WO2019139009A1 - リンカー化合物、ダイヤモンド電極、装置、病原体又はタンパク質の検出方法、及びダイヤモンド電極の製造方法 - Google Patents

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virus
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protein
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佐藤　智典
輝彦 松原
泰明 栄長
崇史 山本
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to linker compounds, diamond electrodes, devices, methods for detecting pathogens or proteins, and methods for producing diamond electrodes.
  • target objects target pathogens, pathogenic bacteria, viruses, proteins thereof, etc.
  • influenza virus is a pandemic and there is a need for rapid and accurate detection of influenza virus.
  • immunochromatography etc. which used an antibody as a molecule which recognizes IFV are mentioned, but the method using an antibody may take time and cost.
  • the present inventors examined a method capable of detecting IFV without using an antibody, and developed a highly sensitive detection method using a diamond electrode presenting a peptide (see Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a technology capable of detecting a detection target with high sensitivity.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by a diamond electrode in which a molecule that recognizes a detection target is immobilized on the surface of a diamond electrode through a linker compound having a specific structure, and the present invention is completed. It came to More specifically, the present invention provides the following.
  • a linker compound represented by the following formula (1) (In the formula (1), A represents a diazo nio group, an amino group, a carboxy group, a carbonyl group, an aldehyde group, a hydroxyl group or a nitro group, B 1 and B 2 may be the same or different, and are each independently represented by the following formula (2), (In the formula (2), X 1 is -NHCO- or -CH 2- , X 2 is a divalent hydrocarbon group which may have a substituent, R is a propargyl group. ) L is an aromatic ring. )
  • the molecule that recognizes the detection target is influenza virus, DNA virus, RNA virus, double stranded DNA virus, single stranded DNA virus, double stranded RNA virus, single stranded RNA (+) strand virus, 1 Single-stranded RNA (-) strand virus, single-stranded RNA reverse transcription virus, double-stranded DNA reverse transcription virus, norovirus, rotavirus, rubella virus, measles virus, RS virus, herpes virus, hepatitis virus, adenovirus, foot-and-mouth disease virus Recognizes rabies virus, human immunodeficiency virus, mycoplasma, mycoplasma, botulinum, pertussis, tetanus, diphtheria, cholera, shigella, anthrax, pathogenic E. coli, staphylococcus, salmonella, welsch or cereus , [3] or [4].
  • the molecule that recognizes the detection target is influenza virus haemagglutinin protein (HA), influenza virus neuraminidase (NA), M1 protein or M2 protein, Mycoplasma bacterial P1 protein, membrane antigen protein or ribosomal protein L7 / L12 Recognizes botulinum toxin, pertussis toxin, tetanus toxin, diphtheria toxin, alpha toxin of C. perfringens, cholera toxin, vero toxin, anthrax toxin, E. coli-derived enterotoxin, staphylococcal-derived enterotoxin, salmonella-derived enterotoxin or B. cereus-derived enterotoxin
  • the diamond electrode as described in [3] or [4].
  • a device comprising the diamond electrode described in any of [2] to [6].
  • a method for producing a diamond electrode comprising the step of immobilizing a linker compound represented by the following formula (1) on the surface of a diamond electrode.
  • A represents a diazo nio group, an amino group, a carboxy group, a carbonyl group, an aldehyde group, a hydroxyl group or a nitro group
  • B 1 and B 2 may be the same or different, and are each independently represented by the following formula (2),
  • X 1 is -NHCO- or -CH 2-
  • X 2 is a divalent hydrocarbon group which may have a substituent
  • R is a propargyl group.
  • L is an aromatic ring.
  • the linker compound of the present invention is represented by the following formula (1).
  • the linker compound of the present invention can be immobilized on the surface of a diamond electrode described later to enhance the sensitivity of the detection system using the diamond electrode.
  • the molecule that recognizes the detection target is immobilized via the linker compound of the present invention (however, detection immobilized on the surface of the diamond electrode via the linker compound of the present invention)
  • a mode in which the molecule recognizing the object and the molecule recognizing the detection object directly immobilized on the surface of the diamond electrode coexist is not excluded.
  • a molecule that recognizes a detection target is also referred to as a "recognition molecule.
  • A represents a diazo nio group, an amino group, a carboxy group, a carbonyl group, an aldehyde group, a hydroxyl group or a nitro group
  • B 1 and B 2 may be the same or different, and are each independently represented by the following formula (2), (In the formula (2), X 1 is -NHCO- or -CH 2- , X 2 is a divalent hydrocarbon group which may have a substituent, R is a propargyl group. ) L is an aromatic ring. )
  • the linker compound of the present invention has a branched structure having two propargyl groups at the end.
  • the recognition molecule and the detection target It has been found that the affinity can be enhanced and as a result, the detection target can be detected with higher sensitivity.
  • the linker compound of the present invention presents a recognition molecule via two propargyl groups.
  • the detection target and the linker compound have a high possibility of binding via at least two points (two propargyl groups).
  • the linker compound of the present invention can enhance the affinity to the detection target as compared with the linker compound having no branched structure.
  • the affinity between the linker compound of the present invention and the detection target may be appropriately adjusted, for example, according to the size of the detection target, etc., for the length and the like of the carbon chain of B 1 and B 2 in the linker compound of the present invention. Can be controlled.
  • A is a functional group capable of reacting with the diamond electrode. From the viewpoint of good reactivity with the surface of the diamond electrode, A is preferably a diazonio group. Since a diazo nio group is a monovalent cationic group, when A is a diazo nio group, a counter anion may coexist with the linker compound of the present invention. Such counter anion, BF4 @ -, and the like.
  • B 1 and B 2 each have a functional group capable of reacting with a molecule that recognizes a detection target, and are represented by Formula (2). Since both of B 1 and B 2 contain a propargyl group, the linker compound of the present invention has a branched structure having two propargyl groups at the end.
  • X 1 may be either —NHCO— or —CH 2 —.
  • the divalent hydrocarbon group at X 2 may be, for example, a divalent aliphatic group or a divalent aryl group.
  • the divalent hydrocarbon group at X 2 is a divalent aliphatic group
  • the divalent aliphatic group is any of linear, branched and cyclic forms It may be in the form of a combination of these structures. More specifically, it may be an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, a cycloalkylene group, a cycloalkenylene group, a cycloalkynylene group or the like, or a structure in which these are mutually bonded.
  • the divalent aliphatic group may be a saturated aliphatic group or an unsaturated aliphatic group, and the unsaturated bond may be one or more (for example, 1 to 5) in the molecule and / or at the end. You may have.
  • the divalent hydrocarbon group at X 2 is a divalent aryl group
  • the divalent aryl group is, for example, a phenyl group, a naphthyl group, a naphthoyl group, a phenalenyl group, an anthryl group, a phenanthryl group. It may be a group, a biphenyl group or the like.
  • the carbon atom which comprises the bivalent hydrocarbon group in X 2 may be substituted by the hetero atom, and may not be substituted.
  • the hetero atom which may be substituted an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom and the like can be mentioned, and as an aspect substituted with a hetero atom, one substituted with a heteroaryl group may be used.
  • heteroaryl group examples include, for example, epoxy group, thienyl group, benzothienyl group, furyl group, benzofuranyl group, isobenzofuranyl group, isothiazolyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, pyrrolyl group, pyridyl group, pyrazinyl group And pyrimidinyl group, pyridazinyl group, indolyl group, isoindole group, quinolyl group, quinoxalyl group, isoquinolyl group, isoxazolyl group, tetrazolyl group, phthalazyl group, imidazopyridyl group, naphthyridyl group, quinazolyl group, acridinyl group and the like.
  • the carbon number of the divalent hydrocarbon group at X 2 may be, for example, in the range of 1 to 50, preferably 1 to 30, and is 1 to 20. Is more preferable, and 1 to 10 is more preferable.
  • the divalent hydrocarbon group for X 2 particularly preferably contains a linear carbon chain, and the linear carbon chain preferably has 1 to 50 carbon atoms, and is 1 to 30. Is more preferable, 1 to 20 is more preferable, and 1 to 10 is even more preferable.
  • R is a propargyl group.
  • the linker compound of the present invention is linked to the recognition molecule via this propargyl group.
  • L is an aromatic ring and may be, for example, an aromatic carbocyclic ring or heterocyclic ring which may be substituted. Specifically, a benzene ring, a naphthalene ring, an anthracene ring and the like can be mentioned.
  • the aromatic ring may be substituted by an alkyl group, an aryl group, a halogen group, a hydroxyl group or the like. Since L is an aromatic ring, the reaction between the functional group A (such as diazo nio group) in the linker compound and the surface of the diamond electrode proceeds, and the linker compound of the present invention can be immobilized on the surface of the diamond electrode.
  • the linker compound of the present invention the functional group R (propargyl group) can be modified by a recognition molecule.
  • the detection target corresponding to the recognition molecule can be specifically detected.
  • the “molecule that recognizes the detection target” and the “recognition molecule” mean a molecule that interacts, binds or associates with the detection target.
  • the recognition molecule preferably has the following structure.
  • C-rec (Wherein rec is a moiety that recognizes the detection target, and C is a functional group capable of reacting with propargyl group).
  • C is preferably an azide group or the like.
  • the recognition molecule may be anything as long as current flows through the diamond electrode when interacting with the detection target.
  • the recognition molecule may be a sugar chain or a peptide.
  • "peptide” may include an antibody or an antigen binding domain thereof.
  • the recognition molecule When the recognition molecule is a sugar chain, it may be any of a monosaccharide, an oligosaccharide, and a polysaccharide, as long as the sugar chain can recognize the detection target.
  • the recognition molecule is preferably a sugar chain (monosaccharide, oligosaccharide or polysaccharide) having a sugar containing sialic acid or a sulfate group.
  • Sugar chains can be prepared by extraction from natural products, organic synthesis, enzyme synthesis, synthesis by microorganisms, synthesis using cells, etc. Moreover, as a kind of the sugar chain which comprises a recognition molecule, one type may be sufficient and the mixture of multiple types may be sufficient.
  • the recognition molecule is a peptide
  • it is not particularly limited to the length of the peptide as long as it is a peptide that can recognize the detection target.
  • the peptide may be a full-length sequence or partial sequence of a protein (such as an antibody) that recognizes a target, a sequence searched from a peptide library, and the like.
  • a sequence searched from a peptide library a peptide that recognizes influenza searched by a phage display method can be mentioned.
  • Such a peptide can be produced according to the method described in Patent No. 5093100, Japanese Patent Application No. 2015-093132.
  • the detection target recognized by the recognition molecule includes a pathogen or a protein.
  • influenza virus influenza virus, DNA virus, RNA virus, double stranded DNA virus, single stranded DNA virus, double stranded RNA virus, single stranded RNA (+) strand virus, 1 Single-stranded RNA (-) strand virus, single-stranded RNA reverse transcription virus, double-stranded DNA reverse transcription virus, norovirus, rotavirus, rubella virus, measles virus, RS virus, herpes virus, hepatitis virus, adenovirus, foot-and-mouth disease virus , Rabies virus, human immunodeficiency virus, mycoplasma, mycoplasma, botulinum, pertussis, tetanus, diphtheria, cholera, shigella, anthrax, pathogenic E. coli, staphylococci, salmonella, welsch or cereus.
  • the above-mentioned detection targets also include the following: hemagglutinin protein (HA) of influenza virus, neuraminidase (NA) of influenza virus, M1 protein or M2 protein, P1 protein of mycoplasma bacteria, membrane Antigen protein or ribosomal protein L7 / L12, botulinum toxin, pertussis toxin, tetanus toxin, diphtheria toxin, alpha toxin of C. perfringens, cholera toxin, vero toxin, anthrax toxin, E. coli-derived enterotoxin, staphylococcal-derived enterotoxin, salmonella-derived Enterotoxin or Enterotoxin derived from Bacillus cereus.
  • HA hemagglutinin protein
  • NA neuraminidase
  • M1 protein or M2 protein M1 protein or M2 protein
  • P1 protein of mycoplasma bacteria membrane Antigen protein or ribosom
  • HA is particularly preferable as the detection target recognized by the recognition molecule.
  • HA is a protein that is presented on the surface of influenza virus, contributes to infection of host cells, and is used as a major component of influenza vaccine. Therefore, HA is relatively easy to detect and can be a specific indicator of influenza virus.
  • any ligation reaction can be adopted. Specifically, a Heusgen cycloaddition reaction (also called a click reaction), a Glaser reaction, a Sonogashira coupling, a Suzuki-Miyaura coupling reaction, etc. can be used, and those which form a covalent bond are preferred. Not exclusively.
  • the modification of the linker compound of the present invention by the recognition molecule can be performed at any timing.
  • the linker compound of the present invention may be modified at any timing before or after immobilization on a diamond electrode described later.
  • a detection target In a diamond electrode on which a linker compound modified by a recognition molecule is immobilized, when the recognition molecule recognizes a detection target in the state where a potential is applied to the electrode, a current flows by an electrochemical reaction. By measuring this current, a detection target can be detected.
  • detection includes qualitative detection and quantitative detection, and means that the object to be detected can be specifically found.
  • the diamond electrode of the present invention is obtained by immobilizing the linker compound of the present invention on the surface of the diamond electrode.
  • the diamond electrode of the present invention corresponds to a working electrode.
  • the diamond electrode of the present invention has the following structure. Electrode-Lin (In the formula, Electrode means a diamond electrode, and Lin means a linker compound of the present invention.)
  • the diamond electrode of the present invention has the following structure. Electrode-Lin-REC (Wherein Electrode means a diamond electrode, Lin means a linker compound of the present invention, and REC means a recognition molecule).
  • the configuration (material, shape, size, etc.) of the diamond electrode on which the linker compound of the present invention is immobilized is not particularly limited.
  • it may be a diamond electrode manufactured based on the description of JP-A-2006-98281, JP-A-2011-152324, or JP-A-2015-172401.
  • the diamond electrode may have the following configuration.
  • the diamond electrode usually has at least a substrate and a diamond layer on the substrate.
  • the linker compound of the present invention is immobilized on the surface opposite to the substrate.
  • the diamond layer on the substrate may be conductive diamond doped with a slight amount of impurities.
  • the impurities include boron (B), sulfur (S), nitrogen (N), oxygen (O), silicon (Si) and the like. From the viewpoint that the effects of the present invention are easily exhibited, the diamond electrode of the present invention is preferably a boron-doped diamond electrode.
  • the substrate can be, for example, 1 to 10 cm in diameter and 0.1 mm to 5 mm in thickness.
  • the substrate may be a Si substrate, a glass substrate such as SiO 2 or a quartz substrate, a ceramic substrate such as Al 2 O 3 , or a metal such as tungsten or molybdenum.
  • the whole or a part of the surface of the substrate can be a diamond layer. All or part of the diamond layer can be used for electrochemical measurements.
  • the deposition of the diamond layer on the substrate can be performed by conventional microwave plasma chemical vapor deposition (MPCVD) or the like.
  • MPCVD microwave plasma chemical vapor deposition
  • any method capable of reacting the functional group L (aromatic ring) in the linker compound of the present invention with the surface of the diamond electrode can be adopted. Such methods include electrolytic grafting.
  • immobilization means that the linker compound of the present invention and the surface of the diamond electrode are linked by a covalent bond.
  • the immobilization amount of the linker compound of the present invention can be appropriately set depending on the kind of detection target, detection sensitivity to be realized, etc., but for example, it is 0.1 to 80 pmol / cm 2 per surface area of diamond electrode. The amount may be fixed. Since the linker compound of the present invention has a branched structure as described above, even with a relatively low immobilization amount, the affinity to the detection target can be sufficiently enhanced.
  • the device of the invention comprises at least the diamond electrode of the invention.
  • the diamond electrode of the present invention functions as a working electrode.
  • the apparatus of the present invention can adopt any configuration, and may have, for example, a reference electrode (reference electrode), a counter electrode, a voltage application unit, a current measurement unit, and any recording means.
  • the device according to the invention comprises tripolar electrodes (working electrode, counter electrode and reference electrode).
  • the apparatus of the present invention further comprises a potentiostat and an AC transmitter connected thereto and a lock-in amplifier. This device can perform electrochemical impedance measurements (AC impedance measurements).
  • the resistance on the reference electrode side is set high and no current flows between the working electrode and the reference electrode.
  • the counter electrode is not particularly limited, and for example, silver wire or platinum wire can be used.
  • the reference electrode is not particularly limited, but a silver-silver chloride electrode (Ag / AgCl) is preferable from the viewpoint of stability, reproducibility and the like.
  • the size and positional relationship in the sensor of the working electrode, the counter electrode and the reference electrode can be designed as appropriate, but the working electrode, the counter electrode and the reference electrode are all designed and arranged so as to be simultaneously accessible Be done.
  • An object to be detected can be detected by the diamond electrode of the present invention or a device provided with the electrode.
  • the “detection target” is a target that the recognition molecule specifically recognizes, and specifically, those described above as the detection target recognized by the recognition molecule (pathogen or protein etc.) can be mentioned.
  • the recognition molecule that modifies the linker compound of the present invention recognizes the detection target.
  • current is generated when a potential is applied to the electrode.
  • the current can be measured by electrochemical impedance measurement, cyclic voltammetry.
  • a potentiostat connected to an AC transmitter is used for electrochemical impedance measurement.
  • a constant DC potential is applied to the electrodes using a potentiostat, and an alternating potential of ⁇ 5 to 10 mV is superimposed and applied using an AC generator.
  • an AC wave of the same phase as the AC input from the transmitter to the potentiostat is also input to the lock-in amplifier.
  • the current flowing is a combination of a direct current and an alternating current
  • the lock-in amplifier compares the alternating current component of the current with the alternating current from the transmitter and outputs an impedance and a phase difference between the two.
  • the alternating current frequency from the transmitter is gradually changed, and complex plane plotting or the like is performed based on the impedance and the phase difference obtained at each frequency.
  • the impedance (charge transfer resistance Rct) of the electrode is determined by Nyquist plot, and a calibration curve plotting the relationship between concentration or amount and Rct is prepared and measured. From the Rct value of the sample, the concentration or amount of the detection target contained in the sample can be calculated.
  • Cyclic voltammetry is performed using a technique of fluctuating (sweeping) a potential. Specifically, the electrode potential is swept from the initial potential (E i ) to the reversal potential (E ⁇ ) at a sweep rate (v) and then reversed, and the current obtained when returning to E i is observed.
  • a current potential graph (cyclic voltammogram) can be obtained by setting the initial potential Ei to a potential at which the electrode reaction does not occur, and setting the inversion potential E ⁇ to a potential at which the electrode reaction becomes diffusion limited.
  • the initial potential, the sweep speed, the inversion potential and the like can be set as appropriate.
  • a peak current value is determined for a detection target of known concentration or amount, and a calibration curve in which the relationship between the concentration or amount and the peak current density is plotted is prepared, and the peak current for the measurement sample is From the value, it is possible to calculate the concentration or amount of the detection target contained in the sample.
  • Samples include any solution (eg, biological samples, drinking water, and solutions that may be contaminated with pathogens such as viruses or toxins).
  • Biological samples include, for example, saliva, sputum, tears, body fluids, blood, disrupted cells, and the like.
  • the origin of the sample is not particularly limited, and examples include animals, mammals, mice, rats, humans, chicken eggs, cells and the like.
  • the amount of sample is not particularly limited, and may be 1 ⁇ L to 10 mL.
  • the sample may be concentrated or may be subjected to measurement as it is.
  • the solvent used for detection is preferably a water system from the viewpoint of workability.
  • the solution from which the current measurement is made usually comprises a supporting electrolyte.
  • the supporting electrolyte is an ionic substance, and is not particularly limited, and examples thereof include phosphate buffered saline (PBS), potassium nitrate, sodium sulfate and the like. Of these, PBS is preferred.
  • the linker compound of the present invention is a branched compound having two propargyl groups (HC ⁇ C-CH 2- ) as in Amide-IPA-N 2 + BF 4 - ("8" in Scheme 4).
  • the linker of the present invention prepared in this example has a diazo nio group (—N + ⁇ N) as a functional group A capable of reacting with a diamond electrode.
  • sugar chain primer is dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) (manufactured by Wako) to prepare 50 mM, and it is passed through a 0.22 ⁇ L membrane filter (Millipore) and placed in a vial Stored at -30.degree.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • a 50 mM sugar primer solution was diluted with DMEM / F12 to which 1% Insulin-Transerrin-Selenium-A (Gibco) was added to prepare a medium containing 50 ⁇ M Lac-C12N3 primer. Five mL each of this was added to 12 dishes of MDCK cells and incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the culture medium was collected in a centrifuge tube, 3 mL of PBS ( ⁇ ) was added to each dish, and the cells were detached with a cell scraper. After another 1 mL of PBS (-) was added and cells were similarly detached, the cells were transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The collected supernatant was used as a medium fraction, and the remaining precipitate was used as a cell fraction. Subsequently, purification of the culture medium fraction was performed using a Sep-Pak C18 column (model number “WAT023635”, manufactured by Waters).
  • a diamond electrode was prepared according to the method described in WO2016 / 175049. Specifically, a diamond film was synthesized on a Si substrate by chemical vapor deposition using microwave plasma. Methane was used as a carbon source and trimethylborane was used as a boron source. The concentration of trimethyl borane in the raw material to be doped was 0.3% w / w. The surface morphology was characterized using a scanning electron microscope. The quality of the thin film was confirmed by Raman spectroscopy. The boron-doped diamond (BDD) electrode thus produced was used.
  • BDD boron-doped diamond
  • Electrolyte solution 100 mM TBA ⁇ PF 6
  • the composition of the reaction solution used for the click reaction is shown in Table 3.
  • “acidic glycan” means the sugar chain (acidic sugar chain) obtained in the above (2-3).
  • the reaction solution was prepared by the following method. First, 250 ⁇ l of MeOH was added to a centrifuge tube containing 17.2 nmol of acidic sugar chain and pipetted. This operation was performed on a total of two acid sugar-containing centrifuge tubes, and then combined into one. Next, 500 ⁇ L each of prepared TBTA, CuSO 4 , and L-ascorbic acid Na were added to each of the centrifuge tubes to prepare a total solution of 2 mL, and the solution was vortexed and stirred. After stirring, 1 mL each of the solution was added to the two cells after electrolytic grafting, and the cells were covered with parafilm and shaken for 1.5 hours for reaction.
  • Hemagglutininin protein was detected by electrochemical impedance measurement (EIS measurement) using a diamond electrode on which a linker compound modified with a sugar chain was immobilized according to the following method.
  • HA Hemagglutinin Protein
  • a virus lipid membrane of H1N1 A / New Caledonia / 20/99 was disassembled and taken out (trimer, about 210 kDa) was used.
  • 0, 5, 50, 125, 250, 375, 500 nM each approximately 0, 1, 10, 25, 50, 75, 100 ⁇ g / mL
  • a solution with an HA concentration of 954 ⁇ g / mL ( 4.54 ⁇ M) as a stock solution
  • the HA serial dilution solution of was prepared on ice.
  • PBS (-) was used as a solvent.
  • bovine serum albumin (BSA) at the same concentration as HA was prepared and used as a negative control.
  • Electrochemical impedance measurement EIS measurement
  • HA solution diluted with PBS was added to the cell and allowed to interact for 30 minutes. After 30 minutes, the solution was completely removed and washed three times with PBS to remove nonspecific adsorption. After completely removing the PBS solution, 2 mL of 5 mM [Fe (CN) 6 ] 3- / 4- / PBS was added to the cell and measurement was performed for 3 cycles. This operation was performed for each using HA solution (0 to 500 nM) and BSA solution (0 to 500 nM).
  • linker compound of the present invention can realize more sensitive detection than conventional linker compounds.

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Abstract

本発明の課題は、検出対象を高感度で検出できる技術を提供することである。　本発明は、以下の式（１）で表されるリンカー化合物を提供する。（式（１）中、Ａは、ジアゾニオ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、又はニトロ基であり、Ｂ１及びＢ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立に以下の式（２）で表され、（式（２）中、Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－であり、Ｘ２は、置換基を有してもよい２価の炭化水素基であり、Ｒは、プロパルギル基である。）Ｌは、芳香環である。）

Description

リンカー化合物、ダイヤモンド電極、装置、病原体又はタンパク質の検出方法、及びダイヤモンド電極の製造方法
　本発明は、リンカー化合物、ダイヤモンド電極、装置、病原体又はタンパク質の検出方法、及びダイヤモンド電極の製造方法に関する。
　従来、各種検出系においては、検出対象（目的の病原体、病原性細菌、ウイルスやそれらのタンパク質等）を高感度で検出することが望まれてきた。
　例えば、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）は世界的流行の可能性があり、迅速かつ正確なインフルエンザウイルスの検出が求められている。現在用いられているＩＦＶの高感度な検出方法としては、ＩＦＶを認識する分子として抗体を用いたイムノクロマトグラフィー等が挙げられるが、抗体を用いた方法は時間やコストがかかり得る。
　本発明者らは、抗体を用いずにＩＦＶを検出できる方法を検討し、ペプチドを提示したダイヤモンド電極を用いた、高感度な検出方法を開発した（特許文献１参照）。
国際公開第２０１６／１７５０４９号パンフレット
　しかし、より高感度な検出方法へのニーズがある。
　本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、検出対象を高感度で検出できる技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、検出対象を認識する分子を、特定の構造を有するリンカー化合物を介してダイヤモンド電極の表面に固定化したダイヤモンド電極によれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。
　［１］　以下の式（１）で表されるリンカー化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式（１）中、
　Ａは、ジアゾニオ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、又はニトロ基であり、
　Ｂ１及びＢ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立に以下の式（２）で表され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式（２）中、
　Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－であり、
　Ｘ２は、置換基を有してもよい２価の炭化水素基であり、
　Ｒは、プロパルギル基である。）
　Ｌは、芳香環である。）
　［２］　［１］に記載のリンカー化合物が表面に固定化されたダイヤモンド電極。
　［３］　前記リンカー化合物におけるプロパルギル基が、検出対象を認識する分子によって修飾された、［２］に記載のダイヤモンド電極。
　［４］　前記検出対象を認識する分子が糖鎖又はペプチドである、［３］に記載のダイヤモンド電極。
　［５］　前記検出対象を認識する分子が、インフルエンザウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、マイコプラズマ菌、ボツリヌス菌、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、病原性大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、ウェルシュ菌又はセレウス菌を認識する、［３］又は［４］に記載のダイヤモンド電極。
　［６］　前記検出対象を認識する分子が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１タンパク質若しくはＭ２タンパク質、マイコプラズマ細菌のＰ１タンパク質、膜抗原タンパク質若しくはリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、破傷風菌毒素、ジフテリア毒素、ウェルシュ菌のα毒素、コレラ菌毒素、ベロ毒素、炭疽菌毒素、大腸菌由来エンテロトキシン、ブドウ球菌由来エンテロトキシン、サルモネラ菌由来エンテロトキシン又はセレウス菌由来エンテロトキシンを認識する、［３］又は［４］に記載のダイヤモンド電極。
　［７］　［２］から［６］のいずれかに記載されたダイヤモンド電極を備えた、装置。
　［８］　［２］から［６］のいずれかに記載された電極又は［７］に記載された装置を用いた、病原体又はタンパク質の検出方法。
　［９］　ダイヤモンド電極の表面に、以下の式（１）で表されるリンカー化合物を固定化する工程を含む、ダイヤモンド電極の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式（１）中、
　Ａは、ジアゾニオ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、又はニトロ基であり、
　Ｂ１及びＢ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立に以下の式（２）で表され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式（２）中、
　Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－であり、
　Ｘ２は、置換基を有してもよい２価の炭化水素基であり、
　Ｒは、プロパルギル基である。）
　Ｌは、芳香環である。）
　本発明によれば、検出対象を高感度で検出できる技術を提供することができる。
ダイヤモンド電極へのリンカー化合物の固定化、及び糖鎖による修飾の方法の一例を示す図である。 本発明の一態様に係るリンカー化合物を用いた場合のＥＩＳ測定の結果である。 従来のリンカー化合物を用いた場合のＥＩＳ測定の結果である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
＜リンカー化合物＞
　本発明のリンカー化合物は、以下の式（１）で表される。本発明のリンカー化合物は、後述するダイヤモンド電極の表面に固定化されることで、ダイヤモンド電極を用いた検出系の感度を高めることができる。また、本発明のダイヤモンド電極において、検出対象を認識する分子は、本発明のリンカー化合物を介して固定化される（ただし、本発明のリンカー化合物を介してダイヤモンド電極の表面に固定化された検出対象を認識する分子と、ダイヤモンド電極の表面に直接固定化された検出対象を認識する分子とが併存する態様は排除されない。）。以下、検出対象を認識する分子を「認識分子」ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式（１）中、
　Ａは、ジアゾニオ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、又はニトロ基であり、
　Ｂ１及びＢ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立に以下の式（２）で表され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式（２）中、
　Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－であり、
　Ｘ２は、置換基を有してもよい２価の炭化水素基であり、
　Ｒは、プロパルギル基である。）
　Ｌは、芳香環である。）
　上記のとおり、本発明のリンカー化合物は、末端に２つのプロパルギル基を有する分岐型の構造を有する。本発明者の検討の結果、このような構造を有するリンカー化合物によれば、ダイヤモンド電極表面面積当たりのリンカー化合物の固定化量が相対的に少ない場合であっても、認識分子と検出対象との親和性を高めることができ、その結果、より高感度で検出対象を検出できることが見出された。その理由は定かではないが、以下のように推察される。すなわち、本発明のリンカー化合物は、２つのプロパルギル基を介して認識分子を提示する。そうすると、ダイヤモンド電極表面面積当たりのリンカー化合物の固定化量に関わらず、検出対象とリンカー化合物とは、少なくとも２点（２つのプロパルギル基）を介して結合する可能性が高くなる。これにより、本発明のリンカー化合物は、分岐型構造を有さないリンカー化合物と比較して、検出対象との親和性を高め得る。
　本発明のリンカー化合物と、検出対象との親和性は、例えば、本発明のリンカー化合物におけるＢ１及びＢ２の炭素鎖の長さ等を、検出対象の大きさ等に応じて適宜調整することで、制御し得る。
　式（１）中、Ａはダイヤモンド電極と反応することができる官能基である。ダイヤモンド電極の表面との反応性が良好であるという観点から、Ａはジアゾニオ基が好ましい。ジアゾニオ基は１価のカチオン性基であるので、Ａがジアゾニオ基である場合、本発明のリンカー化合物とともにカウンターアニオンが併存していてもよい。このようなカウンターアニオンとしては、ＢＦ４－が挙げられる。
　式（１）中、Ｂ１及びＢ２は、それぞれ、検出対象を認識する分子と反応することができる官能基を有し、式（２）で表される。Ｂ１及びＢ２のいずれもプロパルギル基を含むので、本発明のリンカー化合物は、末端に２つのプロパルギル基を有する分岐型の構造を有する。
　式（２）中、Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－のいずれであってもよい。
　式（２）中、Ｘ２における２価の炭化水素基は、例えば、２価の脂肪族基であってもよく、２価のアリール基であってもよい。
　式（２）中、Ｘ２における２価の炭化水素基が２価の脂肪族基である場合、２価の脂肪族基は、直鎖状、分鎖状、環状のいずれの形態であってもよく、これらの構造を組み合わせた形態であってもよい。より具体的には、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基等であってもよく、これらが互いに結合した構造であってもよい。２価の脂肪族基は、飽和脂肪族基であってもよく、不飽和脂肪族基であってもよく、不飽和結合を分子内及び／又は末端に１つ以上（例えば、１～５）有していてもよい。
　式（２）中、Ｘ２における２価の炭化水素基が２価のアリール基である場合、２価のアリール基は、例えば、フェニル基、ナフチル基、ナフトイル基、フェナレニル基、アントリル基、フェナントリル基、ビフェニル基等であってもよい。
　式（２）中、Ｘ２における２価の炭化水素基を構成する炭素原子は、ヘテロ原子で置換されていてもよく、置換されていなくてもよい。置換されてもよいヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられ、ヘテロ原子で置換される態様として、ヘテロアリール基に置換されているものであってもよい。ヘテロアリール基の具体例としては、例えば、エポキシ基、チエニル基、ベンゾチエニル基、フリル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピロリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、インドリル基、イソインドール基、キノリル基、キノキサリル基、イソキノリル基、イソキサゾリル基、テトラゾリル基、フタラジル基、イミダゾピリジル基、ナフチリジル基、キナゾリル基、アクリジニル基等が挙げられる。
　式（２）中、Ｘ２における２価の炭化水素基の炭素数は、例えば、１～５０での範囲内であってもよく、１～３０であることが好ましく、１～２０であることがより好ましく、１～１０であることがさらに好ましい。Ｘ２における２価の炭化水素基は、特に、直鎖状の炭素鎖を含むことが好ましく、直鎖状の炭素鎖の炭素数が、１～５０であることが好ましく、１～３０であることがより好ましく、１～２０であることがさらに好ましく、１～１０であることがさらにより好ましい。
　式（２）中、Ｒはプロパルギル基である。本発明のリンカー化合物は、このプロパルギル基を介して、認識分子と結合する。
　式（１）中、Ｌは芳香環であり、例えば、置換されてもよい芳香族性の炭素環や複素環であってもよい。具体的には、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環等が挙げられる。芳香環はアルキル基、アリール基、ハロゲン基、水酸基等によって置換されていてもよい。Ｌが芳香環であることで、リンカー化合物における官能基Ａ（ジアゾニオ基等）と、ダイヤモンド電極表面との反応が進行し、本発明のリンカー化合物をダイヤモンド電極表面に固定化できる。
　本発明のリンカー化合物の一例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（認識分子）
　本発明のリンカー化合物は、官能基Ｒ（プロパルギル基）が認識分子によって修飾され得る。認識分子によって修飾された本発明のリンカー化合物を用いることで、該認識分子に対応した検出対象を特異的に検出することができる。なお、本発明において「検出対象を認識する分子」及び「認識分子」とは、検出対象と相互作用、結合、又は会合する分子を意味する。
　認識分子は、以下のような構造を有していることが好ましい。
　Ｃ－ｒｅｃ
（式中、ｒｅｃは検出対象を認識する部分、Ｃはプロパルギル基と反応することのできる官能基を意味する。）
　上記認識分子において、Ｃは、アジド基等が好ましい。
　認識分子は、検出対象と相互作用したときに、ダイヤモンド電極に電流が流れるものであれば、どのようなものでもよい。例えば、認識分子は糖鎖、又はペプチドであってもよい。なお、本発明において、「ペプチド」には、抗体又はその抗原結合性ドメインが包含され得る。
　認識分子が糖鎖である場合、検出対象を認識できる糖鎖であれば、単糖、オリゴ糖、多糖のいずれであってもよい。検出対象がインフルエンザウイルスである場合には、認識分子は、シアル酸や硫酸基を含む糖を有する糖鎖（単糖、オリゴ糖又は多糖）が好ましい。
　糖鎖は、天然物からの抽出、有機合成、酵素合成、微生物による合成、細胞を用いた合成等によって作製できる。また、認識分子を構成する糖鎖の種類としては、１種類でもよく、複数種類の混合物であってもよい。
　認識分子がペプチドである場合、検出対象を認識できるペプチドであればペプチドの長さに特に限定されない。ペプチドは、標的を認識するタンパク質（抗体等）の全長配列又は部分配列、ペプチドライブラリーから探索された配列等であってもよい。例えば、ペプチドライブラリーから探索された配列として、ファージディスプレイ法により探索されたインフルエンザを認識するペプチド等が挙げられる。このようなペプチドは、特許第５０９３１００号、特願２０１５－０９３１３２に記載された方法に準じて作製できる。
　認識分子が認識する検出対象としては、病原体又はタンパク質が挙げられる。具体的には、以下のものが挙げられる；インフルエンザウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、マイコプラズマ菌、ボツリヌス菌、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、病原性大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、ウェルシュ菌又はセレウス菌。
　上記の検出対象としては、より具体的には、以下のものも挙げられる；インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１タンパク質若しくはＭ２タンパク質、マイコプラズマ細菌のＰ１タンパク質、膜抗原タンパク質若しくはリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、破傷風菌毒素、ジフテリア毒素、ウェルシュ菌のα毒素、コレラ菌毒素、ベロ毒素、炭疽菌毒素、大腸菌由来エンテロトキシン、ブドウ球菌由来エンテロトキシン、サルモネラ菌由来エンテロトキシン又はセレウス菌由来エンテロトキシン。
　認識分子が認識する検出対象としては、上記のうちＨＡが特に好ましい。ＨＡは、インフルエンザウイルスの表面に提示されており、かつ、宿主細胞への感染に寄与しており、インフルエンザワクチンの主要な成分として利用されているタンパク質である。そのため、ＨＡは比較的検出されやすく、インフルエンザウイルスの特異的な指標となり得る。
　本発明のリンカー化合物を認識分子によって修飾する方法としては、任意の連結反応を採用できる。具体的には、ヒュスゲン環化付加反応（クリック反応とも呼ばれる。）、グレーサー反応、薗頭カップリング、鈴木・宮浦カップリング反応等を用いることができ、共有結合を形成するものが好ましいがこれに限らない。
　認識分子による本発明のリンカー化合物の修飾は、任意のタイミングで行うことができる。例えば、本発明のリンカー化合物を、後述するダイヤモンド電極に固定化する前又は固定化した後のいずれのタイミングで修飾してもよい。ただし、作業性の観点から、ダイヤモンド電極に固定化した後に修飾することが好ましい。
　認識分子によって修飾されたリンカー化合物が固定化されたダイヤモンド電極においては、電極に電位が印加された状態で認識分子が検出対象を認識すると、電気化学反応により電流が流れる。この電流を測定することにより、検出対象を検出することができる。なお、本発明において「検出」とは、定性的検出及び定量的検出を包含し、検出対象を特異的に見出すことができることを意味する。
＜ダイヤモンド電極＞
　本発明のダイヤモンド電極は、ダイヤモンド電極の表面に、本発明のリンカー化合物を固定化することで得られる。本発明のダイヤモンド電極は作用電極に相当する。
　本発明のダイヤモンド電極は、以下の構造を有する。
Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ－Ｌｉｎ
（式中、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅはダイヤモンド電極、Ｌｉｎは本発明のリンカー化合物を意味する。）
　また、リンカー化合物が認識分子によって修飾されていれば、本発明のダイヤモンド電極は、以下の構造を有する。
Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ－Ｌｉｎ－ＲＥＣ
（式中、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅはダイヤモンド電極、Ｌｉｎは本発明のリンカー化合物、ＲＥＣは認識分子を意味する。）
　本発明のリンカー化合物を固定化させるダイヤモンド電極の構成（材料、形状、大きさ等）は特に限定されない。例えば、特開２００６－９８２８１号公報、特開２０１１－１５２３２４号公報又は特開２０１５－１７２４０１号公報等の記載に基づき作製されたダイヤモンド電極であってもよい。例えば、ダイヤモンド電極は以下の構成を備えていてもよい。
　ダイヤモンド電極は、通常、基板、該基板上のダイヤモンド層を少なくとも有する。該ダイヤモンド層において、基板とは逆側の表面に本発明のリンカー化合物が固定化される。基板上のダイヤモンド層は微量の不純物がドープされた導電性ダイヤモンドであってもよい。不純物としては、ホウ素（Ｂ）、硫黄（Ｓ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、ケイ素（Ｓｉ）等が挙げられる。本発明の効果が奏されやすいという観点から、本発明のダイヤモンド電極はホウ素ドープダイヤモンド電極であることが好ましい。
　基板の大きさは特に限定されないが、ｍＬ単位若しくはμＬ単位の試料溶液を測定できる面積を有するものが好ましい。基板は例えば直径１～１０ｃｍ、厚み０．１ｍｍ～５ｍｍのものとすることができる。基板はＳｉ基板、ＳｉＯ２等のガラス基板や石英基板、Ａｌ２Ｏ３等のセラミックス基板、タングステン、モリブデン等の金属であってもよい。基板の表面の全部又は一部をダイヤモンド層とすることができる。ダイヤモンド層の全部又は一部を電気化学的測定に用いることができる。
　基板へのダイヤモンド層の蒸着は、通常のマイクロ波プラズマ化学気相成長法（ＭＰＣＶＤ）等によって実施できる。
　本発明のリンカー化合物をダイヤモンド電極表面に固定化する方法としては、本発明のリンカー化合物における官能基Ｌ（芳香環）と、ダイヤモンド電極表面とを反応させることができる任意の方法を採用できる。このような方法としては、電解グラフトが挙げられる。なお、本発明において、「固定化」とは、本発明のリンカー化合物とダイヤモンド電極表面とが、共有結合によって連結されていることを意味する。
　本発明のリンカー化合物の固定化量は、検出対象の種類や、実現しようとする検出感度等に応じて適宜設定できるが、例えば、ダイヤモンド電極表面面積当たり、０．１～８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２となる量で固定化させてもよい。本発明のリンカー化合物は、上述のとおり分岐型の構造を有するので、相対的に低い固定化量であっても、検出対象との親和性を十分に高め得る。
＜装置＞
　本発明の装置は、少なくとも本発明のダイヤモンド電極を備える。本発明のダイヤモンド電極は作用電極として機能する。本発明の装置は任意の構成を採用でき、例えば、参照電極（基準電極）、対電極、電圧印加部、電流測定部及び任意の記録手段を有していてもよい。
　本発明の装置は三極電極（作用電極、対電極及び参照電極）を備えていることが好ましい。ある実施形態において本発明の装置は、さらにポテンシオスタット及びこれに接続された交流発信機並びにロックインアンプを有する。この装置は電気化学インピーダンス測定（交流インピーダンス測定）を行うことができる。
　本発明の装置が三極電極を備えている場合、参照電極側の抵抗は高く設定されており、作用電極と参照電極との間では電流は流れない。対電極は特に限定されないが、例えば銀線や白金線を使用できる。参照電極は特に限定されないが、安定性や再現性等の観点から銀－塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）が好ましい。作用電極、対電極及び参照電極のセンサーにおける大きさ及び位置関係は、適宜設計することができるが、作用電極、対電極及び参照電極はいずれも測定試料と同時に接触可能であるように設計、配置される。
＜検出方法＞
　本発明のダイヤモンド電極、又は該電極を備える装置によって、検出対象を検出することができる。「検出対象」とは、認識分子が特異的に認識する対象であり、具体的には、認識分子が認識する検出対象として上述したもの（病原体又はタンパク質等）が挙げられる。
　本発明のダイヤモンド電極を、検出対象を含む試料と接触させると、本発明のリンカー化合物を修飾する認識分子が、検出対象を認識する。このとき、電極に電位が印加されていると電流が生じる。該電流を測定することにより試料中の検出対象を検出することができる。電流は、電気化学インピーダンス測定法、サイクリックボルタンメトリーによって測定することができる。
　電気化学インピーダンス測定にはポテンシオスタットに交流発信機を接続したものを使用する。ポテンシオスタットを使用して電極に直流の一定電位を印加し、交流発信機を使用して±５～１０ｍＶの交流電位を重ねあわせて印加する。また、発信機からポテンシオスタットへ入力した交流と同じ位相の交流波をロックインアンプにも入力する。これにより流れる電流は直流電流と交流電流が合わさったものとなり、ロックインアンプは電流の交流成分と発信機からの交流とを比較してインピーダンスと両者の位相差が出力される。発信機からの交流周波数を少しずつ変化させ、それぞれの周波数で得られるインピーダンスと位相差とに基づき複素数平面プロット等を行う。この場合、既知の濃度又は量の検出対象について、ナイキストプロットにより電極のインピーダンス（電荷移動抵抗Ｒｃｔ）を決定して、濃度又は量とＲｃｔとの関係をプロットした検量線を作成しておき、測定試料についてのＲｃｔ値から、当該試料中に含まれる検出対象の濃度又は量を算出することができる。
　サイクリックボルタンメトリーは、電位を変動（掃引）させる手法を用いて行う。具体的には、電極電位を初期電位（Ｅｉ）から掃引速度（ｖ）で反転電位（Ｅλ）まで掃引した後逆転し、Ｅｉまで戻したときに得られる電流を観測する。初期電位Ｅｉを電極反応の起こらない電位に、また反転電位Ｅλを電極反応が拡散律速となるような電位に設定することで、電流電位グラフ（サイクリックボルタモグラム）を得ることができる。初期電位、掃引速度、反転電位等は適宜設定することができる。この場合、既知の濃度又は量の検出対象について、ピーク電流値を決定しておき、濃度又は量とピークの電流密度との関係をプロットした検量線を作成しておき、測定試料についてのピーク電流値から、当該試料中に含まれる検出対象の濃度又は量を算出することができる。
　本発明のダイヤモンド電極、又は該電極を用いて検出を行う対象である試料の態様は特に限定されない。試料としては、任意の溶液（例えば生物学的試料、飲料水、及びウイルス等の病原体又は毒素に汚染されている可能性のある溶液）が挙げられる。生物学的試料としては、例えば唾液、痰、涙液、体液、血液、細胞破砕液等が挙げられる。試料の由来は特に限定されないが動物、哺乳動物、マウス、ラット、ヒト、鶏卵、細胞等が挙げられる。試料の量は特に限定されず、１μＬ～１０ｍＬであってもよい。試料は濃縮してもよく、そのまま測定に供してもよい。
　検出の際に用いる溶媒は、作業性の観点から、水系が好ましい。電流の測定を行う溶液には通常、支持電解質が含まれる。支持電解質はイオン性物質であり、特に限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。これらのうち、ＰＢＳが好ましい。
　以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜略号の意味＞
　本明細書において、以下の略語を用いることがある。
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＨＢＦ４：テトラフルオロホウ酸水溶液
ＭｅＯＨ：メタノール
ＴＢＡ・ＰＦ６：テトラブチルアンモニウムヘキサフルオロホスファート
ＴＢＴＡ：トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン
＜実施例：本発明のリンカー化合物を用いた検討＞
　以下の方法に基づき、リンカー化合物を合成し、次いで、該リンカー化合物をダイヤモンド電極表面に固定した。さらに、リンカー化合物のプロパルギル基を糖鎖で修飾した。
（１）リンカー化合物の合成
　以下のスキームに従い、本発明のリンカー化合物の一態様である「Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －」を合成した。
（１－１）ＩＰＡ－ＮＨＢｏｃの合成
　５－アミノイソフタル酸水和物（スキーム１中の「１」、ＩＰＡ－ＮＨ２；０．９０６ｇ，５．００ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨ；０．４００ｇ，１０ｍｍｏｌ／１０ｍＬ）に溶解させ、氷浴にて０℃に冷却した。この溶液に、あらかじめ氷浴にて０℃に冷却した二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（スキーム１中の「２」、（Ｂｏｃ）２Ｏ）の１，４－ジオキサン溶液（約３０％；１０ｍＬ）を、温度が０℃を維持するように徐々に滴下し、一晩撹拌した。さらに、希塩酸を加えｐＨを５程度とした際の析出物をろ過し、真空下６０℃にて一晩乾燥させ、白色の粉末（スキーム１中の「３」、ＩＰＡ－ＮＨＢｏｃ；収量１．１３１ｇ；収率８０％）を得た。以下にＮＭＲスペクトルの分析結果と反応スキームを示す。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）δ　９．７９（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｄ，２Ｈ），８．０８（ｔ，１Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（１－２）Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－ＮＨＢｏｃの合成
　ＩＰＡ－ＮＨＢｏｃ（スキーム２中の「３」；２．３１４ｇ、８．２３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；４０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（スキーム２中の「４」、ＤＭＴ－ＭＭ；５．０００ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した後、プロパルギルアミン（スキーム２中の「５」；０．９９５ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一晩撹拌した。得られた反応液に酢酸エチルを加え、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順番で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。無水硫酸ナトリウムをろ別した後、溶液を濃縮した。濃縮後の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：ヘキサン－酢酸エチル＝１：１（体積比））によって精製し、白色の粉末（スキーム２中の「６」、Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－ＮＨＢｏｃ；収量２．１７８ｇ；収率７４％）を得た。以下にＮＭＲスペクトルの分析結果と反応スキームを示す。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ　８．０１（ｍ，２Ｈ），７．８６（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｍ，４Ｈ），２．６２（ｍ，２Ｈ），１．５４（ｓ，９Ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（１－３）Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－ＮＨ２の合成
　Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－ＮＨＢｏｃ（スキーム３中の「６」；１．０６６ｇ、３．００ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２；３０ｍＬ）に懸濁させた。この懸濁液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、化学式ＣＦ３ＣＯＯＨ；３．４２１ｇ，３０．０ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し、室温にて４時間撹拌した。次いで、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和した後、ＣＨ２Ｃｌ２を加え、水、飽和食塩水の順番で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。無水硫酸ナトリウムをろ別した後、溶液を濃縮した。濃縮後の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：ヘキサン－酢酸エチル＝２：３（体積比））によって精製し、薄黄色の粉末（スキーム３中の「７」、Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－ＮＨ２；収量０．６２８ｇ；収率８２％）を得た。以下にＮＭＲスペクトルの分析結果と反応スキームを示す。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）δ　８．７４（ｔ，２Ｈ），７．３８（ｔ，１Ｈ），７．１４（ｄ，２Ｈ），５．４９（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｄｄ，４Ｈ），３．１２（ｔ，２Ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（１－４）Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －（本発明のリンカー化合物）の合成
　Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－ＮＨ２（スキーム４中の「７」；３．０６３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）をテトラフルオロホウ酸水溶液（ＨＢＦ４；２５％、２１．６ｍＬ）に溶解させ、食塩を混合させた氷浴にて－５℃に冷却した。この溶液に、あらかじめ食塩を混合させた氷浴にて－５℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液（ＮａＮＯ２；１．２４２ｇ、１８．０ｍｍｏｌ／２．４ｍＬ）を温度が－５℃を維持するように徐々に滴下し、１．５時間撹拌した。得られた析出物をろ過し、冷水、冷メタノールの順番で洗浄した後、真空乾燥させ、ベージュ色の粉末（スキーム４中の「８」、Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －；収量４．０８８ｇ；収率９６％）を得た。以下にＮＭＲスペクトルの分析結果と反応スキームを示す。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）δ　９．５２（ｔ，２Ｈ），９．２４（ｄ，２Ｈ），９．０１（ｔ，Ｈ），４．１６（ｄｄ，４Ｈ），３．２８（ｔ，２Ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　本発明のリンカー化合物は、Ａｍｉｄｅ－ＩＰＡ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －（スキーム４中の「８」）のように、２つのプロパルギル基（ＨＣ≡Ｃ－ＣＨ２－）を有する分岐型化合物である。また、本例で作製した本発明のリンカーは、ダイヤモンド電極と反応することのできる官能基Ａとしてジアゾニオ基（－Ｎ＋≡Ｎ）を有する。
（２）糖鎖の合成と構造解析
　以下の方法に従い、本発明のリンカー化合物を修飾する糖鎖を合成した。
（２－１）細胞の準備
　ＭＤＣＫ細胞（コッカー・スパニエル雄犬腎臓上皮細胞由来細胞）を、１０ｃｍディッシュ当たりの細胞数が２．０×１０６個になるように、各１０ｃｍディッシュに播種した。これを１８時間、３７℃でインキュベートして細胞をディッシュ底に接着させた。
（２－２）糖鎖プライマーの作製
　Ｍ．Ｃ．Ｚ．Ｋａｓｕｙａらの方法（Ａｚｉｄｏ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ：　ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｂｉｏｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ　ａｎａｌｏｇｕｅｓ，　Ｍ．　Ｃ．　Ｚ．　Ｋａｓｕｙａ，　Ｌ．　Ｘ．　Ｗａｎｇ，　Ｙ．　Ｃ．　Ｌｅｅ，　Ｍ．　Ｍｉｔｓｕｋｉ，　Ｈ．　Ｎａｋａｊｉｍａ，　Ｙ．　Ｍｉｕｒａ，　Ｔ．　Ｓａｔｏ，　Ｋ．　Ｈａｔａｎａｋａ，　Ｓ．　Ｙａｍａｇａｔａ，　Ｔ．　Ｙａｍａｇａｔａ，　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．，　３２９，　７５５－７６３　（２０００））の方法に準じ、糖鎖プライマー（Ｌａｃ－Ｃ１２Ｎ３）を作製した。該糖鎖プライマーの構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（２－３）糖鎖の合成
　糖鎖プライマーをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｗａｋｏ社製）に溶解して５０ｍＭになるように調製し、０．２２μＬメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通してからバイアルに入れて－３０℃にて保存した。５０ｍＭ糖鎖プライマー溶液を、１％　Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｔｒａｎｓｅｒｒｉｎ－Ｓｅｌｅｎｉｕｍ－Ａ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２で希釈し、５０μＭ　Ｌａｃ－Ｃ１２Ｎ３プライマー含有培地を作製した。これを、ＭＤＣＫ細胞のディッシュ１２枚にそれぞれ５ｍＬずつ加え、４８時間、３７℃でインキュベートした。
　培地を遠沈管に回収し、各ディッシュにＰＢＳ（－）を３ｍＬずつ加えて、セルスクレイパーで細胞を剥がした。ＰＢＳ（－）をさらに１ｍＬ加えて同様に細胞を剥がした後、遠沈管に移し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。回収した上清を培地画分とし、残りの沈殿物を細胞画分とした。
　続いてＳｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８カラム（型番「ＷＡＴ０２３６３５」、Ｗａｔｅｒｓ社製）による培地画分の精製を行った。ＭｅＯＨでカラムを洗浄した後、ＭｅＯＨ、ＭｉｌｌｉＱ水を１０ｍＬずつ流し、活性化及び平衡化を行った後、培地画分を２回流した。その後、ＭｉｌｌｉＱ水２０ｍＬで洗浄し、ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ＝２／３（ｖ／ｖ）溶液を５ｍＬ流し、色素成分を除去した。続いてＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ＝３／２（ｖ／ｖ）溶液、ＭｅＯＨを５ｍＬずつ流し、それぞれを酸性糖鎖、中性糖鎖として回収した。
（２－４）ＬＣ－ＭＳによる配列解析
　酸性糖鎖画分、中性糖鎖画分をＭｅＯＨに溶解させ、Ｍｉｎｉｓａｒｔ　ＲＣ４フィルター（０．２μｍ）を取り付けた１．５ｍＬチューブに入れ、遠心してから氷上で回収した。回収した酸性糖鎖画分と中性糖鎖画分について、ＬＣ－ＭＳ測定を行った。
　ＬＣ－ＭＳとしては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　Ｓｅｒｅｉｓ　ＬＣ　ｓｙｓｔｅｍ）と、エレクトロスプレーイオン化法／イオントラップ質量分析装置（ＥＳＩ－ＩＴ－ＭＳ、ａｍａＺｏｎ　ＳＬ、Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いた。Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８カラムによって、以下の条件で分離した糖脂質の酸性成分と中性成分を、順相カラム（Ｉｍｔａｋｔ　ＵＫ－Ｓｉｌｉｃａ、１５０ｍｍ×２ｍｍ）をつないだＨＰＬＣによって分離した。
［分離条件］
移動相Ａ：クロロホルム／メタノール／５０ｍＭ　酢酸－トリエチルアミン（ｐＨ＝４．２）＝８３／１６／１（ｖ／ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：メタノール／５０ｍＭ　酢酸－トリエチルアミン（ｐＨ＝４．２）＝３／１（ｖ／ｖ）
カラム：Ｉｍｔａｋｔ　ＵＫ－Ｓｉｌｉｃａ（１５０ｍｍ×２ｍｍ）
流速：０．１ｍＬ／ｍｉｎ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：５μＬ
ＥＳＩ－ＭＳ：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ｍｏｄｅ
Ｄｒｙ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２２０℃
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ：１４．５０ｐｓｉ
Ｄｒｙ　Ｇａｓ：５．００ｌ／ｍｉｎ
ｓｃａｎ　ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ＝５００～１５００
ｔａｒｇｅｔ　ｍａｓｓ：ｍ／ｚ＝１０００
　ＬＣ－ＭＳ解析によって、６種類の構造が検出され、ＩＦＶが結合することが知られている硫酸化糖鎖及びシアル酸含有糖鎖の存在が確認できた。得られた酸性糖鎖を以下の試験に糖鎖として用いた。
（３）ダイヤモンド電極の作製
　ＷＯ２０１６／１７５０４９に記載された方法に準じ、ダイヤモンド電極を作製した。具体的には、マイクロ波プラズマを用いた化学蒸着によりＳｉ基板へダイヤモンド膜を合成した。炭素源としてメタンを使用し、ホウ素源としてトリメチルボランを使用した。ドープするトリメチルボランの原料に占める濃度は０．３％ｗ／ｗだった。表面形態は走査型電子顕微鏡を用いて特徴付けした。薄膜の品質はラマン分光法により確認した。このようにして作製したホウ素ドープダイヤモンド（ＢＤＤ）電極を用いた。
（３－１）Ｓｉ基板の前処理
　ダイヤモンド粉末が入ったシャーレにＳｉ基板（直径５．０８ｃｍ、厚み０．７５ｍｍ）の鏡面が下向きになるように配置し、２０分間Ｓｉ基板を手で回転させて基板表面に傷をつけた。その後、Ｓｉ基板を２－プロパノールの入ったビーカーに浸し、２０分間超音波照射し洗浄した。最後にＮ２ガスで溶媒を揮発させ乾燥させた。
（３－２）Ｓｉ基板上へのダイヤモンド膜の合成
　マイクロ波プラズマを用いた化学的蒸着（ＣＶＤ法、化学気相合成法）によるＳｉ基板へのダイヤモンド膜の合成は、Ｐｌａｓｍａ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＸ６５００、セキテクノトロン株式会社）を用いて行った。原料気体にはメタン、トリメチルボラン、水素、酸素の４種類を用いた。ホウ素の仕込み濃度が０．３％ｗ／ｗとなるように設定し、５時間反応させた。合成条件を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（３－３）電極、溶液の準備
　ＴＢＡ・ＰＦ６を３．８７ｇ（０．０１ｍｏｌ）量りとり、アセトニトリル（ＡＮ）を加えて１００ｍＭテトラブチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸（ＴＢＡＰＦ６）溶液を作製した。下記に示すようにセルを組んだ。ＣＶ測定には三電極法（作用電極：ダイヤモンド電極、対電極：Ｐｔ、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（４）ダイヤモンド電極へのリンカー化合物の固定化、及び糖鎖による修飾
　リンカー化合物を、ジアゾニオ基を介して、電解グラフトによってダイヤモンド電極の表面に固定化させた。次いで、クリック反応により、糖鎖によってリンカー化合物を修飾した。その概要を図１に示した。
（４－１）電解グラフト
　サンプル瓶に、リンカー化合物を１７．７ｍｇ（Ｍｗ＝３５４．０９、０．０５ｍｍｏｌ）秤量し、事前に調製したＴＢＡ・ＰＦ６　５ｍＬ（１００ｍＭ）に溶解させ、１０ｍＭのリンカー溶液を作製した。この溶液の全量をセルに加えて、－０．７～＋０．６Ｖで５回ＣＶ測定（電解グラフト）を行った。
　なお、電解グラフトの条件は下記のとおりである。
対電極：Ｐｔ
参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ
走査速度：５０ｍＶ／ｓ
電解液：１００ｍＭ　ＴＢＡ・ＰＦ６
（４－２）クリック反応
　クリック反応に用いる反応溶液の組成を表３に示した。なお、表３中、「ａｃｉｄｉｃ　ｇｌｙｃａｎ」は、上記（２－３）で得られた糖鎖（酸性糖鎖）を意味する。
　反応溶液は、以下の方法で作製した。まず、酸性糖鎖１７．２ｎｍｏｌが含まれる遠沈管にＭｅＯＨを２５０μｌ加えてピペッティングした。この操作を計２本の酸性糖含有遠沈管に対して行ったのち、１つにまとめた。次いで、この遠沈管に調製済みのＴＢＴＡ、ＣｕＳＯ４、Ｌ－アスコルビン酸Ｎａを、それぞれ５００μＬずつ加えて計２ｍＬの溶液を作製し、ボルテックスを行い撹拌した。撹拌後、電解グラフト後の２つのセルに１ｍＬずつ溶液を加え、セルにパラフィルムをかぶせて１．５時間振とうし、反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（５）ヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）の検出
　以下の方法に従い、糖鎖によって修飾されたリンカー化合物が固定化されたダイヤモンド電極を用い、電気化学インピーダンス測定（ＥＩＳ測定）によってヘマグルチニンタンパク質を検出した。
（５－１）酸化還元物質溶液の調製
　Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（型番「１６９－０３７２１」、Ｗａｋｏ社製）、Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］（型番「１６１－０３７４２」、Ｗａｋｏ社製）を、それぞれ０．１６４ｇ、０．２１１ｇずつ量りとり、別々の５０ｍＬメスフラスコに加えた。それぞれをＰＢＳ　５０ｍＬに溶解させ、１０ｍＭ　Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］／ＰＢＳ、及び、１０ｍＭ　Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］／ＰＢＳを調製した。これらを１：１（ｖ／ｖ）で混合し、１００ｍＬの５ｍＭ　［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－／４－／ＰＢＳを調製した。
（５－２）ヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）溶液の調製
　ＨＡとして、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ　Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）のウイルス脂質膜を分解して取り出したもの（三量体、約２１０ｋＤａ）を用いた。ＨＡ濃度９５４μｇ／ｍＬ（＝４．５４μＭ）の溶液を原液として、０、５、５０、１２５、２５０、３７５、５００ｎＭ（それぞれ、おおよそ、０、１、１０、２５、５０、７５、１００μｇ／ｍＬ）のＨＡ段階希釈溶液を氷上で調製した。溶媒にはＰＢＳ（－）を使用した。またＨＡと同濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を調製し、ネガティブコントロールとした。
（５－３）電気化学インピーダンス測定（ＥＩＳ測定）
　制御ＰＣのパラメーターを表４のように設定し、ＷＯ２０１６／１７５０４９に記載された方法に準じ、各濃度のＨＡ溶液を糖鎖固定化電極と相互作用させた。
　具体的には、まず、ダイヤモンド電極を用いてセル（Ｏリング：φ＝２．８　ｍｍ）を組み立てた。まず、ＰＢＳを５分相互作用させた。次いで、５ｍＭ［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－／４－／ＰＢＳを２ｍＬセルに加え、バックグラウンドを３サイクル測定した。その後、ＰＢＳ　３ｍＬをセルの中央付近に当てながら、３回洗い流した。続いて、ＰＢＳで希釈したＨＡ溶液をセル内に５０μＬ加えて３０分間、相互作用させた。３０分後、完全に溶液を取り除き、ＰＢＳで３回洗い流し、非特異吸着を除去した。完全にＰＢＳ溶液を取り除いた後、５ｍＭ　［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－／４－／ＰＢＳをセルに２ｍＬ加えて３サイクル測定した。この操作をＨＡ溶液（０～５００ｎＭ）及びＢＳＡ溶液（０～５００ｎＭ）を用いて、それぞれについて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（６）結果及び考察
　ＥＩＳ測定の結果を図２に示す。ＨＡについては、ＨＡの濃度依存的にＲｃｔ値が増加した。Ｒｃｔ値は抵抗値を表し、この値がＨＡの濃度依存的に増加したことは、ＨＡの濃度に応じた検出ができたことを意味する。
　他方、ＢＳＡ（対照）については、ＢＳＡの濃度とＲｃｔ値に相関が認められなかった。
　以上のことから、本発明のリンカー化合物を用いて糖鎖を提示したダイヤモンド電極により、ＨＡを高感度かつ特異的に検出できることがわかった。
＜参考例：従来のリンカー化合物を用いた検討＞
　参考として、本発明のリンカー化合物の代わりに、従来のリンカー化合物を用いて、上記実施例と同様の試験を行った。従来のリンカー化合物としては、「ＴＩＰＳ－Ｅｔｈ－Ａｒ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －」（ＷＯ２０１６／１７５０４９を参照。）を用いた。このリンカー化合物は分岐構造を有さない化合物である。「ＴＩＰＳ－Ｅｔｈ－Ａｒ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －」の構造を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ＷＯ２０１６／１７５０４９に記載された方法に準じ、電解グラフトによって「ＴＩＰＳ－Ｅｔｈ－Ａｒ－Ｎ２ ＋ＢＦ４ －」をダイヤモンド電極に固定化し、次いで脱保護してアルキニル基を提示させた。続いて、上記と同様にして、糖鎖の修飾、及び、ＥＩＳ測定によるＨＡの検出を行った。ＥＩＳ測定の結果を図３に示す。
　図３に示されるとおり、ＨＡについては、ＨＡの濃度依存的にＲｃｔ値がやや増加した。他方、ＢＳＡ（対照）については、ＢＳＡの濃度とＲｃｔ値に相関が認められなかった。したがって、従来のリンカー化合物を用いて糖鎖を提示したダイヤモンド電極により、ＨＡを特異的に検出できることがわかった。
　しかし、図２と図３との比較から理解されるとおり、本発明のリンカー化合物を用いた場合（図２）と比較すると、従来のリンカー化合物においては、Ｒｃｔ値変化率（ΔＲｃｔ／Ｒｃｔ）が低かった。Ｒｃｔ値変化率が高いほど、より高い感度で検出できていることを意味する。
　以上のことから、本発明のリンカー化合物によれば、従来のリンカー化合物よりも高感度な検出を実現できることがわかった。

Claims (9)

  1. 　以下の式（１）で表されるリンカー化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）中、
    　Ａは、ジアゾニオ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、又はニトロ基であり、
    　Ｂ１及びＢ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立に以下の式（２）で表され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（２）中、
    　Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－であり、
    　Ｘ２は、置換基を有してもよい２価の炭化水素基であり、
    　Ｒは、プロパルギル基である。）
    　Ｌは、芳香環である。）
  2. 　請求項１に記載のリンカー化合物が表面に固定化されたダイヤモンド電極。
  3. 　前記リンカー化合物におけるプロパルギル基が、検出対象を認識する分子によって修飾された、請求項２に記載のダイヤモンド電極。
  4. 　前記検出対象を認識する分子が糖鎖又はペプチドである、請求項３に記載のダイヤモンド電極。
  5. 　前記検出対象を認識する分子が、インフルエンザウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、マイコプラズマ菌、ボツリヌス菌、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、病原性大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、ウェルシュ菌又はセレウス菌を認識する、請求項３又は４に記載のダイヤモンド電極。
  6. 　前記検出対象を認識する分子が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１タンパク質若しくはＭ２タンパク質、マイコプラズマ細菌のＰ１タンパク質、膜抗原タンパク質若しくはリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、破傷風菌毒素、ジフテリア毒素、ウェルシュ菌のα毒素、コレラ菌毒素、ベロ毒素、炭疽菌毒素、大腸菌由来エンテロトキシン、ブドウ球菌由来エンテロトキシン、サルモネラ菌由来エンテロトキシン又はセレウス菌由来エンテロトキシンを認識する、請求項３又は４に記載のダイヤモンド電極。
  7. 　請求項２から６のいずれかに記載されたダイヤモンド電極を備えた、装置。
  8. 　請求項２から６のいずれかに記載された電極又は請求項７に記載された装置を用いた、病原体又はタンパク質の検出方法。
  9. 　ダイヤモンド電極の表面に、以下の式（１）で表されるリンカー化合物を固定化する工程を含む、ダイヤモンド電極の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（１）中、
    　Ａは、ジアゾニオ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、又はニトロ基であり、
    　Ｂ１及びＢ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ独立に以下の式（２）で表され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（２）中、
    　Ｘ１は、－ＮＨＣＯ－又は－ＣＨ２－であり、
    　Ｘ２は、置換基を有してもよい２価の炭化水素基であり、
    　Ｒは、プロパルギル基である。）
    　Ｌは、芳香環である。）
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