WO2019074071A1 - 核酸分子発現の調節 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的核酸分子の少なくとも一部と相補性を有する第一の核酸分子と、前記第一の核酸分子と相補性を有する第二の核酸分子とを含み、前記第一の核酸分子が直鎖状であり、前記第二の核酸分子が環状であり、前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子とが少なくとも部分的に二重鎖を形成する、核酸分子二量体を提供する。

Description

核酸分子発現の調節

　本開示は、標的核酸分子の発現を調節する核酸分子、当該核酸分子を含む組成物、当該核酸分子を用いた標的核酸分子の発現を調節する方法等に関する。

　ZamecnikおよびStephensonがオリゴ核酸による遺伝子発現の配列特異的な抑制（アンチセンス法）を報告して以来（非特許文献１～２）、核酸分子を用いて遺伝子発現を制御する核酸医薬の開発が行われてきた。核酸医薬には、前記アンチセンス法に用いるアンチセンス核酸のほか、ＲＮＡ干渉に用いる種々の構造の核酸分子（非特許文献３、特許文献１～４）、転写因子を標的とするデコイ核酸（非特許文献４）などがある。

WO 2009/029688 WO 2010/080129 WO 2011/103394 WO 2012/005368

Zamecnik and Stephenson, Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75(1):280-4 Stephenson and Zamecnik, Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75(1):285-8 Elbashir et al., Nature. 2001;411(6836):494-8 Yoshimura et al., Gene Ther. 2001;8(21):1635-42

　オフターゲット効果が少ない、化学的安定性が高い、設計や製造が容易である、などの利点を有する核酸医薬の開発が求められていた。

　本開示の一部の態様は以下に関する。
［１］　標的核酸分子の少なくとも一部と相補性を有する第一の核酸分子と、前記第一の核酸分子と相補性を有する第二の核酸分子とを含み、前記第一の核酸分子が直鎖状であり、前記第二の核酸分子が環状であり、前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子とが少なくとも部分的に二重鎖を形成する、核酸分子二量体。
［２］　第一の核酸分子が、第二の核酸分子より長い、［１］に記載の核酸分子二量体。
［３］　第一の核酸分子の３’末端または５’末端が突出を形成する、［１］または［２］に記載の核酸分子二量体。
［４］　第一の核酸分子がニックを形成する、［１］～［３］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
［５］　第一の核酸分子の長さが１６～３０ｍｅｒである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
［６］　第二の核酸分子の長さが９～３０ｍｅｒである、［１］～［５］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
［７］　第一の核酸分子および／または第二の核酸分子が修飾されている、［１］～［６］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。

［８］　［１］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体を含む組成物。
［９］　［１］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体と、１または２以上の薬学的に許容し得る添加物とを含む、医薬組成物。
［１０］　標的核酸分子の発現の調節に用いるための、［１］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体または［８］もしくは［９］に記載の組成物。
［１１］　標的核酸分子に関連する疾患の処置に用いるための、［１］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体または［８］もしくは［９］に記載の組成物。
［１２］　［１］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子二量体または［８］もしくは［９］に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、標的核酸分子に関連する疾患を処置する方法。

　本開示による核酸分子は、以下の１または２以上の効果を奏する。
（１）標的とする核酸分子の発現を調節できる。
（２）標的非相補的核酸分子によるオフターゲット効果が少ない。
（３）核酸分子による配列非特異的な細胞応答の誘導を回避できる。
（４）ＰＫＲのリン酸化誘導を回避できる。
（５）ＴＬＲ経路の活性化を回避できる。
（６）血中安定性が高い。
（７）ヌクレアーゼ耐性が高い。
（８）設計が容易である。
（９）製造が容易である。

図１は、本開示の核酸分子二量体のいくつかの態様の模式図を示した図である。上側に位置する５’末端および３’末端を有する白色の構築物はＴＣＮＡ、下側に位置する５’末端および３’末端を有しないグレーの構築物はＴＮＮＡ、Ｘ、ＹまたはＺが記載された粒子はヌクレオチド、粒子同士をつなぐ線はヌクレオチド間結合をそれぞれ表す。 図２は、本開示の核酸分子二量体の製造時に設定する、ＴＮＮＡのライゲーション部位の例を示した図である。 図３は、ＴＮＮＡが環状化されたかを変性ＰＡＧＥで確認した結果を示した図である。レーン２および７は、５’リン酸化直鎖状ＴＮＮＡ（ＴＮ－２およびＴＮ－５）、レーン１および６は、５’リン酸化直鎖状ＴＮＮＡをＲＮａｓｅ　Ｒで処理したもの、レーン３および８は、５’リン酸化直鎖状ＴＮＮＡをT4 RNA Ligase 1にて環状化したもの、レーン４および９は、環状化反応物をＲＮａｓｅ　Ｒで処理したもの、レーン５は分子量マーカーを示す。また、レーン１～４のＴＮＮＡは１６ｍｅｒ、レーン６～９のＴＮＮＡは１９ｍｅｒである。レーン３および８に認められる２本のバンドのうち、上側が環状化しなかった直鎖状ＴＮＮＡ、下側が環状化したＴＮＮＡを示す。 図４は、環状ＴＮＮＡ（ＣＴＮＮＡ）と直鎖状ＴＣＮＡ（ＬＴＣＮＡ）とがアニーリングしたかをネイティブＰＡＧＥで確認した結果を示した図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は環状ＴＮＮＡのみ、レーン３は直鎖状ＴＣＮＡのみ、レーン４は、環状ＴＮＮＡと直鎖状ＴＣＮＡとをアニーリングしたものである。レーン４に認められる２本のバンドのうち、上側のものが、環状ＴＮＮＡと直鎖状ＴＣＮＡとがアニーリングした環状核酸分子含有核酸分子二量体（ＣＮＡ－ＮＡＤ）を示す。 図５は、各種核酸分子二量体のＫＤ効果を評価した結果を示したグラフである。 図６は、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体または対応する直鎖状核酸分子二量体を作用させた細胞におけるＰＫＲのリン酸化の程度を、ウェスタンブロッティングで評価した結果を示した図である。Ｐ－ＰＫＲはリン酸化ＰＫＲを示す。 図７は、種々の核酸分子を作用させた細胞におけるＴＬＲ３経路関連遺伝子の発現量を示したグラフである。 図８は、各種核酸分子を作用させた細胞におけるＴＬＲ３経路に関連するタンパク質（ＴＬＲ３、ＳＴＡＴ１）のリン酸化を示した図である。 図９は、ＣＴＮＮＡおよびＬＴＮＮＡのエキソヌクレアーゼ耐性を評価した結果を示したグラフである。 図１０は、各種核酸分子二量体のＫＤ効果を評価した結果を示したグラフである。縦軸は内因性コントロールＨＰＲＴで正規化したＡＲＨＧＡＰ１の発現率を示す。

　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物（オンライン情報を含む）は、その全内容を参照により本明細書に援用する。
　また、本明細書は、２０１７年１０月１１日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１７－１９７９９０号）の明細書および図面に記載の内容を包含する。

　本開示は、一態様において、標的核酸分子の少なくとも一部と相補性を有する第一の核酸分子（標的相補的核酸分子（Target-Complementary Nucleic Acid:ＴＣＮＡ）と称することがある）と、前記第一の核酸分子と相補性を有する第二の核酸分子（標的非相補的核酸分子（Target-Non-complementary Nucleic Acid:ＴＮＮＡ）と称することがある）とを含み、前記第一の核酸分子が直鎖状であり、前記第二の核酸分子が環状であり、前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子とが少なくとも部分的に二重鎖（duplex）を形成する、核酸分子二量体（以下、「本開示の核酸分子」、「環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体」などと称することがある）に関する。

　本開示において、「標的核酸分子」は、本開示の核酸分子による発現の調節の対象となる核酸分子を意味する。標的核酸分子としては、限定されずに、細胞内に存在するＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられる。標的核酸分子は、内因性であっても外来性であってもよい。ＲＮＡとしては、限定されずに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、核内非コードＲＮＡ、ミトコンドリア非コードＲＮＡ、アンチセンス転写物などのＲＮＡ転写物、ウイルスＲＮＡなどが挙げられる。ＤＮＡとしては、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡなどが挙げられる。標的核酸分子は、タンパク質などの発現産物をコードしていてもよいし（例えばｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなど）、していなくてもよい（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、種々の非コードＲＮＡ、アンチセンス転写物など）。また標的核酸分子は、それ自体で生理活性を有するものであってもよい（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡなど）。一部の態様において、標的核酸分子がコードする発現産物は、疾患に関連するものである。一部の態様において、標的核酸分子は、ＲＮＡサイレンシングの対象となるものである。ＲＮＡサイレンシングの対象となる標的核酸分子としては、限定されずに、例えば、細胞質または核に存在するＲＮＡ転写物やウイルスＲＮＡなどが挙げられる。別の態様において、標的核酸分子はＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の対象となるものである。ＲＮＡ活性化の対象となる標的核酸分子としては、限定されずに、例えば、核ＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡなどのＤＮＡ、ＤＮＡ近傍に存在する非コードＲＮＡなどのＲＮＡが挙げられる。

　ＲＮＡサイレンシングは、典型的には、小分子ＲＮＡによる遺伝子発現制御機構を指し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構、ｐｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構などを含む。
　ＲＮＡ干渉は、典型的には、二本鎖核酸分子が誘導する、標的ＲＮＡが配列特異的に分解される現象を指す。二本鎖核酸分子は細胞内に入ると、その長さに応じてダイサーにより切断された後、Argonaute（ＡＧＯ）タンパク質を含むＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。ＲＩＳＣは、標的ＲＮＡと相補的な配列を有するアンチセンス鎖（ガイド鎖）をガイド役に標的ＲＮＡを認識し、これを切断する。標的ＲＮＡがｍＲＮＡである場合は、ｍＲＮＡがコードするタンパク質等が発現されなくなり（遺伝子サイレンシング）、標的ＲＮＡがｍｉＲＮＡやアンチセンス転写物である場合は、当該ｍｉＲＮＡやアンチセンス転写物による作用が消失する。ｍｉＲＮＡやアンチセンス転写物が、遺伝子発現の抑制に作用するものであれば、ＲＮＡ干渉でｍｉＲＮＡやアンチセンス転写物が分解されることにより、当該遺伝子の発現が増大する場合がある。

　ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構は、典型的には、ｍｉＲＮＡが誘導する配列特異的なＲＮＡの分解または翻訳抑制を指す。成熟ｍｉＲＮＡはArgonaute（ＡＧＯ）タンパク質を含むｍｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に取り込まれ、主にシード配列（５’末端から２～８位の配列）と相補的なｍＲＮＡにｍｉＲＩＳＣを誘導し、ｍＲＮＡからの翻訳を抑制するとともに、ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡテールを分解して短縮し、ｍＲＮＡの分解を促進する。
　ｐｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構は、典型的には、ｐｉＲＮＡが誘導する配列特異的なＲＮＡの分解を指す。ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩサブファミリータンパク質であるＰｉｗｉタンパク質を含むｐｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｐｉＲＩＳＣ）に取り込まれると核内に移行し、標的遺伝子の転写を配列特異的に抑制する。

　ＲＮＡ活性化は、典型的には、遺伝子のプロモーター領域を標的とする二本鎖ＲＮＡにより、当該遺伝子の発現が増大する現象を指す（Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(46):17337-42）。標的となる核酸分子は、ＤＮＡであっても（上記li）、プロモーター領域と重複する転写物（例えば、非コード転写物）であってもよい（Jiao and Slack, Epigenetics. 2014;9(1):27-36）。これまでに、Ｅ－カドヘリン、ｐ２１、ＶＥＧＦ、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｐ５３、Ｎａｎｏｇなど、複数の遺伝子でＲＮＡ活性化が確認されている（上記Jiao and Slack）。ＲＮＡ活性化をもたらす短鎖ＲＮＡを短鎖活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と称することがある。

　本開示において、「相補性を有する」または「相補的である」なる用語は、ある核酸分子（第１の核酸分子）が、他の核酸分子（第２の核酸分子）と、ワトソン－クリック型塩基対形成や、非ワトソン－クリック型塩基対形成などにより水素結合を形成できることを意味する。相補性は様々な程度であることができ、相補性の程度は、例えば、前記第２の核酸分子の核酸残基と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対）を形成することができる前記第１の核酸分子の連続する核酸残基のパーセンテージ（相補性パーセント）で表すことができる。例えば、第１の核酸分子および第２の核酸分子が合計１０個のヌクレオチドで構成されており、第１の核酸分子を構成する１０個のヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸分子と塩基対を形成する場合、相補性パーセントは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％となる。「完全な相補性を有する」または「完全に相補的である」は、前記第１の核酸分子の全ての連続する核酸残基が、第２の核酸分子における同じ数の連続する核酸残基と水素結合することを意味する。一態様において、本開示の核酸分子二量体における第１の核酸分子は、１または２以上の標的核酸分子またはその部分に相補的なヌクレオチドを、約１５～約３０個またはそれ以上（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれ以上）含む。

　本開示の核酸分子におけるＴＣＮＡは、当該核酸分子二量体（二本鎖核酸分子と称することもある）を構成する核酸分子の一方であり、標的核酸分子の少なくとも一部と相補性を有する。相補性の程度は、ＴＣＮＡが、ＲＮＡサイレンシングやＲＮＡ活性化などにおいて、標的核酸分子を認識できる程度であればよく、必ずしも１００％の相補性は必要としない。したがって、ＴＣＮＡは、標的核酸分子における標的配列とミスマッチを有してもよい。ミスマッチの個数は、ＴＣＮＡと標的核酸分子の標的部位との結合自由エネルギーにもよるが、１個、２個、３個、４個、５個または６個以上であってよい。ミスマッチはＴＣＮＡのどの位置に設けてもよいが、ＲＮＡサイレンシングの効率などの観点から、５’末端に設けることが好ましい。一部の態様において、ＴＣＮＡは、標的配列と１００％の相補性を有する（すなわち、ミスマッチの個数は０個である）。別の態様において、ＴＣＮＡは、標的配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％などの相補性を有する。特定の態様において、ＴＣＮＡは、標的配列に対し、１個、２個、３個、４個、５個または６個以上のミスマッチを含む。

　ＴＣＮＡがｍｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構、または、これに類する遺伝子発現制御機構により標的核酸分子の発現を制御する場合、ＴＣＮＡと標的核酸分子との相補性は、ｍｉＲＮＡとその標的核酸分子との相補性に準ずるものであってよい。例えば、ＴＣＮＡは、少なくともｍｉＲＮＡのシード領域に該当する部分が標的核酸分子と相補的であってもよい。すなわち、かかるＴＣＮＡは、ｍｉＲＮＡのシード領域に該当する部分のみが標的核酸分子と相補的である態様を含む。ｍｉＲＮＡのシード領域に該当するＴＣＮＡの部分は、標的核酸分子と１００％の相補性を有してもよいし、数個、例えば、１個、２個、３個、４個または５個、好ましくは１個のミスマッチを有してもよい。ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構、または、これに類する遺伝子発現制御機構により標的核酸分子の発現を制御するＴＣＮＡは、例えば、シード領域を含むｍｉＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）のヌクレオチド配列を有していてもよい。かかるＴＣＮＡを含む本開示の核酸分子の標的核酸分子は、当該ｍｉＲＮＡの標的核酸分子と同様たり得る。一般にｍｉＲＮＡは複数の異なる核酸分子を標的とすることが知られており、したがって、ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構、または、これに類する遺伝子発現制御機構により標的核酸分子の発現を制御するＴＣＮＡを含む本開示の核酸分子も複数の標的核酸分子の発現を制御することができる。

　ＴＣＮＡの長さは、本開示の核酸分子二量体がＲＮＡサイレンシングやＲＮＡ活性化などの１または２以上の効果を達成することができれば特に限定されず、約１～約４９ｍｅｒ、より好ましくは、約１５～約３０ｍｅｒであってもよい。ここで「ｍｅｒ」とは、ＴＣＮＡやＴＮＮＡを構成する単量体（例えば、ヌクレオチド）の個数を表す。一部の態様において、ＴＣＮＡは、ＲＩＳＣへの取り込みに適した長さ（例えば、約１５ｍｅｒ～約２５ｍｅｒ）である。別の態様において、ＴＣＮＡは、ダイサー基質として適した長さ（例えば約２５～約３０ｍｅｒ）である。特定の態様において、ＴＣＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍｅｒの長さを有する。

　ＴＣＮＡは、ＲＮＡ干渉の誘導に適した配列的特徴を有してもよい。かかる配列的特徴としては、（１）１位がＡまたはＵ、（２）１９位がＧまたはＣ、（３）１～７位にＡまたはＵが４～７個、（４）連続するＧまたはＣが１０個未満、（５）ＧＣ含量が３０％～５２％、（６）１～５位にＡまたはＵが３個以上、（７）内部反復配列が存在しない、（８）１位がＡ、（９）１７位がＡ、（１０）１０位がＵ、（１１）７位がＧ以外、（１２）１４位がＡまたはＵ、（１３）１９位がＵ以外、（１４）１位がＧまたはＣ以外、（１５）１位がＧ以外、およびこれらの組合せなどが挙げられる。また、ＴＣＮＡは、オフターゲット効果の抑制のため、２位～８位のポリヌクレオチドが相補的な配列を有するポリヌクレオチドと二重鎖を形成した場合に、その融解温度（Ｔｍ）が低くなるよう（例えば、約３０℃以下、好ましくは約２５℃以下、より好ましくは約２１．５℃以下となるよう）、２位～８位の配列を設計してもよい。融解温度は、例えば、Ｇ／Ｃ塩基対の数を減らすことにより低下させることができる。
　ＴＣＮＡの特定の非限定例としては、表２に記載の配列番号２５～３１、３３～３５で表されるヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。
　ＴＣＮＡの別の特定の非限定例としては、表１２に記載の配列番号３８、表１６に記載の配列番号４２～４３で表されるヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。
　ＴＣＮＡのさらなる特定の非限定例としては、シード領域を含むｍｉＲＮＡ（好ましくは成熟ｍｉＲＮＡ）のヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。
　なお、本明細書において、ヌクレオチド配列上の位置は、特段の記載がない限り５’末端から３’末端の順に記載してある。

　本開示の核酸分子二量体におけるＴＮＮＡは、当該核酸分子二量体を構成する鎖の一方であり、ＴＣＮＡと相補性を有する。相補性の程度は、核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングやＲＮＡ活性化などの１または２以上の作用を発揮できる程度であればよく、必ずしも１００％の相補性は必要としない。したがって、ＴＮＮＡは、ＴＣＮＡとミスマッチを有してもよい。ミスマッチの個数は、ＴＮＮＡとＴＣＮＡとの結合自由エネルギーにもよるが、１個、２個、３個、４個、５個または６個以上であってよい。ミスマッチはＴＮＮＡのどの位置に設けてもよい。一部の態様において、ＴＮＮＡは、ＴＣＮＡと１００％の相補性を有する（すなわち、ミスマッチの個数は０個である）。別の態様において、ＴＮＮＡは、ＴＣＮＡと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％などの相補性を有する。特定の態様において、ＴＮＮＡは、ＴＣＮＡに対し、１個、２個、３個、４個、５個または６個以上のミスマッチを含む。

　ＴＮＮＡの長さは、本開示の核酸分子二量体がＲＮＡサイレンシングやＲＮＡ活性化などの１または２以上の効果を達成することができれば特に限定されず、約２～約４９ｍｅｒ、より好ましくは、約９～約３０ｍｅｒであってもよい。一部の態様において、ＴＮＮＡは、ＴＣＮＡのＲＩＳＣへの取り込みに適した長さ（例えば、約１５～約２５ｍｅｒ）である。別の態様において、ＴＮＮＡは、ダイサー基質として適した長さ（例えば約２５～約３０ｍｅｒ）である。特定の態様において、ＴＮＮＡは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍｅｒの長さを有する。また、ＴＮＮＡの長さを１６ｍｅｒ以下とすることにより、環状のＴＮＮＡがヌクレアーゼなどにより切断され、本開示の核酸分子二量体が直鎖状になった場合でも、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を抑制することができる。

　ＴＮＮＡの塩基配列は、ＴＣＮＡと二重鎖を形成するため、ＴＣＮＡの塩基配列に依存するところが大きいが、環状構造を形成するために、以下のような配列的特徴を有してもよい。例えば、ＴＮＮＡの塩基配列は、ＴＮＮＡを環状化したときに環内で二重鎖の形成をもたらすような単純配列の繰り返し、同一塩基の連続、回文構造などが生じないように設計することができる。単純配列の繰り返しは、例えば３回以下、好ましくは２回以下とすることができ、同一塩基の連続は、例えば５個以下、好ましくは４個以下とすることができる。また、環内で対形成可能な塩基数はＴＮＮＡの全塩基数の約８０％以下、好ましくは約７５％以下、より好ましくは約７０％以下とすることができ、環内でＧ／Ｃ対形成可能な塩基数はＴＮＮＡの全塩基数の約４０％以下、好ましくは約３５％以下、より好ましくは約３０％以下、さらに好ましくは約２５％以下とすることができる。環内で最も長い連続した対形成が可能な塩基数はＴＮＮＡの全塩基数の約６０％以下、好ましくは約５５％以下、より好ましくは約５０％以下、さらに好ましくは約４５％以下とすることができる。環内で対形成可能な塩基の数は、例えば、ＴＮＮＡの塩基配列を中心で折り返した場合に、対向する塩基の中で互いに相補的なものの数を計数することなどにより決定することができる。

　例えば、塩基数１６のＴＮＮＡの配列を
Ｘ_０１Ｘ_０２Ｘ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８Ｘ_０９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６
（式中、Ｘｎはヌクレオチド、ｎはヌクレオチドの番号をそれぞれ表す）と表した場合、これを中心（Ｘ_０８とＸ_０９との間）で折り返すと、
Ｘ_０１Ｘ_０２Ｘ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８
Ｘ_１６Ｘ_１５Ｘ_１４Ｘ_１３Ｘ_１２Ｘ_１１Ｘ_１０Ｘ_０９
となる。ここで例えば、Ｘ_０２とＸ_１５、Ｘ_０４とＸ_１３、Ｘ_０５とＸ_１２、Ｘ_０６とＸ_１１の４対が互いに相補的である場合、環内で対形成可能な塩基数は８個、ＴＮＮＡの全塩基数の５０％となり、環内で最も長い連続した対形成が可能な塩基数は、Ｘ_０４とＸ_１３、Ｘ_０５とＸ_１２、Ｘ_０６とＸ_１１の６個、全塩基数の３７．５％となる。

　環状ＴＮＮＡは、特定の５’および３’末端を有しないため、環内で対形成可能な塩基数などの各数値の最大値は、折り返す位置を１塩基ずつずらしながら、すべての可能な折り返し位置について同様に対形成が可能な塩基数を決定することにより決定することができる。例えば、上記の配列で、折り返し位置を１塩基ずらすと、
Ｘ_０２Ｘ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８Ｘ_０９
Ｘ_０１Ｘ_１６Ｘ_１５Ｘ_１４Ｘ_１３Ｘ_１２Ｘ_１１Ｘ_１０
または
Ｘ_１６Ｘ_０１Ｘ_０２Ｘ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７
Ｘ_１５Ｘ_１４Ｘ_１３Ｘ_１２Ｘ_１１Ｘ_１０Ｘ_０９Ｘ_０８
となり、この状態で対形成が可能な塩基数を決定する。

　塩基数が奇数であるＴＮＮＡについては、例えば塩基数１７のＴＮＮＡを例にとると、
Ｘ_０１Ｘ_０２Ｘ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８Ｘ_０９
Ｘ_１７Ｘ_１６Ｘ_１５Ｘ_１４Ｘ_１３Ｘ_１２Ｘ_１１Ｘ_１０
または
Ｘ_０１Ｘ_０２Ｘ_０３Ｘ_０４Ｘ_０５Ｘ_０６Ｘ_０７Ｘ_０８
Ｘ_１７Ｘ_１６Ｘ_１５Ｘ_１４Ｘ_１３Ｘ_１２Ｘ_１１Ｘ_１０Ｘ_０９
と折り返し、塩基数が偶数の場合と同様の計数を行うことができる。
　ＴＮＮＡの特定の非限定例としては、表１に記載の配列番号１～１１で表されるヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。
　ＴＮＮＡの別の特定の非限定例としては、表１２に記載の配列番号３７、表１５に記載の配列番号４１で表されるヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。
　ＴＮＮＡのさらなる特定の非限定例としては、シード領域を含むｍｉＲＮＡ（好ましくは成熟ｍｉＲＮＡ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。

　本開示の核酸分子二量体において、ＴＣＮＡは直鎖状である。直鎖状であるとは、ＴＣＮＡが修飾されたかまたは修飾されていない５’末端と３’末端とを有し、これらの末端同士が共有結合により結合していないことを意味する。また、本開示の核酸分子二量体において、ＴＮＮＡは環状である。環状であるとは、ＴＮＮＡを構成するヌクレオチドなどの単量体がすべて互いに結合し、５’末端と３’末端とを有さず、かつ、環状となったＴＮＮＡ内で二重鎖領域が形成されないことを意味する。なお、環状ＴＮＮＡは実際には５’末端および３’末端を有しないが、特定の位置で単量体同士の結合が切断され、５’末端および３’末端が形成されたとした箇所（例えば、環状ＴＮＮＡが、直鎖状ＴＮＮＡを環状化して得られたものである場合は、環状化される前の直鎖状ＴＮＮＡにおいて５’末端および３’末端であった箇所）を、便宜上環状ＴＮＮＡの５’末端および３’末端と称することがある。

　環状ＴＮＮＡが、直鎖状ＴＮＮＡを環状化して得られたものである場合、直鎖状ＴＮＮＡにおいて５’末端および３’末端であった単量体同士は、典型的にはホスホジエステル結合により結合しているが、他の様式で結合していてもよい。他の結合様式としては、例えば、ホスホロチオエート、３’－（または－５’）デオキシ－３’－（または－５’）チオ－ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’－（または－５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’－（または－５’）デオキシ－３’－（または５’－）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、ホスホトリエステル、リン結合、アミド結合、モルホリノ、２’－５’結合などの修飾されたヌクレオチド間結合、ジスルフィド結合、スペーサーを介した結合などが挙げられる。

　直鎖状環状ＴＮＮＡの５’末端と３’末端とをスペーサーを介して結合する場合、環状化ＴＮＮＡとＴＣＮＡとをアニーリングしたときに、ＴＮＮＡのスペーサーが、ＴＣＮＡに導入されたスペーサーと同様の位置になるか、ＴＣＮＡと重複しない位置になるよう設計することが好ましい。ＴＣＮＡと重複しない位置とは、例えば、ＴＣＮＡが突出を有しない場合は、ＴＣＮＡの５’末端と３’末端との間、ＴＣＮＡが５’突出を有する場合は、ＴＣＮＡの３’末端と５’突出の基部との間、ＴＣＮＡが３’突出を有する場合は、ＴＣＮＡの５’末端と３’突出の基部との間、ＴＣＮＡが両端に突出を有する場合は、ＴＣＮＡの２つの突出の基部の間などである。スペーサーとしては、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル（例えばポリエチレングリコールなど）、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、グリセリンなどがあげられる。

　直鎖状ＴＮＮＡの両末端の単量体同士の結合の位置は特に限定されず、環状化されたＴＮＮＡの任意の位置に設定することができる。なお、環状ＴＮＮＡを構成する他の単量体同士の結合と区別するため、上記結合を「末端間結合」と称する場合がある。末端間結合の位置は、例えば、直鎖状ＴＮＮＡの配列設計により調節することができる。末端間結合は、環状ＴＮＮＡにおける他の単量体間の結合と同じであっても異なってもよい。

　ＴＮＮＡが環状であることは、例えば、ＮＭＲやＡＦＭなどによるＴＮＮＡの立体構造の解析や、エキソヌクレアーゼによる耐性の評価（直鎖状核酸分子との比較）、電気泳動によるバンド位置の解析（直鎖状核酸分子との比較）、ＴＣＮＡとのアニーリングの評価（二重鎖が形成されていると、適切にアニーリングしない）などにより確認することができる。

　本開示の核酸分子二量体において、ＴＣＮＡとＴＮＮＡとは、少なくとも部分的に二重鎖領域（相補結合領域と称することもある）を形成する。「二重鎖領域」は、相補的か実質的に相補的な２個の核酸分子の核酸残基が、ワトソン－クリック型塩基対形成により水素結合している領域、または、相補的か実質的に相補的な２個の核酸分子が、それらの間での二重鎖を可能にする他の任意の方法によって結合している領域を指す。一部の態様において、二重鎖領域は、ＴＣＮＡおよび／またはＴＮＮＡの全長にわたって形成される。この態様において、例えば、ＴＣＮＡとＴＮＮＡの長さが同じ場合は、ＴＣＮＡとＴＮＮＡの両方の全長にわたって二重鎖領域が形成され、ＴＣＮＡがＴＮＮＡより長い場合は、ＴＮＮＡの全長にわたって二重鎖領域が形成され、ＴＮＮＡがＴＣＮＡより長い場合は、ＴＣＮＡの全長にわたって二重鎖領域が形成される。

　別の態様において、二重鎖領域は、両核酸分子の一部に形成される。二重鎖領域内で１００％の相補性は必要とされず、実質的な相補性が許容される。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリングできる核酸分子間の相補性を指す。２個の核酸分子が生物学的条件下でアニーリングができるかを実験的に決定する技法は、当該技術分野において周知である。あるいは、２個の核酸分子を合成し、生物学的条件下で反応させ、これらが互いにアニーリングするかを決定することができる。本開示の核酸分子二量体において、二重鎖領域の長さは、各核酸分子の長さにもよるが、約１～約４９ｍｅｒ、約１～約３０ｍｅｒ、約１５～約３０ｍｅｒ等であってよい。特定の態様において、二重鎖領域の長さは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍｅｒ等であってよい。本開示の核酸分子二量体は、典型的には単一の二重鎖領域を有するが、複数の二重鎖領域を有してもよい。二重鎖領域における核酸残基は、典型的にはすべてワトソン－クリック型塩基対形成により水素結合しているが、水素結合していない核酸残基がバルジループ、内部ループ、ブランチループなどを形成していてもよい。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体におけるＴＣＮＡはＴＮＮＡより長く、ニックを形成する。本開示の核酸分子二量体において、ＴＣＮＡがニックを形成するとは、例えば、ＴＮＮＡ上にＴＣＮＡが二重鎖形成を介して重なり、ＴＮＮＡを覆っていると見たときに、ＴＮＮＡの連続する２個の単量体の間の結合が、ＴＣＮＡにより覆われていないことを意味する。ニックの非限定例は、例えば、図１のＡ１におけるＴＣＮＡの３’末端のヌクレオチドと、５’突出の基部のヌクレオチドとの間の間隙、図１のＢ１におけるＴＣＮＡの５’末端のヌクレオチドと、３’突出の基部のヌクレオチドとの間の間隙、図１のＣ３におけるＴＣＮＡの５’突出の基部のヌクレオチドと、３’突出の基部のヌクレオチドとの間の間隙、図１のＤ１におけるＴＣＮＡの５’末端のヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドとの間の間隙などが挙げられる。

　この態様において、ＴＣＮＡの５’末端部分と３’末端部分とが二重鎖（ステム）を形成しないこと、ＴＣＮＡがバルジループおよび／またはブランチループを形成しないこと、ＴＣＮＡとＴＮＮＡとが内部ループを形成しないこと、および／または、ＴＣＮＡがギャップを形成しないことが好ましい。本開示の核酸分子二量体において、ＴＣＮＡがギャップを形成するとは、例えば、ＴＮＮＡの連続する３個以上のヌクレオチドで形成される領域の各端に位置するヌクレオチドに対してＴＣＮＡの２個のヌクレオチドが塩基対を形成しているときに、このＴＣＮＡの２個のヌクレオチド同士が互いに結合していないこと、また、ＴＮＮＡ上にＴＣＮＡが二重鎖形成を介して重なり、ＴＮＮＡを覆っていると見たときに、ＴＮＮＡの連続する３個以上の単量体の間の結合が、ＴＣＮＡにより覆われていないことを意味する。ギャップの非限定例は、例えば、図１のＧ３におけるＴＣＮＡの３’突出の基部のヌクレオチドと、５’末端のヌクレオチドとの間の間隙などが挙げられる。一態様において、ＴＣＮＡは、その５’末端部分および３’末端部分の少なくとも一方が突出を形成する。突出の長さは、限定されずに、例えば、１～１０ｍｅｒ、１～５ｍｅｒ、１～３ｍｅｒなど、より具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｅｒ等であってよい。突出は、ＴＣＮＡの５’および／または３’末端に、ＴＮＮＡとミスマッチなヌクレオチドを設けることなどにより形成することができる。

　特定の態様において、ＴＣＮＡがＴＮＮＡより長い本開示の核酸分子二量体は、１７ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、１８ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、１９ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２０ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２１ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと１６ｍｅｒのＴＮＮＡ、１８ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、１９ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２０ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２１ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、１９ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２０ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２１ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２０ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２１ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２１ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２５ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２５ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２５ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２５ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２５ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２６ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２７ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２８ｍｅｒのＴＮＮＡ、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２８ｍｅｒのＴＮＮＡ、または、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと２９ｍｅｒのＴＮＮＡとを含む。

　本開示の核酸分子二量体の、ＴＣＮＡがＴＮＮＡより長く、ＴＣＮＡの５’末端部分または３’末端部分のいずれか１つが突出を形成する態様におけるＴＣＮＡとＴＮＮＡとの関係を以下に構造式で示す。式中、Ｙは突出部を形成するヌクレオチド（非修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを包含する。以下同様）、Ｘは二重鎖領域を形成するヌクレオチド、数字はヌクレオチドの数を表す。また、ｍは１～１０、好ましくは１～５、ｎは５～３９、好ましくは１４～２９、ｏは１～１０、好ましくは１～５、ｎ’は５～３８、好ましくは１４～２８、ただし、ｍ＋ｎ、ｎ＋ｏおよびｍ＋ｎ’＋ｏは、それぞれ独立して１５～４９、好ましくは１５～３０である。なお、環状化ＴＮＮＡは、便宜上５’末端および３’末端を有するかのように記載されているが、実際には、上述のとおり５’末端と３’末端とは共有結合により結合され、末端は存在しない。これは、以下の同様の構造式においても該当する。
（Ａ）５’突出型
５’　Ｙ_ｍＸ_ｎ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　　Ｘ_ｎ　５’（環状ＴＮＮＡ）
（Ｂ）３’突出型
５’　Ｘ_ｎＹ_ｏ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　Ｘ_ｎ　５’（環状ＴＮＮＡ）
（Ｃ）５’および３’突出型
５’　Ｙ_ｍＸ_ｎ’Ｙ_ｏ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　　Ｘ_ｎ’　５’（環状ＴＮＮＡ）

　本開示の核酸分子二量体の一部の好ましい態様におけるＴＣＮＡとＴＮＮＡとの関係を以下に示す。なお、Ｙは突出部を形成するヌクレオチド、Ｘは二重鎖領域を形成するヌクレオチド、上段は直鎖状ＴＣＮＡ、下段は環状ＴＮＮＡを表す。また、図１にＡ１、Ｂ１、Ｃ３の模式図を示す。
（Ａ１）５’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ２）５’突出型、ＴＣＮＡ２０ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ３）５’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ４）５’突出型、ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ５）５’突出型、ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ６）５’突出型、ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ７）５’突出型、ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’

（Ａ８）５’突出型、ＴＣＮＡ２０ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ９）５’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ１０）５’突出型、ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ１１）５’突出型、ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ１２）５’突出型、ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ａ１３）５’突出型、ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’

（Ｂ１）３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　５’
（Ｂ２）３’突出型、ＴＣＮＡ２０ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　５’
（Ｂ３）３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　５’
（Ｂ４）３’突出型、ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　５’
（Ｂ５）３’突出型、ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　　５’
（Ｂ６）３’突出型、ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　　　５’
（Ｂ７）３’突出型、ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　　　　５’

（Ｂ８）３’突出型、ＴＣＮＡ２０ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　５’
（Ｂ９）３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　５’
（Ｂ１０）３’突出型、ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　５’
（Ｂ１１）３’突出型、ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　５’
（Ｂ１２）３’突出型、ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　５’
（Ｂ１３）３’突出型、ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　５’

（Ｃ１）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　５’
（Ｃ２）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２０ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　５’
（Ｃ３）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　５’
（Ｃ４）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　５’
（Ｃ５）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹ　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　５’
（Ｃ６）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹ　３’
３’　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　５’
（Ｃ７）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹ　３’
３’　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　５’

（Ｃ８）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹ　３’
３’　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　５’
（Ｃ９）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　５’
（Ｃ１０）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　５’
（Ｃ１１）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　５’
（Ｃ１２）５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　５’

　特定の理論に縛られることは望まないが、上記のようにＴＣＮＡがＴＮＮＡより長い態様は、ＴＮＮＡがヌクレアーゼなどにより切断され、核酸分子二量体が直鎖状になった場合でも、ＴＣＮＡのＲＩＳＣへの取り込みがＴＮＮＡよりも選好され、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果が回避されることが考えられる。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体におけるＴＣＮＡはＴＮＮＡと同じ長さであり、ＴＣＮＡがニックを形成する。したがって、この態様において、ＴＣＮＡは突出、ギャップ、バルジループおよびブランチループのいずれも形成せず、ＴＣＮＡがそれ自体で二重鎖を形成することもない。ＴＣＮＡとＴＮＮＡとが内部ループを形成しないことが好ましい。特定の態様において、ＴＣＮＡがＴＮＮＡと同じ長さである本開示の核酸分子二量体は、１７ｍｅｒのＴＣＮＡと１７ｍｅｒのＴＮＮＡ、１８ｍｅｒのＴＣＮＡと１８ｍｅｒのＴＮＮＡ、１９ｍｅｒのＴＣＮＡと１９ｍｅｒのＴＮＮＡ、２０ｍｅｒのＴＣＮＡと２０ｍｅｒのＴＮＮＡ、２１ｍｅｒのＴＣＮＡと２１ｍｅｒのＴＮＮＡ、２２ｍｅｒのＴＣＮＡと２２ｍｅｒのＴＮＮＡ、２３ｍｅｒのＴＣＮＡと２３ｍｅｒのＴＮＮＡ、２４ｍｅｒのＴＣＮＡと２４ｍｅｒのＴＮＮＡ、２５ｍｅｒのＴＣＮＡと２５ｍｅｒのＴＮＮＡ、２６ｍｅｒのＴＣＮＡと２６ｍｅｒのＴＮＮＡ、２７ｍｅｒのＴＣＮＡと２７ｍｅｒのＴＮＮＡ、２８ｍｅｒのＴＣＮＡと２８ｍｅｒのＴＮＮＡ、２９ｍｅｒのＴＣＮＡと２９ｍｅｒのＴＮＮＡ、または、３０ｍｅｒのＴＣＮＡと３０ｍｅｒのＴＮＮＡとを含む。

　ＴＣＮＡがＴＮＮＡと同じ長さであり、ニックを形成する、本開示の核酸分子二量体の一部の好ましい態様におけるＴＣＮＡとＴＮＮＡとの関係を以下に示す。Ｘは二重鎖領域を形成するヌクレオチド、上段は直鎖状ＴＣＮＡ、下段は環状ＴＮＮＡを表す。また、図１にＤ１の模式図を示す。
（Ｄ１）ＴＣＮＡ１８ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ２）ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ３）ＴＣＮＡ２０ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２０ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ４）ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２１ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ５）ＴＣＮＡ２２ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２２ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ６）ＴＣＮＡ２３ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２３ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ７）ＴＣＮＡ２４ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２４ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’
（Ｄ８）ＴＣＮＡ２５ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２５ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　５’

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体におけるＴＣＮＡはギャップを形成する。ギャップの長さは、限定されずに、例えば、１～１０ｍｅｒ、１～５ｍｅｒ、１～３ｍｅｒなど、より具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｅｒなどであってよい。ＴＣＮＡの長さは、ＴＮＮＡより長くても、ＴＮＮＡより短くても、または、ＴＮＮＡと同じであってもよい。ＴＣＮＡは、その５’末端部分または３’末端部分のいずれか１つが突出を形成してもよい。突出の長さは、限定されずに、例えば、１～１０ｍｅｒ、１～５ｍｅｒ、１～３ｍｅｒなど、より具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｅｒなどであってよい。ＴＣＮＡの長さがＴＮＮＡより長いか、ＴＮＮＡと同じ場合、ＴＣＮＡの５’末端部分および／または３’末端部分は通常突出を形成する。この態様において、ＴＣＮＡの５’末端部分と３’末端部分が二重鎖を形成しないこと、および、ＴＣＮＡがバルジループおよび／またはブランチループを形成しないこと、ＴＣＮＡとＴＮＮＡとが内部ループを形成しないことが好ましい。

　特定の態様において、ＴＣＮＡがＴＮＮＡより短い本開示の核酸分子二量体は、１７ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、１８ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、１９ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２０ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２１ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２２ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと１６ｍｅｒのＴＣＮＡ、１８ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、１９ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２０ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２１ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２２ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと１７ｍｅｒのＴＣＮＡ、１９ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２０ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２１ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２２ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと１８ｍｅｒのＴＣＮＡ、２０ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２１ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２２ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと１９ｍｅｒのＴＣＮＡ、２１ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２２ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２０ｍｅｒのＴＣＮＡ、２２ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２１ｍｅｒのＴＣＮＡ、２３ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２２ｍｅｒのＴＣＮＡ、２４ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２３ｍｅｒのＴＣＮＡ、２５ｍｅｒのＴＮＮＡと２４ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと２４ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２４ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２４ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２４ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２４ｍｅｒのＴＣＮＡ、２６ｍｅｒのＴＮＮＡと２５ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２５ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２５ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２５ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２５ｍｅｒのＴＣＮＡ、２７ｍｅｒのＴＮＮＡと２６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２６ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２６ｍｅｒのＴＣＮＡ、２８ｍｅｒのＴＮＮＡと２７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２７ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２７ｍｅｒのＴＣＮＡ、２９ｍｅｒのＴＮＮＡと２８ｍｅｒのＴＣＮＡ、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２８ｍｅｒのＴＣＮＡ、または、３０ｍｅｒのＴＮＮＡと２９ｍｅｒのＴＣＮＡとを含む。ＴＣＮＡがＴＮＮＡより長い本開示の核酸分子二量体およびＴＣＮＡがＴＮＮＡと同じ長さである本開示の核酸分子二量体の特定の態様については上記に記載したとおりである。

　本開示の核酸分子二量体の、ＴＣＮＡがギャップを形成する態様におけるＴＣＮＡとＴＮＮＡとの関係を以下に構造式で示す。式中、Ｙは突出部を形成するヌクレオチド、Ｘは二重鎖領域を形成するヌクレオチド、ＺはＴＣＮＡによるギャップの形成によりＴＣＮＡのヌクレオチドと塩基対を形成しないＴＮＮＡのヌクレオチド、数字はヌクレオチドの数を表す。また、ｍは１～１０、好ましくは１～５、ｎは５～３９、好ましくは１４～２９、ｏは１～１０、好ましくは１～５、ｎ’は５～３８、好ましくは１４～２８、ｐは１～１０、好ましくは１～５、ｑは１～１１、好ましくは１～６、ただし、ｍ＋ｎ、ｎ＋ｏ、ｍ＋ｎ’＋ｏ、ｎ＋ｐおよびｎ’＋ｑは、それぞれ独立して１５～４９、好ましくは１５～３０である。なお、ＺｐおよびＺｑは便宜上ＴＮＮＡの５’側に記載したが、上記のとおり実際の環状ＴＮＮＡには５’末端も３’末端も存在しないため、ＺｐおよびＺｑは３’末端に位置していると見ることもできる。
（Ｅ）ギャップ・非突出型
５’　Ｘ_ｎ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　Ｘ_ｎＺ_ｐ　５’（環状ＴＮＮＡ）
（Ｆ）ギャップ・５’突出型
５’　Ｙ_ｍＸ_ｎ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　　Ｘ_ｎＺ_ｐ　５’（環状ＴＮＮＡ）
（Ｇ）ギャップ・３’突出型
５’　Ｘ_ｎＹ_ｏ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　Ｘ_ｎＺ_ｐ　５’（環状ＴＮＮＡ）
（Ｈ）ギャップ・５’および３’突出型
５’　Ｙ_ｍＸ_ｎ’Ｙ_ｏ　３’（直鎖状ＴＣＮＡ）
３’　　Ｘ_ｎ’Ｚ_ｑ　５’（環状ＴＮＮＡ）

　本開示の核酸分子二量体の一部の好ましい態様におけるＴＣＮＡとＴＮＮＡとの関係を以下に示す。なお、Ｙは突出部を形成するヌクレオチド、Ｘは二重鎖領域を形成するヌクレオチド、ＺはＴＣＮＡによるギャップの形成によりＴＣＮＡのヌクレオチドと塩基対を形成しないＴＮＮＡのヌクレオチド、上段は直鎖状ＴＣＮＡ、下段は環状ＴＮＮＡを表す。また、図１にＧ３の模式図を示す。
（Ｅ１）ギャップ・非突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２１ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺ　５’
（Ｅ２）ギャップ・非突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２３ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺＺ　５’
（Ｅ３）ギャップ・非突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２５ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺＺＺＺ　５’
（Ｅ４）ギャップ・非突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２３ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺ　５’
（Ｅ５）ギャップ・非突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２５ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺＺ　５’

（Ｆ１）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｆ２）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺ　５’
（Ｆ３）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　３’
３’　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　５’
（Ｆ４）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２１ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　　　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｆ５）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　５’
（Ｆ６）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　３’
３’　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　５’
（Ｆ７）ギャップ・５’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　　３’
３’　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　５’

（Ｇ１）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｇ２）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺ　　５’
（Ｇ３）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　　　　５’
（Ｇ４）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２１ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｇ５）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　　　５’
（Ｇ６）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　　　　５’
（Ｇ７）ギャップ・３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹ　３’
３’　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　　　　　　５’

（Ｈ１）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　　３’
３’　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｈ２）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｈ３）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ１９ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺ　　５’
（Ｈ４）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ２１ｍｅｒ
５’　ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　　３’
３’　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺＺ　５’
（Ｈ５）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１９ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺＺ　５’
（Ｈ６）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１８ｍｅｒ
５’　ＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹ　３’
３’　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　　５’
（Ｈ７）ギャップ・５’および３’突出型、ＴＣＮＡ２１ｍｅｒ、ＴＮＮＡ１６ｍｅｒ
５’　ＹＹＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹＹＹ　３’
３’　　　　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＺ　　　５’

　本開示の核酸分子二量体のＴＣＮＡおよびＴＮＮＡは、非修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書において、非修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを、単に「ヌクレオチド」と総称することがある。非修飾ヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡやＲＮＡを構成するヌクレオチド、すなわち、核酸塩基（アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン）と、糖（リボース、デオキシリボース）と、リン酸基とから構成されるものを指す。非修飾ヌクレオチドで構成される非修飾核酸分子において、隣接する２個の非修飾ヌクレオチド同士は通常ホスホジエステル結合により一方の非修飾ヌクレオチドの３’位と他方の非修飾ヌクレオチドの５’位が連結されている。非修飾ヌクレオチドは、非修飾リボヌクレオチドであっても、非修飾デオキシリボヌクレオチドであってもよく、非修飾核酸分子は、非修飾リボヌクレオチドのみ、非修飾デオキシリボヌクレオチドのみ、または、非修飾リボヌクレオチドおよび非修飾デオキシリボヌクレオチドの両方で構成されていてもよい。

　修飾ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドに対して化学的修飾を含むヌクレオチドを指す。修飾ヌクレオチドは、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであってもよい。修飾ヌクレオチドは、その核酸塩基、糖、バックボーン（ヌクレオチド間結合）、５’末端および／または３’末端が修飾されたものを包含する。修飾ヌクレオチドは、上記部位のいずれか１つが修飾されたもののほか、上記部位の２つ以上が修飾されたものも含む。

　核酸塩基に対する修飾としては、限定されずに、例えば、２，４－ジフルオロトルイル、２，６－ジアミノ、５－ブロモ、５－ヨード、２－チオ、ジヒドロ、５－プロピニル、および、５－メチル修飾、脱塩基などが挙げられる。また、修飾核酸塩基としては、限定されずに、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチル誘導体および他のアルキル誘導体、ユニバーサル塩基、アデニンおよびグアニンの２－プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシンおよび６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよび５－置換シトシン、７－メチルグアニン、アシクロヌクレオチド、デアザプリン、プリンおよびピリミジンの複素環置換アナログ、例えばアミノエチオキシフェノキサジン、プリンおよびピリミジンの誘導体（例えば１－アルキル誘導体、１－アルケニル誘導体、複素芳香環誘導体および１－アルキニル誘導体）およびその互変異性体、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、７－ジアザキサンチン、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５（１－プロピニル）ウラシル、５－（１－プロピニル）シトシン、４，４－エタノシトシン、非プリン塩基および非ピリミジン塩基、例えば２－アミノピリジンおよびトリアジン、無塩基ヌクレオチド、デオキシ無塩基ヌクレオチド、逆位無塩基ヌクレオチド、逆位デオキシ無塩基ヌクレオチドなどが挙げられる。

　糖に対する修飾としては、限定されずに、２’位の修飾、例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－エチル修飾等）、２’－メトキシエトキシ修飾、２’－メトキシエチル修飾、２’－デオキシ修飾、２’－ハロゲン修飾（２’－フルオロ修飾、２’－クロロ修飾、２’－ブロモ修飾等）、２’－Ｏ－アリル修飾、２’－アミノ修飾、２’－Ｓ－アルキル修飾、２’－Ｏ－［２（メチルアミノ）－２－オキソエチル］修飾、２’－アルコキシ修飾、２’－Ｏ－２－メトキシエチル、２’－アリルオキシ（－ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’－プロパルギル、２’－プロピル、２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）修飾、２’－Ｏ－（２，４－ジニトロフェニル）修飾、２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノ修飾など、４’位の修飾、例えば、４’チオ修飾、４’-Ｃ-ヒドロキシメチル修飾など、その他、エチニル、エテニル、プロペニル、ＣＦ、シアノ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ_３、ＯＣＮ、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリルなどが挙げられる。上記以外の修飾糖としては、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、オキセタン－ＬＮＡ（ＯＸＥ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）などが挙げられる。

　本開示において、アルキル基は、飽和脂肪族基を含み、これは直鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基を含む。一部の態様において、直鎖または分枝鎖アルキルはその骨格に６個またはそれ未満の炭素原子を有し（例えば、直鎖についてはＣ_１～Ｃ_６、分枝鎖についてはＣ_３～Ｃ_６）、より好ましくは４個またはそれ未満の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３～８個の炭素原子を有してもよく、より好ましくは５個または６個の炭素を環構造中に有してもよい。用語Ｃ_１～Ｃ_６は、１～６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。アルキル基は、置換アルキル基、例えば、炭化水素骨格の１個または２個以上の炭素上で水素に置換する置換基を有するアルキル部分であってもよい。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは、芳香族部分または複素環式芳香族部分を含んでもよい。

　本開示において、アルコキシ基は、酸素原子に共有結合的に連結した、置換および非置換アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族部分または複素環式芳香族部分で置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、限定されずに、フルオロメトキシに、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。
　本開示において、ハロゲンは、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素を含む。

　修飾バックボーンとしては、限定されずに、例えば、ホスホロチオエート、チオリン酸－Ｄ－リボース体、トリエステル、チオエート、２’－５’結合（５’－２’または２’５’ヌクレオチドまたは２’５’リボヌクレオチドとも称する）、ＰＡＣＥ、ＰＮＡ、３’－（または－５’）デオキシ－３’－（または－５’）チオ－ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’－（または－５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’－（または－５’）デオキシ－３’－（または５’－）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステル修飾、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステルリン結合、５’－エトキシホスホジエステル、Ｐ－アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネートなど、および非リン含有結合、例えば、炭酸塩、カルバメート、シリル、硫黄、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノなどが挙げられる。

　５’末端および／または３’末端修飾としては、例えば、５’末端および／または３’末端へのキャッピング部分の付加や、５’末端および／または３’末端のリン酸基の修飾、例えば、［３～３’］－逆位デオキシリボース、デオキシリボヌクレオチド、［５’－３’］－３’－デオキシリボヌクレオチド、［５’－３’］－リボヌクレオチド、［５’－３’］－３’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、３’－グリセリル、［３’－５’］－３’－デオキシリボヌクレオチド、［３’－３’］－デオキシリボヌクレオチド、［５’－２’］－デオキシリボヌクレオチドおよび［５－３’］－ジデオキシリボヌクレオチドなどが挙げられる。キャッピング部分の非限定例としては、例えば、無塩基ヌクレオチド、デオキシ無塩基ヌクレオチド、逆位（デオキシ）無塩基ヌクレオチド、炭化水素（アルキル）部分およびその誘導体、ミラーヌクレオチド（Ｌ－ＤＮＡまたはＬ－ＲＮＡ）、ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸、結合修飾ヌクレオチド（例えばＰＡＣＥ）および塩基修飾ヌクレオチド、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ_３、ＯＣＮ、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリルなどが挙げられる。キャッピング部分は、非ヌクレオチド突出として機能することもできる。

　本開示における修飾ヌクレオチドには、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、ビオチン基、および末端グリセリルおよび/または逆位デオキシ無塩基残基を含むヌクレオチド、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含むヌクレオチド、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’－ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）または２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）を含むヌクレオチド、ノーザンコンフォメーションを有するヌクレオチド、２’－メチルチオエチル、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロヌクレオチド、２’－アジドヌクレオチド、および２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、６員環ヌクレオチドアナログ（例えば、WO 2006/047842等に記載のヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチドモノマーを含むもの）、ミラーヌクレオチド（例えば、Ｌ－ＤＮＡ（Ｌ－デオキシリボアデノシン－３’－ホスフェート（ミラーｄＡ）、Ｌ－デオキシリボシチジン－３’－ホスフェート（ミラーｄＣ）、Ｌ－デオキシリボグアノシン－３’－ホスフェート（ミラーｄＧ）、Ｌ－デオキシリボチミジン－３’－ホスフェート（鏡像チミジン））およびＬ－ＲＮＡ（Ｌ－リボアデノシン－３’－ホスフェート（ミラーｒＡ）、Ｌ－リボシチジン－３’－ホスフェート（ミラーｒＣ）、Ｌ－リボグアノシン－３’－ホスフェート（ミラーｒＧ）、Ｌ－リボウラシル－３’－ホスフェート（ミラーｄＵ）等）が包含される。

　修飾ヌクレオチドの非限定例は、例えば、Gaglione and Messere, Mini Rev Med Chem. 2010;10(7):578-95、Deleavey and Damha, Chem Biol. 2012;19(8):937-54、Bramsen and Kjems, J.Front Genet. 2012;3:154などにも記載されている。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体のＴＣＮＡおよび／またはＴＮＮＡは、非修飾ヌクレオチドから構成され、修飾ヌクレオチドを含まない。別の態様において、本開示の核酸分子二量体のＴＣＮＡおよび／またはＴＮＮＡは、非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの両方を含む。別の態様において、本開示の核酸分子二量体のＴＣＮＡおよび／またはＴＮＮＡは、修飾ヌクレオチドから構成され、非修飾ヌクレオチドを含まない。

　修飾ヌクレオチドを含む本開示の核酸分子二量体は、上記の修飾を少なくも１つ有していてもよく、上記の２以上の修飾の組合せを有していてもよい。修飾は、本明細書に開示される核酸分子二量体の１または２以上の核酸分子、例えば、ＴＮＮＡ、ＴＣＮＡまたはこれらの両方に存在してもよい。一部の態様において、ＴＣＮＡは修飾ヌクレオチドを含んでもよく、ＴＮＮＡは非修飾ヌクレオチドのみを含んでもよい。別の態様において、ＴＣＮＡは非修飾ヌクレオチドのみを含んでもよく、ＴＮＮＡは修飾ヌクレオチドを含んでもよい。本開示の核酸分子二量体は、核酸分子における総ヌクレオチドに対し、約５％～約１００％の非修飾ヌクレオチド（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％の非修飾ヌクレオチド）を含んでもよい。また、本開示の核酸分子二量体は、核酸分子における総ヌクレオチドに対し、約５％～約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％の修飾ヌクレオチド）を含んでもよい。核酸分子に存在する非修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、核酸分子に存在するヌクレオチドの総数に依存する。非修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセンテージ（非修飾または修飾パーセント）は、ＴＮＮＡ、ＴＣＮＡまたはＴＮＮＡおよびＴＣＮＡの両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。

　一部の態様において、修飾は、本開示の核酸分子の標的核酸分子発現調節活性を増大させるため、および／または核酸分子のin vivoでの安定性、特に血清中の安定性を増大させるため、および/または核酸分子の生体利用能を増大させるために用いてもよい。
　本開示の核酸分子二量体の特定の非限定例は、表３に記載されている。

　本開示の核酸分子二量体は標識されていてもいなくてもよい。標識化により、標的部位への送達の成否や、生体内での位置などをモニタリングすることが可能となり、試験・研究のみならず、臨床適用においても有用である。標識は、当業者に公知な任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、核磁気共鳴する元素（例えば、水素、リン、ナトリウム、フッ素等）、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質（例えば、金属原子もしくはこれを含む化合物）、標識化物質に結合する物質（例えば抗体など）、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、酵素などから選択することができる。

　本開示の核酸分子二量体は、配列特異的に標的核酸分子の発現を調節することができる。標的核酸分子の発現は、標的核酸分子の機能の発現を含む。したがって、標的核酸分子の発現は、例えば、標的核酸分子が発現産物（例えば、タンパク質およびＲＮＡ分子などの核酸分子）をコードしている場合は、発現産物の生成を含み、標的核酸分子がそれ自体で生理活性を有する場合は、その生理活性の発現を含む。標的核酸分子の発現の調節は、標的核酸分子がコードする発現産物の生成の調節や、標的核酸分子が有する生理活性の調節を含む。発現の調節は、発現の抑制および発現の増大を含む。調節の程度は、本開示の核酸分子二量体を作用させない場合の標的核酸分子の発現量を基準とした場合に、本開示の核酸分子二量体を作用させた場合の標的核酸分子の発現量が、前記基準値の約±５０％以上、好ましくは約±６０％以上、より好ましくは約±６５％以上、さらに好ましくは約±７０％以上、特に好ましくは約±７５％以上となる程度であってよい。したがって、本開示の核酸分子二量体は、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができる。また、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、本開示の核酸分子二量体は、標的核酸分子の発現に関連する疾患の処置のために使用することができる。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体は、ＲＮＡサイレンシングにより標的核酸分子の発現を抑制することができる。抑制の程度は、本開示の核酸分子二量体を作用させない場合の標的核酸分子の発現量を１００％とした場合に、本開示の核酸分子二量体を作用させた場合の標的核酸分子の発現量が、約５０％以下、好ましくは約４０％以下、より好ましくは約３５％以下、さらに好ましくは約３０％以下、特に好ましくは約２５％以下となる程度であってよい。この態様における本開示の核酸分子二量体は、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができる。また、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、標的核酸分子の発現に関連する疾患の処置のために使用することができる。

　別の態様において、本開示の核酸分子二量体は、ＲＮＡａにより標的核酸分子の発現を増大させることができる。増大の程度は、本開示の核酸分子二量体を作用させない場合の標的核酸分子の発現量を１００％とした場合に、本開示の核酸分子二量体を作用させた場合の標的核酸分子の発現量が、約１２０％以上、好ましくは約１３０％以上、より好ましくは約１５０％以上、さらに好ましくは約１８０％以上、特に好ましくは約２００％以上となる程度であってよい。この態様における本開示の核酸分子二量体は、標的核酸分子の発現を増大するために使用することができる。また、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、標的核酸分子の発現に関連する疾患の処置のために使用することができる。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果が少ない。より具体的には、本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果が、ＴＮＮＡが非環状の同様の核酸分子二量体、例えば、ＴＮＮＡが直鎖状の同様の（例えば、同じ塩基配列を有する）核酸分子二量体に比べ少ない。したがって、本開示の核酸分子二量体のＴＮＮＡは、オフターゲット効果を回避するための配列設計上の工夫などを講じる必要性が低い。この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避しながら、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングなどにより標的核酸分子の発現を抑制することができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避しながら、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡａなどにより標的核酸分子の発現を増大させることができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避しながら、標的核酸分子の発現を増大させるために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体は、細胞に投与した場合、ＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ）のリン酸化を回避することができる。すなわち、本開示の核酸分子二量体を細胞に投与しても、ＰＫＲのリン酸化が誘導されないか、誘導されたとしても、ＴＮＮＡが非環状の同様の核酸分子二量体、例えば、ＴＮＮＡが直鎖状の同様の（例えば、同じ塩基配列を有する）核酸分子二量体に比べ、その程度が低い。この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＰＫＲのリン酸化を回避しながら、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＰＫＲのリン酸化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングなどにより標的核酸分子の発現を抑制することができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＰＫＲのリン酸化を回避しながら、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＰＫＲのリン酸化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡａなどにより標的核酸分子の発現を増大させることができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＰＫＲのリン酸化を回避しながら、標的核酸分子の発現を増大させるために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＰＫＲのリン酸化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体は、細胞に投与した場合、ＴＬＲ３経路の活性化を回避できる。すなわち、本開示の核酸分子二量体を細胞に投与しても、ＴＬＲ３経路の活性化が誘導されないか、誘導されたとしても、ＴＮＮＡが非環状の同様の核酸分子二量体、例えば、ＴＮＮＡが直鎖状の同様の（例えば、同じ塩基配列を有する）核酸分子二量体に比べ、その程度が低い。この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングなどにより標的核酸分子の発現を抑制することができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡａなどにより標的核酸分子の発現を増大させることができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現を増大させるために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　特定の態様において、本開示の核酸分子二量体は、細胞に投与した場合、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避できる。したがって、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングなどにより標的核酸分子の発現を抑制することができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡａなどにより標的核酸分子の発現を増大させることができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現を増大させるために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　ＰＫＲは二本鎖ＲＮＡと配列非特異的に結合すると自己リン酸化してＮＦ－κＢなどの基質をリン酸化し、インターフェロンなどの産生をもたらす。また、ＴＬＲ３も二本鎖ＲＮＡと配列非特異的に結合すると自己リン酸化してＮＦ－κＢなどの基質をリン酸化し、インターフェロンなどの産生をもたらす。このように、ＰＫＲおよびＴＬＲ３は、核酸分子（特に二本鎖ＲＮＡ分子）による配列非特異的な細胞応答（例えば自然免疫）の誘導プロセスにおいて、最も上流に位置するセンサー分子としての役割を果たしていると考えられており、ＰＫＲのリン酸化およびＴＬＲ３経路の活性化を回避できる本開示の核酸分子二量体は、かかる細胞応答の誘導を、そのプロセスの最も上流から回避することができる。したがって、一部の態様において、本開示の核酸分子二量体は、核酸分子による配列非特異的な細胞応答（例えば自然免疫）の誘導を回避することができる。また、この態様における本開示の核酸分子二量体は、前記細胞応答の誘導を回避しながら、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、前記細胞応答の誘導を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングなどにより標的核酸分子の発現を抑制することができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、前記細胞応答の誘導を回避しながら、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、前記細胞応答の誘導を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡａなどにより標的核酸分子の発現を増大させることができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、前記細胞応答の誘導を回避しながら、標的核酸分子の発現を増大させるために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、前記細胞応答の誘導を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　一部の態様において、本開示の核酸分子二量体は、細胞に投与した場合、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮβ１、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＮＦおよびＣＸＣＲ４から選択される遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避できる。すなわち、本開示の核酸分子二量体を細胞に投与しても、上記遺伝子の発現が増強されないか、増強されたとしても、ＴＮＮＡが非環状の同様の核酸分子二量体、例えば、ＴＮＮＡが直鎖状の同様の（例えば、同じ塩基配列を有する）核酸分子二量体に比べ、その程度が低い。この態様における本開示の核酸分子二量体は、上記遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現を調節するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連している場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、上記遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡサイレンシングなどにより標的核酸分子の発現を抑制することができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、上記遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現を抑制するために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の抑制がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、上記遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の核酸分子二量体が、ＲＮＡａなどにより標的核酸分子の発現を増大させることができる場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、上記遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現を増大させるために使用することができ、標的核酸分子の発現が疾患に関連しており、標的核酸分子の発現の増大がその疾患の改善に有用である場合、この態様における本開示の核酸分子二量体は、上記遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　本開示の核酸分子二量体は、限定されずに、例えば、直鎖状のＴＮＮＡを環状化する工程と、環状化したＴＮＮＡに直鎖状のＴＣＮＡをアニーリングする工程とを含む方法により製造することができる。直鎖状のＴＮＮＡを環状化して得た環状ＴＮＮＡを含む環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体を、「ＴＮＮＡ環状化核酸分子二量体」と称することがある。直鎖状のＴＮＮＡを環状化する工程は、直鎖状の核酸分子を環状化する既知の任意の手法により達成することができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、リガーゼなどによる酵素的ライゲーション、および、ＢｒＣＮ、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣまたはＥＤＡＣなどと略す場合がある）、イミダゾール、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）などによる化学ライゲーションなどが挙げられる。

　酵素的ライゲーションは、例えば、５’末端にリン酸基を、３’末端に水酸基をそれぞれ有する直鎖状のＴＮＮＡにリガーゼ（ライゲーションするヌクレオチドの種類に応じて、例えば、ＲＮＡリガーゼやＤＮＡリガーゼなど）を作用させて行うことができる。反応温度は酵素の至適温度またはその近傍の温度が好ましい。反応時間は特に限定されず、所望の程度のライゲーションが行われるよう適宜調整することができるが、例えば、６時間～３６時間、１２時間～２４時間等の範囲であってよい。ライゲーション反応にはＡＴＰが必要となることがある。リガーゼは各種市販されており、反応条件は製造者による指示に従うことが好ましい。所望の程度のライゲーションが得られたら、リガーゼが後続の反応に影響を与えないよう、リガーゼを加熱などにより失活させてもよい。

　化学ライゲーションとしては、様々な手法が知られている。ＢｒＣＮによるライゲーションは、５’末端または３’末端にリン酸基を有する直鎖状のＴＮＮＡに、ＢｒＣＮ、イミダゾールおよび２価金属イオン（例えば、Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋など）を加え、所定時間反応させて行うことができる（例えば、Dolinnaya et al., Nucleic Acids Res. 1993;21(23):5403-7、Wang and Kool, Nucleic Acids Res. 1994;22(12):2326-33等）。ＥＤＣによるライゲーションは、直鎖状のＴＮＮＡを緩衝液（例えば、２－モルホリノエタンスルホン酸塩とＭｇＣｌ_２を含む緩衝液等）中でＥＤＣとインキュベートすることにより行うことができる（例えば、Dolinnaya et al., Nucleic Acids Res. 1988;16(9):3721-38）。ＥＤＣによるライゲーションは、３’末端にアミノ基またはリン酸基を有する直鎖状のＴＮＮＡを用いることで、反応速度を向上させることができる。ＭＳＮＴによるライゲーションは、Micura, Chem Eur J. 1999;5(7):2077-82などに記載されている。

　環状化したＴＮＮＡは、ライゲーション反応物から精製して、ＴＣＮＡとのアニーリングに使用することができる。精製には、透析などの既知の任意の核酸精製手法を用いることができる。ライゲーション反応物が未反応の直鎖状ＴＮＮＡを含む場合、反応物をエキソヌクレアーゼなどの直鎖状核酸分子を選択的に分解する酵素で処理することにより直鎖状ＴＮＮＡを分解し、環状ＴＮＮＡを濃縮したり、反応物中の核酸分子を電気泳動（例えば、変性ＰＡＧＥ）などで分離し、環状ＴＮＮＡに該当するバンドを切り出したりして、直鎖状ＴＮＮＡを排除してもよい。

　環状ＴＮＮＡと直鎖状ＴＣＮＡとのアニーリングは、既知の任意の手法で行うことができる。アニーリングは、限定されずに、例えば、アニーリングバッファーに溶解したＴＮＮＡおよびＴＣＮＡを、約７０℃～約９０℃で約１分～約５分加熱し、その後、約３７℃で０．５～２時間インキュベートすることにより行ってもよい。アニーリングが行われたかどうかは、例えば、電気泳動（例えば、ＰＡＧＥ）などで確認することができる。

　直鎖状のＴＮＮＡは、そのまま（すなわち、直鎖状のまま）ではＴＣＮＡとのアニーリングが困難だが、環状化するとＴＣＮＡとのアニーリングが容易となるように（例えば、直鎖状のＴＮＮＡを環状化する際のライゲーション部位（すなわち、直鎖状のＴＮＮＡの５’末端および３’末端）が、環状化したＴＮＮＡをＴＣＮＡとアニーリングした場合に、ＴＣＮＡにより形成されるニックまたはギャップと一致しないように）設計することができる。直鎖状のＴＮＮＡをこのように設計することにより、直鎖状ＴＮＮＡの環状化反応後に、環状化されずに残った直鎖状ＴＮＮＡが反応物に混入していたとしても、直鎖状ＴＮＮＡの配列は、ＴＣＮＡの相補配列とは大きく異なるものとなり、ＴＣＮＡとアニーリングして直鎖状の核酸分子二量体を形成する可能性が低くなるため、本開示の環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体を高純度で得ることができるとともに、直鎖状ＴＮＮＡによるオフターゲット効果を回避することが可能となり、有利である。このことは、非環状化ＴＮＮＡをエキソヌクレアーゼなどにより酵素的に除去する場合に特に有利である。したがって、本開示は、直鎖状のままではＴＣＮＡとのアニーリングが困難だが、環状化するとＴＣＮＡとのアニーリングが容易となる直鎖状ＴＮＮＡ（例えば、直鎖状のＴＮＮＡを環状化する際のライゲーション部位が、環状化したＴＮＮＡをＴＣＮＡとアニーリングした場合に、ＴＣＮＡにより形成されるニックまたはギャップと一致しないように設計された直鎖状ＴＮＮＡ）を提供する工程を含む、純度の高い環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体の製造方法を提供する。当該製造方法により得た環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体の純度は、上記の直鎖状ＴＮＮＡを用いずに製造した環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体の純度より高い。本開示はまた、このように純度の高い環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体にも関する。上記の純度は、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体の製造工程における最終生成物に占める環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体の割合を指し、最終生成物中の環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のモル数を、最終生成物の全モル数で除したり、最終生成物中の環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体の質量を、最終生成物の全質量で除したりして算出することができる。質量に基づく純度は、例えば、最終生成物のクロマトグラム（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で得たもの）における環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のピーク面積を最終生成物の全ピーク面積で除したピーク比などに基づいて算出することができる。

　上記のような直鎖状のＴＮＮＡを得るには、例えば、直鎖状のＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基の数または割合（例えば、ＴＮＮＡまたはＴＣＮＡに含まれる全核酸塩基に対する割合）が所定の値以下となるよう、直鎖状ＴＮＮＡを設計することができる。直鎖状のＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基数のＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基数に対する割合は、例えば、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５４％以下、約５３％以下などであってよい。かかる設計手法の非限定例を以下に示す。なお、以下の各配列において、ＸｎはＴＣＮＡに含まれる核酸塩基、ＹｎはＴＮＮＡに含まれる核酸塩基、ｎはＴＣＮＡに含まれる核酸塩基の５’末端からの位置を示す。Ｙｎは、ｎが同じ数であるＸｎと相補的である（例えば、Ｙ_１はＸ_１と相補的である）。

（１）直鎖状ＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基対の割合の最大値が、ＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基の１００％である場合
ＴＣＮＡ：５’　Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１9　３’
ＴＮＮＡ：３’　Ｙ_１Ｙ_２Ｙ_３Ｙ_４Ｙ_５Ｙ_６Ｙ_７Ｙ_８Ｙ_９Ｙ_１０Ｙ_１１Ｙ_１２Ｙ_１３Ｙ_１４Ｙ_１５Ｙ_１６　５’
　上記の例では、ＴＮＮＡの１６位～１位（５’から３’の順）の全ての核酸塩基が、ＴＣＮＡの対応する部分（１位～１６位）の全ての核酸塩基と相補的であり、直鎖状ＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基数は１６である。したがって、これらの核酸塩基数の、ＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基数に対する割合（％）は、１６÷１６×１００＝１００（％）である。

（２）直鎖状ＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基対の割合の最大値が、ＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基の５０％である場合
ＴＣＮＡ：５’　Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１9　３’
ＴＮＮＡ：３’　Ｙ_９Ｙ_１０Ｙ_１１Ｙ_１２Ｙ_１３Ｙ_１４Ｙ_１５Ｙ_１６Ｙ_１Ｙ_２Ｙ_３Ｙ_４Ｙ_５Ｙ_６Ｙ_７Ｙ_８　５’
　上記の例では、ＴＮＮＡの８位～１位（Ｙ_１Ｙ_２Ｙ_３Ｙ_４Ｙ_５Ｙ_６Ｙ_７Ｙ_８）の全ての核酸塩基が、ＴＣＮＡの対応する部分（１位～８位）の全ての核酸塩基（Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８）と相補的であり、ＴＮＮＡの１６位～１０位（Ｙ_９Ｙ_１０Ｙ_１１Ｙ_１２Ｙ_１３Ｙ_１４Ｙ_１５Ｙ_１６）の全ての核酸塩基が、ＴＣＮＡの対応する部分（１０位～１６位）の全ての核酸塩基（Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６）と相補的である。したがって、直鎖状ＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基数は最大で８であり、これらの核酸塩基数の、ＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基数に対する割合（％）は、８÷１６×１００＝５０（％）である。この割合が５０％であるＴＮＮＡが、ＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基対の割合の最大値が最も低くなる。

（３）直鎖状ＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基対の割合の最大値が、ＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基の７５％である場合
ＴＣＮＡ：５’　Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１9　３’
ＴＮＮＡ：３’　Ｙ_５Ｙ_６Ｙ_７Ｙ_８Ｙ_９Ｙ_１０Ｙ_１１Ｙ_１２Ｙ_１３Ｙ_１４Ｙ_１５Ｙ_１６Ｙ_１Ｙ_２Ｙ_３Ｙ_４　５’
　上記の例では、ＴＮＮＡの４位～１位（Ｙ_１Ｙ_２Ｙ_３Ｙ_４）の全ての核酸塩基が、ＴＣＮＡの対応する部分（１位～４位）の全ての核酸塩基（Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４）と相補的であり、ＴＮＮＡの１６位～５位（Ｙ_５Ｙ_６Ｙ_７Ｙ_８Ｙ_９Ｙ_１０Ｙ_１１Ｙ_１２Ｙ_１３Ｙ_１４Ｙ_１５Ｙ_１６）の全ての核酸塩基が、ＴＣＮＡの対応する部分（５位～１６位）の全ての核酸塩基（Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６）と相補的である。したがって、直鎖状ＴＮＮＡとＴＣＮＡの対応する部分との間に形成される連続する相補的領域に含まれる核酸塩基数は最大で１２であり、これらの核酸塩基数の、ＴＮＮＡに含まれる全核酸塩基数に対する割合（％）は、１２÷１６×１００＝７５（％）である。

　上記のような直鎖状のＴＮＮＡを得る別のアプローチとしては、直鎖状ＴＮＮＡを環状化する際のライゲーション部位（すなわち、直鎖状ＴＮＮＡの５’末端および３’末端）が、環状化したＴＮＮＡをＴＣＮＡとアニーリングした場合に、ＴＣＮＡにより形成されるニックまたはギャップとは異なる位置となるように直鎖状ＴＮＮＡを設計することが挙げられる。ライゲーション部位がニックまたはギャップから離れた位置となるよう設計することが好ましく、ニックまたはギャップの反対側かその近傍となるよう設計することが特に好ましい。ここで、反対側とは、例えば、ＴＮＮＡを構成する全単量体を円周上に均等に並べた場合、円の中心に対してニックまたはギャップの中点と点対称になるＴＮＮＡ上の位置を意味する。図２に好ましいライゲーション部位の非限定例を示す。図２に示す核酸分子二量体は、ＴＣＮＡがニックおよび５’突出を有するものであり、ニックの反対側となるＴＮＮＡにおける位置は４となる。ニックの反対側の近傍は、例えば、１～３および５～７、２～３および５～６、３および５などであってよい。ＴＮＮＡを構成するヌクレオチドの数が奇数個の場合、ニックの反対側となるＴＮＮＡにおける位置は、ニックの丁度反対側に位置するヌクレオチドの３’側または５’側となる。

　本開示の核酸分子二量体は、作用部位への送達を補助、促進または容易化する作用を有する既知の任意の送達担体とともに送達または投与されてもよいし、これらの送達担体なしで直接送達または投与されてもよい。送達担体としては、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いることができる。非ウイルスベクターとしては、限定されずに、例えば、ポリマー粒子、脂質粒子、無機粒子などの粒子状担体が挙げられる。粒子としては、大きさがナノレベルのナノ粒子を用いることができる。ポリマー粒子としては、限定されずに、例えば、カチオン性ポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、キトサン、シクロデキストリン、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－カプロラクトン酸）（ＰＬＣＡ）、ポリ（βアミノエステル）、アテロコラーゲンなどのポリマーを含むものが挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、例えば、ポリリジン（例えば、ポリ-Ｌ-リジン（ＰＬＬ））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、これらの誘導体などが挙げられる。ポリエチレンイミンの誘導体としては、例えば、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコールコポリマー（ＰＥＩ－ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）、グラフトＰＥＩ、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体化ＰＥＩなどが挙げられる。アミンを含むポリマーは、エンドソームに取り込まれた際に、エンドソーム脱出に有利なプロトンスポンジ効果を発揮し得る。

　脂質粒子にはリポソームや非リポソーム型脂質粒子などが含まれる。リポソームは脂質二重膜で包まれた内腔を有する小胞であり、非リポソーム型脂質粒子は、このような構造を有しない脂質粒子である。脂質粒子は、カチオン性脂質、イオン化可能（ionizable）脂質、ヘルパー脂質などを含んでいてもよい。カチオン性脂質は、負の電荷を有する核酸分子などを細胞内に導入するのに特に有用である。カチオン性脂質の非限定例としては、Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）－ジドデシル－Ｄ－グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ’－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ－６－１４）などが挙げられる。他に有用なカチオン性脂質の例はWO 2012/170952などにも記載されている。

　イオン化可能脂質としては、イオン化可能カチオン性脂質が挙げられる。イオン化可能カチオン性脂質は、ＰＫａ以上のｐＨでは非イオン性であるが、ＰＫａより低いｐＨでカチオン性となる性質を有する。イオン化可能脂質は３級アミンを有することがある。アミンを含むことで、エンドソームに取り込まれた際にエンドソーム脱出に有利なプロトンスポンジ効果を発揮し得る。一部の態様において、イオン化可能カチオン性脂質のＰＫａは、７．０以上、７．５以上、７．６以上、７．８以上、８．０以上などであってよい。イオン化可能脂質の非限定例としては、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫＤＭＡ、ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡなどが挙げられる。他に有用なイオン化可能カチオン性脂質の例はWO 2013/185116などにも記載されている。

　ヘルパー脂質は、脂質粒子の安定化などに寄与する脂質である。ヘルパー脂質は電荷的に中性であってもよい。ヘルパー脂質の非限定例としては、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、ジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ＰＥＧ脂質などが挙げられる。

　無機粒子としては、例えば、金ナノ粒子、量子ドット、シリカナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子（例えば、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ））、ナノチューブ（例えば、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ））、ナノダイヤモンド、フラーレンなどが挙げられる。
　上記粒子担体には種々の修飾を加えることができる。例えば、ＰＥＧによるステルス化、標的化リガンドによる標的化、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）による修飾などが挙げられる。
　本開示の核酸分子二量体に、上記のポリマーや、標的化リガンド、ＣＰＰなどの機能的部分を結合させ、コンジュゲートとすることもできる。これにより、上記の担体を用いることなく、本開示の核酸分子二量体を製剤化することが可能となる。かかる機能的部分はＴＣＮＡおよびＴＮＮＡのいずれに結合させてもよいが、標的核酸分子に直接作用しないと考えられるＴＮＮＡに結合させることが好ましい。機能的部分はＴＮＮＡの任意の部分に結合させることができる。特定の態様において、機能的部分はＴＣＮＡがニックまたはギャップを形成しているＴＮＮＡの部分に結合させる。別の態様において、機能的部分はＴＣＮＡがニックまたはギャップを形成している箇所から離れたＴＮＮＡの部分、例えば、ニックまたはギャップの反対側のＴＮＮＡの部分に結合させる。

　本開示の核酸分子二量体は皮膚適用、経皮適用または注射（静脈注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射、動脈注射、点滴注射等）を介して、全身投与あるいは関係する組織にex vivoまたはin vivoで、局所投与することができる。本開示の核酸分子二量体は、肺送達、例えば、関連する肺組織への核酸分子の迅速な局所取り込みをもたらす吸入装置または噴霧器によって投与されるエアゾールまたは噴霧乾燥製剤の吸入などによって投与することができる。本開示の核酸分子二量体はまた、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与することができる。ＣＮＳへの核酸分子の送達は、限定されずに、クモ膜下および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの移植、損傷部位または病変部位への直接注射または灌流、脳動脈系への注射、または血液脳関門の化学的または浸透圧的開放などにより行うことができる。

　本開示の核酸分子二量体は、目的に適した送達システムにより送達することができる。送達システムは、例えば、水性および非水性のゲル、クリーム、複エマルション、マイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアゾール、炭化水素基剤およびパウダーなどを含んでもよく、賦形剤、例えば可溶化剤、浸透促進剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコールおよびアミノ酸など）および親水性ポリマー（例えばポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドンなど）を含むことができる。一態様において、薬学的に許容し得る担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。

　送達システムは、パッチ、錠剤、坐薬、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含んでもよく、賦形剤、例えば可溶化剤および促進剤（例えばプロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸など）、および他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、および親水性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸など）を含むことができる。
　本開示の核酸分子二量体の送達に有用な手法やシステムは、例えば、Rettig and Behlke, Mol Ther. 2012;20(3):483-512、Kraft et al., J Pharm Sci. 2014;103(1):29-52、Hong and Nam, Theranostics. 2014;4(12):1211-32、Kaczmarek et al., Genome Med. 2017;9(1):60 などに記載されている。

　本開示の一部の態様は、本開示の核酸分子二量体を含む組成物に関する（以下、本開示の組成物と称することがある）。本開示の組成物に含まれる核酸分子二量体は、同一種であっても、２種以上の異なるものであってもよい。本開示の組成物が２種以上の異なる核酸分子二量体を含む場合、核酸分子二量体は異なる標的核酸分子に対するものであっても、同一の標的核酸分子の異なる配列（領域）に対するものであってもよい。本開示の組成物は、本開示の核酸分子二量体に加え、上述の任意の担体、希釈剤、送達ビヒクル、送達システムなどを含んでもよい。本開示の組成物は、標的核酸分子に関連する疾患の処置に使用できる。したがって、本開示の組成物は、標的核酸分子に関連する疾患の処置のための医薬組成物となり得る（以下、本開示の医薬組成物と称することがある）。本開示の医薬組成物は、１または２以上の薬学的に許容し得る添加物（例えば、界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤など）を含んでもよい。薬学的に許容し得る添加物は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。

　一部の態様において、本開示の医薬組成物は、本開示の核酸分子二量体と同様、標的核酸分子の発現に関連する疾患の処置のために使用することができる。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果、ＰＫＲのリン酸化、ＴＬＲ３経路の活性化および核酸分子による配列非特異的な細胞応答（例えば自然免疫）の誘導の少なくとも１つを回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。また、本開示の医薬組成物は、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮβ１、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＮＦおよびＣＸＣＲ４から選択される遺伝子の少なくとも１つの発現増強を回避しながら、標的核酸分子の発現に関連する疾患を処置するために使用することができる。

　本開示において、「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」は、標的核酸分子に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。したがって、前記核酸分子二量体および医薬組成物には、標的核酸分子に関連する疾患を治療するための医薬組成物、および標的核酸分子に関連する疾患を予防するための医薬組成物が含まれる。

　本開示の核酸分子二量体または医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、頬側、口腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内、気道内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などを参照）。

　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。

　本開示に係る組成物は、いずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供されてもよい。この場合、前記組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。

　本開示のさらなる態様は、本開示に係る組成物、またはその構成要素を含む、前記組成物を調製するための、標的核酸分子に関連する疾患を処置するためのキットまたはパック、ならびに、そのようなキットまたはパックの形で提供される前記組成物、またはその必要構成要素にも関する。かかるキットまたはパックに含まれる、組成物の各構成要素は、前記組成物について上記したとおりである。本キットは、上記のほか、組成物の調製方法や使用方法（例えば、投与方法等）などに関する指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどをさらに含んでいてもよい。また、かかるキットまたはパックは、組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、前記キットまたはパックは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。

　本開示の別の態様は、標的核酸分子に関連する疾患を処置する方法であって、該方法が、前記疾患を処置する薬物を含む有効量の本開示に係る核酸分子二量体または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、前記方法に関する（以下、「本開示の処置方法」と称することがある）。ここで、有効量とは、例えば、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。

　前記処置方法において対象に投与する核酸分子二量体または医薬組成物の具体的な用量は、投与を要する対象に関する種々の条件、例えば、標的の種類、方法の目的、治療内容、疾患の種類、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。医薬組成物の１日総投与量は、限定されずに、例えば、核酸分子二量体の量として約１μｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。あるいは、投与量は患者の表面積に基づいて計算してもよい。

　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、頬側、口腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内、気道内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
　投与頻度は、用いる製剤または組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。

　本開示において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。対象は健常（例えば、特定のまたは任意の疾患を有しない）であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、標的核酸分子に関連する疾患の処置等が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。

　本開示の別の態様は、標的核酸分子の発現を調節する方法であって、該方法が、標的核酸分子を含む細胞に、有効量の本開示に係る核酸分子二量体または医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法に関する（以下、「本開示の発現調節方法」と称することがある）。ここで、有効量とは、例えば、当該標的核酸分子の発現を検出可能な程度に調節できる量である。標的核酸分子の発現は、それがタンパク質の産生に係るものであれば、既知のタンパク質検出手法、例えば、限定されずに、抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ（enzyme immunoassay）（例えば、ＥＬＩＳＡ（emzyme-linked immunosorbent assay）など）、ＲＩＡ（radio immuno assay）（例えば、ＩＲＭＡ（immunoradiometric assay）、ＲＡＳＴ（radioallergosorbent test）、ＲＩＳＴ（radioimmunosorbent test）など）、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法などにより検出することができる。標的核酸分子の発現が核酸分子の産生に係るものであれば、既知の核酸分子検出手法、例えば、限定されずに、当該核酸分子もしくはそのユニークな断片に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより検出することができる。また、標的核酸分子の発現が生理活性の発現である場合は、当該生理活性の既知の任意の検出手法により検出することができる。本開示の発現調節方法は、in vitro、ex vivoまたはin vivoで行うことができる。細胞への核酸分子二量体または医薬組成物の投与は、既知の任意の手法、例えば、in vivoの場合は、本開示の処置方法について上記したような経口および非経口の両方を包含する種々の経路で行うことができ、in vitroまたはex vivoの場合は、細胞を含む媒体（例えば、培養培地など）に核酸分子二量体または医薬組成物を添加することなどにより行うことができる。

　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。
例１：環状核酸分子含有核酸分子二量体（circular nucleic acid molecule-containing nucleic acid molecule dimer、ＣＮＡ－ＮＡＤ）の製造
　ＣＮＡ－ＮＡＤは、直鎖状の標的非相補的核酸分子（target non-complementary nucleic acid、ＴＮＮＡ）を環状化し、これに直鎖状の標的相補的核酸分子（target complementary nucleic acid、ＴＣＮＡ）をアニーリングすることにより製造した。

（１）使用配列
　ＴＮＮＡは、以下の配列のものを用いた。

　ＴＣＮＡは以下のものを用いた。

 　表中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵはＲＮＡを、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴはＤＮＡを、Ｐはリン酸基を、^＋はＬＮＡをそれぞれ示す。

（２）ＴＮＮＡの環状化
　製造者の指示に従い、ＲＮＡリガーゼ（T4 RNA Ligase 1、NEB）と、５‘末端にリン酸基、３’末端に水酸基をそれぞれ有する直鎖状のＴＮＮＡとを、ＡＴＰの存在下、３７℃で１６時間反応させ、ＴＮＮＡの５’末端と３‘末端とをライゲーションした。反応終了後、反応物を６５℃で１５分インキュベートし、ＲＮＡリガーゼを失活させた。反応物を２０％Ｔ変性ポリアクリルアミド／尿素ゲルにアプライし、２５０Ｖで９０分電気泳動した。ゲルを０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドで１５分染色し、ＵＶでバンドを検出した。ラダーマーカーとして、DynaMarker^(R) Small RNA II Easy Load（BioDynamics Laboratory）を使用した。ＴＮＮＡとしてＴＮ－２およびＴＮ－５を使用した電気泳動の結果を図３に示す。なお、非環状化対照としては、ライゲーション前のＴＮＮＡを、環状化対照として、ＴＮ－２およびＴＮ－５を上記のとおり環状化した後、環状化核酸分子を濃縮するためにRNase R（Epicentre）で処理したものをそれぞれ用いた。図３より、５‘末端にリン酸基を有するＴＮＮＡ（ＴＮ－２およびＴＮ－５）が環状化されたことが分かる。環状化核酸分子のバンドを切り出し、ゲル粉砕後、３７℃で４時間以上水に溶出させ、Dr. GenTLE^(R) Precipitation Carrier （TAKARA BIO）にて共沈し、精製した。これをRNase Free水に溶解し、環状（circular）ＴＮＮＡ（ＣＴＮＮＡ）として以後の実験に使用した。

（３）アニーリング
　上記（２）で得たＣＴＮＮＡを含む核酸分子溶液６μＬと、ＣＴＮＮＡと同モル濃度の直鎖状（linear）ＴＣＮＡ（ＬＴＣＮＡ）をRNase Free水に溶解した核酸分子溶液各６μＬと、アニーリングバッファーであるＴｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）３μＬとを混合し、８０℃で５分間、次いで、３７℃で１時間反応させた。アニーリングの確認のため、反応物をネイティブＰＡＧＥで分析した。反応物を２０％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、２００Ｖで７０分電気泳動した。ゲルを０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドで１５分染色し、ＵＶでバンドを検出した。ラダーマーカーとして、DynaMarker^(R) Small RNA II Easy Load（BioDynamics Laboratory）を使用した。ＴＮＮＡとしてＴＮ－２、ＴＣＮＡとしてＴＣ－１を使用した電気泳動の結果を図４に示す。同図に示す結果から、ＣＴＮＮＡとＬＴＣＮＡとがアニーリングしたことが確認された。

　上記の手法により、以下のＣＮＡ－ＮＡＤを製造した。なお、以下の表における「長さ(TN/TC)」は、「ＴＮＮＡの長さ/ＴＣＮＡの長さ」を表す。

　ＴＮＮＡの代わりにＴＣＮＡを環状化した以外は上記と同様にして、以下のＣＮＡ－ＮＡＤを製造した。

　また、ＴＮＮＡもＴＣＮＡも環状化せず、直鎖状ＴＮＮＡと直鎖状ＴＣＮＡとを上記（３）のようにアニーリングして、以下の核酸分子二量体を製造した。

例２：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果（１）
　Ａ５４９細胞を０．１×１０^５個／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM、Sigma-Aldrich）中３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。翌日、製造者のプロトコルに従い、Opti-MEM（Sigma-Aldrich）培地中にLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）と各核酸分子とを含む試料を、核酸分子の終濃度が１０ｎＭになるようにＡ５４９細胞培養物に加え、５時間トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に置換した。トランスフェクション開始から２４時間後に、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出し、SuperScript VILO Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用いて逆転写反応を行った後、SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＬＫ１の発現量を測定した。結果を下表に示す。表中、ｍＲＮＡ残存率は、未処理群（ＮＴ）におけるｍＲＮＡの残存率を１００％とした場合の比率（％）で表示し、１０ｎＭのＲＮＡ濃度でのｍＲＮＡ残存率が３０％以下を合格（〇）と判定した。

　上記のとおり、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体により、ノックダウン効果が十分に得られることが分かる。

例３：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果（２）
　突出やギャップの有無が異なる、種々の構造を有する環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果を検討した。簡潔には、Ａ５４９細胞を２×１０^３個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、図５に示す各核酸分子二量体の終濃度を２０ｎＭとした以外は例２と同様にして、各核酸分子二量体のノックダウン効果をｍＲＮＡ残存率により評価した。図５に示す結果から、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体が、突出の有無や、ＴＣＮＡがニックを有するかギャップを有するかに拘わらず、十分なノックダウン効果を奏することが分かる。

例４：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果（３）
　ＴＣＮＡに修飾を有する環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果を検討した。簡潔には、核酸分子二量体として、表７に記載のものを使用した以外は例２と同様にして、各核酸分子二量体のノックダウン効果を評価した。

  表７に示す結果から、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体は、ＴＣＮＡが修飾されていても十分なノックダウン効果を奏することが分かる。

例５：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果（４）
　別の核酸分子を標的とする環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果を検討した。簡潔には、Ａ５４９細胞を２．５×１０^４個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、表８に示す各核酸分子二量体の終濃度を２０ｎＭとした以外は例２と同様にして、各核酸分子二量体のノックダウン効果をｍＲＮＡ残存率により評価した。結果を表８に示す。数値は、各測定値をＧＡＰＤＨの測定値で正規化し、トランスフェクション試薬のみ加えたＭｏｃｋ対照（Ｍｏｃｋ）を１００とした場合の相対値である。

 
　上表に示す結果から、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体が、異なる標的核酸分子に対しても十分なノックダウン効果を奏することが分かる。

例６：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体によるオフターゲット効果の回避
　環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体と、これに対応するＴＣＮＡ環状化核酸分子二量体のノックダウン効果を比較することにより、ＴＮＮＡによるオフターゲット効果の有無を評価した。環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体としてＣＬ－４、ＴＣＮＡ環状化核酸分子二量体としてＬＣ－１を用い、例２と同様にｍＲＮＡ残存率を測定した。結果を下表に示す。ｍＲＮＡ残存率の表示は例２と同様である。また、１ｎＭの濃度でｍＲＮＡ残存率が４０％以下を示したものを合格（〇）と判定した。

 
　上記結果からＲＮＡサイレンシングを誘導する核酸分子（ＴＣＮＡ）を環状にし、ＴＮＮＡを直鎖状にした場合にはｍＲＮＡ残存率が低下しなかったが、逆にＴＣＮＡを直鎖状にし、ＴＮＮＡを環状にした場合にはｍＲＮＡ残存率が低下したことが分かる。このことより、ＴＮＮＡを環状化（ＴＣＮＡは直鎖状）した場合、ＴＮＮＡ由来のオフターゲット効果が抑制できることが示唆される。

例７：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体によるＰＫＲリン酸化の回避
　環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体により、ＰＫＲの活性化（リン酸化）が回避できるかどうかを評価した。Ａ５４９細胞を０．２５×１０^５個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。翌日、製造者のプロトコルに従い、Opti-MEM（Sigma）培地中にLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）と各核酸分子二量体とを含む試料を、核酸分子二量体の終濃度が２０ｎＭになるようにＡ５４９細胞培養物に加え、５時間トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に置換した。トランスフェクション開始から２４時間後に、培養物の一部を用い、例２と同様にしてＰＬＫ１のｍＲＮＡ残存率を測定した。

　また、トランスフェクション開始から７２時間後に、培養物をLysis Bufferに溶解してタンパク質を抽出し、リン酸化ＰＫＲを検出するためにウェスタンブロッティングに供した。Lysis Bufferの組成は、合計１０ｍｌ中、１％ＮＰ－４０（NP-40 Alternative PROTEIN GRADE Detergent, 10 % Solution, Sterile - Filtered、CALBIOCHEM）１００μＬ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５００μＬ、５Ｍ　ＮａＣｌ　３００μＬ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０μＬ、dialyzed water　９．０８mL、Complete, Mini, EDTA - free（Roche）１錠、Phos STOP（Roche）１錠であった。ブロットメンブレンを５％のPhosphoBLOCKER Blocking Reagent（Cell Biolabs、AKR-103）でブロッキングし、一次抗体（抗Ｐ－ＰＫＲ抗体（ab32036、１／１０００希釈）、抗ＰＫＲ抗体（ab32052、１／１０００希釈）および抗ＧＡＰＤＨ抗体（ab8245、１／５０００希釈））、次いで二次抗体（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体、１／４０００希釈）と反応させ、Amersham ECL Primeウェスタンブロッティング検出試薬（GE Healthcare、RPN2232）を用いてバンドを検出した。ｍＲＮＡ残存率の結果を表１０に、ウェスタンブロッティングの結果を図６にそれぞれ示す。なお、表中、ｍＲＮＡ残存率は、未処理群（ＮＴ）におけるｍＲＮＡの残存率を１００％とした場合の比率（％）で表示し、２０ｎＭのＲＮＡ濃度でｍＲＮＡ残存率ＫＤ効率が２５％以下を示したものを合格（〇）と判定した。

 
　図６の結果から、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体を作用させた細胞におけるＰＫＲのリン酸化の程度は、対応する直鎖状核酸分子二量体に比べ、顕著に小さいことが分かる。

例８：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体によるＴＬＲ３経路活性化の回避
　環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体により、ＴＬＲ３経路の活性化（関連遺伝子の発現誘導）が回避できるかどうかを種々の手法で評価した。
（１）定量ＰＣＲによる評価
　Ａ５４９細胞を０．２５×１０^５個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。翌日、製造者のプロトコルに従いOpti-MEM（Sigma）培地中にLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）と各核酸分子とを含む試料を、核酸分子二量体の終濃度が２０ｎＭになるようにＡ５４９細胞培養物に加え、６時間トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に置換した。トランスフェクション開始から２４時間後に、培養物の一部を用い、例２と同様にして、ＴＬＲ３経路に関連するＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮα１、ＩＦＮβ１、ＩＬ６、ＩＬ１０およびＴＮＦの発現量を測定した。対照として、未処理対照（ＮＴ）およびトランスフェクション試薬のみ加えたＭｏｃｋ対照（Mock）を用いた。図７に示す結果から、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体が、古典的ｓｉＲＮＡや非対称直鎖状核酸分子二量体と比べ、ＴＬＲ３経路関連遺伝子の発現誘導が少ないことが分かる。

（２）ＰＣＲアレイによる評価
　Ａ５４９細胞を０．２５×１０^５個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。翌日、製造者のプロトコルに従いOpti-MEM（Sigma）培地中にLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）と各核酸分子とを含む試料を、核酸分子二量体の終濃度が２０ｎＭになるようにＡ５４９細胞培養物に加え、５時間トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に置換した。トランスフェクション開始から２４時間後に、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出し、RT² First strand kit（QIAGEN）を用いて逆転写反応を行った後、RT² Profiler PCR array（QIAGEN）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＴＬＲ３経路に関連する遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。下表は、ＮＴと各核酸分子との間で発現量に２倍以上の差がある遺伝子についての結果を示す。なお、数値は、ハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ／Ｂ２Ｍ／ＧＡＰＤＨ／ＨＰＲＴ１）の平均値で補正し、未処理対照（ＮＴ）を１とした倍率である。

　同表に示す結果から、ＴＬＲ３経路下流に発現する遺伝子（ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＩＬ１Ｂ）の発現が環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体を作用させた細胞において、古典的ｓｉＲＮＡや非対称直鎖核酸分子二量体と比べ誘導されないことが分かる。

（３）ウェスタンブロットによる評価
　Ａ５４９細胞を０．２５×１０^５個／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。翌日、製造者のプロトコルに従いOpti-MEM（Sigma）培地中にLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）と各核酸分子二量体とを含む試料を、核酸分子二量体の終濃度が２０ｎＭになるようにＡ５４９細胞培養物に加え、６時間トランスフェクションを行った。トランスフェクション開始から６時間後に、例７と同様に培養物をLysis Bufferに溶解してタンパク質を抽出し、ＴＬＲ３経路に関連するタンパク質のリン酸化を検出するためにウェスタンブロッティングに供した。ブロットメンブレンを５%のPhosphoBLOCKER Blocking Reagent（Cell Biolabs、AKR-103）でブロッキングし、一次抗体（抗Ｐ－ＴＬＲ３抗体（NBP2-24904、１／１０００希釈）、抗ＴＬＲ３抗体（ab62566、１／１０００希釈）、GAPDH（ab8245、１／５０００希釈）、抗Ｐ－ＳＴＡＴ１抗体（SC-8394、１／２００希釈)、抗ＳＴＡＴ－１抗体（SC-464、１／２００希釈））、次いで二次抗体（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体、１／４０００希釈、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体、１／２０００希釈）と反応させ、Amersham ECL Primeウェスタンブロッティング検出試薬（GE Healthcare、RPN2232）を用いてバンドを検出した。図８に示す結果から、ＴＬＲ３経路に関連するタンパク質（ＴＬＲ３、ＳＴＡＴ１）のリン酸化が、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体を作用させた細胞において、古典的ｓｉＲＮＡや非対称直鎖核酸分子二量体と比べ誘導されていないことから、本経路が活性化されていないことが分かる。

例９：エキソヌクレアーゼ耐性の評価
　環状化核酸分子のエキソヌクレアーゼに対する安定性を評価した。エキソヌクレアーゼ溶液（RNase R、Epicentre、4.5U）に環状または直鎖状ＴＮＮＡを２０μＭとなるように加え、全体量を１００μＬとした。サンプルを３７℃でインキュベートし、０、５、１０、２０および４０分経過後にそれぞれサンプルの一部を回収し、－８０℃で保存した。全サンプル回収後、各サンプルを２０％変性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、２００Ｖで７０分電気泳動した。ゲルを０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドで１５分染色し、ＵＶでバンド量を評価した。図９に示す結果から、環状核酸分子が、直鎖状核酸分子に比べエキソヌクレアーゼへの耐性が顕著に高いことが分かる。

例１０：環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果（５）
　別の核酸分子を標的とするＴＮＮＡ環状化核酸分子二量体のノックダウン効果を検討した。核酸分子二量体として、ＭＴ１ＭＭＰを標的とする表１２～表１３に示すものを使用した。各核酸分子二量体は、例１と同様の方法で調製した。

　細胞としてＭＤＡ－ＭＢ２３１、核酸分子二量体として表１２～表１３に示すものをそれぞれ用い、ＭＴ１ＭＭＰの発現量を測定対象とした以外は例２と同様にして、前記核酸分子二量体によるＭＴ１ＭＭＰのノックダウン効果を評価した。結果を表１４に示す。表中、ｍＲＮＡ残存率は、未処理群（ＮＴ）におけるｍＲＮＡの残存率を１００％とした場合の比率（％）で表示し、１０ｎＭのＲＮＡ濃度でのｍＲＮＡ残存率が３０％以下を合格（〇）と判定した。

　上記のとおり、環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体によるノックダウン効果が、特定の遺伝子に限定されないことが分かる。

例１１：ｍｉＲＮＡの配列を含む環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体のノックダウン効果
　ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を含むＴＮＮＡ環状化核酸分子二量体のノックダウン効果を検討した。ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列としてｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐの配列を用いた。各核酸分子二量体は、例１と同様の方法で調製した。使用した配列を表１５に、各核酸分子二量体の構成を表１６にそれぞれ示す。

 

 

　細胞としてＨＣＴ１１６、核酸分子二量体として表１５～表１６に示すものをそれぞれ用い、ＡＲＨＧＡＰ１の発現量を測定対象とした以外は例３と同様にして、前記核酸分子二量体によるＡＲＨＧＡＰ１のノックダウン効果を評価した。ＡＲＨＧＡＰ１はｍｉＲ－３４ａの標的遺伝子であり、ｍｉＲ－３４ａによりその発現が抑制されることが知られている（Matsui et al., Mol Ther. 2016;24(5):946-55）。図１０の結果が示すとおり、いずれの環状ＴＮＮＡ含有核酸分子二量体も、未処理群（ＮＴ）に比べ、顕著なノックダウン効果を示した。

　多数の様々な改変が、本発明の精神から逸脱せずになされ得ることを当業者は理解する。したがって、本明細書に記載された本発明の形態は例示にすぎず、本発明の範囲を制限する意図がないことを理解すべきである。

Claims (12)

1. 　標的核酸分子の少なくとも一部と相補性を有する第一の核酸分子と、前記第一の核酸分子と相補性を有する第二の核酸分子とを含み、前記第一の核酸分子が直鎖状であり、前記第二の核酸分子が環状であり、前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子とが少なくとも部分的に二重鎖を形成する、核酸分子二量体。
2. 　第一の核酸分子が、第二の核酸分子より長い、請求項１に記載の核酸分子二量体。
3. 　第一の核酸分子の３’末端または５’末端が突出を形成する、請求項１または２に記載の核酸分子二量体。
4. 　第一の核酸分子がニックを形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
5. 　第一の核酸分子の長さが１６～３０ｍｅｒである、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
6. 　第二の核酸分子の長さが９～３０ｍｅｒである、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
7. 　第一の核酸分子および／または第二の核酸分子が修飾されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子二量体。
8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子二量体を含む組成物。
9. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子二量体と、１または２以上の薬学的に許容し得る添加物とを含む、医薬組成物。
10. 　標的核酸分子の発現の調節に用いるための、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子二量体または請求項８もしくは９に記載の組成物。
11. 　標的核酸分子に関連する疾患の処置に用いるための、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子二量体または請求項８もしくは９に記載の組成物。
12. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子二量体または請求項８もしくは９に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、標的核酸分子に関連する疾患を処置する方法。
     

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