple malformation syndrome characterized by delayed psychomotor development, idiosyncratic facial features, and wide thumb and toes.
  • the responsible gene was found to be the CREB-binding II protein (CBP or CREBBP) gene located at 16p13.3, but most are sporadic cases (Non-Patent Documents 1 to 18).
  • CBP CREB-binding II protein
  • CREBBP is a histone acetyltransferase
  • Rubinstein-Taibi syndrome is considered a histone acetylation disorder. There is currently no cure and early complications are being treated to improve long-term prognosis.
  • Non-Patent Document 19 A mouse in which a wide region of the CREBBP gene has been artificially knocked out is known as a model animal of Rubinstein-Taybi syndrome (Non-Patent Document 19). In this model, the causative gene site is not identified. It is not clear whether this model reflects mutations that occur in nature.
  • ⁇ Object of the present disclosure relates to a genetically modified animal in which a mutation has been introduced into the CREBBP gene.
  • a further object of the present disclosure relates to disease determination using the presence or absence of the mutation as an indicator.
  • mice with a small physique spontaneously generated during breeding show symptoms of Rubinstein-Taybin syndrome and advanced sleep phase syndrome, and have a specific single base deletion in the CREBBP gene. Furthermore, introduction of this single nucleotide deletion into the mouse genome showed similar symptoms.
  • the present application is a non-human genetically modified animal in which a mutation has been introduced into at least one CREBBP locus, wherein the mutation causes the CREBBP gene to have 90% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a genetically modified animal encoding a mutant CREBBP consisting of an amino acid sequence having identity is provided.
  • the present application provides a method for producing the above-mentioned genetically modified animal, comprising introducing a mutation into at least one CREBBP locus of a non-human animal.
  • the present application provides the use of the above-described genetically modified animal as a model of Rubinstein-Taybi syndrome or a model of advanced sleep phase syndrome.
  • the present application provides a peptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or a polynucleotide encoding the same.
  • the present application is a method for determining Rubinstein-Taibi syndrome, (1) determining the nucleotide sequence of the CREBBP gene in a nucleic acid sample derived from a subject; (2) determining the amino acid sequence of the peptide encoded by the nucleotide sequence; (3) When the amino acid sequence is an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, the subject is suffering from Rubinstein-Taybi syndrome or is suffering in the future To determine A method comprising:
  • the present application is a method for determining Rubinstein-Taibi syndrome, (1) determining, in a nucleic acid sample derived from a subject, whether the CREBBP gene lacks a nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3, (2) determining that the subject is suffering from Rubinstein-Taybi Syndrome, or will be affected in the future, if the CREBBP gene lacks the nucleotide;
  • a method comprising:
  • the genetically modified animal having the mutation of the present disclosure is useful as a model of Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome. Further, Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome can be determined using the presence or absence of the mutation as an index.
  • the appearance of a typical dwarf mouse is shown.
  • the length, weight, and BMI of normal mice and dwarf mice are shown.
  • the nose back length and binocular distance of normal mice and dwarf mice are shown.
  • 1 shows blood pressure and body temperature of normal mice and dwarf mice.
  • 2 shows changes in body weight of normal mice and dwarf mice.
  • the normal food consumption and the food consumption per body weight of normal mice and dwarf mice are shown.
  • 1 shows the body weight and food consumption of normal mice and dwarf mice after fasting.
  • 2 shows the concentrations of growth hormone and insulin-like growth factor-I in blood of normal mice and dwarf mice.
  • 3 shows changes in blood glucose levels in normal mice and dwarf mice following a glucose tolerance test.
  • 3 shows changes in blood glucose level and insulin level in a normal mouse and a dwarf mouse following a glucose tolerance test.
  • 3 is an actogram showing behavioral rhythms of normal mice and dwarf mice under light and dark conditions and under constant dark conditions. The results of a footprint test of normal mice and dwarf mice are shown.
  • 2 shows grip strength of normal mice and dwarf mice. It is a schematic diagram of the measuring method of anxiety tendency by an elevated plus maze. The mouse was placed in the center of the elevated plus maze, and the action trajectory for 10 minutes was measured. The result of measurement of the anxiety tendency of the normal mouse and the dwarf mouse by the elevated plus maze is shown. 2 shows the nucleotide sequence of the wild-type mouse CREBBP gene. The guanine nucleotide at position 1123 deleted in the mutant mouse CREBBP gene is indicated by a box.
  • the nucleotide sequence of the wild-type mouse CREBBP gene (continuation) is shown.
  • 2 shows the amino acid sequence of wild-type mouse CREBBP.
  • 2 shows the nucleotide sequence of the wild-type human CREBBP gene.
  • the guanine nucleotide at position 1126 corresponding to the guanine nucleotide at position 1123 deleted in the mutant mouse CREBBP gene is indicated by a box.
  • Fig. 4 shows the nucleotide sequence of the wild-type human CREBBP gene (continuation).
  • 2 shows the amino acid sequence of wild-type human CREBBP.
  • 1 shows the amino acid sequences of mutant mouse CREBBP and mutant human CREBBP.
  • the position of the stop codon is indicated by an asterisk.
  • FIG. 2 shows a part of an alignment of the nucleotide sequence and amino acid sequence of wild-type mouse CREBBP and mutant mouse CREBBP. Amino acid sequences frame-shifted by single base deletions are shown in boxes. 1 shows a part of an alignment of the nucleotide sequence and amino acid sequence of wild-type human CREBBP and mutant human CREBBP. Amino acid sequences frame-shifted by single base deletions are shown in boxes.
  • ⁇ ⁇ As used herein, when values are accompanied by the term “about,” it is intended to include the range of ⁇ 10% of that value. For example, “about 20” includes “18 to 22”. Numeric ranges include all numbers between the endpoints and the endpoints. "About" a range applies to both endpoints of the range. Therefore, for example, “about 20 to 30” includes “18 to 33”.
  • CREBBP is present in almost all cells, and functions as a transcription coupling factor that activates transcription through interaction between proteins without directly binding to DNA.
  • CREBBP is activated by binding to phosphorylated CREB through the KIX domain.
  • Activated CREBBP acts on RNA polymerase via TFIIB, a basic factor of the transcription complex, to promote transcription.
  • CREBBP functions not only as phosphorylated CREB but also as a transcription coupling factor common to many transcription factors such as nuclear hormone receptor, Myb, Fos, Jun, and STST ⁇ 1 ⁇ .
  • CREBBP has HAT activity, is responsible for histone acetylation and the control of the resulting chromatin structure, and activates transcription.
  • CREBBP and “CREBBP gene” may be of any species, typically a mammal (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey). , Humans, etc.), particularly rodents such as mice, and primates such as humans.
  • a representative nucleotide sequence of the mouse wild-type CREBBP gene is shown in SEQ ID NO: 1. It encodes a wild-type CREBPP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consisting of 2441 amino acid sequences.
  • the mouse CREBBP locus is 16qA1.
  • a representative nucleotide sequence of the human wild-type CREBBP gene is shown in SEQ ID NO: 3. It encodes a wild-type CREBP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 consisting of 2442 amino acid sequences.
  • the human CREBBP locus is 16p13.3.
  • the CREBBP gene also includes a gene having a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • hybridize under stringent conditions the hybridization used herein is, for example, according to a general method described in Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), and the like. It can be carried out.
  • the “stringent conditions” refers to, for example, 45 ° C.
  • the CREBBP gene includes at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3. Genes having nucleotide sequences with identity are included.
  • the mutant CREBBP comprises at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 consisting of 386 amino acids or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 consisting of 387 amino acids. %, 96%, 97%, 98%, or 99% or more.
  • the mutant CREBBP of SEQ ID NO: 5 is a protein consisting of amino acids 1 to 374 of the mouse wild-type CREBBP of SEQ ID NO: 2, and further 12 amino acids.
  • the mutant CREBBP of SEQ ID NO: 6 is a protein consisting of amino acids 1 to 375 of the human wild-type CREBBP of SEQ ID NO: 4, and further 12 amino acids.
  • the mutant CREBBP consists of an amino acid sequence having at least 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6. In one embodiment, the mutant CREBBP comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6. In one embodiment, the mutant CREBBP consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6. Mutant CREBBP having these amino acid sequences has substantially lost the transcription activation function of CREBBP.
  • Mutant CREBBP is encoded by the mutant CREBBP gene.
  • the mutant CREBBP gene may be a CREBBP gene having any mutation as long as it is a gene encoding the mutant CREBBP.
  • the mutant CREBBP gene has 90% or more identity with the nucleotide sequence of the mouse wild-type CREBBP gene shown in SEQ ID NO: 1, and lacks the nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1.
  • the mutant CREBBP gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 wherein the nucleotide at position 1123 is deleted (SEQ ID NO: 7).
  • the mutant CREBBP gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. In one embodiment, the mutant CREBBP gene has at least 90% identity to the nucleotide sequence of the human wild-type CREBBP gene set forth in SEQ ID NO: 3, and lacks a nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3. Nucleotide sequence. In one embodiment, the mutant CREBBP gene comprises a sequence in which the nucleotide at position 1126 is deleted in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 8). In one embodiment, the mutant CREBBP gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • Nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 refers to a sequence obtained by aligning a nucleotide sequence of a certain CREBPBP gene with a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in an optimal state (a state in which nucleotide correspondence is maximized). It means a nucleotide in the mutant CREBPBP gene that matches the guanine nucleotide at position 1123 of No. 1.
  • Nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3 is similarly defined.
  • amino acid or nucleotide sequence identity refers to the degree of sequence similarity between proteins or oligonucleotides and is optimal over the region of the sequence to be compared (maximum amino acid or nucleotide identity). Is determined by comparing the two sequences aligned to (state). The sequence identity number (%) determines the number of identical amino acids or nucleotides present in both sequences to determine the number of matching sites, and then compares the number of matching sites to amino acids or nucleotides in the sequence region to be compared. Is calculated by multiplying the obtained numerical value by 100.
  • Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence identity include various algorithms routinely available to those of skill in the art (eg, BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.). Sequence identity can be determined using sequence analysis software such as, for example, BLAST, FASTA.
  • the genetically modified animal may be of any species except human, and is typically a mammal (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, etc.). possible.
  • the genetically modified animal is a rodent, especially a mouse.
  • a genetically modified animal can be produced by introducing a mutation into at least one CREBBP locus of a non-human animal using a known genetic modification technique for modifying a target gene.
  • Known gene modification techniques to be used include a CRISPR system, a method using Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN), a method using zinc finger nuclease, and a homologous recombination method.
  • the CRISPR system can be used because the gene can be selectively and site-specifically modified. Details of the CRISPR / Cas system are described, for example, in Wang, ⁇ H. et al., ⁇ Cell, ⁇ 153, ⁇ 910-918 ⁇ (2013) ⁇ and U.S. Pat. No. 8,697,359, which are hereby incorporated by reference. Partial.
  • Cas9 protein and guide RNA are introduced into a fertilized egg derived from a non-human animal.
  • known methods for example, a calcium phosphate method, an electroporation method, a lipofection method, an agglutination method, a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, and the like can be used.
  • Wild-type Cas9 protein has two functional nuclease domains, RuvC and HNH, each of which cuts a different strand of the DNA duplex.
  • “Cas9 protein” refers to a protein having the ability to bind to DNA in a gRNA-dependent manner, and one having both RuvC and HNH nuclease activity, and having one or both of RuvC and HNH nuclease activity. Includes those that do not.
  • the Cas9 protein can be derived from bacteria having the CRISPR system. Examples of bacteria known to have the CRISPR system include Staphylococcus pyogenis, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, and Treponema denticola.
  • a nucleic acid encoding the Cas9 protein or a vector containing the nucleic acid may be used.
  • the Cas9 protein, the nucleic acid encoding the Cas9 protein, and the vector containing the nucleic acid are not particularly limited, and those known in the art can be used.
  • guide RNA or “gRNA” means an artificial single-stranded RNA in which crRNA and tracrRNA are fused.
  • a linker sequence may be present between the crRNA and the trcrRNA.
  • the Cas9 protein can bind to genomic DNA in a target-specific manner in the presence of gRNA.
  • crRNA and tracrRNA may be used as a combination of separated RNA molecules.
  • CrRNA is derived from bacterial endogenous RNA and is responsible for the sequence specificity of gRNA.
  • crRNA includes a target sequence within genomic DNA.
  • As the target sequence a nucleotide sequence having a PAM sequence immediately after it in genomic DNA is selected.
  • the target sequence can be on any strand of the genomic DNA.
  • the target sequence is a nucleotide sequence that has 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the target sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 with one to three nucleotides added, deleted and / or substituted.
  • the target sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • Cas9 protein can bind to any DNA sequence that has a PAM sequence immediately after the target sequence.
  • the PAM sequence is located immediately after the target sequence in genomic DNA, but not immediately after the target sequence in gRNA.
  • the PAM sequence varies depending on the bacterial species from which the Cas9 protein is derived.
  • the most widely used Cas9 protein is derived from Staphylococcus pyogenis, and the corresponding PAM sequence is the sequence of NGG located immediately after the 3 'end of the target sequence.
  • N indicates any of A, T, G and C bases.
  • TracrRNA complementarily binds to part of the crRNA and forms a hairpin structure. This structure is recognized by Cas9, and a complex of crRNA, tracrRNA and Cas9 is formed. Thus, tracrRNA is responsible for the ability of gRNA to bind to the Cas9 protein.
  • TracrRNA is derived from bacterial endogenous RNA and has a different sequence depending on the bacterial species. In the present disclosure, the tracrRNA may be from a bacterium known to have the CRISPR system described above, and preferably, the tracrRNA and Cas9 protein used for genome editing are derived from the same bacterial species.
  • a gRNA can be obtained by cloning a DNA encoding a desired gRNA sequence into an in vitro transcription vector and transcribed in vitro. Suitable vectors for in vitro transcription are known to those skilled in the art. Also, in vitro transcription vectors containing sequences other than the gRNA target sequence are known in the art. GRNA can be obtained by synthesizing an oligonucleotide of the target sequence, inserting it into such a vector, and performing in vitro transcription. Methods for in vitro transcription are known to those skilled in the art.
  • the gRNA / Cas9 protein complex is recruited to the target sequence by complementary binding between the gRNA sequence and the target sequence in genomic DNA. Binding of the gRNA / Cas9 protein complex to the target sequence localizes the Cas9 protein to the target sequence in the genome, which cleaves both strands of DNA and causes double-strand breaks (DSB).
  • DSB can be repaired by the NHEJ (Non-Homologous End Joining) DNA repair pathway or the HDR (Homologous Recombination Repair) pathway.
  • the NHEJ repair pathway often results in base insertions / deletions at the site of the DSB, which results in a frameshift and / or stop codon and can disrupt the open reading frame of the target gene.
  • the HDR pathway requires the presence of a repair template to repair the DSB. In HDR, the sequence of the repair template is faithfully copied to the cleaved target sequence. Using the repair template and HDR, the desired mutation can be introduced into the target gene
  • a DNA repair template containing the desired sequence In order for HDR to modify a nucleotide in a genomic DNA sequence, a DNA repair template containing the desired sequence must be present during HDR.
  • ssODN single-stranded oligodeoxynucleotide
  • ssODN has high homology to sequences upstream and downstream of DSB. The length and position of each homology region depends on the size of the modification to be introduced.
  • HDR can modify certain nucleotides at the site of DSB by Cas9 protein.
  • the ssODN is designed so as not to include a target sequence having a PAM sequence immediately afterward so that the repaired gene is not cleaved by the Cas9 protein. For example, by changing the sequence corresponding to the PAM sequence to another sequence in ssODN, ssODN can be prevented from being cleaved by Cas9 protein. Details of the design method of the ssODN are described, for example, in Yang, ⁇ H. ⁇ et. al., ⁇ Cell, ⁇ 154 (6), ⁇ 1370-9 ⁇ (2013) ⁇ , which is incorporated herein by reference. ssODN is usually introduced into cells along with gRNA and Cas9 protein.
  • a genetically modified animal By transplanting a fertilized egg into which the Cas9 protein and gRNA have been introduced into the uterus or fallopian tube of a corresponding non-human animal and developing it, a genetically modified animal can be obtained.
  • Obtaining the genetically modified animal can be confirmed by various methods known in the art. For example, it can be confirmed by observing the phenotype or by decoding the sequence of genomic DNA containing the target sequence. In the case of HDR, evaluation can be performed by RFLP (restriction fragment length polymorphism) by incorporating a restriction enzyme cleavage site into ssODN. These methods are well-known in the art.
  • Genetically modified animals include heterozygous (ie, one allele on the genome has been modified) and homozygous (ie, both alleles on the genome have been modified). Heterotype genetically modified animals are preferred. A homozygous genetically modified animal may be produced by crossing heterozygous genetically modified animals.
  • the genetically modified animals of the present disclosure exhibit at least one symptom of Rubinstein-Taybi syndrome.
  • Symptoms of Rubinstein-Taybi syndrome include, for example, mental retardation, small physique, low weight, short stature, interocular dissection, short dorsum of the nose, stagnated testicles, small penis, hypotension or hypothermia. Therefore, the genetically modified animal of the present disclosure can be used as a model animal of Rubinstein-Taibi syndrome.
  • the circadian rhythm tends to advance.
  • the genetically modified animal of the present disclosure can also be used as a model animal of Rubinstein-Taybi syndrome with sleep phase advance syndrome or a model animal of sleep phase advance syndrome.
  • the model animal is useful for elucidating the cause of the disease and for developing a preventive method and a therapeutic method.
  • the genetically modified animals of the present disclosure can be used as model animals for Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome to screen for medicaments for the treatment of the disease.
  • a method of screening a medicament for treating Rubinstein-Taybi Syndrome comprising: (A) administering at least one candidate substance to the genetically modified animal disclosed herein; and (B) treatment of the Rubinstein-Tevi syndrome in a genetically modified animal to which the candidate substance has been administered when the symptoms of Rubinstein-Tevie syndrome have been improved as compared to the genetically modified animal to which the candidate substance has not been administered; Selecting as a medicament for Are provided.
  • a method of screening a medicament for treating advanced sleep phase syndrome (A) administering at least one candidate substance to the genetically modified animal disclosed herein; and (B) treatment of the advanced sleep phase syndrome with the candidate substance when the symptoms of the advanced sleep phase syndrome are improved in the genetically modified animal to which the candidate substance has been administered, as compared to the genetically modified animal to which the candidate substance has not been administered; Selecting as a medicament for Are provided.
  • ⁇ treatment '' refers to preventing the onset of the disease, reducing the likelihood of developing the disease, reducing or eliminating the cause of the disease, delaying or stopping the progression of the disease. And / or alleviating, alleviating, ameliorating or eliminating the symptoms of the disease.
  • Candidadidate substances include all substances such as proteins, amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates and low molecular weight compounds.
  • a candidate substance that has been purified and isolated can be used, but may be an unpurified or unisolated crude product.
  • the candidate substance may be provided in the form of a compound library, a nucleic acid library, a random peptide library, or the like, or may be provided as a natural product.
  • the introduction of the candidate substance into the cells can be performed by a known method according to the type of the candidate substance.
  • One candidate substance may be used, or two or more candidate substances may be administered in combination.
  • the dose and frequency of administration of the candidate substance are appropriately adjusted in consideration of the age, sex, body weight, symptoms, administration method and the like of the genetically modified animal.
  • the administration route of the candidate substance includes oral administration and parenteral administration, and is not particularly limited.
  • parenteral administration may be systemic administration or local administration, and more specifically, for example, intratracheal administration, intrathecal administration, intrathecal administration, intracranial administration, intravenous administration, intraarterial administration, portal administration Examples include intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, transdermal administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, and oral administration.
  • the genetically modified animal may be a fetus or a post-natal animal, and if so, the candidate substance may be administered to the fetus or mother.
  • an improvement in the symptoms of Rubinstein-Taybi Syndrome may include small physique, low weight, short stature, wide interocular distance, short nose spine, hypotension or hypothermia.
  • a numerical value relating to symptoms is, for example, about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and still more preferably about 50% or more.
  • Candidate substances that improve above can be selected as medicines.
  • the behavior cycle under a constant dark condition is, for example, about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and Candidate substances that preferably improve by about 50% or more may be selected as medicaments.
  • a polynucleotide encoding a peptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, which is used to determine Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome. can be used as a marker.
  • the CREBBP gene may have Deficiency of the nucleotide corresponding to position 1123 or the nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3 can cause Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome.
  • Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome can be determined, and the peptide or polynucleotide containing the mutation can be used in Rubinstein-Tybi syndrome or sleep phase. It is useful as a marker for determining advance syndrome.
  • the polynucleotide includes DNA, cDNA, RNA, mRNA, DNA analog, RNA analog and the like.
  • determining a disease refers to determining whether a subject has a disease, or whether a subject is likely to have a disease.
  • the subject may be of any species, typically a mammal (eg, human, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, etc.).
  • the subject is a rodent, especially a mouse.
  • the subject is a primate, especially a human.
  • Subjects include the fetus.
  • the subject sample can be, for example, a bodily fluid such as blood, cerebrospinal fluid, saliva, or a tissue such as oral mucosa, hair. If the subject is a fetus, a sample from the subject may be collected by amniocentesis or villus sampling.
  • a peptide When a peptide is used as a determination marker, the presence or absence of the above mutation in a sample collected from a subject is determined using a reagent such as an antibody that recognizes the peptide. Methods for detecting a mutation are known to those skilled in the art and are not particularly limited. It is preferable to use a reagent that specifically recognizes the mutant peptide. When a reagent that recognizes both the wild-type peptide and the mutant peptide is used, the mutation may be detected based on the difference in the molecular weight of the peptide.
  • nucleic acid may be isolated from a target sample.
  • Methods for isolating nucleic acids are known to those skilled in the art and are not particularly limited.
  • a commercially available kit for collecting DNA or RNA can be used.
  • the nucleic acid is DNA or RNA, and includes a fragment obtained by amplifying the target region, for example, the full length or a part of the CREBBP gene by PCR (Polymerase Chain Reaction) using DNA or RNA as a template.
  • the presence or absence of the above mutation in the nucleic acid is determined.
  • Methods for detecting a mutation are known to those skilled in the art and are not particularly limited.
  • the nucleotide sequence of the CREBBP gene is determined, the amino acid sequence of the peptide encoded by the nucleotide sequence is determined, and it is determined whether the nucleotide sequence has 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6. I do.
  • the CREBBP gene may be detected whether or not the CREBBP gene lacks a nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3.
  • the methods include PCR, allele-specific PCR, PCR-SSP, PCR-RFLP, PCR-SSCP, direct sequencing, ASO hybridization, DGGE, RNaseA cleavage, chemical cleavage, and DOL. , Invader method, TaqMan (registered trademark) -PCR method, MALDI-TOF / MS method, TDI method, molecular beacon method, dynamic allele-specific hybridization method, padlock probe method and the like.
  • the sample collected from the subject has the above mutation, it is determined that the subject has Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome, or will be affected in the future.
  • the above-mentioned mutation is present in a sample collected from the subject, it is determined that the subject is likely to have Rubinstein-Taybi syndrome or advanced sleep phase syndrome, or is likely to be affected in the future.
  • kits for determining Rubinstein-Taybi Syndrome or Advanced Sleep Phase Syndrome.
  • the kit includes a mutation in the CREBBP gene that results in a peptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, for example, a nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Means for determining whether there is a nucleotide deletion corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 1.
  • the means for determining the presence or absence of the above-mentioned mutation is not particularly limited, and includes, for example, a means used for detecting a mutation in the above-described determination method, such as a primer capable of amplifying a region containing the mutation or the mutation. Can be a probe that can bind to the region to be treated.
  • the means for determining the presence or absence of the mutation is a primer for allele-specific PCR.
  • the kit may contain other components as necessary. Other components include, but are not limited to, tools for collecting samples (eg, syringes, etc.), positive control samples, negative control samples, and the like. It may include a document or the like describing a procedure for performing the above method.
  • a genetically modified animal encoding a mutant CREBBP comprising: [2] The genetically modified animal according to item 1, wherein the mutant CREBBP comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. [3] The genetically modified animal according to item 1 or 2, wherein the mutant CREBBP has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. [4] The genetically modified animal according to any one of Items 1 to 3, wherein the mutant CREBBP has substantially lost the transcription activation function.
  • a mutation is introduced by genome editing.
  • the target sequence for genome editing is a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the target sequence for genome editing is a nucleotide sequence in which one to three nucleotides have been added, deleted and / or substituted in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6; [24] The peptide according to item 23, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6. [25] The peptide according to item 23 or 24, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6. [26] A polynucleotide encoding the peptide of any one of items 23 to 25.
  • [30] Use of the peptide according to any of items 23 to 25 as a marker for determining Rubinstein-Taybi syndrome.
  • [31] Use of the polynucleotide according to any one of paragraphs 26 to 29 as a marker for determining Rubinstein-Taibi syndrome.
  • [32] A method for determining Rubinstein-Taibi syndrome, (1) testing a sample derived from the subject for the presence or absence of the determination marker according to paragraph 30 or 31; and (2) determining that the subject is suffering from Rubinstein-Taybi syndrome or is suffering in the future when the sample is determined to include the determination marker; A method that includes [33] Use of the peptide according to any one of items 23 to 25 as a marker for determining advanced sleep phase syndrome.
  • a method for determining Rubinstein-Taibi syndrome (1) determining the nucleotide sequence of the CREBBP gene in a nucleic acid sample derived from a subject; (2) determining the amino acid sequence of the peptide encoded by the nucleotide sequence; (3) When the amino acid sequence is an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, the subject is suffering from Rubinstein-Taybi syndrome or is suffering in the future
  • a method that includes [37] A method for determining Rubinstein-Taibi syndrome (1) determining, in a nucleic acid sample derived from a subject, whether the CREBBP gene lacks a nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3, (2) determining that the subject is suffering from Rubinstein-Taybi Syndrome, or will be affected in the future, if the CREBBP gene lacks the nu
  • a method for determining advanced sleep phase syndrome (1) determining the nucleotide sequence of the CREBBP gene in a nucleic acid sample derived from a subject; (2) determining the amino acid sequence of the peptide encoded by the nucleotide sequence; (3) When the amino acid sequence is an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, the subject is suffering from advanced sleep phase syndrome or will be affected in the future
  • a method that includes [39] A method for determining advanced sleep phase syndrome, (1) determining, in a nucleic acid sample derived from a subject, whether the CREBBP gene lacks a nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide corresponding to position 1126 of SEQ ID NO: 3, (2) determining that the subject is suffering from advanced sleep phase syndrome or is suffering in the future if the CREBBP gene is deficient in the nucleotide; A method that includes [40] The method of any of paragraphs 32
  • a kit for determining Rubinstein-Taybi syndrome wherein the CREBBP gene has a mutation that results in a peptide having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • a kit comprising means for determining [42] A kit for determining advanced sleep phase syndrome, wherein the CREBBP gene has a mutation that results in a peptide having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • Test 1 Analysis of naturally occurring dwarf mice (1) Emergence and maintenance of dwarf mice Sato T, Kurokawa M, Nakashima Y, Ida T, Takahashi T, Fukue Y, Ikawa M, Okabe M, Kangawa K, Kojima M. Regul Pept. 2008 Jan 10; 145 (1-3): 7-11 while maintaining and breeding the ghrelin gene-deficient (ghrl +/- ) mouse strain, small physique, specific face, Mice having appearance characteristics such as walking in a low posture (hereinafter referred to as dwarf mice) spontaneously appeared. A dwarf mouse (male) and a C57BL / 6J mouse (female) were bred to obtain a first generation.
  • FIG. 1 shows an external appearance of a representative dwarf mouse. Dwarf mice were characterized by being smaller in physique, wider between eyes, and shorter in nose than normal mice of the same sex.
  • mice Male mice were used unless otherwise specified. The body length and weight of normal mice and dwarf mice were measured, and BMI was measured. FIG. 2 shows the results. The dwarf mice were smaller in body length and weight than normal mice, but no significant difference was observed in BMI from normal mice.
  • the length of the nose and the distance between the eyes of normal mice and dwarf mice were measured. The results are shown in FIG.
  • the dwarf mouse had a significantly shorter nose than the normal mouse, and the interocular distance was significantly longer.
  • FIG. 4 shows the results. Blood pressure and body temperature of dwarf mice tended to be low. Body temperature of dwarf mice tended to correlate with body weight.
  • FIG. 5 shows the results.
  • the dwarf mouse showed a growth curve similar to that of a normal mouse.
  • FIG. 6 shows the results. Dwarf mice consumed less food, but did not differ in weight ratio from normal mice.
  • FIG. 13 shows the results. The instantaneous grip and sustained grip of the limbs of dwarf mice were weaker than normal mice.
  • Test 2 Quantitative trait loci (QTL) mapping based on determinant linkage analysis of candidate genes responsible for dwarf mice was performed to confirm that the causative gene of dwarf mice exists upstream of 38,931,238 bp on chromosome 16. Revealed. Gene mapping was performed using a probe capable of specifying a more detailed site, and it was revealed that the causative gene of the dwarf mouse was located upstream of chromosome 16 at 21,678,473 bp.
  • QTL Quantitative trait loci
  • the nucleotide sequence of the wild-type mouse CREBBP gene is shown in SEQ ID NO: 2 and FIGS.
  • the mutant CREBBP gene found in the dwarf mouse lacks the guanine nucleotide corresponding to position 1123 of SEQ ID NO: 1 (indicated by a box in FIG. 16) and has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. did.
  • the amino acid sequences of wild-type CREBBP and mutant CREBBP are shown in FIG. 18 and FIG. Wild-type CREBBP consisted of 2441 amino acids, whereas mutant CREBBP consisted of 386 amino acids due to frameshifting. That is, in the dwarf mouse, the C-terminal deletion of CREBBP had occurred.
  • a part of the alignment of the nucleotide sequence and the amino acid sequence is shown in FIG.
  • the CREBBP gene is one of the causative genes of Rubinstein-Taybi syndrome and is known to be inherited autosomal dominantly. Short stature, wide nasal ridges, and nasal septum extending below the nasal wing are known complications of Rubinstein-Taybi syndrome, which are consistent with the characteristics of dwarf mice. Thus, these results indicate that dwarf mice can be used as a model for Rubinstein-Taibi syndrome.
  • Test 3 Production of mouse having mutant CREBBP gene
  • genome editing was performed.
  • Exon 4 ENSMUSE00000295066 241 nt TCCCAGTTGCAAACATCAGTGGGAATTGTACCCACACAAGCAATTGCAACAGGCCCCACAGCAGACCCTGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCCCAAAAGTCAGAG ACGAGAGCAAGCAAATGGAG AGGTTCGAGCCTTCTCTCCCACACTGTCGATCCATCCATACTAGTCGATCCATGAAATCAGTCGATCCATACAACATGGATGCATGATCAGTCGATCCATACAATCAGGACGATGATCAGTCAGTCAGTCAGTCAG
  • sgRNA targeting the nucleotide sequence of ACGAGAGCAAGCAAATGGAG (SEQ ID NO: 9) (underlined sequence of SEQ ID NO: 10) was used.
  • two knock-in oligonucleotides having the following nucleotide sequences were used.
  • Mutant mice artificially produced by this method had a small physique, head malformations (binocular dislocation and shortened nose length), and abnormal walking, similarly to naturally occurring mutant mice. These results indicate that artificially generated mutant mice can be used as a model for Rubinstein-Taybi syndrome, as well as naturally occurring mutant mice.
  • Test 4 Mutation detection by allele-specific PCR Using the following primers and reaction solution, genomic DNA of a mouse was amplified by PCR under the following reaction conditions. The following primers were designed to yield a 207 bp amplification product when the mouse genome had the point mutation identified in Test 2. Forward primer: 5'-GACGAGAGCAAGCAAATCGG -3 '(SEQ ID NO: 13) Reverse primer: 5'-TAGGCAGTGCAGGATTCCAA-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • nucleic acid was amplified using genomic DNA of a wild-type mouse. Nucleic acids were amplified using genomic DNA from naturally occurring mutant mice. Therefore, the mutation can be detected by this system.
  • the mechanism of the onset of the Rubinstein-Taybi syndrome is not yet known, and no therapeutic technique has been established, so that the genetically modified animals of the present disclosure are expected to be used as research tools.
  • the present disclosure may also contribute to genetic diagnosis of Rubinstein-Taybi syndrome.

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Abstract

少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、非ヒト遺伝子改変動物を提供する。また、非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、上記遺伝子改変動物の製造方法を提供する。さらに、上記遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルまたは睡眠相前進症候群のモデルとしての使用を提供する。

Description

ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１８－１２４６６６号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物、その製造方法、疾患モデルとしてのその使用、または、当該変異の有無を指標とする疾患の判定に関する。
　ルビンシュタイン・テイビ症候群は、精神運動発達遅滞、特異顔貌、幅広い拇指趾等を特徴とする多発奇形症候群である。責任遺伝子は１６ｐ１３．３に座位するCREB-binding protein（ＣＢＰまたはＣＲＥＢＢＰ）遺伝子であることが判明したが、ほとんどが散発例である（非特許文献１～１８）。ＣＲＥＢＢＰはヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、ルビンシュタイン・テイビ症候群はヒストンアセチル化異常症と考えられる。現在のところ根本的治療法はなく、長期的予後を改善するために、早期の合併症の治療が行われている。
　ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデル動物として、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の広い領域を人為的にノックアウトしたマウスが知られている（非特許文献１９）。このモデルでは、原因となる遺伝子部位は特定されない。また、このモデルが自然界で起こる変異を反映しているか否かは明らかでない。
Alari V, et al., "iPSC-derived neurons of CREBBP- and EP300-mutated Rubinstein-Taybi syndrome patients show morphological alterations and hypoexcitability" Stem Cell Research, 2018 May 30;30:130-140 Merk DJ, et al., "Opposing Effects of CREBBP Mutations Govern the Phenotype of Rubinstein-Taybi Syndrome and Adult SHH Medulloblastoma" Developmental Cell, 2018 Mar 26;44(6):709-724.e6 Menke LA, et al., "Further delineation of an entity caused by CREBBP and EP300 mutations but not resembling Rubinstein-Taybi syndrome" American Journal of Medical Genetics Part A, 2018 Apr;176(4):862-876 Eser M, et al., "A case with Rubinstein-Taybi syndrome: A novel frameshift mutation in the CREBBP gene" The Turkish Journal of Pediatrics, 2017;59(5):601-603 Rokunohe D, et al., "Rubinstein-Taybi syndrome with multiple pilomatricomas: The first case diagnosed by CREBBP mutation analysis" Journal of Dermatological Science, 2016 Sep;83(3):240-2 Menke LA, et al., "CREBBP mutations in individuals without Rubinstein-Taybi syndrome phenotype" American Journal of Medical Genetics Part A, 2016 Oct;170(10):2681-93 de Vries TI, et al., "Mosaic CREBBP mutation causes overlapping clinical features of Rubinstein-Taybi and Filippi syndromes" European Journal of Human Genetics, 2016 Aug;24(9):1363-6 Wincent J, et al., "CREBBP and EP300 mutational spectrum and clinical presentations in a cohort of Swedish patients with Rubinstein-Taybi syndrome" Molecular Genetics & Genomic Medicine, 2015 Sep 22;4(1):39-45 Kamenarova K, et al., "Identification of a novel de novo mutation of CREBBP in a patient with Rubinstein-Taybi syndrome by targeted next-generation sequencing: a case report" Human Pathology, 2016 Jan;47(1):144-9 Huh R, et al., "Letter to the Editor: A Novel Mutation in the CREBBP Gene of a Korean Girl with Rubinstein-Taybi syndrome" Annals of Clinical & Laboratory Science, 2015 Summer;45(4):458-61 Rusconi D, et al., "Characterization of 14 novel deletions underlying Rubinstein-Taybi syndrome: an update of the CREBBP deletion repertoire" Human Genetics, 2015 Jun;134(6):613-26 Yoo HJ, et al., "Whole exome sequencing for a patient with Rubinstein-Taybi syndrome reveals de novo variants besides an overt CREBBP mutation" International Journal of Molecular Sciences, 2015 Mar 11;16(3):5697-713 Spena S, et al., "Insights into genotype-phenotype correlations from CREBBP point mutation screening in a cohort of 46 Rubinstein-Taybi syndrome patients" Clinical Genetics, 2015 Nov;88(5):431-40 Kim SR, et al., "Cryptic microdeletion of the CREBBP gene from t(1;16) (p36.2;p13.3) as a novel genetic defect causing Rubinstein-Taybi syndrome" Annals of Clinical & Laboratory Science, 2013 Fall;43(4):450-6 Marzuillo P, et al., "Novel cAMP binding protein-BP (CREBBP) mutation in a girl with Rubinstein-Taybi syndrome, GH deficiency, Arnold Chiari malformation and pituitary hypoplasia" BMC Medical Genetics, 2013 Feb 23;14:28 Lai AH, et al., "A submicroscopic deletion involving part of the CREBBP gene detected by array-CGH in a patient with Rubinstein-Taybi syndrome" Gene, 2012 May 10;499(1):182-5 Caglayan AO, et al., "A boy with classical Rubinstein-Taybi syndrome but no detectable mutation in the CREBBP and EP300 genes" Genetic counseling, 2011;22(4):341-6 Li C, Szybowska M. "A novel mutation c.4003 G>C in the CREBBP gene in an adult female with Rubinstein-Taybi syndrome presenting with subtle dysmorphic features" American Journal of Medical Genetics Part A, 2010 Nov;152A(11):2939-41 Oike Y, et al., "Mice homozygous for a truncated form of CREB-binding protein exhibit defects in hematopoiesis and vasculo-angiogenesis" Blood, 1999 May 1;93(9):2771-9
　本開示の目的は、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物に関する。本開示のさらなる目的は、当該変異の有無を指標とする疾患の判定に関する。
　本発明者らは、飼育中に自然発生した体格の小さいマウスがルビンシュタイン・テイビ症候群および睡眠相前進症候群の症状を示し、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に特定の一塩基欠損を有することを見出した。さらに、マウスのゲノムにこの一塩基欠損を導入すると、同様の症状を示した。
　従って、ある態様では、本願は、少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、遺伝子改変動物を提供する。
　また別の態様では、本願は、非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、上記遺伝子改変動物の製造方法を提供する。
　また別の態様では、本願は、上記遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルまたは睡眠相前進症候群のモデルとしての使用を提供する。
　また別の態様では、本願は、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
　また別の態様では、本願は、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法を提供する。
　また別の態様では、本願は、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法を提供する。
　本開示の変異を有する遺伝子改変動物は、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群のモデルとして有用である。また、当該変異の有無を指標として、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定し得る。
代表的な矮小マウスの外貌を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの体長、体重およびＢＭＩを示す。 正常マウスおよび矮小マウスの鼻背長および両眼間隔を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの血圧および体温を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの体重の推移を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの通常時の摂餌量および体重当たりの摂餌量を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの絶食後の体重および摂餌量を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの血中の成長ホルモンおよびインスリン様成長因子－Ｉの濃度を示す。 正常マウスおよび矮小マウスのグルコース寛容試験に伴う血糖値の推移を示す。 正常マウスおよび矮小マウスのグルコース寛容試験に伴う血糖値およびインスリン値の推移を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの明暗条件下および恒常暗条件下での行動リズムを示すアクトグラムである。 正常マウスおよび矮小マウスのフットプリント試験の結果を示す。 正常マウスおよび矮小マウスの握力を示す。 高架式十字迷路による不安傾向の測定方法の模式図である。マウスを高架式十字迷路の中央に置き、１０分間の行動軌跡を測定した。 正常マウスおよび矮小マウスの高架式十字迷路による不安傾向の測定結果を示す。 野生型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。変異型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子において欠損している第１１２３位のグアニンヌクレオチドを四角で囲んで示す。 野生型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列（続き）を示す。 野生型マウスＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を示す。 野生型ヒトＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。変異型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子において欠損している第１１２３位のグアニンヌクレオチドに相当する第１１２６位のグアニンヌクレオチドを四角で囲んで示す。 野生型ヒトＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列（続き）を示す。 野生型ヒトＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を示す。 変異型マウスＣＲＥＢＢＰおよび変異型ヒトＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を示す。ストップコドンの位置をアスタリスクで示す。 野生型マウスＣＲＥＢＢＰおよび変異型マウスＣＲＥＢＢＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントの一部を示す。一塩基欠損によりフレームシフトしたアミノ酸配列を四角で囲んで示す。 野生型ヒトＣＲＥＢＢＰおよび変異型ヒトＣＲＥＢＢＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントの一部を示す。一塩基欠損によりフレームシフトしたアミノ酸配列を四角で囲んで示す。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　ＣＲＥＢＢＰはほぼ全ての細胞に存在しており、ＤＮＡに直接結合することなくタンパク質同士の相互作用を通じて転写を活性化する転写共役因子としての機能を果たしている。ＣＲＥＢＢＰは、ＫＩＸドメインを通じてリン酸化ＣＲＥＢと結合して活性化される。活性化されたＣＲＥＢＢＰは転写複合体の基本因子であるＴＦＩＩＢを介してＲＮＡポリメラーゼに作用し、転写を促進する。ＣＲＥＢＢＰはリン酸化ＣＲＥＢだけではなく、核内ホルモン受容体、Ｍｙｂ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＳＴＳＴ １αなどの多くの転写因子に共通する転写共役因子として機能する。また、ＣＲＥＢＢＰはＨＡＴ活性を有し、ヒストンのアセチル化とそれに伴うクロマチン構造の制御を担い、転写を活性化させる。
　本開示において、「ＣＲＥＢＢＰ」および「ＣＲＥＢＢＰ遺伝子」は、いかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）、特にマウスなどの齧歯類、およびヒトなどの霊長類のＣＲＥＢＢＰまたはＣＲＥＢＢＰ遺伝子である。マウスの野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の代表的なヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。これは、２４４１個のアミノ酸配列からなる配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＣＲＥＢＢＰをコードする。マウスのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座は１６ｑＡ１である。ヒトの野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の代表的なヌクレオチド配列を、配列番号３に示す。これは、２４４２個のアミノ酸配列からなる配列番号４のアミノ酸配列を有する野生型ＣＲＥＢＢＰをコードする。ヒトのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座は１６ｐ１３．３である。
　ＣＲＥＢＢＰ遺伝子には、配列番号１または３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。さらに、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子には、配列番号１または３で表されるヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子が含まれる。
　本開示において、変異型ＣＲＥＢＢＰは、３８６個のアミノ酸からなる配列番号５のアミノ酸配列または３８７個のアミノ酸からなる配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号５の変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号２のマウス野生型ＣＲＥＢＢＰの第１位～第３７４位のアミノ酸と、さらに１２個のアミノ酸からなるタンパク質である。配列番号６の変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号４のヒト野生型ＣＲＥＢＢＰの第１位～第３７５位のアミノ酸と、さらに１２個のアミノ酸からなるタンパク質である。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号５または６のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号５または６のアミノ酸配列からなる。これらのアミノ酸配列を有する変異型ＣＲＥＢＢＰは、ＣＲＥＢＢＰの転写活性化機能を実質的に喪失している。
　変異型ＣＲＥＢＢＰは、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子にコードされる。変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、変異型ＣＲＥＢＢＰをコードする遺伝子であれば、どのような変異を有するＣＲＥＢＢＰ遺伝子であってもよい。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号１で示されるマウス野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列において、第１１２３位のヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列（配列番号７）を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号７のヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号３で示されるヒト野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド配列において、第１１２６位のヌクレオチドが欠損している配列（配列番号８）を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号８のヌクレオチド配列からなる。
　「配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチド」とは、あるＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列と配列番号１のヌクレオチド配列を最適な状態（ヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントしたときに、配列番号１の第１１２３位のグアニンヌクレオチドと一致する、当該変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子におけるヌクレオチドを意味する。「配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチド」も同様に定義される。
　本開示において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性とは、タンパク質またはオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（アミノ酸またはヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のアミノ酸またはヌクレオチドを決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸またはヌクレオチドの総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
＜遺伝子改変動物＞
　本開示において、遺伝子改変動物はヒトを除くいかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）であり得る。ある実施態様では、遺伝子改変動物は齧歯類、特にマウスである。
　遺伝子改変動物は、標的遺伝子を改変するための公知の遺伝子改変技術を用いて、非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することにより、製造できる。用いられる公知の遺伝子改変技術としては、ＣＲＩＳＰＲシステム、Transcription Activator-Like Effector Nucleases（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法、相同組換え方法等が挙げられる。中でも、選択的かつ部位特異的に遺伝子を改変できることから、ＣＲＩＳＰＲシステムを利用し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の詳細は、例えば、Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) および米国特許第８６９７３５９号に記載されており、これらの文献を引用により本明細書の一部とする。
　ＣＲＩＳＰＲシステムを利用して遺伝子改変動物を製造する場合、まず、非ヒト動物由来の受精卵に、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入する。導入には、公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ－デキストラン法等を用いることができる。
　野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの２つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、これらは各々、ＤＮＡの二本鎖の異なる鎖を切断する。本開示において、「Ｃａｓ９タンパク質」は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を有するタンパク質を意味し、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を有するものも、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有さないものも含まれる。Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌として、例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）などが挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質の代わりに、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸または当該核酸を含むベクターを使用してもよい。Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターは、特に限定されず、当分野で公知のものを使用できる。
　本開示において、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが融合した人工１本鎖ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間にリンカー配列が存在してもよい。Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡの存在下で標的特異的にゲノムＤＮＡに結合できる。ｇＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、分離したＲＮＡ分子の組合せとして使用してもよい。
　ｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、ｇＲＮＡの配列特異性を担う。本開示において、ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ内の標的配列を含む。標的配列としては、ゲノムＤＮＡ内で、その直後にＰＡＭ配列を有するヌクレオチド配列を選択する。標的配列は、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい。標的配列の選択および／またはｇＲＮＡの設計に利用できる数々のツール、および、バイオインフォマティックスにより予想された様々な種の様々な遺伝子についての標的配列のリストを利用することができ、例えば、引用により本明細書の一部とするFeng Zhang lab's Target Finder、Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools: Cas-OFFinder、CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes、CRISPR Optimal Target Finder などが挙げられる。ある実施態様では、標的配列は配列番号９のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。ある実施態様では、標的配列は配列番号９のヌクレオチド配列において、１個～３個のヌクレオチドが付加、欠損および／または置換したヌクレオチド配列である。ある実施態様では、標的配列は配列番号９のヌクレオチド配列である。
　Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有するいかなるＤＮＡ配列にも結合できる。ＰＡＭ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列の直後に存在するが、ｇＲＮＡ内の標的配列の直後には存在しない。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌の種により異なる。最も広く使用されているＣａｓ９タンパク質はスタフィロコッカス・ピオゲニスに由来し、対応するＰＡＭ配列は、標的配列の３’末端の直後に位置するＮＧＧの配列である。様々な細菌の種とＰＡＭ配列の組合せが知られており、例えば、ナイセリア・メニンギティディス：ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ストレプトコッカス・サーモフィラス：ＮＮＡＧＡＡ、トレポネーマ・デンティコラ：ＮＡＡＡＡＣなどが挙げられる。これらの配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかの塩基を示す。
　ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部と相補的に結合し、ヘアピン構造を形成する。この構造がＣａｓ９に認識され、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９の複合体が形成される。従って、ｔｒａｃｒＲＮＡはｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質結合能力を担う。ｔｒａｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、細菌の種によって異なる配列を有する。本開示において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌のものであり得、好ましくは、ゲノム編集に使用するｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質は、同じ細菌の種に由来する。
　所望のｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。また、ｇＲＮＡの標的配列以外の配列を含むインビトロ転写用ベクターが当分野で公知である。標的配列のオリゴヌクレオチドを合成し、そのようなベクターに挿入し、インビトロ転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
　ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ内の標的配列との相補的結合により、標的配列にリクルートされる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の標的配列への結合は、Ｃａｓ９タンパク質をゲノム内の標的配列に局在化させ、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡの両方の鎖を切断し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。ＤＳＢは、ＮＨＥＪ（非相同末端結合（Non-Homologous End Joining））ＤＮＡ修復経路、または、ＨＤＲ（相同組換え修復）経路により修復され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢの部位にしばしば塩基の挿入／欠損を与え、それはフレームシフトおよび／または停止コドンをもたらし、標的遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し得る。ＨＤＲ経路は、ＤＳＢを修復するために、修復鋳型の存在を必要とする。ＨＤＲでは、修復鋳型の配列が、切断された標的配列に忠実に複写される。修復鋳型とＨＤＲを利用して、標的遺伝子に所望の変異を導入できる。
　ＨＤＲによりゲノムＤＮＡ配列内のヌクレオチドを改変するためには、ＨＤＲの際に、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。ある実施態様では、ＤＮＡ修復鋳型として、ｓｓＯＤＮ（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）を用いることができる。ｓｓＯＤＮは、ＤＳＢの上流および下流の配列に高い相同性を有する。各相同性領域の長さと位置は導入しようとする改変のサイズに依存する。適する鋳型の存在下で、ＨＤＲは、Ｃａｓ９タンパク質によるＤＳＢの部位で、特定のヌクレオチドを改変できる。ｓｓＯＤＮを設計する際には、修復された遺伝子がＣａｓ９タンパク質により切断されないように、ｓｓＯＤＮが、直後にＰＡＭ配列を有する標的配列を含まないように設計する。例えば、ＰＡＭ配列に対応する配列をｓｓＯＤＮ中では別の配列にすることにより、ｓｓＯＤＮがＣａｓ９タンパク質により切断されないようにできる。ｓｓＯＤＮの設計方法の詳細は、例えば、引用により本明細書の一部とするYang, H. et al., Cell, 154(6), 1370-9 (2013) に記載されている。ｓｓＯＤＮは、通常、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質と共に細胞に導入される。
　Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡを導入した受精卵を対応する非ヒト動物の子宮または卵管へ移植し、発生させることで、遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変動物が得られたことは、当分野で知られている様々な方法により確認できる。例えば、表現型を観察することにより、あるいは、標的配列を含むゲノムＤＮＡの配列を解読することにより確認できる。ＨＤＲの場合は、ｓｓＯＤＮに制限酵素切断部位を組み込むことにより、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）で評価することも可能である。これらの方法は、当分野で周知である。
　遺伝子改変動物には、ヘテロ型（即ち、ゲノム上の一方のアリルが改変されている）およびホモ型（即ち、ゲノム上の両方のアリルが改変されている）の遺伝子改変動物が含まれる。ヘテロ型遺伝子改変動物が好ましい。ヘテロ型遺伝子改変動物同士を交配させることによりホモ型遺伝子改変動物を作製してもよい。
　下記実施例に示す通り、本開示の遺伝子改変動物は、少なくとも１つのルビンシュタイン・テイビ症候群の症状を示す。ルビンシュタイン・テイビ症候群の症状として、例えば、精神発達遅滞、小さい体格、低体重、低身長、眼間開離、短い鼻背、停留睾丸、小陰茎、低血圧または低体温が挙げられる。従って、本開示の遺伝子改変動物を、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデル動物として使用できる。また、本開示の遺伝子改変動物では、サーカディアンリズムが前進傾向にある。よって、本開示の遺伝子改変動物を、睡眠相前進症候群を伴うルビンシュタイン・テイビ症候群のモデル動物、または、睡眠相前進症候群のモデル動物としても使用できる。モデル動物は、疾患の原因の解明や、予防方法および治療方法の開発などに有用である。
＜医薬のスクリーニング方法＞
　例えば、本開示の遺伝子改変動物をルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群のモデル動物として使用して、当該疾患の処置用の医薬をスクリーニングすることができる。
　従って、ある態様では、ルビンシュタイン・テイビ症候群の処置用の医薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）本明細書に開示される遺伝子改変動物に、少なくとも１種の候補物質を投与する工程、および、
（ｂ）候補物質を投与した遺伝子改変動物において、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、ルビンシュタイン・テイビ症候群の症状が改善された場合に、候補物質をルビンシュタイン・テイビ症候群の処置用の医薬として選択する工程、
を含む方法が提供される。
　別の態様では、睡眠相前進症候群の処置用の医薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）本明細書に開示される遺伝子改変動物に、少なくとも１種の候補物質を投与する工程、および、
（ｂ）候補物質を投与した遺伝子改変動物において、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、睡眠相前進症候群の症状が改善された場合に、候補物質を睡眠相前進症候群の処置用の医薬として選択する工程、
を含む方法が提供される。
　本明細書で使用されるとき、「処置」は、疾患の発症を防止すること、疾患を発症する可能性を低減すること、疾患の原因を軽減または除去すること、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、疾患の症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
　「候補物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などの、あらゆる物質が包含される。候補物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品であってもよい。候補物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。候補物質の細胞への導入は、候補物質の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。候補物質は１種類でもよく、２種類以上を組み合わせて投与してもよい。
　候補物質の投与量および投与回数は、遺伝子改変動物の齢、性別、体重、症状、投与方法等を勘案して適宜調節される。候補物質の投与経路は、経口投与または非経口投与を含み、特に限定されない。例えば、非経口投与は、全身投与でも局所投与でもよく、より具体的には、例えば、気管内投与、髄腔内投与、くも膜下腔投与、頭蓋内投与、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。遺伝子改変動物は胎児であっても出生後の動物であってもよく、胎児である場合は、候補物質を胎児または母体に投与し得る。
　ルビンシュタイン・テイビ症候群の処置用の医薬をスクリーニングする場合、ルビンシュタイン・テイビ症候群の症状が改善されたことは、小さい体格、低体重、低身長、広い眼間、短い鼻背、低血圧または低体温等の症状を観察することにより判定し得る。例えば、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、症状に関する数値を、例えば、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上改善する候補物質を、医薬として選択し得る。
　睡眠相前進症候群の処置用の医薬をスクリーニングする場合、睡眠相前進症候群の症状が改善されたことは、サーカディアンリズムを観察することにより判定し得る。例えば、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、恒常暗条件下での行動周期を、例えば、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上改善する候補物質を、医薬として選択し得る。
＜判定マーカー＞
　別の態様では、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが提供され、これは、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の判定マーカーとして使用し得る。別の態様では、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供され、これは、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の判定マーカーとして使用し得る。
　ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異があり、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードすると、例えば、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドの欠損があると、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の原因となり得る。従って、ＣＲＥＢＢＰまたはＣＲＥＢＢＰ遺伝子における当該変異の有無を決定することにより、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定することができ、当該変異を含むペプチドまたはポリヌクレオチドは、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定するためのマーカーとして有用である。ここで、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体等が含まれる。
＜判定方法＞
　別の態様では、上記の判定マーカーを使用するルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の判定方法が提供される。対象から採取した試料において、上記の変異の有無を決定することにより、疾患の判定を行うことができる。本明細書で使用されるとき、疾患の判定とは、対象が疾患に罹患しているか否か、または、対象が疾患に罹患する可能性があるか否かを判定することを意味する。
　対象はいかなる種であってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）である。ある実施態様では、対象は齧歯類、特にマウスである。ある実施態様では、対象は霊長類、特にヒトである。対象は胎児を含む。
　対象から試料を採取する方法は、通常の公知の方法が用いられる。対象の試料は、例えば、血液、髄液、唾液などの体液、または、口腔粘膜、頭髪などの組織であり得る。対象が胎児である場合は、羊水穿刺または絨毛採取により、対象に由来する試料を採取してもよい。
　ペプチドを判定マーカーとして使用する場合、当該ペプチドを認識する抗体等の試薬を用いて、対象から採取した試料における上記の変異の有無を決定する。変異の検出方法は当業者に公知であり、特に限定されない。変異型ペプチドを特異的に認識する試薬を使用することが好ましい。野生型ペプチドも変異型ペプチドも認識する試薬を使用する場合、ペプチドの分子量の差異に基づいて変異を検出してもよい。
　ポリヌクレオチドを判定マーカーとして使用する場合、対象の試料から核酸を単離してもよい。核酸を単離する方法は当業者に公知であり、特に限定されない。例えば、市販のＤＮＡまたはＲＮＡを採取するためのキットを使用し得る。ここで、核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などにより目的の領域、例えば、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の全長または一部を増幅した断片も含まれる。
　次に、核酸における上記の変異の有無を決定する。変異の検出方法は当業者に公知であり、特に限定されない。典型的には、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定し、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するか否かを判定する。
　あるいは、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを検出してもよい。その方法として、ＰＣＲ法、アレル特異的ＰＣＲ法、ＰＣＲ－ＳＳＰ法、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ダイレクトシーケンス法、ＡＳＯハイブリダイゼーション法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法などが挙げられる。
　対象から採取した試料に上述の変異が有る場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定する。あるいは、対象から採取した試料に上述の変異が有る場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群に罹患している可能性、または、将来的に罹患する可能性が高いと判定する。
＜判定用キット＞
　別の態様では、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定するためのキットが提供される。キットは、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをもたらす変異、例えば、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドの欠損があるか否かを決定するための手段を含む。
　上記の変異の有無を決定するための手段は、特に限定されず、例えば、上記の判定方法において変異の検出に使用する手段、例えば、当該変異が含まれる領域を増幅できるプライマーまたは当該変異が含まれる領域に結合できるプローブであり得る。ある実施態様では、上記の変異の有無を決定するための手段はアレル特異的ＰＣＲ用のプライマーであり、例えば、対象がマウスである場合、配列番号１３および１４のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用できる。また、キットは、必要に応じて他の成分を含んでもよい。他の成分は、例えば、試料を採取するための道具（例えば、注射器等）、ポジティブコントロール試料およびネガティブコントロール試料などが挙げられるが、これらに限定されない。上述の方法を行うための手順を記載した書面等を含んでもよい。
　本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、遺伝子改変動物。
［２］変異型ＣＲＥＢＢＰが配列番号５のアミノ酸配列を含む、第１項に記載の遺伝子改変動物。
［３］変異型ＣＲＥＢＢＰが配列番号５のアミノ酸配列からなる、第１項または第２項に記載の遺伝子改変動物。
［４］変異型ＣＲＥＢＢＰが転写活性化機能を実質的に喪失している、第１項～第３項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［５］ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む、第１項～第４項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［６］ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号７のヌクレオチド配列を含む、第１項～第５項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［７］ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号７のヌクレオチド配列からなる、第１項～第６項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［８］齧歯類である、第１項～第７項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［９］マウスである、第１項～第８項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［１０］ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルである、第１項～第９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［１１］ルビンシュタイン・テイビ症候群が睡眠相前進症候群を伴うものである、第１０項に記載の遺伝子改変動物。
［１２］睡眠相前進症候群のモデルである、第１項～第９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［１３］非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、第１項～第１２項のいずれかに記載の遺伝子改変動物の製造方法。
［１４］ゲノム編集により変異が導入される、第１３項に記載の製造方法。
［１５］ゲノム編集の標的配列が配列番号９のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、第１４項に記載の製造方法。
［１６］ゲノム編集の標的配列が、配列番号９のヌクレオチド配列において、１個～３個のヌクレオチドが付加、欠損および／または置換したヌクレオチド配列である、第１４項に記載の製造方法。
［１７］標的配列が配列番号９のヌクレオチド配列である、第１５項または第１６項に記載の製造方法。
［１８］所望の変異をもたらすｓｓＯＤＮをさらに使用する、第１４項～第１７項のいずれかに記載の製造方法。
［１９］第１３項～第１８項のいずれかに記載の製造方法により製造される、遺伝子改変動物。
［２０］第１項～第１２項および第１９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとしての使用。
［２１］ルビンシュタイン・テイビ症候群が睡眠相前進症候群を伴うものである、第２０項に記載の使用。
［２２］第１項～第１２項および第１９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、睡眠相前進症候群のモデルとしての使用。
［２３］配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
［２４］配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、第２３項に記載のペプチド。
［２５］配列番号５または６のアミノ酸配列からなる、第２３項または第２４項に記載のペプチド。
［２６］第２３項～第２５項のいずれかに記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
［２７］配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列、または、
配列番号３のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列、
を含む、第２６項に記載のポリヌクレオチド。
［２８］配列番号７または８のヌクレオチド配列を含む、第２６項または第２７項に記載のポリヌクレオチド。
［２９］配列番号７または８のヌクレオチド配列からなる、第２６項～第２８項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［３０］第２３項～第２５項のいずれかに記載のペプチドの、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定マーカーとしての使用。
［３１］第２６項～第２９項のいずれかに記載のポリヌクレオチドの、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定マーカーとしての使用。
［３２］ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する試料を、第３０項または第３１項に記載の判定マーカーを含むか否かについて試験すること、および、
（２）試料が判定マーカーを含むと判定された場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３３］第２３項～第２５項のいずれかに記載のペプチドの、睡眠相前進症候群の判定マーカーとしての使用。
［３４］第２６項～第２９項のいずれかに記載のポリヌクレオチドの、睡眠相前進症候群の判定マーカーとしての使用。
［３５］睡眠相前進症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する試料を、第３３項または第３４項に記載の判定マーカーを含むか否かについて試験すること、および、
（２）試料が判定マーカーを含むと判定された場合に、対象が睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３６］ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３７］ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３８］睡眠相前進症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象が睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３９］睡眠相前進症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象が睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［４０］対象が胎児である、第３２項および第３５項～第３９項のいずれかに記載の方法。
［４１］ルビンシュタイン・テイビ症候群を判定するためのキットであって、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをもたらす変異があるか否かを決定するための手段を含む、キット。
［４２］睡眠相前進症候群を判定するためのキットであって、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをもたらす変異があるか否かを決定するための手段を含む、キット。
［４３］変異があるか否かを決定するための手段が、アレル特異的ＰＣＲ用のプライマーである、第４１項または第４２項に記載のキット。
［４４］プライマーが配列番号１３および配列番号１４のヌクレオチド配列からなる、第４３項に記載のキット。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本開示の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本開示を説明するためだけに供されるものである。
試験１：自然発生した矮小マウスの解析
（１）矮小マウスの出現と維持
　Sato T, Kurokawa M, Nakashima Y, Ida T, Takahashi T, Fukue Y, Ikawa M, Okabe M, Kangawa K, Kojima M. Regul Pept. 2008 Jan 10;145(1-3):7-11に記載されるグレリン遺伝子欠損（ghrl+/-）マウスの系統を維持して飼育している間に、小さい体格、特異的顔貌、低姿勢での歩行などの外見的な特徴を有するマウス（以下、矮小マウスと称する）が自然に出現した。矮小マウス（雄）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）を交配し、第一世代を得た。矮小マウス（雄）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）を９世代にわたり交配し、矮小マウス（雌）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄）を１世代交配することにより、バッククロス（１０世代）を実行した。その結果、矮小マウスの外見的な特徴は維持された。何らかの遺伝子変異によって矮小形質が出現したと考えられる。
（２）矮小マウスの出現比率
　矮小マウス（雄）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）の交配において、正常マウス：矮小マウスの出現比率は、２７７：１３８であった。矮小マウスの性別に拘わらず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配すると矮小マウスが産まれること、および、矮小マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配すると、正常マウスと矮小マウスの両方が産まれることから、矮小形質は常染色体優性遺伝していると考えられる。出生比率はメンデルの法則による常染色体優性遺伝の比率と異なるが、矮小個体が食殺されている可能性およびホモ変異個体が胎生致死である可能性が考えられる。
（３）矮小マウスの外貌
　代表的な矮小マウスの外貌を図１に示す。矮小マウスは、同性の正常なマウスと比較して、体格が小さく、眼間が広く、鼻背長が短いという特徴を有した。
（４）身体計測
　これ以降の試験では、特記しない限り、雄のマウスを使用した。正常マウスおよび矮小マウスの体長および体重を測定し、ＢＭＩを測定した。結果を図２に示す。矮小マウスの体長および体重は正常マウスよりも小さかったが、ＢＭＩには正常マウスとの有意差は認められなかった。
　正常マウスおよび矮小マウスの鼻背長および両眼間隔を測定した。結果を図３に示す。矮小マウスの鼻背長は正常マウスよりも有意に短く、両眼間隔は有意に長かった。
（５）通常時の血圧および体温
　正常マウスおよび矮小マウスの血圧および体温を測定した。結果を図４に示す。矮小マウスの血圧と体温は低い傾向が見られた。矮小マウスの体温は体重と相関する傾向が見られた。
（６）血液生化学的検査
　正常マウスおよび矮小マウスの血液を、ベストスキャン（セントラル科学貿易）で測定した。結果を下表に示す。矮小マウスでは、アルカリホスファターゼ、カルシウム、無機リン酸の濃度が高く、グルコース濃度が低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（７）体重の推移
　正常マウスおよび矮小マウスについて、体重の推移を観察した。結果を図５に示す。矮小マウスは、正常マウスと同様の成長曲線を示した。
（８）通常時の摂餌量
　正常マウスおよび矮小マウスについて、通常時の２４時間の摂餌量を計量した。結果を図６に示す。矮小マウスの摂餌量は少ないが、体重比では正常マウスとの差は認められなかった。
（９）絶食後の体重および摂餌量
　正常マウスおよび矮小マウスを２４時間絶食させた。絶食後の体重と、絶食後の再給餌時の摂餌量を計量した。結果を図７に示す。絶食２４時間後の体重減少率は、矮小マウスと正常マウスとで差は認められなかった。
（１０）通常時のＧＨおよびＩＧＦ－Ｉ濃度
　正常マウスおよび矮小マウスの血中の成長ホルモン（ＧＨ）濃度およびインスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）濃度を測定した。結果を図８に示す。矮小マウスと正常マウスとでＧＨ濃度に差は認められなかったが、矮小マウスのＩＧＦ－Ｉ濃度は正常マウスよりも有意に低かった。
（１１）グルコース寛容試験に伴う血糖値の推移
　正常マウスおよび矮小マウスを２時間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。結果を図９に示す。矮小マウスは正常マウスよりも耐糖能が有意に高かった。
（１２）グルコース寛容試験に伴うインスリン値の推移
　正常マウスおよび矮小マウスを２時間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。結果を図１０に示す。矮小マウスのインスリン値は、正常マウスよりも早期に低下した。
（１３）行動リズム
　正常マウス３匹および矮小マウス４匹を明暗条件下および恒常暗条件下におき、活動量をダブルプロットで記録した。各マウスのアクトグラムを図１１に示す。明暗条件下（各パネル上部）において、矮小マウスの活動周期は正常マウスと同様であった。恒常暗条件下（各パネル下部）において、活動開始時刻に沿って引いた直線の傾きは矮小マウスで小さく、矮小マウスの活動周期が正常マウスよりも短いことが示唆された。恒常暗条件下での活動周期は内因性の概日リズムを反映するため、この結果は、矮小マウスを睡眠相前進症候群のモデルとして使用し得ることを示す。
（１４）フットプリント試験（歩行解析）
　正常マウスおよび矮小マウスの後肢にインクを塗って紙の上を歩かせ、足跡の歩幅（Hind stride）と横幅（Hind base）を測定した。結果を図１２に示す。矮小マウスでは正常マウスよりも歩行時の横幅が広く、歩幅が狭かった。
（１５）握力測定
　正常マウスおよび矮小マウスの四肢の握力を、小動物用筋弛緩測定装置（トラクションメーター、#BS-TM-RM、Brain Science idea）により測定した。結果を図１３に示す。矮小マウスの四肢の瞬間的握力および持続的握力は正常マウスよりも弱かった。
（１６）高架式十字迷路による不安傾向の測定
　正常マウスおよび矮小マウスを高架式十字迷路の中央に置き、１０分間の行動軌跡を記録した（図１４）。結果を図１５に示す。矮小マウスは正常マウスよりも不安レベルが高いか、または、好奇心が低い可能性が認められた。
試験２：矮小マウスの責任候補遺伝子の決定
　連鎖解析に基づく量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）マッピングを行い、矮小マウスの原因遺伝子が第１６番染色体の３８,９３１,２３８ｂｐより上流に存在することを明らかにした。さらに詳細な部位を特定できるプローブを用いて遺伝子マッピングを行い、矮小マウスの原因遺伝子が第１６番染色体の２１,６７８,４７３ｂｐより上流に存在することを明らかにした。
　遺伝子マッピング法により特定された領域内で次世代シークエンシングを行い、ヌクレオチド配列を決定した。Ｃｈｒ１６：４,１３８,８３５でＣＧ→Ｃの変異があり、フレームシフトを起こしていることが判明した。この結果は、多個体でのサンガー法によるシークエンス結果とも一致した。
　野生型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２並びに図１６および１７に示す。矮小マウスで発見された変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号１の第１１２３位に相当するグアニンヌクレオチド（図１６中、四角で囲んで示す）が欠損しており、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有した。野生型ＣＲＥＢＢＰおよび変異型ＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を図１８および図２２に示す。野生型ＣＲＥＢＢＰが２４４１個のアミノ酸からなるのに対し、変異型ＣＲＥＢＢＰはフレームシフトにより３８６個のアミノ酸からなっていた。即ち、矮小マウスでは、ＣＲＥＢＢＰのＣ末端欠損が起こっていた。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントの一部を図２３に示す。
　ＣＲＥＢＢＰ遺伝子はルビンシュタイン・テイビ症候群の原因遺伝子の１つであり、常染色体優性遺伝することが知られている。ルビンシュタイン・テイビ症候群の合併症として、低身長、幅広い鼻稜、鼻翼より下方に伸びた鼻中隔が知られており、これらは矮小マウスの特徴と一致する。従って、これらの結果は、矮小マウスをルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとして使用し得ることを示す。
試験３：変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子を有するマウスの作製
　マウスゲノム中の下記のヌクレオチド配列に点突然変異を導入するために、ゲノム編集を行った。
Exon 4 ENSMUSE00000295066 241 nt
TCCCAGTTGCAAACATCAGTGGGAATTGTACCCACACAAGCAATTGCAACAGGCCCCACAGCAGACCCTGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCACAAATGTCAGAGACGAGAGCAAGCAAATGGAGAGGTTCGAGCCTGTTCTCTCCCACACTGTCGAACCATGAAAAACGTTTTGAATCACATGACACATTGTCAGGCTGGGAAAGCCTGCCAAG（配列番号１０）
　ACGAGAGCAAGCAAATGGAG（配列番号９）のヌクレオチド配列（配列番号１０の下線部の配列）を標的とするｓｇＲＮＡを使用した。
　相同染色体の一方を変異させ、他方を変異させないために、下記のヌクレオチド配列を有する２種のノックイン用のオリゴヌクレオチドを使用した。
（１）点突然変異用のｓｓＯＤＮ
TGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCACAAATGTCAGAGACGAGAGCAAGCAAATGG-GAGGTTCGAGCCTGTTCTCTCCCACACTGTCGAACCATGAAAAACGTTTTGAATCACATGACACATTGTCAGGCTGGGAA（配列番号１１）
（２）サイレント変異用のｓｓＯＤＮ
TGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCACAAATGTCAGAGACGAGAGCAAGCAAACGGCGAAGTTCGAGCCTGTTCTCTCCCACACTGTCGAACCATGAAAAACGTTTTGAATCACATGACACATTGTCAGGCTGGGAA（配列番号１２）
　Ｃａｓ９タンパク質１００ｎｇ／ｕｌ、ｓｇＲＮＡ１００ｎｇ／ｕｌ、（１）および（２）のｓｓＯＤＮ各５０ｎｇ／ｕｌをエレクトロポレーション法によりＢ６ＮＪｃｌの受精卵１１９個に導入した。翌日正常に発生が進んだ１１０個を仮親４腹へ移植した。仮親４腹は、すべて自然分娩で出産した。３１匹（雄１０匹、雌２１匹）の産子が得られた。遺伝子型を確認したところ、編集された個体は３１匹中１０匹であり、うちファウンダー候補は２匹であった。ファウンダー候補マウスをＢ６ＮＪｃｌマウスと交配し、産子のＣＲＥＢＢＰ遺伝子の配列を解読したところ、目的の点突然変異が確認された。この方法により人為的に作製された変異型マウスは、自然発生した変異型マウスと同様に、体格が小さく、頭部奇形（両眼乖離および鼻背長の短縮）および歩行異常を示した。これらの結果は、人為的に作製した変異型マウスを、自然発生した変異型マウスと同様に、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとして使用し得ることを示す。
試験４：アレル特異的ＰＣＲによる変異検出
　下記のプライマーおよび反応液を使用して、下記の反応条件のＰＣＲにより、マウスのゲノムＤＮＡを増幅した。下記のプライマーは、マウスのゲノムに試験２で同定された点突然変異がある場合に２０７ｂｐの増幅産物が得られるように設計した。
フォワードプライマー：5'- GACGAGAGCAAGCAAATCGG -3'（配列番号１３）
リバースプライマー：5'- TAGGCAGTGCAGGATTCCAA -3'（配列番号１４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　野生型マウスのゲノムＤＮＡを用いると、核酸は増幅されなかった。自然発生した変異型マウスのゲノムＤＮＡを用いると、核酸は増幅された。従って、この系により当該変異を検出することができる。
　ルビンシュタイン・テイビ症候群は発症機序が未だ不明であり、治療技術も確立されていないので、本開示の遺伝子改変動物にはリサーチツールとしての需要が見込まれる。また、本開示は、ルビンシュタイン・テイビ症候群の遺伝子診断に寄与し得る。

Claims (17)

  1. 　少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、遺伝子改変動物。
  2. 　変異型ＣＲＥＢＢＰが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
  3. 　ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変動物。
  4. 　ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
  5. 　齧歯類である、請求項１～４のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
  6. 　マウスである、請求項１～５のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
  7. 　非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、請求項１～６のいずれかに記載の遺伝子改変動物の製造方法。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとしての使用。
  9. 　ルビンシュタイン・テイビ症候群が睡眠相前進症候群を伴うものである、請求項８に記載の使用。
  10. 　請求項１～６のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、睡眠相前進症候群のモデルとしての使用。
  11. 　配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
  12. 　配列番号５または６のアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載のペプチド。
  13. 　請求項１１または１２に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  14. 　配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列、または、配列番号３のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 　配列番号７または８のヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 　ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
    （１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
    （２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
    （３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
    を含む方法。
  17. 　ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
    （１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
    （２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
    を含む方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KASPER, L. H. ET AL.: "Two transactivation mechanisms cooperate for the bulk of HIF-1- responsive gene expression", THE EMBO JOURNAL, vol. 24, 2005, pages 3846 - 3858, XP055673078 *

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