WO2019115970A1 - Chitine et procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan par voie enzymo-chimique - Google Patents

Chitine et procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan par voie enzymo-chimique Download PDF

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WO2019115970A1
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WO
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chitin
chitosan
insects
cuticles
weight
Prior art date
Application number
PCT/FR2018/053285
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Lorena SANCHEZ
Cecilia SOCOLSKY
Valérie ALEZRA
Corentin LE BERRE
Bénédicte LORETTE
Sophie Laurent
Nathalie BEREZINA
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Ynsect
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a chitin, a chitosan and a process for preparing chitin and / or chitosan from insects.
  • chitin means a polymer composed mainly of glucosamine and N-acetyl-glucosamine units, said units possibly being optionally substituted with amino acids and / or peptides.
  • polymer comprises between 55% and 98% by weight, preferably between 75 and 90% by weight of glucosamine and N-acetyl-glucosamine units.
  • Chitin is the second most synthesized polymer in the world after cellulose. Indeed, chitin is synthesized by many species of the living world: it is partly the exoskeleton of crustaceans and insects and the side wall that surrounds and protects mushrooms. More particularly, in insects, chitin thus constitutes 3 to 60% of their exoskeleton.
  • chitosan is meant according to the present invention the deacetylation products of chitin.
  • the usual limit between chitosan and chitin is determined by the degree of acetylation: a compound with a degree of acetylation of less than 50% is called chitosan, beyond that, a compound with a degree of acetylation greater than 50% is named chitin.
  • chitin and / or chitosan are numerous: cosmetic (cosmetic composition), medical and pharmaceutical (pharmaceutical composition, treatment of burns, biomaterials, corneal dressings, surgical threads), dietary and food (human food including oenology and food animal, more specifically in aquaculture and poultry farming), technique (filtering agent, texturizer, flocculant or adsorbent especially for the filtration and depollution of water), etc.
  • cosmetic cosmetic composition
  • medical and pharmaceutical pharmaceutical composition, treatment of burns, biomaterials, corneal dressings, surgical threads
  • dietary and food human food including oenology and food animal, more specifically in aquaculture and poultry farming
  • technique filtering agent, texturizer, flocculant or adsorbent especially for the filtration and depollution of water
  • chitin and / or chitosan are biocompatible, biodegradable and non-toxic materials.
  • chitin and chitosan are obtained from the different species synthesizing chitin, such as those mentioned above, and especially from crustaceans or insects.
  • chitin and chitosan from insects, the latter being an abundant and renewable raw material.
  • Obtaining high purity chitin and / or chitosan is sought in many applications, such as, for example, in cosmetics and pharmaceuticals.
  • High purity limits especially the risk of allergy, local or generalized fever, relating to the application of cosmetic or pharmaceutical products containing chitin and / or chitosan.
  • Such reactions may indeed be caused by impurities such as residual amino acids, ashes or lipids.
  • the invention therefore relates to a chitin whose purity by difference is greater than 97.75%.
  • the known impurity contents namely amino acids, lipids and ashes
  • the value of absolute purity 100%)
  • the chitin according to the invention which has a high difference purity, thus has low levels of amino acids, lipids and ashes.
  • the chitin according to the invention advantageously has a purity with a difference greater than or equal to 98%, preferably greater than or equal to 98.1%.
  • the amino acid content of the chitin according to the invention is preferably determined according to the method NF EN ISO 13904 for tryptophan and NF EN ISO 13903 for the other amino acids.
  • the relative abundance can be calculated by relating the content of each amino acid to the total amino acid content.
  • the method of determining the ash content is well known to those skilled in the art. Preferably, this content is determined according to the NF V18-101 standard.
  • the chitin according to the invention comprises less than 1, 2% by weight of amino acids on the total dry weight of chitin.
  • the chitin according to the invention comprises less than 1% by weight, more preferably less than 0.9% by weight, even more preferably less than 0.8% by weight, and even more preferably less than 0.75% by weight. by weight of amino acids on the total dry weight of chitin.
  • the residual amino acids present in the chitin according to the invention are: Threonine, Serine, Glycine, Glutamic acid, Alanine, Cysteine, Valine, Isoleucine, Aspartic acid, Leucine, Tyrosine, Phenylalanine, Histidine, Lysine, Tryptophan or a combination two or more of these.
  • the residual amino acids present in the chitin according to the invention consist of: Cysteine, Valine, Histidine, Lysine, Tryptophan or a combination of two or more thereof, preferably in a combination of all these amino acids.
  • the chitin according to the invention comprises less than 2% by weight of ash on the total dry weight of chitin.
  • the chitin according to the invention preferably comprises less than 1, 6% by weight, more preferably less than 1, 4% by weight, still more preferably less than 1, 2% by weight of ash on the total dry weight of chitin.
  • the chitin according to the invention comprises less than 1% by weight, preferably less than 0.5% by weight, more preferably less than 0.2% by weight of lipids on the total dry weight of chitin.
  • the chitin according to the invention does not comprise lipids.
  • the chitin according to the invention has a molecular mass of greater than or equal to 450 kg.MuM, preferably greater than or equal to 500 kg. mol 1 , more preferably greater than or equal to 600 kg. mol 1 , even more preferably greater than or equal to 650 kg. mol 1 .
  • the molecular weight is determined by measuring the viscosity by falling ball.
  • the molecular weight is determined according to a method of measuring the falling ball viscosity based on that described in the following publication: "Pacheco et al. ; Structural characterization of chitin and chitosan obtained by biological and chemical methods; Biomacromolecules; 12, 3285-3290, 201 1.
  • the chitin according to the invention is an isolated chitin.
  • isolated chitin we mean a chitin that has been isolated or extracted from its natural environment.
  • chitin is isolated or extracted from insects, more specifically cuticles of insects.
  • chitin has a difference purity greater than or equal to 98.0% and advantageously a molar mass of greater than or equal to 800 kg. mol 1 , a purity with a difference greater than or equal to 98.5% and advantageously a molar mass greater than or equal to 850 kg. mol 1 .
  • chitin advantageously comprises less than 0.35% by weight of amino acids on the total dry weight of chitin, and / or less than 0.9% by weight of ash on the total dry weight of chitin, and / or less than 0.3% by weight of lipids on the total dry weight of chitin.
  • the invention also relates to a chitosan whose purity by difference is greater than 97.75%.
  • the difference purity of the chitosan according to the invention is greater than or equal to 98%, more preferably greater than or equal to 98.1%.
  • the difference purity, amino acid content, ash content, and lipid content of chitosan according to the invention are measured in the same manner as indicated above for chitin.
  • the chitosan according to the invention comprises less than 0.8% by weight of amino acids on the total dry weight of chitosan.
  • the chitosan according to the invention comprises less than 0.6% by weight, and more preferably less than 0.4% by weight of amino acids on the total dry weight of chitosan.
  • the residual amino acids present in the chitosan according to the invention are: Threonine, Tyrosine, Lysine and / or Tryptophan.
  • the chitosan according to the invention comprises less than 2% by weight of ash on the total dry weight of chitosan.
  • the chitosan according to the invention preferably comprises less than 1.8% by weight, more preferably less than 1.5% by weight, and even more preferably less than 1.0% by weight of ash on the total dry weight of chitosan.
  • the chitosan according to the invention comprises less than 1% by weight, preferably less than 0.7% by weight, more preferably less than 0.5% by weight of lipids on the total dry weight of chitosan.
  • the chitosan according to the invention has a molecular mass greater than or equal to 250 kg. mol -1 , preferably greater than or equal to 300 kg. mol -1 , more preferably greater than or equal to 350 kg. mol -1 , even more preferably greater than or equal to 400 kg. mol -1 .
  • the chitosan according to the invention is an isolated chitosan.
  • isolated chitosan we mean a chitosan that has been obtained from a chitin isolated or extracted from its natural environment.
  • chitosan is obtained from a chitin isolated or extracted from insects, more specifically cuticles of insects.
  • the chitosan has a difference purity greater than or equal to 97.9% and a molar mass greater than or equal to 480 kg. mol 1 , more particularly, a difference purity of greater than or equal to 98.8% and a molar mass greater than or equal to 540 kg. mol 1 .
  • the chitosan advantageously comprises less than 0.4% by weight of amino acids on the total dry weight of chitosan, and / or less than 0.6% by weight of ash on the total dry weight of chitosan, and / or less than 0.2% by weight of lipids on the total dry weight of chitosan.
  • the invention also relates to a process for obtaining chitin and / or chitosan, from insects, comprising the following steps:
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention makes it possible to obtain a chitin and / or a chitosan of high purity.
  • the process according to the invention makes it possible to reduce certain disadvantages inherent in the subsequent basic treatment step, such as, for example, reducing the amount of base used during this step.
  • This step also allows the recovery of a hydrolyzate.
  • the process according to the invention does not comprise an oxidation step, such as, for example, a treatment with hydrogen peroxide.
  • insects means insects at any stage of development, such as adult, larval, or nymph stage (intermediate stage).
  • the insects used in the method according to the invention are at a larval stage when the insects are holometabolous, at a nymphal stage (intermediate stage) when the insects are heterometabolic, or if necessary at an adult stage.
  • insects used in the process according to the invention can be edible.
  • the preferred insects for carrying out the method according to the invention are, for example, Coleoptera, Diptera, Lepidoptera (such as, for example, Galleria mellonella), Isoptera, Orthoptera, Hymenoptera, Bats, Hemiptera. , Heteroptera, Ephemeroptera and Mecoptera, preferably Coleoptera, Diptera, Orthoptera, Lepidoptera or mixtures thereof, more preferably Coleoptera.
  • the beetles preferably used in the process according to the invention belong to the families Tenebrionidae, Melolonthidae, Dermestidae, Coccinellidae, Cerambycidae, Carabidae, Buprestidae, Cetoniidae, Dryophthoridae, or mixtures thereof.
  • Tenebrio molitor More preferably, these are the following beetles: Tenebrio molitor, Alphitobius diaperinus, Zophobas morio, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Pachnoda marginata and Rhynchophorus ferrugineus, or mixtures thereof. Even more preferentially, it is Tenebrio molitor.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention comprises a step of separating the cuticles from the soft part of the insects.
  • the cuticle is the outer layer (or exoskeleton) secreted by the epidermis of insects. It usually consists of three layers: the epicuticle, the exocuticle and the endocuticle.
  • soft part refers to the flesh (including muscles and viscera) and the juice (including body fluids, water and haemolymph) of the insects. In particular, the soft part does not consist in the juice of insects.
  • the separation of the cuticles from the soft part of insects can be carried out using any type of suitable separator.
  • the separation of cuticles from the soft part is carried out using a band separator.
  • the separation of cuticles from the soft part is carried out using a filter press.
  • step 2 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 2 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • This separation of the cuticles from the soft part of the insect makes it possible in particular to separate the chitin from the soft part.
  • the cuticles obtained at the end of this separation step have a high chitin content of the order of 10 to 30% by weight on the total weight of cuticles, as indicated below.
  • the step of separating cuticles from the soft part is carried out without any prior step of grinding insects, particularly in the form of particles, has been performed.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention advantageously comprises a slaughtering step prior to the step of separating the cuticles from the soft part.
  • step 1 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 1 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • step 1 of slaughtering the insects are directly used for the implementation of step 2 of cuticle separation of the soft part of the insects, that is to say that the insects are not subjected to no treatment, such as grinding, freezing or dehydration between step 1 and step 2.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention comprises a step of enzymatic hydrolysis of cuticles by a protease, to obtain a solid residue, following the step of separating the cuticles from the soft part of the insects.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out for a period of between 3 and 10 hours, preferably between 4 and 8 hours, such as for example of the order of 6 hours.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a temperature of between 40 and 80 °, preferably between 50 and 70 °, such as for example about 60 ° C.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a pH of between 6 and 8, preferably between 6.5 and 7.5.
  • the enzymatic hydrolysis can be carried out with a single protease or alternatively with a mixture of enzymes containing at least one protease, more preferably a mixture of enzymes containing several proteases, such as a mixture containing an endoprotease and an exoprotease, or a protease and a polysaccharase.
  • the enzyme or enzyme mixture is introduced in an amount of 0.2 at 10% by weight, preferably from 1 to 8% by weight, more preferably from 3 to 7% by weight relative to the weight of (wet) cuticles subjected to enzymatic hydrolysis.
  • the amount of enzyme or mixture of enzymes introduced is equivalent to an activity of between 2000 and 5000 SAPU ("Spectrophotometric Acid Protease Unit"), preferably between 3000 and 4000 SAPU, per 100 g wet weight, with a moisture of 30 to 70%, substrate to be processed, that is to say cuticles of insects.
  • SAPU Specific Acid Protease Unit
  • step 3 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 3 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention comprises a step of basic treatment of the solid residue, following the step of enzymatic hydrolysis of the cuticles.
  • the basic treatment is carried out using a strong base.
  • the strong base is chosen from sodium hydroxide or sodium hydroxide, potassium hydroxide, and ammonium hydroxide.
  • the strong base is sodium or potassium hydroxide, more preferably sodium hydroxide.
  • the base used for the basic treatment is in the form of an aqueous basic solution.
  • the molar concentration of the base in aqueous solution is advantageously between 0.1 and 5 mol.l -1 , preferably between 0.5 and 2 mol.l -1 , even more preferably equal to 1 mol. .L -1 (for example molar soda).
  • the concentration of the base is adjusted so as to obtain a base ratio by dry weight in g: solid residue by dry weight in g: water by weight in g between 0.1: 0.45: 2 and 0, 8: 0.45: 15, more preferably between 0.3: 0.45: 8 and 0.7: 0.45: 12, such as for example about 0.36: 0.45: 9.23 .
  • step 4 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 4 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • the basic treatment step of the solid residue is followed by a step of recovering chitin.
  • step 5 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 5 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention further comprises a step of washing the chitin.
  • step 6 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 6 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention further comprises a step of drying the chitin.
  • step 7 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 7 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • chitin may be marketed in the form of a powder
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention may optionally comprise a step of grinding chitin.
  • the grinding step can also be carried out in order to promote the deacetylation reaction, which makes it possible to prepare chitosan from chitin.
  • the deacetylation step which aims to convert chitin into chitosan, is therefore implemented only when the desired product is chitosan.
  • the deacetylation step of chitin is followed by a step of recovering chitosan.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention further comprises a step of washing the chitosan.
  • step 1 1 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 1 1 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention further comprises a step of drying the chitosan.
  • step 12 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is more fully described in step 12 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below.
  • steps 6 to 8, 11 and 12 mentioned above, and described more fully in the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention below, are optional.
  • the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention advantageously comprises one or more of these steps, preferably all these steps.
  • steps 1 to 12 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention are not limited to an implementation in said detailed process, but apply to all embodiments of the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention described in the present application, regardless of the number of steps provided in these embodiments.
  • the invention therefore relates more particularly to a particular method for obtaining chitin, from insects, comprising the following steps:
  • This process therefore comprises steps 1 to 5 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan below and advantageously one or more of the optional steps 6 to 8 of this detailed method.
  • the invention also relates to chitin obtainable by the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention, or by the particular method for obtaining chitin according to the invention.
  • the invention therefore also relates to a particular method for obtaining chitosan, from insects, comprising the following steps:
  • This process therefore comprises steps 1 to 5, 9 and 10 of the detailed process for obtaining chitin and / or chitosan below and advantageously one or more optional steps 6 to 8, 11 and 12 of this detailed process.
  • the invention also relates to the chitosan obtainable by the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention, or by the particular method for obtaining chitosan according to the invention.
  • Chitin and / or chitosan according to the invention as well as chitin and / or chitosan capable of being obtained by a process according to the invention may advantageously be used in various applications:
  • biomaterials for treating burns as second skin for producing corneal dressings or surgical threads
  • Step 1 Slaughtering insects
  • This slaughtering stage 1 may advantageously be carried out by thermal shock, such as boiling or bleaching.
  • This step 1 makes it possible to kill the insects while lowering the microbial load (reduction of the risk of deterioration and health) and by inactivating the internal enzymes of the insects that can trigger an autolysis, and thus a rapid browning of these.
  • the insects preferably the larvae
  • the insects are thus scalded with water for 2 to 20 minutes, preferably 5 to 15 minutes.
  • the water is at a temperature between 87 to I OO ' ⁇ , preferably 92-95 C.
  • the quantity of water introduced during scalding is determined as follows: the ratio of the volume of water in ml to the weight in g of insect is preferably between 0.3 and 10, more preferably between 0 and 10. , 5 and 5, still more preferably between 0.7 and 3, even more preferably of the order of 1.
  • insects preferably larvae
  • water or by steam nozzles or steam bed
  • nozzles or steam bed at a temperature of between 80 and 10 ° C, preferably between 87 and 105 ° C, more preferably between 95 and 100 ° C, still more preferably 98 ° C or at the water at a temperature between 90 and 100 ° C, preferably between 92 and 95 ° C (by spray nozzles) or in mixed mode (water + steam) at a temperature between 80 and 130 ° C, preferably between 90 and 120 ' ⁇ , more preferably between 95 and 105 ° C, even more preferably 98 q C.
  • bleaching is advantageously carried out in forced-circulation steam whiteners ("forced steaming").
  • the residence time in the bleaching chamber is between 5 seconds and 15 minutes, preferably between 1 and 7 minutes.
  • step 1 of slaughtering the insects are directly used for the implementation of step 2 of cuticle separation of the soft part of the insects, that is to say that the insects are not subjected to no treatment, such as grinding, freezing or dehydration between step 1 and step 2.
  • the insects are beetles and in particular Tenebrio molitor.
  • Step 2 aims to separate the cuticles from the soft part of insects.
  • the separation of the cuticles from the soft part of insects can be carried out using any type of suitable separator.
  • the separation of cuticles from the soft part is carried out using a band separator.
  • band separator is meant a device for separating the solid portion of the soft portion of a product, and which comprises a clamping band (or pressing belt) and a perforated drum.
  • a belt separator may comprise a clamping band and a perforated drum, the clamping band surrounding at least a portion of the perforated drum.
  • the clamping band allows the application and application of the insects against the perforated drum so as to press the soft part of the insects through the perforations of the drum while the solid part of the insects (cuticles) remains. outside the drum.
  • the cuticles can then be recovered using a scraper knife.
  • band separators from the Baader company, such as the band separators 601 to 607 ("soft separator 601 to 607"), or BFD Corporation SEPAmatic® Band Separators (410-4000V range).
  • the diameter of the perforations of the drum is between 0.5 and 3 mm, preferably between 1 and 2 mm.
  • the skilled person is able to determine the pressure to be exerted for the separation of cuticles from the soft part of the insects.
  • the separation of cuticles from the soft part is carried out using a filter press.
  • a filter press is composed of filter cloths, and allows separation according to the pressure filtration principle.
  • the filter press used in the process for obtaining chitin and / or chitosan according to the invention is a band-press filter.
  • a band press filter has two perforated clamping bands (also called “filter cloths"). The insects are placed between the two perforated clamping bands so as to press the soft part of the insects through the perforations of the clamping bands, while the solid part of the insects remain between the two perforated clamping bands.
  • belt press filter or “belt press”
  • band press filters from the company ATR
  • This insect separation step differs from a conventional pressing that can be achieved for example with a single-screw or twin-screw press in that it allows a separation (net) of the soft part and cuticles of insects and not a separation of a juice from a solid fraction.
  • the separation of cuticles from the soft part of the insects is carried out using a band separator.
  • the cuticles obtained in step 2 comprise between 10 and 30%, preferably between 15 and 25% by weight of chitin, on the total dry weight of cuticles.
  • the determination of the chitin content is carried out by extraction thereof.
  • a method for determining chitin that can be used is AOAC 991 .43.
  • the separation of cuticles from the part soft beetles and especially Tenebrio molitor is performed using a band separator.
  • Step 3 enzymatic hydrolysis of cuticles by a protease
  • the enzymatic hydrolysis is carried out by a protease or peptidase.
  • protease or peptidase.
  • the names or suffixes "peptidase” and “protease” are used interchangeably to designate an enzyme lysing a peptide bond of proteins.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out for a period of between 3 and 10 hours, preferably between 4 and 8 hours, such as for example of the order of 6 hours.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a temperature between 40 and 80 ° C, preferably between 50 and 70 ° C, such as for example about 60 ° C.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a pH of between 6 and 8, preferably between 6.5 and 7.5.
  • the enzymatic hydrolysis can be carried out with a single protease or alternatively with a mixture of enzymes containing at least one protease, more preferably a mixture of enzymes containing several proteases, such as a mixture containing an endoprotease and an exoprotease, or a protease and a polysaccharase.
  • the protease is selected from the group consisting of aminopepidases, metallocarboxypeptidases, serine endopeptidases, cysteine endopeptidases, aspartic endopeptidases, metalloendopeptidases, more preferably the protease is selected from serine endopeptidases, such that, for example, Alcalase 2.5L PF or Prolyve NP.
  • the enzymes can be chosen from the following:
  • the enzyme or the enzyme mixture is introduced in an amount ranging from 0.2 to 15% by weight, preferably from 0.2 to 10% by weight, more preferably from 1 to 8% by weight. more preferably from 3 to 7% by weight relative to the weight of (wet) cuticles subjected to enzymatic hydrolysis.
  • the amount of enzyme or mixture of enzymes introduced is equivalent to an activity of between 2000 and 5000 SAPU ("Spectrophotometric Acid Protease Unit"), preferably between 3000 and 4000 SAPU, per 100 g wet weight, with a moisture of 30 to 70%, substrate to be processed, that is to say cuticles of insects.
  • SAPU Specific Acid Protease Unit
  • This enzymatic activity is measured on the basis of the principle of the measurement of tyrosine liberation at 275 nm during the hydrolysis of casein by a proteolytic enzyme (Valley research SAPU Assay method, by Karen PRATT).
  • SAPU / g a spectrophotometric unit of protease
  • the enzymatic activity can also be expressed using the specific activity of an enzyme.
  • the specific activity of an enzyme is the catalytic activity expressed in International Unit (LU) per unit mass of enzyme (eg I.U./g enzyme).
  • the concentration of the enzyme or enzyme mixture used is between 100 and 250 LU. per gram of cuticle dry matter, preferably between 120 and 180 I.U. per gram of cuticle dry matter, more preferably between 120 and 150 I.U. per gram of cuticle dry matter.
  • the enzymatic hydrolysis step is carried out in the presence of water, such as fresh water.
  • the quantity of water used during the enzymatic hydrolysis is determined as follows: the ratio of the volume of water in L to the weight in g of wet cuticles is preferably between 0.005 and 5, more preferentially between 0.01 and 5, such as for example about 0.01, or alternatively between 0.05 and 2, or between 0.1 and 1.
  • the enzymatic hydrolysis step is advantageously carried out with stirring.
  • the enzymatic hydrolysis step is carried out for 5 to 7 hours, such as, for example, approximately 6 hours, at a temperature of 50 to 70 ° C., such as for example of approximately 60 ° C.
  • the enzyme is a serine endopeptidase, such as for example Alcalase 2.5L PF.
  • the enzyme is introduced at a concentration of between 120 and 150 I.U., for example of the order of 120 I.U. per gram of cuticle dry matter.
  • the amount of water used during this enzymatic hydrolysis step is of the order of 0.01 L of water per g of wet cuticles.
  • reaction medium is then separated in order to recover a solid residue comprising chitin and a hydrolyzate.
  • the separation step can be carried out by any suitable separation method. These methods are known to those skilled in the art.
  • the recovered solid residue is advantageously homogenized, for example by mixing.
  • Step 4 Basic treatment of the solid residue
  • step 4 the solid residue recovered at the end of step 3 is subjected to a basic treatment, that is to say that it is brought into contact with a base (or basic agent).
  • the basic treatment is carried out using a strong base.
  • the strong base is chosen from sodium hydroxide or sodium hydroxide, potassium hydroxide, and ammonium hydroxide.
  • the strong base is sodium or potassium hydroxide, more preferably sodium hydroxide.
  • the base used for the basic treatment is in the form of an aqueous basic solution.
  • the molar concentration of the base in aqueous solution is advantageously between 0.1 and 5 mol.l -1 , preferably between 0.5 and 2 mol.l -1 , even more preferably equal to 1 mol. .L -1 (for example molar soda).
  • the concentration of the base is adjusted so as to obtain a base ratio by dry weight in g: solid residue by dry weight in g: water by weight in g between 0.1: 0.45: 2 and 0, 8: 0.45: 15, more preferably between 0.3: 0.45: 8 and 0.7: 0.45: 12, such as for example about 0.36: 0.45: 9.23 .
  • the basic treatment is advantageously carried out for a period of between 5 and 60 hours, preferably for a period of between 5 and 50 hours, such as for example 48 hours.
  • the duration of the basic treatment may advantageously be adapted according to the properties of the chitin that one wishes to obtain, such as its whiteness (white color).
  • the duration of the basic treatment may be less than 40 hours, or even less than 30 hours, such as for example 24 hours.
  • the basic treatment is carried out at a temperature of between 60 and 100%, preferably between 80 and 100%, more preferably about 90 ° C.
  • reaction medium may, for example, be heated using an oil bath, a heat exchanger or a jacket heating system, so as to achieve the desired temperature.
  • the basic treatment step is advantageously carried out with stirring.
  • the basic treatment step is carried out using sodium hydroxide in the form of an aqueous basic solution.
  • concentration of sodium hydroxide in aqueous solution is equal to 1 mol.L 1 .
  • the ratio of sodium hydroxide in dry weight to g: solid residue in dry weight in g: water in weight in g is of the order of 1: 1: 25.
  • the duration of this basic treatment is about 48 hours.
  • this basic treatment is carried out at a temperature of about 90 ° C.
  • the basic treatment step is carried out using potassium hydroxide in the form of an aqueous basic solution.
  • concentration of potassium hydroxide in aqueous solution is equal to 1 mol.L -1 .
  • the ratio of potassium hydroxide to dry weight in g: solid residue in dry weight in g: water in weight in g is of the order of 1, 4: 1: 25.
  • the duration of this basic treatment is about 48 hours.
  • this basic treatment is carried out at a temperature of about 90 ° C.
  • Step 5 of recovering chitin, from the reaction medium obtained at the end of step 4 can be carried out by any appropriate recovery method. These methods are known to those skilled in the art.
  • the recovery of chitin is carried out by filtration.
  • the chitin recovered at the end of step 5 is then optionally washed.
  • Step 6 of washing the chitin is advantageously carried out using tap water, preferably warm, that is to say whose temperature is between 15 and 60 ° C.
  • the washing is carried out until the pH is neutralized.
  • the chitin is then optionally dried.
  • the drying step is carried out at a temperature between 40 and 105 ° C, preferably at about 60 ° C.
  • the drying step is carried out for a period of between 10 and 80 hours, preferably for about 24 hours.
  • the drying is carried out using a drying oven, such as model FED 1 15 or FP53 from Binder®.
  • the chitin obtained at the end of step 5, 6 or 7 is then optionally ground, for example in an ultracentrifuge sieve mill.
  • chitin is preferentially milled to a particle size of less than 300 ⁇ m, such as less than 260 ⁇ m, less than 200 ⁇ m, or less than 160 ⁇ m.
  • This step is implemented only in the case where obtaining chitosan is desired.
  • the chitin is then placed in a reactor where a base is added.
  • the deacetylation of chitin is carried out using a strong base.
  • the strong base is chosen from sodium hydroxide or sodium hydroxide, potassium hydroxide, and ammonium hydroxide.
  • the strong base is sodium or potassium hydroxide, more preferably sodium hydroxide.
  • the base used for the basic treatment is in the form of an aqueous basic solution, preferably a concentrated aqueous basic solution.
  • the molar concentration of the base in aqueous solution is advantageously between 4 and 25 mol.L 1 , preferably between 6 and 22 mol.L 1 , more preferably between 8 and 19 mol.L 1 , still more preferably between 10 and 19 mol. Even more preferably between 12.5 and 19 mol.L 1 .
  • the concentration of the base is adjusted so as to obtain a base ratio by dry weight in g: chitin dry weight in g: water by weight in g between 18: 1: 35 and 55: 1: 55, such for example between 18: 1: 35 and 30: 1: 55, or about 24: 1: 45, more preferably about 38: 1: 50.
  • the most preferred values are especially those to be used when of the use of sodium hydroxide.
  • the deacetylation is carried out for 1 to 24 hours and preferably 2 to 18 hours.
  • this deacetylation is carried out twice, with an intermediate step of neutralizing the pH.
  • the deacetylation can be carried out in two times two hours, that is to say for 4 hours, with an intermediate intermediate pH neutralization step.
  • the deacetylation temperature is advantageously between 80 and 150.degree. C., preferably between 90 and 120.degree. C. and more preferably at 100.degree.
  • step 10 of recovering chitosan from the reaction medium obtained at the end of step 9 can be carried out by any appropriate recovery method. These methods are known to those skilled in the art.
  • the recovery of chitosan is carried out by filtration.
  • the recovered chitosan is in powder form.
  • Chitosan can then undergo any operation known to those skilled in the art to functionalize it, including the addition of radicals (carboxylation, hydroxylation ).
  • the chitosan recovered at the end of step 10 is then optionally washed.
  • Step 1 1 of washing the chitosan is advantageously carried out using tap water.
  • this water has a temperature between 15 and 60 ° C.
  • the washing is carried out until the pH is neutralized.
  • the chitosan which may be in the form of a powder, is then optionally dried between 30 and 60%, advantageously between 50 and 70.degree. 60' ⁇ , to obtain chitosan or a chitosan powder having a dry matter content greater than 85%, more particularly greater than 90%.
  • the drying step is carried out for a period of between 10 and 80 hours, preferably for about 24 hours.
  • the drying is carried out using a drying oven, such as model FED 1 15 or FP53 from Binder®.
  • Tenebrio molitor larvae were used. On receipt of the larvae, they can be stored at 4 ° C for 0 to 15 days in their breeding tanks before slaughter without major degradation. The weight of the larvae (age) used is variable and therefore their composition may vary, as illustrated in Table 2 below:
  • Table 2 Biochemical composition of larvae of Tenebrio molitor according to their weight.
  • Live larvae (+ 4 ° C to + 25 ° C) are conveyed in a thickness of between 2 and 10 cm, on a perforated belt (1 mm) to a bleaching chamber.
  • the insects are thus bleached with steam (nozzles or steam bed) at 98 ° C under forced ventilation or with water at 92-95 ' ⁇ (spray nozzles) or in mixed mode (water + steam).
  • the residence time in the bleaching chamber is between 5 seconds and 15 minutes, ideally 5 minutes.
  • the temperature of the larvae at the bleaching outlet is between 75 ' ⁇ and
  • Step 2 Separation of the soft part of cuticles from insects
  • the larvae, once blanched, are conveyed to the feed hopper of a band separator to separate cuticles from the soft part of the larvae.
  • the separation takes place immediately after slaughtering so that the larvae do not have time to cool to room temperature.
  • the band separator used is a 601 band separator from Baader.
  • the diameter of the perforations of the drum is 1, 3 mm.
  • the soft part of the insects is recovered in a tank.
  • the cuticles are recovered using a scraper knife.
  • the dry matter percentage of the cuticles is about 35-45%.
  • Step 3 enzymatic hydrolysis of cuticles by a protease
  • Heidolph® RZR1 Heidolph® RZR1
  • reaction medium obtained at the end of step 4 is then filtered (SEFAR Filter MEDIFAB® 03-60 / 42) so as to recover the chitin.
  • the chitin recovered at the end of step 5 is then rinsed with warm tap water until the pH is neutralized.
  • the chitin is then dried for 24 hours, at 60 ° C, in a drying oven (Binder®, model FP53).
  • the percentage of dry matter and the moisture content are calculated as follows.
  • the percentage of dry matter is obtained by making the ratio of the dry mass of chitin after drying on the mass of chitin before drying.
  • the moisture content is obtained by removing the percentage of dry matter to the value of 100%.
  • This measurement method can also be used to measure the percentage of dry matter and the moisture content of the cuticles.
  • the ash content was determined according to the NF V18-101 standard method.
  • the protein content is obtained by the Dumas method, with the conversion coefficient of 6.25, adapted from the NF EN ISO 16634-1 standard.
  • the lipid content is obtained by a method adapted from EC regulation 152/2009 - process B - SN.
  • the amino acid content of the chitin according to the invention is preferably determined according to the method NF EN ISO 13904 or an adapted method of the EC regulation 152/2009 of 27 January -2009 - SN (these two methods being equivalent) for the tryptophan, and according to the method NF EN ISO 13903 or a method resulting from the regulation CE 152/2009 of 27-01 -2009 - SN for the other amino acids (these two methods being equivalent).
  • Relative abundance was calculated by relating the content of each amino acid to the total amino acid content.
  • the total amino acid content was determined by summing the individual values obtained for each amino acid, including tryptophan.
  • the molecular weight was determined according to a method of measuring the falling ball viscosity based on that described in the following publication: "Pacheco et al. ; Structural characterization of chitin and chitosan obtained by biological and chemical methods; Biomacromolecules; 12, 3285-3290, 2011 ".
  • the method for determining the molecular weight of chitin relies on viscosity measurements of dilute solutions of chitin.
  • the dilutions are carried out in dimethylacetamide containing 5% lithium chloride (DMAc-LiCl 5%).
  • DMAc-LiCl 5% dimethylacetamide containing 5% lithium chloride
  • the polymers in solution increase the viscosity of a solvent.
  • the viscosity of the polymer in solution depends on its concentration and molecular weight. The relation is defined by the Mark-Houwink-Sakurada equation:
  • the intrinsic viscosity corresponds to the specific viscosity when the concentration of the polymer tends to zero.
  • the intrinsic viscosity is then calculated by plotting the curves "concentration vs. reduced viscosity "(positive slope) and” concentration vs. inherent viscosity "(negative slope). Each of these curves is extrapolated to zero concentration. The ordinate at the origin corresponds to the intrinsic viscosity. Similar results are expected from both curves. Finally, to determine the molecular mass of chitin, the Mark-Houwink-Sakurada equation is applied.
  • valine Three amino acids appear particularly resistant to the process, namely, valine, histidine and lysine. They represent in fact more than 93% of the residual amino acids.
  • the chitin was milled in an ultracentrifugal screen mill at a size of 250 ⁇ m.
  • the chitin is then placed in a reactor where a concentrated sodium hydroxide solution is added.
  • Sodium hydroxide in aqueous solution at a content of 50% ie a concentration of sodium hydroxide in aqueous solution of 12.5 mol / L
  • the tank is then heated to a temperature of 100 ° C.
  • the deacetylation reaction is carried out for 2 times 2 hours, with an intermediate step of neutralizing the pH.
  • reaction medium obtained at the end of step 9 is then filtered (SEFAR MEDIFAB® Filter 03-60 / 42) so as to recover chitosan.
  • the chitosan recovered at the end of step 10 is then rinsed with warm tap water until the pH is neutralized.
  • the chitosan obtained has a purity by difference greater than 98%.
  • the molecular weight of the chitosan obtained is equal to 307 +/- 60 kg. mol -1 .
  • the chitosan powder is then dried at 60 ° C. in order to obtain a powder having a dry matter content greater than 85%.
  • Step 2 Separation of cuticles from the soft part of insects This step is identical to that of Example 1.
  • the ratio by weight of dry weight to g: cuticles in dry weight in g: water in weight in g is approximately equal to 0.9: 0.45: 22.
  • reaction medium obtained at the end of step 3 is then filtered (SEFAR Filter MEDIFAB® 03-60 / 42) so as to recover the chitin.
  • the chitin recovered at the end of step 4 is then rinsed with warm tap water until the pH is neutralized.
  • the chitin is then dried for 24 hours, at 60 ° C, in a drying oven (Binder®, model FP53).
  • the relative amino acid abundance of the chitin obtained is shown in Table 6 below. It is expressed in%.
  • amino acids appear particularly resistant to the process, namely alanine, cysteine, valine, histidine and lysine. Histidine, lysine and alanine are the 3 most resistant amino acids. They represent in fact more than 85% of the residual amino acids.
  • Cuticles were obtained from the larval stage of different insects according to steps 1 and 2 described in Example 1.
  • the cuticles then undergo an enzymatic hydrolysis step under the following conditions:
  • Chitin is recovered at the end of the basic treatment step, washed and then dried under the conditions described in steps 5, 6 and 7 of Example 1 respectively.
  • the chitins are then analyzed according to the analysis methods indicated in point II of Example 1.
  • the results of analyzes are shown in Table 10, in which the ash, lipid and amino acid contents correspond to levels of gram per 100 g of dry matter.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a chitin having a high purity, and this, whatever the insect or the hydrolysis conditions (protease and base) used.
  • Example 4 Each chitin obtained in Example 4 is finely ground in a centrifugal mill (Retsch® ZM200) with a 250 ⁇ m pore grid.
  • reaction medium obtained at the end of the deacetylation step is then filtered (SEFAR Filter MEDIFAB® 03-60 / 42) so as to recover the chitosan.
  • the recovered chitosan is then rinsed with warm tap water until the pH is neutralized.
  • the deacetylation, recovery and washing steps are therefore carried out twice in total.
  • the chitosan is dried for 24 hours, at 60 ° C., in a drying oven (Binder®, model FP53).
  • a mass m 5 of chitosan is collected.
  • the yield is calculated as follows: m 5 / m 4 * 100 and the results are summarized in Table 12.
  • Table 12 refers to a base ratio: chitin: water which is a ratio by dry weight in g for base and chitin, and in weight in g for water.
  • Table 12 Chitin masses, volume base and yield of obtaining chitosan according to insects
  • the chitosans are then analyzed according to the analysis methods indicated in point II of Example 1.
  • the results of analyzes are shown in Table 13, in which the ash, lipid and amino acid contents correspond to contents in grams per 100 g of dry matter. In this table, the measured lipid content is at the limit of detection.
  • the process according to the invention makes it possible to obtain a chitin of high purity, the resulting chitosan also has this characteristic, even under different deacetylation conditions.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une chitine dont la pureté par différence est supérieure à 97,75% et à un procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan par voie enzymo-chimique.

Description

CHITINE ET PROCÉDÉ D’OBTENTION DE CHITINE ET/OU CHITOSAN PAR VOIE
ENZYMO-CHIMIQUE
La présente invention concerne une chitine, un chitosan ainsi qu’un procédé de préparation de chitine et/ou chitosan à partir d’insectes.
Selon l’invention, par « chitine », on entend un polymère composé majoritairement d’unités glucosamine et N-acétyl-glucosamine, lesdites unités pouvant être optionnellement substituées par des acides aminés et/ou des peptides.
Par « composé majoritairement », on entend que ledit polymère comporte entre 55% et 98% en poids, de préférence entre 75 et 90% en poids d’unités glucosamine et N-acétyl-glucosamine.
La chitine serait le deuxième polymère le plus synthétisé dans le monde vivant après la cellulose. En effet, la chitine est synthétisée par de nombreuses espèces du monde vivant : elle constitue en partie l'exosquelette des crustacés et des insectes et la paroi latérale qui entoure et protège les champignons. Plus particulièrement, chez les insectes, la chitine constitue ainsi 3 à 60% de leur exosquelette.
Par « chitosan », on entend selon la présente invention les produits de désacétylation de la chitine. La limite usuelle entre le chitosan et la chitine est déterminée par le degré d'acétylation : un composé ayant un degré d’acétylation inférieur à 50% est nommé chitosan, au-delà, un composé ayant un degré d’acétylation supérieur à 50% est nommé chitine.
Les applications de la chitine et/ou du chitosan sont nombreuses: cosmétique (composition cosmétique), médicale et pharmaceutique (composition pharmaceutique, traitement des brûlures, biomatériaux, pansements cornéens, fils chirurgicaux), diététique et alimentaire (alimentation humaine notamment en oenologie et alimentation animale, plus spécifiquement en aquaculture et aviculture), technique (agent filtrant, texturant, floculant ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution de l'eau), etc. En effet, la chitine et/ou le chitosan sont des matériaux biocompatibles, biodégradables et non toxiques.
Usuellement, la chitine et le chitosan sont obtenus à partir des différentes espèces synthétisant la chitine, telles que celles citées ci-avant, et notamment à partir de crustacés ou d’insectes.
Il est particulièrement avantageux d’obtenir de la chitine et du chitosan à partir d’insectes, ces derniers représentant une matière première abondante et renouvelable. L’obtention d’une chitine et/ou d’un chitosan de pureté élevée est recherchée dans de nombreuses applications, telles que par exemple en cosmétique et en pharmacie. Une pureté élevée limite notamment les risques d’allergie, de fièvre locale ou généralisée, relatifs à l’application de produits cosmétiques ou pharmaceutiques comportant de la chitine et/ou du chitosan. De telles réactions peuvent en effet être provoquées par les impuretés telles que les acides aminés résiduels, les cendres ou encore des lipides.
L’invention concerne donc une chitine dont la pureté par différence est supérieure à 97,75%.
Dans le cadre de la présente demande, pour mesurer la pureté, les teneurs en impuretés connues, à savoir en acides aminés, lipides et cendres, sont soustraites à la valeur de pureté absolue (100%) pour obtenir la valeur de la pureté estimée par différence. Ainsi, par exemple, un échantillon qui contient 30% d’acides aminés, 10% de lipides et 1 % de cendres, se voit dès lors attribuer une pureté par différence de 100-30- 10-1 =59%.
La chitine selon l’invention, qui présente une pureté par différence élevée, possède ainsi des teneurs faibles en acides aminés, lipides et cendres.
La chitine selon l’invention présente avantageusement une pureté par différence supérieure ou égale à 98%, de préférence supérieure ou égale à 98,1 %.
La teneur en acides aminés de la chitine selon l’invention est de préférence déterminée selon la méthode NF EN ISO 13904 pour le tryptophane et NF EN ISO 13903 pour les autres acides aminés.
L’abondance relative, exprimée en pourcentage, peut être calculée en rapportant la teneur de chaque acide aminé à la teneur totale en acides aminés.
Dans toute la demande, lorsqu’aucune date n’est précisée pour un règlement, une norme ou une directive, il s’agit du règlement, de la norme ou de la directive en vigueur à la date de dépôt.
Les méthodes de détermination de la teneur en matière grasse (lipides) sont bien connues de l’homme du métier. A titre d’exemple et de manière préférée, la détermination de cette teneur sera effectuée en adaptant la méthode du règlement CE 152/2009.
La méthode de détermination de la teneur en cendres est bien connue de l’homme du métier. De préférence, cette teneur est déterminée selon la norme NF V18- 101 .
Avantageusement, la chitine selon l’invention comporte moins de 1 ,2% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitine.
De préférence, la chitine selon l’invention comporte moins de 1 % en poids, plus préférentiellement moins de 0,9% en poids, encore plus préférentiellement moins de 0,8% en poids, et encore plus préférentiellement moins de 0,75% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitine.
Avantageusement, les acides aminés résiduels présents dans la chitine selon l’invention sont : Thréonine, Sérine, Glycine, Acide glutamique, Alanine, Cystéine, Valine, Isoleucine, Acide aspartique, Leucine, Tyrosine, Phénylalanine, Histidine, Lysine, Tryptophane ou une combinaison de deux ou plus de ceux-ci. De préférence les acides aminés résiduels présents dans la chitine selon l’invention consistent en : Cystéine, Valine, Histidine, Lysine, Tryptophane ou une combinaison de deux ou plus de ceux-ci, préférentiellement en une combinaison de tous ces acides aminés.
Avantageusement, la chitine selon l’invention comporte moins de 2% en poids de cendres sur le poids sec total de chitine.
La chitine selon l’invention comporte de préférence moins de 1 ,6% en poids, plus préférentiellement moins de 1 ,4% en poids, encore plus préférentiellement moins de 1 ,2% en poids de cendres sur le poids sec total de chitine.
Avantageusement, la chitine selon l’invention comporte moins de 1 % en poids, de préférence moins de 0,5% en poids, plus préférentiellement moins de 0,2% en poids de lipides sur le poids sec total de chitine.
Encore plus préférentiellement, la chitine selon l’invention ne comporte pas de lipides.
Avantageusement, la chitine selon l’invention a une masse moléculaire supérieure ou égale à 450 kg.moM , de préférence supérieure ou égale à 500 kg. mol 1 , plus préférentiellement supérieure ou égale à 600 kg. mol 1 , encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 650 kg. mol 1.
La masse moléculaire est déterminée grâce à la mesure de la viscosité par chute de bille.
De préférence, la masse moléculaire est déterminée selon une méthode de mesure de la viscosité par chute de bille basée sur celle décrite dans la publication suivante : « Pacheco et al. ; Structural characterization of chitin and chitosan obtained by biological and Chemical methods ; Biomacromolecules ; 12, 3285-3290, 201 1 ».
Cette méthode est notamment utilisée dans l’Exemple 1 .
De préférence, la chitine selon l’invention est une chitine isolée.
Par chitine « isolée », on entend une chitine qui a été isolée où extraite de son milieu naturel.
Plus particulièrement, dans le cadre de la présente demande, la chitine est isolée ou extraite d’insectes, plus spécifiquement de cuticules d’insectes.
Selon un mode de réalisation préféré, la chitine a une pureté par différence supérieure ou égale à 98,0% et avantageusement une masse molaire supérieure ou égale à 800 kg. mol 1 , une pureté par différence supérieure ou égale à 98,5% et avantageusement une masse molaire supérieure ou égale à 850 kg. mol 1.
Selon ce mode de réalisation préféré, la chitine comporte avantageusement moins de 0,35% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitine, et/ou moins de 0,9% en poids de cendres sur le poids sec total de chitine, et/ou moins de 0,3% en poids de lipides sur le poids sec total de chitine.
L’invention concerne également un chitosan dont la pureté par différence est supérieure à 97,75%.
De préférence, la pureté par différence du chitosan selon l’invention est supérieure ou égale à 98%, plus préférentiellement supérieure ou égale à 98,1 %.
La pureté par différence, la teneur en acides aminés, la teneur en cendres, et la teneur en lipides du chitosan selon l’invention sont mesurées de la même manière qu’indiqué ci-avant pour la chitine.
Avantageusement, le chitosan selon l’invention comporte moins de 0,8% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitosan.
De préférence, le chitosan selon l’invention comporte moins de 0,6% en poids, et plus préférentiellement moins de 0,4% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitosan.
Avantageusement, les acides aminés résiduels présents dans le chitosan selon l’invention sont : Thréonine, Tyrosine, Lysine et/ou Tryptophane.
Avantageusement, le chitosan selon l’invention comporte moins de 2% en poids de cendres sur le poids sec total de chitosan.
Le chitosan selon l’invention comporte de préférence moins de 1 ,8% en poids, plus préférentiellement moins de 1 ,5% en poids, encore plus préférentiellement moins de 1 ,0% en poids de cendres sur le poids sec total de chitosan.
Avantageusement, le chitosan selon l’invention comporte moins de 1% en poids, de préférence moins de 0,7% en poids, plus préférentiellement moins de 0,5% en poids de lipides sur le poids sec total de chitosan.
Avantageusement, le chitosan selon l’invention a une masse moléculaire supérieure ou égale à 250 kg. mol-1 , de préférence supérieure ou égale à 300 kg. mol-1 , plus préférentiellement supérieure ou égale à 350 kg. mol-1 , encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 400 kg. mol-1.
De préférence, le chitosan selon l’invention est un chitosan isolé.
Par chitosan « isolé », on entend un chitosan qui a été obtenu à partir d’une chitine isolée ou extraite de son milieu naturel.
Plus particulièrement, dans le cadre de la présente demande, le chitosan est obtenu à partir d’une chitine isolée ou extraite d’insectes, plus spécifiquement de cuticules d’insectes.
Selon un mode de réalisation préféré, le chitosan a une pureté par différence supérieure ou égale à 97,9% et une masse molaire supérieure ou égale à 480 kg. mol 1 , plus particulièrement, une pureté par différence supérieure ou égale à 98,8% et une masse molaire supérieure ou égale à 540 kg. mol 1.
Selon ce mode de réalisation préféré, le chitosan comporte avantageusement moins de 0,4% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitosan, et/ou moins de 0,6% en poids de cendres sur le poids sec total de chitosan, et/ou moins de 0,2% en poids de lipides sur le poids sec total de chitosan.
L’invention concerne également un procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan, à partir d’insectes, comprenant les étapes suivantes :
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
l’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide, et
- le traitement basique du résidu solide.
Le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention permet l’obtention d’une chitine et/ou d’un chitosan de pureté élevée.
En outre, le procédé selon l’invention, et plus particulièrement l’étape d’hydrolyse enzymatique, permet de réduire certains inconvénients inhérents à l’étape de traitement basique subséquente, comme par exemple réduire la quantité de base utilisée lors de cette étape. Cette étape permet également la récupération d’un hydrolysat.
Avantageusement, le procédé selon l’invention ne comprend pas d’étape d’oxydation, tel que par exemple un traitement avec du peroxyde d’hydrogène.
Par « insectes », on entend des insectes à n’importe quel stade de développement, tel qu’un stade adulte, larvaire ou un stade de nymphe (stade intermédiaire). Avantageusement, les insectes mis en oeuvre dans le procédé selon l’invention sont à un stade larvaire lorsque les insectes sont des holométaboles, à un stade de nymphe (stade intermédiaire) lorsque les insectes sont des hétérométaboles, ou le cas échéant à un stade adulte.
Les insectes mis en œuvre dans le procédé selon l’invention peuvent être comestibles.
Avantageusement, les insectes préférés pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention sont par exemple les coléoptères, les diptères, les lépidoptères (tel que par exemple Galleria mellonella), les isoptères, les orthoptères, les hyménoptères, les blattoptères, les hémyptères, les hétéroptères, les éphéméroptères et les mécoptères, de préférence, les coléoptères, les diptères, les orthoptères, les lépidoptères ou leurs mélanges, encore plus préférentiellement les coléoptères.
Les coléoptères préférentiellement mis en œuvre dans le procédé selon l’invention appartiennent aux familles des Tenebrionidae, Melolonthidae, Dermestidae, Coccinellidae, Cerambycidae, Carabidae, Buprestidae, Cetoniidae, Dryophthoridae, ou leurs mélanges.
Plus préférentiellement, il s’agit des coléoptères suivants : Tenebrio molitor, Alphitobius diaperinus, Zophobas morio, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Pachnoda marginata et Rhynchophorus ferrugineus, ou leurs mélanges. Encore plus préférentiellement, il s’agit de Tenebrio molitor.
Le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend une étape de séparation des cuticules de la partie molle des insectes.
La cuticule est la couche externe (ou exosquelette) sécrétée par l'épiderme des insectes. Elle est en général formée de trois couches : l’épicuticule, l’exocuticule et l’endocuticule.
Par « partie molle », on vise la chair (comportant notamment les muscles et les viscères) et le jus (comportant notamment les liquides biologiques, l’eau et l’hémolymphe) des insectes. En particulier, la partie molle ne consiste pas en le jus des insectes.
La séparation des cuticules de la partie molle des insectes peut être effectuée à l’aide de tout type de séparateur adapté.
Selon un premier mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie molle est réalisée à l’aide d’un séparateur à bande.
Selon un second mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie molle est réalisée à l’aide d’un filtre presse.
Cette étape de séparation des cuticules de la partie molle des insectes est plus amplement décrite dans l’étape 2 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après. Cette séparation des cuticules de la partie molle de l’insecte permet notamment de séparer la chitine de la partie molle. En effet, les cuticules obtenues à l’issue de cette étape de séparation présentent une teneur en chitine élevée de l’ordre de 10 à 30% en poids sur le poids total de cuticules, comme indiqué ci-après.
En particulier, l’étape de séparation des cuticules de la partie molle s’effectue sans qu’aucune étape préalable de broyage des insectes, notamment sous forme de particules, n’ait été effectuée.
Le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend avantageusement une étape d’abattage préalable à l’étape de séparation des cuticules de la partie molle.
Cette étape d’abattage est plus amplement décrite dans l’étape 1 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après.
Avantageusement, suite à l’étape 1 d’abattage, les insectes sont directement utilisés pour la mise en oeuvre de l’étape 2 de séparation des cuticules de la partie molle des insectes, c’est-à-dire que les insectes ne sont soumis à aucun traitement, tel qu’un broyage, une congélation ou une déshydratation entre l’étape 1 et l’étape 2.
Le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend une étape d’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide, suite à l’étape de séparation des cuticules de la partie molle des insectes.
Avantageusement, l’hydrolyse enzymatique est effectuée pendant une durée comprise entre 3 et 10 heures, préférentiellement comprise entre 4 et 8 heures, telle que par exemple de l’ordre de 6 heures.
On notera que dans le cadre de la présente demande, et sauf stipulation contraire, les gammes de valeurs indiquées s’entendent bornes incluses.
De préférence, l’hydrolyse enzymatique est réalisée à une température comprise entre 40 et 80 'O, préférentiellement comprise entre 50 et 70 'O, telle que par exemple d’environ 60°C.
Avantageusement, l’hydrolyse enzymatique est réalisée à un pH compris entre 6 et 8, préférentiellement entre 6,5 et 7,5.
L’hydrolyse enzymatique peut être réalisée avec une seule protéase ou alternativement avec un mélange d’enzymes contenant au moins une protéase, plus préférentiellement un mélange d’enzymes contenant plusieurs protéases, tel qu’un mélange contenant une endoprotéase et une exoprotéase, ou une protéase et une polysaccharase.
L’enzyme ou le mélange d’enzymes est introduit(e) à une quantité allant de 0,2 à 10% en poids, préférentiellement de 1 à 8% en poids, plus préférentiellement de 3 à 7% en poids par rapport au poids de cuticules (humides) soumises à l’hydrolyse enzymatique.
En termes d’activité enzymatique, la quantité d’enzyme ou de mélange d’enzymes introduite est équivalente à une activité comprise entre 2000 et 5000 SAPU (« Spectrophotometric Acid Protease Unit »), de préférence comprise entre 3000 et 4000 SAPU, pour 100 g en poids humide, avec une humidité de 30 à 70%, de substrat à transformer, c’est-à-dire de cuticules d’insectes.
Cette étape d’hydrolyse enzymatique des cuticules est plus amplement décrite dans l’étape 3 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après.
Le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend une étape de traitement basique du résidu solide, suite à l’étape d’hydrolyse enzymatique des cuticules.
Avantageusement, le traitement basique est réalisé à l’aide d’une base forte.
Avantageusement, la base forte est choisie parmi l’hydroxyde de sodium ou soude, de potassium, et d’ammonium. De préférence, la base forte est l’hydroxyde de sodium ou de potassium, plus préférentiellement l’hydroxyde de sodium.
De préférence, la base utilisée pour le traitement basique est sous forme d’une solution basique aqueuse.
Dans ce cas, la concentration molaire de la base en solution aqueuse est avantageusement comprise entre 0,1 et 5 mol.L-1 , de préférence comprise entre 0,5 et 2 mol.L-1 , encore plus préférentiellement égale à 1 mol.L-1 (par exemple soude molaire).
De préférence, la concentration de la base est ajustée de manière à obtenir un ratio base en poids sec en g : résidu solide en poids sec en g : eau en poids en g compris entre 0,1 : 0,45 : 2 et 0,8 : 0,45 : 15, plus préférentiellement compris entre 0,3 : 0,45 : 8 et 0,7 : 0,45 : 12, tel que par exemple d’environ 0,36 : 0,45 : 9,23.
Cette étape de traitement basique du résidu solide est plus amplement décrite dans l’étape 4 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après.
Avantageusement, l’étape de traitement basique du résidu solide est suivie d’une étape de récupération de la chitine.
Cette étape de récupération de la chitine est plus amplement décrite dans l’étape 5 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après.
Optionnellement, le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend en outre une étape de lavage de la chitine.
Cette étape optionnelle de lavage de la chitine est plus amplement décrite dans l’étape 6 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci- après.
Optionnellement, le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend en outre une étape de séchage de la chitine.
Cette étape optionnelle de séchage de la chitine est plus amplement décrite dans l’étape 7 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci- après.
La chitine pouvant être commercialisée sous forme de poudre, le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention peut optionnellement comprendre une étape de broyage de la chitine.
Cette étape optionnelle de broyage de la chitine est plus amplement décrite dans l’étape 8 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci- après.
L’étape de broyage peut également être effectuée afin de favoriser la réaction de désacétylation, qui permet de préparer du chitosan à partir de chitine.
L’étape de désacétylation, qui vise à transformer la chitine en chitosan, n’est donc mise en oeuvre que lorsque le produit souhaité est le chitosan.
Cette étape de désacétylation de la chitine est plus amplement décrite à l’étape
9 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après.
Avantageusement, l’étape de désacétylation de la chitine est suivie d’une étape de récupération du chitosan.
Cette étape de récupération du chitosan est plus amplement décrite dans l’étape
10 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après.
Optionnellement, le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend en outre une étape de lavage du chitosan.
Cette étape optionnelle de lavage du chitosan est plus amplement décrite dans l’étape 1 1 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci- après.
Optionnellement, le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend en outre une étape de séchage du chitosan.
Cette étape optionnelle de séchage du chitosan est plus amplement décrite à l’étape 12 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci- après. On notera que les étapes 6 à 8, 1 1 et 12 mentionnées ci-avant, et décrites plus amplement dans le procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention ci-après, sont optionnelles. Toutefois, le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention comprend avantageusement une ou plusieurs de ces étapes, de préférence toutes ces étapes.
On notera par ailleurs que les caractéristiques des étapes 1 à 12 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention, qui sont décrites ci-après, ne sont pas limitées à une mise en oeuvre dans ledit procédé détaillé, mais s’appliquent à tous les modes de réalisation du procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention décrits dans la présente demande, indépendamment du nombre d’étapes prévu dans ces modes de réalisation.
Ces caractéristiques s’appliquent également à un procédé particulier d’obtention de chitine et à un procédé particulier d’obtention de chitosan selon l’invention, décrits ci- après.
L’invention vise donc plus particulièrement un procédé particulier d’obtention de chitine, à partir d’insectes, comprenant les étapes suivantes :
l’abattage des insectes,
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
l’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide,
- le traitement basique du résidu solide, et
- la récupération de la chitine.
Ce procédé comprend donc les étapes 1 à 5 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan ci-après et avantageusement une ou plusieurs des étapes optionnelles 6 à 8 de ce procédé détaillé.
L’invention concerne également la chitine susceptible d’être obtenue par le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention, ou par le procédé particulier d’obtention de chitine selon l’invention.
L’invention vise donc également un procédé particulier d’obtention de chitosan, à partir d’insectes, comprenant les étapes suivantes :
l’abattage des insectes,
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
l’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide,
- le traitement basique du résidu solide, - la récupération de la chitine,
- la désacétylation de la chitine, et
- la récupération du chitosan.
Ce procédé comprend donc les étapes 1 à 5, 9 et 10 du procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou de chitosan ci-après et avantageusement une ou plusieurs des étapes optionnelles 6 à 8, 1 1 et 12 de ce procédé détaillé.
L’invention concerne également le chitosan susceptible d’être obtenu par le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention, ou par le procédé particulier d’obtention de chitosan selon l’invention.
La chitine et/ou le chitosan selon l’invention ainsi que la chitine et/ou le chitosan susceptible(s) d’être obtenu(s) par un procédé selon l’invention peu(ven)t avantageusement être utilisé(s) dans diverses applications :
- dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou diététiques,
- comme biomatériaux pour traiter des brûlures en tant que seconde peau, pour réaliser des pansements cornéens ou des fils chirurgicaux,
- comme agent filtrant, texturant, floculant et/ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution de l'eau.
Procédé détaillé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention • Etape 1 : Abattage des insectes
Cette étape 1 d’abattage peut avantageusement s’effectuer par choc thermique, tel que par ébouillantage ou par blanchiment. Cette étape 1 permet d’abattre les insectes tout en abaissant la charge microbienne (réduction du risque d’altération et sanitaire) et en inactivant les enzymes internes des insectes pouvant déclencher une autolyse, et ainsi un brunissement rapide de ceux-ci.
Pour l’ébouillantage, les insectes, de préférence des larves, sont ainsi ébouillantés à l’eau pendant 2 à 20 minutes, préférentiellement, 5 à 15 minutes. De préférence, l’eau est à une température comprise entre 87 à I OO 'Ό, préférentiellement 92 à 95 qC.
La quantité d’eau introduite lors de l’ébouillantage est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d’eau en ml sur le poids en g d’insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l’ordre de 1 .
Pour le blanchiment, les insectes, de préférence des larves, sont blanchis à l’eau ou à la vapeur (buses ou lit de vapeur) à une température comprise entre 80 et I Od'Ό, de préférence entre 87 et 105°C, plus préférentiellement entre 95 et 100°C, encore plus préférentiellement 98°C ou bien à l’eau à une température comprise entre 90 et 100°C, préférentiellement entre 92 et 95°C (par buses d’aspersion) ou en mode mixte (eau + vapeur) à une température comprise entre 80 et 130 °C, de préférence entre 90 et 120 'Ό, plus préférentiellement entre 95 et 105°C, encore plus préférentiellement 98 qC. Lorsque les insectes sont blanchis uniquement à la vapeur, le blanchiment est avantageusement réalisé dans des blancheurs à vapeur à circulation forcée (« forced steaming »). Le temps de séjour dans la chambre de blanchiment est compris entre 5 secondes et 15 minutes, préférentiellement entre 1 et 7 minutes.
Avantageusement, suite à l’étape 1 d’abattage, les insectes sont directement utilisés pour la mise en oeuvre de l’étape 2 de séparation des cuticules de la partie molle des insectes, c’est-à-dire que les insectes ne sont soumis à aucun traitement, tel qu’un broyage, une congélation ou une déshydratation entre l’étape 1 et l’étape 2.
Selon un mode de réalisation préféré, les insectes sont des coléoptères et notamment, Tenebrio molitor.
• Etape 2 : Séparation des cuticules de la partie molle des insectes
L’étape 2 a pour objectif de séparer les cuticules de la partie molle des insectes.
La séparation des cuticules de la partie molle des insectes peut être effectuée à l’aide de tout type de séparateur adapté.
Selon un premier mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie molle est réalisée à l’aide d’un séparateur à bande.
Par « séparateur à bande », on vise un dispositif permettant la séparation de la partie solide de la partie molle d’un produit, et qui comporte une bande de serrage (ou bande presseuse) et un tambour perforé.
A titre d’exemple, un séparateur à bande peut comprendre une bande de serrage et un tambour perforé, la bande de serrage entourant au moins une partie du tambour perforé.
La bande de serrage permet l’apport et l’application des insectes contre le tambour perforé de sorte à faire passer, par pression, la partie molle des insectes à travers les perforations du tambour, tandis que la partie solide des insectes (cuticules) reste à l’extérieur du tambour.
Les cuticules peuvent ensuite être récupérées à l’aide d’un couteau racleur.
A titre d’exemple, on peut citer les séparateurs à bande provenant de la société Baader, tels que les séparateurs à bande 601 à 607 (« soft separator 601 to 607 »), ou encore les séparateurs à bande SEPAmatic® de BFD Corporation (gamme 410 à 4000V).
Avantageusement, le diamètre des perforations du tambour est compris entre 0,5 et 3 mm, de préférence entre 1 et 2 mm.
Concernant la pression, l’homme du métier est à même de déterminer la pression à exercer permettant la séparation des cuticules de la partie molle des insectes.
Selon un second mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie molle est réalisée à l’aide d’un filtre presse.
Un filtre presse est composé de toiles filtrantes, et permet une séparation selon le principe de filtration sous pression.
Avantageusement, le filtre presse utilisé dans le procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan selon l’invention est un filtre presse à bandes.
Un filtre presse à bandes comporte deux bandes de serrage perforées (également appelées « toiles filtrantes »). Les insectes sont placés entre les deux bandes de serrage perforées de sorte à faire passer, par pression, la partie molle des insectes à travers les perforations des bandes de serrage, tandis que la partie solide des insectes restent entre les deux bandes de serrage perforées.
L’homme du métier est à même de déterminer le diamètre des perforations des bandes de serrage ainsi que la pression à exercer, permettant la séparation des cuticules de la partie molle des insectes.
A titre d’exemple, on peut citer le filtre presse à bandes (ou « presse à bandes ») provenant de la société Flottweg, ou encore les filtres presses à bandes de la société ATR Créations.
Cette étape de séparation des insectes se distingue d’un pressage classique pouvant être réalisé par exemple avec une presse mono-vis ou bi-vis en ce qu’elle permet une séparation (nette) de la partie molle et des cuticules des insectes et non une séparation d’un jus d’une fraction solide.
Avantageusement, la séparation des cuticules de la partie molle des insectes est effectuée à l’aide d’un séparateur à bande.
Les cuticules obtenues dans l’étape 2 comportent entre 10 et 30%, de préférence entre 15 et 25% en poids de chitine, sur le poids sec total de cuticules.
La détermination du taux de chitine est effectuée par extraction de celle-ci. A titre d’exemple, une méthode de détermination du taux de chitine pouvant être utilisée est la méthode AOAC 991 .43.
Selon un mode de réalisation préféré, la séparation des cuticules de la partie molle des coléoptères et notamment de Tenebrio molitor est effectuée à l’aide d’un séparateur à bande.
• Etape 3 : Hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase
L’hydrolyse enzymatique est effectuée par une protéase ou peptidase. Dans la présente demande, les noms ou suffixes « peptidase » et « protéase » sont utilisés indifféremment pour désigner une enzyme lysant une liaison peptidique des protéines.
Avantageusement, l’hydrolyse enzymatique est effectuée pendant une durée comprise entre 3 et 10 heures, préférentiellement comprise entre 4 et 8 heures, telle que par exemple de l’ordre de 6 heures.
De préférence, l’hydrolyse enzymatique est réalisée à une température comprise entre 40 et 80 °C, préférentiellement comprise entre 50 et 70‘C, telle que par exemple d’environ 60°C.
Avantageusement, l’hydrolyse enzymatique est réalisée à un pH compris entre 6 et 8, préférentiellement entre 6,5 et 7,5.
L’hydrolyse enzymatique peut être réalisée avec une seule protéase ou alternativement avec un mélange d’enzymes contenant au moins une protéase, plus préférentiellement un mélange d’enzymes contenant plusieurs protéases, tel qu’un mélange contenant une endoprotéase et une exoprotéase, ou une protéase et une polysaccharase.
De préférence, la protéase est choisie parmi le groupe constitué par les aminopepdidases, les métallocarboxypeptidases, les endopeptidases à sérine, les endopeptidases à cystéine, les endopeptidases aspartiques, les métalloendopeptidases, plus préférentiellement la protéase est choisie parmi les endopeptidases à sérine, telle que, par exemple, l’Alcalase 2.5L PF ou la Prolyve NP.
Avantageusement, les enzymes peuvent être choisies parmi les suivantes :
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
*n.a. : non applicable
L’enzyme ou le mélange d’enzymes est introduit(e) à une quantité allant de 0,2 à 15% en poids, de préférence de 0,2 à 10% en poids, plus préférentiellement de 1 à 8% en poids, encore plus préférentiellement de 3 à 7% en poids par rapport au poids de cuticules (humides) soumises à l’hydrolyse enzymatique.
En termes d’activité enzymatique, la quantité d’enzyme ou de mélange d’enzymes introduite est équivalente à une activité comprise entre 2000 et 5000 SAPU (« Spectrophotometric Acid Protease Unit »), de préférence comprise entre 3000 et 4000 SAPU, pour 100 g en poids humide, avec une humidité de 30 à 70%, de substrat à transformer, c’est-à-dire de cuticules d’insectes.
Il est usuel d’exprimer l’activité enzymatique d’une protéase en SAPU.
Cette activité enzymatique est mesurée en se basant sur le principe de la mesure de libération de la tyrosine à 275 nm lors de l’hydrolyse de la caséine par une enzyme protéolytique (Valley research SAPU Assay method, par Karen PRATT).
SAPU (AA - i) X 11
- =— - - - g x 30 x C x 1
SAPU/g = une unité spectrophotométrique de protéase
DA = absorbance corrélée
i = ordonnée à l’origine
1 1 = volume final de réaction
M = coefficient directeur de la courbe de calibration 30 = temps de réaction (en minutes)
C = concentration de l’enzyme (g/ml_) dans la solution enzymatique ajoutée
1 = 1 mL volume de la solution d’enzyme ajoutée
L’activité enzymatique peut également être exprimée à l’aide de l’activité spécifique d’une enzyme.
L’activité spécifique d’une enzyme est l’activité catalytique exprimée en Unité Internationale (LU.) par unité de masse d’enzyme (par exemple : I.U./g d’enzyme).
Avantageusement, la concentration de l’enzyme ou du mélange d’enzyme mis(e) en oeuvre est comprise entre 100 et 250 LU. par gramme de matière sèche de cuticules, de préférence entre 120 et 180 I.U. par gramme de matière sèche de cuticules, plus préférentiellement entre 120 et 150 I.U. par gramme de matière sèche de cuticules.
Avantageusement, l’étape d’hydrolyse enzymatique s’effectue en présence d’eau, telle que de l’eau douce.
La quantité d’eau mise en oeuvre lors de l’hydrolyse enzymatique est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d’eau en L sur le poids en g de cuticules humides est de préférence compris entre 0,005 et 5, plus préférentiellement entre 0,01 et 5, tel que par exemple environ 0,01 , ou alternativement entre 0,05 et 2, ou entre 0,1 et 1 .
L’étape d’hydrolyse enzymatique est avantageusement réalisée sous agitation.
Selon un mode de réalisation préféré, l’étape d’hydrolyse enzymatique est effectuée pendant 5 à 7h, tel que par exemple, environ 6 heures, à une température de 50 à 70‘C, telle que par exemple d’environ 60°C, et l’enzyme est une endopeptidase à sérine, telle que par exemple Alcalase 2.5L PF. De préférence, l’enzyme est introduite à une concentration comprise entre 120 et 150 I.U., telle que par exemple de l’ordre de 120 I.U. par gramme de matière sèche de cuticules. De préférence, la quantité d’eau mise en oeuvre lors de cette étape d’hydrolyse enzymatique est de l’ordre de 0,01 L d’eau par g de cuticules humides.
A l’issue de la réaction d’hydrolyse enzymatique des cuticules, le milieu réactionnel est ensuite séparé, afin de récupérer un résidu solide comprenant de la chitine et un hydrolysat.
L’étape de séparation peut être réalisée par toute méthode de séparation appropriée. Ces méthodes sont connues de l’homme du métier.
A titre d’exemple, il est possible d’utiliser un extracteur de jus, tel que ceux commercialisés par la société Angel®.
Le résidu solide récupéré est avantageusement homogénéisé, par exemple par mélangeage. • Etape 4 : Traitement basique du résidu solide
Dans l’étape 4, le résidu solide récupéré à l’issue de l’étape 3 est soumis à un traitement basique, c’est-à-dire qu’il est mis en contact avec une base (ou agent basique).
Avantageusement, le traitement basique est réalisé à l’aide d’une base forte.
Avantageusement, la base forte est choisie parmi l’hydroxyde de sodium ou soude, de potassium, et d’ammonium. De préférence, la base forte est l’hydroxyde de sodium ou de potassium, plus préférentiellement l’hydroxyde de sodium.
De préférence, la base utilisée pour le traitement basique est sous forme d’une solution basique aqueuse.
Dans ce cas, la concentration molaire de la base en solution aqueuse est avantageusement comprise entre 0,1 et 5 mol.L-1 , de préférence comprise entre 0,5 et 2 mol.L-1 , encore plus préférentiellement égale à 1 mol.L-1 (par exemple soude molaire).
De préférence, la concentration de la base est ajustée de manière à obtenir un ratio base en poids sec en g : résidu solide en poids sec en g : eau en poids en g compris entre 0,1 : 0,45 : 2 et 0,8 : 0,45 : 15, plus préférentiellement compris entre 0,3 : 0,45 : 8 et 0,7 : 0,45 : 12, tel que par exemple d’environ 0,36 : 0,45 : 9,23.
Le traitement basique est avantageusement réalisé pendant une durée comprise entre 5 et 60 heures, de préférence pendant une durée comprise entre 5 et 50 heures, telle que par exemple 48 heures.
La durée du traitement basique pourra avantageusement être adaptée selon les propriétés de la chitine que l’on souhaite obtenir, telles que sa blancheur (couleur blanche).
La durée du traitement basique pourra être inférieure à 40 heures, voire inférieure à 30 heures, telle que par exemple 24 heures.
Avantageusement, le traitement basique est réalisé à une température comprise entre 60 et I OO 'Ό, de préférence comprise entre 80 et I OO 'Ό, plus préférentiellement d’environ 90°C.
Pour cela, le milieu réactionnel peut, par exemple, être chauffé à l’aide d’un bain d’huile, d’un échangeur de chaleur ou d’un système de chauffage à double enveloppe, de sorte à atteindre la température souhaitée.
L’étape de traitement basique est avantageusement réalisée sous agitation.
Selon un premier mode de réalisation préféré, l’étape de traitement basique est réalisée à l’aide d’hydroxyde de sodium sous forme d’une solution basique aqueuse. De préférence, la concentration de l’hydroxyde de sodium en solution aqueuse est égale à 1 mol.L 1. De préférence, le ratio hydroxyde de sodium en poids sec en g : résidu solide en poids sec en g : eau en poids en g est de l’ordre de 1 : 1 : 25. De préférence, la durée de ce traitement basique est d’environ 48 heures. De préférence, ce traitement basique est réalisé à une température d’environ 90°C.
Selon un second mode de réalisation préféré, l’étape de traitement basique est réalisée à l’aide d’hydroxyde de potassium sous forme d’une solution basique aqueuse. De préférence, la concentration de l’hydroxyde de potassium en solution aqueuse est égale à 1 mol.L-1. De préférence, le ratio hydroxyde de potassium en poids sec en g : résidu solide en poids sec en g : eau en poids en g est de l’ordre de 1 ,4 : 1 : 25. De préférence, la durée de ce traitement basique est d’environ 48 heures. De préférence, ce traitement basique est réalisé à une température d’environ 90°C.
• Etape 5 : Récupération de la chitine
L’étape 5 de récupération de la chitine, à partir du milieu réactionnel obtenu à la fin de l’étape 4, peut être réalisée par toute méthode de récupération appropriée. Ces méthodes sont connues de l’homme du métier.
A titre d’exemple, on peut citer la filtration, la centrifugation et la décantation.
Avantageusement, la récupération de la chitine est réalisée par filtration.
• Etape (optionnelle) 6 : Lavage de la chitine
La chitine récupérée à l’issue de l’étape 5 est ensuite optionnellement lavée.
L’étape 6 de lavage de la chitine est avantageusement réalisée à l’aide d’eau du robinet, de préférence tiède, c’est-à-dire dont la température est comprise entre 15 et 60 °C.
De préférence, le lavage est réalisé jusqu’à neutralisation du pH.
• Etape (optionnelle) 7 : Séchage de la chitine
La chitine est ensuite optionnellement séchée.
De préférence, l’étape de séchage est réalisée à une température comprise entre 40 et 105°C, de préférence à environ 60 °C.
L’étape de séchage est réalisée pendant une durée comprise entre 10 et 80 heures, de préférence pendant environ 24 heures.
Avantageusement, le séchage est réalisé à l’aide d’une étuve de séchage, telle que le modèle FED 1 15 ou FP53 de la société Binder®.
Afin de préparer du chitosan à partir de la chitine, les étapes suivantes peuvent en outre être réalisées :
• Etape (optionnelle) 8 : Broyage de la chitine
La chitine obtenue à l’issue de l’étape 5, 6 ou 7 est ensuite optionnellement broyée, par exemple dans un broyeur ultracentrifuge à tamis.
La production de chitosan à partir de chitine, par la réaction de désacétylation, dépend en grande partie de la taille des particules de chitine. Ainsi, un broyage très fin de la chitine avant désacétylation permet d’augmenter significativement les rendements et la vitesse de la réaction de désacétylation, comme cela est illustré dans le Tableau 1 ci-après :
Figure imgf000020_0001
*Mesure du Degré d’Acétylation DA
Tableau 1 : Efficacité de la désacétylation selon le broyage préalable de la chitine
Les conditions de la désacétylation effectuée dans l’essai rapporté dans le Tableau 1 sont les suivantes : 4 heures de réaction, 100°C, NaOH en solution aqueuse à 30% en volume, dans un ratio chitine estimée : solution de NaOH égal à 1 :20.
Par conséquent, la chitine est préférentiellement broyée à une taille de particules inférieure à 300 pm, telle qu’une taille inférieure à 260 pm, ou inférieure à 200 pm, ou encore, inférieure à 160 pm.
· Etape 9 : Désacétylation de la chitine
Cette étape n’est mise en oeuvre que dans le cas où l’obtention de chitosan est souhaitée.
La chitine est ensuite placée dans un réacteur où est ajoutée une base.
Avantageusement, la désacétylation de la chitine est réalisée à l’aide d’une base forte.
Avantageusement, la base forte est choisie parmi l’hydroxyde de sodium ou soude, de potassium, et d’ammonium. De préférence, la base forte est l’hydroxyde de sodium ou de potassium, plus préférentiellement l’hydroxyde de sodium.
De préférence, la base utilisée pour le traitement basique est sous forme d’une solution basique aqueuse, de préférence une solution basique aqueuse concentrée.
Dans ce cas, la concentration molaire de la base en solution aqueuse est avantageusement comprise entre 4 et 25 mol.L1, de préférence comprise entre 6 et 22 mol.L 1, plus préférentiellement comprise entre 8 et 19 mol.L1, encore plus préférentiellement comprise entre 10 et 19 mol. L \ de manière encore plus préférentielle comprise entre 12,5 et 19 mol.L1.
De préférence, la concentration de la base est ajustée de manière à obtenir un ratio base en poids sec en g : chitine en poids sec en g : eau en poids en g compris entre 18 : 1 : 35 et 55 : 1 : 55, tel que par exemple compris entre 18 : 1 : 35 et 30 : 1 : 55, ou d’environ 24 : 1 : 45, plus préférentiellement d’environ 38 : 1 : 50. Les valeurs plus préférées sont notamment celles à mettre en oeuvre lors de l’utilisation d’hydroxyde de sodium.
De préférence, la désacétylation est réalisée pendant 1 à 24 heures et préférentiellement 2 à 18 heures.
Avantageusement, cette désacétylation est réalisée en deux fois, avec une étape intermédiaire de neutralisation du pH. Par exemple, la désacétylation pourra être réalisée en deux fois deux heures, c’est-à-dire pendant 4 heures, avec une étape intermédiaire de neutralisation du pH intermédiaire.
La température de désacétylation se situe avantageusement entre 80 et 150°C, de préférence entre 90 et 120 °C et plus préférentiellement à I OO 'Ό.
• Etape 10 : Récupération du chitosan
L’étape 10 de récupération du chitosan, à partir du milieu réactionnel obtenu à la fin de l’étape 9, peut être réalisée par toute méthode de récupération appropriée. Ces méthodes sont connues de l’homme du métier.
A titre d’exemple, on peut citer la filtration, la centrifugation et la décantation.
Avantageusement, la récupération du chitosan est réalisée par filtration.
Dans le cas où l’étape 8 de broyage de la chitine est mise en oeuvre, le chitosan récupéré est sous forme de poudre.
Le chitosan peut ensuite subir toute opération connue de l’homme du métier permettant de le fonctionnaliser, notamment par l’ajout de radicaux (carboxylation, hydroxylation...).
• Etape (optionnelle) 11 : Lavage
Le chitosan récupéré à l’issue de l’étape 10 est ensuite optionnellement lavé.
L’étape 1 1 de lavage du chitosan est avantageusement réalisée à l’aide d’eau du robinet. De préférence, cette eau a une température comprise entre 15 et 60 °C.
De préférence, le lavage est réalisé jusqu’à neutralisation du pH.
• Etape (optionnelle) 12 : Séchage
Le chitosan, pouvant être sous forme de poudre, est ensuite optionnellement séché entre 30 et dO 'Ό, avantageusement entre 50 et 70 °C, de préférence à environ 60‘Ό, pour obtenir du chitosan ou une poudre de chitosan ayant une teneur en matière sèche supérieure à 85%, plus particulièrement supérieure à 90%.
L’étape de séchage est réalisée pendant une durée comprise entre 10 et 80 heures, de préférence pendant environ 24 heures.
Avantageusement, le séchage est réalisé à l’aide d’une étuve de séchage, telle que le modèle FED 1 15 ou FP53 de la société Binder®.
L’invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent, qui sont donnés à titre illustratif. EXEMPLE 1 : Procédé d’obtention de chitine selon l’invention
I. Matériel et méthodes
Des larves de Tenebrio molitor ont été utilisées. A réception des larves, ces dernières peuvent être stockées à 4°C pendant 0 à 15 jours dans leurs bacs d’élevage avant l’abattage sans dégradation majeure. Le poids des larves (âge) utilisées est variable et par conséquent leur composition peut varier, comme cela est illustré dans le Tableau 2 ci-après :
Figure imgf000022_0001
* Les % sont exprimés en poids sec sur le poids humide de larves.
Tableau 2 : Composition biochimique des larves de Tenebrio molitor selon leur poids.
· Etape 1 : Abattage des insectes
Les larves vivantes (+4°C à + 25°C) sont convoyées en couche d’épaisseur comprise entre 2 et 10 cm, sur un tapis à bande perforé (1 mm) jusqu’à une chambre de blanchiment. Les insectes sont ainsi blanchis à la vapeur (buses ou lit de vapeur) à 98‘C sous ventilation forcée ou bien à l’eau à 92-95 'Ό (buses d’aspersion) ou en mode mixte (eau + vapeur). Le temps de séjour dans la chambre de blanchiment est compris entre 5 secondes et 15 minutes, idéalement 5 minutes.
La température des larves en sortie de blanchiment est comprise entre 75 'Ό et
98°C.
• Etape 2 : Séparation de la partie molle des cuticules des insectes Les larves, une fois blanchies, sont convoyées jusqu’à la trémie d’alimentation d’un séparateur à bande, afin de séparer les cuticules de la partie molle des larves.
Avantageusement, la séparation s’effectue immédiatement après l’abattage de manière à ce que les larves n’aient pas le temps de refroidir à température ambiante.
Le séparateur à bande utilisé est un séparateur à bande 601 de la société Baader.
Le diamètre des perforations du tambour est de 1 ,3 mm.
La partie molle des insectes est récupérée dans une cuve.
Les cuticules sont récupérées à l’aide d’un couteau racleur.
Le pourcentage de matière sèche des cuticules est d’environ 35-45%.
• Etape 3 : Hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase
Dans 1 tricol de 2 L muni d’un réfrigérant et d’un agitateur (Heidolph® RZR1 ), on place 160,015 ± 0.007 g de cuticules humides obtenues à l’étape 2 (Matière sèche = 38 ± 5%), 8 g de Prolyve® NP (5 % de la masse de cuticules humides) et 1 ,6 L ± 0,02 L d’eau chaude. Le milieu est chauffé avec un bain marie à une température de 60 ± 2 °C pendant 6 heures. Ensuite, la température est portée à 80‘O pendant 15 min. Le milieu réactionnel est ensuite séparé via extracteur de jus (Angelia 7500). Pendant toute la réaction, le milieu réactionnel est soumis à une agitation de 280 rpm. Le pH est compris entre 6 et 8, de préférence entre 6,5 et 7,5. L’activité spécifique de la Prolyve® NP est de 1 132,1 I.U./g d’enzyme. On utilise 8 g de Prolyve® NP, soit 9056,8 I.U pour 160,015 ± 0.007 g de cuticules humides (Matière sèche = 38 ± 5%). La concentration de l’enzyme est donc d’environ 149 I.U./g de matière sèche de cuticules.
On obtient 58 ± 2 g de résidu solide, et un hydrolysat. Le résidu solide est mélangé pour être homogène, pesé puis mis au réfrigérateur pour la nuit. L’hydrolysat est lyophilisé.
• Etape 4 : Traitement basique du résidu solide
Dans un tricol de 2 L muni d’un réfrigérant et d’un agitateur mécanique (Heidolph® RZR1 ), on place le résidu solide obtenu à l’étape 3 (Matière Sèche = 44 ± 16%) et 512,05 ± 0,02 mL de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium de concentration égale à 1 mol.L 1. Le milieu est chauffé avec un bain d’huile à une température de 90 ± 2 'O pendant 24 heures.
On utilise donc environ 0,02 L de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium par gramme de matière sèche de résidu solide.
Le ratio base en poids sec en g : résidu solide en poids sec en g : eau en poids en g est environ égal à 0,36 : 0,45 : 9,23. • Etape 5 : Récupération de la chitine
Le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape 4 est ensuite filtré (Filtre SEFAR MEDIFAB® 03-60/42) de sorte à récupérer la chitine.
• Etape (optionnelle) 6 : Lavage de la chitine
La chitine récupérée à l’issue de l’étape 5 est ensuite rincée à l’eau tiède du robinet jusqu’à neutralisation du pH.
• Etape (optionnelle) 7 : Séchage de la chitine
La chitine est ensuite séchée pendant 24 heures, à 60 °C, dans une étuve de séchage (Binder®, modèle FP53).
On obtient ainsi 9,6 ± 0,2 g de chitine.
II. Méthodes d’analyse
Mesure de la matière sèche et du taux d’humidité
Le pourcentage de matière sèche et le taux d’humidité sont calculés de la façon suivante.
2 g de chitine sont pesés dans des coupelles, introduits dans une étuve de séchage (Binder®, modèle FED 1 15) et séchés à 105 'O pendant 24 h (ou jusqu’à séchage complet).
Le pourcentage de matière sèche est obtenu en faisant le rapport de la masse sèche de chitine après séchage sur la masse de chitine avant séchage.
Le taux d’humidité est obtenu en ôtant le pourcentage de matière sèche à la valeur de 100%.
Cette méthode de mesure peut également être utilisée pour mesurer le pourcentage de matière sèche et le taux d’humidité des cuticules.
Mesure du taux de cendres
Le taux de cendres a été déterminé selon la méthode norme NF V18-101.
Mesure de la teneur en protéines brutes
Le taux de protéines est obtenu par la méthode Dumas, avec le coefficient de conversion de 6,25, adaptée de la norme NF EN ISO 16634-1.
Mesure de la teneur en lipides ou matières grasses
Le taux de lipides est obtenu par une méthode adaptée du règlement CE 152/2009 - procédé B - SN.
Teneur et abondance relative en acides aminés
La teneur en acides aminés de la chitine selon l’invention est de préférence déterminée selon la méthode NF EN ISO 13904 ou une méthode adaptée du règlement CE 152/2009 du 27-01 -2009 - SN (ces deux méthodes étant équivalentes) pour le tryptophane, et selon la méthode NF EN ISO 13903 ou une méthode issue du règlement CE 152/2009 du 27-01 -2009 - SN pour les autres acides aminés (ces deux méthodes étant équivalentes).
L’abondance relative a été calculée en rapportant la teneur de chaque acide aminé à la teneur totale en acides aminés.
Teneur totale en acides aminés
La teneur totale en acides aminés a été déterminée en additionnant les valeurs individuelles obtenues pour chaque acide aminé, y compris le tryptophane.
Pureté par différence
Dans le cas de cette mesure, les teneurs en impuretés connues (acides aminés, lipides et cendres) ont été soustraites à la valeur de pureté absolue (100%) pour obtenir la valeur de la pureté estimée par différence. Par exemple, un échantillon qui contient 30% d’acides aminés, 10% de lipides et 1 % de cendres, se voit dès lors attribuer une pureté par différence de 100-30-10-1 =59%
Masse moléculaire de la chitine
La masse moléculaire a été déterminée selon une méthode de mesure de la viscosité par chute de bille basée sur celle décrite dans la publication suivante : « Pacheco et al. ; Structural characterization of chitin and chitosan obtained by biological and Chemical methods ; Biomacromolecules ; 12, 3285-3290, 2011 ».
En particulier, la méthode de détermination de la masse moléculaire de la chitine repose sur des mesures de viscosité de solutions diluées de chitine. Les dilutions sont réalisées dans du diméthyleacétamide contenant 5% de chlorure de lithium (DMAc-LiCI 5%). En effet, les polymères en solution augmentent la viscosité d’un solvant. La viscosité du polymère en solution dépend de sa concentration et de sa masse moléculaire. La relation est définie par l’équation de Mark-Houwink-Sakurada :
[h] = KMa
avec [h] : la viscosité intrinsèque, M : la masse moléculaire, K et a des constantes spécifiques d’un système solvant/polymère à une température donnée.
Les valeurs pour la chitine dissoute dans le solvant DMAc-LiCI 5 % à 25 'Ό sont : K = 0,24 mL.g-1 et a = 0,69 (Pacheco et al ; 201 1 ).
La viscosité intrinsèque correspond à la viscosité spécifique quand la concentration du polymère tend vers zéro.
[h] = c li®m 0 ( v^ c ) /
Pour mesurer la viscosité spécifique de la chitine, cinq solutions de faibles concentrations sont préparées dans le DMAc-LiCI 5 %. Les temps d’écoulement du solvant seul (t0) et des solutions (t) des différentes concentrations sont mesurés par un micro viscosimètre à chute de bille pour calculer la viscosité relative (hG). A partir de la viscosité relative fa), il est nécessaire de calculer les viscosités spécifiques (her), réduites (hίbά) et inhérentes (hih^ de chaque concentration de chitine.
Figure imgf000026_0001
La viscosité intrinsèque est alors calculée en traçant les courbes « concentration vs. viscosité réduite » (pente positive) et « concentration vs. viscosité inhérente » (pente négative). Chacune de ces courbes est extrapolée à la concentration de zéro. L’ordonnée à l’origine correspond à la viscosité intrinsèque. Des résultats similaires sont0 attendus des deux courbes. Enfin, pour déterminer la masse moléculaire de la chitine, l’équation de Mark-Houwink-Sakurada est appliquée.
III. Résultats
Les propriétés de la chitine obtenue sont présentées dans le Tableau 3 ci-5 dessous.
Figure imgf000026_0002
*MS : matière sèche
Tableau 3 : Propriétés de la chitine obtenue dans l’Exemple 1
L’abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue est présentée dans le Tableau 4 ci-dessous. Elle est exprimée en %.
Figure imgf000026_0003
Figure imgf000027_0001
Tableau 4 : Abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue dans l’Exemple 1
Trois acides aminés apparaissent particulièrement résistants au procédé, à savoir la valine, l’histidine et la lysine. Ils représentent en effet plus de 93% des acides aminés résiduels.
EXEMPLE 2 : Procédé d’obtention de chitosan selon l’invention
Pour préparer le chitosan, on utilise la chitine résultant de l’étape 5, 6 ou 7 de l’Exemple 1.
· Etape (optionnelle) 8 : Broyage de la chitine
La chitine a été broyée dans un broyeur ultracentrifuge à tamis à une taille de 250 pm.
• Etape 9 : Désacétylation de la chitine
La chitine est ensuite placée dans un réacteur où est ajoutée une solution de soude concentrée. L’hydroxyde de sodium en solution aqueuse à une teneur de 50% (soit une concentration d’hydroxyde de sodium en solution aqueuse de 12,5 mol/L) est ajouté selon un ratio poids en g de chitine broyée / volume en mL d’hydroxyde de sodium en solution aqueuse égal à 1 :50. La cuve est ensuite chauffée à une température de 100°C. La réaction de désacétylation est réalisée pendant 2 fois 2 heures, avec une étape intermédiaire de neutralisation du pH.
• Etape 10 : Récupération du chitosan
Le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape 9 est ensuite filtré (Filtre SEFAR MEDIFAB® 03-60/42) de sorte à récupérer du chitosan.
• Etape (optionnelle) 11 : Lavage
Le chitosan récupéré à l’issue de l’étape 10 est ensuite rincé à l’eau tiède du robinet jusqu’à neutralisation du pH.
On obtient ainsi du chitosan en poudre.
Le chitosan obtenu a une pureté par différence supérieure à 98%.
La masse moléculaire du chitosan obtenu est égale à 307 +/- 60 kg. mol-1.
· Etape (optionnelle) 12 : Séchage
La poudre de chitosan est ensuite séchée à 60°C afin d’obtenir une poudre ayant une teneur en matière sèche supérieure à 85%.
EXEMPLE 3 : Procédé d’obtention de chitine comparatif I. Matériel et méthodes
• Etape 1 : Abattage des insectes
Cette étape est identique à celle de l’Exemple 1.
• Etape 2 : Séparation des cuticules de la partie molle des insectes Cette étape est identique à celle de l’Exemple 1.
• Etape 3 : Traitement basique des cuticules
Dans un tricol de 2 L muni d’un réfrigérant et d’un agitateur mécanique (Heidolph® RZR1 ), on place 90,02 ± 0,02 g de cuticules humides obtenues à l’étape 2 (Matière Sèche = 40,1 ± 0,1 %) et 1 ,80 ± 0,02 L de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium de concentration égale à 1 mol.L1. Le milieu est chauffé avec un bain d’huile à une température de 90 ± 2 °C pendant 48 heures. Pendant toute la réaction, le milieu réactionnel est soumis à une agitation de 280 rpm.
On utilise donc environ 0,05 L de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium par gramme de matière sèche de cuticules.
Le ratio base en poids sec en g : cuticules en poids sec en g : eau en poids en g est environ égal à 0,9 :0,45 :22.
• Etape 4 : Récupération de la chitine
Le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape 3 est ensuite filtré (Filtre SEFAR MEDIFAB® 03-60/42) de sorte à récupérer la chitine.
• Etape (optionnelle) 5 : Lavage de la chitine
La chitine récupérée à l’issue de l’étape 4 est ensuite rincée à l’eau tiède du robinet jusqu’à neutralisation du pH.
• Etape (optionnelle) 6 : Séchage de la chitine
La chitine est ensuite séchée pendant 24 heures, à 60 °C, dans une étuve de séchage (Binder®, modèle FP53).
On obtient ainsi 6.3 ± 0.2 g de chitine.
II. Résultats
Les propriétés de la chitine obtenue à l’issue de l’étape 6 sont présentées dans le Tableau 5 ci-dessous.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
*MS : matière sèche
**aa : acides aminés
Tableau 5 : Propriétés de la chitine obtenue dans l’Exemple 3
L’abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue est présentée dans le Tableau 6 ci-dessous. Elle est exprimée en %.
Figure imgf000029_0002
Tableau 6 : Abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue dans l’Exemple 3
5 acides aminés apparaissent particulièrement résistants au procédé, à savoir l’alanine, la cystéine, la valine, l’histidine et la lysine. L’histidine, la lysine et l’alanine sont les 3 acides aminés les plus résistants. Ils représentent en effet plus de 85% des acides aminés résiduels.
EXEMPLE 4 : Obtention de chitine selon l’invention à partir de différents insectes
Différents insectes ont été utilisés dans cet exemple : Tenebrio molitor,
Pachnoda marginata, Zophobas morio et Galleria mellonella.
Les cuticules ont été obtenues à partir du stade larvaire des différents insectes selon les étapes 1 et 2 décrites à l’Exemple 1.
• Hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase
Les cuticules subissent alors une étape d’hydrolyse enzymatique dans les conditions suivantes :
Dans un tricol de 2 L muni d’un réfrigérant et d’un agitateur (Heidolph® RZR1 ), on place ITH g de cuticules humides obtenues à l’étape précédente (Matière sèche = ni %), une quantité qi (g ou mL) de protéase et 1 ,6 L ± 0,02 L d’eau chaude, de sorte que la concentration de protéase soit d’environ 140 I.U./g de cuticules sèches. Le milieu est chauffé avec un bain marie à une température de 60 ± 2°C pendant 6 heures. Ensuite, la température est portée à 80‘C pendant 15 min. Le milieu réactionnel est ensuite séparé via un extracteur de jus (Angelia 7500). Pendant toute la réaction, le milieu réactionnel est soumis à une agitation de 300 rpm. Le pH est compris entre 6 et 8, de préférence entre 6,5 et 7,5.
On obtient m2 g de résidu solide, et un hydrolysat. Les différentes conditions expérimentales sont résumées dans le Tableau 7. Le résidu solide est mélangé pour être homogène, pesé puis mis au réfrigérateur pour la nuit. L’hydrolysat est lyophilisé.
Figure imgf000030_0001
Tableau 7 : Conditions expérimentales des différentes hydrolyses enzymatiques en fonctions des insectes utilisés
• Traitement basique du résidu solide
Dans un tricol de 2 L muni d’un réfrigérant et d’un agitateur mécanique
(Heidolph® RZR1 ), on place m2g de résidu solide obtenu à l’étape précédente (Matière sèche = n2 %), et un volume Vi (Vi = m2 * n2 *25 mL) de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium (ou d’hydroxyde de potassium) de concentration égale à 1 ,0 mol.L 1. Le milieu est chauffé avec un bain d’huile à une température de 90 ± 2°C pendant 48 heures. Pendant toute la réaction, le milieu réactionnel est soumis à une agitation de 300 rpm. • Récupération, lavage et séchage de la chitine
La chitine est récupérée à l’issue de l’étape de traitement basique, lavée puis séchée dans les conditions décrites aux étapes 5, 6 et 7 de l’Exemple 1 respectivement.
Les conditions expérimentales du traitement basique pour différents insectes sont présentées dans le Tableau 8.
Figure imgf000031_0001
Tableau 8 : Conditions expérimentales du traitement basique de différents insectes
On recueille une masse m3 de chitine. Le rendement est calculé de la manière suivante : m3/m’i*100 et les résultats sont indiqués dans le Tableau 9.
Figure imgf000031_0002
Tableau 9 : Rendements d’extraction de chitine pour différents insectes
Les chitines sont ensuite analysées selon les méthodes d’analyses indiquées au point II de l’Exemple 1. Les résultats d’analyses sont présentés dans le Tableau 10, dans lequel les teneurs en cendres, lipides et acides aminés correspondent à des teneurs en gramme pour 100 g de matière sèche.
Figure imgf000032_0001
Tableau 10 : Propriétés des chitines obtenues à partir de différents insectes et différentes protéases
Le procédé selon l’invention permet d’obtenir une chitine présentant une pureté élevée, et ce, quel que soit l’insecte ou les conditions d’hydrolyse (protéase et base) utilisé(es).
L’abondance relative en acides aminés des chitines obtenues est présentée dans le Tableau 1 1 ci-dessous et est exprimée en pourcentages.
Figure imgf000033_0001
de différents insectes
Les conditions d’hydrolyse enzymatique (protéase utilisée), du traitement basique (NaOH ou KOH) ainsi que les insectes utilisés influent sur la composition en acides aminés de la chitine résultante.
EXEMPLE 5 : Obtention de chitosan selon l’invention à partir de différents insectes
• Broyage de la chitine
Chaque chitine obtenue à l’Exemple 4 est broyée finement dans un broyeur centrifuge (Retsch® ZM200) avec une grille de pores 250 pm.
• Désacétylation de la chitine
Dans un tricol de 2 L muni d’un réfrigérant et d’un agitateur (Heidolph® RZR1 ), on place une masse de m4 g de la chitine obtenue après l’étape de broyage, et un volume V2 (V2 = m4 *50 mL) de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium (ou d’hydroxyde de potassium) de concentration égale à 19,0 mol.L 1. Le milieu est chauffé avec un bain d’huile à une température de 100 ± 2°C pendant 2 heures. Pendant toute la réaction, le milieu réactionnel est soumis à une agitation de 300 rpm.
• Récupération du chitosan
Le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape de désacétylation est ensuite filtré (Filtre SEFAR MEDIFAB® 03-60/42) de sorte à récupérer le chitosan.
• Lavage du chitosan
Le chitosan récupéré est ensuite rincé à l’eau tiède du robinet jusqu’à neutralisation du pH.
II est ensuite remis en réaction dans un tricol contenant la même quantité de solution aqueuse d’hydroxyde de sodium (ou d’hydroxyde de potassium) et les 3 étapes précédentes (désacétylation, récupération et lavage) sont répétées à l’identique.
• Séchage du chitosan
Les étapes de désacétylation, récupération et lavage sont donc réalisées deux fois au total. A l’issue de ces étapes, le chitosan est séché pendant 24 heures, à 60‘O, dans une étuve de séchage (Binder®, modèle FP53). On recueille une masse m5 de chitosan. Le rendement est calculé de la manière suivante : m5/m4 *100 et les résultats sont résumés dans le Tableau 12. En particulier, le Tableau 12 fait référence à un ratio base : chitine : eau qui est un ratio en poids sec en g pour la base et la chitine, et en poids en g pour l’eau.
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0002
Tableau 12 : Masses de chitine, volume
Figure imgf000035_0001
base et rendement d’obtention de chitosan en fonction des insectes
Les chitosans sont ensuite analysés selon les méthodes d’analyses indiquées au point II de l’Exemple 1 . Les résultats d’analyses sont présentés dans le Tableau 13, dans lequel les teneurs en cendres, lipides et acides aminés correspondent à des teneurs en gramme pour 100 g de matière sèche. Dans ce tableau, la teneur en lipides mesurée est à la limite de détection.
Figure imgf000035_0003
Tableau 13 ’ropriétés des chitosans obtenus à partir de différents insectes
Le procédé selon l’invention permettant d’obtenir une chitine de pureté élevée, le chitosan résultant présente également cette caractéristique, même dans des conditions de désacétylation différentes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Chitine dont la pureté par différence est supérieure à 97,75%, la pureté par différence étant obtenue par soustraction des teneurs en impuretés en acides aminés, lipides et cendres, à la valeur de pureté absolue, ladite valeur de pureté absolue étant égale à 100%.
2. Chitine selon la revendication 1 , comportant moins de 1 ,2% en poids d’acides aminés sur le poids sec total de chitine.
3. Chitine selon la revendication 1 ou 2, comportant moins de 2% en poids de cendres sur le poids sec total de chitine.
4. Chitine selon l’une quelconques des revendications 1 à 3, dont la pureté par différence est supérieure ou égale à 98,0% et la masse molaire est supérieure ou égale à 800 kg. mol-1, la masse molaire étant déterminée grâce à la mesure de la viscosité par chute de bille.
5. Chitosan dont la pureté par différence est supérieure à 97,75%, la pureté par différence étant obtenue par soustraction des teneurs en impuretés en acides aminés, lipides et cendres, à la valeur de pureté absolue, ladite valeur de pureté absolue étant égale à 100%.
6. Chitosan selon la revendication 5, dont la pureté par différence est supérieure ou égale à 97,9% et la masse molaire supérieure ou égale à 480 kg. mol-1, la masse molaire étant déterminée grâce à la mesure de la viscosité par chute de bille.
7. Procédé d’obtention de chitine et/ou chitosan, à partir d’insectes, comprenant les étapes suivantes :
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
l’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide, et
- le traitement basique du résidu solide.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la séparation des cuticules de la partie molle des insectes est effectuée à l’aide d’un séparateur à bande.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel la protéase est choisie parmi le groupe constitué par les aminopepdidases, les métallocarboxypeptidases, les endopeptidases à sérine, les endopeptidases à cystéine, les endopeptidases aspartiques, les métalloendopeptidases.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la protéase est choisie parmi les endopeptidases à sérine.
1 1 . Procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel le traitement basique est réalisé avec une base forte.
12. Procédé d’obtention de chitine, à partir d’insectes, comprenant les étapes suivantes :
l’abattage des insectes,
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
l’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide,
- le traitement basique du résidu solide, et
- la récupération de la chitine.
13. Chitine susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 12.
14. Procédé d’obtention de chitosan, à partir d’insectes, comprenant les étapes suivantes :
l’abattage des insectes,
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
l’hydrolyse enzymatique des cuticules par une protéase, pour obtenir un résidu solide,
- le traitement basique du résidu solide,
- la récupération de la chitine,
- la désacétylation de la chitine, et
- la récupération du chitosan.
15. Chitosan susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 12, 14.
5
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