WO2019181235A1 - 脂質化タンパク質の製造方法、及び脂質化タンパク質 - Google Patents

Abstract

本開示は、微生物由来トランスグルタミナーゼの存在下、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物とを反応させて、上記融合タンパク質と上記化合物とがイソペプチド結合によって架橋された脂質化タンパク質を得る工程を備え、上記融合タンパク質は、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有し、上記化合物は、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する、脂質化タンパク質の製造方法を提供する。

Description

脂質化タンパク質の製造方法、及び脂質化タンパク質

　本発明は、脂質化タンパク質の製造方法、及び脂質化タンパク質に関する。

　脂質化タンパク質は、細胞の機能発現及び機能制御の過程における重要な役割を担っている。細胞膜上における脂質化タンパク質の機能を解析することが、種々の疾病を解析するための有用な手段である。そのため、細胞膜上における脂質化タンパク質の機能を解析することが注目されている。また、脂質化タンパク質は、薬物送達キャリアへの係留が可能である等の特性を有している。そのため、脂質化タンパク質の医薬品としての応用も期待される。

　従来、タンパク質の脂質化方法は、反応効率及び部位特異性が低いことに加えて、原料のタンパク質に期待する機能に比べて、得られる脂質化タンパク質の機能が低下する等の課題があった。部位特異的かつ効率的な脂質修飾手段としては、微生物由来トランスグルタミナーゼを利用した脂質化タンパク質の製造方法が検討されている。例えば、非特許文献１には、微生物由来のトランスグルタミナーゼの存在下、リジン残基を含むペプチドを緑色蛍光タンパク質のＣ末端に結合させた融合タンパク質と、グルタミン残基を有するペプチドのＮ末端に脂肪酸を結合させた脂質ペプチドと、を反応させて、脂質化タンパク質を得る方法が記載されている。

Ｈｉｒｏａｋｉ　Ａｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，"Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ　Ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ"、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１１、１７、ｐ.１４００４－１４００８

　脂質化タンパク質を得るために用いる融合タンパク質及び脂質ペプチドの組み合わせによってはトランスグルタミナーゼ反応が進行しづらく、トランスグルタミナーゼ反応の基質が制限される場合がある。タンパク質及び脂質の種類にかかわらず、容易にトランスグルタミナーゼ反応を行うことが可能な脂質化タンパク質の製造方法があれば、有用である。

　そこで、本発明は、脂質化タンパク質に求められる用途等に対応した種々の脂質又は脂溶性ビタミンが導入可能であり、脂質化タンパク質を容易に製造することができる脂質化タンパク質の製造方法及び脂質化タンパク質を提供することを目的とする。

　本発明は一側面において、微生物由来トランスグルタミナーゼの存在下、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物とを反応させて、上記融合タンパク質と上記化合物とがイソペプチド結合によって架橋された脂質化タンパク質を得る工程を備え、上記融合タンパク質は、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有し、上記化合物は、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する、脂質化タンパク質の製造方法を提供する。

　従来法において、グルタミン残基を有するペプチドと脂肪酸との反応によって得られる脂質ペプチドの疎水性が高くトランスグルタミナーゼ反応における反応性が低下する場合等がある。このような場合には、グルタミン残基を有するペプチドに親水性アミノ酸残基を導入することで、脂質ペプチドの水溶性を改善する方法が考えられる。しかし、グルタミン残基を含有するペプチドに親水性のアミノ酸残基を導入すると、微生物由来トランスグルタミナーゼによって基質として認識されづらくなる傾向がある。

　脂質ペプチドが水に溶けにくい場合には、反応系に界面活性剤及び有機溶剤等を添加することで脂質ペプチドを溶解させる対応が考えられる。しかし、微生物由来トランスグルタミナーゼの酵素活性の低下若しくは消失を誘発し得ることから、脂質化タンパク質を得ることが困難になることが懸念される。また、医薬品等への応用を考えると、脂質化タンパク質の製造において有機溶剤等の使用は極力控えることが好ましい。

　上記脂質化タンパク質の製造方法では、従来とは逆に、脂質化させる対象となるタンパク質を含む融合タンパク質がグルタミン残基を有しており、脂質を含む化合物が１級アミノ基を有している。融合タンパク質と１級アミノ基を有する化合物とを、微生物由来トランスグルタミナーゼが基質として認識できる。また、親水性を付与し得る官能基として１級アミノ基を脂質側に導入することで、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物との間で、トランスグルタミナーゼ反応を進行させ、容易に脂質化タンパク質を製造することができる。

　上記化合物は、リジン残基を含有する第二のペプチド、及び、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する脂質ペプチドを含み、上記１級アミノ基が上記リジン残基に由来するものであってもよい。リジン残基を含有する第二のペプチド、及び、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する脂質ペプチドは、微生物由来トランスグルタミナーゼに基質として認識されやすい。上記化合物がこのような脂質ペプチドを含むことで、より容易に脂質化タンパク質を製造することができる。また、上記脂質ペプチドは、ペプチド鎖（第二のペプチド）を有しているため、第二のペプチド部分のアミノ酸残基の種類及び数を調整することができる。これによって、例えば、タンパク質に導入する脂質に応じて、アミノ酸残基の種類及び数等を調整することができる。上記化合物が脂質ペプチドを含むことで、上記製造方法によってタンパク質に後修飾可能な脂質又は脂溶性ビタミンの選択肢を広げることができる。

　上記第二のペプチドは、上記第一のペプチドよりも親水性アミノ酸残基の割合が高くてもよい。第二のペプチドの親水性アミノ酸残基の割合を、第一のペプチドよりも高くすることで、脂質ペプチドの脂質部分に由来する疎水性の程度を弱めて水溶性を改善させることができるため、トランスグルタミナーゼ反応をより進行しやすいものとできる。

　上記第二のペプチドは、ヒスチジン残基、プロリン残基、トリプトファン残基及びアルギニン残基からなる群から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を更に含有してもよい。第二のペプチドが上記アミノ酸残基を含むことで、脂質ペプチドが微生物由来トランスグルタミナーゼによってより認識されやすいものとなり、トランスグルタミナーゼ反応をより進行しやすいものとできる。

　上記脂質部は、炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を含んでもよい。脂質部が上述のような構成を有することによって、得られる脂質化タンパク質が細胞膜により係留しやすいものとなる。

　上記第一のペプチドは、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、及びフェニルアラニン残基からなる群から選ばれる少なくとも一種の疎水性アミノ酸残基を更に含んでもよい。第一のペプチドが上記疎水性アミノ酸残基を含むことで、融合タンパク質における第一のペプチドが微生物由来トランスグルタミナーゼによってより認識されやすいものとなり、トランスグルタミナーゼ反応をより進行しやすいものとできる。

　本発明は別の側面において、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有する融合タンパク質部、及び脂質部又は脂溶性ビタミン部を含み、上記脂質部又は上記脂溶性ビタミン部が、上記第一のペプチドのグルタミン残基とイソペプチド結合によって上記融合タンパク質部と結合している、脂質化タンパク質を提供する。

　上記脂質化タンパク質は、融合タンパク質部がグルタミン残基を有しており、脂質部又は脂溶性ビタミン部がグルタミン残基とイソペプチド結合によって融合タンパク質部と結合する構成を備えることから、容易に合成することができる。

　上記脂質部又は上記脂溶性ビタミン部は、リジン残基を含有する第二のペプチドを有する脂質ペプチド部を含み、上記イソペプチド結合が、上記リジン残基と上記グルタミン残基との結合であってもよい。

　上記第二のペプチドは、上記第一のペプチドよりも親水性アミノ酸残基の割合が高くてもよい。

　上記第二のペプチドは、ヒスチジン残基、プロリン残基、トリプトファン残基及びアルギニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を更に含有してもよい。

　上記脂質部は、炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を有してもよい。脂質が上記のような構成を有することによって、脂質化タンパク質がより細胞膜に係留しやすいものとなる。

　上記第一のペプチドは、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びフェニルアラニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基を更に含有してもよい。

　本発明によれば、求められる用途等に対応した種々の脂質又は脂溶性ビタミンが導入可能であり、脂質化タンパク質を容易に製造することができる脂質化タンパク質の製造方法及び脂質化タンパク質を提供することができる。

図１は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図２は、合成した脂質ペプチドに内包させた蛍光物質（ピレン）の蛍光強度比（Ｉ_３８５／Ｉ_３７３）を測定した結果を示すグラフである。 図３は、合成した脂質ペプチドの円二色性スペクトル測定の結果を示すグラフである。 図４は、合成した脂質ペプチドの円二色性スペクトル測定の結果を示すグラフである。 図５は、実施例１における融合タンパク質と脂質ペプチドの反応結果を示す液体クロマトグラフである。 図６は、実施例１及び２におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図７は、実施例１及び２におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率と反応時間との関係を示すグラフである。 図８は、実施例３及び４におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図９は、実施例３及び４におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率と反応時間との関係を示すグラフである。 図１０は、実施例５及び６におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図１１は、実施例６におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率と反応時間との関係を示すグラフである。 図１２は、実施例３、実施例４及び実施例７～１０におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図１３は、実施例３、実施例４及び実施例７～１０におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率と反応時間との関係を示すグラフである。 図１４は、実施例３、実施例４及び実施例１１～１６におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図１５は、実施例３、実施例４及び実施例１１～１６におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率と反応時間との関係を示すグラフである。 図１６は、実施例３、実施例４、及び実施例８～１０にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図１７は、実施例３、実施例４、及び実施例８～１０にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図１８は、実施例４、及び実施例１１～１６にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図１９は、実施例３、実施例４、及び実施例１１～１６にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図２０は、実施例２５～２８におけるトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図２１は、実施例２１～２２、及び２５～２８にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図２２は、実施例２５～２８にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した状態を示す蛍光顕微鏡写真である。 図２３は、実施例２８にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した状態を示す蛍光顕微鏡写真である。 図２４は、実施例２１及び２２にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図２５は、実施例２６～２８にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図２６は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図２７は、実施例９及び実施例２９～３４にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図２８は、実施例４及び実施例２９～３４にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図２９は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図３０は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図３１は、実施例１１及び実施例４２～４７にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図３２は、実施例１１及び実施例４２～４７にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図３３は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図３４は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図３５は、合成した脂質ペプチドの細胞毒性試験の結果を示すグラフである。 図３６は、合成した脂質ペプチドトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図３７は、合成した脂質ペプチドトランスグルタミナーゼ反応の反応率とＫ／Ｑ比率との関係を示すグラフである。 図３８は、実施例１６及び実施例５５～６４にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図３９は、実施例５５～５７、実施例５９～６３及び実施例６６にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。 図４０は、実施例６７にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞一個当たりの蛍光の発生量を示すグラフである。 図４１は、実施例６８にて得られた脂質化タンパク質及び融合タンパク質を浮遊細胞に適用した後における、細胞毒性の評価結果を示すグラフである。

　以下、場合により図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。ただし、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。

［脂質化タンパク質の製造方法］
　脂質化タンパク質の製造方法の一実施形態は、微生物由来トランスグルタミナーゼの存在下、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物とを反応させて、上記融合タンパク質と上記化合物とがイソペプチド結合によって架橋された脂質化タンパク質を得る工程を備える。上記融合タンパク質は、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有する。上記化合物は、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する。

　本実施形態に係る脂質化タンパク質の製造方法において、グルタミン（Ｑ）残基を含有する第一のペプチドを有する融合タンパク質、及び１級アミノ基を有する化合物がいずれも微生物由来トランスグルタミナーゼによって基質として認識されることから、トランスグルタミナーゼ反応によってイソペプチド結合を形成して、容易に脂質又は脂溶性ビタミンを導入した脂質化タンパク質を得ることができる。

　融合タンパク質が有する第一のペプチドを構成するアミノ酸残基数は、１～２７であってもよく、２～２７であってもよく、２～１０であってもよく、２～８であってもよく、又は２～７であってもよい。第一のペプチドは、例えば、Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフで表されるアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。ここで、ｎは、０～１３の整数であってもよく、１～１３の整数であってもよく、１～９の整数であってもよく、又は１～４の整数であってもよい。ｍは、０～１３の整数であってもよく、１～１３の整数であってもよく、１～９の整数であってもよく、又は１～４の整数であってもよい。Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフ中、複数あるＸ^１、及び複数あるＸ^２は互いに同一であっても異なってもよい。

　Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフにおいて、Ｘ^１は、グルタミン残基及びリジン（Ｋ）残基以外のアミノ酸残基を示す。Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフにおけるＸ^１は、グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、チロシン（Ｙ）残基、プロリン（Ｐ）残基、トリプトファン（Ｗ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基及びアルギニン（Ｒ）残基からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を含んでもよく、又はグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、及びフェニルアラニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基を含んでもよい。

　Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフにおけるＸ^２は、グルタミン残基及びリジン残基以外のアミノ酸残基を示す。Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフにおけるＸ^２は、例えば、メチオニン（Ｍ）残基、アルギニン（Ｒ）残基、グリシン残基及びセリン（Ｓ）残基からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を含んでもよい。

　Ｘ^１ _ｎＱＸ^２ _ｍモチーフで表されるアミノ酸配列は、例えば、ＦＹＰＬＱＭＲＧ、ＬＬＱＧ、及びＡＷＨＲＰＱＦＧＧ等で表されるアミノ酸配列であってよい。

　融合タンパク質を構成するタンパク質は、特に制限されるものではなく、例えば、緑色蛍光タンパク質、抗体、酵素、抗原タンパク質、増殖因子、及び生理活性に作用するホルモン（例えば、インスリン及び成長ホルモン等）等が挙げられる。

　第一のペプチドは、タンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に直接結合してもよく、又はタンパク質のＣ末端若しくはＮ末端に第一のリンカーを結合させ、当該第一のリンカーに結合してもよい。つまり、融合タンパク質は、タンパク質と、第一のリンカーと、第一のペプチドとを有していてもよい。融合タンパク質が第一のリンカーを有する場合、融合タンパク質は、例えば、［タンパク質］－［第一のリンカー］－［第一のペプチド］で表される融合タンパク質が含まれてもよく、［第一のペプチド］－［第一のリンカー］－［タンパク質］で表される融合タンパク質が含まれてもよい。

　第一のリンカーは、１～２０個のアミノ酸残基を含む。第一のリンカーを構成するアミノ酸残基は、グリシン残基、セリン残基及びプロリン残基からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含んでよく、グリシン残基、及びセリン残基からなる群から選択される少なくとも一種のアミノ酸残基を含んでよい。ここで、第一のリンカーを構成するアミノ酸残基数は以下のように決定される。まず、融合タンパク質のアミノ酸残基を解析し、融合タンパク質を構成するタンパク質のＣ末端又はＮ末端に直接接続するアミノ酸残基から第一のペプチドの方向に向かってアミノ酸残基の数を数える。アミノ酸残基の数が２０個となるまでの間にグリシン残基、セリン残基及びプロリン残基以外のアミノ酸残基が検出された場合、検出された当該アミノ酸残基までのアミノ酸残基の数からひとつ減じた数を、第一のリンカーを構成するアミノ酸残基数とする。

　第一のリンカーは、例えば、Ｇ_ｒモチーフ、（Ｇ_ｒＳ）_ｓモチーフ、（ＰＧ_ｒ）_ｓモチーフ、（ＰＧ_ｒＳ）_ｓモチーフ、及び（ＳＧ_ｒＳ）_ｓモチーフ等で表されるペプチドであってよい。ここで、ｒは１～６の整数である。ここで、ｓは１～５の整数である。第一のリンカーは、より具体的には、ＧＧＧＳ、ＰＧＧＧ、ＳＧＧＧＳ、及びＰＧＧＧＳ等が挙げられる。

　融合タンパク質は、化学合成によって得られるものであってもよく、又は形質転換した宿主を利用してタンパク質を発現して得られるものであってもよい。化学合成によって得られる融合タンパク質としては、例えば、タンパク質の発現後修飾によって、第一のペプチド、又は第一のペプチド及び第一のリンカーを導入して得られるものを用いてもよい。形質転換した宿主を利用して得られる融合タンパク質としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列に、第一のペプチド、又は第一のペプチド及び第一のリンカーのアミノ酸配列を導入したもの（改変タンパク質）を設計して、当該改変タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１以上の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主によって、当該改変タンパク質を発現させることで得られるものを用いてもよい。ここで、調節配列、発現ベクター、及び宿主等は特に制限されるものではない。

　改変タンパク質をコードする核酸の製造方法は特に限定されず、設計した遺伝子を利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅してクローニングする方法であってよく、又は化学合成によって製造する方法であってもよい。改変タンパク質の精製等を容易にするために、改変タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓタグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなる改変タンパク質、をコードする核酸を合成してもよい。

　１級アミノ基を有する化合物は、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する。１級アミノ基及び脂質部を有する化合物は、例えば、テトラデシルアミン、及びヘキサデシルアミン等の脂肪族アミンが挙げられる。１級アミノ基を有する化合物は、例えば、リジン残基を含有する第二のペプチド、及び、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する脂質ペプチドであってもよい。この場合、１級アミノ基は、リジン残基に由来するアミノ基であってよい。上記化合物は、例えば、リジン残基、及び、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する脂質ペプチドである。上記化合物が、リジン残基を有することによって、微生物由来トランスグルタミナーゼに基質としてより認識されやすくなる。

　上記化合物が有する第二のペプチドは、リジン残基のみで構成されていてもよく、複数のアミノ酸残基で構成されていてもよい。第二のペプチドを構成するアミノ酸残基数は、１～２７であってもよく、２～２７であってもよく、２～１０であってもよく、２～８であってもよく、又は２～７であってもよい。第二のペプチドは、例えば、Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフで表されるアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。ここで、ｐは、０～１３の整数であってもよく、１～１３の整数であってもよく、１～９の整数であってもよく、又は１～４の整数であってもよい。ｑは、０～１３の整数であってもよく、１～１３の整数であってもよく、１～９の整数であってもよく、又は１～４の整数であってもよい。Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフ中、複数あるＸ^３、及び複数あるＸ^４は互いに同一であっても異なってもよい。

　Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフにおいて、Ｘ^３は、グルタミン残基及びリジン残基以外のアミノ酸残基を示す。Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフにおけるＸ^３は、好ましくは、ヒスチジン残基、プロリン残基、トリプトファン残基及びアルギニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を含み、より好ましくは、ヒスチジン残基及びアルギニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種の塩基性アミノ酸残基を含む。Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフにおけるＸ^３が上記のアミノ酸残基を含むことによって、脂質ペプチドの反応溶液（例えば、水溶液）への溶解性をより向上させることが可能であり、使用可能な脂質又は脂溶性ビタミンの選択肢を広げるとともに、トランスグルタミナーゼ反応の進行をより促進できる。

　Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフにおけるＸ^４は、グルタミン残基及びリジン残基以外のアミノ酸残基を示す。Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフにおけるＸ^４は、例えば、グリシン残基及びセリン残基からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を含んでもよい。

　Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフで表されるアミノ酸配列は、例えば、ＭＲＨＫＧＳ、ＫＧＳ、ＲＫＧＳ及びＨＫＧＳ等で表されるアミノ酸配列であってよい。Ｘ^３ _ｐＫＸ^４ _ｑモチーフで表されるアミノ酸配列は、また例えば、Ｋ、ＲＫ、ＨＫ及びＲＨＫ等であってよい。

　上記脂質部は、脂質に由来する構造を備える部分である。上記脂溶性ビタミン部は、脂溶性ビタミンに由来する構造を備える部分である。上記脂質は、脂肪酸、及びステロイド等を含む。脂肪酸としては、例えば、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、及び多価不飽和脂肪酸等が挙げられる。ステロイドとしては、例えば、コレステロール等が挙げられる。コレステロールとしては、例えば、リトコール酸等が挙げられる。上記脂質は、例えば、脂肪族炭化水素基からなる群から選ばれる少なくとも１種の炭化水素基を有する脂質であってよく、脂肪族炭化水素基は、直鎖であってよく、分岐又は脂環を有していてもよい。脂肪族炭化水素基は、例えば、炭素数６以上の脂肪族炭化水素基を有する脂質であってよく、炭素数１２～２９の脂肪族炭化水素基を有する脂質であってよく、炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を有する脂質であってもよい。脂質が上述のような炭化水素基を有すると、細胞膜への脂質化タンパク質の係留をより強いものとすることができ、また細胞に対する毒性を充分に低いものとできる。炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を有する脂質は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、及びステアリン酸等の飽和脂肪酸が挙げられる。炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を有する脂質は、上記飽和脂肪酸に加えて、例えば、オレイン酸及びリノール酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。炭素数１２～２４の脂肪族炭化水素基を有する脂質は、上記飽和脂肪酸に加えて、例えば、リトコール酸等が挙げられる。上記脂溶性ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ（レチナール等）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、及びコレカルシフェロール等），ビタミンＥ（α－トコフェロール等）、及びビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン、メナジオン、及びメナジオール等）等が挙げられる。

　第二のペプチドは、脂質部又は脂溶性ビタミン部が末端に有するカルボキシル基若しくはアミノ基に直接結合してもよく、脂質部又は脂溶性ビタミン部が末端に有するカルボキシル基若しくはアミノ基に第二のリンカーを結合させ、当該第二のリンカーと結合していてもよい。つまり、脂質ペプチドは、脂質部又は脂溶性ビタミン部と、第二のリンカーと、第二のペプチドとを有していてもよい。脂質ペプチドが第二のリンカーを有する場合、脂質ペプチドは、例えば、［脂質部］－［第二のリンカー］－［第二のペプチド］で表される脂質ペプチドを含んでもよく、又は、［脂溶性ビタミン部］－［第二のリンカー］－［第二のペプチド］で表される脂質ペプチドを含んでもよい。

　第二のリンカーは、１～１０個のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドであってよく、又はポリアルキレングリコール鎖であってもよい。リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基は、グリシン残基、セリン残基及びプロリン残基からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含んでよい。ここで、リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基数は以下のように決定される。まず、脂質ペプチドを構成するペプチド部分のアミノ酸残基を解析し、脂質部又は脂溶性ビタミン部に直接接続するアミノ酸残基から第二のペプチドの方向に向かってアミノ酸残基の数を数える。アミノ酸残基の数が１０個となるまでの間にグリシン残基、セリン残基及びプロリン残基以外のアミノ酸残基が検出された場合、検出された当該アミノ酸残基までのアミノ酸残基の数からひとつ減じた数を、リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基数とする。

　リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基はまた、リジン残基、グリシン残基、セリン残基及びプロリン残基からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含んでよい。この場合、リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基数は以下のように決定される。まず、脂質ペプチドを構成するペプチド部分のアミノ酸残基を解析し、脂質部又は脂溶性ビタミン部に直接接続するアミノ酸残基から第二のペプチドの方向に向かってアミノ酸残基の数を数える。アミノ酸残基の数が１０個となるまでの間にリジン残基、グリシン残基、セリン残基及びプロリン残基以外のアミノ酸残基が検出された場合、検出された当該アミノ酸残基の数からひとつ減じた数を、リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基数とする。

　第二のリンカーは、例えば、Ｇ_ｒモチーフ、（Ｇ_ｒＳ）_ｓモチーフ、（ＰＧ_ｒ）_ｓモチーフ、（ＰＧ_ｒＳ）_ｓモチーフ、及び（ＳＧ_ｒＳ）_ｓモチーフ等で表されるペプチドであってよい。ここで、ｒは１～６の整数を示す。ここで、ｓは１～５の整数を示す。第二のリンカーは、より具体的には、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＧＳ、ＰＧＧＧ、及びＰＧＧＧＳ等のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ポリアルキレングリコール鎖は、（ＲＯ）_ｔで表される。ここで、ｔは１～３の整数を示し、Ｒはアルキル基を示す。ポリアルキレングリコール鎖は、例えば、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール等が挙げられる。

　上記化合物（例えば、上記脂質ペプチド）は、例えば、脂質末端のアミノ化等によって得られるものを用いてもよく、ペプチド合成によって得られるものを用いてもよい。ペプチド合成としては、例えば、Ｆｍｏｃ固相合成法を使用することができる。Ｆｍｏｃ固相合成法に用いる樹脂は、脂質ペプチドに要求される特性、及び反応させる融合タンパク質の特性等に応じて選択することができる。

　第一のペプチドは、第二のペプチドよりも疎水性アミノ酸残基の割合が高くてもよい。第一のペプチド及び第二のペプチドを上記のような関係とすることで、融合タンパク質及び脂質ペプチドが微生物由来トランスグルタミナーゼによって認識されやすいものとできる。

　第二のペプチドは、第一のペプチドよりも親水性アミノ酸残基の割合が高くてもよい。第一のペプチド及び第二のペプチドを上記のような関係とすることで、脂質ペプチドの脂質部又は脂溶性ビタミン部に由来する疎水性の程度を弱め、トランスグルタミナーゼ反応を促進することができる。

　上記化合物（例えば、上記脂質ペプチド）の臨界ミセル濃度は、例えば、１μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、又は２０μＭ以上であってよい。上記化合物（例えば、上記脂質ペプチド）の臨界ミセル濃度は、例えば、３５０μＭ以下、３００μＭ以下、２５０μＭ以下、又は２００μＭ以下であってよい。上記化合物（例えば、上記脂質ペプチド）の臨界ミセル濃度はまた、例えば、１５０μＭ以下、又は１４０μＭ以下であってよい。上記化合物の臨界ミセル濃度が上記の範囲内にあることによって、トランスグルタミナーゼ反応の際に、系内において上記化合物がミセルを形成することが抑制され、微生物由来トランスグルタミナーゼの反応サイトに上記化合物が浸入することが容易となり、トランスグルタミナーゼ反応を促進することができる。臨界ミセル濃度は、例えば、脂質部又は脂溶性ビタミン部の種類、第二のリンカー並びに第二のペプチドの長さ及び構成するアミノ酸残基の種類等を選択することによって調整することができる。臨界ミセル濃度は、上記化合物にピレンを含む溶液を用いて、３８５ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３８５）と３７３ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３７３）との比（Ｉ_３８５／Ｉ_３７３）を測定する方法によって、Ｉ_３８５／Ｉ_３７３比の変化から決定することができる。具体的には、後述する実施例に記載した方法に基づいて決定することができる。

　上記化合物（例えば、上記脂質ペプチド）は、脂質部又は脂溶性ビタミン部の種類等によって、種々の二次構造を取り得る。上記化合物の二次構造としては、例えば、βシート構造及びランダムコイル構造等が挙げられる。例えば、上記化合物の二次構造が、βシート構造であると、細胞膜への係留能力を向上させることができる。

　微生物由来トランスグルタミナーゼは、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼ、又は野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼの変異体であってよい。本明細書において「野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼの変異体」とは、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列に依拠して、そのアミノ酸配列を改変したもの又は野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列によらずに人工的に設計及び合成したものであり、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質である。

　野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼの変異体は、例えば、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列（シグナルペプチド部分を除く）において、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列を有する。アミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者において周知の方法によって行うことができる。アミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加は、例えば、１～１０個のアミノ酸残基、１～５個のアミノ酸残基、１～３個のアミノ酸残基、１個のアミノ酸残基に対して行われてもよい。具体的には、国際公開２０１８／００４０１４号に開示された微生物由来トランスグルタミナーゼの変異体等を使用することができる。

　脂質化タンパク質の製造方法において、微生物由来トランスグルタミナーゼと、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物（例えば、脂質ペプチドを含む化合物）とを、溶媒に溶解させた反応溶液中で反応を行う。溶媒は水を含み、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を用いることができる。反応温度は、微生物由来トランスグルタミナーゼの活性に合わせて調整することができ、例えば、５０℃以上、又は６０℃以上であってよく、７０℃以下であってよい。

　反応溶液における融合タンパク質と脂質ペプチドを含む化合物との濃度は、融合タンパク質及び脂質ペプチドを含む化合物の種類、及び組み合わせによって調整することができる。例えば、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）は、例えば、３以上、４以上、５以上、１０以上、又は１５以上であってよい。Ｋ／Ｑ比率は、例えば、２５以下又は２０以下であってよい。例えば、Ｋ／Ｑ比率を上記数値範囲内とすることによって、より効率的にタンパク質に脂質を導入することができる。

　脂質化タンパク質の製造方法は、脂質化タンパク質を作用させる対象となる細胞の存在下で行うこともできる。すなわち、脂質化タンパク質の製造方法の別の実施形態は、細胞（例えば、脂質化タンパク質を作用させる対象となる細胞）及び微生物由来トランスグルタミナーゼの存在下、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物とを反応させて、上記融合タンパク質と上記化合物とがイソペプチド結合によって架橋された脂質化タンパク質を得る工程を備える。上記融合タンパク質は、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有し、上記化合物は、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する。

　脂質化タンパク質を係留させる対象となる細胞の存在下で、融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応を行う方法は、上述のようにあらかじめ脂質化タンパク質の合成及び生成を行ってから、対象とする細胞の細胞膜へ脂質化タンパク質を係留させる方法に比べて、精製などの操作が不要であるため有益である。

［脂質化タンパク質］
　脂質化タンパク質の一実施形態は、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有する融合タンパク質部、及び脂質部又は脂溶性ビタミン部を含む。上記脂質部又は上記脂溶性ビタミン部が、上記第一のペプチドのグルタミン残基とイソペプチド結合によって上記融合タンパク質部と結合している。上記脂質部又は上記脂溶性ビタミン部は、リジン残基を含有する第二のペプチドを有する脂質ペプチド部を含んでもよい。

　脂質化タンパク質は、上述の脂質化タンパク質の製造方法によっても得ることができる。したがって、脂質化タンパク質は、上述の脂質化タンパク質の製造方法についての説明内容を適用することができる。また逆に、本実施形態の脂質化タンパク質についての説明は、上述の脂質化タンパク質の製造方法に適用することができる。

　脂質化タンパク質は、脂質又は脂溶性ビタミンを導入することによって、細胞膜への係留等の細胞膜との相互作用を持つことが可能となっている。本実施形態に係る脂質化タンパク質は、タンパク質に導入することが可能な脂質を種々選択可能であり、また第一のペプチド及び第二のペプチド並びに第一のリンカー及び第二のリンカーの選択によって、細胞膜への係留の程度を制御することが可能である。本実施形態に係る脂質化タンパク質は、例えば、医薬、分析試薬、及び酵素反応等に有用である。

　上記脂質化タンパク質を細胞と共存又は細胞に作用させた際の細胞生存率における５０％効果濃度（ＣＣ５０）は、例えば、１μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、又は２０μＭ以上であってよい。上記脂質化タンパク質を細胞と共存又は細胞に作用させた際の細胞生存率における５０％効果濃度は、例えば、１５０μＭ以下、又は１４０μＭ以下であってよい。上記細胞生存率における５０％効果濃度が上記の範囲内にあることによって、脂質化タンパク質の安全性をより十分なものとすることができる。細胞生存率における５０％効果濃度は、例えば、脂質部又は脂溶性ビタミン部の種類、脂質部の鎖長等を選択することによって調整することができる。細胞生存率における５０％効果濃度は、ＷＳＴアッセイによって評価することができる。具体的には、後述する実施例に記載した方法に基づいて細胞生存率における５０％効果濃度を決定することができる。

　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に何ら限定されるものではない。

　以下、実施例、比較例及び参考例を参照して本発明の内容をより詳細に説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
［融合タンパク質の調製］
　高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＨＭ６４０２７９、ＧＩ：３１２２０５４９０）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて、配列番号１～３に示すアミノ酸配列からなる融合タンパク質を設計した。これらの融合タンパク質はいずれもグルタミン（Ｑ）残基を含む第一のペプチド部分を有している。なお、配列番号１及び配列番号２に示すアミノ酸配列においては、ＥＧＦＰと第一のペプチドとがＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの４塩基からなるリンカーによって結合している。一方、配列番号３に示すアミノ酸配列においては、ＥＧＦＰと第一のペプチドとが直接結合している。

　次に、設計した上記融合タンパク質をコードする核酸を合成した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＥＴ２２ｂ＋）にクローニングした。その後、当該核酸を、ＰＣＲ法によって遺伝子組換えを行うことで、目的タグ配列が挿入された発現ベクターを得た。この発現ベクターの配列は、ＤＮＡシーケンスにより同定した。

　配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含む上記発現ベクターで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に対してヒートショック法を用いて形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンナトリウム１００μｇ／ｍＬで含むＬＢ寒天培地に植菌して、３７℃で一晩静置することでコロニーを得た。得られた大腸菌コロニーを、アンピシリンナトリウム１００μｇ／ｍＬで含むＬＢ培地１０ｍＬに植菌して、３７℃、２００ｒｐｍで４時間培養した。その後、５００ｍＬのＬＢ培地に植菌して、３７℃、１２０ｒｐｍで培養を行い、ＯＤ６００が０．６に到達した時点で、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）を終濃度が０．５ｍＭとなるように添加して、培養温度を１５℃に下げ、更に１６時間培養を継続した。

　培養後、培養液を６０００×ｇ、７分間の条件で遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体をＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液の混合液、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、上清を除去し、ペレット状になった菌体を－８０℃で凍結保存した。凍結保存したペレットをＴＢＳ緩衝液１５ｍＬに溶解させた後、超音波処理によって菌体を粉砕し、遠心分離（温度：４℃、遠心力：１８０００×ｇ、時間：２０分間）によって破砕した菌体の沈殿物と、タンパク質が溶解した溶液とを分離した。得られた溶液を０．４５μｍのＰＶＤＦメンブレンフィルター及び０．２２μｍのＰＶＤＦメンブレンフィルターでろ過して、不溶性画分及び菌体を除去した。不溶性画分等が除去された溶液に対してＨｉｓＴｒａｐ　Ｅｘｃｅｌ　カラム（１ｍＬ）を用いて、タンパク質の精製を行った。得られたタンパク質に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、設計した融合タンパク質に対応する分子量帯に相当するバンドの出現が見られ、融合タンパク質の発現及び純度を確認した。

［脂質部を有する化合物（脂質ペプチド）の調製］
　Ｆｍｏｃ固相合成法によって、下記表１に記載のアミノ酸配列を１アミノ酸ずつ縮合して合成して第二のペプチドを調製し、その後、第二のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基とミリスチン酸を縮合して脂質ペプチド１を合成した。得られた脂質ペプチドは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。精製後の脂質ペプチドの同定及び純度の測定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって行った。また、ミリスチン酸と第二のペプチドとをリンカーで接続した脂質ペプチドを同様に合成した（表１の脂質ペプチド２～１２）。ミリスチン酸に代えて、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸を用いて同様に脂質ペプチドを合成した（表１の脂質ペプチド１３～１５）。第二のペプチドとして、ＭＲＨＫＧＳよりも短いペプチドを用いて同様に脂質ペプチドを合成した（表１の脂質ペプチド１６～２１）。ミリスチン酸に代えて、リトコール酸を用いて脂質ペプチドを合成した（表１の脂質ペプチド２２）。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、３０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が３０％から６０％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２２０ｎｍの吸光度で検出した。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いた測定は、０．５ｍｇ／ｍＬの脂質ペプチド溶液２μＬと、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスとを用いて行った。

［脂質ペプチドの細胞毒性試験］
　合成した脂質ペプチドの細胞に対する毒性をＷＳＴアッセイによって評価した。１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した浮遊細胞ＳＮＵ－１を５．０×１０^４個／ウェル（２５μＬの液体培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社製））となるように、９６ウェルプレートに播種した。そして、上記で合成した脂質ペプチド（０～１０００μＭ）を２５μＬだけ加えて混合し、終濃度が０～５００μＭとなるようにして溶液を調製した。得られた溶液を３７℃の条件下で、一日間インキュベートした。インキュベート後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで６倍に希釈した発色剤（ＷＳＴ－８、同仁化学研究所製）を６０μＬ／ウェルとなるように添加して、３７℃の条件下で、９０分間インキュベートした。そして、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、細胞生存率を算出した。細胞生存率は以下の式より計算した。結果を図１に示す。図１より、細胞毒性の指標であるＣＣ５０を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈのシグモイド回帰曲線から算出した。結果を表２に示す。

　細胞生存率［％］＝［ＯＤ４５０（試料）－ＯＤ４５０（ブランク）］／［ＯＤ４５０（未処理）－ＯＤ４５０（ブランク）］×１００
　上記式において、ＯＤは光学濃度を示す。

［脂質ペプチドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定］
　表２に示す脂質ペプチドの臨界ミセル濃度を測定した。脂質ペプチドの濃度は、ピレン法（Ｊ．　Ａｇｕｉａｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．　２００３,　２５８,　ｐ．１１６－１２２）に従って測定した。まず、２μＬミクロチューブに１００μＭのピレン（テトラヒドロフラン溶液）を取り、テトラヒドロフランを蒸発させた。その後、１００μＬの脂質ペプチド（０．０００１～０．５ｍＭ、ＰＢＳ溶液）を上記ミクロチューブに加えて、２５℃、１５ｒｐｍの条件下で、６０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ溶液を９６ウェルプレートに、５０μＬ／ウェルとなるように添加し、蛍光プレートリーダーで、３８５ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３８５）と３７３ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３７３）との比（Ｉ_３８５／Ｉ_３７３）を測定した。励起光の波長は３３４ｎｍに設定した。脂質ペプチド１を用いた場合の結果を図２に示す。図２におけるＩ_３８５／Ｉ_３７３比の変化から、臨界ミセル濃度を決定した。結果を表２に示す。

　図１に示す結果から、いずれの脂質ペプチドもＣＣ５０が大きな値となっており、脂質ペプチドが通常使用される１μＭ程度の濃度であれば、細胞毒性は低いことが確認された。また、第二のリンカーの選択によって、細胞毒性を調整することができることも確認された。表２に示す結果から、第二のリンカーの選択によって、臨界ミセル濃度を調整することができることが確認された。

［脂質ペプチドの円二色性スペクトル測定］
　合成した脂質ペプチドの円二色性スペクトル測定を行い、二次構造を評価した。まず、５０μＭの脂質ペプチドを、４００μＬのＰＢＳ中に溶解して、３７℃の条件下で、３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ溶液を、光路長０．１ｃｍの石英セルを用いて、円二色性スペクトルの測定を行った。測定は、温度を３７℃、走査速度を５０ｎｍ／分、データ取込み間隔を０．２ｎｍとして行った。結果を図３及び図４に示す。

　図３及び図４は、合成した脂質ペプチドの円二色性スペクトル測定の結果を示すグラフである。図３は、脂質ペプチド１，３，６，及び９～１２の結果を示し、図４には、脂質ペプチド９、及び１６～２１の結果を示している。図３に示す結果から、脂質ペプチド９～１１は、２１５～２２５ｎｍに負のピークを有することから、脂質ペプチドがβシート構造を形成していることが確認された。また、脂質ペプチド６及び１２は、２０５ｎｍに負のピークを有することから、脂質ペプチドがランダムコイル構造を形成していることが確認された。図４に示す結果から、脂質ペプチド１６，１７及び２０も脂質ペプチド９と同様にβシート構造を形成していることが確認された。また脂質ペプチド１９及び２１がランダムコイル構造を形成していることが確認された。βシート構造を形成する脂質ペプチドを用いることで、細胞膜への係留能力を向上させることが期待される。

［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　上記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド１を５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＬのＰＢＳ中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を５とした。６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。結果を図５に示す。

　図５の上部に示すクロマトグラムは反応前の溶液に対する液体クロマトグラフィーの結果を示している。１３．４分間経過後に融合タンパク質に対応する溶出ピークが観察されることが確認された。また、図５の下部に示すクロマトグラムは反応後の溶液に対する液体クロマトグラフィーの結果を示している。１３．４分間経過後に融合タンパク質に対応する溶出ピークが観察されることに加えて、１４．３分間経過後に脂質化タンパク質に対応する新たな溶出ピークが観察された。図５に示される結果から、トランスグルタミナーゼ反応が進行していることが確認された。また図５に示すクロマトグラムのピーク面積から、トランスグルタミナーゼ反応における反応率を下記式によって算出した。

　トランスグルタミナーゼ反応における反応率［％］＝［（１４．３分間後のピークに対するピーク面積）／｛（１３．４分間後のピークに対するピーク面積）＋（１４．３分間後のピークに対するピーク面積）｝］×１００

　ＲＰ－ＨＰＬＣによる測定は、４．６×１５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質化タンパク質の溶出は、４０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が２０％から１００％になるように流速１ｍＬ／分で移動相を送液する条件で行い、２８０ｎｍの吸光度で検出した。

　Ｋ／Ｑ比率が５且つ反応時間３０分間経過した際の、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を下記の基準で評価した。結果を表３に示す。
＜反応性の評価基準＞
　反応に要した融合タンパク質に対して脂質ペプチドが導入された割合に基づいて反応性を評価した。
　Ａ：脂質ペプチドと反応した融合タンパク質が１００質量％
　Ｂ：脂質ペプチドと反応した融合タンパク質が６０質量％を超えて１００％未満
　Ｃ：脂質ペプチドと反応した融合タンパク質が６０質量％未満

　次に、Ｋ／Ｑ比率が、１，２，１０，及び２０となるように変更して、上記と同様の実験を行い、各Ｋ／Ｑ比率における反応率を算出した。結果を図６に示す。また、反応時間が、５分間，１０分間，１５分間，３０分間，及び６０分間経過したごとにサンプリングを行い、各反応時間後における反応率を算出した。結果を図７に示す。

（実施例２）
　脂質ペプチド１に変えて、リンカーを有する脂質ペプチド９を用いたこと以外は、実施例１と同様にして実験を行い、反応率を算出した。結果を表３、図６及び図７に示す。

（実施例３）
　上記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質に代えて、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いたこと以外は、実施例１と同様にして実験を行い、反応率を算出した。結果を表３、図８及び図９に示す。

（実施例４）
　上記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質に代えて、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いたこと以外は、実施例２と同様にして実験を行い、反応率を算出した。結果を表３、図８及び図９に示す。

（実施例５）
　上記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質に代えて、上記配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いたこと以外は、実施例１と同様にして実験を行った。評価に関しては、Ｋ／Ｑ比率と反応率との関係を評価した。結果を表３、図１０に示す。

（実施例６）
　上記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質に代えて、上記配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いたこと以外は、実施例２と同様にして実験を行い、反応率を算出した。結果を表３、図１０及び図１１に示す。

　図６～図１１に示す結果から、いずれの融合タンパク質と脂質ペプチドの関係においても脂質化タンパク質を製造できることが確認された。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いる場合、脂質ペプチドの種類によらず、Ｋ／Ｑ比率が小さくても反応性に優れることが確認された。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いる場合、Ｋ／Ｑ比率を調整することによって、融合タンパク質のすべてに脂質を導入することが可能であることが確認された。

（実施例７）
［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド６を５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＬのＰＢＳ中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、Ｋ／Ｑ比率を５とした。６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。

　次に、Ｋ／Ｑ比率が、１，２，１０，及び２０となるように変更して、上記と同様の実験を行い、反応性を評価した。結果を図１２に示す。また、反応時間が、５分間，１０分間，１５分間，３０分間，及び６０分間経過したごとにサンプリングを行い、反応性を評価した。結果を表３及び図１３に示す。図１２及び図１３には、比較のために実施例３及び実施例４で製造した例も併記する。

（実施例８～１０）
　脂質ペプチド６に代えて、表１の脂質ペプチド１０（実施例８）、表１の脂質ペプチド１１（実施例９）、又は表１の脂質ペプチド１２（実施例１０）を用いたこと以外は、実施例７と同様にして実験を行い、評価を行った。結果を表３、図１２及び図１３に示す。

（実施例１１～１６）
　脂質ペプチド６に代えて、表１の脂質ペプチド１６（実施例１１）、表１の脂質ペプチド１７（実施例１２）、表１の脂質ペプチド１８（実施例１３）、表１の脂質ペプチド１９（実施例１４）、表１の脂質ペプチド２０（実施例１５）、又は表１の脂質ペプチド２１（実施例１６）を用いたこと以外は、実施例７と同様にして実験を行い、評価を行った。結果を表３、図１４及び図１５に示す。

［細胞膜への係留能力解析（フローサイトメトリー解析）］
　実施例３、実施例４、及び実施例８～実施例１０で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を評価した。まず、浮遊細胞ＳＮＵ－１を２．０×１０^５個播種して、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬのＰＢＳに懸濁させた。得られた浮遊細胞の懸濁液に、上記で得られた脂質化タンパク質（２μＭ、又は１０μＭ）を２５μＬだけ混合して、終濃度が１μＭ又は５μＭとなるようにして溶液を調製した。混合した後の溶液を３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳで溶液を２回洗浄した。洗浄した後の溶液を４００μＬのＰＢＳに懸濁し、セルストレーナーで濾過した。その後、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を図１６に示す。

　定量した蛍光量に基づいて脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を下記の基準で評価した。結果を表３に示す。
＜係留能力の評価基準（細胞１個あたりの蛍光強度）＞
　Ａ：１０００以上
　Ｂ：５００以上１０００未満
　Ｃ：２００以上５００未満
　Ｄ：１５０以上２００未満
　Ｅ：１００以上１５０未満
　Ｆ：５０以上１００未満
　Ｇ：５０未満

（参考例１）
　参考例として、脂質ペプチドと反応させる前の、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をそのまま浮遊細胞の懸濁液に添加し、終濃度が１μＭ又は５μＭである溶液を調製した。混合した後の溶液を、３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳで溶液を２回洗浄した。洗浄した後の溶液を４００μＬのＰＢＳに懸濁し、セルストレーナーで濾過した。その後、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を表３及び図１６に示す。

［細胞毒性試験］
　実施例３、実施例４、及び実施例８～実施例１０で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、ＷＳＴアッセイによって脂質化タンパク質の細胞毒性を評価した。まず、１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した浮遊細胞ＳＮＵ－１を５．０×１０^４個／ウェル（２５μＬのダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ））を９６ウェルプレートに播種した。そして、上記の反応溶液（２μＭ又は１０μＭ、必要に応じてＤ－ＰＢＳで濃度を調整した）を２５μＬだけ混合して、終濃度が１μＭ又は２μＭとるようにして溶液を調製した。得られた溶液を、３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬのＤ－ＰＢＳで２回洗浄した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈したＷＳＴ－８を１１０μＬ/ウェル添加して、３７℃の条件下で、９０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して細胞生存率を算出した。結果を図１７に示す。

（参考例２）
　参考例として、脂質ペプチドと反応させる前の、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をそのまま浮遊細胞の懸濁液に添加し、終濃度が１μＭ又は５μＭである溶液を調製した。得られた溶液を、３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬのＤ－ＰＢＳで２回洗浄した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈したＷＳＴ－８を１１０μＬ／ウェル添加して、９０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して細胞生存率を算出した。結果を図１７に示す。

　図１７に示す結果から、脂質化タンパク質は１μＭ程度の濃度で使用しても、脂質化タンパク質を係留させた細胞の細胞生存率は１００％近くとなっており、十分に生体適合性があるといえることが確認された。

　実施例４、及び実施例１１～１６で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留挙動及び細胞毒性を評価した。結果を表３、図１８及び図１９に示す。

　図１９に示す結果から、脂質化タンパク質は１μＭ程度の濃度で使用しても、脂質化タンパク質を係留させた細胞の細胞生存率は１００％近くとなっており、十分に生体適合性があるといえることが確認された。

（実施例１７～２０）
　脂質ペプチド１に代えて、脂質ペプチド３（実施例１７）、脂質ペプチド４（実施例１８）、脂質ペプチド８（実施例１９）又は脂質ペプチド７（実施例２０）を用いたこと以外は、実施例７と同様にして実験を行い、脂質化タンパク質を製造できることを確認した。結果を表３に示す。

（実施例２１）
［脂溶性ビタミン部を有する化合物の調製］
　Ｆｍｏｃ固相合成法によって、ＧＧＧＳＭＲＨＫＧＳで表されるアミノ酸配列を１アミノ酸ずつ縮合して合成し、その後、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基とα－トコフェロールとを縮合して脂溶性ビタミン部を有する化合物を合成した。得られた脂溶性ビタミン部を有する化合物は逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。精製後の脂質ペプチドの同定及び純度の測定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって行った。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂溶性ビタミン部を有する化合物（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、３０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が５０％から８０％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２２０ｎｍの吸光度で検出した。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いた測定は、０．５ｍｇ／ｍＬの脂溶性ビタミン部を有する化合物の溶液２μＬと、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスとを用いて行った。

［融合タンパク質と脂溶性ビタミン部を有する化合物との反応］
　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂溶性ビタミン部を有する化合物を５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び１質量／体積％のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ｎ－Ｄｏｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｓｉｄｅ：ＤＤＭ）の混合溶液中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、脂溶性ビタミン部を有する化合物における１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を５とした。６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質（純度：９９％）が得られたことを確認した。

（実施例２２）
［融合タンパク質と、脂質部を有する化合物（脂質ペプチド）との反応］
　上記脂溶性ビタミン部を有する化合物に代えて、表１の脂質ペプチド２２を用いたこと以外は、実施例２１と同様にして、脂質化タンパク質を調製した。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質（純度：８０％）が得られたことを確認した。

（実施例２３）
［融合タンパク質と脂質部を有する化合物との反応］
　脂溶性ビタミン部を有する化合物に代えて、テトラデシルアミン（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例２１と同様にして脂質化タンパク質を製造した。すなわち、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、テトラデシルアミンを５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＬのＰＢＳ中で混合させ、３７℃の条件下で、３０分間反応させた。このとき、脂質部を有する化合物に含まれる１級アミノ基と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を５とした。３０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。なお、テトラデシルアミンは、ジメチルスルホキシドに溶解させて調製した５ｍＭ溶液を用いた。

（実施例２４）
　テトラデシルアミンに代えてヘキサデシルアミン（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例２３と同様にして実験を行い、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。

（実施例２５）
［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　上記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、表１の脂質ペプチド９を５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で混合させ、３７℃の条件下で６０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を１，５又は２０とした。６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質（純度：９１％）が得られたことを確認した。各Ｋ／Ｑ比率における反応率の結果を図２０に示す。

（実施例２６～２８）
　脂質ペプチド９に代えて、表１の脂質ペプチド１３（実施例２６），表１の脂質ペプチド１４（実施例２７）又は表１の脂質ペプチド１５（実施例２８）を用いたこと以外は、実施例２５と同様にして、脂質化タンパク質を製造した。脂質化タンパク質の純度はそれぞれ、実施例２６では４８％、実施例２７では９６％、及び実施例２８では９０％であった。各Ｋ／Ｑ比率における反応率の結果を図２０に示す。

［細胞膜への係留能力解析（フローサイトメトリー解析）］
　実施例２１～２２、及び２５～２８で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂溶性ビタミンを有する化合物を含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を評価した。評価方法は、上記実施例３と同様にして行った。結果を図２１に示す。実施例２５～２８の蛍光顕微鏡観察結果を図２２及び図２３に示す。

［細胞毒性試験］
　実施例２１及び２２、並びに実施例２６～２８で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂溶性ビタミンを有する化合物を含む）を用いて、ＷＳＴアッセイによって脂質化タンパク質の細胞毒性を評価した。評価方法は、上記実施例３と同様にして行った。結果を図２４及び図２５に示す。

［脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する化合物の細胞毒性及び臨界ミセル濃度の測定］
　実施例２１～２２、及び実施例２５～２８で使用した脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する化合物の細胞毒性及び臨界ミセル濃度を測定した。結果を表４に示す。

（実施例２９）
　Ｆｍｏｃ固相合成法によって、下記表５に記載のアミノ酸配列を１アミノ酸ずつ縮合して合成して第二のペプチドを調製し、その後、第二のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基とα－トコフェロールとを第二のリンカーで接続して脂質ペプチド２３を合成した。得られた脂質ペプチドは、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。精製後の脂質ペプチドの同定及び純度の測定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって行った。α－トコフェロールに代えて、コレステロールを用いて、同様に脂質ペプチドを合成した（表５の脂質ペプチド２４）。なお、脂質ペプチド２４は、下記の化学式で表される。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、３０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が３０％か６０％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２２０ｎｍの吸光度で検出した。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いた測定は、０．５ｍｇ／ｍＬの脂質ペプチド溶液２μＬと、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスとを用いて行った。

　上述のとおり合成した脂質ペプチド２３及び脂質ペプチド２４について、実施例１と同様にして、細胞毒性試験及び臨界ミセル濃度の評価を行った。結果を表６に示す。脂質ペプチド２４を用いた場合の測定結果を図２６に示す。また比較のため、実施例１において合成した脂質ペプチド９、脂質ペプチド１３、脂質ペプチド１４、脂質ペプチド１５及び脂質ペプチド２２の評価結果も表６に示す。

［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド１３を５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を５とした。

　６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。実施例１と同様に反応性を評価した。結果を表７に示す。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、４０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が２０％か１００％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２８０ｎｍの吸光度で検出した。

（実施例３０～３４）
　表７に記載のとおり、脂質ペプチド１３に代えて、脂質ペプチド１４（実施例３０）、脂質ペプチド１５（実施例３１）、脂質ペプチド２２（実施例３２）、脂質ペプチド２３（実施例３３）、及び脂質ペプチド２４（実施例３４）を用いたこと以外は、実施例２９と同様にして実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例３５）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例３６）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例２９と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例３７）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例３０と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例３８）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例３１と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例３９）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例３２と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例４０）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例３３と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

（実施例４１）
　表７に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例３４と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表７に示す。

［細胞膜への係留能力解析（フローサイトメトリー解析）］
　実施例２９～実施例４１で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を評価した。まず、浮遊細胞ＳＮＵ－１を２．０×１０^５個播種して、１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬのＰＢＳに懸濁させた。得られた浮遊細胞の懸濁液に、上記で得られた脂質化タンパク質（２μＭ）を２５μＬだけ混合して、終濃度が１μＭとなるようにして溶液を調製した。混合した後の溶液を３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳで溶液を２回洗浄した。洗浄した後の溶液を４００μＬのＰＢＳに懸濁し、セルストレーナーで濾過した。その後、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を図２７及び表７に示す。

（参考例３）
　参考例として、脂質ペプチドと反応させる前の、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をそのまま浮遊細胞の懸濁液に添加し、終濃度が１μＭ又は５μＭである溶液を調製した。混合した後の溶液を、３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳで溶液を２回洗浄した。洗浄した後の溶液を４００μＬのＰＢＳに懸濁し、セルストレーナーで濾過した。その後、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を図２７に示す。

　従来のトランスグルタミナーゼを用いた脂質化タンパク質の製造方法のように、グルタミン残基を有するペプチドのＮ末端に脂肪酸を結合させた脂質ペプチドを基質として用いる場合には、脂質部の炭素数が比較的大きい（例えば、炭素数１６以上）と水溶性が低く、界面活性剤の添加無しでは、トランスグルタミナーゼ反応を行うことが困難であった。しかしながら、表７の結果から、炭素数が比較的大きな脂質ペプチド１４、脂質ペプチド１５、脂質ペプチド２３、及び脂質ペプチド２４を用いた場合であっても、トランスグルタミナーゼ反応が進行し、脂質化タンパク質を製造することができることが確認された。また、表７の結果から、界面活性剤を用いた例（実施例３５～実施例４１）において、トランスグルタミナーゼ反応の反応性をより向上させることができた。

　なお、従来のトランスグルタミナーゼを用いた脂質化タンパク質の製造方法のように、グルタミン残基を有するペプチドのＮ末端に脂肪酸を結合させた脂質ペプチドを基質として用いる場合、脂質部の炭素数が大きくなると、脂質ペプチド自体の精製も困難となるため、脂質化タンパク質を製造するための脂質ペプチドの選択肢が限られる傾向にあった。上述のように本開示の方法によれば、脂質ペプチドの選択肢を従来よりも広げることが可能であることが確認された。

［細胞毒性試験］
　実施例２９～３４で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂溶性ビタミンを有する化合物を含む）を用いて、ＷＳＴアッセイによって脂質化タンパク質の細胞毒性を評価した。評価方法は、上記実施例３と同様にして行った。結果を図２８に示す。

（参考例４）
　参考例として、脂質ペプチドと反応させる前の、上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をそのまま浮遊細胞の懸濁液に添加し、終濃度が１μＭ又は５μＭである溶液を調製した。得られた溶液を、３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬのＤ－ＰＢＳで２回洗浄した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈したＷＳＴ－８を１１０μＬ／ウェル添加して、９０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して細胞生存率を算出した。結果を図２８に示す。

（実施例４２）
　Ｆｍｏｃ固相合成法によって、下記表８に記載のアミノ酸配列を１アミノ酸ずつ縮合して合成して第二のペプチドを調製し、その後、第二のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基とラウリン酸とを第二のリンカーで接続して脂質ペプチド２５を合成した。得られた脂質ペプチドは、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。精製後の脂質ペプチドの同定及び純度の測定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって行った。さらに、ラウリン酸に代えて、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸又はコレステロールを用いて、同様に脂質ペプチドを合成した（表８の脂質ペプチド２６～３０）。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、３０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が３０％か６０％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２２０ｎｍの吸光度で検出した。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いた測定は、０．５ｍｇ／ｍＬの脂質ペプチド溶液２μＬと、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスとを用いて行った。

　上述のとおり合成した脂質ペプチド２５～脂質ペプチド３０について、細胞毒性試験及び臨界ミセル濃度の評価を行った。

［脂質ペプチドの細胞毒性試験］
　合成した脂質ペプチドの細胞に対する毒性をＷＳＴアッセイによって評価した。１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した浮遊細胞ＳＮＵ－１を１．０×１０^４個／ウェル（２５μＬの液体培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社製））となるように、９６ウェルプレートに播種した。そして、上記で合成した脂質ペプチド（０～１０００μＭ）を２５μＬだけ加えて混合し、終濃度が０～５００μＭとなるようにして溶液を調製した。得られた溶液を３７℃の条件下で、一日間インキュベートした。インキュベート後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで６倍に希釈した発色剤（ＷＳＴ－８、同仁化学研究所製）を６０μＬ／ウェルとなるように添加して、３７℃の条件下で、９０分間インキュベートした。そして、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、細胞生存率を算出した。細胞生存率は実施例１に示したものと同じ式を用いて計算した。結果を図２９及び図３０に示す。図２９及び図３０から、細胞毒性の指標であるＣＣ５０をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈのシグモイド回帰曲線を用いて算出した。結果を表９に示す。比較のため、実施例１において合成した脂質ペプチド１６の結果も表９に示す。

［脂質ペプチドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定］
　脂質ペプチド２５～脂質ペプチド３０の臨界ミセル濃度を測定した。脂質ペプチドの濃度は、ピレン法（Ｊ．　Ａｇｕｉａｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．　２００３,　２５８,　ｐ．１１６－１２２）に従って測定した。まず、２μＬミクロチューブに１００μＭのピレン（テトラヒドロフラン溶液）を取り、テトラヒドロフランを蒸発させた。その後、１００μＬの脂質ペプチド（０．０００１～０．５ｍＭ、ＰＢＳ溶液）を上記ミクロチューブに加えて、２５℃、１５ｒｐｍの条件下で、６０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ溶液を９６ウェルプレートに、５０μＬ／ウェルとなるように添加し、蛍光プレートリーダーで、３８５ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３８５）と３７３ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３７３）との比（Ｉ_３８５／Ｉ_３７３）を測定した。励起光の波長は３３４ｎｍに設定した。実施例１と同様に、脂質ペプチドを用いた場合の蛍光強度測定の結果を示すグラフから、Ｉ_３８５／Ｉ_３７３比の変化を導き、臨界ミセル濃度を決定した。結果を表９に示す。比較のため、実施例１において合成した脂質ペプチド１６の結果も表９に示す。

［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド２５を５０μＭ、及び微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬを、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を５とした。

　６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。実施例１と同様に反応性を評価した。結果を表１０に示す。比較のため、実施例１１の結果も表９に示す。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、４０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が２０％から１００％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２８０ｎｍの吸光度で検出した。

（実施例４３～４７）
　表１０に記載のとおり、脂質ペプチド２５に代えて、脂質ペプチド２６（実施例４３）、脂質ペプチド２７（実施例４４）、脂質ペプチド２８（実施例４５）、脂質ペプチド２９（実施例４６）、及び脂質ペプチド３０（実施例４７）を用いたこと以外は、実施例４２と同様にして実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例４８）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例１１と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例４９）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４２と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例５０）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４３と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例５１）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４４と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例５２）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４５と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例５３）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４６と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

（実施例５４）
　表１０に記載のとおり、界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを加えたこと以外は、実施例４７と同様にして、実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を表１０に示す。

［細胞膜への係留能力解析（フローサイトメトリー解析）］
　実施例１１及び実施例４２～実施例５４で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を評価した。まず、浮遊細胞ＳＮＵ－１を２．０×１０^５個播種して、１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬのＰＢＳに懸濁させた。得られた浮遊細胞の懸濁液に、上記で得られた脂質化タンパク質（２μＭ）を２５μＬだけ混合して、終濃度が１μＭとなるようにして溶液を調製した。混合した後の溶液を３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳで溶液を２回洗浄した。洗浄した後の溶液を４００μＬのＰＢＳに懸濁し、セルストレーナーで濾過した。その後、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を図３１及び表１０に示す。

［細胞毒性試験］
　実施例４２～４７で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂溶性ビタミンを有する化合物を含む）を用いて、ＷＳＴアッセイによって脂質化タンパク質の細胞毒性を評価した。評価方法は、上記実施例３と同様にして行った。結果を図３２に示す。

（実施例５５）
　Ｆｍｏｃ固相合成法によって、下記表１１に記載のアミノ酸配列を１アミノ酸ずつ縮合して合成して第二のペプチドを調製し、その後、第二のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基とラウリン酸とをリンカーで接続した脂質ペプチド３１を合成した。得られた脂質ペプチドは、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。精製後の脂質ペプチドの同定及び純度の測定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって行った。また、ラウリン酸に代えて、パルミチン酸、ステアリン酸、α－トコフェロール又はコレステロールを用いて同様に脂質ペプチドを合成した（表１１の脂質ペプチド３２～３５）。

　また、第二のリンカーとして、Ｇ_３Ｓの脂質部側にリジン（Ｋ）を導入することで、脂質部を２つ導入した脂質ペプチドの合成も行い、精製後の脂質ペプチドの同定及び純度の測定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって行った。より具体的には、ラウリン酸を２つ導入した脂質ペプチド３６、ミリスチン酸を２つ導入した脂質ペプチド３７、パルミチン酸を２つ導入した脂質ペプチド３８、ステアリン酸を２つ導入した脂質ペプチド３９、α－トコフェロールを２つ導入した脂質ペプチド４０、及びコレステロールを２つ導入した脂質ペプチド４１を合成した。なお、脂質ペプチド３６は、下記の化学式で表される。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、３０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が３０％か６０％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２２０ｎｍの吸光度で検出した。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いた測定は、０．５ｍｇ／ｍＬの脂質ペプチド溶液２μＬと、α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスとを用いて行った。

　上述のとおり合成した脂質ペプチド３１～脂質ペプチド４１について、細胞毒性試験及び臨界ミセル濃度の評価を行った。

［脂質ペプチドの細胞毒性試験］
　合成した脂質ペプチドの細胞に対する毒性をＷＳＴアッセイによって評価した。１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した浮遊細胞ＳＮＵ－１を１．０×１０^４個／ウェル（２５μＬの液体培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社製））となるように、９６ウェルプレートに播種した。そして、上記で合成した脂質ペプチド（０～１０００μＭ）を２５μＬだけ加えて混合し、終濃度が０～５００μＭとなるようにして溶液を調製した。得られた溶液を３７℃の条件下で、一日間インキュベートした。インキュベート後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで６倍に希釈した発色剤（ＷＳＴ－８、同仁化学研究所製）を６０μＬ／ウェルとなるように添加して、３７℃の条件下で、９０分間インキュベートした。そして、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、細胞生存率を算出した。細胞生存率は実施例１に示したものと同じ式を用いて計算した。結果を図３３、図３４及び図３５に示す。図３３、図３４及び図３５から、細胞毒性の指標であるＣＣ５０をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈのシグモイド回帰曲線を用いて算出した。結果を表１２に示す。比較のため、実施例１において合成した脂質ペプチド２１の結果も表１２に示す。

［脂質ペプチドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定］
　脂質ペプチド２１及び脂質ペプチド３１～脂質ペプチド４１の臨界ミセル濃度を測定した。脂質ペプチドの濃度は、ピレン法（Ｊ．　Ａｇｕｉａｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．　２００３,　２５８,　ｐ．１１６－１２２）に従って測定した。まず、２μＬミクロチューブに１００μＭのピレン（テトラヒドロフラン溶液）を取り、テトラヒドロフランを蒸発させた。その後、１００μＬの脂質ペプチド（０．０００１～０．５ｍＭ、ＰＢＳ溶液）を上記ミクロチューブに加えて、２５℃、１５ｒｐｍの条件下で、６０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ溶液を９６ウェルプレートに、５０μＬ／ウェルとなるように添加し、蛍光プレートリーダーで、３８５ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３８５）と３７３ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ_３７３）との比（Ｉ_３８５／Ｉ_３７３）を測定した。励起光の波長は３３４ｎｍに設定した。実施例１と同様に、脂質ペプチドを用いた場合の蛍光強度測定の結果を示すグラフから、Ｉ_３８５／Ｉ_３７３比の変化を導き、臨界ミセル濃度を決定した。結果を表１２に示す。

［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド３１を５０μＭ、微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬ及び界面活性剤としてｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドを１．０質量／体積％を、１０ｍＬのＰＢＳ中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を１０とした。Ｋ／Ｑ比率を、５又は２０に変更して上記同様の反応を行った。結果を図３６に示す。

　６０分間経過後、０．２％ＴＦＡ含有アセトニトリルを３０μＬ添加して反応を停止させた。ＲＰ－ＨＰＬＣによって、脂質化タンパク質が得られたことを確認した。実施例１と同様に反応性を評価した。結果を表１３に示す。

　ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた測定は、４．６×２５０ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラムを用いて室温（２５℃）で行った。移動相は０．１％ＴＦＡ含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用した。脂質ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）の溶出は、４０分間後にアセトニトリルの濃度勾配が２０％から１００％になるように流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで移動相を送液する条件で行い、２８０ｎｍの吸光度で検出した。

（実施例５６～６６）
　表１３に記載のとおり、脂質ペプチド３１に代えて、脂質ペプチド３２（実施例５６）、脂質ペプチド３３（実施例５７）、脂質ペプチド３４（実施例５８）、脂質ペプチド３５（実施例５９）、脂質ペプチド３６（実施例６０）、脂質ペプチド３７（実施例６１）、脂質ペプチド３８（実施例６２）、脂質ペプチド３９（実施例６３）、脂質ペプチド４０（実施例６４）、脂質ペプチド４１（実施例６５）、及び脂質ペプチド２１（実施例６６）を用いたこと、及びＫ／Ｑ比率が５、１０、２０となるように各脂質ペプチドの配合量を調整したこと以外は、実施例５５と同様にして実験を行い、融合タンパク質及び脂質ペプチドのトランスグルタミナーゼ反応の反応性を評価した。結果を図３６、図３７及び表１３に示す。

［細胞膜への係留能力解析（フローサイトメトリー解析）］
　実施例５５～実施例６６で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を評価した。まず、浮遊細胞ＳＮＵ－１を２．０×１０^５個播種して、１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬのＰＢＳに懸濁させた。得られた浮遊細胞の懸濁液に、上記で得られた脂質化タンパク質（２μＭ）を２５μＬだけ混合して、終濃度が１μＭとなるようにして溶液を調製した。混合した後の溶液を３７℃の条件下で、１５分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳで溶液を２回洗浄した。洗浄した後の溶液を４００μＬのＰＢＳに懸濁し、セルストレーナーで濾過した。その後、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を図３８及び表１３に示す。比較のため、実施例１６の結果も表１３に示す。

　表１３中「－^※」で示した部分は、測定を実施していないことを意味する。

［細胞毒性試験］
　実施例５５～５７、及び実施例５９～６３、６６で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂溶性ビタミンを有する化合物を含む）を用いて、ＷＳＴアッセイによって脂質化タンパク質の細胞毒性を評価した。評価方法は、上記実施例３と同様にして行った。結果を図３９に示す。

（実施例６７）
［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　脂質化タンパク質を係留させる対象となる細胞の存在下で、融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応を行った。

　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド２４を５μＭ、微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬ、及び浮遊細胞ＳＮＵ－１を２．０×１０^５個、を１０ｍＬのＤ－ＰＢＳ中で混合させ、３７℃の条件下で、６０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を０．５とした。

［細胞膜への係留能力解析（フローサイトメトリー解析）］
　実施例６７で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂質ペプチドを含む）を用いて、脂質化タンパク質の細胞膜への係留能力を評価した。上記反応溶液を２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、４００μＬのＰＢＳに懸濁させた。得られた懸濁液を対象として、セルアナライザー（製品名「セルアナライザーＥＣ８００」）によって細胞一個あたりの蛍光を定量した。結果を図４０に示す。

（実施例６８）
［融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応］
　脂質化タンパク質を係留させる対象となる細胞の存在下で、融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応を行った。

　上記配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を１０μＭ、上記脂質ペプチド２４を５μＭ、微生物由来トランスグルタミナーゼを０．１Ｕ／ｍＬ、及び浮遊細胞ＳＮＵ－１を５．０×１０^５個、をＤ－ＰＢＳ中で混合させ、合計体積が５０μＬ／ウェルとなるように調製し、３７℃の条件下で、３０分間反応させた。このとき、脂質ペプチドにおける第二のペプチドに含まれる１級アミノ基（ここではリジン（Ｋ）残基）と、融合タンパク質における第一のペプチドに含まれるグルタミン（Ｑ）残基と、のモル比（Ｋ／Ｑ比率）を０．５とした。

［細胞毒性試験］
　実施例６８で得られた脂質化タンパク質の反応溶液（未反応の脂溶性ビタミンを有する化合物を含む）を用いて、ＷＳＴアッセイによって脂質化タンパク質の細胞毒性を評価した。上記反応溶液を１００μＬのＤ－ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで６倍に希釈した発色剤（ＷＳＴ－８、同仁化学研究所製）を１１０μＬ／ウェルとなるように添加して、３７℃の条件下で、９０分間インキュベートした。そして、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、細胞生存率を算出した。細胞生存率は実施例１に示したものと同じ式を用いて計算した。結果を図４１に示す。

　実施例６７及び実施例６８の結果から、脂質化タンパク質を係留させる対象となる細胞の存在下で、融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応を行う方法によっても、脂質化タンパク質を対象とする細胞の細胞膜へ係留させることができることが確認された。脂質化タンパク質を係留させる対象となる細胞の存在下で、融合タンパク質と脂質ペプチドとの反応を行う方法は、あらかじめ脂質化タンパク質の合成及び生成を行ってから、対象とする細胞の細胞膜へ脂質化タンパク質を係留させる方法に比べて、精製などの操作が不要であるため、有益である。

Claims (12)

1. 　微生物由来トランスグルタミナーゼの存在下、融合タンパク質と、１級アミノ基を有する化合物とを反応させて、前記融合タンパク質と前記化合物とがイソペプチド結合によって架橋された脂質化タンパク質を得る工程を備え、
   　前記融合タンパク質は、グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有し、
   　前記化合物は、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する、脂質化タンパク質の製造方法。
2. 　前記化合物は、リジン残基を含有する第二のペプチド、及び、脂質部又は脂溶性ビタミン部を有する脂質ペプチドを含み、前記１級アミノ基が前記リジン残基に由来するものである、請求項１に記載の脂質化タンパク質の製造方法。
3. 　前記第二のペプチドは、前記第一のペプチドよりも親水性アミノ酸残基の割合が高い、請求項２に記載の脂質化タンパク質の製造方法。
4. 　前記第二のペプチドは、ヒスチジン残基、プロリン残基、トリプトファン残基及びアルギニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を更に含有する、請求項２又は３に記載の脂質化タンパク質の製造方法。
5. 　前記脂質部は、炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質化タンパク質の製造方法。
6. 　前記第一のペプチドは、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、及びフェニルアラニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基を更に含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の脂質化タンパク質の製造方法。
7. 　グルタミン残基を含有する第一のペプチド及びタンパク質を有する融合タンパク質部と、脂質部又は脂溶性ビタミン部とを含み、
   　前記脂質部又は前記脂溶性ビタミン部が、前記第一のペプチドのグルタミン残基とイソペプチド結合によって前記融合タンパク質部と結合している、脂質化タンパク質。
8. 　前記脂質部又は前記脂溶性ビタミン部は、リジン残基を含有する第二のペプチドを有する脂質ペプチド部を含み、
   　前記イソペプチド結合が、前記リジン残基と前記グルタミン残基との結合である、請求項７に記載の脂質化タンパク質。
9. 　前記第二のペプチドは、前記第一のペプチドよりも親水性アミノ酸残基の割合が高い、請求項８に記載の脂質化タンパク質。
10. 　前記第二のペプチドは、ヒスチジン残基、プロリン残基、トリプトファン残基及びアルギニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を更に含有する、請求項８又は９に記載の脂質化タンパク質。
11. 　前記脂質部は、炭素数１２～１８の脂肪族炭化水素基を有する、請求項７～１０のいずれか一項に記載の脂質化タンパク質。
12. 　前記第一のペプチドは、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、及びフェニルアラニン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基を更に含有する、請求項７～１１のいずれか一項に記載の脂質化タンパク質。

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