WO2019093400A1 - ミトコンドリア膜電位応答性蛍光性化合物 - Google Patents

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mitochondria
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川俣　純
康孝 鈴木
直哉 浅村
陽輔 仁子
仁望 関
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国立大学法人山口大学
国立大学法人高知大学
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    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to novel fluorescent compounds and, more particularly, to fluorescent compounds that change localization in response to mitochondrial membrane potential.
  • the present invention also relates to a fluorescent dye composition containing the compound.
  • the present invention relates to a method for detecting a change in mitochondrial membrane potential and a method for determining cell viability using the above-mentioned fluorescent dye composition.
  • Mitochondria are organelles involved in the control of apoptosis while producing energy of cells, and involved in cell death and death.
  • metabolic diseases such as diabetes, cerebral infarction and myocardial infarction, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and cancer are caused due to mitochondrial dysfunction. Therefore, it is important to observe mitochondrial changes also for elucidating the mechanisms of these diseases and developing therapeutic methods.
  • the mitochondrial membrane potential generated with energy production means a potential difference between the inside and the outside of the mitochondria, and represents the activity (activity) of the mitochondria itself. That is, when there is a membrane potential, energy is produced and the mitochondrial activity is high. On the other hand, when the membrane potential disappears, energy production is not performed and the vitality is low.
  • the mitochondrial membrane potential indicates the state of health of the cell, and is a normal cell when there is a membrane potential, and an abnormal cell when there is no membrane potential.
  • the mitochondria is stained with a dye that changes the light emission behavior according to the membrane potential, and the change in the light emission behavior is observed
  • a dye that respond to conventional mitochondrial membrane potential One is a type of dye whose emission intensity changes according to mitochondrial membrane potential, and the other is a type of dye whose emission color changes.
  • the change in emission intensity due to the mitochondrial membrane potential and the change in emission intensity due to the photobleaching of the dye occur simultaneously at the same time, does the change in fluorescence intensity depend on the change in membrane potential? It is difficult to distinguish between dye photobleaching and it is not suitable for detecting changes in membrane potential.
  • the excitation light source and the fluorescence detector each have a smaller number It is necessary to prepare two systems, and it is also necessary to adjust the excitation light source and the fluorescence detector in real time, which increases the cost of the apparatus and makes the experimental operation extremely complicated. Furthermore, in both types of dyes, there is a problem that it is necessary to use an organic solvent harmful to the cells in order to stain the cells from low solubility.
  • the property of the compound BP to transfer the localization position from mitochondria to the nucleus according to the mitochondrial membrane potential does not mean that the fluorescence intensity changes, it detects the change in the membrane potential without being affected by the photobleaching of the compound BP itself.
  • compound BP was highly water soluble and allowed staining of cells without using any organic solvent harmful to the cells. Therefore, cell death by the organic solvent did not occur, and observation of live cells for 24 hours or more was enabled.
  • the quantum yield ( ⁇ ) which is the ratio of the number of photons absorbed by the compound by absorption (excitation) to the number of photons emitted by fluorescence, is as low as 0.14 and the efficiency of light emission is good
  • a compound that is efficient for light emission is also required to detect fluorescence with high sensitivity.
  • Patent Documents 1 and 2 a compound having a high quantum yield and a good luminous efficiency
  • Patent Documents 1 and 2 light emission occurs in the blue or green region, and a compound emitting in the red region has not been obtained. Since light in the red region has high bio-permeability and facilitates identification of light emission, a compound having responsiveness to mitochondrial membrane potential and emitting light in the highly bio-transparent red region has been desired.
  • the present inventors examined the compound which has responsiveness to mitochondrial membrane potential and emits light in a highly bio-permeable red region.
  • a compound having a small polarizability tends to exhibit a function of monitoring the membrane potential due to a change in the staining site along with a change in the membrane potential because the bond with mitochondria is weak.
  • compounds with small polarizability have small conjugated systems, and light emission often occurs in the blue or green region instead of red.
  • the present inventors aimed to develop a compound that emits red light with small polarizability. In the case of naphthalene, the ana substitution has a lower polarizability than the amphi substitution.
  • X is (Wherein, R 1 represents a C 1 to C 10 alkyl group, Z ⁇ represents a counter anion to a pyridinium cation), k and m each represent an integer of 0 to 3, and l and n each represent 0 to It is an integer of 2, k, l, m and n are not simultaneously 0, and X may be the same or different.
  • R 2 represents an electron donating group or an electron withdrawing group, a and c are integers of 0 to 3, b and d are integers of 0 to 2, and R 2 may be the same or different.
  • the compound of the present invention is fluorescent and has the property of transferring localized sites from mitochondria to the nucleus according to the mitochondrial membrane potential, the change in mitochondrial membrane potential, ie, the activity of mitochondria The presence or absence can be determined from the localized position of the above-mentioned compound, and since light is emitted in the red region, it is excellent in biopermeability and the light emitting portion can be clearly identified.
  • the compound of the present invention is water-soluble and it is not necessary to use an organic solvent that is toxic to cells, observation of live cells is possible.
  • the compound of the present invention does not change the emission color of fluorescence during cell observation, it is sufficient to detect the fluorescence wavelength of a single wavelength emitted by irradiation of excitation light of a single wavelength, and a general fluorescence microscope Allows easy observation of cells.
  • the compound of the present invention also has multiphoton absorptivity, and for example, in observation with a multiphoton excitation fluorescence microscope, use is made of excitation light of small energy, that is, light of long wavelength reaching deep part of living body. As a result, the observation range in the depth direction can be expanded more than ever, and the object that can be observed by the multiphoton excitation fluorescence microscope can be expanded.
  • FIG. 1 is a 1 H NMR chart of a compound obtained in Example 1.
  • FIG. 6 is a 1 H NMR chart of the compound obtained in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing absorption spectra of a compound obtained in Example 1 and a compound obtained in Example 2.
  • FIG. 2 is a graph showing emission spectra of the compound obtained in Example 1 and the compound obtained in Example 2. It is a figure showing the microscope image of Hek293 cells before membrane potential fall (a), after membrane potential fall (b), and after membrane potential recovery (c) stained with the compound obtained in Example 1. The whitish part in the image is a red part.
  • the applicant has submitted the color drawing of FIG. 5 to the Japan Patent Office.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the formula (1).
  • X is (R 1 represents a C 1 to C 10 alkyl group, and Z ⁇ represents a counter anion to a pyridinium cation).
  • k and m each independently represent an integer of 0 to 3
  • l and n each independently represent an integer of 0 to 2
  • k, l, m and n are not simultaneously 0, and X May be the same or different.
  • R 2 represents an electron donating group or an electron withdrawing group
  • a and c each independently represent an integer of 0 to 3
  • b and d each independently represent an integer of 0 to 2
  • R 2 represents the same
  • X may be substituted on a non-substituted carbon atom.
  • Wavy lines represent geometric isomers E and Z.
  • the C1-C10 alkyl group in the formula (1) is a linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent.
  • R 1 can be a C1 to C3 alkyl group, and to delay the time to transfer to the nucleus In the above, the carbon number of R 1 can be more than that.
  • a halogen atom, an alkoxy group, an aryl group etc. are mentioned as a substituent of the said "optionally having a substituent.”
  • the counter anion Z ⁇ to the pyridinium cation is not particularly limited as long as it can form a salt with the pyridinium cation, and examples thereof include halide ions such as chlorine ion, bromine ion and iodine ion; hexafluorophosphate ion; Sulfonates such as methanesulfonate, p-toluenesulfonate, trifluoromethanesulfonate, trifluoroethanesulfonate and the like; hexafluoroantimonate, hexafluorophosphate, tetrafluoroborate, perchlorate ion and the like, preferably halides Ions, sulfonates, and perchlorate ions.
  • halide ions such as chlorine ion, bromine ion and iodine ion
  • hexafluorophosphate ion Sulfon
  • X in the formula (1) is substituted on the carbon atom of the benzene ring
  • k, l, m and n represent the number of X substituted on the carbon atom.
  • X represents one substitution at a time on the carbon atom of It is preferable that l and n be 0 from the viewpoint of improving the responsiveness to mitochondrial membrane potential and the red light-emitting property. Further, k and m are preferably 1 or 2. Preferably, k is 2, and l, m and n are 0, or k and m are 1 and l and n are 0. In the formula (1), the case where X is substituted at the 1,3 position and the case where it is substituted at the 1,8 position are more preferable.
  • R 2 represents an electron donating group or an electron withdrawing group.
  • R 2 is an electron donating group
  • the absorption wavelength can be shifted to a longer wavelength, and the fluorescence characteristics can be changed.
  • R 2 is an electron-withdrawing group
  • the absorption wavelength can be shifted to a short wavelength, and the fluorescence characteristics can be changed.
  • the electron donating group R 2 is not particularly limited as long as it is an organic group having an effect of increasing the electron density of the pyrene group, and examples thereof include a hydroxyl group, a C1 to C10 alkyl group, a C1 to C10 alkoxy group, an amino group and an ether Examples thereof include an alkyl group having a bond and an alkoxy group having an ether bond.
  • the electron withdrawing group R 2 is not particularly limited as long as it has an effect of reducing the electron density of the pyrene group, and examples thereof include halogens such as fluorine, chlorine, bromine and iodine, nitriles, carboxylic acids and carbonyl groups And cyano groups.
  • R 2 is substituted on the non-substituted carbon atom of X in the benzene ring.
  • R 2 is preferably substituted at the 1 to 10 position, and the total number of R 2 is preferably 1 to 6.
  • the method for synthesizing the compound represented by the formula (1) of the present invention includes a method in which a fused polycyclic moiety and a pyridine moiety are linked via a double bond. Specifically, the aldehyde represented by the formula (I) and the N-alkyl-4-methylpyridin-1-ium compound represented by the formula (II) are optionally added in the presence of a catalytic amount of a base.
  • the compound of formula (1) can be synthesized by reacting in a suitable reaction solvent.
  • aldehyde represented by the formula (I) although commercially available ones can be used, known methods such as, for example, J. Am. Org. Chem. , 2015, 80 (21), pp 10794 to 10805, and the like.
  • a method of deriving pyrene from an aryl compound by Friedel-Crafts reaction can also be mentioned, but it is not limited thereto.
  • N-alkyl-4-methylpyridin-1-ium compounds represented by the formula (II) can be prepared from 4-methyliodopyridine by Zhang, Y .; Wang, J .; Ji, P .; Yu, X .; Liu Liu, H .; Liu, X .; Zhao, N .; Huang, B. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 4582-4588 can be synthesized according to the method described in detail, specifically 4-methylpyridine and Although it can synthesize
  • haloalkanes 1-iodobutane, 1-iodo-2-methylpropane, 1-iodo-1-methylpropane, 2-iodo-2-methylpropane, 1-iodopentane, 1-iodo-3-methylbutane, 1 It is also possible to use commercially available haloalkanes such as -iodo-2,2-dimethylpropane, 1-iodohexane, 1-iodoheptane, 1-iodooctane and the like.
  • the ratio of the amount of the aldehyde to the amount of the N-alkyl-4-methylpyridin-1-ium compound used is not particularly limited, but the equivalent ratio of N-alkyl-4-methylpyridin-1-ium to the aldehyde is 2 .0 to 4.0, preferably 2.1 to 3.0.
  • Examples of the base include trimethylamine, triethylamine, diisopropylethylamine, dicyclohexylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, ethylenediamine, pyridine, piperidine and the like.
  • the amount of the base used is not particularly limited, but is appropriately selected from the range of 0.01 to 1.0 as an equivalent ratio to the aldehyde.
  • the compound and the compound represented by Formula (1) can be used as a fluorescent dye because they exhibit fluorescence.
  • the fluorescent dye composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least one of the compounds represented by Formula (1).
  • the fluorescent dye composition of the present invention may contain, in addition to the above compounds, a solubilizer, a pH regulator, a buffer, a tonicity agent and the like which are additives generally used for the preparation of reagents. The blending amount of these can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the fluorescent dye composition of the present invention preferably further contains a solvent to facilitate staining of cells and living tissues, and dimethylsulfoxide (DMSO) can be suitably used as the solvent.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Examples of the form of the fluorescent dye composition of the present invention include a form of a powder form, a form of a lyophilizate, a form of a granule, a form of a tablet, a form of a liquid preparation and the like.
  • the fluorescent dye composition of the present invention can be used for visualization of mitochondria.
  • the above-mentioned visualization of mitochondria refers to obtaining the mitochondrial presence in cells as visual information such as fluorescence microscope images and the like.
  • the fluorescent dye of the present invention is applied to cells that are energy-producing, ie, cells in which mitochondria (also referred to as 'active mitochondria') having a membrane potential in the state of energy production by aerobic respiration are present.
  • mitochondria also referred to as 'active mitochondria'
  • the mitochondria and the compound of the formula (1) contained in the fluorescent dye composition interact to localize the compound of the formula (1) in the mitochondria.
  • the compound of the formula (1) localized in mitochondria emits fluorescence of a predetermined wavelength, and such fluorescence is detected by a fluorescence microscope or the like.
  • a fluorescence microscope or the like it is possible to obtain a fluorescence microscope image of the observation target.
  • the fluorochrome composition of the present invention can discriminate whether it is a normal cell or a cell having mitochondria depolarized due to apoptosis, metabolic stress or the like, that is, discrimination of cell viability.
  • the compound of the formula (1) contained in the above-mentioned fluorochrome composition is localized to such mitochondria and fluorescence is detected, and it is judged as a normal cell.
  • the fluorescence of the present invention is applied to cells in which energy production has stopped, that is, cells in which mitochondria whose membrane potential has been depolarized in the state of stopping energy production by aerobic respiration (also referred to as 'mitochondria without activity').
  • the pigment composition is added, the mitochondrial membrane potential is depolarized, so the compound of formula (1) is not localized in the mitochondria, and the localization site is changed to other organelles such as nuclei or scatter.
  • a compound of the formula (1) present in other organelles such as a nucleus emits fluorescence of a predetermined wavelength, or
  • the light emission behavior is changed with normal cells because the fluorescence intensity detected is also reduced because the compound represented in 1.) is dispersed, and cells having mitochondria which are depolarized due to apoptosis, metabolic stress, etc. It is judged. It is judged that the mitochondria in this case is not active.
  • the compound represented by the formula (1) contained in the fluorescent dye composition of the present invention changes the localization location in cells in response to the change in mitochondrial membrane potential, and the fluorescence of the compound is detected. It is possible to determine the presence or absence of mitochondrial activity by confirming the location of The detection of a change in mitochondrial membrane potential in the present invention is to determine the presence or absence of mitochondrial activity.
  • Changes in mitochondrial membrane potential indicate the presence or absence of mitochondrial activity, that is, whether or not energy production of the cell is being performed. Therefore, by observing the cells with the fluorochrome composition of the present invention, it can be discriminated whether it is a normal cell or a cell having mitochondria depolarized by apoptosis, metabolic stress or the like, ie, discrimination of cell viability.
  • Irradiation of cells or living tissues with excitation light or detection of fluorescence emitted from the compound represented by formula (1) can be performed by a fluorescence microscope.
  • the excitation light is not particularly limited as long as it can absorb the compound represented by the formula (1), and it is light in the ultraviolet region, visible region, and infrared region.
  • excitation light cause the compound represented by Formula (1) to cause multiphoton absorption, specifically, a wavelength range of 600 to 1200 nm.
  • a three-dimensional image can be obtained by condensing the excitation light with a lens or the like, scanning the focal position, and irradiating the light.
  • Example 3 Measurement of Absorption Spectrum and Emission Spectrum
  • the ultraviolet-visible absorption spectrum was measured using a V-670-UV-VIS-NIR spectrophotometer (Jasco Co.).
  • the luminescence (fluorescence) spectrum was measured using C9920-03G (Hamamatsu Photonics K. K.).
  • the compound 2a obtained in Example 1 and the compound 2b obtained in Example 2 were measured using samples adjusted to have a concentration of 10 ⁇ 6 mol / L.
  • the measurement results are shown in FIG. 3 and FIG. FIG. 3 represents the UV-visible absorption spectrum
  • FIG. 4 represents the emission spectrum.
  • Hek293 cells Human fetal kidney cells, Hek293 cells, were used as model cells for staining. Hek 293 cells were cultured at 37 ° C., 5% CO 2 in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% (v / v) fetal bovine serum, 1% (v / v) trypsin and streptomycin .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the fluorescence microscope was created using the optical block (Hamamatsu Photonics K. K.).
  • a femtosecond titanium sapphire laser (Mira 900, Coherent) was used as a light source.
  • a photomultiplier R 928, Hamamatsu Photonics K. K.
  • DC detection was performed via a socket with a preamplifier (5 MHz) at an applied voltage of 1000 V.
  • CCCP carbonyl cyanide-m-chlorophenyl hydrazone
  • the compound of the present invention is a compound that changes its localization according to mitochondrial membrane potential and emits red fluorescence.
  • the compound of the present invention is fluorescent and has the property of being localized in mitochondria, so that a microscopic image visualizing mitochondria can be obtained.
  • the intensity of excitation light for irradiating tissues or cells to be observed may be weak, damage to living tissues or cells by light irradiation, and compounds Photobleaching can be suppressed.
  • the compound of the present invention is fluorescent and has the property of transferring localized sites from mitochondria to the nucleus according to mitochondrial membrane potential, it is possible to detect changes in mitochondrial membrane potential.
  • the compound of the present invention as a fluorescent dye, living cells can be observed and cells can be easily observed by a general fluorescence microscope.
  • the fluorescent dye composition of the present invention is a preventive research on diseases caused by dysfunction of mitochondria and research on elucidation of development mechanism of diseases, for example, effects of drugs by administration of therapeutic agents, effects on mitochondrial vitality and cell life and death It can be used when testing etc.
  • the compound of the present invention also has multiphoton absorption or multiphoton excitation fluorescence characteristics, and for example, excitation light of weak intensity in observation with a multiphoton excitation fluorescence microscope, that is, a long wavelength reaching the deep part of living body Because it is possible to use the light of (1), it is possible to widen the observation range in the depth direction more than ever, and it is possible to widen the object that can be observed by the multiphoton excitation fluorescence microscope.

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Abstract

細胞を染色できる色素であって、水溶性を備え、発光の効率が良く、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有し、赤色領域で発光する化合物を提供することを課題とする。本発明の化合物は、式（１）［式（１）中、Ｘは、式（２）（式（２）中、Ｒ１はＣ１～Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ－はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表す。）で表され、ｋ及びｍは０～３の整数であり、ｌ及びｎは０～２の整数であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは同時に０ではなく、Ｘは同じでも異なっていてもよい。Ｒ２は電子供与性基又は電子求引性基を表し、ａ及びｃは０～３の整数であり、ｂ及びｄは０～２の整数であり、Ｒ２は同じでも異なっていてもよく、Ｘが置換していない炭素原子上に置換する。波線は、幾何異性体Ｅ、Ｚを表す。］で表される。 【化１】

Description

ミトコンドリア膜電位応答性蛍光性化合物
　本発明は、新規な蛍光性化合物に関し、さらに詳しくは、ミトコンドリア膜電位に応答して局在場所を変化させる蛍光性化合物に関する。また、該化合物を含有する蛍光色素組成物に関する。さらに、上記蛍光色素組成物を用いた、ミトコンドリア膜電位の変化の検出方法や細胞の生死の判別方法に関する。
　ミトコンドリアは、細胞のエネルギーを生産する一方でアポトーシスの制御にも関わり、細胞の生死に関わる細胞小器官である。また、ミトコンドリアの機能障害に起因して、糖尿病、脳梗塞、心筋梗塞等の代謝疾患、アルツハイマーやパーキンソン病等の神経変性疾患、癌が発病することが指摘されている。そのため、これら疾患のメカニズム解明や、治療方法の開発のためにも、ミトコンドリアの変化を観察することは重要である。
　エネルギー生産に伴って生じるミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリアの内側と外側での電位差を意味し、ミトコンドリア自体の活力（活性）を表す。すなわち、膜電位があるときはエネルギーが生産され、ミトコンドリアの活力が高い状態にある。他方、膜電位が消失しているときは、エネルギー生産がされず、活力が低い状態にある。また、ミトコンドリア膜電位は、細胞の健康状態を表し、膜電位があるときは正常細胞で、膜電位がないときは異常細胞とされる。
　ミトコンドリア膜電位の変化を検出したり、該変化による細胞の健康状態を判別したりするためには、膜電位に応じて発光挙動を変化させる色素によりミトコンドリアを染色し、その発光挙動の変化を観測する方法がある。従来のミトコンドリア膜電位に応答する色素には、２種類のタイプがある。一つは、ミトコンドリア膜電位に応じて発光強度が変化する型の色素、もう一つは、発光色が変化する型の色素である。しかし、発光強度が変化する型の色素は、ミトコンドリア膜電位による発光強度の変化と、色素自体の光退色による発光強度の変化が同時に起こるため、蛍光強度の変化が膜電位の変化によるものか、色素の光退色によるものかを区別することが難しく、膜電位の変化の検出に適するとはいえない。
　また、もう一方の発光色が変化する型の色素においても、膜電位の変化に伴う色素の発光色の変化を観測するために、励起光源及び蛍光検出器は発光色に応じてそれぞれ少なくても２系統用意する必要があり、且つリアルタイムで上記励起光源及び蛍光検出器を調整する必要もあり、装置が高コスト化するとともに、実験操作が極めて煩雑となる。さらに、どちらの型の色素も、溶解度の低さから細胞を染色するには、細胞に対して有害な有機溶媒を用いなければならないという問題もある。
　本発明者らは、ミトコンドリア膜電位に応じて、局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有している以下の化合物ＢＰを見いだし、細胞の染色に利用できることを既に報告している（非特許文献１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ミトコンドリア膜電位に応じて、化合物ＢＰが局在場所をミトコンドリアから核に移す性質は、蛍光強度が変化する訳ではないので、化合物ＢＰ自身の光退色の影響を受けずに膜電位の変化を検出することを可能にする。また、蛍光色の変化もないため、特別な励起光源及び蛍光検出装置を必要とせず、一般的な蛍光顕微鏡による膜電位の変化の検出を可能にした。また、化合物ＢＰは水溶性が高く、細胞にとって有害な有機溶媒を用いなくても細胞の染色を可能にした。そのため、有機溶媒による細胞死が起こらず、２４時間以上にわたる生きた細胞の観察を可能にした。
　しかし、化合物ＢＰにおける、吸収（励起）によって化合物に吸収された光子数と蛍光によって放出された光子数との比である量子収率（φ）が０．１４と低く、発光の効率がよいものではなく、高感度で蛍光を検出するためにも発光の効率がよい化合物が必要とされていた。
　そこで、本発明者らは、量子収率が高く発光効率のよい化合物をさらに提案した（特許文献１及び２）。しかし、特許文献１及び２で提案した化合物は、発光が青や緑の領域で生じるものであり、赤色領域で発光する化合物は得られていなかった。赤色領域の光は生体透過性が高く発光の識別が容易となるため、ミトコンドリア膜電位に対する応答性を持ち、かつ生体透過性の高い赤色領域で発光する化合物が求められていた。
特開２０１６－１６６１５４号公報 特開２０１７－４８２６８号公報
H. Moritomo, K. Yamada, Y. Kojima, Y. Suzuki, H. Kinoshita, A. Sasaki, S. Mikuni, M. Kinjo, J. Kawamata, Cell Struct. Funct. 39 (2014) 125.
　細胞を染色できる色素であって、水溶性を備え、発光の効率が良く、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有し、赤色領域で発光する化合物を提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するためにミトコンドリア膜電位に対する応答性を持ち、かつ生体透過性の高い赤色領域で発光する化合物の検討を行った。分極率が小さい化合物は、ミトコンドリアとの結合が弱いため、膜電位の変化に伴って染色個所が変化することで膜電位のモニタリング機能が現れやすい。しかし、分極率が小さい化合物は、共役系が小さく、発光は赤ではなく青や緑の領域に生じることが多い。本発明者らは、分極率が小さく、赤色発光する化合物の開発を目指した。ナフタレンの場合、ａｎａ置換体は、ａｍｐｈｉ置換体に比べ分極率が小さい。そこで、ナフタレンにおけるａｎａ置換体に相当する位置に置換基を有するピレン誘導体を合成したところ、ミトコンドリア膜電位に対する応答性を持ち、かつ赤色領域で発光する化合物が得られることを見いだしたものである。
　すなわち、本発明は以下に示す事項により特定されるものである。
（１）式（１）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（１）中、Ｘは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１はＣ１～Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ－はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表す。）で表され、ｋ及びｍは０～３の整数であり、ｌ及びｎは０～２の整数であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは同時に０ではなく、Ｘは同じでも異なっていてもよい。Ｒ２は電子供与性基又は電子求引性基を表し、ａ及びｃは０～３の整数であり、ｂ及びｄは０～２の整数であり、Ｒ２は同じでも異なっていてもよく、Ｘが置換していない炭素原子上に置換する。波線は、幾何異性体Ｅ、Ｚを表す。］
（２）カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、スルホネート又は過塩素酸イオンであることを特徴とする上記（１）記載の化合物。
（３）上記（１）又は（２）記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光色素組成物。
（４）上記（１）又は（２）記載の化合物の１又は２以上を用いることを特徴とする、ミトコンドリア膜電位の変化の検出方法。
（５）上記（１）又は（２）記載の化合物の１又は２以上を用いることを特徴とする、細胞の生死を判別する方法。
　本発明の化合物は、蛍光性があり、また、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有していることから、ミトコンドリアの膜電位の変化、すなわち、ミトコンドリアの活力の有無を上記化合物の局在場所から判別することができ、赤色領域で発光するため生体透過性に優れ発光個所を明確に識別できる。また、本発明の化合物は水溶性を示し、細胞に毒性のある有機溶媒を使用する必要がないため、生きた細胞の観察が可能である。また、本発明の化合物は、細胞観察中に蛍光の発光色の変化がないため、単一波長の励起光の照射によって発光する単一波長の蛍光波長を検出すればよく、一般的な蛍光顕微鏡によって簡単に細胞の観察ができる。また、本発明の化合物は多光子吸収性も有しており、例えば、多光子励起蛍光顕微鏡での観察において、小さいエネルギーの励起光、すなわち、生体深部まで到達する長波長の光を利用することができるため、奥行き方向の観察範囲をこれまでよりも大きく広げることが可能になり、多光子励起蛍光顕微鏡により観察できる対象を広げることができる。
実施例１で得られた化合物の１ＨＮＭＲチャートである。 実施例２で得られた化合物の１ＨＮＭＲチャートである。 実施例１で得られた化合物と実施例２で得られた化合物の吸収スペクトルを表す図である。 実施例１で得られた化合物と実施例２で得られた化合物の発光スペクトルを表す図である。 実施例１で得られた化合物により染色された膜電位低下前（ａ）、膜電位低下後（ｂ）、膜電位回復後（ｃ）のＨｅｋ２９３細胞の顕微鏡画像を表す図である。画像の中で白っぽい箇所は赤色の箇所である。なお、基礎出願において出願人は、日本国特許庁に図５のカラー図面を提出している。 実施例２で得られた化合物により染色された膜電位低下前（ａ）、膜電位低下後（ｂ）、膜電位回復後（ｃ）のＨｅｋ２９３細胞の顕微鏡画像を表す図である。画像の中で白っぽい箇所は赤色の箇所である。なお、基礎出願において出願人は、日本国特許庁に図６のカラー図面を提出している。
（化合物）
　本発明の化合物は、式（１）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（１）中、Ｘは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （Ｒ１はＣ１～Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ－はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表す。）で表される。式（１）中、ｋ及びｍはそれぞれ独立に０～３の整数であり、ｌ及びｎはそれぞれ独立に０～２の整数であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは同時に０ではなく、Ｘは同じでも異なっていてもよい。Ｒ２は電子供与性基又は電子求引性基を表し、ａ及びｃはそれぞれ独立に０～３の整数であり、ｂ及びｄはそれぞれ独立に０～２の整数であり、Ｒ２は同じでも異なっていてもよく、Ｘが置換していない炭素原子上に置換する。波線は幾何異性体Ｅ、Ｚを表す。
　式（１）におけるＣ１～Ｃ１０のアルキル基とは、置換基を有してもよい炭素数１～１０の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－へキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基等が挙げられる。また、アルキル基の長さにより、式（１）で表される化合物がミトコンドリアの膜電位に応じて移動する際の時間を調整することが可能である。アルキル基の長さが長いと式（１）で表される化合物がミトコンドリアの膜電位に応じて移動する際に、膜電位を下げてから核に移行するまでの時間を遅くできる。したがって、膜電位を下げてから核に移行するまでの時間を早くしたい場合には、例えば、Ｒ１をＣ１～Ｃ３のアルキル基とすることができ、核に移行するまでの時間を遅くしたい場合には、Ｒ１の炭素数をそれ以上とすることができる。
　上記「置換基を有していてもよい」の置換基としては、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリール基等が挙げられる。
　上記ピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンＺ－としては、上記ピリジニウムカチオンと塩を形成できるものであれば特に制限されず、例えば、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲン化物イオン；ヘキサフルオロリン酸イオン；メタンスルホネート、p－トルエンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート、トリフルオロ
エタンスルホネート等のスルホネート；ヘキサフルオロアンチモネート、ヘキサフルオロホスフェート、テトラフルオロボラート、過塩素酸イオン等を挙げることができ、好ましくは、ハロゲン化物イオン、スルホネート、過塩素酸イオンである。
　式（１）におけるＸはベンゼン環の炭素原子上に置換しており、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは炭素原子上に置換しているＸの個数を表す。例えば、（Ｘ）ｋにおいてｋ＝０とは、当該ベンゼン環がＸで置換されていない状態を表し、ｋ＝１とは、当該ベンゼン環の１個の炭素原子上にＸが１個置換している状態を表し、ｋ＝２とは、当該ベンゼン環の２個の炭素原子上に、それぞれＸが１個ずつ置換している状態を表し、ｋ＝３とは、当該ベンゼン環の３個の炭素原子上に、それぞれＸが１個ずつ置換している状態を表す。ミトコンドリア膜電位に対する応答性、赤色の発光性を向上させる観点から、ｌ及びｎは０であることが好ましい。また、ｋ及びｍは１又は２であることが好ましい。また、ｋが２でありｌ、ｍ及びｎが０、あるいはｋ及びｍが１でありｌ及びｎが０であることが好ましい。式（１）において、Ｘが１，３位に置換している場合及び１，８位に置換している場合がより好ましい。
　Ｒ２は電子供与性基又は電子求引性基を表す。Ｒ２が電子供与性基の場合、吸収波長を長波長へシフトさせることができ、蛍光特性を変化させることができる。また、Ｒ２が電子求引性基の場合、吸収波長を短波長へシフトさせることができ、蛍光特性を変化させることができる。電子供与性基Ｒ２としては、ピレン基の電子密度を増加させる効果がある有機基であれば特に制限されず、例えば、水酸基、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ基、アミノ基、エーテル結合を有するアルキル基及びエーテル結合を有するアルコキシ基等を挙げることができる。電子求引性基Ｒ２としては、ピレン基の電子密度を減少させる効果がある基であれば特に制限されず、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン、ニトリル、カルボン酸、カルボニル基、シアノ基等を挙げることができる。Ｒ２が存在する場合、Ｒ２はベンゼン環のＸが置換していない炭素原子上に置換している。Ｒ２は１～１０位に置換していることが好ましく、Ｒ２の総個数は、１～６が好ましい。
　式（１）で表される化合物としては、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（化合物の合成）
　本発明の式（１）で表される化合物の合成法は、縮合多環部分とピリジン部分とを二重結合を介して連結する方法が挙げられる。具体的には、式（Ｉ）で表されるアルデヒドと式（II）で表されるＮ－アルキル－４－メチルピリジン－１－イウム化合物とを、触媒量の塩基の存在下、必要に応じて適当な反応溶媒中で反応することにより式（１）の化合物を合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ１、Ｚ－は上記と同じ意味を表し、波線は幾何異性体Ｅ又はＺを表す。Ｙは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 を表す。）
　式（Ｉ）で表されるアルデヒドは、市販のものを使用することもできるが、公知の方法、例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１５，８０（２１），ｐｐ１０７９４～１０８０５に記載された方法等で合成することができる。例えば、ピレンをフリーデル・クラフツ反応によりアリール化合物から誘導する方法もが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　式（II）で表されるＮ－アルキル－４－メチルピリジン－１－イウム化合物は、４－メチルヨードピリジンからZhang, Y.; Wang, J.; Ji, P.; Yu, X.; Liu, H.; Liu, X.; Zhao, N.; Huang, B. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 4582-4588に記載の方法にしたがって合成でき、具体的には、４－メチルピリジンとハロアルカンとを反応させることによって合成できるが、これに限定されるものではなく、市販のものを用いてもよい。上記ハロアルカンとしては、１－ヨードブタン、１－ヨード－２－メチルプロパン、１－ヨード－１－メチルプロパン、２－ヨード－２－メチルプロパン、１－ヨードペンタン、１－ヨード－３－メチルブタン、１－ヨード－２，２－ジメチルプロパン、１－ヨードヘキサン、１－ヨードヘプタン、１－ヨードオクタン等の市販のハロアルカンを使用することもできる。
　また、上記アルデヒドと上記Ｎ－アルキル－４－メチルピリジン－１－イウム化合物の使用量比は、特に制限されないが、Ｎ－アルキル－４－メチルピリジン－１－イウムのアルデヒドに対する当量比として、２．０～４．０、好ましくは２．１～３．０の範囲から適宜選択される。
　上記塩基としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ピリジン、ピペリジン等を挙げることができる。塩基の使用量は、特に限定されないが、前記アルデヒドに対する当量比として、０．０１～１．０の範囲から適宜選択される。
（蛍光色素組成物）
　式（１）で表される化合物及は、蛍光性を示すため、蛍光色素として用いることができる。本発明の蛍光色素組成物は、式（１）で表される化合物の少なくとも一つを含むものであれば特に制限されない。本発明の蛍光色素組成物は、上記化合物に加えて、試薬の調製に通常用いられる添加剤である、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤等を含んでいてもよく、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。また、本発明の蛍光色素組成物は、細胞や生体組織の染色をしやすくするために、さらに溶媒を含むことが好ましく、かかる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を好適に用いることができる。本発明の蛍光色素組成物の形態としては、粉末形態の形態、凍結乾燥物の形態、顆粒剤の形態、錠剤の形態、液剤の形態等を挙げることができる。
　本発明の蛍光色素組成物は、ミトコンドリアの可視化に用いることができる。上記のミトコンドリアの可視化とは、ミトコンドリアの細胞中での存在を、蛍光顕微鏡画像等のような視覚情報として得ること指す。具体的には、エネルギー生産されている細胞、すなわち、好気呼吸によってエネルギー生産している状態の膜電位を有するミトコンドリア（‘活性のあるミトコンドリア’とも称す）が存在する細胞に本発明の蛍光色素組成物を添加すると、ミトコンドリア膜電位に応答して、ミトコンドリアと蛍光色素組成物に含まれる式（１）の化合物とが相互作用して、ミトコンドリアに式（１）の化合物が局在する。上記細胞に所定の波長の励起光が照射されると、ミトコンドリアに局在する式（１）で表される化合物より所定の波長の蛍光が発せられ、かかる蛍光が蛍光顕微鏡等で検出されることによって、観察対象の蛍光顕微鏡画像を得ることができる。以上のように、ミトコンドリアから蛍光が検出されることによって、ミトコンドリアは活性を有していると判断される。
　また、本発明の蛍光色素組成物は、正常な細胞か、アポトーシスや代謝ストレス等により脱分極したミトコンドリアを有する細胞かの判別、すなわち、細胞の生死の判別ができる。上述したように、細胞が活性のあるミトコンドリアを含む場合、上記蛍光色素組成物に含まれる式（１）の化合物がかかるミトコンドリアに局在して蛍光が検出され、正常な細胞と判断される。
　他方、エネルギー生産が停止した細胞、すなわち、好気呼吸によるエネルギー生産を停止している状態の膜電位が脱分極したミトコンドリア（‘活性のないミトコンドリア’とも称す）が存在する細胞に本発明の蛍光色素組成物を添加すると、ミトコンドリア膜電位は脱分極しているためミトコンドリアに式（１）の化合物は局在せず、局在場所を核等の他の細胞小器官に変化させるか、細胞質に分散する。上記細胞に所定の波長の励起光が照射されると核等の他の細胞小器官に存在する式（１）で表される化合物より所定の波長の蛍光が発せられるか、細胞質に式（１）で表される化合物が分散しているために検出される蛍光強度も小さくなるかして、正常な細胞とは発光挙動が変化するため、アポトーシスや代謝ストレス等により脱分極したミトコンドリアを有する細胞と判断される。この場合のミトコンドリアは活性がないと判断される。　
　このように、本発明の蛍光色素組成物に含まれる式（１）で表される化合物はミトコンドリア膜電位の変化に応答して細胞中で局在場所を変化させ、該化合物の蛍光が検出される場所を確認することによってミトコンドリアの活性の有無を判別できる。本発明におけるミトコンドリア膜電位の変化の検出とは、ミトコンドリアの活性の有無を判別することである。
　ミトコンドリア膜電位の変化から、ミトコンドリアの活性の有無、すなわち、細胞のエネルギー生産がされているか否かがわかる。したがって、本発明の蛍光色素組成物による細胞の観察によって、正常な細胞か、アポトーシスや代謝ストレス等により脱分極したミトコンドリアを有する細胞かの判別、すなわち、細胞の生死の判別ができる。
　細胞や生体組織への励起光の照射や式（１）で表される化合物より発せられる蛍光の検出は、蛍光顕微鏡によって行うことができる。上記励起光としては、式（１）で表される化合物が吸収できる波長であれば特に制限されず、紫外領域、可視領域、赤外領域の光である。そしてまた、生体組織の三次元的なイメージを得るために、励起光は式（１）で表される化合物に多光子吸収を起こさせるものが好ましく、具体的には、６００～１２００ｎｍの波長領域の励起光をレンズ等で集光し焦点の位置を走査して光を照射することで三次元的なイメージを得ることができる。
　以下に、実施例において本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術範囲は、これらに限定されるものではない。
　［実施例１］
４，４'-（（１Ｅ，１’Ｅ）-ピレン-１，３-ジイルビス（エテン-２，１-ジイル））ビス（１-メチルピリジン-１-イウム）ヨージド［4,4'-((1E,1'E)-pyrene-1,3-diylbis(ethene-2,1-diyl))bis(1-methylpyridin-1-ium)iodide］ (２ａ) の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　２００ｍＬ のナスフラスコに上記化合物１ａ (１５０ｍｇ、０．５８１ｍｍｏｌ) と １，４－ジメチルピリジン－１－イウムヨージド (５４６．３ｍｇ、２．３２４ｍｍｏｌ) を量りとり、ＤＭＦ（６０ｍＬ） とピペリジン (１５ｄｒｏｐｓ) を加え、１００ ℃で還流・攪拌を行った。１７ 時間後反応を終了させ、反応溶液を減圧濃縮した。濃縮物を熱クロロホルムで２回、熱メタノールで２回洗浄した。その結果、赤茶色固体の化合物２ａ（６７．１ｍｇ、 収率２２％） が得られた。得られた化合物２ａの１ＨＮＭＲデータを以下に示す。また、１ＨＮＭＲチャートを図１に示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO, TMS) δ = 4.30 (6H, s), 8.01 (2H, d, Ｊ=15.95), 8.17 (1H,t, Ｊ=7.51), 8.44 (2H, d, Ｊ=9.19), 8.46(2H, d, Ｊ=7.51), 8.54 (4H, d, Ｊ=6.79), 8.93-8.95 (6H, m), 9.11 (2H, d, Ｊ=15.95), 9.10 (1H, s)
　［実施例２］
４，４'-（（１Ｅ，１’Ｅ）-ピレン-１，８-ジイルビス（エテン-２，１-ジイル））ビス（１-メチルピリジン-１-イウム）ヨージド［4,4'-((1E,1'E)-pyrene-1,8-diylbis(ethene-2,1-diyl))bis(1-methylpyridin-1-ium) iodide］(２ｂ) の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　２００ｍＬ のナスフラスコに上記化合物１ｂ (１００ｍｇ、０．３８７ｍｍｏｌ) と １，４－ジメチルピリジン－１－イウムヨージド (３６４ｍｇ、１．５４９ｍｍｏｌ) を量りとり、ＤＭＦ（６０ｍＬ） とピペリジン (１５ｄｒｏｐｓ) を加え、１００ ℃で還流・攪拌を行った。１７ 時間後反応を終了させ、反応溶液を減圧濃縮した。濃縮物を熱クロロホルムで２回、熱メタノールで２回洗浄した。その結果、赤黒色固体の化合物２ｂ（１１４．７ｍｇ、 収率４３％） が得られた。得られた化合物２ｂの１ＨＮＭＲデータを以下に示す。また、１ＨＮＭＲチャートを図２に示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO, TMS) δ = 4.28 (6H, s), 7.88 (2H, d, J=15.98), 8.32 (2H, s), 8.46 (2H, d, Ｊ=8.26), 8.51 (4H, d, Ｊ=6.69), 8.69 (2H, d,Ｊ=8.26), 8.92 (4H, d, Ｊ=6.69), 9.04 (2H, s), 9.14 (2H, d, Ｊ=15.98)
　［実施例３］吸収スペクトル及び発光スペクトルの測定
　紫外－可視吸収スペクトルは、V-670-UV-VIS-NIR spectrophotometer（Jasco Co.）を用いて測定した。発光（蛍光）スペクトルは、C9920-03G（Hamamatsu Photonics. K. K.）を用いて測定した。実施例１で得られた化合物２ａ及び実施例２で得られた化合物２ｂについて、それぞれ濃度が１０－６ｍｏｌ／Ｌとなるように調整した試料を用いて測定した。測定結果を、図３及び図４に示す。図３は紫外－可視吸収スペクトルを表し、図４は発光スペクトルを表す。
［実施例４］細胞の蛍光化と観察
［細胞の培養］
　染色のモデル細胞としてヒト胎児腎細胞であるＨｅｋ２９３細胞を使用した。Ｈｅｋ２９３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）のトリプシン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
［細胞の蛍光化］
　顕微鏡観察を行う準備のために、Ｈｅｋ２９３細胞を３５ｍｍガラスベースディッシュに細胞密度１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように継代した。継代して２４時間後、細胞がディッシュへ付着していることを顕微鏡観察により確認した。ディッシュより培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回細胞を洗浄した。実施例１で得られた化合物２ａ及び実施例２で得られた化合物２ｂのそれぞれの化合物の１×１０－３ｍｏｌ　ｄｍ－３のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液２μＬを添加したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬ（ＰＹ最終濃度１μｍｏｌ　ｄｍ－３、最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））をディッシュに入れ、１２時間インキュベートすることにより染色を行った。顕微鏡観察の直前に、色素を含む培地をディッシュから取り除き、ＰＢＳを用いて２回細胞を洗浄し、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬをディッシュに加えた。
［蛍光顕微鏡観察］
　蛍光顕微鏡は、オプティカルブロック（Hamamatsu Photonics K. K.）を用いて作成した。光源にはフェムト秒チタンサファイヤレーザー（Mira900、Coherent）を用いた。蛍光の検出には光電子増倍管（R928、Hamamatsu Photonics K. K.）を用い、印加電圧１０００Ｖでプリアンプ（５ＭＨｚ）付きソケットを経てＤＣ検出した。サンプルステージにはKZG0620-Gを用い、対物レンズは倍率４０倍、ＮＡ＝１．１５の無限遠補正対物レンズを用いた。なお、膜電位の調整、すなわち、膜電位の低下への誘導は、脱共役剤であるカルボニルシアニド－ｍ－クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）を用いた。ＣＣＣＰは、ミトコンドリアのプロトン透過性を増加させてミトコンドリア膜電位を崩壊させる化合物である。ＣＣＣＰをＤＭＳＯに溶解させ、１０ｍｍｏｌ／ｄｍ３の溶液を調製した。調製したＣＣＣＰのＤＭＳＯ溶液を、培地に対して０．１％（ｖ／ｖ）となるよう添加した（最終ＣＣＣＰ濃度　１０（ｍｏｌ／ｄｍ３）。添加して５分後、蛍光顕微鏡により観察した。観察後、ＣＣＣＰが入った培地を取り除き、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地で４～５回洗浄し、ミトコンドリア膜電位を回復させた。回復後、蛍光顕微鏡により観察した。観察により得られた画像を図５及び図６に示す。図５は実施例１で得られた化合物２ａについての結果であり、図６は実施例２で得られた化合物２ｂについての結果である。図５及び図６における（ａ）はＣＣＣＰ添加前（膜電位正常）、（ｂ）はＣＣＣＰ添加後（膜電位低下）、（ｃ）はＣＣＣＰ除去、洗浄後（膜電位回復）の観察結果を示す。
　図５及び図６に示されるように、実施例１で得られた化合物２ａ及び実施例２で得られた化合物２ｂは、膜電位の低下前はミトコンドリアで赤色の蛍光が検出され、核では蛍光が検出されなかったが、膜電位の低下後は核での赤色の蛍光が検出されるようになり、蛍光が検出される場所が変化した。また、膜電位回復後はミトコンドリアで赤色の蛍光が検出された。したがって、本発明の化合物は、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所が変化し、赤色の蛍光を発する化合物である。
　本発明の化合物は、蛍光性及びミトコンドリアに局在する性質を有しているため、ミトコンドリアを可視化した顕微鏡画像を得られる。また、本発明の化合物を細胞の染色に使用した場合、観察する対象である組織や細胞へ照射する励起光の強度は弱くてもよく、光照射による生体組織や細胞へのダメージ、及び、化合物の光退色を抑制できる。本発明の化合物は、蛍光性があり、また、ミトコンドリア膜電位に応じて局在場所をミトコンドリアから核に移す性質を有していることから、ミトコンドリアの膜電位の変化を検出することができる。また、本発明の化合物を蛍光色素として用いることにより、生きた細胞の観察が可能で一般的な蛍光顕微鏡によって、簡単に細胞の観察ができる。さらに、蛍光顕微鏡によって、蛍光の発せられる場所の情報を得ることができ、簡単に細胞の生死を判別することができる。本発明の蛍光色素組成物は、ミトコンドリアの機能障害に起因する疾患の予防研究や疾患の発生メカニズム解明の研究、例えば、治療候補薬の投与による薬剤の効果、ミトコンドリア活力や細胞の生死への影響等を試験するときに使用できる。また、本発明の化合物は多光子吸収性若しくは多光子励起蛍光特性も有しており、例えば、多光子励起蛍光顕微鏡での観察において、弱い強度の励起光、すなわち、生体深部まで到達する長波長の光を利用することができるため、奥行き方向の観察範囲をこれまでよりも大きく広げることが可能になり、多光子励起蛍光顕微鏡により観察できる対象を広げることができる。

Claims (5)

  1. 式（１）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｘは、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１はＣ１～Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｚ－はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表す。）で表され、ｋ及びｍは０～３の整数であり、ｌ及びｎは０～２の整数であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは同時に０ではなく、Ｘは同じでも異なっていてもよい。Ｒ２は電子供与性基又は電子求引性基を表し、ａ及びｃは０～３の整数であり、ｂ及びｄは０～２の整数であり、Ｒ２は同じでも異なっていてもよく、Ｘが置換していない炭素原子上に置換する。波線は、幾何異性体Ｅ、Ｚを表す。］
  2. カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、スルホネート又は過塩素酸イオンであることを特徴とする請求項１記載の化合物。
  3. 請求項１又は２記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光色素組成物。
  4. 請求項１又は２記載の化合物の１又は２以上を用いることを特徴とする、ミトコンドリア膜電位の変化の検出方法。
  5. 請求項１又は２記載の化合物の１又は２以上を用いることを特徴とする、細胞の生死を判別する方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022230354A1 (ja) * 2021-04-26 2022-11-03 国立大学法人高知大学 化合物、蛍光色素剤、キット及び細胞の検出方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01217328A (ja) * 1988-02-26 1989-08-30 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 有機非線形光学材料
JPH02225334A (ja) * 1989-02-28 1990-09-07 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 有機光非線形色素を含むガラス光学素子、光ファイバ及びそれらの製造方法
WO2015136583A1 (ja) * 2014-03-11 2015-09-17 国立大学法人山口大学 二光子吸収化合物
JP2017048268A (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 国立大学法人山口大学 ミトコンドリアに局在する性質を有する蛍光性化合物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01217328A (ja) * 1988-02-26 1989-08-30 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 有機非線形光学材料
JPH02225334A (ja) * 1989-02-28 1990-09-07 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 有機光非線形色素を含むガラス光学素子、光ファイバ及びそれらの製造方法
WO2015136583A1 (ja) * 2014-03-11 2015-09-17 国立大学法人山口大学 二光子吸収化合物
JP2017048268A (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 国立大学法人山口大学 ミトコンドリアに局在する性質を有する蛍光性化合物

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biology", JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY B, vol. 31, 1995, pages 145 - 158 *
ACS SYMPOSIUM SERIES, 1991, pages 187 - 199, ISSN: 0097-6156 *
ANGEW CHEM. INT. ED.-, vol. 49, 2010, pages 6549 - 6553 *
CHEM. COMMUN., vol. 53, 16 May 2017 (2017-05-16), pages 5886 - 5889 *
HIROKI MORITOMO ET AL.: "A Biphenyl Type Two-Photon Fluorescence Probe for Monitoring the Mitochondrial Membrane Potential", CELL STRUCTURE AND FUNCTION, vol. 39, no. 2, 2014, pages 125 - 133, XP055313357, ISSN: 0386-7196, DOI: 10.1247/csf.14006 *
INOUYE MASAHIKO ET AL.: "Nondestructive Detection of Acetylcholine in Protic Media: Artificial-Signaling Acetylcholine Receptors", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 116, no. 12, 1 June 1994 (1994-06-01), pages 5517 - 5518, XP055608014 *
J. MATER. CHEM. B, vol. 3, 2015, pages 18 4 - 190 *
MINAKER SAMUEL A. ET AL.: "Antibody-Free Reading of the Histone Code Using a Simple Chemical Sensor Array", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 134, no. 28, 14 June 2012 (2012-06-14), pages 11674 - 11680, XP055608016, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja303465x *
MORITOMO, HIROKI ET AL.: "Femtosecond Fiber Laser Excitation Two-Photon Fluorescent Imaging Using Pyrene Derivatives in a Probe", PROGRAM OF THE 96TH CSJ ANNUAL SPRING MEETING, 4A4-01, 10 March 2016 (2016-03-10) *
OMURA, YURIKO ET AL.: "Two-Photon Excitation Emission Characteristics of Mitochondrial Membrane Potential Response Probe Having Biaryl Region", PROGRAM OF THE 97TH CSJ ANNUAL SPRING MEETING, 3 March 2017 (2017-03-03) *
ONISHI, SHOZO ET AL.: "Multiphoton Excitation Behavior of Red Light-Emissive Compounds for Mitochondrial Staining", PROCEEDINGS OF THE 2017 ANNUAL MEETING ON PHOTOCHEMISTRY, 20 September 2017 (2017-09-20) *
SEKI, HITOMI ET AL.: "Development of Mitochondrial Two-Photon Fluorescent Probe with Pyrene Base", PROGRAM OF THE 98TH CSJ ANNUAL SPRING MEETING, vol. 98, 6 March 2018 (2018-03-06), pages 313 - 13 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022230354A1 (ja) * 2021-04-26 2022-11-03 国立大学法人高知大学 化合物、蛍光色素剤、キット及び細胞の検出方法

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