WO2019132619A1 - 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법 - Google Patents

고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2019132619A1
WO2019132619A1 PCT/KR2018/016924 KR2018016924W WO2019132619A1 WO 2019132619 A1 WO2019132619 A1 WO 2019132619A1 KR 2018016924 W KR2018016924 W KR 2018016924W WO 2019132619 A1 WO2019132619 A1 WO 2019132619A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nanoparticles
group
agnps
edc
nhs
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/016924
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
우흥명
압델마우굿 살레 타렉모하메드
유리나
곽호현
아흐메드 모하메드 엡테할압델카릭
Original Assignee
강원대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강원대학교산학협력단 filed Critical 강원대학교산학협력단
Publication of WO2019132619A1 publication Critical patent/WO2019132619A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G5/00—Compounds of silver
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/10—Mineral substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the biocompatibility of degenerated tissue using immobilized nanoparticles.
  • Orthotopic liver transplantation is the only standard treatment for patients with end-stage liver disease. There are serious problems with these procedures, such as the need for donor liver, the lack of liver donors, as well as post-transplant rejection.
  • One potential way to complement the chronic shortage of donor agencies is to develop between bioartificial liver and secondary livers.
  • the liver is very complex in structure and has various functions within the body, including the production of biochemicals necessary for detoxification, protein synthesis and degradation. Therefore, it is difficult to manufacture a scaffold that is the same as the liver in terms of components, structure and function. It also has good biocompatibility, suitable porosity, and should be similar in composition, morphology and structure to the living body.
  • the functional biomechanical liver fabrication for tissue engineering, organ transplantation and drug screening can be constructed using a de-saturation process.
  • the intracellular components are completely removed from the liver tissue using a detergent, the structural and functional characteristics of the intact liver-specific ECM and vascular network are well preserved.
  • the application potential of de-saturated matrix in tissue engineering has been identified for a number of tissues including bladder, artery, esophagus, skin and organs. Degeneration of tissues or organs has been studied as a promising approach to producing functional scaffolds for cell culture and transplantation.
  • Developing artificial liver for regenerative medicine and tissue engineering requires biologically compatible scaffolds that preserve all extracellular matrix proteins and mimic natural liver structures as a basic and complementary key element.
  • a number of synthetic or naturally derived substrates have been used in liver tissue engineering.
  • most synthetic substrates were biocompatible.
  • the de-saturated scaffold is the most suitable and reliable source of retention of extracellular matrix, proteins and blood vessels.
  • the pig liver can be degraded immediately after harvest and calcified after transplantation, so cross-linking is used to maintain important components before re-vaccination of the cytoplasm It is very important to reduce the decomposition rate and increase the tensile strength.
  • noble metal nanoparticles such as silver nanoparticles (AgNPs) are increasingly used due to their unique characteristics.
  • Citrate-AgNP has the ability to bind collagen fibers in a very regular manner through different non-covalent bonding mechanisms.
  • most crosslinking agents provide only two point connections between collagen molecules, while citrate-AgNP has the advantage of providing multiple attachment sites.
  • AgNP has the ability to increase collagen stability by regulating the alignment and development of newly formed collagen fibers.
  • AgNP improves the resistance of various polymers to calcification and provides anti-inflammatory and anti-bacterial properties.
  • the main task of the scaffold is to provide a microenvironment suitable for improving the survival rate of cell transplants and transplanted cells
  • the nature of the surface on which cell attachment occurs may be an important criterion for determining cell behavior, but most of the tissue engineering three- Has a limitation in realizing a complete tissue regeneration due to the hydrophobic surface characteristics and the lack of attachment sites that the receptor of the cell can recognize and the side effects caused by the crosslinking agent.
  • biocompatibility which is synergistic to the cell proliferation
  • the stability of the defatted tissue of the scaffold which is important for cell adhesion or survival environment, it is expected to have an excellent effect on tissue regeneration.
  • the present inventors have made extensive efforts to develop a method for improving the structural stability and biocompatibility of a scaffold for biomedical research and implantable artificial tissues and organs.
  • the three-dimensional biomatrix which is a scaffold prepared by immersing the defatted biotissue into silver nanoparticles so that only the extracellular matrix (ECM) remains, and crosslinking the silver nanoparticles for immobilization. It has been shown that not only the structural stability and degradation resistance of the collagen fiber of the degummed tissue are increased but also the biocompatibility such as the survival rate and the adhesion ability of the graft cell are improved remarkably By confirming, the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a medium composition for improving the biocompatibility of mammalian-derived deglazed tissues excluding humans.
  • the present invention provides a method of improving biocompatibility of de-fatified tissue, comprising the steps of:
  • the structural stability and degradation resistance of collagen fibers in living tissues are increased according to the above-described method, and thus, it is possible to provide a collapsible tissue, a scaffold or an artificial organ containing the same, which has excellent biocompatibility, It can provide long term.
  • a scaffold made according to the method of the present invention can introduce a population of more than one type of cell (i.e., a cocktail of cells).
  • co-culturing with the same and / or different cell line as a specific cell line may be additionally performed for use in the biocompatibility, and the cell line may be any cell known in the art, May be added singly or in combination depending on the type and stage of the cell to be induced.
  • the one or more cell lines of the different kind may be homologous or heterologous and preferably cell lines derived from the same species.
  • the different cell line of the same kind means a parenchymal cell constituting the corresponding organ.
  • hepatocytes are included as the parenchymal cells in the present invention.
  • the biological tissue of step (a) may be a tissue isolated from a mammal other than a human, and may include any mammalian tissue as long as it is capable of degeneration to obtain an extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • it is a tissue isolated from pigs, cows, horses, rabbits, dogs, cats, sheep, goats, primates, guinea pigs or rodents, more preferably pigs or cows, most preferably pigs.
  • the biological tissue of step (a) may be liver, heart, kidney, stomach, small intestine, large intestine, spleen, bladder, lung or skin separated from a mammal, Or heart, and most preferably liver.
  • scaffold refers to a structure used for tissue engineering, which uses a combination of cells and various materials by placing a living cell.
  • the term " scaffold " refers to a structure (template), which is formed by decellularizing a structure, that is, a biological organ, to remove cells and leaving only the outline of the microstructure and organs.
  • artificial organ as used herein in reference to de-saturated tissues made according to the method of the present invention, is used herein interchangeably with scaffolds, and includes nanoparticles coated to enhance biocompatibility of de- And to provide an environment that is similar to the in vivo environment so that it is anchored to the cell attachment.
  • Such a scaffold of the present invention has at least one of the following properties: biocompatibility, anti-calcification characteristics, nutritional content of cells and intercellular matrix formation ability.
  • the scaffold of the present invention can be obtained by 1) preserving extracellular matrix and protein involved in cell growth and differentiation, 3) 4) The nanoparticle-coated layer facilitates the induction of endothelial cells and / or parenchymal cells. 5) In addition, Prevents degradation of collagen fibers.
  • the deaeration of the step (a) is performed by using at least one selected from the group consisting of a lysis solution, a hypotonic solution, a surfactant, RNase A and DNase I .
  • the surfactant may be a conventional surfactant, and its concentration is preferably 0.1 to 10%.
  • the surfactant is at least one selected from the group consisting of SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase and CHAPS (3- (3-cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propane sulfonate SDS (sodium dodecyl sulfate) or Triton-X, and most preferably SDS (sodium dodecyl sulfate).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Triton-X DNase and CHAPS (3- (3-cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propane sulfonate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Triton-X Triton-X
  • biodegradation means that the biodegradation is spontaneously and slowly decomposed in vivo after a certain period of time.
  • the immobilization of the step (C) may be performed by using glutaraldehyde, Genipin, carbodiimide and EDC / NHS (1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide / Nhydroxysuccinimide).
  • the crosslinking is preferably carried out using a fixing solution containing at least one compound selected from the group consisting of carbodiimide / Nhydroxysuccinimide.
  • crosslinked means that one polymer chain is linked covalently to another polymer chain, and any crosslinking agent can be used as long as it is capable of introducing crosslinking between the materials of the present invention .
  • the concentration of the compound in the fixing solution is preferably 0.001 to 1.0%. It is preferable that the fixing liquid further contains an alcohol-based solvent.
  • the alcoholic solvent may be ethanol, methanol, acetone, ethyl acetate, hexane, butanol, acetonitrile, 1,4-dioxane, isopropanol, It is preferable that the fixing of the step (2) is repeatedly performed one to three times.
  • the nanoparticles of step (b) are particles selected from the group consisting of silver nanoparticles, gold nanoparticles, platinum nanoparticles, iridium nanoparticles, rhodium nanoparticles, palladium nanoparticles, copper nanoparticles and zinc nanoparticles, Silver nanoparticles.
  • the content of the silver nanoparticles is preferably 0.001 to 10% by weight, and more preferably 0.01 to 1% by weight, based on the weight of the total de-saturated tissue. If the content of the silver nanoparticles is less than the above range, the mechanical strength of the coating layer is weakened. If the content of the silver nanoparticles exceeds the above range, seeding of the cells may become difficult.
  • the silver nanoparticles are prepared by mixing silver salt with citrate.
  • the present invention relates to a method for the immobilization of citrate-silver nanoparticles (AgNPs) in an EDC / NHS cross-linking at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml to 20 ⁇ g / ml, preferably 5 ⁇ g / and improved the structural stability and degradation resistance of collagen fibers in hypotensive - pig liver tissue when immobilized.
  • AgNPs citrate-silver nanoparticles
  • the ethyl carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide (EDC / NHS) -immobilized citrate-AgNP inhibit the structural stability and biocompatibility of the pig hypersecreted liver (DL) .
  • What is important in improving the biocompatibility of the scaffold of the present invention is to prevent collapse of the structure and / or degradation of collagen, and to increase cell adhesiveness.
  • the nanoparticles and collagen content retained in the scaffold of the present invention are identified and they bind to receptors present in the cells and may exert biological functions important for their engraftment in culturing endothelial cells .
  • the resultant scaffold pre-coated with a mixture of silver nanoparticles and citrate after de-saturated, and immobilized through crosslinking with EDC / NHS, according to the method of the present invention, to increase the survival rate of cells and to exhibit an anti-collagen degrading effect.
  • a medium composition for improving the biocompatibility of de-fatified tissue comprising the above-described nanoparticles and a crosslinking agent.
  • culture media &quot in the present invention means a medium that enables cell growth and survival in vitro, and includes all conventional culture media used in the art suitable for culturing cells
  • the basic culture medium used for culturing the cells is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), which generally contains a carbon source, a nitrogen source and a trace element component
  • CCMM cell culture minimum medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimum Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12,
  • GMEM Gasgow's Minimal Essential Medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium and the like.
  • composition of the present invention uses the above-mentioned nanoparticles of the present invention and a crosslinking agent for immobilization, redundant description thereof is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present invention.
  • the attachment rate and survival rate of the transplanted cells are improved,
  • the reconstructed microstructure maximizes in vivo efficiency and can be effectively used as a bio organ.
  • Figure 1 shows the characteristics of the de-saturated liver slices.
  • 1A and 1B show the overall shape;
  • Figure 1I shows DNA gel electrophoresis;
  • FIG. 1K shows DNA quantitation;
  • FIG. 11 shows collagen quantification and
  • FIG. 1M shows elastin quantification results (**, P value ⁇ 0.01 / ***, P value ⁇ 0.001).
  • H & E hematoxylin and eosin
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
  • SEM scanning electron microscopy.
  • FIG. 2 shows an indirect MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) for the detection of optimal concentration of ethyl carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide (EDC / NHS)
  • EDC / NHS N-hydroxysuccinimide
  • Figure 3 shows the morphological evaluation results of each cross-linking slice.
  • EDC / NHS-fixed citrate AgNP treatment group of the present invention decellularized group, glutaraldehyde, glutaraldehyde alone treatment group, EDC / NHS; EDC / NHS complex alone treatment group, AgNPs
  • Figure 4 shows the results of in vitro collagenase-mediated biodegradation of each cross-linking fragment.
  • Figures 1 i-k show the percentage of weight loss, absorbance of ninhydrin solution ratio and insoluble collagen content of each group.
  • Other characters (a, b, c) in the same row mean a significant difference at P ⁇ 0.05.
  • FIG. 5 shows the results of cell fitness evaluation of each cross-linking fragment against HepG2 and EAhy926 cell lines.
  • Figure 6 shows the overall and histological results of each group after implantation.
  • Figures 6a-e show the representative overall shape at 21 days PI (post-implantation) in each group;
  • Figures 6p-t show the results of ARS staining in PI of 21 days in each group.
  • PI post implantation
  • H & E hematoxylin and eosin
  • ARS Alizarin red.
  • FIG 8 shows the degree of retention of the nanoparticles (AgNps).
  • 8A shows the result of UV-vis spectroscopic measurement analysis
  • TEM transmission electron microscope
  • SEM scanning electron microscopy
  • EDS energy-dispersive X-ray spectroscopy.
  • the cells were then degassed by stirring with 0.1% SDS (Bio-Shop Canada, Inc., Burlington, Ontario, Canada) for 3 days at 4 ° C. SDS was changed 9 times at equal intervals. Finally, the de-saturated liver slices removed SDS residues using 1X PBS for 2 hours.
  • SDS Bio-Shop Canada, Inc., Burlington, Ontario, Canada
  • a group treated with ultrapure water as a control (de-saturated or DL group);
  • insoluble collagen content was estimated using the Sircol assay kit (Bicolor, Ltd) according to the manufacturer's instructions to detect the amount of collagen remaining in the section after in vitro biodegradation.
  • the HepG2 and EAhy926 cell lines were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours using the LIVE / DEAD® survival rate / cytotoxicity kit (calcein AM / ethidium homodimer, Invitrogen) according to the manufacturer's instructions to determine the survival rate of HepG2 and EAhy926 cell lines
  • LIVE / DEAD® survival rate / cytotoxicity kit (calcein AM / ethidium homodimer, Invitrogen) according to the manufacturer's instructions to determine the survival rate of HepG2 and EAhy926 cell lines
  • the effect of conditional medium from the sections of each group was quantitatively evaluated and then imaged using a fluorescence microscope (Olympus, Japan). MTT assay (Sigma-Aldrich, USA) was used to quantitatively assess cytotoxicity.
  • Cell viability was calculated by dividing the optical density (OD) value of MTT formazan at 570 nm in the different cross-linking groups by the optical density (OD) value of the DL group.
  • Cell attachment analysis was also performed by methods known in the art. The cell attachment rate was calculated by dividing the OD value of the SWT-8 formazan (water-soluble formazan) at 450 nm of the different cross-linking groups by the OD value of the DL group.
  • Immunofluorescence (IF) staining Differentiation of macrophages by the detection of their phenotypes (M1: proinflammatory and M2 anti-inflammatory) at 7 and 21 days were evaluated.
  • Anti-macrophage marker (# 141726, Bio-legend, USA) containing anti-CCR7 antibody (Alexa Fluor 555) (ab207018, abcam, UK) as M1 label and anti- CD206 antibody (Alexa Fluor 594) CA) was used.
  • DAPI was used for nuclear staining. The M1 / M2 ratio of each group was measured using the Image J analysis program.
  • Liver sections of the AgNPs group were cultured for 7 days in a culture medium containing collagenase (90 IU / And a similar environment. The sections were imaged by TEM and SEM and analyzed by EDS to evaluate the degree of maintenance of the nanoparticles. The size of the nanoparticles released from the medium was also calculated using TEM. The TEM was also performed on the sections of the AgNP group after 21 days of the biopsy to quantitatively evaluate the retention of the nanoparticles on the slice.
  • DNA, collagen, and elastin content were statistically analyzed using Student's t-test. Univariate analysis (ANOVA) with quantitative difference (HSD) for comparison between each cross-linking group - Tukey post hoc multiple comparison test Respectively. All tests were performed using a statistical software program (IBM SPSS version 21).
  • the present inventors have confirmed the characteristics of degenerated hepatic (DL) sections.
  • the DL intercept was white in color while maintaining its original shape (Fig. 1A, B). Histological analysis using H & E staining showed removal of all nuclear and cytoplasmic material and the presence of intact extracellular matrix (Fig. 1C, D). DAPI staining showed that no nuclear fraction remained in the slice after de-aeration (Fig. 1E, F). SEM analysis confirmed that the depleted slices had an undamaged ECM structure without the presence of intracellular material (Fig. 1 G, H). Gel electrophoresis failed to show a detectable DNA fragment in the de-saturatedized fragment (Fig. 1I).
  • the DNA content of the native and degummed sections was determined to be 3450 ⁇ 20.3 ng and 11.07 ⁇ 3.2 ng, respectively, per mg of dry tissue, which was significantly different (P ⁇ 0.0001) 1J).
  • the collagen content of the natural and de-saturated sections was 11.02 ⁇ 0.44 ⁇ g and 9.53 ⁇ 0.50 ⁇ g per 1 mg of dry weight, respectively, after normalization; The difference between them was not significant (P ⁇ 0.05) (Fig. 1L).
  • the elastin content was significantly reduced (P ⁇ 0.05) (FIG. 1M) in the degenerated slices (5.221 ⁇ 0.49 ⁇ g / mg dry weight) compared to the natural slices (15.89 ⁇ 1.61 ⁇ g / mg dry weight) after normalization.
  • Example 2 Optimization of non-toxic concentration of EDC / NHS citrate-AgNP of the present invention using HepG2 and EAhy926 cell lines
  • AgNPs at 5 ⁇ g / mL was the highest non-toxic (optimal) concentration for both HepG2 and EAhy926 cell lines in the case of AgNPs-crosslinking. Therefore, in the following examples, AgNPs were used at 5 ⁇ g / mL.
  • the Glu group which is conventionally known in the art, retains collagen as compared with the control group, it is irregularly attached to each other and the porosity is significantly lower than that of the AgNps group of the present invention;
  • EDC / NHS (pretreatment) group although collagen was preserved as compared with the control group, they were irregularly attached to each other and the porosity was significantly lower than that of the AgNps group of the present invention.
  • the AgNps (EDC / NHS + Ag Nps treated) group of the present invention did not modify the matrix, and maintained the collagen arrangement and porosity better.
  • the present inventors evaluated the degree of swelling of the sections of each cross-linking group.
  • the DL group showed collapse of superfine structure with unfolded and finely broken collagen material over several zones, while the other cross - linking groups were more resistant to collapse.
  • the quality of collagen in the Glut group was affected; Their collagen fibers were very rough.
  • the EDC / NHS group has shown tremendous destruction zones.
  • the AgNPs group exhibited higher quality smooth surface interconnected collagen fibers (FIG. 4E-H).
  • the weight loss ratio (39.58 +/- 2.7%) of the DL group showed a significant difference (P ⁇ 0.05) in comparison with other cross-linking groups.
  • EDC / NHS group had higher weight loss rate (25.50 ⁇ 0.66%) than other cross-linking groups (P ⁇ 0.05).
  • the Glut and AgNPs groups showed the longest persistent insoluble collagen contents (35.69 ⁇ 2.08 and 34.01 ⁇ 1.35 ⁇ g / mg tissue), indicating that the DL group (15.07 ⁇ 0.52 ⁇ g / mg), whereas the amount of insoluble collagen in the EDC / NHS group was lower than other cross-linking groups (26.92 ⁇ 0.81 ⁇ g / mg tissue) (P ⁇ 0.05).
  • the weight reduction of the scaffold, the strength evaluation, and the amount of residual collagen that can detect the extent of collagen disappearance were confirmed, and the AgNps group of the present invention was remarkably effective.
  • the present inventors evaluated the cell suitability of the sections of each crosslinking group.
  • the adhesion rate of EEAhy926 cell line was significantly increased (P ⁇ 0.05) compared to the DL group, whereas the adhesion rate of two cell lines in the Glut group was significantly reduced compared to the DL group (FIG. 5M, N).
  • the cytotoxicity of Glut group was the highest, and the other groups showed similar results to the control group DL. Therefore, the AgNps group of the present invention was confirmed to be cytotoxic to the cells for recellulization used for producing artificial organs.
  • Example 7 In vivo transplantation
  • the present inventors confirmed the effect of the cross-section of each cross-linking group in a living body implant.
  • each group was subcutaneously and intraperitoneally transplanted into an animal, and the inflammatory reaction (biodegradation reaction) was evaluated at 7th and 21st days.
  • the AgNps group of the present invention did not cause the most inflammatory reaction.
  • the present inventors confirmed the degree of conservation of AgNP in the fragments of each crosslinking group.
  • TEM, SEM and EDS analyzes of the sections of the AgNPs group showed that the nanoparticles remained still bound on the slice (Fig. 8B-D).
  • the TEM image of the medium shows that the size of any nanoparticles released ( ⁇ 89.1 ⁇ 28.6 nm) has decreased non-significant, which means they are non-toxic in the body (FIG. 8E).
  • the TEM of the subcutaneously transected sections of the transplanted AgNP group for 21 days showed the presence of nanoparticles in the implanted area, indicating that the nanoparticles were retained in the grafted sections (Fig. 8F).
  • nanoparticles according to the present invention were well maintained not only in vitro but also when they were transplanted into living tissues.
  • EDC / NHS-immobilized citrate-AgNP improved the super-structure of DL collagen fibers with good porosity and increased the tolerance of DL to in vitro degradation with good cell compatibility.
  • EDC / NHS-immobilized citrate-AgNPs reduced the host inflammatory response to the pig DL graft transplanted into the body and increased the polarization of M2 macrophages.
  • structural and functional improvement of porcine DLs could be achieved using EDC / NHS-immobilized citrate-AgNP.
  • the structural stability and degradation resistance of the collagen fiber in the biotissue biotissue are increased, and thus, a vegatable tissue, scaffold or a scaffold having improved biocompatibility such as survival rate and adhesion ability of graft cells Artificial organs can be provided.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 생체적합성이 개선된 생체 조직 유래의 스캐폴드에 세포를 이식한 경우, 이식된 세포의 부착율 및 생존율을 향상시키고, 또한 재건된 미세구조는 생체 내 효율을 극대화시켜 바이오 장기로 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법
본 발명은 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법에 관한 것이다.
동소 간(Orthotopic liver) 이식은 말기 간 질환 환자를 살리기 위한 유일한 표준 치료이다. 이러한 절차와 관련하여 기증 간에 대한 수요, 간 기증자의 부족뿐 만 아니라 이식 후 거부 반응과 같은 심각한 문제가 있다. 기증자 기관의 만성적 부족을 보완하기 위한 하나의 잠재적인 방법은 생체 인공(bioartificial) 간 및 보조(secondary livers) 간을 개발하는 것이다. 간은 구조가 매우 복잡하고, 해독, 단백질 합성 및 분해에 필요한 생화학 물질의 생산을 포함하여 신체 내에서 다양한 기능들을 갖는다. 따라서, 구성 요소, 구조 및 기능에 있어서, 간과 동일한 인공 지지체(scaffold)를 제조하는 것은 어렵다. 또한, 양호한 생체 적합성, 적합한 다공성을 가지며 조성, 형태, 구조 상 생체 간과 유사해야 한다. 따라서, 조직 공학, 장기 이식 및 약물 스크리닝을 위한 기능적인 생체 공학적 간의 제조는, 탈세포화 과정을 이용하여 구축될 수 있다. 계면활성제(detergent)를 이용하여 간 조직으로부터 세포 내 구성 요소를 완전히 제거하면, 온전한 간 특이 ECM 및 혈관 네트워크의 구조적 및 기능적 특징들은 잘 보존된다. 조직 공학에 있어 탈세포화된 매트릭스의 응용 잠재력은 방광, 동맥, 식도, 피부 및 기관을 포함한 다수의 조직에 대해 확인된 바 있다. 조직 또는 장기의 탈세포화는 세포 배양 및 이식을 위한 기능적 스캐폴드를 제조하는 유망한 접근법으로 연구되어 왔다.
재생의학 및 조직공학용 인공 간을 개발하기 위해서는, 기본적이고 상호보완적인 핵심 요소로서, 모든 세포 외 기질(extracellular matrix) 단백질을 보존하고 천연 간 구조를 모방한 생물학적으로 호환 가능한 스캐폴드가 요구된다. 이에,합성 또는 천연 유래의 다수의 기질들이 간 조직 공학에 이용되어 왔다. 그러나, 대부분의 합성 기질들은 생체 적합성에 문제가 있었다. 따라서, 탈세포화 간 스캐폴드는 세포외 기질, 단백질 및 혈관을 유지하고 있어 가장 적합하고 신뢰할 수 있는 소스이다.
다만,다른 콜라겐성 조직과 마찬가지로 돼지 간은 수확 후 즉시 분해되고 이식 후 석회화될 수 있기 때문에, 세포질을 재접종하기 전에 중요 성분을 유지하기 위해 가교 결합(cross-linking)을 사용하여 탈세포화 직후에 분해 속도를 줄이고 인장 강도를 증가시키는 것이 매우 중요하다.
당업계에서는 이러한 스캐폴드 조직의 기계적 안정성 및 기능성을 유지하기위하여 글루탈알데히드로 고정하여 사용해 왔다. 그러나, 이종조직들에 대한 글루탈알데히드 고정 후에 세포막에 다량으로 존재하는 인지질, 조직의 가교 결합에 참여하지 않고 세포독성을 가지고 있는 유리 알데하이드기(free aldehyde groups) 및이종 조직에 남아있는 세포 성분의 조직 항원에 대한 면역반응이 조직의 석회화를 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 천연 가교제인 제니핀은 생체적합성으로 인해 돼지 간 인공 지지체를 가교결합시키는 가교제로 제시된 바 있으나, 가교-스캐폴드의 청색 착색, 고비용 및 추출 방법의 복잡성 때문에 응용에 한계가 있다.특히, 간 조직에서의 세포외매트릭스(ECM)에 대한 가교 결합 연구는 거의 전무한 상태이다(Hussein KH, Park K-M, Lee Y-S, et al: New insights into the pros and cons of cross-linking decellularized bioartificial organs. The International journal of artificial organs 40:136, 2017).
　최근, 나노 기술에 대한 관심이 증가하여 여러 가지 목적을 위해 다양한 크기와 모양의 여러 나노 물질을 사용하여 다양한 탈세포화된 조직을 변형시키는 연구가 진행되고 있다(Shimizu K, Ito A, Arinobe M, et al: Effective cell-seeding technique using magnetite nanoparticles and magnetic force onto decellularized blood vessels for vascular tissue engineering. Journal of bioscience and bioengineering 103:472-478, 2007).
이러한 나노 물질들 중 특히, 은나노입자(AgNPs)와 같은 귀금속 나노입자는그 독특한 특성으로 인해 이를 이용한 응용 분야는 증가하는 추세이다. 시트레이트(Citrate)-AgNP는 서로 다른 비공유 결합 메커니즘을 통해 매우 규칙적인 방식으로 콜라겐 섬유와 결합하는 능력을 가지고 있다. 또한, 대부분의 가교제는 콜라겐 분자간에 2 점 연결만을 제공하나,시트레이트-AgNP는 여러 부착 부위를 제공하는 이점이 있다. 이전 연구에 따르면 AgNP는 새로 형성된 콜라겐 섬유의 정렬과 발달을 조절하여 콜라겐의 안정성을 증가시키는 능력을 가지고 있음을 보여주었다. 또한, AgNP는 석회화에 대한 다양한 폴리머의 내성을 향상시키고 항-염증 및 항-박테리아 특성을 제공한다.
스캐폴드의 주요 임무가 세포이식 및 이식된 세포의 생존율 향상에 적합한미세환경을 제공하는 것이므로, 세포부착이 일어나는 표면의 성격은 세포거동을 결정짓는 중요한 기준이될 수 있으나, 대부분의 조직공학용 삼차원 지지체는 소수성 표면특성과 세포의 리셉터가 인식할 수 있는부착 사이트의 결여나 가교제에 의한 부작용으로 온전한 조직재생을 구현하는데 한계를 갖는다.
따라서, 세포의 부착 또는 생존 환경에 중요한 스캐폴드의 탈세포화 조직의 안정성을 개선해주는 동시에, 세포의 증식에 상승작용을 가져오는 생체적합성을 증가시킬 수 있다면 조직 재생에서 우수한 효과를 가져올 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 생체의학적 연구 및 이식용 인공조직 및 장기에 적용하기 위하여, 스캐폴드의 구조적 안정성 및 생체적합성을 개선시키는 방법을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)만이 남도록 탈세포화된 생체 조직을 은나노입자로 침지하고, 은나노입자의 고정화를 위해 가교결합을 실시하여 제작한 스캐폴드인 3-차원 바이오 매트릭스를 지략적인 플랫폼으로 이용하여 세포를 도입(리시딩)한 경우, 탈세포화된 조직의 콜라겐 섬유의 구조적 안정성 및 분해 저항성의 증가가 달성되었을 뿐만 아니라 이식 세포의 생존율 및 부착능과 같은 생체 적합성이 탁월하게 개선되었음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 인간을 제외한 포유동물-유래 탈세포화된 조직의 생체적합성 개선 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 포유동물-유래 탈세포화된 조직의 생체적합성 개선용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 탈세포화된 조직의 생체적합성 개선 방법을 제공한다:
(a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생체 조직을 탈세포화(decellularization)시키는 단계;
(b) 상기 탈세포화된 생체 조직을 나노입자로 침지시켜 코팅하는 단계; 및
(C) 상기 나노입자가 코팅된 생체조직을 고정화(fixation)시키는 단계.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 생체 조직 내 콜라겐 섬유의 구조적 안정성 및 분해 저항성이 증가되어, 이식 세포의 생존율 및 부착능과 같은 생체 적합성이 탁월하게 향상된 탈세포화 조직, 스캐폴드 또는 이를 포함하는 인공 장기를 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제작된 스케폴드는 한 가지 유형 이상의 세포(즉, 세포의 칵테일) 집단을 도입시킬 수 있다.
즉, 상기 생체 적합화에 이용하기 위하여 특정 세포주와 동일 및/또는 상이한 세포주와 공동-배양하는 단계를 추가적으로 실시할 수 있으며, 상기 세포주는 당업계에 공지된 어떠한 세포도 이용될 수 있으며, 생착을 유도하고자 하는 세포의 유형 및 단계에 따라 다양하게 단독 또는 조합하여 첨가될 수 있다.
상기 상이한 종류의 1 종 이상의 세포주는 동종 또는 이종일 수 있고 바람직하게는 동종으로부터 유래한 세포주이다.
상기 동종의 상이한 세포주는 해당 장기의 구성세포인 실질세포(parenchymal cell)를 의미하며, 본 발명에서 상기 해당 실질세포로 간 실질세포로서 간세포(hepatocytes)를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 (a) 단계의 생체 조직은 인간을 제외한 포유류로부터 분리된 조직으로, 탈세포화시켜 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득할 수 있는 한 어떠한 포유류의 조직도 포함할 수 있다.
바람직하게는, 돼지, 소, 말, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 영장류, 기니 피크, 또는 설치류으로부터 분리된 조직이고, 보다 바람직하게는 돼지 또는 소이며, 가장 바람직하게는 돼지이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 포유류로부터 분리된 간, 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 비장, 방광, 폐 또는 피부일 수 있고, 보다 바람직하게는 간 또는 심장이며, 가장 바람직하게는 간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "스캐폴드(scaffold)"란, 조직공학(Tissue engineering)에 사용되는 용어로서, 생체 세포를 안착시켜 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용하는 구조물을 말하며, 바이오 스캐폴드란 생체 구조물 즉, 생체 장기를 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후, 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 의미한다.
본 명세서에서 본 발명의 방법에 따라 제작된 탈세포화 조직을 언급하면서 사용되는 용어 "인공 장기"는 본 명세서에서 스캐폴드와 혼용되며, 탈세포화된 스캐폴드의 생체적합성을 향상시키기 위해 나노입자를 코팅 및 고정시켜서 세포 부착에 유리하도록 생체 내 환경과 유사한 형태의 환경을 제공하는 것이다.
또한, 종래 스캐폴드 제작 방법의 항석회화 효과를 향상시키기 위해 나노입자의 코팅 및 고정화 처리를 함께 적용하여 병용 상승 효과(combined synergistic effect)를 입증하였다.
이러한 본 발명의 스캐폴드는 생체적합성, 항(抗)석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 스캐폴드는 1) 탈세포화로 인하여 세포 구성물이 제거되어 이식시 면역 거부 반응이 최소화되고, 2) 세포 성장과 분화에 관여하는 세포외기질 및 단백질이 보존되고, 3) 간소엽 구조가 보존되어 세포 주입 후 산소 및 영양 공급이 가능하고, 원래 장기 그대로의 형태와 구조가 유지될 뿐만 아니라 4) 나노입자-코팅층이 내피세포 및/또는 실질세포의 생착을 도우며 5) 콜라겐 섬유의 분해를 막는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonic solution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 계면활성제는 통상의 계면활성제가 이용될 수 있으며, 이의 농도는 0.1 내지 10%가 바람직하다.
바람직하게는, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 또는 Triton-X이고, 가장 바람직하게는 SDS (sodium dodecyl sulfate)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생분해"는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것을 의미한다.
상기 본 발명에 있어서, 상기 단계 (C)의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin), 카보디이미드 (carbodiimide) 및 EDC/NHS (1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethyl carbodiimide/Nhydroxysuccinimide)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 화합물을 포함하는 고정액을 이용하여 가교결합시키는 것이 바람직하다.
용어 "가교결합"은 하나의 중합체쇄가 다른 중합체쇄에 공유결합으로 연결된 것을 의미하며, 가교결합제로는 본 발명의 물질 사이에 가교결합을 도입할 수 있는 한, 어떠한 임의의 제제도 포함될 수 있다.
상기 고정액에서의 상기 화합물의 농도는 0.001~1.0%인 것이 바람직하다. 상기 고정액에는 알코올계 용매가 더 포함되는 것이 바람직하다. 상기 알코올계 용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올, 아세토니트릴, 1,4-디옥산, 이소프로판올, 옥탄올 등 일 수 있다. 상기 단계 (2)의 고정은 1~3회 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.
상기 (b) 단계의 나노입자는 은나노입자, 금나노입자, 백금나노입자, 이리듐나노입자, 로듐나노입자, 팔라듐나노입자, 구리나노입자 및 아연나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 입자이고, 바람직하게는 은나노입자이다.
이때 은나노입자의 함량은 총 탈세포화된 조직 중량 대비 0.001 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 은나노입자의 함량이 상기 범위 미만이면 코팅층의 기계적 강도가 약해지는 반면, 이의 함량이 상기 범위를 초과하면 세포의 파종이 어려워지는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에서, 상기 은나노입자는 시트레이트(citrate)에 은염(Ag salt)을 혼합하여 제조된다.
본 발명은, 일 구현예에서, 0.5 ug/ml 내지 20 ug/ml의 농도, 바람직하게는 5 μg/ml의 농도의 시트레이트(citrate)-은나노입자(AgNPs)를 EDC/NHS 가교결합으로 고정화(immobilized)시킨 경우 탈세포화-돼지 간 조직의 콜라겐 섬유의 구조적 안정성 및 분해 저항성을 향상시켰다.
즉, 에틸 카르보디이미드 하이드로클로라이드(ethyl carbodiimide hydrochloride) 및 N-하이드록시석신이미드(Hydroxysuccinimide)(EDC/NHS)-고정화 시트레이트-AgNP가 돼지 탈세포화 간(DL)의 구조적 안정성과 생체 적합성을 향상시켰다.
본 발명의 스캐폴드의 생체적합성 향상에 있어서 중요한 것은 구조의 붕괴 및/또는 콜라겐의 분해를 막고, 세포의 부착성을 증가시키는 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드 내에 유지되는 나노입자 및 콜라겐 함량을 확인하였고 이것들은 세포에 존재하는 수용체와 결합하여 내피세포의 배양 시 이들의 생착에 중요한 생물학적 기능을 발휘할 수 있다.
본 발명의 목적에 따라 원하는 각 단계 중 소요되는 시간, 횟수 등은 당업자에 의해 변형 및 조절될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 따른 결과물인, 탈세포화된 후 은나노입자 및 시트레이트의 혼합물로 사전 코팅처리하고, EDC/NHS로 가교결합을 통해 고정화시킨 스캐폴드는, 세포 생착 또는 배양을 위한 미세환경을 조성하여 세포의 생존율을 증가시킬 뿐만 아니라 항-콜라겐 분해 효과를 나타낸다.
또한, 종래 스캐폴드의 문제였던 석회화의 발생이 감소하며, 독성이 적고, 이종 이식시의 면역반응이 현저하게 감소하는 바, 효과적이고 안전한 이종 이식용 생체 조직으로서 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 나노입자 및 가교결합제를 포함하는, 탈세포화된 조직의 생체적합성 개선용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서 용어, “배지(culture media)"는 인 비트로에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를들어, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, (Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 상술한 나노입자 및 고정화를 위한 가교결합제를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법에 따라 생체적합성이 개선된 생체 조직 유래의 스캐폴드에 세포를 이식한 경우, 이식된 세포의 부착율 및 생존율을 향상시키고, 또한 재건된 미세구조는 생체 내 효율을 극대화시켜 바이오 장기로 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 탈세포화된 간 절편의 특성을 보여준다. 도 1a 및 b는 전체 모양; 도 1c 및 d는 H&E 염색(스케일 바=100 μm); 도 1e 및 f는 DAPI 염색(스케일 바=100 μm); 도 1g 및 h는 SEM 이미지(스케일 바=1 μm); 도 1i는 DNA 겔 전기 영동; 도 1j는 PCR 분석; 도 1k는 DNA 정량; 도 1l은 콜라겐 정량 및 도 1m은 엘라스틴 정량 결과를 보여준다(**, P 값 <0.01 / ***, P 값 <0.001). H&E, hematoxylin and eosin; DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole; SEM, scanning electron microscopy.
도 2는 EDC/NHS(ethyl carbodiimide hydrochloride and N-Hydroxysuccinimide)-고정 시트레이트 AgNP의 최적 농도 검출을 위한 간접 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석 결과로서, 5 μg/mL의 농도가 두 세포주 모두에서 가장 적합한 무독성 농도임을 보여준다(**, P 값 <0.01 / ***, P 값 <0.001). 이하, 본 발명의 EDC/NHS-고정 시트레이트 AgNP는 AgNPs로 표기한다.
도 3은 각 가교-결합 절편의 형태학적 평가 결과를 보여준다. 도 3a 내지 d는 전체 모양; 도 1e 내지 h는 H&E 염색(스케일 바=100 μm); 도 1i 내지 l은 SEM 이미지(스케일 바=1 μm)를 보여준다.
(Decellularized; 탈세포화 그룹, glutaraldehyde; 글루타르알데히드 단독 처리 그룹, EDC/NHS; EDC/NHS 복합체 단독 처리 그룹, AgNPs; 본 발명의 EDC/NHS-고정 시트레이트 AgNP 처리 그룹)
도 4는 각 가교-결합 절편의 시험관내 콜라겐 분해 효소-매개 생분해 평가 결과를 보여준다. 도 4a 내지 d는 H&E 염색(스케일 바=100 μm); 도 1e 내지 h는 SEM 이미지(스케일 바=1 μm)를 보여준다. 도 1i 내지 k는 각 그룹의 중량 감소, 닌히드린 용액 비율의 흡광도 및 불용성 콜라겐 함량에 대한 백분율을 보여준다. 같은 행의 다른 문자(a, b, c)는 P <0.05에서 유의한 차이를 의미한다.
도 5는 HepG2 및 EAhy926 세포주에 대한 각 가교-결합 절편의 세포적합성 평가 결과를 보여준다. 도 5a 내지 j는 살아있거나/죽은 세포 독성 분석(스케일 바=50μm; 도 5k 및 m은 세포 생존율%; 도 5l 및 n은 세포 부착율% 결과를 보여준다. 그래프 내 다른 글자(a, b, c)를 갖는 평균 ± SD는 P <0.05에서 유의한 차이를 의미한다.
도 6은 이식 후 각 그룹의 전체 및 조직학 결과를 보여준다. 도 6a 내지 e는 각 그룹의 21 일 PI(이식후)에서의 대표적인 전체 모양; 도 6f 내지 o는 각 그룹의 7일 및 21 일 PI에서의 H&E 염색(스케일 바=100 μm); 및 도 6p 내지 t는 각 그룹의 21 일 PI에서의 ARS 염색 결과를 보여준다. PI, post implantation; H&E, hematoxylin and eosin; ARS, Alizarin red.
도 7은 대식세포 표현형(M1 및 M2)에 대한 형광 염색 결과를 보여준다. 각 그룹의 7 일 PI(도 7a1 내지 t1) 및 21 일 PI(도 7a2 내지 t2)에서의 M1 및 M2 대식세포의 분극화(polarization)에 대한 대표적인 이미지(스케일 바=50μm); 7 일 PI(U1) 및 21 일 PI(U2)에서의 각 그룹의 M1 / M2 비율의 평균 ± SD 값을 보여준다. CCR7+ 세포 (녹색)는 M1 대식세포이며, CD206+ 세포(적색)는 M2 대식세포이다. DAPI(파란색)는 핵에 대한 대비염색으로 사용되었다. 그래프 내 같은 행의 다른 문자(A, B, C, D)는 P <0.05에서 유의한 차이를 나타낸다. PI, post implantation; DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole.
도 8은 나노입자(AgNps)의 유지 정도를 보여준다. 도 8a는 UV-vis 분광 측정 분석 결과를 보여주고, 도 8b 내지 d는 각각 절편 상의 나노입자의 보존을 나타내는 TEM(스케일 바=500nm), SEM(스케일 바=3μm) 및 EDS 분석 결과를 보여준다. 도 8e는 방출된 나노입자의 TEM 이미징(스케일 바=1 μm)을 보여준다. 도 8f는 21일 PI에서의 AgNPs 그룹의 피하 이식된 절편의 TEM 이미지(스케일 바=500 nm)를 보여준다. TEM, transmission electron microscope; SEM, scanning electron microscopy; EDS, energy-dispersive X-ray spectroscopy.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 방법 및 재료
간 적출 및 탈세포화
모든 절차는 강원대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 120kg 내지 130 kg 무게의 돼지를 사용하였다. 수술 전 과정은 마취 하에 진행되었다. 간문맥에 24게이지 혈관내튜브 카테터를 연결하고 500 IU/L 농도의 헤파린이 포함된 1X PBS(phosphate buffered solution)을 주입하여 간 내 혈액을 세척한 뒤, 주변 조직과 분리하여 간을 적출하여 얇은 조각 (1x1x0.2-0.3cm)으로 절단하였다. 500 IU/L 농도의 헤파린이 포함된 1X PBS(phosphate buffered solution)에서 2 시간 동안 교반(120 rpm-4℃)하면서 세척하였다. 그런 다음 4℃에서 3 일 동안 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate; Bio-Shop Canada, Inc., Burlington, Ontario, Canada)를 사용하여 교반하여 탈세포화하였다. SDS는 동일한 간격으로 9 번 바꿔주었다. 마지막으로, 탈세포화된 간 조각은 2 시간 동안 1X PBS를 이용하여 SDS 잔류물을 제거하였다.
탈세포화의 특성
탈세포화된 간(DL; decellularized liver) 절편에 대한 육안, 현미경 검사(H&E 및 DAPI 염색)및 주사 전자 현미경 (SEM) 분석을 수행하였다. G-spin 쪠 Total DNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 제조 회사의 지침에 따라 간 조각에서 총 DNA를 추출하였다. 총 DNA는 DNA 래더-겔 전기 영동 및 Nanodrop 분광 광도계 ND-1000 (PeqLab, Erlangen, Germany)을 통해 평가되었다.
PCR(Polymerase chain reaction)분석을 실시하여 361 bp크기의 1,3α gal(galactosyltransferase)[정방향 프라이머 5'-GCTCCACCTGGCAGTCATAG-3'(서열번호 1);역방향 프라이머 5'-GTCCTGGAGGATTCCCTTGA-3' (서열번호 2)];및280 bp 크기의 β-actin(porcine beta actin)[정방향 프라이머 5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3'(서열번호 3);역방향 프라이머 5'-TGTTGGCGTAGAGGTCCTTC -3'(서열번호 4)]를 확인하였다. 콜라겐 및 엘라스틴은 제조사의 지침에 따라 각각 Sircol과 Fastin 분석 키트 (Bicolor, UK)를 사용하여 측정되었다. 이들의 값은 Mattei et al.의 절차에 따라 표준화되었다.
HepG2 및 EAhy926 세포주를 이용한 EDC/NHS 시트레이트-AgNP의 최적 농도
다양한 농도(0.5, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 또는 20 μg/mL)의 시트레이트(citrate) 코팅된 100 nm AgNP(#730777, Sigma-Aldrich, USA)에서 일정한 진탕으로 37℃에서 4 시간 동안 DL 절편을 침지시켰다. 나노입자의 분산 조건은 480nm의 파장에서 UV-Visible 분광기를 사용하여 확인하였다. DL 절편에 EDC(6mg/mL)/NHS (3.6mg/mL)를 함유하는 MES(2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid)완충액(1.06%)을 추가로 30 분 동안 처리하여 나노입자를 고정화하였다. 이 과정에 사용된 3 개의 시약은 모두 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma-Aldrich, USA)분석으로세포독성(cytotoxicity)을 확인하여 AgNP의 최적 무독성 농도를 결정하였다.
가교 결합(Cross-linking)
DL 절편을 37℃에서 4 시간 동안 하기와 같이 다양한 가교 결합 용액 처리군에서 일정하게 교반하면서 침지시켰다:
글루타르알데히드(0.625%) 단독 처리군 (Glut 그룹);
1.06% MES 완충액 내 EDC(6mg/mL)/ NHS(3.6mg/mL) 복합체 처리군 (EDC/NHS 그룹);
대조군으로서의 초순수 처리군 (탈세포화된 또는 DL 그룹); 및
EDC/NHS + 시트레이트-AgNps 처리군 (AgNPs 그룹).
이어서 모든 그룹의 절편을 PBS로 24 시간씩 2 회 세척한 후 가교 결합 효과를 평가하였다.
형태학적 평가
가교결합 후 간 ECM의 구조적 변화를 평가하기 위해 육안 검사, H&E 염색 및 SEM 이미징을 수행하였다.
팽창율(swelling ratio) 평가
각각 다른 가교 결합 처리 후의절편의 친수성 및 다공성의 변화를 평가하기 위해 당업계에 공지된 Yan방법으로 팽창 테스트를 수행하였다.
시험관내( in vitro ) 콜라게나제-매개 생분해(biodegradation):
당업계에 공지된 방법에 따라 시험 관내에서 콜라게나제 분해에 대한 저항성테스트를 실시하여 다양한 가교 결합된 조합의 안정성을 평가하였다. 그런 다음 H&E 염색 및 SEM 이미징을실시하여 각 그룹의 절편 내 구조적 퇴보 변화를 평가하였다. 각 그룹의 절편의중량 감소율은 시험관내 생분해 후의 초기 건조 중량(W0)및 건조 중량(W1)(중량 감소율= W0-W1/W0 X 100)의 차이를 계산하여 평가하였다. 시험관내 생분해 후 각 그룹의 절편에서 방출된 아미노산을 닌히드린 반응으로 시각화하여 생성된 자주색의 광학 밀도를 분광 광도법으로 측정하고,각 가교결합된 그룹의 혼합물의 광학 밀도 값을 DL 그룹의 광학 밀도 값으로 나눔으로써 반-정량적으로 평가하였다.
또한, 시험관내 생분해 후 절편에 남아있는 콜라겐 양을 검출하기 위해 Sircol 분석 키트 (Bicolor, Ltd)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 불용성 콜라겐 함량을 추정하였다.
세포적합성(cytocompatibility) 평가
제조사의 지침에 따라 LIVE/DEAD® 생존율/세포독성 키트(calcein AM/ethidium homodimer, Invitrogen)를 사용하여 HepG2 및 EAhy926 세포주를 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 배양하여 HepG2 및 EAhy926 세포주의 생존율에 대한 각 그룹의 절편으로부터의 조건 배지의 영향을 정량적으로 평가한 후형광 현미경 (Olympus, Japan)을 사용하여 이미징하였다. MTT 분석(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 세포 독성을 정량적으로 평가하였다. 상이한 가교결합 그룹의 570 nm에서 MTT 포르마잔의 광학 밀도(OD) 값을 DL 그룹의 광학 밀도(OD) 값으로 나누어 세포 생존률을 계산하였다. 또한,당업계에 공지된 방법으로 세포 부착 분석을 실시하였다. 상이한 가교 결합 그룹의 450 nm에서 SWT-8 포르마잔 (수용성 포르마잔)의 OD 값을 DL 그룹의 OD 값으로 나누어 세포 부착율을 계산하였다.
생체 내 이식
모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회(강원 대학교, 대한민국)의 규칙에 따라 수행되었다. 비-가교결합시킨 천연(Native) DL 절편 및 각 가교결합 DL 절편들을 30 마리의 ICR 수컷 마우스(3-4 주령)(각각 n=6)에 피하이식하였다. 간단히 말하면, 동물을 마취시키고, 동물의 등쪽에 작게 절개하여, 피하 포켓을 무딘 절개로 만들었다. 간 절편을 이 포켓에 삽입하고 상처를 봉합하였다. 동물 안락사는 이식 후 7 일과 21 일에 수행되었다. 각 이식된 절편들을 다음과 같이 평가하였다:
- 총체적: 각 그룹의 절편의 생체 내 분해 평가
- H&E 염색법: 각 그룹의 절편에 대한 국소 염증 반응을 정성적으로 평가. 이미지 J 분석 프로그램(소프트웨어 버전 1.47)을 사용하여 7 일 및 21 일 PI에서 각 그룹의 동물 당 5 개의 조직 부분(400 x)의 호중구 및 림프구를 계수하여 정량적으로 측정하였다.
- ARS(Alizarin Red S) 염색법: 21 일 PI에서 염색을하여 이식된 절편의 석회화를 평가하였다.
-면역 형광(IF) 염색법:7 일 및 21 일에 이들의 표현형(M1: 전염증성 및 M2 항-염증성)의 검출에 의한 대식세포의 분화를 평가하였다. M1 표지로서 항-CCR7 항체 (Alexa Fluor® 555) (ab207018, abcam, UK) 및 M2 마커로서항-CD206 항체 (Alexa Fluor® 594)를 포함하는 항-대식세포 마커(#141726, Bio-legend, CA)를 사용하였다. DAPI는 핵염색으로 사용되었다. 각 그룹의 M1 / M2 비율은 이미지 J 분석 프로그램을 사용하여 측정되었다.
절편 상의 AgNP의 유지(retention) 평가
- UV-vis 분광측광: 당업계에 공지된 방법에 따라 수행되었다.
*- TEM(Transmission electron microscopy), SEM 및 EDS(Energy-dispersive X-ray spectroscopy): AgNPs 그룹의 간 절편을 콜라게나제(90 IU/mL)를 함유한 배양 배지에서 7 일 동안 배양하여 생체 조건과 유사한 환경을 제공하였다. 절편을 TEM 및 SEM으로 영상화하고, EDS로 분석하여 나노입자의 유지 정도를 평가하였다. 배지에서 방출된 나노입자의 크기도 TEM을 이용하여 계산하였다. 또한, TEM은 절편 상의 나노입자의 유지를 정량적으로 평가하기 위해 생체 주입 21 일 후 AgNP 그룹의 절편에 대해서도 수행되었다.
통계 분석
　　　　DNA, 콜라겐, 및 엘라스틴 함량을 Student 's t-test를 이용하여 통계적으로 분석하였으며, 각 가교 결합 그룹 간의 비교를 위해 정량적 차이(HSD)가 있는 단변량 분석(ANOVA)-Tukey post hoc다중 비교 테스트를 실시하였다. 모든 테스트는 통계 소프트웨어 프로그램 (IBM SPSS 버전 21)을 사용하여 수행되었다.
실시예 1: 탈세포화의 특성화
본 발명자들은 탈세포화시킨 간(DL) 절편의 특징을 확인하였다.
그 결과, DL 절편은 원래 모양을 유지하면서 색상이 흰색이 되었다(도 1A, B). H&E 염색을 이용한 조직학적 분석은 모든 핵 및 세포질 물질의 제거와 손상되지 않은 세포외 기질의 존재를 보여주었다(도 1C, D). DAPI 염색은 탈세포화 후 핵분획이 절편에 남아 있지 않음을 보여주었다(도 1E, F). SEM 분석을 통해 탈세포화된 절편은 세포내 물질의 존재없이 손상되지 않은 ECM 구조를 가지고 있음을 확인하였다(도 1 G,H). 겔 전기 영동은 탈세포화된 조각에서 검출 가능한 DNA 단편을 보여주지 못했다(도 1I). Nanodrop 분광 광도법을 사용하여 천연(Native) 및 탈세포화된 절편의 DNA 함량은 각각 건조 조직 1mg 당 3450 ± 20.3 ng 및 11.07 ± 3.2 ng인 것으로 결정되었으며, 이는 유의한 차이가 있었다(P <0.0001)(도 1J). 탈세포화된 물질의 cDNA의 PCR 분석을 이용하여 1,3 α-gal 및
Figure PCTKR2018016924-appb-I000001
-actin 유전자의 제거를 확인하였다(도 1K). 천연 및 탈세포화된 절편의 콜라겐 함량은 각각 정상화 후 건조 중량 1mg 당 11.02 ± 0.44 μg 및 9.53 ± 0.50 μg이었고; 이들간 차이는 유의하지 않았다(P <0.05) (도 1L). 엘라스틴 함량은 정상화 후 천연 절편(15.89 ± 1.61 μg/mg 건조 중량)과 비교하여 탈세포화된 절편(5.221 ± 0.49 μg/mg 건조 중량)에서 유의하게 감소하였다(P <0.05)(도 1M).
실시예 2: HepG2 및 EAhy926 세포주를 이용한 본 발명의 EDC/NHS 시트레이트-AgNP의 비독성 농도 최적화
본 발명자들은 hepG2 및 EAhy926 세포주를 이용하여 다양한 농도의 EDC/NHS 시트레이트-AgNP(AgNPs)가 로딩된 절편에 대한 MTT 분석을 실시하였다.
그 결과, hepG2 세포의 생존율은 AgNP의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하였다. 7.5 μg/mg의 농도가 hepG2 세포의 생존율에 유의하지 않은 감소(P=0.05)를 보인 가장 높은 농도였다(도 2A). 양 세포주 모두 생존율과 관련하여, 5 μg/mL이 가장 높은 비독성 농도였다(도 2B).
따라서, AgNPs-가교 결합시 AgNPs 5 μg/mL일 때가 HepG2 및 EAhy926 세포주 모두에 대해 가장 높은 무독성(최적) 농도였기 때문에 이하 실시예에서는 AgNPs 5 μg/mL를 사용하여 실시하였다.
실시예 3: 형태학적 평가
본 발명자들은 각 가교 결합 그룹의 절편들을 형태학적으로 평가하였다.
총체적 형태론 분석 결과, Glut 그룹의 절편이 노란색을 띠었다는 점만 제외하고, 각 가교 결합 처리 후 간 절편의 총 형태에는 변화가 없었다(도 3A-D).
또한, H&E 염색분석 결과, 각 가교 결합 간 절편에서 미세한 변화가 관찰되지 않았다(도 3E-H).
그러나, SEM 분석 결과, 도 3I-P에 나타낸 바와 같이, 각 가교 결합 간 절편은 콜라겐 섬유의 배열, 밀도 및 다공성(porosity)에 있어 분명한 차이를 나타냈다.
즉, 대조군인 DL 그룹의 경우 콜라겐이 얇아지고 다공성이 소실되었으며; 종래 당업계에 공지된 물질인 Glu 그룹의 경우 대조군에 비해 콜라겐이 보존되긴 하였으나, 불규칙하게 서로 붙어있고, 다공성이 본 발명의 AgNps 그룹에 비해 현저히 낮으며; EDC/NHS(전처리) 그룹의 경우 대조군에 비해 콜라겐이 보존되긴 하였으나, 불규칙하게 서로 붙어있고, 다공성이 본 발명의 AgNps 그룹에 비해 현저히 낮았다.
반면, 본 발명의 AgNps(EDC/NHS + Ag Nps 처리) 그룹의 경우 정상적인 콜라겐 배열 사이에 나노파티클이 붙어있고, 다공성이 다른 군(특히, Glu, EDC/NHS)에 비해 현저히 높았다.
즉, 본 발명의 AgNps(EDC/NHS + Ag Nps 처리) 그룹은 매트릭스를 변형시키지 않고, 콜라겐의 배열과 다공성이 더 잘 유지됨을 알 수 있었다.
실시예 4: 팽창비 평가
본 발명자들은 각 가교 결합 그룹의 절편들의 팽창 정도를 평가하였다.
그 결과, DL 그룹의 팽창비(4.95±0.11)와 비교했을 때, 모든 가교 결합 그룹은 팽창비에서 현저한 감소(P <0.05)를 보였다. 그러나, 가교 결합 그룹 중에서, AgNPs 그룹은 Glut 및 EDC/NHS 그룹(각각 1.580±0.31 및 2.349±0.09)에 비해 가장 높은 팽창비(4.17±0.10)를 보였다.
실시예 5: 시험관내 콜라겐 분해 효소-매개 생분해
본 발명자들은 각 가교 결합 그룹의 절편들의 H&E 염색 및 SEM 이미징을 이용하여 시험관내 콜라겐-매개 생분해 정도를 정성적으로 분석하였다.
가교 결합(cross linking) 후 생체 내 환경과 유사하게 콜라게나아제로 처리하여 생분해(biodegradation) 정도를 평가한 결과, H&E 염색에서 DL 그룹은 완전한 구조적 손실을 나타냈고, 다른 가교 결합 그룹은 중앙정맥이 손상되지 않은 간엽의 다공성 구조를 보존하고 있음을 나타냈다(도 4A-D).
SEM 이미징 결과에서 DL그룹은 여러 구역에 걸쳐 언폴딩되고 미세하게 파괴된 콜라겐 물질이 존재하는 초미세구조의 붕괴를 보여분 반면, 다른 가교 결합 그룹들은 붕괴에 대한 저항력이 더 높았다. 그러나, Glut 그룹에서 콜라겐의 질은 영향을 받았다; 이들의 콜라겐 섬유는 매우 거칠게 나타났다. 게다가, EDC/NHS 그룹은 엄청난 파괴 지역을 보여주었다. 이와는 대조적으로, AgNPs 그룹은 더 높은 질의 매끄러운 표면의 상호연결된 콜라겐 섬유들을 나타냈다(도 4E-H).
즉, AgNps 군이 다른 군(Glu, EDC/NHS)에 비해서도 콜라겐이 부드럽고, 다공성이 유지된 양질의 모습이 보존되었음을 제시한다.
또한, 각 절편의 중량 감소 비율을 확인한 결과, 도 4I에 나타낸 같이, DL 그룹은 중량 감소 비율(39.58±2.7%)에서 다른 가교 결합 그룹과 비교하여 유의한 차이를 나타냈다(P <0.05). Glut 및 AgNPs 그룹은 두 그룹 사이에 유의한 차이없이 최소 중량 감소율(각각 14.8±0.42% 및 17.75±0.46% 각각)을 보였다(P=0.05). EDC/NHS 그룹은 다른 가교 결합 그룹에 비해 중량 감소율(25.50 ±0.66%)이 높았다(P <0.05).
또한, 닌히드린(Ninhydrin) 색도 분석 결과, 도 4J에 나타낸 바와 같이, DL 그룹의 그룹에 비해, Glut 및 AgNPs 그룹의 혼합물의 형성된 보라색의 광 밀도는 최소였고(각각 53.91±2.74% 및 59.45±3.40%) 유의미한 차이가 없었다(P=0.05). EDC/NHS 그룹은 다른 가교 결합 그룹에 비해 광밀도(77.60±2.80%)에서 상당히 높은 비율의 변화를 보였다(P <0.05).
또한, Sircol 콜라겐 분석 결과, 도 4K에 나타낸 바와 같이, Glut 및 AgNPs 그룹은 가장 오래 지속되는 불용성 콜라겐 함량(35.69±2.08 및 34.01±1.35μg/mg 조직)을 보였으며, 이는 DL 그룹(15.07±0.52μg/mg)과 유의하게 차이나는 반면, EDC/NHS 그룹의 나머지 불용성 콜라겐 양은 다른 가교 결합 그룹보다 낮다(26.92±0.81μg/mg 조직)(P<0.05).
즉, 콜라젠 소실 정도를 파악할 수 있는 스케폴드의 중량 감소, 강도 평가 및 콜라겐 잔존량 확인 결과, 본 발명의 AgNps 그룹이 현저하게 효과적이었다.
실시예 6: 세포적합성의 평가
본 발명자들은 각 가교 결합 그룹의 절편들의 세포적합성을 평가하였다.
살아있거나/죽은 세포독성(Live/dead cytotoxicity) 분석 결과, Glut 그룹이 EAhy926 세포주에서 생존율의 감소를 나타내는 몇 개의 빨간색 점들을 보인다는 것을 제외하고, 가교 결합 그룹들은 HepG2와 EAhy926의 세포주에서 어떠한 세포독성 효과도 나타내지 않았다(도 5A-J). 또한, 간접 MTT 분석 결과, EAH926 세포의 생존율에서 상당한 감소를 보인 Glut 그룹을 제외하고, 각 가교 결합 그룹에서는 두 세포주의 생존율에 유의하지 않은 감소가 있었다(P = 0.05)(도 5K, L). 또한, CCK-8 키트에서 얻은 결과에 따르면 AgNP와 EDC/NHS 그룹 모두 HepG2 세포 부착시 유의한 변화(P=0.05)를 보이지 않았다. 또한, DL 그룹에 비해 EEAhy926 세포주의 부착률이 상당히 증가한 반면(P <0.05), Glut 그룹에서 두 세포주의 부착률은 DL 그룹에 비해 상당히 감소하였다(도 5M, N).
즉, Glut 군의 세포 독성이 가장 높았으며, 그 외 그룹들은 대조군인 DL군과 유사한 결과를 보였다. 따라서, 본 발명의 AgNps 그룹은 인공 장기를 만드는데 사용되는 재세포화용 세포들에게 세포독성이 없음을 확인하였다.
실시예 7: 생체 내 이식
본 발명자들은 각 가교 결합 그룹의 절편들의 생체 이식시 효과를 확인하였다.
그 결과, 동물들은 어떠한 감염이나 행동 변화의 징후를 보이지 않았다. 전체적으로 모든 절편은 7일 PI에서 질적으로 비슷한 크기인 반면, 21일 PI에서, 각 가교 결합-탈세포화 절편의 크기는 천연 및 비-가교 결합 탈세포화 절편보다 컸다. 또한, 천연 절편이 가장 작았다(도 6A-E). 7일 PI의 H&E 결과, 천연 그룹의 절편에서는 염증이 심한 반면, 다른 그룹에서는 가벼운 염증 반응을 나타냈고; 21일 PI에서는 천연 그룹을 제외한 모든 그룹에서 가벼운 만성 염증이 나타났다. 더욱이, AgNPs 및 EDC/NHS 그룹은 DL 및 Glut 그룹보다 더 얇은 섬유 캡슐을 보였다(도 6F-O). 중성지방과 림프구를 계산함으로써, AgNPs 그룹은 7일 PI에서 가장 적은 염증 세포를 보여주었는데(하기 표 1), 이는 다른 그룹의 염증 세포에 비해 유의한 차이를 나타냈다(P <0.05). 반면 21일 PI에서는 모든 그룹의 염증 세포 수에서 유의한 차이가 없었다(P=0.05). 단, 중성지방과 림프구 수가 유의하게 증가하였다(P <0.05).
또한, ARS(Alizarin red staining) 염색 결과, 21일 PI에서 석회화 영역이 나타난 Glut 그룹을 제외하고 어떤 그룹에서도 석회화가 검출되지 않았다(도 6P-T).
또한, 7일과 21일 PI에서 대식세포(M1 및 M2)에 대한 IF 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 천연 그룹은 다른 그룹과 비교했을 때 M1 표현형 대식세포를 상당히 많이 발현한 반면, 다른 그룹은 높은 수준의 M2 표현형을 나타냈다. 7일 및 21일 PI에서 M1 / M2 비율을 측정한 결과, AgNP 및 EDC/NHS 그룹은 DL 그룹에 비해 상당한 감소를 보였다(P <0.05). 또한, 다른 그룹에 비해 AgNP 그룹의 비율은 훨씬 더 낮았다(P <0.05).
즉, 각 그룹을 동물의 피하 및 복강내 이식하여, 7일 및 21일째에 염증반응 (생분해 반응)을 평가한 결과, 본 발명의 AgNps 그룹이 가장 염증반응을 일으키지 않았다.
Figure PCTKR2018016924-appb-T000001
실시예 8: 절편 상의 AgNP 유지 평가
본 발명자들은 각 가교 결합 그룹의 절편들의 AgNP의 보존 정도를 확인하였다.
그 결과, UV-vis 분광 측정 분석(spectrophotometry)에서, AgNPs 그룹의 절편을 침지하는 데 사용된 초순수의 회수된 상층액의 UV 가시 스펙트럼을 측정한 결과, 1주 동안 특정 AgNPs 피크가 나타나지 않았다(도 8A).
또한, (7일 동안 콜라겐을 함유한 배지로 배양한) AgNPs 그룹의 절편에 대한 TEM, SEM 및 EDS 분석 결과, 나노입자는 절편 상에 여전히 결합되어 남아 있는 것으로 나타났다(도 8B-D). 배지의 TEM 이미지는 방출된 임의의 나노입자의 크기(≥89.1±28.6nm)가 비-유의하게 감소했다는 것을 보여주고, 이는 이들이 체내에서 비독성임을 의미한다(도 8E). 또한, 21일 동안 이식된 AgNP 그룹의 피하 이식된 절편의 TEM은 이식된 영역에서 나노입자의 존재를 보여주었고, 이는 이식된 절편에서 나노입자가 유지되고 있음을 나타낸다(도 8F).
즉, 본 발명에 따른 나노파티클은 시험관내(in vitro) 뿐만 아니라 생체조직에 이식되었을 때에도 잘 유지됨을 알 수 있었다.
종합적으로, 탈세포화된 간(DLs)에 대한 이상적인 가교제는 아직 밝혀지지 않다. 본 발명자들은 EDC/NHS(ethyl carbodiimide hydrochloride and N-Hydroxysuccinimide)-고정화 시트레이트 은나노입자 (시트레이트-AgNP)와의 가교 결합시킨 후의 돼지 DL의 구조적 개선과 생체 적합성을 평가하였다. 돼지 간 슬라이스를 탈세포화한 다음 인간 간세포 암종 (HepG2)과 EA. hy926 인간 내피 세포주를 사용하여 가장 높은 무독성 농도(5μg/mL)로 최적화한 후 EDC/NHS-고정화 시트레이트-AgNPs (100nm)를 넣었다. 가교 결합 효과는 글루타르알데하이드 및 EDC/NHS에 대해 평가하였다. 상기 결과는 EDC/NHS-고정화 시트레이트-AgNP가 우수한 다공성을 갖는 DL의 콜라겐 섬유의 초-구조를 개선시키고 우수한 세포 적합성을 갖는 생체 외 분해에 대한 DL의 내성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. EDC/NHS-고정화 시트레이트-AgNPs는 체내에서 이식된 돼지 DL 조각에 대한 숙주 염증 반응을 감소시키고 M2 대식세포의 분극을 증가시켰다. 따라서, EDC/NHS-고정화 시트레이트-AgNP를 사용하여 돼지 DLs의 구조적 및 기능적 개선을 달성할 수 있었다.
즉, 본 발명의 방법에 따라 탈세포화된 생체 조직 내 콜라겐 섬유의 구조적 안정성 및 분해 저항성이 증가되어, 이식 세포의 생존율 및 부착능과 같은 생체 적합성이 탁월하게 향상된 탈세포화 조직, 스캐폴드 또는 이를 포함하는 인공 장기를 제공할 수 있다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는, 탈세포화된 조직의 생체적합성 개선 방법:
    (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생체 조직을 탈세포화(decellularization)시키는 단계;
    (b) 상기 탈세포화된 생체 조직을 나노입자로 침지시켜 코팅하는 단계; 및
    (C) 상기 나노입자가 코팅된 생체조직을 가교결합제로 고정화(fixation)시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 나노입자는 은나노입자, 금나노입자, 백금나노입자, 이리듐나노입자, 로듐나노입자, 팔라듐나노입자, 구리나노입자 및 아연나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin), 카보디이미드 (carbodiimide) 및 EDC/NHS (1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethyl carbodiimide/Nhydroxysuccinimide)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 화합물을 이용하여 가교결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 은나노입자이며, 상기 은나노입자는 시트레이트(citrate)에 은염(Ag salt)을 혼합하여 제조된 시트레이트(citrate)-은나노입자(AgNPs)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 시트레이트(citrate)-은나노입자(AgNPs)는 0.5 ug/ml 내지 20 ug/ml의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 시트레이트(citrate)-은나노입자(AgNPs)는 EDC/NHS로 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 생체 조직은 간, 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 비장, 방광, 폐 또는 피부인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonicsolution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 나노입자 및 가교결합제를 포함하는, 탈세포화된 조직의 생체적합성 개선용 배지 조성물.
PCT/KR2018/016924 2017-12-29 2018-12-28 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법 WO2019132619A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2017-0183408 2017-12-29
KR20170183408 2017-12-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019132619A1 true WO2019132619A1 (ko) 2019-07-04

Family

ID=67067954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/016924 WO2019132619A1 (ko) 2017-12-29 2018-12-28 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102148759B1 (ko)
WO (1) WO2019132619A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113041216A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 福州大学 一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶及其制备方法
CN115462366A (zh) * 2021-06-11 2022-12-13 中国科学院理化技术研究所 一种液态金属复合材料及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010033860A1 (en) * 2008-09-18 2010-03-25 The Curators Of The University Of Missouri Bionanocomposite for tissue regeneration and soft tissue repair
US20160106886A1 (en) * 2013-05-20 2016-04-21 Ramot At Tel-Aviv University Ltd Metal-coated scaffolds for tissue engineering

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2827803A4 (en) * 2012-03-22 2015-11-04 Univ Missouri NANOVER FIBERS FOR SOFTWARE SAVING AND SUBSTITUTION

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010033860A1 (en) * 2008-09-18 2010-03-25 The Curators Of The University Of Missouri Bionanocomposite for tissue regeneration and soft tissue repair
US20160106886A1 (en) * 2013-05-20 2016-04-21 Ramot At Tel-Aviv University Ltd Metal-coated scaffolds for tissue engineering

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEEKEN, C. R.: "Assessment of the biocompatibility of two novel, bionanocomposite scaffolds in a rodent model", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH PART B: APPLIED BIOMATERIALS, vol. 96b, no. 2, 28 December 2010 (2010-12-28), pages 351 - 359, XP055624488 *
RATH, G.: "Collagen nanofiber containing silver nanoparticles for improved wound-healing applications", JOURNAL OF DRUG TARGETING, 21 October 2015 (2015-10-21), pages 520 - 529 *
SALEH, T. M.: "Incorporation of nanoparticles into transplantable decellularized matrices: Applications and challenges", THE INTERNATIONAL JOURNAL OF ARTIFICIAL ORGANS, 2018, pages 421 - 430 *
SALEH, T: "Silver nanoparticles improve structural stability and biocompatibility of decellularized porcine liver", ARTIFICIAL CELLS, NANOMEDICINE, AND BIOTECHNOLOGY, vol. 46, November 2018 (2018-11-01), pages S273 - S284, XP055624492 *
SHEVACH, M.: "Gold nanoparticle-decellularized matrix hybrids for cardiac tissue engineering", NANO LETTERS, vol. 14, no. 10, 1 September 2014 (2014-09-01), pages 5792 - 5796, XP055624490 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113041216A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 福州大学 一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶及其制备方法
CN113041216B (zh) * 2021-03-26 2022-07-08 福州大学 一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶及其制备方法
CN115462366A (zh) * 2021-06-11 2022-12-13 中国科学院理化技术研究所 一种液态金属复合材料及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102148759B1 (ko) 2020-08-27
KR20190082141A (ko) 2019-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1856246B1 (en) Natural tissue-derived decellularized matrix and methods of generating and using same
Lu et al. Thin collagen film scaffolds for retinal epithelial cell culture
US9707256B2 (en) Methods of making endothelial scaffolds
US20220347350A1 (en) Patch graft compositions for cell engraftment
JP5232636B2 (ja) 組織の工作された血管
US8628964B2 (en) Fetal pulmonary cells and uses thereof
WO2019132619A1 (ko) 고정화된 나노입자를 이용한 탈세포화 조직의 생체적합성 개선 방법
AU2016298145B2 (en) Vascular cast-based scaffolds and methods of making the same
Hazard et al. Demonstrating collagen tendon fibril segments involvement in intrinsic tendon repair
WO2021071307A1 (ko) 신규한 다공성 스캐폴드 및 이의 제조방법
Robain et al. GABAergic neurons of the hippocampus: development in homotopic grafts and in dissociated cell cultures
Soto-Suazo et al. Distribution and space-time relationship of proteoglycans in the extracellular matrix of the migratory pathway of primordial germ cells in mouse embryos
Schraermeyer Effects of chloroquine on the photosensory membrane turnover and the ultrastructure of lysosome-related bodies of the crayfish photoreceptor
JP2022126281A (ja) 免疫抑制剤なしで拒絶制御を可能にする脂肪由来間葉系幹細胞の誘導方法ならびに移植方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18897356

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18897356

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1