WO2019181714A1 - テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a compound that inhibits telomere-binding protein and a telomere-binding protein inhibitor containing the same.
  • telomere At the end of human chromosomal DNA, there is a double-stranded DNA consisting of a repetitive sequence of 5'-TTAGGG-3 'called telomere.
  • the 3 'end protrudes from the extreme end of the telomere, and a single-stranded DNA portion of 75 to 300 bases called G tail is formed.
  • G tail is protected by forming a loop except when accessed by telomerase, which is a telomere extending enzyme, or during DNA replication (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • telomeres have been known that the double-stranded part occupying the majority of telomeres is shortened each time cell division is repeated, and this is involved in cell aging.
  • POT1 which is a protein that does not bind to double-stranded telomeric DNA but binds to G tail
  • protein PIP1 that binds to them have been discovered.
  • G tail of telomeres is related to functions completely different from the double-stranded part, such as direct signals of cell death and various cellular responses as described below.
  • telomeres have telomere-binding proteins that bind to them, and telomere-binding proteins such as TRF1 (Teromere repeat binding factor) and TRF2 are known.
  • TRF1 Turomere repeat binding factor
  • TRF2 Turomere repeat binding factor
  • the G tail is shortened (for example, see Non-Patent Document 2).
  • the G tail is shortened, and further, fusion of chromosome ends is caused.
  • the G tail is shortened and cell proliferation stops and ages (for example, see Non-Patent Document 2). In this case as well, since the total telomere length does not change, shortening of the G tail is considered to trigger aging.
  • TRF1 and TRF2 various proteins such as ATM, NBS1, and MRN are required for G tail loop formation.
  • Signals sensitive to various DNA damaging agents and DNA damage caused by radiation show shortening of the G tail even if telomere shortening is not observed.
  • ATM is a causative gene for vasodilatory disease
  • NBS1 is a causative gene for Nimygen syndrome.
  • Nimiehen syndrome is a rare autosomal recessive disorder characterized by high carcinogenicity, immunodeficiency, chromosomal instability, and radiosensitivity. Recruitment of these proteins to the G tail indicates the relationship with each of the above diseases.
  • inhibition of the function of TRF2 functioning as a G tail loop glue induces ATM-dependent apoptosis (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • an anticancer agent that specifically acts on the G tail causes G tail shortening without causing telomere shortening and causes cancer cells to die (see, for example, Non-Patent Document 4). From these results, it is considered that drugs and stresses that cause DNA damage transmit signals to cells via the G tail and cause various cellular responses. It is also known that the tumor suppressor gene product p53, which is known to be mutated in many cancers, binds to the G tail (see, for example, Non-Patent Document 5), and even in diseases associated with cancer and aging, the G tail It is clear that this change is a signal.
  • telomere-binding protein is important for maintaining the G tail, it is considered that inhibiting the telomere-binding protein may be used for diagnosis of various diseases, development of therapeutic agents, and the like.
  • inhibiting the telomere-binding protein may be used for diagnosis of various diseases, development of therapeutic agents, and the like.
  • there is no known compound that inhibits telomere binding protein there is no known compound that inhibits telomere binding protein.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to obtain a compound that inhibits telomere-binding protein, and to make the compound applicable to diagnosis and treatment of diseases. There is.
  • the present inventors have completed the present invention by finding a compound that inhibits telomere-binding protein as a result of intensive studies.
  • the compound according to the present invention is a compound represented by the following chemical formula.
  • R 1 is oxygen or sulfur
  • R 2 to R 6 are independently of each other from hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a nitro group. Selected.
  • R 1 is oxygen or sulfur
  • R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group
  • R 3 is hydrogen, nitro group, methyl group, methoxy group or butyl group
  • R 5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group
  • R 6 is preferably hydrogen or a butyl group.
  • the compound according to the present invention is more preferably represented by any of the following chemical formulas.
  • the compound according to the present invention can inhibit telomere-binding protein from binding to telomeric DNA, and therefore can inhibit loop formation in the G tail. As a result, shortening of the G tail can be promoted, and cell aging and cell death can be induced. Therefore, the compound according to the present invention may be used as a reagent for inducing cell senescence or cell death, and further has potential for application to the development of therapeutic agents for various diseases such as cancer.
  • the telomere binding protein inhibitor according to the present invention includes any one of the above compounds.
  • the telomere binding protein inhibitor according to the present invention is, for example, TRF1, TRF2, or POT1.
  • the telomere-binding protein inhibitor according to the present invention includes the above-mentioned compound, and thus can inhibit the telomere-binding protein from binding to telomeric DNA as described above. For this reason, loop formation in the G tail can be inhibited, shortening of the G tail can be promoted, and cell senescence and cell death can be induced.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer comprising the above compound, and the treatment or prevention of cancer. It also relates to the use of the above compounds for the manufacture of a pharmaceutical composition for use. Furthermore, the present invention also relates to a method comprising administering the above compound for treating or preventing cancer of a cancer patient.
  • the compound according to the present invention and the telomere-binding protein inhibitor containing the compound can inhibit the telomere-binding protein from binding to telomeric DNA, and thus can inhibit loop formation in the G tail. As a result, shortening of the G tail can be promoted, and cell aging and cell death can be induced.
  • (A) is a photograph obtained with a fluorescence microscope
  • (b) is a graph showing the results of measuring 53BP1 (TIF) localized in telomeres using image analysis software for the results shown in (a). is there.
  • the compound according to this embodiment is a compound that inhibits telomere binding protein.
  • the compound according to this embodiment is represented by the following chemical formula.
  • R 1 is oxygen or sulfur
  • R 2 to R 6 are independently of each other from hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a nitro group. Selected.
  • R 1 is oxygen or sulfur
  • R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group
  • R 3 is hydrogen, nitro group, methyl group, methoxy group or butyl group
  • R 5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group
  • R 6 is preferably hydrogen or a butyl group.
  • the telomere binding protein is, for example, TRF1, TRF2, POT1, and the like.
  • the said compound inhibits that the said telomere binding protein bind
  • the compound in the present embodiment has such characteristics, it can be used as a telomere-binding protein inhibitor, and can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer.
  • telomere-binding protein was screened using a DSE-FRET assay (see the first aspect of Patent Document 1 above).
  • candidate compounds 12212 compounds in a compound library held by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology were used. The principle of the DSE-FRET assay is described in Patent Document 1, but will be briefly described below.
  • the DSE-FRET assay is a complex (nucleic acid duplex) in which two nucleic acid double-stranded parts (nucleic acid double-stranded A and nucleic acid double-stranded B) are bonded to each other at their terminal sequences. And measuring the amount of a new nucleic acid duplex produced by a structural change of the (stranded complex).
  • the nucleic acid duplex A is composed of a nucleic acid A1 that is a nucleic acid single strand and a nucleic acid A2 that is a nucleic acid single strand, and binds to a nucleic acid duplex B in a terminal sequence.
  • the resulting nucleic acid duplex is composed of a nucleic acid B1 that is a nucleic acid single strand and a nucleic acid B2 that is a nucleic acid single strand, and is a nucleic acid duplex that can bind to the nucleic acid duplex A at the terminal sequence.
  • nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 can be designed as follows.
  • Nucleic acid A1 A nucleic acid single strand having a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence (terminal sequence).
  • Nucleic acid A2 a nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the first nucleotide sequence and a third nucleotide sequence (terminal sequence).
  • Nucleic acid B1 A nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the second nucleotide sequence (terminal sequence) and a fourth nucleotide sequence.
  • Nucleic acid B2 A nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the third nucleotide sequence (terminal sequence) and a sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence.
  • nucleic acid A1 One mode of specific structures of the nucleic acid A1, the nucleic acid A2, the nucleic acid B1, and the nucleic acid B2 is as shown in FIG.
  • the nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 are designed to have a binding site for a nucleic acid binding protein.
  • the binding site of the nucleic acid binding protein was a binding sequence of the telomere binding protein, particularly TRF2. Details of the arrangement will be described later.
  • This method utilizes the fact that structural changes between nucleic acid duplexes are inhibited by the binding of nucleic acid binding proteins.
  • a nucleic acid duplex complex formed by binding a nucleic acid duplex A composed of nucleic acids A1 and A2 and a nucleic acid duplex B composed of nucleic acids B1 and B2 to each other at their terminal sequences is a chain.
  • the structure changes due to the exchange reaction. Specifically, the nucleic acid duplex complex in which the terminal sequences of the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B shown in FIG. 2 (a) bind to each other is converted into the structure shown in FIG. 2 (b) by the strand exchange reaction. Then, the structure further changes to the structure shown in FIG.
  • FIG. 2 (e) when a nucleic acid binding protein binds to a nucleic acid double-stranded complex composed of nucleic acid double strand A and nucleic acid double strand B, FIG.
  • the structural change proceeds to some extent by the strand exchange reaction, the protein inhibits the strand exchange reaction at the portion where the protein is bound. Therefore, the chain exchange reaction is interrupted in this portion, and as a result, the structure shown in FIG. 2 (g) cannot be changed.
  • the degree of structural change due to the strand exchange reaction that is, the degree of telomere binding protein binding to the telomere sequence
  • Such a measurement can be easily performed by labeling the nucleic acid duplex.
  • the telomere sequence is obtained by labeling the 5 ′ end of the nucleic acid A1 with a fluorescent substance, labeling the 3 ′ end of the nucleic acid B1 with a quenching substance, and measuring the fluorescence intensity of the fluorescent substance. It is possible to measure the degree of binding of telomere-binding protein.
  • the 5 ′ end of the nucleic acid A1 is labeled with a fluorescent substance and the 3 ′ end of the nucleic acid B1 is labeled with a substance that quenches the fluorescent substance
  • two nucleic acids as shown in FIG.
  • the strand exchange reaction proceeds, and as shown in FIGS. 2B and 2C, the 5 ′ end of the nucleic acid A1 approaches the 3 ′ end of the nucleic acid B1, that is, as the fluorescent substance and the quenching substance approach each other. , The fluorescence intensity is reduced.
  • the strand exchange reaction proceeds and, as shown in FIG.
  • the nucleic acid double strand C and the nucleic acid double strand D which are the final products, are formed, they are quenched by the label of the nucleic acid B1. For this reason, the amount of the nucleic acid double-stranded complex, the nucleic acid double-stranded C, and the nucleic acid double-stranded D can be easily measured by measuring the fluorescence value.
  • the combination of the positions labeled with the fluorescent substance and the quenching substance is not limited to the combination of the above positions, and may be any position where the distance between the fluorescent substance and the quenching substance is close to or away from each other as the chain exchange reaction proceeds. Further, the quenching substance and the fluorescent substance can be interchanged.
  • the position of the fluorescent substance and the quenching substance should be close to each other by the progress of the strand exchange reaction.
  • the chain exchange does not proceed, and the fluorescent substance and the quenching substance are separated from each other, so that fluorescence is emitted. That is, according to this method, it is possible to measure the degree of TRF2 binding or inhibition by the fluorescence intensity.
  • a synthetic oligonucleotide TLM-06 corresponding to the nucleic acid A2 and a synthetic oligonucleotide TLM-01-5F corresponding to the nucleic acid A1 whose 5 ′ end is labeled with FAM (fluorescent substance) are double-stranded in 20 ⁇ L. It was mixed in the forming solution (10 mM HEPES-NaOH (pH 7.9), 50 mM KCl, 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 2.5 mM DTT, 10% Glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630).
  • T01F / 06 corresponding to the nucleic acid double strand A having a single strand at the end was prepared by heat denaturation and annealing.
  • T01C / 06 has a TRF2 binding sequence.
  • T02D / 05 corresponding to the nucleic acid double-stranded B having a single strand at the terminal was prepared by heat denaturation and annealing.
  • T02D / 05 has a TRF2 binding sequence. All synthetic oligonucleotides were used at 20 pmol. For all of the labels thereafter, those produced by requesting synthesis from Japan Bioservice were used.
  • Heat denaturation and annealing were performed under the following temperature conditions. 95 °C 120 seconds-90 °C 30 seconds-85 °C 90 seconds-80 °C 90 seconds-77 °C 90 seconds-75 °C 90 seconds-72 °C 90 seconds-70 °C 90 seconds-67 °C 90 seconds-65 °C 90 seconds- 62 °C 90 seconds-60 °C 90 seconds-57 °C 90 seconds-55 °C 90 seconds-52 °C 90 seconds-50 °C 90 seconds-47 °C 90 seconds-45 °C 90 seconds-42 °C 90 seconds-40 °C 90 seconds- 37 °C 90 seconds-35 °C 90 seconds-32 °C 90 seconds-30 °C 90 seconds.
  • TLM-01-5F 5 'FAM- AGTTGAG TTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGG G CAGGcggtg tctcgctcgc 3' (SEQ ID NO: 1)
  • TLM-02-3D 5 'gcgagcgagacaccgCCTG C CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAA CTCAACT -Dabcyl 3' (SEQ ID NO: 2)
  • TLM-05 5'AGTTGAG TTA GGGTTAGGGT TAGGGTTAGG G CAGGcacca caccattccc 3 '(SEQ ID NO: 3)
  • TLM-06 5'gggaatggtg tggtgCCTG C CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAA CTCAACT 3 '(SEQ ID NO: 3)
  • TLM-06 5'gggaatggtg tggtgCCTG C CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAA CTCAACT 3 '
  • reaction solution 10 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 150 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630, 20 ⁇ L
  • reaction solution 10 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 150 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630, 20 ⁇ L
  • 100 fmol of T02D / 05 was added to T01F / 06 to make 50 ⁇ L, followed by reaction at 25 ° C. for 120 minutes.
  • the fluorescence value of Cy3 was measured using a fluorescence plate reader EnVision (Perkin elmer).
  • compound # 10 having the following chemical formula was obtained as a compound having a high detected fluorescence intensity, that is, inhibiting the binding of TRF2 to the binding site.
  • R 1 is oxygen or sulfur; R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group; R 3 is hydrogen, nitro group, methyl group, methoxy group or butyl group, R 5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group, R 6 is hydrogen or a butyl group.
  • each of the above compounds is synthesized by a usual synthesis method.
  • the synthesis method of Compound # 198 is shown below.
  • HeLa 1.2.11 cells were treated with compound # 198 (20 ⁇ M) or DMSO as a control for 24 hours, and then fixed with 1% formaldehyde. Thereafter, the cells were lysed with Lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)), and chromatin was fragmented by ultrasound. Thereafter, chromatin immunoprecipitation was performed using TRF2 antibody (santacruz, sc-8528) or normalmouse IgG (santacruz, sc-2025), and DNA was adsorbed to Hybond N + membrane (Amersham, RPN82B), followed by DIG-labeled telomere probe.
  • Lysis buffer 1% SDS, 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  • chromatin was fragmented by ultrasound.
  • chromatin immunoprecipitation was performed
  • FIG. 3A is a photograph of HybondN + membrane
  • FIG. 3B is a graph showing the result of calculating the amount of telomeric DNA by quantifying the signal.
  • telomeric DNA As shown in FIG. 3, the detection of telomeric DNA was suppressed to 50% or less when Compound # 198 was treated as compared with the control using DMSO. This result suggests that Compound # 198 inhibits TRF2 from binding to telomeric DNA.
  • HeLa 1.2.11 cells seeded on an 8 well tissue culture culture slide (Matsunami Glass Industry, scs-008) were treated with Compound # 198 (20 ⁇ M) or DMSO as a control for 24 hours. Thereafter, the plate was washed twice with PBS ( ⁇ ), treated with 0.25% Triton X-100 (WAKO, 591-1191) / PBS ( ⁇ ) for 2 minutes on ice, and treated with 4% paraformaldehyde (MERCK, 1. (04.05.1000) / PBS ( ⁇ ) was treated at room temperature for 15 minutes and then washed twice with PBS ( ⁇ ).
  • Triton X-100 / PBS 0.5% Triton X-100 / PBS ( ⁇ ) was treated on ice for 10 minutes, and then washed 5 times with PBS ( ⁇ ).
  • a TRF2 antibody Novus, NB100-56506
  • 3% BSA / 0.05% Tween / PBS diluted 200-fold with 3% BSA / 0.05% Tween / PBS ( ⁇ ) was reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then twice with PBS ( ⁇ ). Washed.
  • AlexaFluor 488 Goat anti-mouse IgG (invitrogen, A11001) diluted 500-fold with 3% BSA / 0.05% Tween / PBS (-) was reacted at room temperature for 45 minutes and washed three times with PBS (-) Then, 0.25 ⁇ g / mL DAPI (Dojindo Laboratories, 340-07971) was reacted at room temperature for 5 minutes and washed 3 times with PBS ( ⁇ ). After enclosing the slide glass, the slide glass was observed with a fluorescence microscope (Zwiss, Axiovert 200M). The number of TRF2 foci in the nucleus was measured using image analysis software Columbias.
  • FIG. 4A is a photograph of a cell obtained using a fluorescence microscope.
  • an enlarged white square is indicated by “Enlarged”, and an arrow in “Enlarged”.
  • FIG. 4B is a graph showing the ratio of the number of TRF2foci when the number of TRF2foci in the nucleus is measured using a fluorescence microscope and the control is 1.00.
  • TRF2 is present in the nucleus stained with DAPI, and TRF2 is considered to be bound to DNA in the nucleus.
  • TRF2 is considered to be bound to DNA in the nucleus.
  • cells treated with compound # 198 much of TRF2 is present outside the cell nucleus. This result suggests that Compound # 198 inhibits TRF2 from binding to the TRF2 binding site of DNA in the nucleus.
  • telomere FISH telomere FISH
  • HeLa 1.2.11 cells seeded on 8-well tissue culture culture slides were treated with Compound # 198 (10 ⁇ M) or DMSO as a control for 24 hours. Thereafter, the plate was washed twice with PBS ( ⁇ ), treated with 0.25% Triton X-100 (WAKO, 591-1191) / PBS ( ⁇ ) for 2 minutes on ice, and treated with 4% paraformaldehyde (MERCK, 1. (04.005.1000) / PBS ( ⁇ ) was treated at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the plate was washed twice with PBS ( ⁇ ), treated with 0.5% Triton X-100 / PBS ( ⁇ ) on ice for 10 minutes, and then washed 5 times with PBS ( ⁇ ).
  • Compound # 198 10 ⁇ M
  • DMSO DMSO
  • Blocking solution (1 mg / ml BSA, 3% goatserum, 0.1% Triton X-100, 1 mM EDTA pH 8.0) was treated at room temperature for 30 minutes, and 53BP1 antibody (Novus, NB100) diluted 1000 times with Blocking solution. -304) was reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then washed twice with PBS ( ⁇ ).
  • Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG invitrogen, A11008
  • Blocking solution was reacted at room temperature for 45 minutes, washed 3 times with PBS ( ⁇ ), and 4% paraformaldehyde / PBS ( ⁇ ) at room temperature.
  • FIG. 5A is a photograph of a cell obtained using a fluorescence microscope, and the arrow indicates a portion where co-localization between telomere and 53BP1 is observed.
  • FIG. 5B is a graph showing the result of calculating the ratio by measuring the number of cells in which co-localization occurs, that is, TIF occurs, using a fluorescence microscope.
  • telomere abnormality As described above, it is thought that Compound # 198 promotes telomere abnormality.
  • telomere abnormalities are known to be related to cell aging and cell death, whether or not compound # 198 causes cell apoptosis was examined using FACS. The method and result will be described below.
  • the HeLa 1.2.11 cells were treated with 20 ⁇ M compound # 198 or DMSO for 48 hours, and then the cells together with the supernatant were collected in a 15 mL tube, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. The cells were resuspended with 5 ml of PBS ( ⁇ ), centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. Resuspend the cells with 500 ⁇ l of 1 ⁇ Binding buffer (MBL, 4695-300), transfer 90 ⁇ l of this to a 5 mL tube (BDAlcon, 352052), and add 10 ⁇ l of Annexin V-FITC (MBL, 4700-100). Stained. The sample was incubated for 15 minutes in the dark and analyzed. Annexin V-positive cells were detected with a Cellsorter (SONY, SH-800). The results are shown in FIG.
  • compound # 198 induces cellular apoptosis by another method
  • compound # 198 promoted the expression of truncated caspase 3, which is known as a crucial factor in apoptosis? Whether or not was analyzed by Western blotting. The method and result will be described below.
  • a 10 ⁇ g sample was run on an 8% acrylamide gel in a running buffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% (w / v) SDS) at a constant voltage (120 V). Thereafter, the protein was transferred to a PVDF membrane filter Immobilon-P (MILLIPORE), and the target protein was detected using an antigen-antibody reaction.
  • the antibodies used were B-actin (SIGMA, A5441) or Cleavedcase 3 (CST, D175) as the primary antibody, and Peroxidase-labeled Goat anti-mouse / anti-rabbit secondary antibody (Jackson Immuno-Research, 111-035-003 /) as the secondary antibody. 115-035-003), and the signal was detected using a luminoanalyzer (ImageQuant, LAS4000). The result is shown in FIG.
  • HeLa 1.2.11 cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / 35 mm dish, and the following day, compound # 198 (5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M) or DMSO as a control was treated (the treatment day is the first day). Cells were counted on day 1, day 3, day 5 and day 7. The result is shown in FIG.
  • FIG. 9A shows a photograph of the Giemsa-stained plate
  • FIG. 9B is a graph showing the result of calculating the colony generation rate.
  • the compound according to the present invention inhibits telomere binding of telomere-binding protein, and as a result, inhibits G tail formation in telomere and shortens G tail.
  • the compound according to the present invention is thought to cause cell growth inhibition and induction of apoptosis. Therefore, the compound according to the present invention may be used as a reagent for inducing cell senescence or cell death, and further has potential for application to the development of therapeutic agents for various diseases such as cancer.

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Abstract

本発明に係る化合物は、下記化学式で示される化合物であって、 上記化学式中において、Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択されることを特徴とする。

Description

テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤
　本発明は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤に関する。
　ヒトの染色体ＤＮＡの末端には、テロメアとよばれる５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’の繰り返し配列からなる二本鎖ＤＮＡが存在する。テロメアの最末端は、３’末端が突出しており、Ｇテイルと呼ばれる７５～３００塩基の一本鎖ＤＮＡ部分が形成されている。通常、Ｇテイルは、テロメア延長酵素であるテロメラーゼがアクセスする場合やＤＮＡの複製時以外は、ループを形成して保護された状態となっている（例えば、非特許文献１参照）。
　従来から、テロメアのうち大部分を占める２本鎖部分は、細胞分裂が繰り返される度に短くなり、これが細胞老化に関与することが知られている。また、近年、二本鎖テロメアＤＮＡには結合しないがＧテイルには結合するタンパク質であるＰＯＴ１やそれらに結合するタンパク質ＰＩＰ１などが発見された。さらに、テロメアのＧテイルが、２本鎖部分とは全く異なる機能、例えば、下記のように細胞死の直接的シグナルや様々な細胞応答等に関係していることが明らかになってきた。
　テロメアにはそれに結合するテロメア結合タンパク質が存在し、該テロメア結合タンパク質は、ＴＲＦ１（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ　ｒｅｐｅａｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）及びＴＲＦ２等が知られているが、癌細胞では、ＴＲＦ２がないと、Ｇテイルのループ形成ができなくなり、Ｇテイルの短縮が起こることが明らかとなっている（例えば、非特許文献２参照）。この場合、テロメア全長には変化が見られないにもかかわらず、Ｇテイルの短縮がみられ、さらには染色体末端の融合を引き起こしている。正常細胞の場合も、ＴＲＦ２の機能を細胞内で消失させるとＧテイルの短縮がおこり細胞増殖が停止して、老化することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。この場合も、テロメア全長は変化しないことから、Ｇテイルの短縮が老化の引き金になっていると考えられている。
　上記ＴＲＦ１やＴＲＦ２のみならず、ＡＴＭ、ＮＢＳ１、ＭＲＮなど様々なタンパク質がＧテイルのループ形成に要求されることが分かってきている。様々なＤＮＡ傷害剤や放射線によるＤＮＡの傷害に感受性のシグナルでは、テロメアの短縮が見られなくてもＧテイルの短縮がみられる。これは、ＤＮＡの修復に必要なタンパク質（ＡＴＭ、ＮＢＳ１及びＭＲＮなど）がリクルートされてくることからも明らかである。ＡＴＭは、血管拡張性疾患の原因遺伝子、ＮＢＳ１は、ナイミーヘン症候群の原因遺伝子である。なお、ナイミーヘン症候群は、高発ガン性、免疫不全、染色体不安定性、放射線感受性を特徴とする稀な常染色体劣性遺伝疾患である。これらのタンパク質がＧテイルにリクルートされることは、上記各疾患との関わりを示している。実際に、Ｇテイルのループののり付けとして機能しているＴＲＦ２の機能を阻害すると、ＡＴＭに依存したアポトーシスが誘導される（例えば、非特許文献３参照）。
　さらに、Ｇテイルに特異的に作用する抗癌剤は、テロメアの短縮を伴わずにＧテイルの短縮を引き起こし、癌細胞を死に至らしめることも分かってきている（例えば、非特許文献４参照）。これらの結果から、ＤＮＡ障害をもたらす薬剤やストレスが、Ｇテイルを介して細胞にシグナルを伝え、様々な細胞応答を引き起こしているものと考えられる。また、多くの癌で変異が知られている癌抑制遺伝子産物ｐ５３は、Ｇテイルに結合していることもわかっており（例えば、非特許文献５参照）、癌及び老化に伴う疾患でもＧテイルの変化がシグナルとなっていることが明らかである。
特許第５６５２８５０号公報
グリフィス・ジェイ・ディー，コミュー・エル，ローゼンフィールド・エス，スタンセル・アール・エム，ビアンチ・エー，モス・エイチ及びデ・ランジェ・ティ(Griffith JD，Comeau L，Rosenfield S，Stansel RM，Bianchi A，Moss H and de Lange T.），Cell: 97(1999)，503-14. ファン・スティーンセル・ビィ，スモゴルゼウスカ・エイ及びデ・ランジェ・ティ．（van Steensel B，Smogorzewska A and de LangeT.），92(1998)，Cell :401-13. カールセダー・ジェイ，ブロッコリ・ディ，ダイ・ワイ，ハーディ・エス及びデ・ランジェ・ティ．（Karlseder J，Broccoli D，Dai Y，Hardy S and de Lange T.），Science: 283(1999)，1321-5. ゴメス・ディー，パテルスキ・アール，レマルテリュー・ティー，シン‐ヤ・ケイ，メルグニージェイ・エル及びリュオウ・ジェイ・エフ．（Gomez D，Paterski R，Lemarteleur T，Shin-Ya K，Mergny JL and Riou JF.），J Biol Chem:279(2004)，41487-94. スタンセル・アール・エム，サブラマニアン・ディー及びグリフィス・ジェイ・ディー．（Stansel RM，Subramanian D and Griffith JD.），J Biol Chem: 277(2002)，11625-8.
　上述のように、テロメア結合タンパク質がＧテイルの維持に重要であるため、テロメア結合タンパク質を阻害することが種々の疾患の診断や治療薬開発などに利用できる可能性があると考えられる。しかしながら、テロメア結合タンパク質を阻害するような化合物は知られていない。
　本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物を得ることにあり、また、当該化合物を疾患の診断や治療等に適用できるようにすることにある。
　前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物を見出して本発明を完成した。
　具体的に、本発明に係る化合物は、下記化学式で示される化合物であることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記化学式中において、
　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
　Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択される。
　また、本発明に係る化合物は、上記化学式中において、
　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
　Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
　Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
　Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
　Ｒ６は、水素又はブチル基であることが好ましい。
　また、本発明に係る化合物は、下記化学式のいずれかで示されることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004

 
　本発明に係る化合物によると、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できるため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害できる。その結果、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。従って、本発明に係る化合物は、細胞老化や細胞死を誘導する試薬として利用できる可能性があり、さらには、癌等の種々の疾患の治療薬開発等への応用の可能性もある。
　本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤は、上記化合物のいずれかを含むことを特徴とする。
　本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤において、テロメア結合タンパク質は、例えばＴＲＦ１、ＴＲＦ２又はＰＯＴ１等である。
　本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤によると、上記化合物を含むため、上述の通り、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できる。このため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害でき、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。
　以上から、本発明に係る上記化合物は、癌の治療や予防に利用できると考えられ、このため、本発明は上記の化合物を含む癌の治療又は予防用医薬組成物に関し、癌の治療又は予防用医薬組成物を製造するための上記化合物の使用にも関する。さらに、本発明は、上記の化合物を癌患者の癌を治療又は予防するために投与することを含む方法にも関する。
　本発明に係る化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤によると、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できるため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害できる。その結果、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。
本発明の実施例におけるＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイを説明するための図である。 本発明の実施例におけるＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイを説明するための図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討したクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイの結果を示す図である。（ａ）はＣｈＩＰアッセイの結果を示すメンブレンの写真であり、（ｂ）は（ａ）に示す結果について、画像解析ソフトを用いてシグナルを定量し、１０％ｉｎｐｕｔに対するＴＲＦ２抗体による免疫沈降物中のテロメアＤＮＡ量を算出した結果を示すグラフである。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討した蛍光免疫染色試験の結果を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡で得られた写真であり、（ｂ）は（ａ）示す結果について、画像解析ソフトを用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測した結果を示すグラフである。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討したテロメアＦＩＳＨ試験の結果を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡で得られた写真であり、（ｂ）は（ａ）示す結果について、画像解析ソフトを用いてテロメアに局在している５３ＢＰ１（ＴＩＦ）を計測した結果を示すグラフである。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞のアポトーシスの誘導効果を検討したＦＡＣＳ試験の結果を示す図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞のアポトーシスの誘導効果を検討したウエスタンブロット試験の結果を示す図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞増殖抑制効果を検討した細胞増殖試験の結果を示す図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞増殖抑制効果を検討したコロニーフォーメーションアッセイの結果を示す図である。（ａ）は各条件での培養プレートを示す写真であり、（ｂ）は（ａ）に示す結果からコロニー数を計測した結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
　本実施形態に係る化合物は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物である。また、本実施形態に係る化合物は、下記化学式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　なお、上記化学式中において、
　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
　Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択される。
　また、本実施形態に係る化合物は、上記化学式中において、
　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
　Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
　Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
　Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
　Ｒ６は、水素又はブチル基であることが好ましい。
　本実施形態において、テロメア結合タンパク質は、例えばＴＲＦ１、ＴＲＦ２及びＰＯＴ１等である。また、本実施形態において、上記化合物は、特に当該テロメア結合タンパク質がテロメアに結合することを阻害する。
　本実施形態における化合物はこのような特徴を有するため、テロメア結合タンパク質阻害剤に利用することもでき、さらに、癌の治療又は予防用の医薬組成物に利用することもできる。
　以下に、本発明に係る化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質を詳細に説明するための実施例を示す。
　まず、ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイ（上記特許文献１の特に第一の態様を参照）を用いて、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物をスクリーニングした。なお、候補化合物には、独立行政法人産業技術総合研究所が保有する化合物ライブラリーの１２２１２種の化合物を用いた。ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイの原理は特許文献１に記載されているが、以下にも簡単に説明する。
　特許文献１に示すように、ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイは、二つの核酸二本鎖部分（核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂ）がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）の構造変化により生じる新たな核酸二本鎖の量を測定することを特徴とする方法である。本願の図１に示すように、核酸二本鎖Ａは、核酸一本鎖である核酸Ａ１と核酸一本鎖である核酸Ａ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ｂと結合し得る核酸二本鎖である。核酸二本鎖Ｂは、核酸一本鎖である核酸Ｂ１と核酸一本鎖である核酸Ｂ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ａと結合し得る核酸二本鎖である。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ａ１：第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ａ２：第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ１：第二のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ２：第三のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１及び核酸Ｂ２の具体的な構造の一態様は、本願の図１に示すとおりである。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２については、核酸結合タンパク質の結合部位を有するように設計される。本実施例では、テロメア結合タンパク質のテロメア配列への結合及びその阻害を評価することを目的とするため、上記核酸結合タンパク質の結合部位は、テロメア結合タンパク質、特にＴＲＦ２の結合配列とした。配列の詳細は後に説明する。
　当該方法は、核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを利用するものである。核酸Ａ１及び核酸Ａ２で構成された核酸二本鎖Ａと、核酸Ｂ１及び核酸Ｂ２で構成された核酸二本鎖Ｂがそれらの末端配列において互いに結合してなる核酸二本鎖複合体は、鎖交換反応により構造変化をする。具体的に、図２（ａ）に示す核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂの末端配列が互いに結合する核酸二本鎖複合体が、鎖交換反応により図２（ｂ）に示す構造に変化し、さらに図２（ｃ）に示す構造に変化する。なお、図２（ａ）～（ｃ）の構造変化は可逆的変化である。図２（ｃ）に示す構造から、さらに鎖交換反応が進行することにより、図２（ｄ）に示すように、核酸Ａ１及び核酸Ｂ１で構成された核酸二本鎖Ｃと、核酸Ａ２及び核酸Ｂ２で構成された核酸二本鎖Ｄとが生成される。なお、図２（ｃ）から（ｄ）への構造変化は不可逆反応である。これに対して、核酸結合タンパク質（テロメア結合タンパク質）が核酸二本鎖Ａ又は核酸二本鎖Ｂのいずれかに結合すると上記構造変化は阻害される。具体的に、図２（ｅ）に示すように、核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂで構成された核酸二本鎖複合体に核酸結合タンパク質が結合した場合、図２（ｆ）に示すように鎖交換反応によって、ある程度の構造変化が進むものの、タンパク質が結合した部分においてタンパク質が鎖交換反応を阻害する。よって、この部分において鎖交換反応が中断されて、その結果、図２（ｇ）に示す構造には変化することができない。
　従って、核酸二本鎖Ａ、Ｂと、核酸二本鎖Ｃ、Ｄとの量を測定することによって、上記鎖交換反応による構造変化の程度、すなわち、テロメア配列へのテロメア結合タンパク質の結合の程度を測定することができる。このような測定は、核酸二本鎖を標識することにより容易に行うことができる。以下の方法に限られないが、例えば核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１の３’末端を消光物質で標識し、当該蛍光物質の蛍光強度を測定することによって、テロメア配列へのテロメア結合タンパク質の結合程度の測定が可能となる。
　例えば、核酸Ａ１のうち、５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１のうち、３’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識した場合、図２（ａ）に示すように核酸二本鎖Ａ、Ｂにより核酸二本鎖複合体が形成されている時は蛍光を発する。一方、鎖交換反応が進行し、図２（ｂ）、（ｃ）に示すように、核酸Ａ１の５’末端と核酸Ｂ１の３’末端とが近づく、すなわち蛍光物質と消光物質とが近づくに従って、蛍光強度が低減する。さらに、鎖交換反応が進行し、図２（ｄ）に示すように、最終産物である核酸二本鎖Ｃ及び核酸二本鎖Ｄを形成すると、核酸Ｂ１の標識によって消光される。このため、蛍光値を測定することにより、容易に核酸二本鎖複合体と、核酸二本鎖Ｃ及び核酸二本鎖Ｄの量を測定することができる。なお、蛍光物質及び消光物質で標識する位置の組合せは、上記位置の組合せに限らず、鎖交換反応の進行で蛍光物質と消光物質との距離が近接する又は離間する位置であればよい。また、消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
　以上の通り、ＴＲＦ２結合部位を有する上記核酸のいずれかにＴＲＦ２が結合しない場合（結合が阻害されている場合）は、上記鎖交換反応が進行して蛍光物質と消光物質の位置が近接することにより消光され、一方、ＴＲＦ２が結合する場合は、上記鎖交換が進行せず、蛍光物質と消光物質とが離間しているため蛍光が発せられる。すなわち、本方法によると、蛍光強度により、ＴＲＦ２の結合又はその阻害の程度を測定することが可能となる。
　以下に、本実施例で行ったＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイの方法及び結果を説明する。
　まず、上記核酸Ａ２に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０６と、５’末端をＦＡＭ（蛍光物質）で標識した上記核酸Ａ１に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０１－５Ｆとを、２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ－６３０）中に混合した。その後、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ上記核酸二本鎖Ａに対応する二本鎖Ｔ０１Ｆ／０６を調製した。Ｔ０１Ｃ／０６はＴＲＦ２結合配列を持つ。また、上記核酸Ｂ２に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０５と、３’末端をＤａｂｃｙｌ（消光物質）で標識した上記核酸Ｂ１に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０２－３Ｄとを、２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０）中に混合した。その後、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ上記核酸二本鎖Ｂに対応する二本鎖Ｔ０２Ｄ／０５を調製した。Ｔ０２Ｄ／０５はＴＲＦ２結合配列を持つ。合成オリゴヌクレオチドは全て２０ｐｍｏｌ使用した。なお、以後すべての標識については、日本バイオサービス社に合成を依頼して作製されたものを使用した。
　加熱変性とアニーリングは以下の温度条件で行った。
95℃ 120秒 - 90℃ 30秒 - 85℃ 90秒 - 80℃ 90秒 - 77℃ 90秒 - 75℃ 90秒 - 72℃ 90秒 - 70℃ 90秒 - 67℃ 90秒 - 65℃ 90秒 - 62℃ 90秒 - 60℃ 90秒 - 57℃ 90秒 - 55℃ 90秒 - 52℃ 90秒 - 50℃ 90秒 - 47℃ 90秒 - 45℃ 90秒 - 42℃ 90秒 - 40℃ 90秒 - 37℃ 90秒 - 35℃ 90秒 - 32℃ 90秒 - 30℃ 90秒。
　使用した配列は以下の通りである。なお、下線を引いた部分はＴＲＦ２結合配列であり、小文字の部分は核酸複合体を形成した際に一本鎖となる配列である。
ＴＬＭ－０１－５Ｆ：
5’ FAM- AGTTGAGTTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GCAGGcggtg tctcgctcgc  3’（配列番号１）
ＴＬＭ－０２－３Ｄ：
5’ gcgagcgagacaccgCCTGC CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAACTCAACT -Dabcyl  3’（配列番号２）
ＴＬＭ－０５：
5’AGTTGAGTTA GGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GCAGGcacca caccattccc  3’（配列番号３）
ＴＬＭ－０６：
5’gggaatggtg tggtgCCTGC CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAACTCAACT  3’（配列番号４）
　１００ｆｍｏｌのＴ０１Ｆ／０６と５０μＭの候補化合物を反応溶液（１０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、２０μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。その後、Ｔ０１Ｆ／０６に、１００ｆｍｏｌのＴ０２Ｄ／０５をそれぞれ加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させた。Ｃｙ３の蛍光値の測定は、蛍光プレートリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　ｅｌｍｅｒ社）を用いた。
　候補化合物のスクリーニングの結果、検出された蛍光強度が大きく、すなわち、ＴＲＦ２がその結合部位に結合することを阻害する化合物として下記化学式をもつ化合物＃１０が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　
　また、得られた化合物＃１０の構造に基づいて、これと類似する構造を有する化合物を合成し、上記スクリーニングを行った。その結果、検出された蛍光強度が大きく、ＴＲＦ２がその結合部位に結合することを阻害する化合物は以下の表１に示すとおりである。なお、候補化合物を反応溶液に混合していないコントロールの場合の蛍光強度を基準として、各化合物を反応溶液に混合した場合の蛍光強度の低減率を阻害率として算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008

 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　上記表１に示した化合物は、下記化学式を共通の骨格として有していることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　なお、上記化学式中において、
　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
　Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
　Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
　Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
　Ｒ６は、水素又はブチル基である。
　また、上記各化合物は、通常の合成法にて合成されるものである。例として、以下に化合物＃１９８の合成方法を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　その他の化合物においても、当業者であれば上記化合物＃１９８の合成法の部分的変更、すなわち原料であるアミノフェノール誘導体およびハロゲン化アリールとして適当な置換其を有するものを用いることによって容易に合成可能である。例えば化合物＃２０７では、上記化合物＃１９８の合成法のうち［化６］中の２から３への合成を、２，４，６‐トリニトロクロロベンゼンの代わりに４-ヨードアニソールを用いることは、当業者には容易に想到可能である。
　ここで、本実施例で用いた他の化合物の具体的な合成法を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013

 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　次に、上記スクリーニングの結果において、比較的に高いＴＲＦ２の阻害効果が認められた化合物＃１９８を用いて、ＴＲＦ２の阻害効果についてさらに検討した。そのために、ＴＲＦ２抗体を用いたクロマチン免疫沈降試験（ＣｈＩＰアッセイ）を行った。その方法及び結果を以下に説明する。
　ＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物＃１９８（２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理後、１％ホルムアルデヒドで固定した。その後、細胞をＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で溶かし、超音波によりクロマチンを断片化した。その後、ＴＲＦ２抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ社，ｓｃ－８５２８）又はｎｏｒｍａｌｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ－２０２５）を用いてクロマチン免疫沈降を行い、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＲＰＮ８２Ｂ）にＤＮＡを吸着後、ＤＩＧ標識テロメアプローブ（Ｄｉｇｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｉｌｉｎｇｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、０３ ３５３ ５８３９１０）を用いて、１００ｐｍｏｌの３’－（ＣＣＣＴＡＡ）４－５’オリゴヌクレオチドの３’末端に、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎを標識したもの）を反応させ、ルミノアナライザー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ社、ＬＡＳ４０００）にてシグナルを検出した。画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いてシグナルを定量し、１０％ｉｎｐｕｔに対するＴＲＦ２抗体による免疫沈降物中のテロメアＤＮＡ量を算出した。その結果を図３に示す。なお、図３（ａ）はＨｙｂｏｎｄＮ＋ メンブレンの写真であり、（ｂ）は上記シグナル定量をしてテロメアＤＮＡ量を算出した結果を示すグラフである。
　図３に示すように、ＤＭＳＯを用いたコントロールと比較して、化合物＃１９８を処理した場合ではテロメアＤＮＡの検出は５０％以下に抑制された。この結果から、化合物＃１９８によって、ＴＲＦ２がテロメアＤＮＡに結合することが阻害されることが示唆される。
　次に、化合物＃１９８の処理の有無によるＴＲＦ２の細胞内局在を蛍光免疫染色法で検討した。その方法及び結果を以下に説明する。
　８ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライド（松波硝子工業、ｓｃｓ－００８）に播種したＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物＃１９８（２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＷＡＫＯ社，５９１－１２１９１）／ＰＢＳ（－）を氷上で２分間処理し、４％　パラホルムアルデヒド（ＭＥＲＣＫ社，１．０４００５．１０００）／ＰＢＳ（－）を室温で１５分間処理した後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。さらに０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）を氷上で１０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で５回洗浄した。次に、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（－）で２００倍希釈したＴＲＦ２抗体（Ｎｏｖｕｓ社、ＮＢ１００－５６５０６）を３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次に、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（－）で５００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ１１００１）を室温で４５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（同仁化学研究所、３４０－０７９７１）を室温で５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。スライドガラスを封入後、蛍光顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ　２００Ｍ）にて観測した。画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓを用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測した。その結果を図４に示す。なお、図４（ａ）は、蛍光顕微鏡を用いて得られた細胞の写真であり、図４（ａ）において、白い四角の領域を拡大したもの「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」で示し、「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」中の矢印は核外に存在するＴＲＦ２を示す。図４（ｂ）は、蛍光顕微鏡を用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測し、コントロールを１．００としたときのＴＲＦ２ｆｏｃｉ数の割合を示すグラフである。
　図４に示すように、ＤＭＳＯで処理されたコントロールでは、ＤＡＰＩにより染まった核内にＴＲＦ２が存在し、ＴＲＦ２が核内のＤＮＡに結合していると考えられる。一方、化合物＃１９８により処理された細胞では、ＴＲＦ２の多くが細胞の核の外側に存在している。この結果から、化合物＃１９８によってＴＲＦ２が核内でＤＮＡのＴＲＦ２結合部位に結合することを阻害することが示唆される。
　次に、テロメアＦＩＳＨ法を用いて、テロメア異常における化合物＃１９８の影響について検討した。具体的に、テロメアにおいて異常が生じると、テロメアにおける５３ＢＰ１の局在を特徴とするＴＩＦ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｆｏｃｉ）が生じることが知られているため、テロメアＦＩＳＨ法を用いて、化合物＃１９８がテロメアにおける５３ＢＰ１の局在化に影響するか否かを検討した。以下にその方法及び結果を説明する。
　８ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライドに播種したＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物　＃１９８（１０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＷＡＫＯ社，５９１－１２１９１）／ＰＢＳ（－）を氷上で２分間処理し、４％パラホルムアルデヒド（ＭＥＲＣＫ社，１．０４００５．１０００）／ＰＢＳ（－）を室温で１５分間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）を氷上で１０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で５回洗浄した。次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ　（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，３％ ｇｏａｔｓｅｒｕｍ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，　１ｍＭＥＤＴＡ　ｐＨ８．０）を室温で３０分間処理し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎで１０００倍に希釈した５３ＢＰ１抗体（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ１００－３０４）を３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎで５００倍に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１１００８）を室温で４５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（－）を室温で５分間処理し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。その後、７０％，９５％，１００％ＥｔＯＨを順に３，２，２分間処理した。風乾後、Ｃｙ－３標識３’－（ＣＣＣＴＡＡ）４－５’プローブ（ＰＡＮＡＧＥＮＥ社，Ｆ１００２）を８０℃で３分間反応させた。その後、ｗａｓｈｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（７０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．２））　で洗浄し、ＰＢＳ（－）で３回洗浄後、０．２５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを室温で５分間反応させ、さらにＰＢＳ（－）で３回洗浄した。スライドガラスを封入後、蛍光顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）にて観測した。画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓを用いてテロメアに局在している５３ＢＰ１（ＴＩＦ）を計測した。核１個あたりＴＩＦが４個以上あったものをＴＩＦ陽性細胞とした。その結果を図５に示す。なお、図５（ａ）は蛍光顕微鏡を用いて得られた細胞の写真であり、矢印はテロメアと５３ＢＰ１との共局在が見られる部分を示す。図５（ｂ）は、蛍光顕微鏡を用いてその共局在が生じている、すなわちＴＩＦが生じている細胞数を計測し、その割合を算出した結果を示すグラフである。
　図５に示すように、コントロールでは、テロメアと５３ＢＰ１との共局在はほとんど見られなかったが、化合物＃１９８で処理した細胞では、テロメアと５３ＢＰ１との共局在が認められた。すなわち、化合物＃１９８で処理した細胞では、ＴＩＦが生じており、テロメアに異常が生じていると考えられる。これは、化合物＃１９８がＴＲＦ２のテロメアへの結合を阻害していることに起因していると考えられる。
　上記の通り、化合物＃１９８がテロメア異常を促すと考えられる。ここで、テロメア異常は細胞老化や細胞死に関連することが知られているため、化合物＃１９８により細胞のアポトーシスを引き起こすか否かについてＦＡＣＳを利用して検討した。その方法及び結果を以下に説明する。
　ＨｅＬａ１．２．１１細胞を２０μＭの化合物＃１９８又はＤＭＳＯで４８時間処理した後に、上清ごと細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。５ｍｌのＰＢＳ（－）で細胞を再懸濁し１０００ｒｐｍで３分遠心し、上清を除いた。５００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社、４６９５－３００）　で細胞を再懸濁し、このうち９０μｌを５ｍＬチューブ（ＢＤＦａｌｃｏｎ社、３５２０５２）へ移し、１０μｌのＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ（ＭＢＬ社、４７００－１００）を加え染色した。遮光した状態で１５分インキュベートし、解析を行った。Ｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ（ＳＯＮＹ社、ＳＨ－８００）にてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞を検出した。結果を図６に示す。
　図６に示すように、ＤＭＳＯ処理したコントロールと比較して、化合物＃１９８で処理した場合では多くの細胞がＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性であった。すなわち、化合物＃１９８によって細胞のアポトーシスが誘導されることが示唆される。
　さらに、別の方法により化合物＃１９８によって細胞のアポトーシスが誘導されることを証明するために、アポトーシスの極めて重要な因子として知られている切断型カスパーゼ３の発現が化合物＃１９８により促進されるか否かをウエスタンブロット法によって解析した。その方法及び結果を以下に説明する。
　ＨｅＬａ１．２．１１細胞を２０μＭの化合物＃１９８又はＤＭＳＯで４８時間処理した後に、上清と共に細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。細胞ペレットを２×Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（１１７ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１３％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，３．７％ＳＤＳ，２００ｍＭ　ＤＴＴ，０．００４％Ｂｒｏｍｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ）で溶解し、９５℃で５分間熱変性を行った。８％アクリルアミドゲルに１０μｇのサンプルをＲｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（２５　ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中、定電圧（１２０Ｖ）で泳動した。その後、ＰＶＤＦメンブレンフィルター Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写し、抗原抗体反応を用いて目的のタンパクを検出した。用いた抗体は一次抗体にＢ－ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社、Ａ５４４１）又はＣｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ３（ＣＳＴ社、Ｄ１７５）、二次抗体にＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識Ｇｏａｔ抗マウス／抗ラビット二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１－０３５－００３／１１５－０３５－００３）を用い、シグナルの検出はルミノアナライザー　（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ社、ＬＡＳ４０００）を用いて検出した。その結果を図７に示す。
　図７に示すように、ＤＭＳＯを処理したコントロールでは、切断型カスパーゼ３はほぼ見られなかったが、一方、化合物＃１９８を処理した細胞では切断型カスパーゼ３が検出された。この結果から、化合物＃１９８によって、切断型カスパーゼ３の生成が促進され、すなわち細胞のアポトーシスが誘導されると考えられる。
　次に、化合物＃１９８の細胞増殖に対する影響を検討した。その方法及び結果を以下に示す。
　ＨｅＬａ１．２．１１細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍｄｉｓｈで播種し、その翌日に、化合物＃１９８（５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを処理し（処理日を１日目とする）、１日目、３日目、５日目及び７日目に細胞を計数した。その結果を図８に示す。
　図８に示すように、化合物＃１９８の処理濃度依存的に、細胞増殖が抑制された。
　また、＃１９８以外における上記各候補化合物によるＨｅＬａ１．２．１１細胞の増殖に対する抑制効果を上記と同様に測定し、ＩＣ５０を算出した結果を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 
　表２に示すように、化合物＃１９８以外の候補化合物も細胞増殖の抑制効果を奏することが明らかである。
　次に、ＨｅＬａ１．２．１１細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍｄｉｓｈに播種した翌日に化合物＃１９８（５～２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを処理し、播種してから１０日後、形成されたコロニーを１００％ＥｔＯＨで固定後、４％ギムザ染色液（武藤化学株式会社、１５００－２）／ＰＢＳ（－）を用いて染色し、計測した。その結果を図９に示す。なお、図９（ａ）は上記ギムザ染色をしたプレートの写真を示し、図９（ｂ）コロニーの生成割合を算出した結果を示すグラフである。
　図９に示すように、化合物＃１９８の処理濃度依存的にコロニーの生成が抑制された。
　以上、各実施例の結果から、本発明に係る化合物は、テロメア結合タンパク質のテロメア結合を阻害し、その結果、テロメアにおけるＧテイル形成を阻害して、Ｇテイルを短縮させると考えられる。これにより、本発明に係る化合物は、細胞の増殖抑制及びアポトーシスの誘導を引き起こすと考えられる。従って、本発明に係る化合物は、細胞老化や細胞死を誘導する試薬として利用できる可能性があり、さらには、癌等の種々の疾患の治療薬開発等への応用の可能性もある。

Claims (8)

  1. 　下記化学式で示される化合物であって
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    　上記化学式中において、
    　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    　Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択されることを特徴とする化合物。
  2. 　上記化学式中において
    　Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    　Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
    　Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
    　Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
    　Ｒ６は、水素又はブチル基である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
  3. Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002

    　上記化学式のいずれかで示されることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
  4. 　テロメア結合タンパク質がテロメアに結合することを阻害するための請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物を含むテロメア結合タンパク質阻害剤。
  5. 　前記テロメア結合タンパク質は、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２又はＰＯＴ１であることを特徴とする請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。
  6. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物を含む癌の治療又は予防用医薬組成物。
  7. 　癌の治療又は予防用医薬組成物を製造するための請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  8. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物を癌の治療又は予防のために患者に投与することを含む方法。

     
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