WO2019177159A1 - 癌免疫療法併用剤 - Google Patents

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antibody
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壽孝 佐邊
平野　聡
あり 橋本
橋本　茂
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to a cancer immunotherapy companion drug and a method for analyzing the effectiveness of this concomitant drug.
  • Pancreatic ductal cancer is a cancer with a very poor prognosis, with a 5-year survival rate not exceeding several percent.
  • surgical excision and some anticancer drugs are used as the treatment, but their effects are limited.
  • precision medicine has been advocated, but there is no known biomarker that correlates with treatment effect (or treatment resistance).
  • immune system anticancer agents include anti-CTLA-4 antibody (ipilimumab (trade name Yervoy)), anti-PD-1 antibody (nivolumab (trade name Opdivo) and pembrolizumab (trade name Kiytruuda)), and anti-PD-L1 antibody (atezolizumab) (Trade name Tecentric), Averumab (Trade name Babentio), Durvalumab (Trade name Imifinji), but there are still limitations on the types of cancer that can be applied and the range of patients that can be applied.
  • the development of new immune system anticancer agents is also underway, but the effectiveness of immune system anticancer agents against PDAC is unknown (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Literature 1 Japanese Patent No. 6202362
  • Patent Literature 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-020963
  • Patent Literature 3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-021800
  • Patent Literature 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2017-108686
  • Non-Patent Document 1 Jiang H., et al., Nat Med. 22: 851-60, 2016. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.
  • Non-Patent Document 2 Winograd R., et al., Cancer Immunol Res. 3: 399-411, 2015. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockage and Improves Survival in Pancreatic Carcinomas.
  • Fig.3B The entire descriptions of Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 2 are specifically incorporated herein by reference.
  • An object of the present invention is to provide a cancer immunotherapy effective for PDAC.
  • ARF6-AMAP1-EPB41L5 pathway factor group a signal pathway centered on ARF6, promotes invasion and metastasis such as breast cancer and renal cell carcinoma, drug resistance, and has high patient prognosis and survival.
  • ARF6-AMAP1-EPB41L5 pathway factor group a signal pathway centered on ARF6, promotes invasion and metastasis such as breast cancer and renal cell carcinoma, drug resistance, and has high patient prognosis and survival.
  • PDAC having a luminal epithelium as a developmental base
  • a specific gene of the ARF6-AMAP1-EPB41L5 pathway factor group can be used as a marker as a means for predicting recurrence risk.
  • PDAC highly expresses this pathway factor group and promotes invasion and metastasis, drug resistance, and intracellular recycling and cell surface expression of PD-L1, It was clarified that inhibition of this pathway can significantly inhibit invasion and metastasis ability, anticancer drug resistance, and immune surveillance avoidance.
  • the present inventors have discovered that ARF6 and AMAP1 signals are involved in the recycling of PD-L1 using MiaPaCa-2 cells derived from human pancreatic cancer and KPC mouse model cells. Got. Furthermore, the results obtained suggest that the effectiveness of cancer immunotherapy by the combined use of a statin targeting the activation of ARF6 pathway and an anti-PD-L1 antibody is improved. Based on these, the present invention was completed.
  • mTORC1 means mTOR and Raptor complex. See the upper right figure in FIG. 10.
  • mTORC1 means mTOR and Raptor complex. See the upper right figure in FIG. 10.
  • PD-L1 on the cell surface decreased due to inhibition of mTORC1 expression and eIF4A expression. From this, it can be inferred that PD-L1 recycling is also inhibited by mTORC1 expression inhibition and eIF4A expression inhibition.
  • Example 8 the ARF6-AMAP1 pathway is activated by PDGFR, so that PDGFR signaling enhances PD-L1 recycling, and in the absence of PDGF, PD-L1 recycling only occurs at basal level Showed that.
  • PDGFR inhibitors strongly suggest that the ARF6-AMAP1 pathway is inhibited, and this pathway is highly expressed not only by inhibiting the expression of ARF6 and AMAP1, but also by inhibiting PDGFR. Since it can be presumed to inhibit the immune evasion ability of pancreatic cancer, the third aspect of the present invention was completed.
  • Example 12 AMAP1 is involved in PDGF stimulation-dependent control of CXCL12 expression, and in tumor tissues in which AMAP1 expression is suppressed, a stained image in which CXCL12 expression is reduced is observed. It was strongly suggested that AMAP1 is involved in expression control.
  • CXCL12 is a ligand of CXCR4, and is known to be involved in the recruitment of immunosuppressive cells MDSC and Treg that express CXCR4 and in the growth of tumor cells.
  • a CXCR4 inhibitor that inhibits the binding between CXCL12 and CXCR4 is considered to suppress antitumor immunity and have an antitumor effect.
  • the present invention is as follows. [1] One or more expression inhibitors of at least one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR, and eIF4A as an active ingredient, A cancer immunotherapy combination agent used in combination with an anti-PD-L1 antibody. [2] A cancer immunotherapy combination agent used in combination with an anti-PD-L1 antibody, comprising as an active ingredient one or more inhibitors selected from the group consisting of a PDGFR inhibitor and a CXCR4 inhibitor. [3] The cancer immunotherapy combination agent according to [1] or [2], wherein the cancer is pancreatic cancer.
  • the mevalonate pathway activity inhibitor is a statin.
  • the expression inhibitor is a nucleic acid that inhibits the expression of ARF6 or AMAP1.
  • the expression inhibitor is an expression inhibitor for mTOR or an expression inhibitor for eIF4A.
  • the anti-PD-L1 antibody is at least one selected from the group consisting of the anti-PD-L1 monoclonal antibody atezolizumab, the anti-PD-L1 monoclonal antibody averumab, and the anti-PD-L1 monoclonal antibody durvalumab [1] to [7]
  • the cancer immunotherapy combination agent according to any one of the above.
  • An analytical agent comprising a protein and / or polypeptide capable of specifically recognizing a translation product of any one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR and eIF4A.
  • a method for analyzing the effectiveness of a cancer immunotherapy combination agent comprising: [12] The method according to [11], wherein in step (A), the translation product expression levels of all genes selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR and eIF4A are determined.
  • a concomitant drug that enhances the effect of cancer immunotherapy possessed by an anti-PD-L1 antibody can be provided by using it together with an anti-PD-L1 antibody.
  • a method for analyzing the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention can be provided.
  • the expression result of PD-L1 in MiaPaCa-2 cells stimulated with IFN ⁇ in Example 1 is shown.
  • the expression result of PD-L1 of the MiaPaCa-2 cell which suppressed the expression of the ARF6 pathway structure protein in Example 2 is shown.
  • the cell membrane localization test result of PD-L1 of MiaPaCa-2 cells in which the expression of ARF6 pathway constituent protein was suppressed in Example 3 is shown.
  • the flow cytometry (FACS) analysis result of the cell surface PD-L1 in the MiaPaCa-2 cell which suppressed the expression of the ARF6 pathway structure protein in Example 4 is shown.
  • the results of the cell membrane localization test of PD-L1 of MiaPaCa-2 cells subjected to Simvastatin treatment in Example 5 are shown.
  • the results of the cell membrane localization test of PD-L1 of MiaPaCa-2 cells treated with Brefeldin A in Example 6 are shown.
  • the FACS analysis result of PD-L1 on the cell surface in MiaPaCa-2 cells treated with Simvastatin and BrefeldinfeldA in Example 7 is shown.
  • the recycling analysis result of PD-L1 in the MiaPaCa-2 cell which suppressed the expression of the ARF6 pathway structure protein in Example 8 is shown.
  • the analysis result of the tumor growth ability by the KPC cell using the individual in Examples 9a to c is shown.
  • FIG. 10 shows a model obtained by analyzing the relationship between the malignancy of pancreatic cancer and the ARF6 pathway on the upper left.
  • the upper right figure shows that mTOR is involved in the expression of AMAP1, and eIF4A is involved in the induction of ARF6 expression.
  • the lower right figure shows that PDGFR and mevalonate pathway are involved in ARF6 activity.
  • the result of A of Example 10 is shown.
  • the result of B of Example 10 is shown.
  • the result of C of Example 10 is shown.
  • the result of D of Example 10 is shown.
  • the result of E of Example 10 is shown.
  • the result of F of Example 10 is shown.
  • the result of G of Example 10 is shown.
  • the result of A of Example 11 is shown.
  • the result of B of Example 11 is shown.
  • the result of C of Example 11 is shown.
  • the result of A of Example 12 is shown.
  • the result of B of Example 12 is shown.
  • the result of C of Example 12 is shown.
  • the result of D of Example 12 is shown.
  • the result of E of Example 12 is shown.
  • One aspect of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention comprises one or more expression inhibitors of at least one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR and eIF4A as an active ingredient,
  • the anti-PD-L1 antibody comprising, as an active ingredient, one or two or more expression inhibitors of one or two genes selected from the group consisting of ARF6 and AMAP1 Is a cancer immunotherapy concomitant drug used in combination.
  • the knowledge obtained by the present inventors was obtained using human pancreatic cancer-derived MiaPaCa-2 cells and KPC mouse model cells as described above, and the cancer immunotherapy combination agent of the present invention is at least It is effective as a concomitant epidemiological treatment for pancreatic cancer, and the same effect can be obtained in cases other than pancreatic cancer, as long as at least one of ARF6 and AMAP1 signals is involved in recycling of immune checkpoint molecule PD-L1. I can expect.
  • ARF6 and AMAP1 are genes belonging to the ARF6 signal pathway (also referred to as ARF6-AMAP1-EPB41L5 pathway) factor group. It has already been reported that the ARF6 signal pathway is involved in breast cancer invasion, metastasis, and drug resistance.
  • the low molecular weight G protein ARF6 (ADP-ribosylation factor 6) belongs to the Arf subfamily in the Ras superfamily.
  • Arf GTPase ⁇ is classified into three classes, but ARF6 is only classified into class III, and various cell movements (endocytosis, exocytosis, membrane station) that are localized in cell membranes and endosomes and are based on the dynamics of the actin cytoskeleton. It controls the transport and recirculation of proteins in the membrane, and the roughing of cell membranes. These cellular functions are the basis for physiological / pathological cell movement and intracellular transport.
  • ARF6 traverses between an inactive state associated with GDP and an active state associated with GTP, and functions as a molecular switch in cellular processes.
  • ARF6 is activated when GDP is converted to GTP by GEF (guanine exchange factors), and inactivated when GTP is hydrolyzed by GAP (GTPase activating proteins). In order to hydrolyze GTP to which ARF6 is bound to GDP, it is necessary to assist GAP.
  • GEF guanine exchange factors
  • GAP GTPase activating proteins
  • Statins are a general term for HMG-Co-A reductase inhibitors, and many types are marketed as drugs for lowering blood cholesterol levels. Although there is no restriction
  • Rosuvastatin Crestor Pitavastatin Rivaroatorvastatin Lipitor Cerivastatin Cerivastatin Baycol / Celtafluvastatin Fluvastatin Simvastatin Lipova (Zocor) Pravastatin (Pravastatin) Mevalotin (Pravachol) Lovastatin Mevastatin
  • the concomitant drug of the present invention containing statin as an active ingredient can contain an optional ingredient for formulation.
  • an optional ingredient for formulation for example, powders, granules, tablets, suppositories, and injections can be prepared according to a conventional method.
  • the optional component include emulsifiers, solubilizers, dispersants, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, sugar-coating agents, flavoring agents, and stabilizers.
  • the concomitant drug of the present invention containing a statin as an active ingredient is appropriately determined by a medical staff in consideration of the dose of a known statin and the concomitant effect obtained by administration.
  • the expression inhibitor of ARF6 gene and AMAP1 gene can also be a nucleic acid that inhibits the expression of ARF6 or AMAP1, and the nucleic acid can be a ribonucleic acid (RNA) capable of causing ribonucleic acid interference, eg, siRNA , ShRNA, miRNA and the like.
  • RNA ribonucleic acid
  • ARF6 has a cds region base sequence represented by NM_001663.3 (SEQ ID NO: 1).
  • ARF6 includes splice variants of ARF6.
  • AMAP1 has a cds region base sequence of NM_018482.3 (SEQ ID NO: 2).
  • AMAP1 (ASAP1) also includes its splice variants. Examples of the splice variant of AMAP1 (ASAP1) include a protein having a cds region base sequence of NM_001247996.1 (SEQ ID NO: 3).
  • SiRNA and the like that inhibit the expression of these proteins can be appropriately designed and obtained by known methods based on the base sequence of cDNA encoding the protein.
  • a “prediction algorithm” is known and can be used. For example, when a cDNA sequence of a protein to be targeted is entered, candidate sequences with high “score” can be automatically listed according to a prediction algorithm, and siRNA that inhibits the expression of the protein can be obtained from the listed candidate sequences. it can. Furthermore, when using a prediction algorithm, it is possible to obtain a candidate sequence that takes into consideration that “no other genes are targeted”, that is, specificity. It can be easily confirmed that the candidate sequence obtained by “prediction” has an expression suppression effect experimentally.
  • nucleic acids that inhibit the expression of ARF6 include siRNAs consisting of 5'-GCACCGCAUUAUCAAUGACCGdTdT-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-CAACGUGGAGACGGUGACUUdTdT-3' (SEQ ID NO: 5).
  • nucleic acid that inhibits the expression of AMAP1 examples include siRNA consisting of 5'-AAGACCUGACAAAAGCCAUUAdTdT-3 '(SEQ ID NO: 6) and 5'-CCAGGGAUUUACUUGCACUAAdTdT-3' (SEQ ID NO: 7).
  • Each of the siRNAs exemplified above has a sequence that has been confirmed to inhibit the expression of each protein by actually synthesizing a nucleic acid fragment from candidate sequences obtained using the prediction algorithm. is there.
  • the nucleic acid fragments and siRNA may include delivery vehicles, carriers and diluents and salts thereof for administration to a subject, including liposomes, and / or are present in a pharmaceutically acceptable formulation. Also good.
  • the nucleic acid fragment and siRNA can be used as a target by using any delivery vehicle having an effect of assisting, promoting or facilitating entry into cells, including viral vectors, viral particles, liposome preparations, lipofectin or precipitants. In addition to being able to be administered, it can also be delivered or administered directly with a carrier or diluent without the use of a delivery vehicle. Delivery vehicles, carriers and diluents, or pharmaceutically acceptable formulations can be appropriately selected from known ones.
  • siRNA can be administered as an emulsion, orally or as a suppository, in addition to injection.
  • delivery vehicle carrier and diluent, or pharmaceutically acceptable formulation
  • JP 2013-514761 is a publication of WO2011 / 072082.
  • One aspect of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention comprises one or more expression inhibitors of at least one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR and eIF4A as an active ingredient
  • the cancer immunotherapy combination agent of the second aspect is an anti-PD-L1 antibody comprising as an active ingredient one or more expression inhibitors of one or two genes selected from the group consisting of mTOR and eIF4A Is a cancer immunotherapy concomitant drug used in combination.
  • TOR is an abbreviation for target of rapamycin (rapamycin target protein), a kind of protein kinase involved in intracellular signal transduction in animals, and mTOR is an abbreviation for mammalian TOR.
  • eIF4A is an abbreviation for eukaryotic initiation factor 4A, one of eukaryotic translation initiation factors, and a DEAD box RNA helicase.
  • the left figure of FIG. 10 shows a model obtained by analyzing the relationship between the malignancy of pancreatic cancer and the ARF6 pathway.
  • the KRAS signal and p53 mutation accompanying gene mutation are involved in high expression of proteins such as ARF6, AMAP1, and EPB41L5 which are ARF6 pathway factors.
  • mTOR is involved in the expression of AMAP1
  • eIF4A is involved in the induction of ARF6 expression.
  • the present inventors examined the relationship between mTORC1 expression inhibition and eIF4A expression inhibition and PD-L1 amount on the cell surface using MiaPaCa-2 cells derived from human pancreatic cancer. As a result, it was found that PD-L1 on the cell surface decreased in any case of inhibition. This can be presumed that PD-L1 recycling is inhibited by both mTORC1 expression inhibition and eIF4A expression inhibition. Therefore, coupled with the findings in the first aspect of the present invention, It was found that the cancer immunotherapy combination agent of the second aspect is also effective as an epidemiological combination agent for at least pancreatic cancer. Further, in addition to pancreatic cancer, similar effects can be expected for PD-L1 recycling if mTOR is involved in AMAP1 expression or eIF4A is involved in ARF6 expression.
  • mTOR inhibitors examples include Temsirolimus® (CAS RN: 162635-04-3), Everolimus® (CAS: 159351-69-6), Rapamycin® (CAS: 53123-88-9), Torin 1 (CAS: 1222998-36) -8), and Torin 2: 1 (CAS: 1223001-51-1).
  • eIF4A inhibitor examples include Silvestrol® (CAS: 697235-38-4), eFT226, Hippuristanol® (CAS: 80442-78-0), and the like.
  • the concomitant drug of the present invention containing an mTOR inhibitor or an eIF4A inhibitor as an active ingredient can contain an optional ingredient for formulation.
  • an optional ingredient for formulation for example, powders, granules, tablets, suppositories, and injections can be prepared according to a conventional method.
  • the optional component include emulsifiers, solubilizers, dispersants, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, sugar-coating agents, flavoring agents, and stabilizers.
  • mTOR inhibitors and eIF4A inhibitors are known compounds, and their existing pharmacological effects and therapeutic effects are also known.
  • the concomitant drugs of the present invention containing these compounds as active ingredients are doses of known compounds. In view of the above, and taking into account the combined effect obtained by administration, it is appropriately determined by a medical worker.
  • the cancer immunotherapy combination agent of the third aspect of the present invention relates to a cancer immunotherapy combination agent used in combination with an anti-PD-L1 antibody, which comprises a PDGFR inhibitor as an active ingredient.
  • PDGFR is an abbreviation for Platelet-Derived Growth Factor Receptor
  • PDGF is a growth factor mainly involved in the regulation of mesenchymal cell migration and proliferation, and has physiological activity through PDGFR. To express.
  • Example 8 the ARF6-AMAP1 pathway was activated via PDGFR, and as a result, it was shown that the PDGFR signal enhances PD-L1 recycling. Furthermore, it was shown that PD-L1 recycling can only occur at basal level under the conditions without PDGF addition. As shown in the left diagram of FIG. 10, since the PDGFR inhibitor inhibits activation of the ARF6-AMAP1 pathway, based on the experimental results of Example 8 above, it is not a direct expression inhibition of ARF6 and AMAP1, It can be presumed that inhibition of PDGFR also inhibits immune evasion ability of pancreatic cancer that highly expresses the ARF6-AMAP1 pathway. This point can be confirmed experimentally by each method shown in Example 11.
  • PDGFR inhibitors Various compounds are known as PDGFR inhibitors and are commercially available.
  • Crenoranib CAS: 220670220-88-9 and Imatinib CAS (CAS: 152459-95-5)
  • Sunitinib CAS: 341031-54-7
  • Ponatinib CAS: 943319-70-8
  • Axitinib CAS: 319460-85-0
  • Nintedanib CAS CAS: 656247-17-5
  • Pazopanib CAS CAS: 444731-52-6
  • Dovitinib CAS: 405169-16-6
  • Linifanib CAS: 796967-16-3)
  • Masitinib CAS: 790299-79-5
  • Tivozanib CAS: 475108-18-0
  • Amuvatinib CAS: 850879-09-3
  • Orantinib CAS: 252916-29-3
  • CP-673451 CAS: 343787-29
  • the cancer immunotherapy combination agent according to the fourth aspect of the present invention relates to a cancer immunotherapy combination agent used in combination with an anti-PD-L1 antibody, comprising a CXCR4 inhibitor that inhibits CXCL12-CXCR4 binding as an active ingredient.
  • CXCR4 is an abbreviation for CXC chemokine receptor-4.
  • One of the proteins on the surface of CD4 positive T cells, particularly naive T cells, is a chemokine receptor that accepts chemokine SDF-1 produced by supporting cells between cells, and is a kind of G protein-coupled receptor It is.
  • CXCR4 is a chemokine receptor used when AIDS virus infects host cells.
  • CXCR4 ligand CXCL12 SDF-1 / PBSF
  • Example 12 AMAP1 is shown to be involved in PDGF stimulation-dependent CXCL12 expression control (FIG. 13C), and in the tumor tissue in which AMAP1 expression was suppressed, a stained image in which CXCL12 expression decreased Observed (FIG. 13E), strongly suggesting that AMAP1 is involved in the regulation of CXCL12 expression. From this, it can be presumed that the CXCR4 inhibitor does not directly inhibit the expression of ARF6 and AMAP1, but also inhibiting CXCR4 inhibits the immune evasion ability of pancreatic cancer that highly expresses the ARF6-AMAP1 pathway ( (See the lower diagram in FIG. 13A).
  • CXCL12 is increased by AMAP1, and anti-tumor immunity is generated by recruiting immunosuppressive cells that express CXCR4, or the growth of tumor cells that express CXCR4 is promoted.
  • anti-tumor immunity is suppressed, and it is considered that cancer immunotherapy with anti-PD-L1 antibody becomes more effective. That is, it is suggested that cancer immunotherapy with CXCL12-CXCR4 inhibition and anti-PD-L1 antibody may be effective in pancreatic cancer expressing the Arf6-AMAP1 pathway.
  • CXCR4 inhibitors Various compounds are known as CXCR4 inhibitors, and are commercially available.
  • CXCR4 chemokine receptor antagonist “Mozobil® Mozovir” (generic name: Prerixaphor), CXCL12 analogue CTCE-9908 (ChemokineTherapeutics , Canada), anti-CXCL12 aptamer Nox-A12 (Noxxon, Germany), modified peptide CXCR4 antagonists (e.g., T140, BKT140, POL6326, FC131), small-molecules CXCR4 antagonists (e.g., AMD3100, AMD1221 ), CXCL12 peptide analogs (e.g.
  • CTCE-9908, CTCE-0214 Antibodies targeting CXCR4 (e.g. MDX-1338 / BMS93656, ALX-0651), 30D8: a humanized antibody against mouse / human CXCL12 .
  • CXCR4 e.g. MDX-1338 / BMS93656, ALX-0651
  • 30D8 a humanized antibody against mouse / human CXCL12 .
  • the combination agent of the present invention containing one or more inhibitors selected from the group consisting of a PDGFR inhibitor and a CXCR4 inhibitor as an active ingredient can contain an optional ingredient for formulation.
  • an optional ingredient for formulation for example, powders, granules, tablets, suppositories, and injections can be prepared according to a conventional method.
  • the optional component include emulsifiers, solubilizers, dispersants, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, sugar-coating agents, flavoring agents, and stabilizers.
  • PDGFR inhibitors and CXCR4 inhibitors are known compounds, and their physiological activities, existing pharmacological effects and therapeutic effects are also known, and the combination agent of the present invention containing these compounds as active ingredients is known compounds. In consideration of the dose of the drug, and taking into account the combined effect obtained by administration, it is appropriately determined by the medical staff.
  • the use amount of the cancer immunotherapy combination agent (first to fourth aspects) of the present invention is the type of anti-PD-L1 antibody to be used together, the dose, the administration method, the patient's symptoms, age, the administration method of the combination agent, etc.
  • the lower limit is 0.01 mg / kg body weight (preferably 0.1 mg / kg body weight) and the upper limit is 1000 mg / kg body weight (preferably 100 mg / kg body weight).
  • the upper limit is 1000 mg / kg body weight (preferably 100 mg / kg body weight). It can be administered one to several times per day depending on the symptoms.
  • this numerical range is an example, and is not intended to be limited to these ranges.
  • Examples of the anti-PD-L1 antibody used in combination with the cancer immunotherapy combination agent of the present invention include, for example, human PD-L1 monoclonal antibody human atezolizumab (trade name Tecentriq), human PD-L1 monoclonal antibody averumab (product) And the human-type PD-L1 monoclonal antibody durvalumab (trade name imifinji).
  • the present inventors have obtained a new finding that ARF6 and AMAP1 signals are involved in PD-L1 recycling. Furthermore, the results obtained suggest that the effectiveness of cancer immunotherapy by the combined use of a statin targeting the activation of ARF6 pathway and an anti-PD-L1 antibody is improved.
  • ARF6 pathway is involved in the recycling of PD-L1 expressed in cancer cells.
  • PD-L1 is recycled (taken into the cell and transferred to the cell membrane again), it is expected that the anti-PD-L1 antibody is detached and the therapeutic effect is lowered.
  • Statin a mevalonate pathway inhibitor, inhibits ARF6 activity and is expected to increase its therapeutic effect when used in combination with anti-PD-L1 antibody therapy.
  • inhibition of PD expression of PD-L1 is inhibited by both inhibition of mTOR expression and inhibition of eIF4A expression, the use of these inhibitors in combination with anti-PD-L1 antibody therapy increases the therapeutic effect. Be expected.
  • inhibiting the PDGFR can also inhibit the ARF6-AMAP1 pathway and, as a result, inhibit the recycling of PD-L1.
  • antitumor immunity can be suppressed by inhibiting CXCR4, an increase in therapeutic effect is expected by using a PDGFR inhibitor or CXCR4 inhibitor in combination with anti-PD-L1 antibody therapy.
  • the cancer immunotherapy combination agent of the present invention is a statin under the management of a medical professional
  • the statin is, for example, Standard dosages adopted when used alone, depending on the type of statin, etc. (for example, daily) and anti-PD-L1 antibody is used alone depending on the type of anti-PD-L1 antibody It can be done in the same way as a schedule. However, it can be appropriately changed under the management of a medical professional according to the type of cancer, the condition of the patient, the type of concomitant cancer immunotherapy, the type of anti-PD-L1 antibody, and the like.
  • the present invention includes an analytical agent for use in analyzing the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention.
  • This analytical agent contains a protein and / or polypeptide that can specifically recognize a translation product of at least one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR, and eIF4A.
  • the analytical agent of the present invention is used for analyzing the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention, and a translation product of at least one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR, and eIF4A. Contains specifically recognizable proteins and / or polypeptides.
  • Proteins and / or polypeptides that can specifically recognize gene translation products can be, for example, antibodies and antibody fragments.
  • the protein and / or polypeptide capable of specifically recognizing the translation product of the ARF6 gene can be, for example, a specific antibody against ARF6 protein or a fragment thereof.
  • Such antibodies are commercially available and are exemplified below. It is not intended to be limited to these.
  • Anti-ARF6 antibody (ab219350) Anti-ARF6 antibody [EPR8357] (ab131261) Anti-ARF6 antibody (ab77581) Anti-ARF6 antibody (ab81650) Anti-ARF6 antibody (sc-7971)
  • the protein and / or polypeptide capable of specifically recognizing the translation product of the mTOR gene can be, for example, a specific antibody against the mTOR protein or a fragment thereof.
  • Such antibodies are commercially available and are exemplified below. It is not intended to be limited to these.
  • Anti-mTOR antibody (GTX101557) Anti-mTOR antibody (ab2732) Anti-mTOR antibody (ab45989) Anti-mTOR antibody [EPR390 (N)] (ab134903) Anti-mTOR antibody (ab2833) Anti-mTOR antibody (CST2972)
  • the protein and / or polypeptide capable of specifically recognizing the translation product of the eIF4A gene can be, for example, a specific antibody against the eIF4A protein or a fragment thereof.
  • Such antibodies are commercially available and are exemplified below. It is not intended to be limited to these.
  • Anti-eIF4A antibody (GTX114910) Anti-eIF4A antibody (ab31217) Anti-eIF4A antibody [EPR14505 (B)] (ab180506) Anti-eIF4A antibody [EPR14506] (ab185946) Anti-eIF4A antibody (NBP2-16302)
  • the protein and / or polypeptide capable of specifically recognizing the translation product of the AMAP1 gene can be, for example, an antibody specific to the AMAP1 protein or a fragment thereof, and specifically, for example, AMAP1 (SEQ ID NO: 2 ) In the vicinity of the amino acid sequence from the 935th to the 1002nd, or an fragment thereof having an amino acid sequence serving as an epitope (see Patent Document 4).
  • the protein and / or polypeptide capable of specifically recognizing the translation product of the gene is not particularly limited as long as it can specifically bind to the translation product of one of the genes.
  • an antibody against the translation product and / or a fragment thereof can be mentioned.
  • antibodies and / or fragments thereof include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies, and the like.
  • any method can be adopted as long as specific binding to the gene translation product can be maintained.
  • a desired polyclonal antibody, monoclonal antibody, single chain antibody, humanized antibody and the like can be prepared by a known method using the protein and / or fragment thereof as the gene translation product as an antigen.
  • the specific binding property to the gene translation product possessed by the protein and polypeptide that can specifically recognize the translation product of the above-mentioned gene is that the translation product of the gene can coexist with the translation product of the gene. It is sufficient if it can be distinguished from the translation product of the gene. Therefore, for example, even in the case of proteins and polypeptides that can specifically recognize a translation product of a gene in which a partial modification (substitution, deletion, addition, etc.) is added to the gene, As long as it has a specific binding property to a gene translation product that can be distinguished from the translation product of another gene that may coexist with the translation product of the gene, the “translation product of the gene is specifically recognized” of the present invention. Possible proteins and / or polypeptides ”.
  • the single analytical agent may contain only one kind of protein or polypeptide that can specifically recognize the translation product of one of the above genes, Alternatively, two or more kinds of proteins and / or polypeptides capable of specifically recognizing each translation product of the gene may be included.
  • the protein and / or polypeptide may be labeled with a labeling substance for detection of gene translation products.
  • the labeling substance include fluorescent substances (for example, fluorescent proteins such as GFP, and fluorescent low molecular compounds such as fluorescein). However, it is not intended to be limited to those having labels with these labeling substances.
  • the translation product of the gene can be detected by a known method.
  • a system using a secondary antibody that binds to the protein and / or polypeptide primary antibody
  • detection kits for systems using secondary antibodies for systems using secondary antibodies.
  • the secondary antibody against the primary antibody is labeled with peroxidase, and the secondary antibody is further specifically bound to the primary antibody specifically bound to the target gene translation product in the sample.
  • a gene translation product can be detected by adding a chromogenic substrate (eg, 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride) to the sample and observing the color development.
  • a chromogenic substrate eg, 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • one analytical drug contains two or more proteins and / or polypeptides capable of specifically recognizing each of the translation products of the above genes, for example, two or more of them
  • proteins and / or polypeptides can be labeled with different fluorescent substances that emit fluorescence of different wavelengths. Thereby, each target gene translation product can be detected in the same sample.
  • Analytical agents can optionally include buffering agents, preservatives, antifreezing agents, and the like.
  • buffer include tris hydrochloride, potassium phosphate, sodium phosphate and the like.
  • preservative include sodium azide.
  • antifreezing agent include glycerol.
  • the present invention relates to a method for analyzing the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention, which comprises the following steps (A) and (B).
  • a “biological sample” is any biological sample collected from a patient who has been treated for cancer.
  • the biological sample can be pancreatic tissue.
  • the pancreatic tissue for example, a tissue of a pancreatic lesion site removed from a patient at the time of tumor excision in the treatment of pancreatic cancer, or a pancreatic tissue in the vicinity where the lesion site was present, and after the tumor excision
  • the pancreatic tissue collected separately from the excision can be mentioned.
  • the pancreatic tissue should be the tissue of the pancreatic cancer lesion site removed from the patient at the time of tumor removal Is preferred.
  • Step (A) In a biological sample collected from a cancer patient, a translation product expression level of at least one gene selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR, and eIF4A is determined.
  • the translation product expression level of some or all of the genes selected from the group consisting of ARF6, AMAP1, mTOR and eIF4A can be determined.
  • the method for determining the expression level of translation products of these genes is not particularly limited as long as it is performed on the biological sample.
  • the determination of the translation product expression level of the at least one gene may be performed, for example, on the entire biological sample, or may be performed on a specific type of cell in the biological sample, or The cytoplasm and the cell nucleus may be separately performed in the cells present in the sample.
  • the result of the determined translation product expression level is the result for the cytoplasm and the cell nucleus. Two types of results are obtained. These two types of results can be used for the later-described step (B).
  • the method for determining the translation product expression level of the predetermined gene in the biological sample used in step (A) of the method of the present invention is not particularly limited. Specifically, as described above for the analytical agent of the present invention, the expression level of the translation product of the gene is determined using a protein or polypeptide (analytical agent) that can specifically recognize the translation product of the gene to be detected. A method of determining is available. Specifically, it is preferable to determine the expression level by accurately grasping the expression intensity and expression distribution of the gene translation product in a tissue section that is a biological sample. In particular, determining the translation product expression level of the gene by immunohistochemistry using these proteins and / or polypeptides (analytical drugs) can more accurately grasp the expression intensity and distribution of the gene translation product.
  • the translation product expression level determination method such as immunohistochemistry is not particularly limited as long as the expression level of the target gene translation product can be determined.
  • step (A) the expression level of the translation product of the at least one gene is determined, for example, by an immunohistochemical method using a protein and / or polypeptide that can specifically recognize the translation product of the gene. Is preferable from the viewpoint of ensuring specific detection of gene translation products.
  • the protein and / or polypeptide can be an antibody and / or a fragment thereof.
  • step (A) of the method of the present invention the expression level of the translation product of a predetermined gene of the present invention is determined based on the signal intensity detected by an arbitrary protein detection method in a biological sample, and comparison with this standard is used. I can do it.
  • biological samples used as a reference include non-cancerous tissues (particularly non-cancerous pancreatic tissues) collected from the same patient, and the expression level of the gene translation product of the present invention in this tissue is used as a control. be able to.
  • the non-cancerous tissue especially non-cancerous pancreatic tissue collected from the same patient, and the gene translation product expression signal intensity according to the present invention in the target biological sample, By detecting and comparing with the same protein detection method, the translation product expression level of at least one gene of the present invention can be determined.
  • the signal intensity of translation product expression of at least one gene of the present invention in the subject biological sample in the target biological sample is, for example, “high”, “equivalent” Alternatively, a ranking such as “low” can be given.
  • the signal intensity of the translation product expression of at least one gene of the present invention in the subject biological sample in the target biological sample can be scored based on the signal intensity used as the reference. Signal intensity scoring is performed, for example, by setting the signal intensity of the gene translation product in the sample used as a reference to 0, and comparing the signal intensity with the signal intensity of the gene translation product in the target biological sample. It can be scored with an integer such as. Ranking and scoring of signal intensity of gene translation products can be determined as appropriate.
  • step (B) Based on the translation product expression level determined in step (A), information for analyzing the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent of the present invention of the patient from whom the biological sample was collected is obtained.
  • the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent can be analyzed based on a rank such as “low” or a scored value. More specifically, when the expression level of the translation product of the at least one gene in the target biological sample is obtained as “high”, the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent is effective for the patient. It can be understood that it is relatively high. Further, when the expression level of the translation products of the above two genes in the target biological sample is ranked as “high”, the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent is relatively higher for the patient. I can understand.
  • the cancer immunotherapy combination agent is effective for the patient. It can be understood that the sex is relatively low.
  • the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent can be understood from the score itself. Alternatively, a score such as “high”, “low”, or “moderate” is assigned in advance to the score, and the effectiveness of the cancer immunotherapy combination agent is “high”, “low”, or It can also be understood as “medium”.
  • the cancer immunotherapy combination agent of the present invention can be a cancer immunotherapy combination agent for use in the treatment of patients whose effectiveness has been analyzed based on the information obtained in the efficacy analysis method of the present invention.
  • the cancer immunotherapy combination agent of the present invention is preferably used for the treatment of patients who have been analyzed as having relatively high effectiveness based on the information obtained by the efficacy analysis method of the present invention.
  • the presence / absence of effectiveness is appropriately determined by a medical professional based on information acquired by the effectiveness analysis method of the present invention.
  • Example 1 Expression of PD-L1 in IFN ⁇ -stimulated MiaPaCa-2 cells MIAPaCa-2 cells were used to stimulate IFN ⁇ (0, 10 50 ng / ml), and cell extracts were collected 72 hours later, and 10 ⁇ g was used to collect SDS- PAGE was performed, and immunoblotting was performed using PD-L1 and ⁇ -actin antibody.
  • Example 2 Expression of PD-L1 in MiaPaCa-2 cells with suppressed expression of ARF6 pathway constituent proteins
  • Various MRNAs were introduced using Lipofectamine RNAiMAX using MiaPaCa-2 cells and stimulated with IFN ⁇ (50 ng / ml) 48 hours later After collecting the cell extract, SDS-PAGE was performed using 10 ⁇ g, and immunoblotting was performed using various antibodies.
  • EPB41L5 sequence targeted by siRNA GAGAUGGAACUGGCUAUUUUU (SEQ ID NO: 8)
  • Example 3 Cell membrane localization of PD-L1 in MiaPaCa-2 cells with suppressed expression of ARF6 pathway-constituting proteins
  • MiaPaCa-2 cells were used to introduce various siRNAs in the same manner as in Example 2 and stimulated with IFN ⁇ (50 ng / ml) Went. After 48 hours, the cells were fixed with 4% PFA / PBS, stained with anti-PD-L1 antibody, and labeled with anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 555) as a secondary antibody. Alexa Fluor 488 phalloidin was used for actin staining, and DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) was used for nuclear staining.
  • Example 4 Flow cytometry (FACS) analysis of PD-L1 on the cell surface in MiaPaCa-2 cells with suppressed expression of ARF6 pathway constituent proteins.
  • Various siRNAs were introduced in the same manner as in Example 2, and the cells were collected 48 hours later. After the reaction using anti-PD-L1-PE, FACS analysis was performed. Mouse IgG-PE was used as a negative control.
  • FIG. As a result of FACS analysis, a decrease in PD-L1 on the cell surface was observed due to suppression of ARF6 and AMAP1 expression. On the other hand, suppression of EPB41L5 expression did not show a decrease in PD-L1 on the cell surface.
  • Example 5 Cell membrane localization of PD-L1 in MiaPaCa-2 cells treated with Simvastatin After stimulation with IFN ⁇ (50 ng / ml) using MiaPaCa-2 cells, Simvastatin (1 ⁇ M) was added, and 4% PFA 24 hours later The cells were fixed with / PBS, stained with anti-PD-L1 antibody, and labeled with anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 555) as a secondary antibody. Alexa Fluor 488 phalloidin was used for actin staining, and DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) was used for nucleus staining.
  • FIG. 1 The mevalonate pathway is involved in the activation of the ARF6 pathway.
  • Simvastatin 1 ⁇ M
  • a mevalonate pathway inhibitor a mevalonate pathway inhibitor, a decrease in cell surface PD-L1 was observed.
  • Example 6 Cell membrane localization of PD-L1 in MiaPaCa-2 cells treated with Brefeldin A After stimulation with IFNg (50 ng / ml) using MiaPaCa-2 cells, Brefeldin A (5 ⁇ g / ml) was added, and 30 minutes Thereafter, the cells were fixed with 4% PFA / PBS, and stained with an anti-PD-L1 antibody in the same manner as in Example 5. Anti- ⁇ -COP antibody was used for ⁇ -COP staining.
  • FIG. 1 The addition of Brefeldin A (an inhibitor of GEF that activates Arf1) to MiaPaCa-2 cells does not change the localization of PD-L1, so Arf1 may be involved in PD-L1 recycling Is considered low. Differences in the localization of ⁇ -COP, which is sensitive to Brefeldin A, indicate that Brefeldin A is functioning without problems.
  • Brefeldin A an inhibitor of GEF that activates Arf1
  • Example 7 FACS analysis of PD-L1 on the cell surface in MiaPaCa-2 cells treated with Simvastatin and Brefeldin A
  • IFNg 50 ng / ml
  • Simvastatin 1 ⁇ M
  • 24 Cells were harvested after time.
  • Brefeldin A 5 ⁇ g / ml
  • cells were collected 30 minutes after the addition.
  • FACS analysis was performed.
  • Mouse IgG-PE was used as a negative control.
  • FIG. As a result of FACS analysis, PD-L1 on the cell surface was decreased in MiaPaCa-2 cells treated with Simvastatin (1 ⁇ M), whereas PD-L1 on the cell surface was decreased in cells treated with BFA (Brefeldin A) Was not seen.
  • Example 8 Recycling analysis of PD-L1 in MiaPaCa-2 cells with suppressed expression of ARF6 pathway constituent proteins
  • Various MRNAs were introduced into MiaPaCa-2 cells in the same manner as in Example 2 and stimulated with IFNg (50 ng / ml) 48 hours later, after reacting at 4 ° C. with PD-L1 on the cell surface using an anti-PD-L1 antibody, the cell surface PD-L1 was internalized by culturing at 37 ° C. After that, the anti-PD-L1 antibody bound to PD-L1 on the cell surface is dissociated with acid wash (0.5% glacial acetic acid and 0.5M NaCl, pH 3.0) and cultured again at 37 ° C.
  • PD-L1 internalized in the cells was recycled back to the cell surface.
  • PD-L1 that had been internalized in the cells was permeabilized with 0.1% TritoX-100 and labeled with anti-mouse IgG (Alexa Fluor 790).
  • PD-L1 on the cell surface was labeled with anti-mouse IgG (Alexa Fluor 790) without permeabilizing and quantified with Odyssey.
  • Nuclear staining was performed with DRAQ5, the value of internalization with respect to the number of cells was calculated, and the ratio of recycling to internalization was calculated over time.
  • FIG. 1 When PDGF stimulation was performed using MiaPaCa-2 cells, the recycling of PD-L1 increased (blue line). On the other hand, when the expression of ARF6 and AMAP1 was suppressed, PDGF stimulation-dependent PD-L1 recycling was not observed (red line, green line). In the suppression of EPB41L5 expression, PDGF stimulation-dependent PD-L1 recycling was observed (purple line), indicating that Arf6 and AMAP1 signals are involved in PDGF stimulation-dependent PD-L1 recycling.
  • KPC cells (Irr or shAMAP1) were transplanted subcutaneously into a syngenic mouse (C57BL / 6), and Anti-PD-L1 Ab or mouse IgG was intraperitoneally administered at 10 mg, 13 and 16 at 3 mg / kg Then, the tumor growth ability was measured by the tumor volume for 25 days.
  • the time schedule of the treatment experiment using PD-L1 antibody is shown in FIG. 9d.
  • FIGS. 9a-c and 9e The results are shown in FIGS. 9a-c and 9e.
  • a Using mouse pancreatic cancer cell KPC, control (irr), FAK expression-suppressed (shFAK) and AMAP1 expression-suppressed (shAMAP1) cells were transplanted subcutaneously in a syngenic mouse (C57BL / 6) in which the immune system is maintained Then, the tumor growth ability of FAK expression suppression (shFAK) and AMAP1 expression suppression (shAMAP1) cells was suppressed as compared with the control (irr). The suppression of AMAP1 expression inhibited the ability of tumor growth more than the suppression of FAK expression (FIG. 9a).
  • Example 10 A. PD-L1 cell membrane localization of MiaPaCa-2 cells with suppressed expression of GGT-II GGT-II siRNA was introduced into MiaPaCa-2 cells and stimulated with IFN ⁇ (50 ng / ml). After 48 hours, cells were fixed with 4% PFA / PBS, stained with anti-PD-L1 antibody, and labeled with anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 555) as a secondary antibody. Alexa Fluor 488 phalloidin was used for actin staining, and DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) was used for nuclear staining.
  • GGT-II siRNA / shRNA The target sequence information of GGT-II siRNA / shRNA is as follows.
  • GGT-II (# 1): GCAGAUUAUAUCGCAUCCU (SEQ ID NO: 9)
  • GGT-II (# 2): GCCAACAUGAAUGUGGUGG (SEQ ID NO: 10)
  • FIG. 11A When the expression of GGT-II was suppressed using MiaPaCa-2 cells, it was observed that the localization of PD-L1 on the cell surface was decreased or abnormal.
  • FIG. 11B As a result of FACS analysis, a decrease in PD-L1 on the cell surface was observed due to suppression of GGT-II expression.
  • RICTOR (# 1): TACTTGTGAAGAATCGTATCTT (SEQ ID NO: 11)
  • RAPTOR # 1): AGGGCC CTGCTACTCG CTTTT (SEQ ID NO: 12)
  • mTOR (# 1): CCGCATTGTCTCTATCAAGTT (SEQ ID NO: 13)
  • Rictor, Raptor and mTOR siRNA were introduced and IFN ⁇ (50 ng / ml) stimulation was performed, and after 48 hours, the cells were collected, reacted with anti-PD-L1-PE, and then subjected to FACS analysis.
  • Mouse IgG-PE was used as a negative control.
  • FIG. 11D The result is shown in FIG. 11D.
  • PD-L1 decreased on the cell surface due to suppression of Raptor and mTOR expression.
  • Rictor expression there was no decrease in PD-L1 on the cell surface.
  • FIG. 11E It is revealed that the mTOR / eIF4A pathway is involved in the activation of the ARF6 pathway.
  • Silvestrol® (10 nM) ® Silvestrol® (10 nM) ®, a decrease in PD-L1 on the cell surface was observed.
  • FIG. 11F As a result of FACS analysis, a decrease in PD-L1 on the cell surface was observed in MiaPaCa-2 cells treated with Silvestrol® (10 nM).
  • FIG. 11G Suppression of AMAP1 expression by mTOR inhibitor (Rapamycin, Torin1) MiaPaCa-2 and KPC cells were treated with mTOR inhibitors Rapamycin (100 nM, 10 nM) and Torin1 (500 nM) for 24 hours, and the expression of AMAP1 was analyzed. It was confirmed that the expression of AMAP1 was suppressed by mTOR inhibitor (Rapamycin, Torin1). The result is shown in FIG. 11G. This suggests that cancer immunotherapy with mTOR inhibitors and immune checkpoint inhibitory antibodies is effective in pancreatic cancer expressing the Arf6-AMAP1 pathway.
  • Example 11 PD-R1 recycling inhibition by PDGFR inhibitor (Crenoranib) PD-L1 recycling by PDGF stimulation was analyzed using MiaPaCa-2 cells treated with PDGFR inhibitor Crenoranib (0.3 ⁇ M) for 12 hours.
  • A Using MiaPaCa-2 cells, DMSO and PDGFR inhibitor Crenolanib (0.3 ⁇ M) were treated for 16 hours, and the cell surface amount of PD-L1 was measured by FACS. The PDGFR inhibitor Crenolanib (0.3 ⁇ M) resulted in a decrease in the cell surface amount of PD-L1 (FIG. 12A).
  • Example 12 AMAP1 is involved in CXCL12 expression (RNAseq. Analysis) RNAseq. Analysis was performed using KPC cells in which AMAP1 expression was suppressed, and chemokine expression was examined. As a result, CXCL12 was most decreased (FIG. 13A). CXCL12 is known to recruit MDSC and Treg, which are immunosuppressive cells, suggesting that AMAP1 may be involved in the malignancy of pancreatic cancer via CXCL12.
  • AMAP1 is involved in CXCL12 expression (Real-Time PCR analysis) CXCL12 expression was analyzed by real-time PCR using KPC cells with suppressed AMAP1 expression. As a result, CGFCL12-stimulated PDGF-stimulated expression was suppressed in cells that suppressed AMAP1 expression compared to control cells (Irrelevant). .
  • FIG. 13C shows that AMAP1 is involved in PDGF stimulation-dependent CXCL12 expression control (FIG. 13C).
  • AMAP1 is thought to be involved in the regulation of CXCL12 secreted by cancer cells.
  • cancer immunotherapy with CXCL12-CXCR4 inhibition and anti-PD-L1 antibody may be effective in pancreatic cancer expressing the Arf6-AMAP1 pathway.
  • the present invention is useful in fields related to cancer immunotherapy using immune checkpoint-inhibiting antibodies.
  • SEQ ID NO: 1 ARF6 cds region base sequence (NM_001663.3)
  • SEQ ID NO: 2 Cds region base sequence of AMAP1 (ASAP1) (NM_018482.3)
  • SEQ ID NO: 3 cds region base sequence of splice variant of AMAP1 (ASAP1) (NM — 001247996.1)
  • SEQ ID NO: 4 siRNA nucleic acid that inhibits expression of ARF6
  • 5 siRNA nucleic acid that inhibits expression of ARF6
  • SEQ ID NO: 6 siRNA nucleic acid that inhibits expression of AMAP1
  • SEQ ID NO: 7 expression of AMAP1 Inhibiting siRNA nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 8 siRNA nucleic acid sequence inhibiting EPB41L5 expression
  • SEQ ID NO: 9 siRNA nucleic acid sequence inhibiting GGT-II (# 1) expression
  • SEQ ID NO: 10 GGT-II (# 2 SiRNA nucleic acid sequence that inhibits expression of

Abstract

本発明は、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤またはＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤、並びに本発明の癌免疫療法併用剤の有効性の分析に用いるための分析薬に関する。分析薬は、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａからなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する。本発明は、ＰＤＡＣに対して有効性を有する癌免疫療法を提供する。

Description

癌免疫療法併用剤
　本発明は、癌免疫療法併用剤(Cancer immunotherapy companion drug)及びこの併用剤の有効性を分析する方法に関する。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０１８年３月１５日出願の日本特願２０１８－４８１７９号および２０１８年９月２１日出願の日本特願２０１８－１７６８５３号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。
　膵管癌（ＰＤＡＣ）は、５年生存率が数%を超えない、極めて予後不良の癌である。現行ではその治療として外科的切除と幾つかの抗がん剤が用いられているが、それらの効果は限定的である。また、precision medicineがかしましく唱えられているが、治療効果と相関する（もしくは、治療抵抗性）biomarkerなどもわかっていない。
　一方、免疫系抗癌剤の開発普及が急速に進められている。免疫系抗癌剤には、抗ＣＴＬＡ－４抗体（イピリムマブ（商品名ヤーボイ））、抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ(商品名オプジーボ)やペムブロリズマブ（商品名キイトルーダ））があり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ(商品名テセントリク)、アベルマブ(商品名バベンチオ)、デュルバルマブ（商品名イミフィンジ）もある。しかし、適用できる癌の種類及び適用できる患者の範囲に依然として制限があり、その拡大が望まれている。さらに、新たな免疫系抗癌剤の開発も進められている。しかし、ＰＤＡＣに対する免疫系抗癌剤の有効性は未知である（非特許文献１、２）。
特許文献１：日本特許第６２０２３６２号
特許文献２：日本特開２０１５－０２０９６３号公報
特許文献３：日本特開２０１５－０２１８００号公報
特許文献４：日本特開２０１７－１０８６８６号公報
非特許文献１：Jiang H., et al., Nat Med.22:851-60, 2016. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. (Supplement Fig.7c and 7d)
非特許文献２：Winograd R., et al., Cancer Immunol Res. 3:399-411, 2015. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockage and Improves Survival in Pancreatic Carcinomas. (Fig.3B)
特許文献１～４及び非特許文献１～２の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、ＰＤＡＣに対して有効性を有する癌免疫療法を提供することを課題とする。
　本発明者らはＡＲＦ６を軸としたシグナル経路、ARF6-AMAP1-EPB41L5経路因子群の高発現が乳癌や腎細胞癌などの浸潤転移、薬剤抵抗性を促進し、患者予後や生存性と高い統計的有意差をもって相関することを報告してきた（特許文献１～３）。乳癌や腎細胞癌は管腔上皮を主な発生母地とする。また、同じく管腔上皮を発生母地とするＰＤＡＣに関しては、再発リスクの予測手段として、ARF6-AMAP1-EPB41L5経路因子群の特定の遺伝子をマーカーとすることができることを報告した（特許文献４）。
　本発明者らは、今回、さらに、ＰＤＡＣが本経路因子群を高発現し、浸潤転移、薬剤抵抗性、並びに、ＰＤ－Ｌ１の細胞内リサイクリングと細胞表面発現を促進すること、さらには、本経路を阻害することによって、浸潤転移能、抗癌剤抵抗性、並びに、免疫サーベイランス回避を著しく阻害できることを明らかにした。
　具体的には、本発明者らは、ヒト膵臓がん由来のMiaPaCa-2細胞及びKPCマウスモデル細胞を用いて、ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングにＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１シグナルが関与しているとの新規知見を得た。さらに、ＡＲＦ６経路活性化を分子標的としたスタチンと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用による癌免疫療法の有効性が向上することを示唆する結果を得た。これらに基づいて本発明を完成した。
　さらに本発明者らは、上記知見並びにＡＭＡＰ１の発現誘導にｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲＣ１はｍＴＯＲとＲａｐｔｏｒのｃｏｍｐｌｅｘを意味する。図１０右上図参照）が関与すること、及びＡＲＦ６の発現誘導にｅＩＦ４Ａが関与することから、ヒト膵臓がん由来のMiaPaCa-2細胞を用いて、ｍＴＯＲＣ１の発現阻害及びｅＩＦ４Ａの発現阻害により細胞表面のＰＤ－Ｌ１が減少する知見を得た。このことから、ｍＴＯＲＣ１の発現阻害及びｅＩＦ４Ａの発現阻害によってもＰＤ－Ｌ１のリサイクリングが阻害されていると推認できることから、ＡＲＦ６経路活性化に関連するｍＴＯＲＣ１及び／又はｅＩＦ４Ａに対する阻害剤と抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用による癌免疫療法の有効性が向上することを期待して、本発明の第２の態様を完成した。
　加えて、例８においてＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路はＰＤＧＦＲによって活性化され、その結果、ＰＤＧＦＲシグナルがＰＤ－Ｌ１リサイクリングを亢進させること、及びＰＤＧＦ非添加では、ＰＤ－Ｌ１リサイクリングはbasal levelしか起こらないことを示した。この事実を踏まえると、ＰＤＧＦＲ阻害剤はＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路を阻害することを強く示唆するものであり、ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１の発現阻害だけではなく、ＰＤＧＦＲを阻害することによっても、本経路を高発現する膵癌の免疫回避能を阻害するものと推定できることから、本発明の第３の態様を完成した。
　加えて、例１２においてＡＭＡＰ１がＰＤＧＦ刺激依存的なＣＸＣＬ１２の発現制御に関与していること及びＡＭＡＰ１の発現を抑制した腫瘍組織では、ＣＸＣＬ１２の発現が減少している染色像が観察され、ＣＸＣＬ１２の発現制御にＡＭＡＰ１が関与していることが強く示唆された。ＣＸＣＬ１２はＣＸＣＲ４のリガンドであり、ＣＸＣＲ４を発現する免疫抑制細胞ＭＤＳＣやＴｒｅｇをリクルートすること、及び腫瘍細胞の増殖にも関与することが知られている。ＣＸＣＬ１２とＣＸＣＲ４との結合を阻害するＣＸＣＲ４阻害剤は、抗腫瘍免疫の抑制及び抗腫瘍効果が考えられる。ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１の発現阻害だけではなく、ＣＸＣＬ１２とＣＸＣＲ４との結合を阻害することによっても、本経路を高発現する膵癌の免疫回避能を阻害するものと推定できることから、本発明の第４の態様を完成した。
　本発明は以下の通りである。
［１］
ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤を有効成分とする、
抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤。
［２］
ＰＤＧＦＲ阻害剤及びＣＸＣＲ４阻害剤から成る群から選択される１種又は２種以上の阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤。
［３］
癌が膵癌である、［１］又は［２］に記載の癌免疫療法併用剤。
［４］
発現阻害剤がＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１に対する発現阻害剤であるメバロン酸経路活性阻害剤である、［１］又は［３］に記載の癌免疫療法併用剤。
［５］
メバロン酸経路活性阻害剤がスタチンである、［４］に記載の癌免疫療法併用剤。
［６］
発現阻害剤がＡＲＦ６又はＡＭＡＰ１の発現を阻害する核酸である、［１］又は［３］に記載の癌免疫療法併用剤。
［７］
発現阻害剤が、ｍＴＯＲに対する発現阻害剤又はｅＩＦ４Ａに対する発現阻害剤である［１］に記載の癌免疫療法併用剤。
［８］
抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体アテゾリズマブ、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体アベルマブ、及び抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体デュルバルマブから成る群から選ばれる少なくとも1種である、［１］～［７］のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤。
［９］
［１］、［３］～［８］のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤の有効性の分析に用いるための分析薬であって、
ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａからなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、分析薬。
［１０］
上記タンパク質及び／又はポリペプチドが、抗体及び／又はその断片である、［９］に記載の分析薬。
［１１］
（Ａ）癌の患者から採取した生体試料において、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、 ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の［１］、［３］～［８］のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤の有効性を分析するための情報を取得すること、
を含む、癌免疫療法併用剤の有効性を分析する方法。
［１２］
工程（Ａ）において、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、 ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する、［１１］に記載の方法。
［１３］
上記生体試料が膵組織である、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１４］
工程（Ａ）及び／又は（Ｂ）において、上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、それら遺伝子の翻訳産物をそれぞれ特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを用いた免疫組織化学法により決定される、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
上記タンパク質及び／又はポリペプチドが抗体及び／又はその断片である、［１４］に記載の方法。
［１６］
［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法において有効性が分析された患者の治療に用いるための、［１］、［３］～［８］のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤。
　本発明によれば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用することで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が有する癌免疫療法の効果を高める併用剤を提供することができる。
　さらに本発明によれば、本発明の癌免疫療法併用剤の有効性を分析する方法を提供することができる。
　さらに本発明によれば、本発明の方法において有効性ありと分析された患者の治療に用いるための、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が有する癌免疫療法の効果を高める併用剤を提供することができる。
例１における、IFNγ刺激したMiaPaCa-2細胞のＰＤ－Ｌ１の発現結果を示す。 例２における、ＡＲＦ６経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞のＰＤ－Ｌ１の発現結果を示す。 例３における、ＡＲＦ６経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞のＰＤ－Ｌ１の細胞膜局在試験結果を示す。 例４における、ＡＲＦ６経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のＰＤ－Ｌ１のフローサイトメトリー（FACS）解析結果を示す。 例５における、Simvastatin処理を行ったMiaPaCa-2細胞のＰＤ－Ｌ１の細胞膜局在試験結果を示す。 例６における、Brefeldin A処理を行ったMiaPaCa-2細胞のＰＤ－Ｌ１の細胞膜局在試験結果を示す。 例７における、Simvastatin及びBrefeldin A処理を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のＰＤ－Ｌ１のFACS解析結果を示す。 例８における、ＡＲＦ６経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞におけるＰＤ－Ｌ１のリサイクリング解析結果を示す。 例９ａ～ｃにおける、個体を用いたＫＰＣ細胞による腫瘍増殖能の解析結果を示す。 例９ｄにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた治療実験のタイムスケジュール及びその結果を示す。 例９ｄにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた治療実験のタイムスケジュール及びその結果を示す。 図１０は、左上は、膵癌の悪性度とARF6経路との関連についての解析により得られたモデルを示す。右上図は、ｍＴＯＲはＡＭＡＰ１の発現に関与し、ｅＩＦ４ＡはＡＲＦ６の発現誘導に関与することを示す。右下図は、ＰＤＧＦＲやメバロン酸経路がＡＲＦ６活性に関与することを示す。 例１０のＡの結果を示す。 例１０のＢの結果を示す。 例１０のＣの結果を示す。 例１０のＤの結果を示す。 例１０のＥの結果を示す。 例１０のＦの結果を示す。 例１０のＧの結果を示す。 例１１のＡの結果を示す。 例１１のＢの結果を示す。 例１１のＣの結果を示す。 例１２のＡの結果を示す。 例１２のＢの結果を示す。 例１２のＣの結果を示す。 例１２のＤの結果を示す。 例１２のＥの結果を示す。
＜癌免疫療法併用剤（第１の態様）＞
　本発明の癌免疫療法併用剤の一態様は、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤を有効成分とし、本発明の第１の態様の癌免疫療法併用剤は、ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１から成る群から選択される１つ又は２つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤である。
　本発明者らが得た知見は、前述のようにヒト膵臓がん由来のMiaPaCa-2細胞及びKPCマウスモデル細胞を用いて得られたものであり、本発明の癌免疫療法併用剤は、少なくとも膵癌に対する疫療法併用剤として有効であり、膵癌以外でも、免疫チェックポイント分子ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングにＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１シグナルの少なくとも一方が関与している癌であれば同様の効果が得られることが期待できる。
　ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１は、ＡＲＦ６シグナル経路（ARF6-AMAP1-EPB41L5経路とも呼ばれる）因子群に属する遺伝子である。ＡＲＦ６シグナル経路が乳ガンの浸潤・転移・薬剤耐性に関与することは既に報告されている。
　低分子量Ｇタンパク質ＡＲＦ６（ADP-ribosylation factor 6）はＲａｓスーパーファミリーのうちＡｒｆサブファミリーに属する。Ａｒｆ ＧＴＰａｓｅ は３つのクラスに分類されるが、ＡＲＦ６は唯一クラスIIIに分類され、細胞膜やエンドソームに局在しアクチン細胞骨格のダイナミクスに基づく様々な細胞運動（エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、膜局在タンパク質の輸送や再循環、細胞膜のラフリングなど）を制御する。これらの細胞機能は生理学的／病理学的な細胞運動および細胞内輸送の基盤となっている。ＡＲＦ６は、ＧＤＰと結合した不活性状態とＧＴＰと結合した活性状態との間を行き来し、細胞プロセスにおける分子スイッチとして機能する。ＡＲＦ６は、ＧＥＦ（guanine exchange factors）によりＧＤＰがＧＴＰへと変換されると活性化され、ＧＡＰ（GTPase activating proteins）によりＧＴＰが加水分解されると不活性化される。ＡＲＦ６が結合しているＧＴＰをＧＤＰに加水分解するためには、ＧＡＰの補助が必要である。ＡＭＡＰ１はＧＡＰの１種として知られているＡＲＦ６の下流エフェクターである。
　ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１から成る群から選択される１つ又は２つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤には、特に制限はないが、ＡＲＦ６の活性化にはメバロン酸経路活性が必要であることがわかっており、メバロン酸経路活性阻害剤として知られているスタチンは、上記ＡＲＦ６発現阻害剤として用いることができる。
　スタチンは、HMG-Co-A reductase阻害剤の総称であり、血中のコレステロール値を下げるための薬剤として、多くの種類が販売されている。本発明に用いるスタチンには特に制限はないが、例えば、以下のスタチンを例示できる。但し、これらの限定される意図ではなく、メバロン酸経路活性阻害効果を有する薬剤であれば、同様に用いることができる。
ロスバスタチン（Rosuvastatin）クレストール
ピタバスタチン（Pitavastatin）リバロ
アトルバスタチン（Atorvastatin）リピトール
セリバスタチン（Cerivastatin）バイコール（Baycol）／ セルタ
フルバスタチン（Fluvastatin）ローコール
シンバスタチン（Simvastatin）リポバス（Zocor）
プラバスタチン（Pravastatin）メバロチン（Pravachol）
ロバスタチン（Lovastatin）メバコール
メバスタチン（Mevastatin）
　スタチンを有効成分として含有する本発明の併用剤は、製剤化のための任意成分を含有することができる。例えば、常法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、座剤、注射剤とすることができる。前記任意成分としては、例えば、乳化剤、可溶化剤、分散剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、糖衣剤、矯味矯臭剤、安定剤などが例示できる。スタチンを有効成分として含有する本発明の併用剤は、公知のスタチンの用量を考慮し、かつ投与により得られる併用効果を考慮して、医療従事者により適宜決定される。
　ＡＲＦ６遺伝子及びＡＭＡＰ１遺伝子の発現阻害剤は、ＡＲＦ６又はＡＭＡＰ１の発現を阻害する核酸であることもでき、核酸はリボ核酸干渉を生じることができるリボ核酸（ＲＮＡ）であることができ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであることができる。
　ＡＲＦ６は、ｃｄｓ領域塩基配列がNM_001663.3（配列番号1）で示される。ＡＲＦ６には、ＡＲＦ６のスプライスバリアントも包含する。
　ＡＭＡＰ１（ＡＳＡＰ１）は、ｃｄｓ領域塩基配列がNM_018482.3（配列番号2）で示される。ＡＭＡＰ１（ＡＳＡＰ１）には、そのスプライスバリアントも包含する。ＡＭＡＰ１（ＡＳＡＰ１）のスプライスバリアントとしては、ｃｄｓ領域塩基配列が例えば、NM_001247996.1（配列番号3）であるタンパク質を挙げることができる。
　これらタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ等は、上記タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、公知の方法により適宜設計し入手することができる。具体的には、ｓｉＲＮＡの配列については、「予測アルゴリズム」が知られており、それを利用することができる。例えば、標的にしたいタンパクのcDNA配列を入れると、予測アルゴリズムに従って自動的に「スコア」の高い候補配列をリストアップでき、リストアップされた候補配列から前記タンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡを得ることができる。さらに予測アルゴリズムを用いる際に、「他の遺伝子は標的にしない」こと、つまり特異性について考慮した候補配列を得ることができる。「予測」で得た候補配列が、実験的に発現抑制効果があることは容易に確認できる。
　ＡＲＦ６の発現を阻害する核酸としては、例えば、5’-GCACCGCAUUAUCAAUGACCGdTdT-3’（配列番号4）および5’-CAACGUGGAGACGGUGACUUdTdT-3’（配列番号5）からなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
　ＡＭＡＰ１の発現を阻害する核酸としては、例えば、5’-AAGACCUGACAAAAGCCAUUAdTdT-3’（配列番号6）および5’-CCAGGGAUUUACUUGCACUAAdTdT-3'（配列番号7）からなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
　上記で例示したｓｉＲＮＡは何れも、前記予測アルゴリズムを用いて得られた候補配列の中から、実際に核酸断片を合成して、各タンパク質の発現を阻害することを確認できた配列を有するものである。
　上記核酸断片およびｓｉＲＮＡは、リポソームを含む、対象に投与するための送達ビヒクル、担体および希釈剤およびその塩を含んでいてもよく、および／または、薬学的に許容し得る製剤中に存在してもよい。また、上記核酸断片およびｓｉＲＮＡは、ウイルスベクター、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む、細胞への進入を補助、促進または容易化する作用を有する任意の送達ビヒクルを用いて対象に投与することができる他、送達ビヒクルを用いることなく、担体または希釈剤とともに直接送達または投与することもできる。送達ビヒクル、担体および希釈剤、あるいは薬学的に許容し得る製剤は、公知のものから適宜選択することができる。ｓｉＲＮＡは、注射の外、エマルジョンとして経口や座薬などとて投与できる。送達ビヒクル、担体および希釈剤、あるいは薬学的に許容し得る製剤の具体例については、例えば、特表２０１３－５１４７６１号公報の段落０３６８～０３９８の記載を参照でき、投与量は段落０４１１～０４１８を参照できる。特表２０１３－５１４７６１号公報はＷＯ２０１１／０７２０８２の公表公報である。
＜癌免疫療法併用剤（第２の態様）＞
　本発明の癌免疫療法併用剤の一態様は、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤を有効成分とし、本発明の第２の態様の癌免疫療法併用剤は、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される１つ又は２つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤である。ＴＯＲはtarget of rapamycin（ラパマイシン標的タンパク質）の略称であり、動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼの一種であり、ｍＴＯＲはmammalian TOR（哺乳類のTOR)の略である。ｅＩＦ４Ａはeukaryotic initiation factor 4Aの略称であり、真核生物翻訳開始因子のひとつで、DEADボックス型RNAヘリカーゼである。
　図１０の左図には、膵癌の悪性度とＡＲＦ６経路との関連についての解析により得られたモデルを示す。このモデルにおいて、遺伝子変異に伴うKRASシグナル及びp53変異が、ＡＲＦ６経路因子であるＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ＥＰＢ４１Ｌ５等の蛋白質高発現に関与していることを示す。さらに、右上図においては、ｍＴＯＲはＡＭＡＰ１の発現に関与し、ｅＩＦ４ＡはＡＲＦ６の発現誘導に関与することを示す。
　この点を考慮して、本発明者らは、ヒト膵臓がん由来のMiaPaCa-2細胞を用いて、ｍＴＯＲＣ１の発現阻害、及びｅＩＦ４Ａの発現阻害と、細胞表面のPD-L1量の関係を検討したところ、何れの阻害の場合も、細胞表面のPD-L1が減少することを見出した。このことは、ｍＴＯＲＣ１の発現阻害及びｅＩＦ４Ａの発現阻害の何れによっても、ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングが阻害されていると推認できることから、前記本発明の第１の態様における知見と相まって、本発明の第２の態様の癌免疫療法併用剤も、少なくとも膵癌に対する疫療法併用剤として有効であることが分かった。さらに、膵癌以外でも、ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングに、ｍＴＯＲがＡＭＡＰ１の発現に関与する癌、あるいはｅＩＦ４ＡがＡＲＦ６の発現に関与する癌であれば同様の効果が得られることが期待できる。
　ｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、Temsirolimus （CAS RN：162635-04-3）, Everolimus (CAS: 159351-69-6), Rapamycin (CAS: 53123-88-9), Torin 1 (CAS:1222998-36-8), Torin 2 (CAS:1223001-51-1)等を挙げることができる。また、ｅＩＦ４Ａ阻害剤としては、例えば、Silvestrol (CAS:697235-38-4), eFT226, Hippuristanol (CAS:80442-78-0)等を挙げることができる。
　ｍＴＯＲ阻害剤又はｅＩＦ４Ａ阻害剤を有効成分として含有する本発明の併用剤は、製剤化のための任意成分を含有することができる。例えば、常法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、座剤、注射剤とすることができる。前記任意成分としては、例えば、乳化剤、可溶化剤、分散剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、糖衣剤、矯味矯臭剤、安定剤などが例示できる。
　これらのｍＴＯＲ阻害剤およびｅＩＦ４Ａ阻害剤は公知化合物であり、それぞれ既存の薬効や治療効果も知られており、これらの化合物を有効成分として含有する本発明の併用剤は、公知の各化合物の用量を考慮し、かつ投与により得られる併用効果を考慮して、医療従事者により適宜決定される。
＜癌免疫療法併用剤（第３の態様）＞
　本発明の第３の態様の癌免疫療法併用剤は、ＰＤＧＦＲ阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤に関する。ＰＤＧＦＲは血小板由来成長因子レセプター（Platelet-Derived Growth Factor Receptor）の略称であり、ＰＤＧＦは主に間葉系細胞の遊走および増殖などの調節に関与する増殖因子であり、ＰＤＧＦＲを介して生理活性を発現する。
　例８においてＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路はＰＤＧＦＲを介して活性化され、その結果、ＰＤＧＦＲシグナルがＰＤ－Ｌ１リサイクリングを亢進させることを示した。さらに、ＰＤＧＦ非添加の条件下では、ＰＤ－Ｌ１リサイクリングはbasal levelしか起こらないことも示した。図１０の左図に示すように、ＰＤＧＦＲ阻害剤はＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路の活性化を阻害することから、この上記例８の実験結果を踏まえると、ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１の直接的な発現阻害ではなく、ＰＤＧＦＲを阻害することでも、ＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路を高発現する膵癌の免疫回避能を阻害するものと推定できる。この点は、例１１に示す各方法により実験的に確認することができる。
　ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、種々の化合物が知られており、かつ市販されている。例えば、Crenoranib (CAS: 670220-88-9)及びImatinib (CAS: 152459-95-5), Sunitinib (CAS: 341031-54-7), Ponatinib (CAS: 943319-70-8), Axitinib  (CAS: 319460-85-0), Nintedanib (CAS: 656247-17-5), Pazopanib (CAS: 444731-52-6), Dovitinib  (CAS: 405169-16-6), Linifanib (CAS: 796967-16-3), Masitinib (CAS: 790299-79-5), Tivozanib (CAS: 475108-18-0), Amuvatinib (CAS: 850879-09-3), Orantinib (CAS: 252916-29-3), CP-673451 (CAS: 343787-29-1), Telatinib (CAS: 332012-40-5), PP121 (CAS: 1092788-83-4), MK-2461 (CAS: 1092788-83-4), Avapritinib (CAS: 1703793-34-3), AZD2932 (CAS: 883986-34-3), Sennoside B (CAS: 128-57-4) 等を挙げることができる。さらにこれらの薬学的に許容される塩であることもできる。但し、これらに限定される意図ではない。尚、実施例で用いたCrenoranib (CAS: 670220-88-9)は、膵癌細胞 (KPC)を用いた解析の報告があり、PDGFRの活性（リン酸化）や転移が阻害されることが報告されている（Weissmueller et al. (2014) Cell 157, 382-394）。
＜癌免疫療法併用剤（第４の態様）＞
　本発明の第４の態様の癌免疫療法併用剤は、ＣＸＣＬ１２－ＣＸＣＲ４の結合を阻害するＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤に関する。ＣＸＣＲ４は、C-X-C chemokine receptor-4の省略形である。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の特にナイーブＴ細胞の表面にあるたんぱく質の一つであり、細胞同士の間にある支持細胞が作るケモカインＳＤＦ－１を受けとめるケモカイン受容体であり、Ｇ蛋白結合型受容体の一種である。ＣＸＣＲ４は、エイズウイルスが宿主細胞へ感染する際に利用するケモカイン受容体であり、Ｔ細胞指向性のＨＩＶがＣＸＣＲ４と結合すると、膜同士が融合して、ＨＩＶが細胞内に侵入することができる。腫瘍の転移が起こりやすい臓器ではＣＸＣＲ４のリガンドCXCL12(SDF-1/PBSF)が発現し、腫瘍細胞ではＣＸＣＲ４の発現が亢進していることが報告されており、CXCL12-CXCR4系の腫瘍転移との関与が注目されている。
　例１２において、AMAP1がPDGF刺激依存的なCXCL12の発現制御に関与していることを示し（図１３Ｃ）、さらにAMAP1の発現を抑制した腫瘍組織では、CXCL12の発現が減少している染色像が観察され（図１３Ｅ）、CXCL12の発現制御にAMAP1が関与していることが強く示唆された。このことから、ＣＸＣＲ４阻害剤は、ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１の直接的な発現阻害ではないが、ＣＸＣＲ４を阻害することでも、ＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路を高発現する膵癌の免疫回避能を阻害するものと推定できる（図１３Ａ下図参照）。ＡＭＡＰ１によってCXCL12の発現が上昇し、ＣＸＣＲ４を発現する免疫抑制細胞をリクルートすることで抗腫瘍免疫が生じ、あるいはＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞の増殖を促進していると考えられる。ＣＸＣＲ４を阻害することで、免疫抑制細胞による抗腫瘍免疫が抑制されるため、抗ＰＤ－Ｌ１抗体による癌免疫療法がより有効になると考えられる。即ち、Arf6-AMAP1経路が発現している膵癌において、CXCL12-CXCR4阻害と抗PD-L1抗体による癌免疫療法が有効である可能性が示唆される。
　ＣＸＣＲ４阻害剤としては、種々の化合物が知られており、かつ市販されており、例えば、CXCR4ケモカイン受容体拮抗剤「Mozobil(R)モゾビル」（一般名：プレリキサホル）、CXCL12 analogue CTCE-9908 (ChemokineTherapeutics, Canada)、anti-CXCL12 aptamer Nox-A12 (Noxxon, Germany)、modified peptide CXCR4 antagonists (例えば、T140, BKT140, POL6326, FC131)、small-molecules CXCR4 antagonists (例えば、AMD3100, AMD11070, MSX-122, GSK812397)、CXCL12 peptide analogs (例えば、CTCE-9908, CTCE-0214)、Antibodies targeting CXCR4 (例えば、MDX-1338/BMS93656, ALX-0651)、30D8 : a humanized antibody against mouse/human CXCL12等を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
　ＰＤＧＦＲ阻害剤及びＣＸＣＲ４阻害剤から成る群から選択される１種又は２種以上の阻害剤を有効成分として含有する本発明の併用剤は、製剤化のための任意成分を含有することができる。例えば、常法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、座剤、注射剤とすることができる。前記任意成分としては、例えば、乳化剤、可溶化剤、分散剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、糖衣剤、矯味矯臭剤、安定剤などが例示できる。
　これらＰＤＧＦＲ阻害剤及びＣＸＣＲ４阻害剤は公知化合物であり、それぞれ生理活性、既存の薬効や治療効果も知られており、これらの化合物を有効成分として含有する本発明の併用剤は、公知の各化合物の用量を考慮し、かつ投与により得られる併用効果を考慮して、医療従事者により適宜決定される。
　本発明の癌免疫療法併用剤（第１～第４の態様）の使用量は、併用する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の種類、投与量、投与方法、患者の症状、年齢、併用剤の投与方法等により異なるが、例えば、経口投与の場合には、１回当り、下限として0.01mg/kg 体重（好ましくは、0.1mg/kg 体重）、上限として、1000mg/kg 体重（好ましくは、100mg/kg 体重）を、静脈内投与の場合には、１回当り、下限として0.001mg/kg 体重（好ましくは、0.01mg/kg 体重）、上限として、1000mg/kg 体重（好ましくは、100mg/kg 体重）を１日当り１乃至数回症状に応じて投与することができる。但し、この数値範囲は例示であって、これらの範囲に限定される意図ではない。
　本発明の癌免疫療法併用剤と併用される抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、例えば、ヒト型ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体ヒトアテゾリズマブ(商品名テセントリク)、ヒト型ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体アベルマブ(商品名バベンチオ)、ヒト型ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体デュルバルマブ（商品名イミフィンジ）などを挙げることができる。
　前述のように、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングにＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１シグナルが関与しているとの新規知見を得た。さらに、ＡＲＦ６経路活性化を分子標的としたスタチンと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用による癌免疫療法の有効性が向上することを示唆する結果を得た。
　また、がん細胞に発現しているＰＤ－Ｌ１のリサイクルにＡＲＦ６経路が関与していることを明らかにした。ＰＤ－Ｌ１がリサイクル（細胞内に取りこまれ、再び細胞膜へ移行する）されると、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がはずれてしまい、治療効果が下がることが予想される。メバロン酸経路阻害薬であるスタチンはＡＲＦ６活性を阻害するため、抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法と併用することで治療効果の上昇が期待される。さらに、ｍＴＯＲの発現阻害及びｅＩＦ４Ａの発現阻害の何れによっても、ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングが阻害されることから、これらの阻害剤を抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法と併用することで治療効果の上昇が期待される。加えて、ＰＤＧＦＲを阻害することでも、ＡＲＦ６－ＡＭＡＰ１経路を阻害でき、その結果、ＰＤ－Ｌ１のリサイクリングを阻害することができる。また、ＣＸＣＲ４を阻害することで抗腫瘍免疫を抑制することが出来ることから、ＰＤＧＦＲ阻害剤又はＣＸＣＲ４阻害剤を抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法と併用することで治療効果の上昇が期待される。
　本発明の癌免疫療法併用剤の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用には特に制限はなく、医療専門家の管理の下で、本発明の癌免疫療法併用剤がスタチンである場合、スタチンは例えば、スタチンの種類などに応じて定期的に（例えば、毎日）服用し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の種類に応じて、単独で使用する場合に採用される標準的な投与スケジュールと同様に行うことができる。但し、癌の種類や患者の状態、癌免疫療法併用剤の種類や抗ＰＤ－Ｌ１抗体の種類等に応じて医療専門家の管理の下で、適宜変更は可能である。
<分析薬>
　本発明は、本発明の癌免疫療法併用剤の有効性の分析に用いるための分析薬を包含する。この分析薬は、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａからなる群から選択されるいずれか少なくとも1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する。
　後述するように、MiaPaCa-2細胞を用いてＰＤＧＦ刺激すると、ＰＤ－Ｌ１のリサイクルが増加し、ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１のいずれか、又は両方の発現を抑制すると、ＰＤＧＦ刺激依存的なＰＤ－Ｌ１のリサイクルが観察されなかった。また、ＥＰＢ４１Ｌ５の発現抑制では、ＰＤＧＦ刺激依存的なＰＤ－Ｌ１のリサイクルが観察された。これらのことは、ＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１シグナルがＰＤＧＦ刺激依存的なＰＤ－Ｌ１のリサイクルに関わり、ＥＰＢ４１Ｌ５シグナルはＰＤＧＦ刺激依存的なＰＤ－Ｌ１のリサイクルに関わっていないことを示す。さらに、ｍＴＯＲの発現抑制及びｅＩＦ４Ａの阻害でも、ＰＤ－Ｌ１の細胞表面量が減少することが観察された。これらのことは、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４ＡシグナルがＰＤＧＦ刺激依存的なＰＤ－Ｌ１のリサイクルに関わる可能性を強く示す。
　本発明の分析薬は、本発明の癌免疫療法併用剤の有効性の分析に用いるものであり、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａからなる群から選択されるいずれか少なくとも1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する。
　遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドは、例えば、抗体及び抗体断片であることができる。
　ＡＲＦ６遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドは、例えば、ＡＲＦ６タンパク質に対する特異的な抗体またはその断片であることができる。そのような抗体は、市販品が入手可能であり、以下に例示す。これらに限定される意図ではない。
Ａｎｔｉ－ＡＲＦ６ 抗体（ａｂ２１９３５０）
Ａｎｔｉ－ＡＲＦ６ 抗体［ＥＰＲ８３５７］（ａｂ１３１２６１）
Ａｎｔｉ－ＡＲＦ６ 抗体（ａｂ７７５８１）
Ａｎｔｉ－ＡＲＦ６ 抗体（ａｂ８１６５０）
Ａｎｔｉ－ＡＲＦ６ 抗体（ｓｃ－７９７１）
　ｍＴＯＲ遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドは、例えば、ｍＴＯＲタンパク質に対する特異的な抗体またはその断片であることができる。そのような抗体は、市販品が入手可能であり、以下に例示す。これらに限定される意図ではない。
Ａｎｔｉ－ｍＴＯＲ 抗体 (ＧＴＸ１０１５５７)
Ａｎｔｉ－ｍＴＯＲ 抗体（ａｂ２７３２）
Ａｎｔｉ－ｍＴＯＲ 抗体(ａｂ４５９８９)
Ａｎｔｉ－ｍＴＯＲ 抗体［ＥＰＲ３９０（Ｎ）］（ａｂ１３４９０３）
Ａｎｔｉ－ｍＴＯＲ 抗体(ａｂ２８３３)
Ａｎｔｉ－ｍＴＯＲ 抗体(ＣＳＴ２９７２)
　ｅＩＦ４Ａ遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドは、例えば、ｅＩＦ４Ａタンパク質に対する特異的な抗体またはその断片であることができる。そのような抗体は、市販品が入手可能であり、以下に例示す。これらに限定される意図ではない。
Ａｎｔｉ－ｅＩＦ４Ａ 抗体 (ＧＴＸ１１４９１０)
Ａｎｔｉ－ｅＩＦ４Ａ 抗体 (ａｂ３１２１７)
Ａｎｔｉ－ｅＩＦ４Ａ抗体［ＥＰＲ１４５０５（Ｂ）］（ａｂ１８０５０６）
Ａｎｔｉ－ｅＩＦ４Ａ抗体［ＥＰＲ１４５０６］（ａｂ１８５９４６）
Ａｎｔｉ－ｅＩＦ４Ａ 抗体 (ＮＢＰ２－１６３０２)
　ＡＭＡＰ１遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドは、例えば、ＡＭＡＰ１タンパク質に対する特異的な抗体またはその断片であることができ、具体的には、例えば、ＡＭＡＰ１（配列番号2）の935番目から1002番目付近のアミノ酸配列領域にエピトープとなるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であることができる(特許文献４参照)。
　上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドとは、上記遺伝子のうち一の遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得るものであれば特に限定されるものでは無い。例えば、当該翻訳産物に対する抗体及び／又はその断片が挙げられる。抗体及び／又はその断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドの調製方法については、遺伝子翻訳産物に対する特異的結合を保持し得る限り、どのような方法も採用し得る。例えば、当該遺伝子翻訳産物となるタンパク質及び／又はその断片を抗原として、公知の手法により所望のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等を調製することが出来る。
　尚、上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドが有する遺伝子翻訳産物に対する特異的結合性は、当該遺伝子の翻訳産物を、当該遺伝子の翻訳産物と共存可能性がある他の遺伝子の翻訳産物と識別できる程度であれば良い。従って、例えば、上記遺伝子に一部改変（置換、欠失、付加等）が加わっている遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドであっても、上記遺伝子の翻訳産物を、当該遺伝子の翻訳産物と共存可能性がある他の遺伝子の翻訳産物と識別できる程度の遺伝子翻訳産物に対する特異的結合性を有するものであれば、本発明の「遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチド」に含めることができる。
　さらに、本発明の分析薬においては、単一の分析薬に、上記遺伝子のうち１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド１種のみが含まれていてもよいし、或いは上記遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２種以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれていてもよい。加えて、上記タンパク質及び／又はポリペプチドは、遺伝子翻訳産物の検出のために、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、並びにフルオロセイン等の蛍光低分子化合物を含む）等が挙げられる。但し、これら標識物質による標識を有する物に限定される意図ではない。
　本発明の分析薬において上記タンパク質及び／又はポリペプチドが標識されていない場合には、当該遺伝子の翻訳産物を公知の方法により検出することができる。そのような検出には、例えば、それらタンパク質及び／又はポリペプチド（一次抗体）に結合する二次抗体を用いたシステムを用いることができる。二次抗体を用いたシステムには市販の検出キットがある。このシステムでは、例えば、一次抗体に対する二次抗体がペルオキシダーゼで標識されており、試料中で目的遺伝子翻訳産物に特異的に結合した一次抗体にさらに上記二次抗体を特異的に結合させ、ペルオキシダーゼの発色基質（例えば、3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）を当該試料に添加して発色を観察することにより遺伝子翻訳産物の検出することが出来る。さらに、本発明において、１つの分析薬に、上記遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれていている場合には、例えば、それら２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドをそれぞれ異なる波長の蛍光を発する異種の蛍光物質で標識することができる。これにより、同一試料において目的の遺伝子翻訳産物それぞれを検出することが出来る。
　分析薬は、任意に、緩衝剤、防腐剤、凍結防止剤等を含み得る。緩衝剤としては、例えば、トリス塩酸塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等を挙げることかできる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム等を挙げることができる。凍結防止剤としては、例えば、グリセロール等を挙げることができる。
＜癌免疫療法併用剤の有効性を分析する方法＞
　本発明は、本発明の癌免疫療法併用剤の有効性を分析する方法であって以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法に関する。
（Ａ）癌の患者から採取した生体試料において、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の本発明の癌免疫療法併用剤の有効性を分析するための情報を取得すること。
　本発明の方法において、「生体試料」とは、癌の治療を受けた患者から採取された任意の生体試料である。生体試料は、膵組織であることができる。さらに、膵組織としては、例えば、膵癌の治療において腫瘍摘出術の際に患者から摘出した膵臓病変部位の組織、又は、病変部位が存在していた近傍の膵組織であって腫瘍摘出術の後に、摘出術とは別に採取した膵組織を挙げることができる。但し、患者への負担を極力軽減し、かつ癌免疫療法併用剤の有効性を分析し得るという観点から、膵組織は、腫瘍摘出術の際に患者から摘出した膵癌病変部位の組織であることが好ましい。尚、本発明では病理診断のために膵臓原発巣および転移巣の外科切除検体から作製されたパラフィン包埋組織を用いて上述の有効性分析が可能であるため、病理診断が行われたすべて症例について実施可能である。
工程（Ａ）
　癌の患者から採取した生体試料において、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、 ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する。工程（Ａ）においては、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、 ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される一部又は全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することができる。これら遺伝子の翻訳産物発現レベルの決定は、上記生体試料に対して実施される限り、その方法については特に限定されるものでは無い。上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの決定は、例えば、上記生体試料全体に対して実施してもよいし、或いは生体試料において特定種の細胞に対して実施してもよいし、或いは生体試料に存在する細胞において細胞質及び細胞核それぞれ別々に実施してもよい。上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの決定が、生体試料に存在する細胞において細胞質及び細胞核それぞれ別々に実施された場合、決定した翻訳産物発現レベルの結果は、細胞質についての結果と細胞核についての結果の２種類が得られる。それら２種類の結果は、後述の工程（Ｂ）にそれぞれ用いることが出来る。
　本発明方法の工程（Ａ）において使用される、生体試料における上記所定の遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する方法は、特に限定されない。具体的には、本発明の分析薬について上記した如く、検出の対象となる遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド（分析薬）を用いて当該遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する方法を利用可能である。具体的には、生体試料である組織切片において遺伝子翻訳産物の発現強度及び発現分布を正確に把握して発現レベルを決定することが好ましい。特に、それらタンパク質及び／又はポリペプチド（分析薬）を用いた免疫組織化学法により当該遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することが、遺伝子翻訳産物の発現強度及び発現分布をより正確に把握できるという観点から好ましい。なお、免疫組織化学法については、各種公知の手法を用いることができる。本発明においては、それら公知の手法を用いても良いし、或いは新たに開発された手法を用いてもよい。免疫組織化学法等の翻訳産物発現レベル決定方法は、対象となる遺伝子翻訳産物の発現レベルを決定できるものである限り、特に限定されるものではない。
　工程（Ａ）において、上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルは、例えば、それら遺伝子の翻訳産物をそれぞれ特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを用いた免疫組織化学法により決定されることが、遺伝子翻訳産物の特異的な検出を確保するという観点から好ましい。上記タンパク質及び／又はポリペプチドが抗体及び／又はその断片であることができる。
　本発明方法の工程（Ａ）において、本発明所定の遺伝子の翻訳産物の発現レベル決定には、生体試料において任意のタンパク質検出法で検出されたシグナル強度を基準とし、この基準との比較を用いることが出来る。基準に用いる生体試料の例としては、同一患者から採取した非癌性組織（特に、非癌性膵組織）を挙げることができ、この組織における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現レベルを対照とすることができる。この場合、同一患者から採取した非癌性組織（特に、非癌性膵組織）における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現シグナル強度と、対象生体試料における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現シグナル強度を、同一のタンパク質検出法で検出し、比較するそれにより、本発明所定の少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することができる。
　さらに、「翻訳産物発現レベルの決定」においては、上記基準との比較において、対象生体試料における本発明所定の少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現のシグナル強度が、例えば、「高い」、「同等」又は「低い」等のランク付けをすることもできる。或いは、例えば上記基準として用いるシグナル強度を基準として対象生体試料における本発明所定の少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現のシグナル強度をスコア化することもできる。シグナル強度のスコア化は、例えば、基準として用いた試料における遺伝子翻訳産物のシグナル強度を０とし、そのシグナル強度と対象生体試料における遺伝子翻訳産物のシグナル強度を比較して、例えば、－１から３等の整数でスコア化することが出来る。遺伝子翻訳産物のシグナル強度のランク付けやスコア化は、適宜決定できる。
（Ｂ）工程
　（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、生体試料を採取した患者の本発明の癌免疫療法併用剤の有効性を分析するための情報を取得する。
　工程（Ｂ）において癌免疫療法併用剤の有効性を分析するには、具体的には、工程（Ａ）に関し上記に説明した通り、上記基準との比較により決定した「高い」、「同等」又は「低い」等のランク、或いはスコア化した値に基づいて、癌免疫療法併用剤の有効性を分析することが出来る。より具体的には、対象生体試料における上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「高い」とのランク付けが得られた場合には、当該患者については、癌免疫療法併用剤の有効性が相対的に高いと理解することができる。さらに、対象生体試料における上記２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「高い」とのランク付けが得られた場合には、当該患者については、癌免疫療法併用剤の有効性が相対的により高いと理解することができる。
　それに対して、対象生体試料における上記２つの遺伝子全ての翻訳産物発現レベルが「同等」又は「低い」とのランク付けが得られた場合には、当該患者については、癌免疫療法併用剤の有効性が相対的に低いと理解することができる。翻訳産物発現レベルをスコア化した場合には、スコア自体から癌免疫療法併用剤の有効性を理解することができる。或いは、予めスコアに再発リスクが「高い」、「低い」又は「中程度」等の判定を割り振っておき、得られたスコアから癌免疫療法併用剤の有効性を「高い」、「低い」又は「中程度」等と理解することもできる。
　本発明の癌免疫療法併用剤は、本発明の有効性分析方法において取得した情報に基づいて有効性を分析された患者の治療に用いるため癌免疫療法併用剤であることができる。本発明の癌免疫療法併用剤は、本発明の有効性分析方法において取得した情報に基づいて有効性が相対的に高いと分析された患者の治療に用いることが好ましい。有効性の有無は、本発明の有効性分析方法において取得した情報に基づいて、医療専門家により適宜行われる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
例１
IFNγ 刺激したMiaPaCa-2細胞のPD-L1の発現
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNγ(0, 10 50 ng/ml)刺激を行い、72時間後に細胞抽出液を回収し、10μgを用いてSDS-PAGEを行い、PD-L1及びβ-actin抗体を用いてimmunoblottingを行った。
結果：図１
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNγ刺激すると、濃度依存的にPD-L1の発現が誘導される。
例２
ARF6経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞のPD-L1の発現
　MiaPaCa-2細胞を用いて各種siRNAをLipofectamine RNAiMAXにより導入し、IFNγ(50 ng/ml)刺激を行い、48時間後に細胞抽出液を回収した後、10μgを用いてSDS-PAGEを行い、各種抗体を用いてimmunoblottingを行った。
ARF6 sequence targeted by siRNA; GCACCGCAUUAUCAAUGACCG(配列番号4)
AMAP1 sequence targeted by siRNA; AAGACCUGACAAAAGCCAUUA(配列番号6)
EPB41L5 sequence targeted by siRNA; GAGAUGGAACUGGCUAUUUUU(配列番号8)
結果：図２
　MiaPaCa-2細胞を用いてARF6，AMAP1及びEPB41L5の発現を抑制してもIFNγ刺激によるPD-L1の総発現量は変わらない。
例３
ARF6経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞のPD-L1の細胞膜局在
　MiaPaCa-2細胞を用いて例２と同様の方法で各種siRNAを導入し、IFNγ(50 ng/ml)刺激を行った。48時間後に4% PFA/PBSにて細胞を固定後、anti-PD-L1抗体を用いて染色し、anti-Rabbit IgG(Alexa Fluor 555)を二次抗体として用い、標識した。アクチンの染色には、Alexa Fluor 488 phalloidinを用い、核の染色には、DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)を用いた。
結果：図３
　MiaPaCa-2細胞を用いてARF6及びAMAP1の発現を抑制すると、細胞表面のPD-L1の局在が減少するのが観察された。一方、EPB41L5の発現抑制では、細胞表面のPD-L1の局在はコントロールと差は見られていない。
例４
ARF6経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のPD-L1のフローサイトメトリー（FACS）解析
　例２と同様の方法で各種siRNAを導入し、48時間後に細胞を回収し、anti-PD-L1-PEを用いて反応後、FACS解析を行った。陰性コントロールとしてmouse IgG-PEを用いた。
結果：図４
　FACS解析を行った結果、ARF6及びAMAP1の発現抑制により細胞表面のPD-L1の減少が見られた。一方、EPB41L5の発現抑制では、細胞表面のPD-L1の減少は見られなかった。
例５
Simvastatin処理を行ったMiaPaCa-2細胞のPD-L1の細胞膜局在
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNγ(50 ng/ml)刺激を行った後、Simvastatin(1μM)を加え、24時間後に4% PFA/PBSにて細胞を固定後、anti-PD-L1抗体を用いて染色し、anti-Rabbit IgG(Alexa Fluor 555)を二次抗体として用い、標識した。アクチンの染色には、Alexa Fluor 488 phalloidin、核の染色にはDAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)を用いた。
結果：図５
　ARF6経路の活性化にメバロン酸経路が関与することを明らかにしている。メバロン酸経路阻害剤であるSimvastatin (1μM) を用いてMiaPaCa-2細胞を処理すると、細胞表面のPD-L1の減少が観察された。
例６
Brefeldin A処理を行ったMiaPaCa-2細胞のPD-L1の細胞膜局在
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNg(50 ng/ml)刺激を行った後、Brefeldin A(5μg/ml)を加え、30分後に4% PFA/PBSにて細胞を固定後、anti-PD-L1抗体を用いて例５と同様の方法で染色を行った。β-COP染色は、anti-β-COP抗体を用いた。
結果：図６
　MiaPaCa-2細胞にBrefeldin A(Arf1を活性化するGEFの阻害剤)を添加してもPD-L1の局在は変化しないことから、PD-L1のリサイクリングにArf1が関与している可能性は低いことが考えられる。Brefeldin Aに対してsensitiveであるβ-COPの局在には違いが見られていることから、Brefeldin Aは問題なく機能していることを示している。
例７
Simvastatin及びBrefeldin A処理を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のPD-L1のFACS解析
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNg(50 ng/ml)刺激を行った後、Simvastatin(1μM)を加え、24時間後に細胞を回収した。また、Brefeldin A(5μg/ml)に関しては、添加してから30分後に細胞を回収した。anti-PD-L1-PEを用いて反応後、FACS解析を行った。陰性コントロールとしてmouse IgG-PEを用いた。
結果：図７
　FACS解析を行った結果、Simvastatin(1μM)処理したMiaPaCa-2細胞では細胞表面のPD-L1が減少しているのに対し、BFA(Brefeldin A)処理した細胞では細胞表面のPD-L1の減少は見られなかった。
例８
ARF6経路構成蛋白質の発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞におけるPD-L1のリサイクリング解析
　MiaPaCa-2細胞を用いて例２と同様の方法で各種siRNAを導入し、IFNg(50 ng/ml)刺激を行い、48時間後にanti-PD-L1抗体を用いて細胞表面のPD-L1と４℃で反応後、37℃で培養することにより、細胞表面のPD-L1を細胞内にinternalizationさせた。その後、細胞表面のPD-L1に結合しているanti-PD-L1抗体をacid wash(0.5% glacial acetic acid and 0.5M NaCl, pH3.0)にて解離し、再度37℃で培養することにより、細胞内にinternalizationしたPD-L1を細胞表面にrecycle backさせた。細胞内にinternalizationさせたPD-L1を、0.1% TritoX-100を用いてpermeabilizeし、anti-mouse IgG(Alexa Fluor 790)を用いて標識した。細胞表面のPD-L1は、permeabilizeしないでanti-mouse IgG(Alexa Fluor 790)を用いて標識し、Odysseyにて定量した。DRAQ5にて核染色を行い、細胞数に対するinternalizationの値を算出し、リサイクリングは、internalizationに対する割合を経時的に算出した。
結果：図８
　MiaPaCa-2細胞を用いてPDGF刺激すると、PD-L1のリサイクルが増加した（青線）。一方、ARF6及びAMAP1の発現を抑制すると、PDGF刺激依存的なPD-L1のリサイクルが観察されなかった（赤線、緑線）。EPB41L5の発現抑制では、PDGF刺激依存的なPD-L1のリサイクルが観察されたことから（紫線）、Arf6及びAMAP1シグナルがPDGF刺激依存的なPD-L1のリサイクルに関わっていることを示す。
　以上の結果から、PD-L1のリサイクリングにARF6及びAMAP1シグナルが関与している新規知見が得られた。ARF6経路活性化を分子標的としたスタチンと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用による癌免疫療法の有効性向上に繋がる可能性があることを強く示唆する結果である。
例９
個体を用いたKPC細胞による腫瘍増殖能の解析
（ａ）FAK及びAMAP1の発現を抑制したKPC細胞(2 x 105)を用い、シンジェニックマウス（C57BL/B6, 5-week-old females）の皮下に同量のマトリゲルと共にシリンジで注入し、２１日間腫瘍増殖能を腫瘍体積にて測定した(V=(W2 x L)/2 (V: 体積　W：短径　L：長径))。
（ｂ）FAK及びAMAP1の発現を抑制したKPC細胞(2 x 105)を用い、免疫不全マウス（ヌードマウス、5-week-old females）の皮下に同量のマトリゲルと共にシリンジで注入し、２１日間腫瘍増殖能を腫瘍体積にて測定した。
（ｃ）FAK及びAMAP1の発現を抑制したKPC細胞(1 x 104)を用い、３日間in vitroにおける細胞生存率をCell counting Kit-8を用いて測定した。
（ｄ）シンジェニックマウス (C57BL/6)の皮下にKPC細胞(Irr or shAMAP1)を移植し、10、13、16日にAnti-PD-L1 Ab or mouse IgGを3 mg/kgで腹腔内投与し、25日間腫瘍増殖能を腫瘍体積にて測定した。PD-L1抗体を用いた治療実験のタイムスケジュールを図９ｄに示す。
　結果を図９ａ～ｃ及び図９ｅに示す。
(a)マウス膵癌細胞KPCを用いて、コントロール(irr)、FAK発現抑制(shFAK)及びAMAP1発現抑制(shAMAP1)細胞を免疫系が保持されているシンジェニックマウス(C57BL/6)の皮下に移植すると、コントロール(irr)に比べFAK発現抑制(shFAK)及びAMAP1発現抑制(shAMAP1)細胞の腫瘍増殖能が抑制された。AMAP1の発現抑制は、FAKの発現抑制よりも腫瘍増殖能が阻害されていた(図9a)。
(b)マウス膵癌細胞KPCを用いて、コントロール(irr)、FAK発現抑制(shFAK)及びAMAP1発現抑制(shAMAP1)細胞を免疫不全マウス（ヌードマウス）の皮下に移植しても、これらの細胞の腫瘍増殖能に大きな差は見られない(図9b)。
(c)マウス膵癌細胞KPCによるコントロール(irr）、FAK発現抑制(shFAK)及びAMAP1発現抑制(shAMAP1) 細胞のin vitroにおける増殖能に大きな差は見られない(図9c)。
(d) PD-L1抗体を用いた治療実験にて腫瘍増殖能を測定した結果、AMAP1の発現を抑制したKPC細胞は、コントロールに比べ、Anti-PD-L1 Ab投与により、腫瘍贈職能が減少する傾向が観察された(図9e)。
　(a)～(c)の結果から、AMAP1シグナルは免疫回避に関与している可能性が示唆され、さらに(d)の結果は、Arf6-AMAP1経路が発現している膵癌において、AMAP1の発現阻害と抗PD-L1抗体による癌免疫療法が有効であることを示唆する。
例１０
A. GGT-IIを発現抑制したMiaPaCa-2細胞のPD-L1細胞膜局在
　MiaPaCa-2細胞を用いてGGT-II siRNAを導入し、IFNγ(50 ng/ml)刺激を行った。48時間後に4% PFA/PBSにて細胞を固定後、anti-PD-L1抗体を用いて染色し、anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 555)を二次抗体として用い、標識した。アクチンの染色には、Alexa Fluor 488 phalloidinを用い、核の染色には、DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)を用いた。GGT-II siRNA/shRNAのターゲット配列情報は以下の通りである。
GGT-II (#1) : GCAGAUUAUAUCGCAUCCU (配列番号9)
GGT-II (#2) : GCCAACAUGAAUGUGGUGG (配列番号10)
　結果を図11Aに示す。MiaPaCa-2細胞を用いてGGT-IIの発現を抑制すると、細胞表面のPD-L1の局在が減少あるいは異常になっているのが観察された。
B. GGT-IIの発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のPD-L1 のフローサイトメトリー(FACS) 解析
　Aと同様にGGT-II siRNAを導入し、IFNγ(50 ng/ml)刺激を行い、48時間後に細胞を回収し、anti-PD-L1-PEを用いて反応後、FACS解析を行った。陰性コントロールとしてmouse IgG-PEを用いた。
　結果を図11Bに示す。FACS解析を行った結果、GGT-IIの発現抑制により細胞表面のPD-L1の減少が見られた。
C. Rictor, Raptor及びmTORを発現抑制したMiaPaCa-2細胞のPD-L1細胞膜局在
　Aと同様にRictor, Raptor及びmTOR siRNAを導入し、IFNγ(50 ng/ml)刺激を行った。48時間後に4% PFA/PBSにて細胞を固定後、anti-PD-L1抗体を用いて染色し、anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 555)を二次抗体として用い、標識した。アクチンの染色には、Alexa Fluor 488 phalloidinを用い、核の染色には、DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)を用いた。
Rictor, Raptor及びmTOR siRNA/shRNAのターゲット配列情報は以下の通りである。
RICTOR (#1) : TACTTGTGAAGAATCGTATCTT (配列番号11)
RAPTOR (#1) : AGGGCC CTGCTACTCG CTTTT  (配列番号12)
mTOR (#1) : CCGCATTGTCTCTATCAAGTT  (配列番号13)
　結果を図11Cに示す。MiaPaCa-2細胞を用いてRaptor及びmTORの発現を抑制すると、細胞表面のPD-L1の局在が減少するのが観察された。一方、Rictorの発現抑制では、細胞表面のPD-L1の局在はコントロールと差は見られていない。
D. Rictor, Raptor及びmTORの発現抑制を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のPD-L1 のフローサイトメトリー(FACS) 解析
　Aと同様にRictor, Raptor及びmTOR siRNAを導入し、IFNγ(50 ng/ml)刺激を行い、48時間後に細胞を回収し、anti-PD-L1-PEを用いて反応後、FACS解析を行った。陰性コントロールとしてmouse IgG-PEを用いた。
　結果を図11Dに示す。FACS解析を行った結果、Raptor及びmTORの発現抑制により細胞表面のPD-L1の減少が見られた。一方、Rictorの発現抑制では、細胞表面のPD-L1の減少は見られなかった。
E. Silvestrol処理を行ったMiaPaCa-2細胞のPD-L1の細胞膜局在
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNγ(50 ng/ml)刺激を行った後、Silvestrol (10 nM)を加え、24時間後に4% PFA/PBSにて細胞を固定後、anti-PD-L1抗体を用いて染色し、anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 555)を二次抗体として用い、標識した。アクチンの染色には、Alexa Fluor 488 phalloidin、核の染色にはDAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)を用いた。
　結果を図11Eに示す。ARF6経路の活性化にmTOR/eIF4A経路が関与することを明らかにしている。eIF4A阻害剤であるSilvestrol (10 nM) を用いてMiaPaCa-2細胞を処理すると、細胞表面のPD-L1の減少が観察された。
F. Silvestrol処理を行ったMiaPaCa-2細胞における細胞表面のPD-L1のFACS解析
　MiaPaCa-2細胞を用いてIFNg (50 ng/ml)刺激を行った後、Silvestrol (10μM)を加え、24時間後に細胞を回収した。anti-PD-L1-PEを用いて反応後、FACS解析を行った。陰性コントロールとしてmouse IgG-PEを用いた。
　結果を図11Fに示す。FACS解析を行った結果、Silvestrol (10 nM)処理したMiaPaCa-2細胞では細胞表面のPD-L1の減少が見られた。
G. mTOR阻害剤 (Rapamycin, Torin1)によるAMAP1の発現抑制
MiaPaCa-2及びKPC細胞をmTOR阻害剤 Rapamycin (100 nM, 10 nM)及び Torin1 (500 nM)で24時間処理し、AMAP1の発現を解析した。mTOR阻害剤 (Rapamycin, Torin1)でAMAP1の発現が抑制されることを確認した。結果を図11Gに示す。Arf6-AMAP1経路が発現している膵癌において、mTOR阻害剤と免疫チェックポント阻害抗体による癌免疫療法が有効であることを示唆する。
　以上の例１０のＡ～Ｇの結果から、ARF6経路の活性化に関わるメバロン酸経路に加え、GGT-II、mTOR及びeIF4A阻害により細胞表面のPD-L1が減少する新規知見が得られた。ARF6経路活性化を分子標的としたGGT-II阻害剤、mTOR阻害剤及びSilvestrolと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用による癌免疫療法の有効性向上に繋がる可能性があることを強く示唆する結果である。
例１１
 PDGFR阻害剤 (Crenoranib)によるPD-L1 リサイクリング阻害
　PDGFR阻害剤Crenoranib(0.3 μM) を12時間処理したMiaPaCa-2細胞を用い、PDGF刺激によるPD-L1 リサイクリングを解析した。
(A)MiaPaCa-2細胞を用い、DMSO及びPDGFR阻害剤 Crenolanib (0.3 μM)を16時間処理し、FACSによりPD-L1の細胞表面量を測定した。PDGFR阻害剤 Crenolanib (0.3 μM)により、PD-L1の細胞表面量が減少する結果が得られた（図１２Ａ）。
(B)MiaPaCa-2細胞を用い、DMSO及びPDGFR阻害剤 Crenolanib (0.3 μM)を16時間処理し、ウェスタンブロッティングにより、PD-L1の発現を調べた。PDGFR阻害剤 Crenolanib (0.3 μM)により、PD-L1の発現量に大きな差は見られていない（図１２Ｂ）。
(C)MiaPaCa-2細胞を用い、DMSO及びPDGFR阻害剤 Crenolanib (0.3 μM)を16時間処理し、細胞染色を行った。PDGFR阻害剤 Crenolanib (0.3 μM)により、細胞表面のPD-L1の減少が観察された。（図１２Ｃ（Scale bar, 10 μm））
例１２
 (A)AMAP1はCXCL12の発現に関わる（RNAseq.解析）
AMAP1の発現を抑制したKPC細胞を用いてRNAseq.解析を行い、ケモカインの発現を調べた結果、CXCL12が最も減少している結果が得られた（図１３Ａ）。CXCL12は、免疫抑制細胞であるMDSCやTregをリクルートすることが知られており、AMAP1がCXCL12を介して膵癌の悪性度に関わっている可能性が示唆される。
 (B)AMAP1はCXCL12の発現と正に相関する
膵癌のTCGAデータベース (n = 165) を用いて、AMAP1の発現とCXCL12の発現を調べた結果、有意な差 (P < 0.001)を持って正の相関が見られ、AMAP1がCXCL12の発現制御に関与していることを強く示唆する（図１３Ｂ）。
 (C)AMAP1はCXCL12の発現に関わる（Real-Time PCR解析）
AMAP1の発現を抑制したKPC細胞を用いてCXCL12の発現をReal-Time PCRで解析した結果、コントロール細胞 (Irrelevant)に比べ、AMAP1の発現を抑制した細胞ではPDGF刺激によるCXCL12の発現が抑制された。AMAP1がPDGF刺激依存的なCXCL12の発現制御に関与していることを示す（図１３Ｃ）。
一般に、癌組織の周囲のストローマ細胞がCXCL12を分泌することが知られているが、癌細胞自身もCXCL12を分泌して腫瘍の増殖に関与していることも知られている。AMAP1は癌細胞が分泌するCXCL12の制御に関与していると考えられる。
 (D)マウス腫瘍組織を用いた組織染色のタイムスケジュール
シンジェニックマウス (C57BL/6)の皮下にKPC細胞(Irr or shAMAP1)を移植し、14日後に腫瘍を摘出し、組織染色を行った（図１３Ｄ）。
 (E)AMAP1の発現を抑制した腫瘍組織ではCXCL12の発現が減少する
シンジェニックマウス (C57BL/6)の皮下にKPC細胞(Irr or shAMAP1)を移植し、14日後に摘出した腫瘍組織を用いてCXCL12の染色を行った。コントロール (Irr)に比べ、AMAP1の発現を抑制した腫瘍組織では、CXCL12の発現が減少している染色像が観察され、CXCL12の発現制御にAMAP1が関与していることが強く示唆される（図１３Ｅ）。
この結果は、Arf6-AMAP1経路が発現している膵癌において、CXCL12-CXCR4阻害と抗PD-L1抗体による癌免疫療法が有効である可能性を示唆する。   
　本発明は、免疫チェックポイント阻害抗体を用いる癌免疫療法に関連する分野に有用である。
配列番号１：ＡＲＦ６のｃｄｓ領域塩基配列（NM_001663.3）
配列番号２：ＡＭＡＰ１（ＡＳＡＰ１）のｃｄｓ領域塩基配列（NM_018482.3）
配列番号３：ＡＭＡＰ１（ＡＳＡＰ１）のスプライスバリアントのｃｄｓ領域塩基配列（NM_001247996.1）
配列番号４：ＡＲＦ６の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号５：ＡＲＦ６の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号６：ＡＭＡＰ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号７：ＡＭＡＰ１の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号８：ＥＰＢ４１Ｌ５の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号９：ＧＧＴ－ＩＩ（＃１）の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号１０：ＧＧＴ－ＩＩ（＃２）の発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号１１：ＲＩＣＴＯＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号１２：ＲＡＰＴＯＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列
配列番号１３：ｍＴＯＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡの核酸配列

Claims (16)

  1. ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の１種又は２種以上の発現阻害剤を有効成分とする、
    抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤。
  2. ＰＤＧＦＲ阻害剤及びＣＸＣＲ４阻害剤から成る群から選択される１種又は２種以上の阻害剤を有効成分とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用される癌免疫療法併用剤。
  3. 癌が膵癌である、請求項１又は２に記載の癌免疫療法併用剤。
  4. 発現阻害剤がＡＲＦ６及びＡＭＡＰ１に対する発現阻害剤であるメバロン酸経路活性阻害剤である、請求項１又は３に記載の癌免疫療法併用剤。
  5. メバロン酸経路活性阻害剤がスタチンである、請求項４に記載の癌免疫療法併用剤。
  6. 発現阻害剤がＡＲＦ６又はＡＭＡＰ１の発現を阻害する核酸である、請求項１又は３に記載の癌免疫療法併用剤。
  7. 発現阻害剤が、ｍＴＯＲに対する発現阻害剤又はｅＩＦ４Ａに対する発現阻害剤である請求項１に記載の癌免疫療法併用剤。
  8. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体アテゾリズマブ、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体アベルマブ、及び抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体デュルバルマブから成る群から選ばれる少なくとも1種である、請求項１～７のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤。
  9. 請求項１、３～８のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤の有効性の分析に用いるための分析薬であって、
    ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａからなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、分析薬。
  10. 上記タンパク質及び／又はポリペプチドが、抗体及び／又はその断片である、請求項９に記載の分析薬。
  11. （Ａ）癌の患者から採取した生体試料において、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること；並びに
    （Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の請求項１、３～８のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤の有効性を分析するための情報を取得すること、
    を含む、癌免疫療法併用剤の有効性を分析する方法。
  12. 工程（Ａ）において、ＡＲＦ６、ＡＭＡＰ１、 ｍＴＯＲ及びｅＩＦ４Ａから成る群から選択される全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する、請求項１１に記載の方法。
  13. 上記生体試料が膵組織である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  14. 工程（Ａ）及び／又は（Ｂ）において、上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、それら遺伝子の翻訳産物をそれぞれ特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを用いた免疫組織化学法により決定される、請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 上記タンパク質及び／又はポリペプチドが抗体及び／又はその断片である、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１１～１５のいずれかに記載の方法において有効性が分析された患者の治療に用いるための、請求項１、３～８のいずれかに記載の癌免疫療法併用剤。
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