WO2019082906A1 - リゾビウム属菌の培養方法 - Google Patents
リゾビウム属菌の培養方法Info
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/41—Rhizobium
Definitions
- the present invention relates to a culture method of Rhizobium genus bacteria and the like. Specifically, depending on the medium composition, culture conditions, etc., which keep the viscosity of the culture solution low during liquid culture of Rhizobium and at the end of culture, and improve the number of viable cells, the subsequent viable cell concentration / separation step
- the present invention relates to a culture method and the like that make it easy and efficient.
- Root-head cancer disease is mainly caused by bacteria that inhabit the soil: pathogenic Rhizobium radiobacter (different name: Agrobacterium tumefaciens), pathogenic Rhizobium rhizogenes (Rhizobium rhizogenes) (Synonym: Agrobacterium rhizogenes), pathogenic Rhizobium vitis (synonym: Agrobacterium vitis) (hereinafter collectively referred to as “the present invention”) "In some cases referred to as” root-end cancerous fungus ") infects plants and is called" root-end cancer " By forming the Nshu (carcinomas), or reduce the like vigor, if severe is a kind of plant diseases debilitating ⁇ withering plants. Since this root-head cancerous disease occurs mainly in fruit trees and flowers in Japan, it is a plant disease that causes serious damage to tree management such as agricultural production sites in fruit trees and flowers and parks, etc. It is.
- root head cancerous fungi In the case of root head cancer disease, all of the root head cancerous fungi carry a Ti (tumor-inducing) plasmid, and a part (T-DNA region) of the carried Ti plasmid is a plant cell nucleus. Tumorigenesis is induced by transformation into DNA. Once the tumor has formed, the tumor will continue to grow even after the root-head cancerous fungus is removed, causing the plant to weaken or die. Therefore, with the current technology, it is difficult to treat a plant once it has developed an onset of root-head cancer disease. Therefore, it is important to take preventive measures so that plants do not get infected with root-head cancerous fungus, for root-head cancerous disease.
- a control method using non-pathogenic bacteria as a biological pesticide has been proposed.
- a method using nonpathogenic Rhizobium bacteria as a biopesticide is proposed, for example, nonpathogenic Rhizobium vitis ARK-1, ARK-2, and ARK-3 have high root heads. It is disclosed that microbial pesticides and the like using them are promising in order to exert the disease control effect and the plant seed germination rate improvement effect (Patent Document 1).
- Rhizobium spp. Particularly the above ARK-1 strain, ARK-2 strain, ARK-3 strain, etc., have sufficient bacterial growth by adding sufficient amounts of nutrient components essential for bacterial growth during production culture etc.
- concentration is improved, the viscosity of the culture solution is increased, which makes it difficult to stir the culture and to concentrate or separate viable cell bodies after the culture is completed.
- the viscosity is increased, which makes it difficult to stir the culture and to concentrate or separate viable cell bodies after the culture is completed.
- the higher the viscosity the more difficult it is for the bacterial cells to settle, and the bacterial cells leak into the supernatant.
- the viable cell recovery loss at the time of production increases, leading to an increase in cost.
- Patent Document 2 As a method of reducing the viscosity of the culture broth of a microorganism, when producing a polysaccharide by culturing cells in a liquid medium and secreting polysaccharides, the viscosity of the culture broth is reduced by containing 10 to 100 mM of a metal salt.
- Patent Document 3 a method of mutating Aureobasidium spp. To reduce the viscosity of the culture solution (Patent Document 3), and the like.
- the method described in Patent Document 2 is a method of producing polysaccharides by mainly secreting polysaccharides during liquid culture of plant cells, and is not suitable for reducing the viscosity of Rhizobium culture fluid.
- the present invention provides a culture method and the like that can keep the viscosity of the culture solution low during liquid culture of Rhizobium and at the end of culture, and that concentration and separation of viable cells can be easily and efficiently performed thereafter.
- the purpose is
- the present inventors used a medium in which disaccharides account for 25% by mass or more of carbon sources in the medium, and the pH of the culture solution was at the start of culture.
- the Rhizobium sp In the range of 5.0 to 7.0 and carrying out liquid culture of the Rhizobium sp. From the end of the culture, it is possible to keep the viscosity of the culture solution low during and at the end of the cultivation of It has been found that the viable cell count can also be improved, and the present invention has been completed.
- the embodiment of the present invention is as follows.
- a liquid culture of Rhizobium is carried out using a culture medium in which disaccharides occupy 25% by mass or more of the carbon source in the culture medium, and the pH of the culture solution is from the start of culture to the end of culture.
- a culture method of Rhizobium sp. Characterized by maintaining in the range of 0 to 7.0.
- the disaccharide is one or more selected from maltose, trehalose, lactose and sucrose.
- the Rhizobium spp. Is any one of Rhizobium radiobacter, Rhizobium Rhizogenes and Rhizobium Witis.
- Rhizobium is nonpathogenic.
- Rhizobium spp. Rhizobium vitis ARK-1 strain (FERM BP-11426), Rhizobium witis ARK-2 strain (FERM BP-11427), Rhizobium witis ARK-3 strain (FERM BP-11428), The method according to (1) or (2), which is any one of Agrobacterium radiobacter K84 strains.
- a method for producing a viable Rhizobium cell which comprises holding and carrying out liquid culture of Rhizobium and concentrating and / or separating viable cells from the culture solution.
- the disaccharide is one or more selected from maltose, trehalose, lactose, and sucrose.
- Rhizobium radiobacterium Rhizobium rhizogenes and Rhizobium Witis.
- (11) The method according to any one of (7) to (10), wherein Rhizobium is nonpathogenic.
- (12) Rhizobium spp., Rhizobium vitis ARK-1 strain (FERM BP-11426), Rhizobium witis ARK-2 strain (FERM BP-11427), Rhizobium witis ARK-3 strain (FERM BP-11428), The method according to any one of (7) to (9), which is any one of Agrobacterium radiobacter K84 strains.
- (13) The method according to any one of (7) to (12), which is produced by mass culture with a culture solution volume of 5 L or more.
- a liquid medium is used in which the disaccharide accounts for 25% by mass or more of the carbon source in the medium, and the pH of the culture solution is in the range of 5.0 to 7.0 from the culture initiation time to the culture completion time
- Rhizobium bacteria are liquid-cultured using a culture medium in which disaccharides occupy 25% by mass or more of carbon sources in the culture medium, and the pH of the culture solution is from the start of culture to the end of culture Rhizobium vitis ARK-1 strain (FERM BP-11426) or Rhizobium vitis ARK-2 strain (FERM BP-11427) or Rhizobium vitis, characterized in that it is maintained within the range of 5.0 to 7.0.
- a culture method of ARK-3 strain (FERM BP-11428).
- Rhizobium bacteria are liquid-cultured using a medium in which disaccharides occupy 25% by mass or more of the carbon source in the medium, and the pH of the culture solution is from the start of the culture to the end of the culture
- a method for cultivating Agrobacterium radiobacter K 84 strain characterized in that it is maintained within the range of 5.0 to 6.0.
- the present invention it is possible to keep the viscosity of the culture solution low during the culture of Rhizobium and at the end of the culture (suppress the increase in viscosity), and to facilitate the subsequent concentration, viable cell separation and the like.
- by performing pH adjustment constantly during the culture period it is possible not only to suppress the increase in viscosity of the culture solution but also to improve the number of viable Rhizobium bacteria at the end of the culture, which is very efficient in industrial production etc. It can be manufactured.
- the present invention is particularly effective in mass culture with a culture fluid volume of 5 L or more assuming industrial production and the like.
- the present invention relates to a method for culturing Rhizobium sp., Etc.
- Rhizobium sp. examples include Rhizobium alamii, Rhizobium alkalisoli, Rhizobium, etc.
- Rhizobium cellulosilyticum Rhizobium daejeonense, Rhizobium endophyticum, Rhizobium etli, Rhizobium fahlium, Rhizobium falium ), Rhizobium ⁇ Gi Rudini (Rhizobium giardinii), Rhizobium grahammi (Rhizobium grahamii), Rhizobium hainanense (Rhizobium hainanense), Rhizobium faurensu (Rhizobium huautlense), Rhizobium galegae (Rhizobium galegae), Rhizobium (Rhizobium indicus), Rhizobium indigoferae, Rhizobium larrymoorei, Rhizobium leguminosarum (Rhizobium leguminosar) m) Rhizobium leucaenae, Rhizobium loessense, Rhizobium leucaenae,
- the present invention is preferably applied to Rhizobium radiobacter, Rhizobium Rhizogenes, Rhizobium Witis.
- the culture method and the like of the present invention can be applied to any Rhizobium spp. Which is a root-head cancerous fungus and a nonpathogenic Rhizobium sp., But it is particularly non-pathogenic Rhizobium vitis (synonym: agro Agrobacterium vitis (Agrobacterium vitis) F2 / 5 (pT2TFXK) strain (see US Patent No.
- Rhizobium vitis strain ARK-1 Rhizobium vitis strain ARK-2
- Agrobacterium radiobacter K84 strain trade name: Bacterose (registered trademark), manufactured by Japan Pesticide Co., Ltd.
- Natural or artificial Nonpathogenic rhizobium bacteria which have been treated differently or genetically modified can also be used, but among them, nonpathogenic Rhizobium vitis ARK-1, ARK-2, ARK-3, and agrobacteri Application to the Umm Radiobacter K84 strain is very suitable.
- ARK-1 strain is not limited to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center Deposit center: ⁇ 292-0818
- ARK-1 strain is FERM BP-11426
- ARK-2 strain is FERM BP-11427
- ARK-3 strain is FERM BP-11428.
- Rhizobium is cultured by liquid culture.
- a Rhizobium inoculum as described above is obtained.
- This inoculum can be obtained by a person skilled in the art if it is a strain that is universally present naturally, even if it is a method other than the method obtained by culturing the above-mentioned deposited strain or commercially available strain in a plate medium or the like.
- strains of foreign species and strains that have been mutated in a closed environment can also be obtained from biogenetic resources organizations such as the National Institute of Technology and Evaluation Technology Biotech Center (NRBC) if known. can do.
- NRBC National Institute of Technology and Evaluation Technology Biotech Center
- artificially genetically modified strains which do not exist at all in nature may be used as inoculum strains prepared in the laboratory or the like or strains transferred from others or strains obtained by pure culture of them.
- the inoculum is precultured (expanded culture) in a small amount of medium before main culture to increase the number of bacteria to a certain extent.
- the culture scale is small, etc., there is no particular limitation on the carbon source and the pH during the culture period, and a known medium and culture conditions can be appropriately used as a pre-culture method of Rhizobium.
- liquid culture of the Rhizobium sp., which is the main culture is carried out.
- a carbon source used for the medium of this main culture disaccharides account for 25 mass% or more, preferably 40 mass% of carbon sources in the medium.
- the content is more preferably 55% by mass or more, and most preferably 70% by mass or more.
- disaccharides to be used include sucrose, lactulose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, cordobiose, nigerose, isomaltose, isotreoseose, neotrehalose, sophorose, laminaribiose, gentiobiose, turanaose, maltulose, palatinose, gentiobi Urosese, mannobiose, melibiose, melibiulose, neolactose, galactosucrose, silabiose, rutinose, bicyanose, xylobiose, primevelose, etc., and one or more selected from maltose, trehalose, sucrose, lactose is preferred. Although shown as an example, it is not limited to these.
- Components other than disaccharides used in the medium may be those which can be used for liquid culture of Rhizobium sp., And carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. which are usually used for liquid culture of microorganisms are shown.
- a carbon source saccharides such as starch and molasses, organic acids such as citric acid and the like (however, amounts used such that the ratio to the above disaccharides is maintained), nitrogen sources such as yeast extract and soy peptide, Organic nitrogen sources such as meat extract and peptone, and inorganic nitrogen sources such as ammonium salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium chloride and nitrate, and the like can be used.
- Inorganic salts include salts such as phosphoric acid, potassium, magnesium, manganese, sodium and the like, and trace organic nutrients such as vitamins can also be added.
- any antifoaming agent having an antifoaming effect (for example, silicone type, polyether type, etc.) can be used without affecting the growth of Rhizobium.
- Liquid culture of Rhizobium spp. Is carried out using such a culture medium, and culture conditions of the main culture can be cultured under aerobic conditions, for example, by aeration, agitation, shaking culture, etc., and feed culture is performed. You can also.
- the culture temperature conditions and culture time are not particularly limited, but the culture temperature is selected in the range of about 10 to 40 ° C., preferably about 15 to 35 ° C., and the culture time is indicated as a guide for about 24 to 72 hours.
- the culture is carried out while always maintaining (maintaining) the pH of the culture solution at 5.0 to 7.0, more preferably 5.5 to 7.0, from the start of the culture to the end of the culture.
- the pH of the culture solution is 5.0 to 7.0, more preferably 5.5 to 7.0, and most preferably 6
- the pH of the culture solution is 5.0 to 7.0, more preferably 5.0 to 6.5, most preferably Preferably, culture is performed while maintaining (maintaining) at 5.0 to 6.0.
- the method for maintaining the pH is not particularly limited, but usually, the pH of the liquid culture solution of Rhizobium bacteria gradually rises with the progress of the culture, so the pH is adjusted using an acid such as phosphoric acid or sulfuric acid. Preferred is a method of suppressing the rise.
- a base such as sodium hydroxide or ammonia may be used.
- a weak acid and its salt or a weak base and its salt such as a combination of acetic acid and sodium acetate, a combination of dipotassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate, etc.
- the method etc. which use a buffer action are also illustrated.
- the above-mentioned culture operation is all performed aseptically, and sterilized materials are used as medium components and materials used for pH adjustment.
- sterilization method steam sterilization using an autoclave is typically employed, but for materials which can not withstand high temperature or high pressure, a suitable alternative may be adopted.
- sterilization methods other than steam sterilization methods by heating such as flame sterilization and dry heat sterilization, ionizing radiation such as ⁇ -ray, X-ray, ultraviolet light (UV-C) of wavelength 200 to 280 nm or microwave and high frequency
- Chemical sterilization such as sterilization method by electromagnetic wave irradiation such as non-ionizing radiation, gas sterilization by ethylene oxide gas, ethanol sterilization, hydrogen peroxide low temperature plasma sterilization, glutaraldehyde, phthaldialdehyde, hypochlorous acid, peracetic acid etc
- a sterilization method by action, a sterilization method by separation removal such as filtration sterilization and the like can be mentioned, but it is not particularly limited.
- the culture solution of Rhizobium genus bacteria obtained by such a culture method can be utilized as a microbial pesticide or raw material as it is, it requires a large amount of culture solution at the time of actual use.
- viable cells are concentrated and / or formulated, etc. to lead to cost reduction by making it a high concentration and compact form.
- methods for concentrating viable cells include conventional methods such as centrifugation and membrane concentration.
- this concentration step can be performed very simply and efficiently.
- methods of formulation include methods such as lyophilization, fluid bed drying and spray drying, and it is particularly preferable to use a lyophilization composition.
- a protective agent protein and its hydrolyzate, carbohydrate, sugar alcohol, amino acid and its salts, ionic halide salt, etc.
- a protective agent protein and its hydrolyzate, carbohydrate, sugar alcohol, amino acid and its salts, ionic halide salt, etc.
- the present invention is characterized in that it is particularly effective at the time of mass culture with a culture fluid volume of 5 L or more (in mass liquid culture) in industrial production and the like.
- a culture fluid volume of 5 L or more in mass liquid culture
- the present invention exhibits sufficient effects even in such mass culture.
- biopesticides such as root head cancer disease control.
- plants including seeds
- soil disersion treatment on the ground, treatment with soil irrigation, treatment by immersing plants in bacterial solution, treatment by coating fungus powder on plants, etc.
- the type of plant to which this biological pesticide is applied is not particularly limited. Specifically, Rosaceae plants such as apples, roses, plums and cherries, Chrysanthemum plants such as chrysanthemums, Grapevine plants such as grapes, and eggplants such as tomatoes Family plants can be exemplified.
- the above-mentioned ARK-1 strain and ARK-3 strain exert a high root-head cancerous disease control effect to any of the above-mentioned plants.
- the ARK-2 strain exerts an effect of controlling root-head cancerous disease particularly on rose, grape and tomato.
- strain K84 exerts an effect of controlling root-head cancerous disease, particularly against apples, roses and chrysanthemums.
- Rhizobium is liquid-cultured using a medium in which the disaccharide accounts for at least 25% by mass of the carbon source in the medium, and the pH of the culture solution is from the start of the culture to the end of the culture
- the concentration within the range of 5.0 to 7.0, it is possible to keep the viscosity of the culture solution low during and at the end of the culture of Rhizobium spp. It becomes easy and efficient to separate the body, and the viable cell count can be improved, which is very efficient in industrial production.
- carbon source means a compound (mainly sugars and organic acids) composed of carbon, hydrogen and oxygen and which can be assimilated to Rhizobium during liquid culture.
- NA plate Medium 5 parts of meat extract, 10 parts of peptone, 5 parts of sodium chloride, 15 parts of agar and 1000 parts of water were mixed and heated to dissolve completely, then poured into petri dishes and cooled to prepare NA plate medium.
- a preculture medium was prepared by mixing 17 parts of soy peptide, 3 parts of yeast extract, 2.5 parts of glucose, 5 parts of sodium chloride and 1000 parts of water.
- Example 1 A glycerol stock of Rhizobium vitis ARK-1 strain was thawed and streaked to inoculate the above-mentioned NA medium by a streaking method, and stationary culture was carried out for 1 day in a temperature-controlled room at 28 ° C. to make an inoculum. First, one platinum loop volume was inoculated from the inoculum into the pre-culture medium, and pre-culture was performed for 1 day using a rotary shaker at 190 rpm in a temperature-controlled room at 28 ° C.
- Pre-culture solution is separately inoculated to 6 L of 8 medium components and controls, each containing 120 parts of maltose, glucose, fructose, mannitol, trehalose, lactose, sucrose, and starch as carbon sources as controls.
- the main culture was performed at 28 ° C. for 2 days using a mentor.
- culture was performed at pH 7 or lower (approximately pH 6.5 to 7.0) using phosphoric acid so that the pH of each culture solution did not exceed 7.
- the culture solution has a low viscosity, and the viable count at the end of culture is sufficient, and disaccharides are used as a carbon source It was revealed that when the culture was carried out and the pH was adjusted during the culture period, the increase in viscosity of the ARK-1 strain culture solution was suppressed and the number of viable cells was also improved.
- Inoculation and pre-culture are carried out in the same manner as above, and 102 parts of soy peptide as main culture medium components, 18 parts of yeast extract, 30 parts of sodium chloride, 30 parts of NQH-7403 disorder and 6000 parts of water are mixed.
- the preculture solution is inoculated into each of 6 L of four medium components separately added with 120 parts of maltose, trehalose, lactose, and sucrose as carbon sources separately to the prepared medium, and the mixture is cultured at 28 ° C. using a 10 L jar fermenter.
- a test was also conducted to carry out the main culture for 2 days. During this culture period, culture was performed without pH control of the culture solution.
- the viscosity of the culture solution slightly increases compared to the case where pH adjustment is performed using the same disaccharide as the carbon source, although this is not the same as in the case of using carbon sources other than disaccharides such as glucose. It was also shown that it was somewhat less. From the above, using a disaccharide as a carbon source and adjusting the pH during the culture period is extremely effective in suppressing the increase in viscosity of ARK-1 strain culture solution and improving the viable count of ARK-1 strain. It turned out to be effective.
- Test Example 2 Glycerin stocks of Rhizobium vitis ARK-2 strain, Rhizobium vitis ARK-3 strain and Agrobacterium radiobacter K84 strain are thawed and inoculated into the above NA medium by streaking, and the temperature is maintained at 28 ° C. 1 The stationary culture was carried out for 1 day to make an inoculum. First, one platinum loop volume was inoculated from the inoculum into the pre-culture medium, and pre-culture was performed for 1 day using a rotary shaker at 190 rpm in a temperature-controlled room at 28 ° C.
- 10 L jar fermenter as a control and inoculating the pre-culture solution to 6 L of 3 medium components and controls separately added with maltose, glucose and mannitol as carbon sources separately as a control, and using a 10 L jar fermenter for 2 days Culture was performed.
- Rhizobium vitis ARK-2 strain and Rhizobium vitis ARK-3 strain are controlled with phosphoric acid at pH 7.0 or lower so that the pH of each culture solution does not exceed 7.0.
- Radiobacterium strain K84 is controlled using phosphoric acid so that the pH of each culture solution does not exceed 6.0, pH 6.0 or less is controlled, only the culture using glucose as a carbon source of Agrobacterium radiobacter K84 strain ammonia water was added to control pH 5.0 or higher.
- the culture solution viscosity was low and the viable cell count was sufficient.
- the Rhizobium vitis ARK-2, Rhizobium vitis ARK-3 and Agrobacterium radiobacter K 84 strains are also cultured using a disaccharide as a carbon source, similarly to the Rhizobium vitis ARK-1 strain, and the culture period When the pH adjustment was performed, the increase in the viscosity of the culture solution was suppressed and the viable cell count was also improved.
- Test Example 3 The inoculum and pre-culture are the same as in Test Example 1.
- main culture medium components 306 parts of soybean peptide, 54 parts of yeast extract, 90 parts of sodium chloride, 360 parts of maltose, 90 parts of disform NQH-7403 and water
- An 18 L medium component prepared by mixing 18,000 parts of the medium was inoculated with the preculture solution, and main culture was performed at 28 ° C. for 2 days using a 30 L jar fermenter.
- Test Example 4 In addition to ARK-1 strain, using Rhizobium vitis ARK-2 strain, Rhizobium vitis ARK-3 strain, and Agrobacterium radiobacter K84 strain, the method of obtaining the inoculum and pre-culturing is the same as in Test Example 1.
- a 6 L medium prepared by mixing 102 parts of soy peptide as main culture medium components, 18 parts of yeast extract, 30 parts of sodium chloride, 120 parts of maltose, 30 parts of NQH-7403 with disproportion and 6000 parts of water The components were inoculated with the pre-culture liquid, and main culture was performed at 28 ° C. for 2 days using a 10 L jar fermenter.
- Rhizobium vitis ARK-1 strain using Rhizobium vitis ARK-2 strain, Rhizobium vitis ARK-3 strain, and Agrobacterium radiobacter K84 strain, the method of obtaining and preculturing the inoculum is Experiment 2 And prepared as a main culture medium component by mixing 102 parts of soy peptide, 18 parts of yeast extract, 30 parts of sodium chloride, 120 parts of maltose, 30 parts of NQH-7403 and 6,000 parts of water. The preculture solution was inoculated into 6 L of medium components, and the main culture was performed for 2 days at 28 ° C. using a 10 L jar fermenter.
- Test Example 6 Using Rhizobium vitis ARK-1 strain, inoculum and pre-culture are the same as in Test Example 2; 306 parts of soybean peptide, 54 parts of yeast extract, 90 parts of sodium chloride, 360 parts of maltose as main culture medium components, An 18 L medium component prepared by mixing 90 parts of Disform NQH-7403 and 18,000 parts of water was inoculated with the preculture solution, and main culture was performed at 28 ° C. for 2 days using a 30 L jar fermenter.
- 7.0 g of the viable cell stock solution is put into a 10 mL vial, pre-frozen in a deep freezer set at -80 ° C., and then using a lyophilizer (VirTis 25 L Genesis SQ Super ES-55, SP Industries, Inc. product) Lyophilization was carried out for 48 hours under reduced pressure of about 200 mTorr to obtain a lyophilized composition.
- the total weight of the freeze-dried composition in the vial was 2.0 g and the water content was 7.9% by weight.
- the obtained freeze-dried composition was stored still in a refrigerator at 6 ° C. or a thermostatic chamber at 28 ° C. in the form of a sealed vial.
- the viable cell number concentration (cfu / g) of Rhizobium vitis ARK-1 strain in the freeze-dried composition of Test Example 6 is measured by a conventional method, and this is multiplied by the total mass (g) of the freeze-dried composition, Total viable cell count (cfu) of Rhizobium vitis ARK-1 strain in the lyophilized composition was determined. The total viable cell count was divided by the total viable cell count of Rhizobium vitis ARK-1 strain in 7 g of the viable cell stock solution, and the viable cell viability (%) of Rhizobium vitis ARK-1 strain immediately after lyophilization was calculated. did.
- ⁇ Preservation evaluation of viable cell viability> The viable cell number concentration (cfu / g) of Rhizobium vitis ARK-1 strain in the freeze-dried composition at each storage day is determined by a conventional method, and this is multiplied by the total mass (g) of the freeze-dried composition The total viable count (cfu) of Rhizobium vitis ARK-1 strain in the lyophilized composition was determined. The total viable cell count was divided by the total viable cell count immediately after the lyophilization to calculate the viable cell viability (%) of Rhizobium vitis ARK-1 at each storage day.
- the total viable bacteria per vial before freeze-drying of the viable cell stock solution using the culture solution cultured at each pH control time is shown in Table 7 below.
- the viable cell survival rate immediately after lyophilization was not significantly different depending on the presence or absence of pH control during the main culture, but as shown in Tables 9 and 10, the storage stability was pH 7.
- the storage stability was low at 5 or more, but high storage stability was shown at 6 ° C. and 28 ° C. in the control range of pH 6.0 to 7.0 or less. Controlling the pH in the main culture to 7.0 or less is extremely effective in improving the storage stability of the freeze-dried composition, in addition to suppressing the increase in viscosity of the culture solution and improving the viable cell count.
- the present invention is summarized as follows.
- the present invention provides a culture method and the like that can keep the viscosity of the culture solution low during liquid culture of Rhizobium and at the end of culture, and that concentration and separation of viable cells can be easily and efficiently performed thereafter.
- the purpose is
- Rhizobium vitis ARK-1 strain (FERM BP-11426)
- Rhizobium vitis ARK-2 strain (FERM BP-11427)
- Rhizobium vitis ARK-3 strain (FERM BP-11428)
Landscapes
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Abstract
課題 リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易且つ効率的となるような培養方法等を提供する。 解決手段 二糖類（例えば、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースなど）が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌を液体培養することで、上記課題を解決する。
Description
本発明は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養方法等に関する。詳細には、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保ち、且つ、生菌数が向上するような培地組成・培養条件等により、その後の生菌体濃縮・分離工程などを簡便且つ効率的とする培養方法等に関する。
根頭がんしゅ病は、主に土壌中に生息する細菌である病原性リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（異名：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（異名：アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ））、病原性リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）（異名：アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ））（以下、本明細書において、これらを総称して「根頭がんしゅ病菌」という場合もある）が、植物体に感染し、「根頭がんしゅ」と呼ばれるがんしゅ（癌腫）を形成することにより、樹勢などを低下させたり、激しい場合は植物体を衰弱・枯死させる植物病の一種である。この根頭がんしゅ病は、日本国内においては、主に果樹や花卉に発生していることから、特に、果樹及び花卉の農業生産現場や公園等の樹木管理に深刻な被害をもたらす植物病である。
根頭がんしゅ病では、前記根頭がんしゅ病菌のいずれもがＴｉ（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドを保有しており、かかる保有するＴｉプラスミドの一部（Ｔ－ＤＮＡ領域）が、植物細胞核ＤＮＡに形質転換されることにより腫瘍化が誘導される。一度腫瘍が形成されると、根頭がんしゅ病菌を除去しても腫瘍は増殖を続け、植物体の衰弱・枯死などを引き起こす。従って、現状の技術では、植物体が根頭がんしゅ病を一度発病してしまうと、治療することは困難である。そのため、根頭がんしゅ病に関しては、植物体が根頭がんしゅ病菌に感染しないように予防措置をとることが重要である。
このような根頭がんしゅ病菌の感染に対する予防措置としては、従来、根頭がんしゅ病菌に汚染された土壌に対して、土壌全体を加熱滅菌したり、クロルピクリン剤や臭化メチル剤等の土壌殺菌剤を用いて土壌を薫蒸消毒したり、根頭がんしゅ病菌がグラム陰性であるため、グラム陰性細菌用抗生物質で当該土壌を処理したりすることがなされてきた。しかし、このような方法では、当該土壌に含まれる、根頭がんしゅ病菌以外の有用土壌細菌も殺菌・除去されてしまうので、当該土壌の土質が改悪される。このように改悪された土壌を、本来の植物栽培に適した土壌に回復させるには、有機肥料の投与等が必要であるため、多大な経費・労力と、多時間とを要するという問題が生じる。さらに、土壌殺菌剤を用いた土壌の薫蒸消毒では、土壌殺菌剤の毒性がきわめて高く、作業者及び周辺住民の健康を害する危険性がある。
そこで、上記に代わる方法として、近年、非病原性菌を生物農薬として用いる防除方法が提案されている。特に有効なものとして、非病原性リゾビウム属菌を生物農薬として用いる方法が提案され、例えば、非病原性のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、ＡＲＫ－２株、ＡＲＫ－３株は高い根頭がんしゅ病防除効果及び植物種子発芽率向上効果を発揮するため、これらを用いた微生物農薬等が有望であることが開示されている（特許文献１）。
しかし、リゾビウム属菌、特に上記ＡＲＫ－１株、ＡＲＫ－２株、ＡＲＫ－３株などは、生産培養時などで菌体の増殖に不可欠な栄養成分を十分量添加して菌体増殖性を向上させると、培養液粘度が上昇し、培養時の攪拌や、培養終了後の生菌体濃縮又は分離が困難となる。例えば、遠心分離で菌体を濃縮又は分離する際に、同じ遠心力で生菌体回収を試みると粘度が高いほど菌体が沈降しにくくなり、上清に菌体が漏れてしまう。その結果、製造時の生菌体回収ロスが大きくなりコスト増加に繋がる。
微生物の培養液を低粘度化する方法としては、液体培地中で細胞を培養し多糖類を分泌させて多糖類を製造する際に、金属塩を１０～１００ｍＭ含有させ培養液を低粘度化する方法（特許文献２）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属菌を変異処理してその培養液を低粘度化する方法（特許文献３）などが知られている。しかし、特許文献２に記載されている方法は、主として植物細胞の液体培養時に多糖類を分泌させて多糖類を製造する方法であり、リゾビウム属菌培養液の低粘度化には適さない。また、特許文献３に記載されている変異処理方法は、リゾビウム属菌の変異処理による培養液の低粘度化が可能か不明であり、さらに、変異処理により菌体増殖性及び根頭がんしゅ病防除効果等の菌株の性質も変異する可能性があるというリスクが存在する。そして、リゾビウム属菌の培養液の低粘度化に関しては、現在までのところ報告は見当たらない。
このような背景技術の中、当業界では、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を上昇させないような培養技術等の開発が望まれていた。
本発明は、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易且つ効率的となるような培養方法等を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行った結果、二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養することで、リゾビウム属菌の培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ且つ生菌数の向上も可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム属菌の培養方法。
（２）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（１）に記載の方法。
（３）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）リゾビウム属菌が非病原性である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）培養液量５Ｌ以上の大量培養であることを特徴とする、（１）～（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養し、この培養液から生菌体を濃縮及び／又は分離することを特徴とする、リゾビウム属菌生菌体の製造方法。
（８）さらに、生菌体を凍結乾燥することを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）リゾビウム属菌が非病原性である、（７）～（１０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１３）培養液量５Ｌ以上の大量培養により製造することを特徴とする、（７）～（１２）のいずれか１つに記載の方法。
（１４）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める液体培地を使用し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持しながら液体培養することで得られる、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養物。
（１５）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）の培養方法。
（１６）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～６．０の範囲内に保持することを特徴とする、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の培養方法。
（１）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム属菌の培養方法。
（２）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（１）に記載の方法。
（３）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）リゾビウム属菌が非病原性である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）培養液量５Ｌ以上の大量培養であることを特徴とする、（１）～（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養し、この培養液から生菌体を濃縮及び／又は分離することを特徴とする、リゾビウム属菌生菌体の製造方法。
（８）さらに、生菌体を凍結乾燥することを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）リゾビウム属菌が非病原性である、（７）～（１０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１３）培養液量５Ｌ以上の大量培養により製造することを特徴とする、（７）～（１２）のいずれか１つに記載の方法。
（１４）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める液体培地を使用し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持しながら液体培養することで得られる、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養物。
（１５）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）の培養方法。
（１６）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～６．０の範囲内に保持することを特徴とする、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の培養方法。
本発明によれば、リゾビウム属菌の培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つ（粘度上昇を抑制する）ことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易となる。また、培養期間中に常時ｐＨ調整を行うことで、培養液の粘度上昇抑制だけでなく培養終了時のリゾビウム属菌生菌数の向上も可能となり、工業生産等において非常に効率的な生菌製造ができる。本発明は、工業生産などを想定した培養液量５Ｌ以上の大量培養において特に有効である。
本発明は、リゾビウム属菌の培養方法等に関するものであるが、本発明の対象となるリゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・アラミ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ａｌａｍｉｉ）、リゾビウム・アルカリソリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ａｌｋａｌｉｓｏｌｉ）、リゾビウム・セルロシライティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・ダエジェオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・エンドフィティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）、リゾビウム・ファバエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆａｂａｅ）、リゾビウム・ガリカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｌｉｃｕｍ）、リゾビウム・ギアルディニ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇｉａｒｄｉｎｉｉ）、リゾビウム・グラハミ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇｒａｈａｍｉｉ）、リゾビウム・ハイナネンセ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈａｉｎａｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・フアウトレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈｕａｕｔｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・ガレガーエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｅｇａｅ）、リゾビウム・インディカ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｄｉｃａ）、リゾビウム・インディカス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｓ）、リゾビウム・インディゴフェラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｅ）、リゾビウム・ラリームーレイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・ロイカエナエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｕｃａｅｎａｅ）、リゾビウム・ロエセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｅｓｓｅｎｓｅ）、リゾビウム・ルピニ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｕｐｉｎｉ）、リゾビウム・ラシタナム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｕｓｉｔａｎｕｍ）、リゾビウム・メソシニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｓｏｓｉｎｉｃｕｍ）、リゾビウム・ミルオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｉｌｕｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・モンゴレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・マルチホスピティウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｕｌｔｉｈｏｓｐｉｔｉｕｍ）、リゾビウム・ナガージュナ・ナガレンシス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｎａｇａｒｊｕｎａ ｎａｇａｒｅｎｓｉｓ）、リゾビウム・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｏｒｙｚａｅ）、リゾビウム・ファゼオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・ピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｉｓｉ）、リゾビウム・ピュセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｕｓｅｎｓｅ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、リゾビウム・ルビ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｕｂｉ）、リゾビウム・セレニティレデゥセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、リゾビウム・ソリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｏｌｉ）、リゾビウム・スラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｕｌｌａｅ）、リゾビウム・ティベティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｉｂｅｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・トリフォリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ）、リゾビウム・ツクストレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｕｘｔｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・アンディコラ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｕｎｄｉｃｏｌａ）、リゾビウム・ヴァリダム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖａｌｉｄｕｍ）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）などが挙げられ、これらを人工的に改変（変異処理や遺伝子組み換えなど）した株も対象となる。
本発明は、上記したリゾビウム属菌の中でも、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスへの適用が好適である。本発明の培養方法等は、このように根頭がんしゅ病菌、非病原性リゾビウム属菌のいずれのリゾビウム属菌にも適用できるが、特に、非病原性であるリゾビウム・ヴィティス（異名：アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ））Ｆ２／５（ｐＴ２ＴＦＸＫ）株（米国特許第７１４１３９５号明細書参照）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株、リゾビウム・リゾゲネス（異名：アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ））Ｋ８４株（商品名：バクテローズ（登録商標）、日本農薬株式会社製品）などに適用するのが好適であり、この他の天然由来又は人工的な変異処理や遺伝子組み換えなどがされた非病原性リゾビウム属菌を使用することもできるが、なかでも、非病原性のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、ＡＲＫ－２株、ＡＲＫ－３株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株への適用は非常に好適である。
この非病原性リゾビウム属菌のうち、ＡＲＫ－１菌株、ＡＲＫ－２菌株及びＡＲＫ－３菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター：〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０１０年（平成２２年）１０月１４日付で上記名称で寄託された後、２０１１年（平成２３年）１０月３１日付けで国際寄託に移管されており、その受託番号は、ＡＲＫ－１菌株はＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６であり、ＡＲＫ－２菌株はＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７であり、そしてＡＲＫ－３菌株はＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８である。
そして本発明では、このようなリゾビウム属菌を液体培養により培養する。液体培養に際しては、まず、上記のようなリゾビウム属菌の種菌を入手する。この種菌は、上記寄託菌株や市販品株を平板培地などで培養して得る方法以外であっても、天然に普遍的に存在する菌株であれば当業者は自ら単離することにより入手可能であり、外来種の菌株や閉鎖環境中で突然変異を起こした菌株についても、公知のものであれば独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＲＢＣ）のような生物遺伝資源機関などから入手することができる。天然に全く存在しない、例えば人為的に遺伝子を組み換えた菌株は、自ら実験室内などで作成し或いは他者から譲渡された菌株又はそれらを純粋培養して得た菌株を種菌として用いてもよい。
この種菌は、本培養の前に少量の培地で前培養（拡大培養）を行い、菌数を一定程度増やしておくのが好ましい。この前培養は、培養スケールが小さいこと等から、炭素源や培養期間中のｐＨなどに特段の制限はなく、リゾビウム属菌の前培養方法として公知の培地や培養条件を適宜利用可能である。
次に、本培養である該リゾビウム属菌の液体培養を行うが、この本培養の培地に用いる炭素源としては、二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上、好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは５５質量％以上、最も好ましくは７０質量％以上を占めるようにする。使用する二糖類の例としては、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソトレハロース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ネオラクトース、ガラクトスクロース、シラビオース、ルチノース、ビシアノース、キシロビオース、プリメベロースなどが挙げられ、マルトース、トレハロース、スクロース、ラクトースから選ばれる１種又は２種以上を用いるのが好適例として示されるが、これらに限定されるものではない。
培地に用いる二糖類以外の成分は、リゾビウム属菌液体培養に用いることができるものでよく、微生物の液体培養に通常使用される、炭素源、窒素源、無機塩類等が示される。例えば、炭素源として、デンプン、糖蜜等の糖類、クエン酸等の有機酸など（但し、上記した二糖類との比率が維持されるような使用量）、窒素源として、酵母エキス、大豆ペプチド、肉エキス、ペプトン等の有機窒素源や、アンモニア、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源などが利用できる。無機塩としては、リン酸、カリウム、マグネシウム、マンガン、ナトリウム等の塩類が挙げられ、ビタミン等の微量有機栄養素も添加可能である。また、消泡剤としてはリゾビウム属菌の生育に影響がなく、消泡効果を有するいずれの消泡剤（例えばシリコーン系、ポリエーテル系など）も利用できる。
このような培地を用いてリゾビウム属菌を液体培養するが、本培養の培養条件は、好気的条件下に、例えば通気撹拌や振盪培養等によって培養することができ、流加培養を行うこともできる。培養温度条件及び培養時間は特に限定はないが、培養温度は１０～４０℃程度、好ましくは１５～３５℃程度の範囲から選択され、培養時間は２４～７２時間程度が目安として示される。
更に、この本培養において、培養開始時から培養終了時まで常に培養液のｐＨを５．０～７．０、より好ましくは５．５～７．０に保持（維持）しながら培養を行う。例えば、ＡＲＫ－１菌株またはＡＲＫ－２菌株またはＡＲＫ－３菌株を培養する場合には培養液のｐＨを５．０～７．０、より好ましくは５．５～７．０、最も好ましくは６．０～７．０に保持（維持）しながら培養を行い、Ｋ８４菌株を培養する場合には培養液のｐＨを５．０～７．０、より好ましくは５．０～６．５、最も好ましくは５．０～６．０に保持（維持）しながら培養を行うのが良い。これにより、培養液の粘度上昇を抑制するだけでなく、培養終了時のリゾビウム属菌生菌数の向上も可能となる。ｐＨを保持するための方法は特に限定されないが、通常、リゾビウム属菌の液体培養液ｐＨは培養が進むとともに徐々に上昇していく場合が多いため、リン酸、硫酸等の酸を用いてｐＨ上昇を抑制する方法が好適である。一方、ｐＨを上昇させたい場合は水酸化ナトリウムやアンモニア等の塩基を用いれば良い。また、酢酸と酢酸ナトリウムの組み合わせ、リン酸水素２カリウムとリン酸２水素カリウムの組み合わせ等、弱酸とその塩あるいは弱塩基とその塩をあらかじめ培地に配合するか培養中に適宜添加し、それらの緩衝作用を用いる方法なども例示される。
なお、前記培養操作は全て無菌的に行い、培地成分やｐＨ調整に用いる材料には滅菌したものを用いる。滅菌方法としては、典型的にはオートクレーブを用いた蒸気滅菌が採用されるが、高温や高圧に耐えない材料においては、適当な代替手段を採ってもよい。蒸気滅菌以外の滅菌方法としては火炎滅菌、乾熱滅菌などの加熱による方法、γ線、Ｘ線、波長２００～２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ－Ｃ）のような電離放射線又はマイクロ波や高周波のような非電離放射線などの電磁波照射による滅菌方法、酸化エチレンガスなどによるガス滅菌、エタノール滅菌、過酸化水素低温プラズマ滅菌、グルタルアルデヒド、フタルジアルデヒド、次亜塩素酸、過酢酸などによる化学滅菌などの化学作用による滅菌方法、濾過滅菌などの分離除去による滅菌方法などを挙げることができるが、特に限定されない。
このような培養法により得られたリゾビウム属菌の培養液は、そのまま微生物農薬又は原体として利用することができるが、これは実使用時に多量の培養液が必要となる。運送及び保管等を考慮すると、生菌体の濃縮及び／又は製剤化等を行い、より高濃度でコンパクトな形態とすることによりコスト低減に繋がる。生菌体を濃縮する方法としては、遠心分離や膜濃縮等の通常の方法が挙げられる。本発明においては、液体培養終了時の粘度が高くないため、この濃縮工程を非常に簡便且つ効率的に行うことができる。また、製剤化の方法としては凍結乾燥、流動層乾燥及びスプレードライ乾燥等の方法が挙げられるが、特に凍結乾燥組成物とすることが好適である。また、乾燥等により製剤化する際には保護剤（タンパク質及びその加水分解物、炭水化物、糖アルコール、アミノ酸及びその塩類、イオン性ハロゲン化物塩など）を培養終了時の培養液あるいは濃縮液に添加することが好ましい。
なお、本発明は、工業生産などにおける培養液量５Ｌ以上の大量培養時（大量液体培養時）に特に効果を発揮することが特徴である。大量培養においては、培養液粘度の上昇は攪拌不良、通気不良に陥りやすく、また、培養終了後の濃縮工程が極めて困難となる場合が非常に多い。本発明は、このような大量培養においても十分な効果を奏する。
このようにして培養されたリゾビウム属菌生菌体や、ここから得られた製剤等は、非病原性菌であれば根頭がんしゅ病防除などの生物農薬として使用できる。例えば、この生物農薬を植物体（種子を含む）又は土壌に適用（地上散布処理、土壌灌注処理、植物を菌液に浸漬する処理、植物に菌粉を粉衣する処理等）することにより農園芸作物を根頭がんしゅ病などから防除することができる。
この生物農薬の施用対象植物の種類は特に制限されないが、具体的にはリンゴ、バラ、スモモ、オウトウなどのバラ科植物、キクなどのキク科植物、ブドウなどのブドウ科植物、トマトなどのナス科植物を例示することができる。前記のＡＲＫ－１株及びＡＲＫ－３株は、上記植物のいずれに対しても高い根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。また、ＡＲＫ－２株は、上記植物のうち、特にバラ、ブドウ及びトマトに対して根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。Ｋ８４株は、上記植物のうち、特にリンゴ、バラ、キクに対して根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。
このようにして、二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することで、リゾビウム属菌の培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つ（粘度上昇を抑制する）ことができ、その後の濃縮や生菌体分離が容易且つ効率的となり、また、生菌数の向上も可能となり、工業生産等において非常に効率的となる。
なお、本発明において「炭素源」とは、炭素、水素、酸素から構成される、液体培養中にリゾビウム属菌に資化され得る化合物（主として糖類や有機酸）を意味する。
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。なお、下記実施例の操作は全て無菌的に行った。また、以下の記載において「部」は質量部を表す。
＜ＮＡ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ）平板培地の調製＞
肉エキス５部、ペプトン１０部、塩化ナトリウム５部、寒天１５部及び水１０００部を混合し、加熱して完全に溶解させた後、シャーレに流し入れ、冷却して、ＮＡ平板培地を調製した。
肉エキス５部、ペプトン１０部、塩化ナトリウム５部、寒天１５部及び水１０００部を混合し、加熱して完全に溶解させた後、シャーレに流し入れ、冷却して、ＮＡ平板培地を調製した。
＜前培養用培地の調製＞
大豆ペプチド１７部、酵母エキス３部、グルコース２．５部、塩化ナトリウム５部及び水１０００部を混合して前培養用培地を調製した。
大豆ペプチド１７部、酵母エキス３部、グルコース２．５部、塩化ナトリウム５部及び水１０００部を混合して前培養用培地を調製した。
＜試験例１＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１菌株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、フルクトース、マンニトール、トレハロース、ラクトース、スクロース、デンプンを各１２０部添加した６Ｌの８種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、各培養液のｐＨが７を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７以下制御（おおよそｐＨ６．５～７．０の範囲）で培養を行った。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１菌株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、フルクトース、マンニトール、トレハロース、ラクトース、スクロース、デンプンを各１２０部添加した６Ｌの８種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、各培養液のｐＨが７を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７以下制御（おおよそｐＨ６．５～７．０の範囲）で培養を行った。
そして、培養終了時の各培養液粘度（ｍＰａ・ｓ）及び生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を常法により測定した。その結果を下記表１に示す。
この結果から、グルコース、フルクトース及びマンニトールを炭素源とした場合の培養液粘度はかなり上昇し、デンプンを炭素源とした場合は培養液粘度が低い結果であったが、ＡＲＫ－１菌株はデンプンを資化できないためにコントロールと同程度の粘度、生菌数であると推察された。これら炭素源と比較して、マルトース、トレハロース、ラクトース及びスクロースを炭素源とした場合は培養液が低粘度であり、培養終了時の生菌数も十分であって、二糖類を炭素源として用いて培養を行い且つ培養期間中のｐＨ調整を行うと、ＡＲＫ－１菌株培養液粘度の上昇が抑制され且つ生菌数も向上することが明らかとなった。
また、種菌及び前培養は上記と同様に行い、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地に、別途炭素源としてマルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースを各１２０部添加した６Ｌの４種培地成分にそれぞれ前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行う試験も行った。なお、この培養期間中、培養液のｐＨ制御は行わずに培養を行った。
そして、培養終了時の各培養液ｐＨ、培養液粘度及び生菌数を常法により測定した。その結果を下記表２に示す。
この結果、グルコースなど二糖類以外を炭素源とした場合ほどではないものの、いずれも同じ二糖類を炭素源としてｐＨ調整を行った場合と比較して、培養液粘度はやや上昇し、生菌数もやや少ないことが示された。以上より、炭素源として二糖類を使用し、且つ、培養期間中にｐＨ調整を行うことが、ＡＲＫ－１菌株培養液の粘度上昇抑制及びＡＲＫ－１菌株の生菌数向上という点において非常に有効であることが明らかとなった。
＜試験例２＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、マンニトールを各１２０部添加した６Ｌの３種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株は、各培養液のｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株は各培養液のｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ６．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の炭素源にグルコースを用いた培養のみアンモニア水を用いてｐＨ５．０以上の制御を加えた。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、マンニトールを各１２０部添加した６Ｌの３種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株は、各培養液のｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株は各培養液のｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ６．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の炭素源にグルコースを用いた培養のみアンモニア水を用いてｐＨ５．０以上の制御を加えた。
培養終了後の各培養液粘度（ｍＰａ・ｓ）及び生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を常法により測定した。その結果を下記表３に示す。
単糖類であるグルコース及び糖アルコール類であるマンニトールと比較して、二糖類であるマルトースを炭素源とした場合は、培養液粘度が低粘度であり、生菌数も十分であった。リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株もリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株と同様に、二糖類を炭素源として用いて培養を行い且つ培養期間中のｐＨ調整を行うと培養液粘度の上昇が抑制され且つ生菌数も向上した。
＜試験例３＞
種菌及び前培養は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような９種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行ったものも用意した。
種菌及び前培養は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような９種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行ったものも用意した。
そして、培養終了時の各培養液ｐＨ、培養液粘度及び生菌数を常法により測定した。その結果を下記表４に示す。
この結果、コントロールの培養終了時ｐＨは８．３であり、表３に示されるようにｐＨ７．５以上では培養液粘度がやや高く、ｐＨ４．５以下では増殖性が悪かった。これと比較して、ｐＨ５．０～７．０の範囲では培養液が低粘度であり、特にｐＨ５．５～７．０では生菌数も極めて向上することが明らかとなった。
＜試験例４＞
ＡＲＫ－１菌株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２菌株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３菌株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。なお、本培養中の培養液ｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した結果を下記表５に示した。
ＡＲＫ－１菌株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２菌株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３菌株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。なお、本培養中の培養液ｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した結果を下記表５に示した。
この結果から、ＡＲＫ－２菌株及びＡＲＫ－３菌株においても、ＡＲＫ－１菌株と同様に、本培養中の培養液ｐＨの制御が生菌数の向上と培養液粘度の低下に極めて有効であることが明らかとなった。また、Ｋ８４株においても、上記３菌株よりもやや効果は低いものの、やはり本培養中の培養液ｐＨの制御が生菌数の向上と培養液粘度の低下に有効であることが明らかとなった。
＜試験例５＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った、なお、本培養中の培養液ｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した。結果を下記表６に示す。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った、なお、本培養中の培養液ｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した。結果を下記表６に示す。
この結果、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株において本培養中のｐＨ制御が培養液粘度の上昇の抑制及び生菌数の向上に極めて有効であることが明らかとなった。
＜試験例６＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株を用い、種菌及び前培養は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような７種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行った。本培養終了後の培養液を遠心分離して上澄みを捨て、菌体濃縮物を得た。凍結乾燥用保護剤水溶液として、トレハロース２０部、グルタミン酸ナトリウム１０部、システイン塩酸塩８部、カルボキシメチルセルロースナトリウム１部及び水６１部を混合し、若干量の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整して凍結乾燥用保護剤水溶液を調製した。菌体濃縮物５０部と凍結乾燥用保護剤水溶液５０部を混合し、水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨ７に再度調整し、生菌原液を調製した。該生菌原液７．０ｇを１０ｍＬ容バイアル瓶に取り、－８０℃に設定したディープフリーザーで予備凍結した後、凍結乾燥装置（ＶｉｒＴｉｓ２５Ｌ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＳＱ Ｓｕｐｅｒ ＥＳ－５５、ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製品）を用いて、２００ｍ Ｔｏｒｒ程度に減圧して凍結乾燥を４８時間実施し、凍結乾燥組成物を得た。バイアル瓶内の凍結乾燥組成物の全質量は２．０ｇ、水分含量は７．９質量％であった。得られた凍結乾燥組成物は、密封したバイアル瓶の状態で６℃の冷蔵室又は２８℃の恒温室で静置保存した。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株を用い、種菌及び前培養は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような７種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行った。本培養終了後の培養液を遠心分離して上澄みを捨て、菌体濃縮物を得た。凍結乾燥用保護剤水溶液として、トレハロース２０部、グルタミン酸ナトリウム１０部、システイン塩酸塩８部、カルボキシメチルセルロースナトリウム１部及び水６１部を混合し、若干量の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整して凍結乾燥用保護剤水溶液を調製した。菌体濃縮物５０部と凍結乾燥用保護剤水溶液５０部を混合し、水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨ７に再度調整し、生菌原液を調製した。該生菌原液７．０ｇを１０ｍＬ容バイアル瓶に取り、－８０℃に設定したディープフリーザーで予備凍結した後、凍結乾燥装置（ＶｉｒＴｉｓ２５Ｌ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＳＱ Ｓｕｐｅｒ ＥＳ－５５、ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製品）を用いて、２００ｍ Ｔｏｒｒ程度に減圧して凍結乾燥を４８時間実施し、凍結乾燥組成物を得た。バイアル瓶内の凍結乾燥組成物の全質量は２．０ｇ、水分含量は７．９質量％であった。得られた凍結乾燥組成物は、密封したバイアル瓶の状態で６℃の冷蔵室又は２８℃の恒温室で静置保存した。
＜凍結乾燥直後の生菌生存率評価＞
試験例６の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記生菌原液７ｇ中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の総生菌数で除し、凍結乾燥直後のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
試験例６の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記生菌原液７ｇ中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の総生菌数で除し、凍結乾燥直後のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
＜保存安定性の生菌生存率評価＞
各保存日数時の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記凍結乾燥直後の総生菌数で除し、各保存日数時のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
各保存日数時の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記凍結乾燥直後の総生菌数で除し、各保存日数時のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた生菌原液の凍結乾燥前のバイアル瓶当り総生菌を下記表７に示す。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた凍結乾燥組成物の凍結乾燥直後の生菌生存率（％）の結果を下記表８に示す。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた凍結乾燥組成物の６℃での保存安定性の結果を下記表９に示す。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた凍結乾燥組成物の２８℃での保存安定性の結果を下記表１０に示す。
表８より、凍結乾燥直後の生菌生存率は、本培養中のｐＨ制御の有無で著しい差は見られなかったが、表９及び表１０に示されている通り、保存安定性はｐＨ７．５以上では保存安定性が低い結果であったが、ｐＨ６．０～７．０以下制御の範囲では６℃保存及び２８℃保存共に高い保存安定性を示した。本培養中のｐＨを７．０以下に制御することは、培養液の粘度の上昇の抑制及び生菌数の向上に加え、凍結乾燥組成物の保存安定性の向上にも極めて有効である。
本発明を要約すれば、以下の通りである。
本発明は、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易且つ効率的となるような培養方法等を提供することを目的とする。
そして、二糖類（例えば、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースなど）が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養することで、上記課題を解決する。
本発明で寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）
（２）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）
（３）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）
（１）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）
（２）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）
（３）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）
Claims (14)
- 二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養方法。
- 二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載の方法。
- リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌が、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｉｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のいずれかである、請求項１又は２に記載の方法。
- リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌が非病原性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌が、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株のいずれかである、請求項１又は２に記載の方法。
- 培養液量５Ｌ以上の大量培養であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌を液体培養し、この培養液から生菌体を濃縮及び／又は分離することを特徴とする、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌生菌体の製造方法。
- さらに、生菌体を凍結乾燥することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- 二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、請求項７又は８に記載の方法。
- リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌が、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｉｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のいずれかである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
- リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌が非病原性である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
- リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌が、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株のいずれかである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
- 培養液量５Ｌ以上の大量培養により製造することを特徴とする、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める液体培地を使用し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持しながら液体培養することで得られる、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養物。
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