WO2019069825A1 - β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層を含む複合体及びその製造方法 - Google Patents

β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層を含む複合体及びその製造方法 Download PDF

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WO2019069825A1
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一雄 小沼
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • B28B11/00—Apparatus or processes for treating or working the shaped or preshaped articles
    • B28B11/04—Apparatus or processes for treating or working the shaped or preshaped articles for coating or applying engobing layers
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    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
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    • C01B25/26—Phosphates
    • C01B25/32—Phosphates of magnesium, calcium, strontium, or barium

Definitions

  • a complex comprising a ⁇ -tricalcium phosphate (hereinafter sometimes referred to as “ ⁇ -TCP”) base and an octacalcium phosphate (hereinafter sometimes referred to as “OCP”) crystal layer or
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • OCP octacalcium phosphate
  • Non-Patent Document 1 Since octacalcium phosphate (Ca 8 (HPO 4 ) 2 (PO 4 ) 4. 5 H 2 O; OCP) has been shown by Non-Patent Document 1 to have excellent bone induction performance, the reactivity of OCP in the body Active research has been conducted to reveal the excellent potential as an osteoinductive material. OCP acts as a core of multiple bone formation sites in the body, and therefore, hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ; hereinafter sometimes referred to as “HAP”) or ⁇ -phosphate It is easier to accelerate the replacement of neonatal bone as compared to tricalcium ( ⁇ -Ca 3 (PO 4 ) 2 ; ⁇ -TCP).
  • HAP hydroxyapatite
  • ⁇ -phosphate It is easier to accelerate the replacement of neonatal bone as compared to tricalcium ( ⁇ -Ca 3 (PO 4 ) 2 ; ⁇ -TCP).
  • OCP is also used as a bone substitute material for transplantation, a microscaffold (for inducing new bone), and a material for coating.
  • Studies to coat OCP on a titanium substrate have been carried out particularly vigorously, in order to improve the bone induction performance of titanium.
  • One of the problems with using OCP in the body is the inability to construct large shaped bodies without adding additives into the system to form OCP or hydrolysis reaction from other calcium phosphates (eg DCPD) Will.
  • ⁇ -TCP has long been used as a bone grafting (alternative) material. This is to cope with the problem such as the decrease in spontaneous bone regeneration ability often found in orthopedic clinical practice. Studies are being conducted not only on the use of ⁇ -TCP alone, but also on the case of using it as a three-dimensional scaffolding material (for bone guidance) in combination with HAP and organic matter. Such studies are due to the inherent biocompatibility and high degradability in the body required by ⁇ -TCP for the material for inducing new bone. Also, the established ⁇ -TCP synthesis method can be said to be advantageous. It has also been reported that decreasing the size of ⁇ -TCP particles from micrometer size to nanometer size improves biocompatibility and degradability.
  • OCP and ⁇ -TCP necessarily leads to one idea when considered from the viewpoint of bone grafting (alternative) material development which has excellent properties and can be easily made. That is, it is a material in which an OCP layer is coated on a ⁇ -TCP substrate.
  • little research has been conducted on the combined use of OCP and ⁇ -TCP. More than 30 years ago, preliminary research results that OCP is formed when ⁇ -TCP powder is introduced into pH 6.0 calcium phosphate solution with Ca / P ratio maintained at 1.33 (stoichiometric ratio of OCP) Have been reported (see Non-patent Document 2; Note: direct evidence of OCP formation (such as X-ray diffraction pattern) not shown).
  • the present invention has been made on the background of the above-described past studies, and an object of the present invention is to provide a composite including a ⁇ -TCP substrate and an OCP crystal layer, and a method for producing the same.
  • the inventor of the present invention has conducted research on constructing an OCP crystal layer on the surface of a ⁇ -TCP base material in a pseudo-physiological environment field, and described in ⁇ Discussion on Examples etc.> I got various findings like this.
  • ⁇ 1> At least a portion of the surface of a ⁇ -TCP base material comprising a filler of ⁇ -TCP crystal particles is immersed in a mother liquor containing calcium ions and phosphate ions and having a magnesium ion content of 0.5 mM or less
  • a process for producing a complex comprising a ⁇ -TCP substrate and an OCP crystal layer.
  • the manufacturing method of the complex as described in ⁇ 1> which makes ⁇ 2> (beta) -TCP crystal particle a thing of micrometer size, and forms an OCP crystal directly on the surface of a (beta) -TCP base material.
  • Production method. ⁇ 4> The mother liquid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, which is an aqueous solution having a calcium ion concentration of 0.2 to 5 mM and a phosphate ion concentration of 0.2 to 5 mM. Method.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the mother liquor has a magnesium ion content of 0.1 mM or less.
  • ⁇ 6> The method for producing a complex according to ⁇ 4>, wherein the mother liquor has a pH of more than 5.5 but not more than 8.0.
  • ⁇ 7> The method for producing a complex according to ⁇ 4>, wherein the temperature of the mother liquor is 0 to 60 ° C.
  • a complex comprising a ⁇ -TCP substrate comprising a filler of ⁇ 8> ⁇ -TCP crystal particles, and an OCP crystal layer on the surface of the ⁇ -TCP substrate.
  • ⁇ 9> The complex according to ⁇ 8>, wherein the ⁇ -TCP crystal particle is nanometer size, and includes a HAP crystal layer between the ⁇ -TCP substrate and the OCP crystal layer.
  • ⁇ 10> The complex according to ⁇ 8>, wherein the ⁇ -TCP crystal particle is a micrometer size and the OCP crystal layer is directly present on the surface of the ⁇ -TCP substrate.
  • ⁇ 11> The complex according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10>, wherein the OCP layer includes a portion in which the crystal structure and / or the chemical composition is modulated.
  • the present invention can include the following aspects.
  • ⁇ 12> The method for producing a complex according to ⁇ 4>, wherein the mother liquor has a calcium ion concentration of 1 to 4 mM and a phosphate ion concentration of 1 to 4 mM.
  • the manufacturing method of the complex as described in ⁇ 5> whose magnesium ion content of the ⁇ 13> said mother liquor is 0.01 mM or less.
  • ⁇ 14> The method for producing a complex according to ⁇ 6>, wherein the mother liquor has a pH of 6.0 or more and 7.8 or less.
  • ⁇ 15> The process for producing a composite according to ⁇ 7>, wherein the temperature of the mother liquor is 20 to 40 ° C.
  • ⁇ 16> A method for producing a composite according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, comprising preparing the ⁇ -TCP base material by compression molding of ⁇ -TCP crystal particles. Manufacturing method. The manufacturing method of the composite as described in ⁇ 16> whose compression pressure at the time of the ⁇ 17> said compression molding is 1 Mpa or more. ⁇ 18> The method for producing a complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the ⁇ -TCP base material is a substrate.
  • a complex comprising a ⁇ -TCP base layer and an OCP crystal layer can be produced.
  • a small mass of platelets is formed on the substrate.
  • (A) 1 minute after immersion. The lumps indicated by white arrows are deposited on the substrate surface.
  • (B) 3 minutes after immersion.
  • (C) After 10 minutes of immersion. The plates in the mass grow and fuse together.
  • (D) After 20 minutes of immersion. A plate with irregular edges covers most of the surface.
  • a polygon plate-like OCP covers the surface. The figure which the plaid parallel to the extension direction of a flat plate crystal
  • This checkered pattern is unique to the OCP crystal, and the orientation corresponds to [100].
  • the image inserted at the upper left in the figure is an FFT (Fast Fourier Transform) pattern for the HR-TEM figure, and it can be understood from this figure that the average interval of the lattice is 1.67 nm.
  • the measurement area is 800 nm ⁇ . The pattern corresponds to the ideal OCP observed from the [011] direction.
  • FIG. 1 A simulated SAED pattern viewed from four crystallographic axis directions in a dashed square frame in (b). Drawing which shows the STEM-EDS analysis result with respect to the growth layer on a (beta) -TCP micro substrate.
  • the squares in (a) indicate element mapping regions.
  • the dashed squares numbered 1, 2 and 3 in the calcium mapping image are the three representative regions (bush-like needle-like regions, irregularly-shaped plate regions, multiple, etc.) of the growth layer analyzed by EDS. Corresponds to the rectangular plate area).
  • the fourth curve from the bottom is the spectrum corresponding to the polygonal plate in the region about 40 ⁇ m away from the substrate interface.
  • the sample is different from (a).
  • the substrate was first immersed in 3.96 mM Ca 2+ , 3.94 mM PO 4 3- , 0.526 mM (10 ppm) F 2 - solution for 30 minutes and then in a solution containing no fluorine for about 20 hours.
  • B Magnified image of (a).
  • C Surface image after immersion for 30 minutes. HAP nanorod structures are formed on the surface. This sample is different from the samples of (a), (b) and (d).
  • D Surface image after immersion of the substrate for about 20 hours. The surface is covered by a plate of OCP.
  • ACP amorphous calcium phosphate
  • amorphous calcium phosphate CR crystal
  • DCPD dibasic calcium phosphate dihydrate
  • FFT Fast Fourier Transform
  • FIB focused-ion-beam
  • Focused Ion Beam HAP hydroxyapatite
  • Hydroxyapatite Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2
  • HR-TEM High-resolution TEM
  • the composite of the present invention comprises a ⁇ -TCP substrate consisting of a packing of ⁇ -TCP crystal particles, and an OCP crystal layer formed on the surface of the substrate.
  • the complex of the present invention is a mother liquor containing at least a part of the surface of a ⁇ -TCP substrate consisting of a packing of crystalline particles of ⁇ -TCP containing calcium ions and phosphate ions and substantially free of magnesium ions. It can be manufactured by immersion.
  • the structure of the composite and the structure of the OCP crystal layer change depending on the particle size of the ⁇ -TCP crystal particles used for the substrate, as described in detail in the Examples and the like described later. That is, when the ⁇ -TCP crystal particles have a micrometer size, OCP crystals are directly formed on the surface of the ⁇ -TCP substrate. On the other hand, when the ⁇ -TCP crystal particles have a nanometer size, a HAP crystal layer is first formed on the surface of the ⁇ -TCP substrate, and an OCP crystal is formed on the HAP crystal layer. Thus, if the ⁇ -TCP crystal particles are of nanometer size, the complex comprises a HAP layer between the ⁇ -TCP substrate and the OCP crystal layer.
  • the crystal structure and the chemical composition of the OCP crystal layer formed on the surface of the ⁇ -TCP base material are modulated at an early stage, and the OCP crystal layer changes to a normal OCP with its growth. Furthermore, the modulation portion is wider when using nanometer-sized ⁇ -TCP crystal particles than when using micrometer-sized particles, and thus the particle size of ⁇ -TCP crystal particles It has also become apparent that the width of the area of the modulation part can be adjusted by adjusting the.
  • the modulation part of the crystal structure has a theoretical value of the crossing angle of more than 81.0 ° (more specifically, 83 to 92 ° as the modulation part of the clear crystal structure). Is a part of 85 to 92 °, and the modulation part of the chemical composition is more than the theoretical value of the Ca / P elemental% ratio of more than 1.33 (as a modulation part of a clear chemical composition, 1.35 to 1. 66, more specifically as 1.40 to 1.66), respectively.
  • the upper limit does not have to be limited, but is usually 20 to 30 ⁇ m.
  • the lower limit does not have to be limited, but is usually 1 to 5 nm.
  • a substrate comprising a filler of ⁇ -TCP crystal particles can be prepared by compression molding crystal particles of ⁇ -TCP.
  • the substrate may have any shape, for example, spherical particles, a substrate having a curved surface at a part, etc., but at least a part of the surface is formed flat and at least a part of the flat surface is dipped in mother liquor It can also be done.
  • a flat surface to be immersed in a mother liquor has, for example, a flatness (magnitude of deviation from a geometrically correct plane) specified by JIS B0621 of 200 nm or less, 100 nm or less, 50 nm or less, or a square specified by JIS B0601.
  • the mean square root roughness Rq can also be set to 200 nm or less, 100 nm or less, 50 nm or less, or the like.
  • the flatness can be measured by a known means such as a flatness tester.
  • a substrate is used as the substrate, both surfaces of the substrate may be formed flat, or the entire surface or a part of one surface may be formed flat.
  • the temperature during compression molding is acceptable as long as the crystals do not melt or decompose. Preferably it is normal temperature.
  • the pressure of compression at the time of compression molding is acceptable if it is within the range in which a base consisting of a filler of ⁇ -TCP crystal particles can be formed. Usually, it is 1 MPa or more.
  • the upper limit of the compression pressure does not have to be limited, but generally, the allowable upper limit can be set to 100 MPa, 150 MPa, 200 MPa, etc., depending on the molding machine, mold, etc. used.
  • the substrate can also be coated with a substance which does not react with the calcium phosphate solution except for the surface to be immersed in the mother liquor and does not cause precipitation of a calcium phosphate salt. Materials for such coatings include, but are not limited to, resins, metals, and the like.
  • the mother liquor for substrate immersion contains calcium ion and phosphate ion.
  • the concentration of calcium ion and phosphate ion is 0.2 mM or more, preferably 1 mM or more. If the concentration is less than 0.2 mM, OCP crystals will not form or their formation rate will be slow. On the other hand, if the concentration is high, the formation rate of OCP crystals will be faster, but if the concentration is too high, homogeneous nucleation (precipitation) will easily occur during substrate immersion, and OCP crystals oriented in a certain direction can be obtained. It becomes difficult.
  • the upper limit of the concentration of calcium ions and phosphate ions at which homogeneous nucleation (precipitation) does not occur during substrate immersion also depends on the pH of the mother liquor and the presence or absence of agitation of the mother liquor. If the pH of the mother liquor is relatively low at around 6.2, the upper limit of the concentration is around 5 mM (if the pH is around 5.6, the upper limit for the concentration is around 8 mM), but the pH is around 7.4 If it is relatively high, it should be lowered to about 2 mM or less.
  • the mother liquor when the mother liquor is stirred, homogeneous nucleation (precipitation) tends to occur, but if the concentration is 2 mM or less at about pH 6.2, the mother liquor should be stirred to accelerate the formation rate of the OCP crystals. Is also acceptable. If the concentration of calcium ions and phosphate ions decreases and the formation rate of OCP crystals decreases during formation of OCP crystals, calcium ions and phosphate ions can also be replenished to the mother liquor. When magnesium ions are present in the mother liquor, the magnesium ions inhibit the nucleation and growth of OCP.
  • the mother liquor does not contain any magnesium ion, but it is acceptable if it is 0.5 mM or less (preferably 0.1 mM or less, more preferably 0.01 mM or less).
  • the magnesium ion content of the mother liquor should be limited to the above-mentioned value or less until at least a predetermined amount (for example, a thickness of 1 ⁇ m or more) of the OCP crystal layer is formed. preferable.
  • the substrate to be immersed in the mother liquor is preferably placed on the bottom of the container containing the mother liquor.
  • the immersion time is not limited, but depending on the thickness of the required OCP crystal layer, 1 minute, 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 6 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 5 days It can be set appropriately as in the range of about 0.5 hours to 30 days, such as 10 days.
  • the mother liquor at the time of forming the OCP crystal layer on the surface of the ⁇ -TCP base material has a pH of 5.5 to 8.0 or less, preferably pH 6.0 to 7.6, more preferably pH 6.2 to 7.
  • the mother liquor temperature can be from 0 to 60 ° C. (preferably 10 to 50 ° C., more preferably 20 to 40 ° C.). Therefore, if the mother liquor temperature is set in the range of 20 to 40 ° C., in combination with the above-mentioned numerical value of pH, ⁇ -TCP can be obtained under the condition (that is, pseudo physiological environment) acceptable to living bodies such as the human body. It can be said that a composite including a substrate and an OCP crystal layer formed on the surface of the substrate can be easily and efficiently produced.
  • the composite of the present invention comprises a base material composed of ⁇ -TCP as a bone grafting (alternative) material and an OCP crystal layer having an excellent potential as an osteoinductive material, it can be used for treating damaged bones, etc.
  • Application to bone substitute materials, scaffold materials for inducing new bone, etc. is conceivable.
  • the composite of the present invention having a modulation portion in such an OCP crystal layer and capable of adjusting the width and width of the modulation portion, the above-mentioned It is expected to make more effective use for
  • ⁇ -TCP substrate >> ⁇ 1.1
  • a reagent-grade ⁇ -TCP crystal powder (Wako, consisting of crystal particles with a particle size distribution of about 0.5 to 3 ⁇ m), which can be purchased generally, is used for the preparation of the substrate, and -Two types of ⁇ -TCP substrates of “nano-substrate” were prepared using the ⁇ -TCP crystal powder of nanoparticles obtained by pulverizing the TCP crystal powder.
  • ⁇ -TCP crystal powder About 10 mg of as-received ⁇ -TCP crystal powder was placed in a mold, and the micro substrate was compression molded at a pressure of 40 MPa for 30 minutes at room temperature to obtain a substrate with a plane of 2 ⁇ 10 mm and a thickness of about 0.3 mm.
  • the purchased ⁇ -TCP crystal powder is dispersed in a 99.5% ethanol solution (Wako, analytical grade), and it is made by using a bead mill (AIMEX) having zirconia beads with a diameter of 30 ⁇ m.
  • the stock K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 solution was diluted with milli-Q water to make a phosphate solution containing 5.0 mM phosphate ion.
  • the phosphoric acid solution was adjusted to pH 6.3 at 25 ⁇ 0.1 ° C. using stock CH 3 COOH and CH 3 COONa ⁇ 2H 2 O solutions.
  • the acetate ion concentration at this time is 50 mM.
  • a 1.0 M CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O solution was added to the pH-adjusted phosphoric acid solution at a volume ratio of 1: 199 to finally make a standard calcium phosphate solution.
  • the final calcium ion and phosphate ion concentrations in this calcium phosphate solution are 5.0 mM and 4.9 mM, respectively (1.02 in Ca / P molar ratio).
  • the pH of the standard calcium phosphate solution is 6.20 ⁇ 0.01.
  • the standard calcium phosphate solution is adjusted to pH 5.5 with 50 mM sodium acetate-acetic acid and pH 7.4 with 50 mM trisaminomethane, and the composition change with the change of calcium ion concentration and phosphate ion concentration It was a solution.
  • Substrate immersion process Fifty mL of a standard or modified calcium phosphate solution was placed in a Pyrex® beaker and allowed to preheat at 37 ⁇ 0.5 ° C. Place the ⁇ -TCP substrate cut into 2 ⁇ 2 ⁇ 0.3 mm at the bottom of the beaker and after double capping with PARAFILM® to prevent evaporation of the solution, 37 ⁇ 0. It was kept without stirring in an incubator at 5 ° C. The immersion time is 1 minute to 20 hours. After immersion for the set time, the growth sample was removed from the solution and immediately washed with milliQ water. Thereafter, it was washed with 99.5% ethanol (Wako, analytical grade) and air dried.
  • ethanol 99.5% ethanol
  • SEM Scanning Electron Microscope
  • TEM Transmission Electron Microscope
  • FIGS. 1 a-j show the solution pH dependency of the substance formed on the substrate surface after immersion of the substrate for 20 hours, which was evaluated by surface SEM observation and XRD measurement.
  • the Ca / P molar ratio is constant at 1.02.
  • the calcium ion concentration in the solution depends on the pH of the solution. They are 7.5 mM at pH 5.5, 5.0 mM at 6.2, 1.2 mM at 7.4. These concentrations were set as the threshold concentrations where material growth occurs on the substrate but does not occur in the solution for at least 20 hours when the substrate is immersed in the solution.
  • This peak is a characteristic peak corresponding to the (020) diffraction of dibasic calcium phosphate dihydrate (CaHPO 4 .2H 2 O, DCPD). All peaks except 11.7 ° were also assigned to DCPD (FIG. 1c, upper curve). A peak corresponding to (020) of DCPD was also observed for the substance on the nanosubstrate after immersion (FIG. 1 c, lower curve). Peaks originating from the substrate were also observed, due to the low density of the precipitates on the substrate. From these results, it is concluded that the substance formed on the substrate at pH 5.5 is DCPD for both micro and nano substrates.
  • the substrate immersed in the standard calcium phosphate solution (pH 6.2) is covered with a polygonal plate-like material having a width of 10-20 ⁇ m regardless of the size of the substrate particles.
  • the size of the plate is slightly smaller for nano substrates (Fig. 1 d, e).
  • the thickness of the growth layer deposited on the microsubstrate was about 80 ⁇ m, and the thickness of the growth layer on the nanosubstrate was about 65 ⁇ m.
  • FIG. 1 g is a SEM image of the microsubstrate surface after immersion in a solution of pH 7.4. Calcium phosphate solutions modified for this pH are buffered with 50 mM trisaminomethane. The substrate surface is covered with a dense plate-like material several to 10 ⁇ m wide.
  • These results indicate that the growth material is OCP.
  • the degree of c-axis orientation is inferior to that at pH 6.2 because peaks other than (002) and (004) appear.
  • the form of the substance formed on the nanosubstrate was also plate-like as in the case of the microsubstrate.
  • the size of each plate is uneven compared to that on the microsubstrate (FIG. 1h).
  • the plate is an OCP crystal, and the c-axis orientation degree is determined from the intensity of the (002) peak. The case was better.
  • FIGS. 6a, b are low magnification TEM images (FIG. 6a) and SAED patterns at growth layer locations about 4.5 ⁇ m away from the substrate interface (measured around the upper left arrow in FIGS. 6b, 6a).
  • CR represents crystals
  • RE represents filled resin (see the elemental mapping image of FIG. 8).
  • Two interplanar spacings d were calculated from the SAED pattern. They were 1.870 nm and 0.550 nm, and the crossing angle in both directions was 81.0 °. These d values coincide with the surface separation of the (100) and (0-11) planes of the OCP crystal with an error range ( ⁇ 1%).
  • the theoretical value of the crossing angle of the [100] and [0-11] orientations of the OCP crystal is 81.0 °, which corresponds to the measured value. Therefore, the SAED pattern of FIG. 6 b is an image viewed from the crystal axis [011] direction. From the HR-TEM observation of the crystals, a plaid parallel to the extension direction was observed. The lattice spacing calculated from the FFT-transformed image is 1.86 nm, which approximately matches d (100) (FIG. 6c).
  • the SAED pattern (near the lower right-pointing arrow in FIG. 6d, FIG. 6a) in the initial growth region separated from the substrate interface by about 1.3 ⁇ m showed two d values. They were 1.655 nm (dashed line extending from lower left to upper right) and 0.560 nm (broken line extending from upper left to lower right), and the crossing angle in both directions was 90.3 °. Among the d values of ⁇ -TCP, OCP, and HAP, 1.655 nm is the only value corresponding to d (100) of OCP.
  • the HAP crystal When the HAP crystal is monoclinic, its d (010) takes a value close to 1.655 nm, but (010) diffraction does not appear due to the annihilation rule.
  • the measured d (100) is 11.2% smaller than the theoretical value. That is, the [100] direction is contracted, and the structure of the OCP is modulated. This contraction should of course affect the other d (hkl) . From the observed crossing angle, 0.560 nm seems to correspond to d ( -11-1 ) . However, the value is 2% larger than the theoretical value.
  • Figures 8a, b are elemental mapping of the grown layers by STEM-EDS, showing how they depend on the growth stage. From spectral analysis, in the late growth stage (area away from the interface of 5 ⁇ m or more, upper curve in FIG. 8e), the average Ca / P elemental% ratio is 1.42 ⁇ 0.02, and the stoichiometry ratio of OCP is 1. Greater than 33. The Ca / P ratio is 1.49 ⁇ 0.03 at the early growth stage (region within 2 ⁇ m from the interface, lower curve in FIG. 8 e) and is further increased.
  • FIGS. 10 a-f show the results of time-resolved SEM observation of the growth layer formation process on the nano substrate.
  • nanoparticles of 100 nm or less in size are deposited on the surface (FIG. 10 a). These particles fuse rapidly to form a tree root structure after 3-5 minutes ( Figure 10b, c). The root structure of the tree transforms into irregularly shaped plates after 10 minutes (Fig.
  • FIG. 11 a is a low magnification TEM image of a sample (made by FIB method) after immersion for 20 hours.
  • the growth layer is divided into three regions. They are a region consisting of bush-like needle-like substances directly above the substrate interface, a region consisting of irregularly shaped plates, and a region consisting of polygonal plates. The boundaries of each region are unclear, in particular the transition from irregularly shaped plates to polygonal plates is continuous.
  • Two high-resolution TEM images of the bush-like needles FIG. 11 b
  • two clear Debye rings from the SAED measurements in the 800 nm ⁇ region were observed (FIG. 11 c, top image).
  • the SAED measurement region contains nanoparticles derived from the substrate in addition to the bush-like needle-like substance
  • the distances from the centers of the two Debye rings were measured and found to be 0.345 nm and 0.281 nm.
  • the HAPs d (002) intensity 99.36%) and d (211) (intensity 52.34%) have an error range ( ⁇ 1%) of 0. It was found to be consistent with 345 nm and 0.281 nm.
  • the (211) diffraction appears as the highest intensity peak in the XRD pattern of HAP.
  • the obtained Debye ring is that of OCP
  • 0.345 nm coincides with the OCP d (121) within an error range.
  • 0.281 nm corresponds to many diffractions, which are (130), (6-2-1), (5-30) and so on.
  • (5-30) diffraction has a relative intensity of 100%, while (121) diffraction shows only an intensity of 20% or less. This suggests that the obtained SAED pattern corresponds to HAP but not to OCP.
  • HR-TEM observation of a bush-like needle-like substance was performed (FIG.
  • the SAED pattern is that of OCP
  • the pattern also corresponds to the ac plane viewed from the [010] direction.
  • the intersection angle of [100] and [001] calculated is 87.3 °, which is close to the measured value.
  • the 0.341 nm value agrees with the OCP d (002) with an error range ( ⁇ 1%).
  • 0.862 nm is 7.5% smaller than the OCP d (200) of 0.932 nm. From the HR-TEM observation on the irregularly shaped plate, a plaid having a spacing corresponding to about 1.7 nm, that is, approximately double of 0.862 nm was observed.
  • FIG. 12a The results of two-dimensional elemental mapping of the grown layer are shown in FIG. 12a.
  • the dashed squares and numbers superimposed on the calcium element mapping image indicate the measurement ranges for the bush-like needle-like area (1), the irregularly-shaped plate area (2), and the polygonal plate area (3), respectively.
  • the Ca / P elemental% ratio determined from the STEM-EDS spectrum (FIG. 12 b, first curve from the bottom) of the bush-like needle-like region is 1.66 ⁇ 0.02, which is close to the stoichiometric ratio of HAP . This result supports that the bush like needles are HAP.
  • Nanoscaling of the particles that make up the ⁇ -TCP substrate changes the material that forms on the substrate at the early growth stage from OCP to HAP. This is because the nano-scaling of the particles resulted in an increase of the free surface to the particle volume and the surface free energy of the nanoparticles was increased compared to that of the microparticles.
  • the surface energy of HAP is larger than that of OCP or ⁇ -TCP, and the difference between OCP and ⁇ -TCP is relatively small. Therefore, it is natural for the OCP to form on the ⁇ -TCP substrate.
  • thermodynamic effect overcomes the surface energy barrier required for nucleation, Instead of OCP, HAP is nucleated on the substrate.
  • OCP organic radical
  • HAP is nucleated on the substrate.
  • the question here is why the HAP formed on the surface of the nanosubstrate does not grow as it is, but the OCP grows later. This seems to be contradictory to the phenomenon in which OCP usually appears earlier than HAP and eventually transitions to HAP. As an interpretation of this phenomenon, the inventor speculates that the kinetic effect contributes more than the thermodynamic effect with respect to the growth of OCP and HAP.
  • the growth rate of HAP in the c-axis direction under the conditions of this research is estimated to be several tens of nm / h or less (see Non-Patent Document 4).
  • the growth rate of OCP in the c-axis direction is 500 nm / h-1 ⁇ m / h or more according to this observation.
  • the growth rate of OCP is at least an order of magnitude greater than the growth rate of HAP, so it is possible for OCP to develop as the main phase even if it appears late for HAP. This growth mode is not unique to the present ⁇ -TCP substrate.
  • Non-Patent Document 5 In our previous studies (see Non-Patent Document 5) in which HAP nanorod structures were constructed on an ACP nanoparticle substrate, HAP grew in the presence of fluorine in the solution, and OCP grew in the absence of fluorine. In this process, after initially growing the HAP nanorods in the fluorine-containing solution for about 30 minutes, the sample was transferred to the non-fluorine-containing solution to form an OCP layer on the HAP nanorods after 20 hours (FIG. 15). Under certain conditions, OCP may appear after HAP nucleation and develop as a major phase.
  • the structure of the OCP in the a-axis direction consists of the repetition of HAP-like layer-transition layer-HPO 4 -H 2 O layer-transition layer-HAP-like layer. It is known that molecules having a carboxyl group such as acetic acid and succinic acid are incorporated into the HPO 4 -H 2 O layer to extend d (100) . On the other hand, contraction of d (100) due to the loss of water molecules in the HPO 4 -H 2 O layer occurs when the OCP is heated to 150 ° C. or higher.
  • An oriented OCP crystal layer can be formed on a ⁇ -TCP substrate under a wide range of solution pH / body temperature conditions.
  • (2) Modulation of the OCP crystal structure and chemical composition due to HPO 4 -H 2 O layer defects may occur without crystal heating or additives into the solution. This modulation is promoted by the nano formation of the substrate particles.
  • (3) Modulation in the structure and chemical composition of OCP crystals has a major impact when using OCP as a bone graft (alternative) material. Therefore, simple control of these modulations is useful.
  • a composite including a base material composed of ⁇ -TCP as a bone grafting (alternative) material and an OCP crystal layer having an excellent potential as an osteoinductive material is permitted to living organisms such as the human body. Because it can be easily formed or manufactured under possible conditions or simulated physiological environment, it can be applied to treatment of damaged bones, application to bone substitutes for grafting, scaffolds for inducing new bones, etc., production of those materials, etc. The use of is expected.
  • the OCP crystal layer according to the invention has a modulation part which is known to promote new bone formation, and the width of the modulation part can also be adjusted by the particle size of the ⁇ -TCP crystal particles Therefore, more effective utilization for the application and the like is expected.

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Abstract

本発明は、β－リン酸三カルシウム(β－ＴＣＰ)基材とリン酸八カルシウム(ＯＣＰ)結晶層を含む複合体やその製造方法を提供することを課題とするもので、該複合体は、β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材と、該β－ＴＣＰ基材の表面上のＯＣＰ結晶層を含む。該複合体の製造方法は、β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなる基材の表面の少なくとも一部を、カルシウムイオン及びリン酸イオンを含有し、マグネシウムイオン含有量が０.５ｍＭ以下である母液に浸漬する工程を具備する。

Description

β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層を含む複合体及びその製造方法
　本発明は、β－リン酸三カルシウム(以下、「β－ＴＣＰ」ということがある。)基材とリン酸八カルシウム(以下、「ＯＣＰ」ということがある。)結晶層を含む複合体や、該複合体の製造方法に関するものである。
　リン酸八カルシウム(Ｃａ８(ＨＰＯ４)２(ＰＯ４)４・５Ｈ２Ｏ；ＯＣＰ)は、その優れた骨誘導性能が非特許文献１により示されて以来、体中におけるＯＣＰの反応性に関する研究が盛んに行われ、骨誘導材料としての優れたポテンシャルが明らかになった。ＯＣＰは体中において複数の骨形成サイトの中核として働き、それ故、水酸アパタイト(Ｃａ１０(ＰＯ４)６(ＯＨ)２；以下、「ＨＡＰ」ということがある。)あるいはβ－リン酸三カルシウム(β－Ｃａ３(ＰＯ４)２；β－ＴＣＰ)に比べて新生骨への置換をより加速しやすい。実際の治療現場でも、ＯＣＰは移植用骨代替材料、(新生骨誘導用)微小足場、コーティング用材料として利用されている。ＯＣＰをチタン基板上にコーティングする研究は特に精力的に行われているが、これはチタンの持つ骨誘導性能を向上させるためである。体中でＯＣＰを用いる際の問題点の一つは、ＯＣＰを形成する系中に添加物を加える、あるいは他のリン酸カルシウム(例えばＤＣＰＤ)からの加水分解反応なしに、大きな成形体を構築できない点であろう。
　一方でβ－ＴＣＰは、古くから骨移植(代替)材料として用いられてきた。これは、整形外科臨床現場においてしばしば見られる、自発的骨再生能力の減少問題などに対処するためである。β－ＴＣＰの単独使用だけではなく、ＨＡＰや有機物と併用して(骨誘導用)３次元足場材料として用いるケースに関しても、研究が行われている。このような研究は、新生骨誘導用材料に要求される優れた生体適合性と体中における分解性の高さを、β－ＴＣＰが本来有しているためである。また、確立されたβ－ＴＣＰ合成手法も有利な点と言える。β－ＴＣＰ粒子のサイズをマイクロメートルサイズからナノメートルサイズに減少させると、生体適合性と分解性が向上するとの報告もある。
　ＯＣＰとβ－ＴＣＰに関する上記の研究状況は、優れた性質を持ち容易に作成可能な骨移植(代替)材料開発の観点から考えた場合、必然的に一つの考えを導く。すなわち、β－ＴＣＰ基板上にＯＣＰ層をコーティングした材料である。しかし、ＯＣＰとβ－ＴＣＰの併用に関しては、ほとんど研究が行われていない。３０年以上前に、Ｃａ／Ｐ比を１.３３(ＯＣＰの化学量論比)に保持したｐＨ６.０のリン酸カルシウム溶液中にβ－ＴＣＰ粉末を投入すると、ＯＣＰが形成するという予備的研究成果が報告された(非特許文献２参照；注：ＯＣＰ形成の直接的証拠(Ｘ線回折パターンなど)は示されていない)。今世紀に入ると、合成ＨＡＰとβ－ＴＣＰを混合した基板がin vitro人工体液(以下、「ＳＢＦ」)中で表面にＯＣＰ形成を誘導する結果が報告された(非特許文献３参照)。しかし引き続いて行われた研究では、β－ＴＣＰを単独で基板化した場合、in vitro ＳＢＦ中でもウサギの筋肉中でも基板上にＯＣＰは形成されず、α－ＴＣＰが示したＯＣＰあるいはＨＡＰの誘導能と明確な差が見られるとの報告がなされた。この研究では、ＳＢＦ中にβ－ＴＣＰを５日間浸漬してもＯＣＰは形成されなかった(非特許文献４参照)。
O. Suzuki, M. Nakamura, Y. Miyasaka, M. Kagayama, M. Sakurai, Bone formation on synthetic precursors of hydroxyapatite, Tohoku J. Exp. Med. 164 (1) (1991) 37-50. J.C. Heughebaert , S.J. Zawacki, G.H. Nancollas, The growth of octacalcium phosphate on beta tricalcium phosphate, J. Cryst. Growth 63 (1) (1983) 83-90. Y. Leng, J. Chen, S. Qu, TEM study of octacalcium phosphate precipitate on HA/TCP ceramics, Biomaterials 24 (13) (2003) 2125-2131. R. Xin, Y. Leng, J. Chen, Q. Zhang, A comparative study of calcium phosphate formation on bioceramics in vitro and in vivo, Biomaterials 26 (33) (2005) 6477-6486. K. Onuma, N. Kanzaki, A. Ito, T. Tateishi, Growth kinetics of hydroxyapatite (0001) face revealed by phase shift interferometry and atomic force microscopy, J. Phys. Chem. B 102 (40) (1998) 7833-7838. K. Onuma, M. Iijima, Artificial enamel induced by phase transformation of amorphous nanoparticles, Scientific Reports 7 (2017) DOI:10.1038/s41598-017-02949-w. N. Miyatake, K.N. Kishimoto, T. Anada, H. Imaizumi, E. Itoi, O. Suzuki, Effect of partial hydrolysis of octacalcium phosphate on its osteoconductive characteristics, Biomaterials 30(2009)1005-1014.
　上述のように、過去の研究では、β－ＴＣＰ基板上へのＯＣＰ形成が可能か否かに関する結論が得られていなかった。加えて、β－ＴＣＰ基板を構成する粒子のサイズがＯＣＰ形成にどのような影響を及ぼすかの研究は全く行われていなかった。
　本発明は、上述のような過去の研究を背景としてなされたものであり、β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層を含む複合体やその製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、前記課題のもとで、β－ＴＣＰ基材の表面上にＯＣＰ結晶層を、擬似生理環境場で構築する研究を進め、後記＜実施例等についての考察＞などにおいて述べたような様々な知見を得た。
　本発明は、そのような知見に基づいて完成したものであり、本件では、以下に記載のような発明が提供される。
＜１＞β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材の表面の少なくとも一部を、カルシウムイオン及びリン酸イオンを含有し、マグネシウムイオン含有量が０.５ｍＭ以下である母液に浸漬する工程を備える、β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層を含む複合体の製造方法。
＜２＞β－ＴＣＰ結晶粒子をマイクロメートルサイズのものとし、β－ＴＣＰ基材の表面に直接ＯＣＰ結晶を形成する＜１＞に記載の複合体の製造方法。
＜３＞前記β－ＴＣＰ結晶粒子をナノメートルサイズのものとし、β－ＴＣＰ基材表面にＨＡＰ結晶層と、該ＨＡＰ結晶層上にＯＣＰ結晶層を形成する＜１＞に記載の複合体の製造方法。
＜４＞前記母液は、カルシウムイオン濃度が０.２～５ｍＭ、リン酸イオン濃度が０.２～５ｍＭの水溶液である＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
＜５＞前記母液は、マグネシウムイオン含有量が０.１ｍＭ以下である＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
＜６＞前記母液はｐＨが５.５を超え８.０以下である＜４＞に記載の複合体の製造方法。
＜７＞前記母液の温度が０～６０℃である＜４＞に記載の複合体の製造方法。
＜８＞β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材と、該β－ＴＣＰ基材の表面上のＯＣＰ結晶層を含む複合体。
＜９＞前記β－ＴＣＰ結晶粒子がナノメートルサイズであり、β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層との間にＨＡＰ結晶層を含む＜８＞に記載の複合体。
＜１０＞前記β－ＴＣＰ結晶粒子がマイクロメートルサイズであり、ＯＣＰ結晶層がβ－ＴＣＰ基板の表面上に直接存在するものである＜８＞に記載の複合体。
＜１１＞前記ＯＣＰ層は、その結晶構造及び／又は化学組成が変調した部分を含むものである＜８＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の複合体。
　本発明は、次のような態様を含むことができる。
＜１２＞前記母液は、カルシウムイオン濃度が１～４ｍＭ、リン酸イオン濃度が１～４ｍＭである＜４＞に記載の複合体の製造方法。
＜１３＞前記母液は、マグネシウムイオン含有量が０.０１ｍＭ以下である＜５＞に記載の複合体の製造方法。
＜１４＞前記母液はｐＨが６.０以上７.８以下である＜６＞に記載の複合体の製造方法。
＜１５＞母液の温度が２０～４０℃である＜７＞に記載の複合体の製造方法。
＜１６＞＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の複合体の製造方法において、β－ＴＣＰ結晶粒子を圧縮成形することにより前記β－ＴＣＰ基材を調製することを含む複合体の製造方法。
＜１７＞前記圧縮成形時の圧縮圧力が１ＭＰａ以上である＜１６＞に記載の複合体の製造方法。
＜１８＞前記β－ＴＣＰ基材が基板である＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
　本発明によれば、β－ＴＣＰ基材層とＯＣＰ結晶層を含む複合体を製造することができる。
粒子サイズが異なる２種類のβ－ＴＣＰ基板をｐＨが異なる３種類のリン酸カルシウム溶液に２０時間浸漬した後のそれぞれの基板上に形成された成長物質のＳＥＭ観察像((ａ)～(ｈ))及びＸＲＤパターン測定結果((ｃ)～(ｉ))を示す図面。(ａ)～(ｃ)はｐＨ５.５溶液を用いた場合、(ｄ)～(ｆ)はｐＨ６.２溶液を用いた場合、(ｇ)～(ｉ)はｐＨ７.４溶液を用いた場合をそれぞれ示す。また、(ａ)、(ｄ)、(ｇ)のＳＥＭ観察像、及び、(ｃ)、(ｆ)、(ｉ)の上側カーブは、マイクロ基板を用いた場合を、(ｂ)、(ｅ)、(ｈ)のＳＥＭ観察像、及び、(ｃ)、(ｆ)、(ｉ)の下側カーブは、ナノ基板を用いた場合をそれぞれ示す。 粒子サイズが異なる２種類のβ－ＴＣＰ基板(上側カーブがマイクロ基板、下側カーブがナノ基板)をｐＨが異なる２種類のリン酸カルシウム溶液に２０時間浸漬した後のそれぞれの基板上に形成された成長物質の薄膜ＸＲＤ測定結果を示す図面。（ａ）ｐＨ６.２、（ｂ）ｐＨ７.４。 マグネシウム含有及び非含有ＳＢＦ中に２０時間浸漬後のβ－ＴＣＰマイクロ基板上に成長する物質のＳＥＭ観察像。（ａ）マグネシウム非含有ＳＢＦ。基板上にＯＣＰ板状結晶が形成する。（ｂ）１.５ｍＭマグネシウム含有ＳＢＦ。基板上には微細板からなる少量の塊が形成する。 標準リン酸カルシウム溶液に浸漬したβ－ＴＣＰマイクロ基板上での物質成長過程の時間分割ＳＥＭ観察像。（ａ）浸漬１分後。白矢印で示した塊が基板表面に析出。（ｂ）浸漬３分後。（ｃ）浸漬１０分後。塊中の板が成長し互いに融合する。（ｄ）浸漬２０分後。不規則なエッジを持つ板が表面の大部分を覆っている。（ｅ）浸漬４０分後。（ｆ）浸漬１時間後。多角形板状のＯＣＰが表面を覆う。 平板結晶の伸長方向に平行な格子縞が基板のマイクロ結晶に直接結合している図。この格子縞パターンはＯＣＰ結晶に特有のものであり、方位は［１００］に相当する。図中の左上に挿入したイメージはＨＲ－ＴＥＭ図に対するＦＦＴ(高速フーリエ変換)パターンであり、この図から格子縞の平均間隔が１.６７ｎｍであることがわかる。 標準リン酸カルシウム溶液に２０時間浸漬後のβ－ＴＣＰマイクロ基板上に成長した物質のＴＥＭ観察像及びＳＡＥＤ測定結果を示す図面。（ａ）ＦＩＢ法を用いて作成したサンプルの低倍率ＴＥＭ像。白破線は基板と成長層の界面を示す。ＣＲ及びＲＥは、それぞれ結晶と充填樹脂を意味する。（ｂ）(ａ)の上方左向き矢印付近で測定した成長層のＳＡＥＤパターン。測定領域は８００ｎｍφ。パターンは［０１１］方向から観察した理想的なＯＣＰに対応する。（ｃ）(ｂ)で観察した板に対するＨＲ－ＴＥＭ像、及びそのＦＦＴパターン(右上にスーパーインポーズ)。ＯＣＰのｄ(１００)に相当する格子縞間隔が観察された。（ｄ）(ａ)の下方右向き矢印付近で測定した成長板のＳＡＥＤパターン。測定領域は２００ｎｍφ。左下から右上に伸びる破線及び左上から右下に伸びる破線は、それぞれＯＣＰの(１００)及び(１１－２)方位に相当する。しかし、面間隔ｄは、理想的なＯＣＰのそれと一致しない。 (１００) 面に平行な方向から見た実測及びシミュレーションＳＡＥＤパターンのサンプル回転角度依存性の調査結果を示す図面。（ａ）観察されたＳＡＥＤパターン群と各ＳＡＥＤパターン間の為す回転角度。サンプル回転は(１００)面に垂直な軸の回りに行った。各ＳＡＥＤ像は、［１００］方位が水平になるように傾斜させてある。（ｂ）サンプルを仮想的に［０１０］から［０－１０］まで回転させた際に出現する低指数晶体軸。破線四角枠により囲まれた晶体軸と軸間回転角度の組み合わせは、実測値に近い角度値を示すもの。（ｃ）(ｂ)における破線四角枠内の４つの晶体軸方向から見たシミュレーションＳＡＥＤパターン。 β－ＴＣＰマイクロ基板上の成長層に対するＳＴＥＭ－ＥＤＳ分析結果を示す図面。(ａ)ＦＩＢ法により準備されたサンプルの低倍率ＴＥＭ像。上方及び下方の四角形は測定領域を示す。(ｂ)カルシウム原子の二次元分布マッピング。(ｃ)リン原子の二次元分布マッピング。(ｄ)炭素原子の二次元分布マッピング。(ｅ)成長後期(Ｃａ／Ｐ＝１.４２±０.０２の上側カーブ、(ａ)における上方四角形エリアに対応)及び成長初期(Ｃａ／Ｐ＝１.４９±０.０３の下側カーブ、(ａ)における下方四角形エリアに対応)に対応する領域のＳＴＥＭ－ＥＤＳスペクトル。モリブデンはＴＥＭグリッドのメッシュに由来する。ガリウム及びタングステンは、それぞれイオン源とサンプル作成時の試料キャップに由来し、サンプル調整時にサンプル内空隙に再析出したものである。アルミニウムは、装置特有の由来物質である。 基板界面から約７０μ離れた領域でのＯＣＰ結晶群に対するＳＴＥＭ－ＥＤＳ分析結果を示す図面。(ａ)ＯＣＰ結晶の低倍率ＴＥＭ像(ＳＴＥＭ－ＨＡＡＤＦモード)。四角領域が測定範囲。(ｂ)ＳＴＥＭ－ＥＤＳスペクトル。Ｃａ／Ｐ元素％比は１.３３±０.０１。(ｃ)異なる５つの結晶に対して行った分析結果のまとめ。平均Ｃａ／Ｐ比は１.３５±０.０２。 標準リン酸カルシウム溶液に浸漬したβ－ＴＣＰナノ基板上での物質成長過程の時間分割ＳＥＭ観察像を示す図面。(ａ)浸漬１分後。ナノ粒子が表面に析出する。(ｂ)浸漬３分後。木の根構造が出現する。(ｃ)浸漬５分後。(ｄ)浸漬１０分後。不規則形状板が形成する。(ｅ)浸漬４０分後。(ｆ)浸漬１時間後。多角形板状のＯＣＰが表面を覆う。 標準リン酸カルシウム溶液に２０時間浸漬後のβ－ＴＣＰナノ基板上に成長した物質のＴＥＭ観察像及びＳＡＥＤ測定結果を示す図面。（ａ）ＦＩＢ法を用いて作成したサンプルの低倍率ＴＥＭ像。３つの横方向の破線は、それぞれの界面を示す。（ｂ）ブッシュ様針状物質の高倍率ＴＥＭ像。大小二重の円は、それぞれ８００ｎｍφと２００ｎｍφのＳＡＥＤ測定領域を示す。（ｃ）(ｂ)の大円領域(上)と小円領域(下)に対応するＤｅｂｙｅリング。（ｄ）ブッシュ様針状物質の格子像(左)と、そのＦＦＴパターン(右)。ＦＦＴパターンに挿入した２つの矢印は、０.８１３ｎｍと０.６８２ｎｍに対応する。格子像はＨＡＰのａｃ面に相当するものである。（ｅ）不規則形状板のＳＡＥＤパターン。（ｆ）不規則形状板のＨＲ－ＴＥＭ像。（ｇ）多角形板のＳＡＥＤパターン。不規則形状板、及び多角形板の両者ともＯＣＰ結晶であるが、ｄ(１００)は変調を受けている。 標準リン酸カルシウム溶液にβ－ＴＣＰナノ基板を２０時間浸漬した後の成長層に関するＳＴＥＭ－ＥＤＳ分析結果を示す図面。（ａ）低倍率ＴＥＭ像(左)、及びカルシウム、リン、炭素の二次元マッピングイメージ。(ａ)における四角は元素マッピング領域を示す。カルシウムマッピング像に記載された１，２，３番の番号が付された破線の四角は、ＥＤＳ分析した成長層の３つの代表的な領域(ブッシュ様針状領域、不規則形状板領域、多角形板領域)に対応する。（ｂ）ブッシュ様針状物質(下から３番目のカーブ)、不規則形状板(下から２番目のカーブ)、多角形板(下から１番目のカーブ)のＳＴＥＭ－ＥＤＳスペクトル。下から４番目のカーブは、基板界面から約４０μｍ離れた領域での多角形板に対応するスペクトル。サンプルは(ａ)とは別である。 基板界面から遠く離れた領域での多角形板状ＯＣＰに対するＴＥＭ観察像とＳＡＥＤ測定結果を示す図面。（ａ）界面から約４０μｍ離れた位置での板に対するＴＥＭ観察像。白の円はＳＡＥＤ測定を行なった領域を示す。（ｂ）［０１０］方位から見たＯＣＰに対応するＳＡＥＤパターン。この領域では変調構造は解消している。 ｐＨ６.２のリン酸カルシウム溶液に基板を２０時間浸漬後のサンプルの断面ＳＥＭ像。（ａ）Ｃａ／Ｐ＝１.３３の溶液中において、マイクロ基板上に成長したＯＣＰ層。（ｂ）Ｃａ／Ｐ＝１.６７の溶液中において、マイクロ基板上に成長したＯＣＰ層。（ｃ）Ｃａ／Ｐ＝１.３３の溶液中において、ナノ基板上に成長したＯＣＰ層。（ｄ）Ｃａ／Ｐ＝１.６７の溶液中において、ナノ基板上に成長したＯＣＰ層。(ａ)、(ｂ)中の破線は基板と成長層の境界を示す。(ｃ)、(ｄ)中の下から１番目、２番目、３番目の破線はそれぞれ基板とブッシュ様針状物質領域との境界、ブッシュ様針状領域と不規則形状板領域との境界、不規則形状板領域と多角形板領域との境界を示す。 ｐＨ６.２のリン酸カルシウム溶液にＡＣＰ基板を浸漬した後の断面ＳＥＭ像。（ａ）浸漬後のＡＣＰ基板の断面ＳＥＭ像。基板は初めに３.９６ｍＭ　Ｃａ２＋，３.９４ｍＭ　ＰＯ４ ３－，０.５２６ｍＭ(１０ｐｐｍ)　Ｆ－溶液に３０分間浸漬し、その後フッ素を含まない溶液に約２０時間浸漬した。（ｂ）(ａ)の拡大像。（ｃ）３０分間浸漬後の表面像。ＨＡＰナノロッド構造が表面に形成している。このサンプルは(ａ)，(ｂ)，(ｄ)のサンプルとは異なる。（ｄ）基板を約２０時間浸漬した後の表面像。表面はＯＣＰの板に覆われている。
　以下、本発明を実施するための形態を説明する。
　なお、本明細書において数値範囲を示す「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味として使用される。
　本明細書で使用する主な略号とその意味は、次のとおりである。
ＡＣＰ(amorphous calcium phosphate)：アモルファスリン酸カルシウム
ＣＲ(crystal)：結晶
ＤＣＰＤ(dicalcium phosphate dihydrate)：第二リン酸カルシウム二水塩(ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ)
ＦＦＴ(Fast Fourier Transform)：高速フーリエ変換
ＦＩＢ(focused-ion-beam)：収束イオンビーム
ＨＡＰ(hydroxyapatite)：水酸アパタイト(Ｃａ１０(ＰＯ４)６(ＯＨ)２)
ＨＲ－ＴＥＭ(High-resolution TEM)：高分解能透過型電子顕微鏡
ＯＣＰ(octacalcium phosphate)：リン酸八カルシウム(Ｃａ８(ＨＰＯ４)２(ＰＯ４)４・５Ｈ２Ｏ)
ＲＥ(resin)：樹脂
ＳＡＥＤ(selected area electron diffraction)：選択領域電子線回折
ＳＢＦ(simulated body fluid)：人工体液
ＳＥＭ(scanning electron microscope)：走査電子顕微鏡
ＳＴＥＭ－ＥＤＳ(Scanning-TEM energy dispersion spectroscopy)：走査透過電子顕微鏡エネルギー分散分光分析
ＳＴＥＭ－ＨＡＡＤＦ(Scanning-TEM high-angle annular dark field)：走査透過電子顕微鏡高角度環状暗視野場観察
ＴＣＰ(Tricalcium phosphate)：リン酸三カルシウム(Ｃａ３(ＰＯ４)２)
ＴＥＭ(transmission electron microscope)：透過電子顕微鏡
Ｘ－ＥＤＳ(X-ray energy-dispersive spectrometry)：Ｘ線分光分析法
ＸＲＤ(X-ray diffraction)：Ｘ線回折
β－ＴＣＰ：β－リン酸三カルシウム(β－Ｃａ３(ＰＯ４)２)
　本発明の複合体は、β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材と、該基材表面上に形成されたＯＣＰ結晶層を含む。本発明の複合体は、β－ＴＣＰの結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材の表面の少なくとも一部をカルシウムイオン及びリン酸イオンを含有し、マグネシウムイオンを実質的に含有しない母液に浸漬することにより製造することができる。
　基材に用いるβ－ＴＣＰ結晶粒子は、後記実施例等において詳述するように、その粒径サイズにより前記複合体の構造や前記ＯＣＰ結晶層の構造が変化することも明らかとなった。
　すなわち、前記β－ＴＣＰ結晶粒子がマイクロメートルサイズである場合、β－ＴＣＰ基材の表面に直接ＯＣＰ結晶が形成される。一方、前記β－ＴＣＰ結晶粒子がナノメートルサイズである場合、β－ＴＣＰ基材の表面にまずＨＡＰ結晶層が形成され、ＨＡＰ結晶層上にＯＣＰ結晶が形成される。そのため、前記β－ＴＣＰ結晶粒子がナノメートルサイズである場合、複合体は、β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層の間にＨＡＰ層を含む。
　また、β－ＴＣＰ基材の表面上に形成される前記ＯＣＰ結晶層は初期段階で結晶構造や化学組成が変調し、その成長に伴って正常なＯＣＰへと変化することが明らかとなった。
　さらに、その変調部分は、ナノメートルサイズのβ－ＴＣＰ結晶粒子を用いた場合には、マイクロメートルサイズのものを用いた場合よりも広い領域となること、したがって、β－ＴＣＰ結晶粒子の粒子サイズを調整することにより、前記変調部分の領域の広狭を調整できることも明らかとなった。
　なお、ＯＣＰ結晶は、［１００］及び［０－１１］方位の交差角の理論値が８１.０°、Ｃａ／Ｐ元素％比の理論値が１.３３であるが、前記変調部分は、それらの一方又は両方が外れた領域であり、結晶構造の変調部分は、前記交差角の理論値が８１.０°超(明確な結晶構造の変調部分としては、８３～９２°、より明確には８５～９２°)の部分として、また、化学組成の変調部分は、前記Ｃａ／Ｐ元素％比の理論値１.３３超(明確な化学組成の変調部分としては、１.３５～１.６６、より明確には１.４０～１.６６)の部分として、それぞれ確認することができる。
　本発明において、「マイクロメートルサイズ」とは、ＳＥＭ等で観察した粒径〔＝(長径＋短径)／２〕の平均値が０.５μｍ以上のものを意味する。上限は限定する必要はないが、通常は２０～３０μｍである。
　本発明において、「ナノメートルサイズ」とはＳＥＭ等で観察した粒径〔＝(長径＋短径)／２〕の平均値が０.５μｍ未満のものを意味する。好ましくは１００ｎｍ以下である。下限は限定する必要はないが、通常は１～５ｎｍである。
　β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなる基材は、β－ＴＣＰの結晶粒子を圧縮成形することにより調製することができる。基材は、どのような形状でも良く、例えば、球状粒子、一部に曲面を有する基体などでも良いが、少なくとも一部の表面を平坦に形成し、平坦な表面の少なくとも一部を母液に浸漬するようにすることもできる。母液に浸漬する平坦な表面は、例えば、ＪＩＳＢ０６２１で規定される平面度(幾何学的に正しい平面からの狂いの大きさ)が２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下などや、ＪＩＳＢ０６０１で規定される二乗平均平方根粗さＲｑが２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下などのように設定することもできる。その場合、平面度は、フラットネステスタ等の公知の手段により測定することができる。
　基材として基板を用いる場合、基板の両面を平坦に形成しても良いし、一方の面の全面や一部を平坦に形成しても良い。
　圧縮成形時の温度は、結晶が溶解あるいは分解しない範囲内であれば許容される。好ましくは常温である。
　圧縮成形時の圧縮の圧力は、β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなる基材が成形できる範囲内であれば許容される。通常、１ＭＰａ以上である。圧縮圧力の上限は限定する必要はないが、一般的には、使用する成形機械や型などにより、１００ＭＰａ、１５０ＭＰａ、２００ＭＰａ等のように許容上限を設定することもできる。
　基材は、母液に浸漬する表面以外をリン酸カルシウム溶液と反応せず且つその表面にリン酸カルシウム塩の析出を起こさない物質で被覆することもできる。そのような被覆の材料としては、限定するものではないが、樹脂や金属などが挙げられる。
　基材浸漬用の母液は、カルシウムイオンとリン酸イオンを含むものである。
　カルシウムイオンとリン酸イオンの濃度は、０.２ｍＭ以上、好ましくは、１ｍＭ以上である。濃度が０.２ｍＭ未満であると、ＯＣＰ結晶が形成しない、あるいは形成速度が遅くなる。一方、濃度が高いと、ＯＣＰ結晶の形成速度が速くなるが、濃度が高すぎると、基材浸漬中に均質核形成(析出)が生起しやすくなり、一定方向に配向したＯＣＰ結晶が得られにくくなる。基材浸漬中に均質核形成(析出)が生起しないカルシウムイオンとリン酸イオンの濃度の上限は、母液のｐＨや母液撹拌の有無などにも依存する。母液のｐＨが６.２程度の比較的低い場合には、濃度の上限は５ｍＭ程度(ｐＨが５.６程度に低い場合、濃度の上限は８ｍＭ程度)であるが、ｐＨが７.４程度と比較的に高い場合には、２ｍＭ以下程度まで下げる必要がある。また、母液を攪拌すると、均質核形成(析出)を生起しやすくなるが、ｐＨ６.２程度の場合には濃度が２ｍＭ以下であれば、ＯＣＰ結晶の形成速度を速めるために母液を攪拌することも許容される。ＯＣＰ結晶の形成中、カルシウムイオンとリン酸イオンの濃度が低下し、ＯＣＰ結晶の形成速度が低下する場合には、カルシウムイオンとリン酸イオンを母液に補充することもできる。
　母液中にマグネシウムイオンが存在する場合、マグネシウムイオンは、ＯＣＰの核形成や成長を阻害する。そのため、母液はマグネシウムイオンを全く含有しないことが最も望ましいが、０.５ｍＭ以下(好ましくは０.１ｍＭ以下、より好ましくは０.０１ｍＭ以下)であれば許容し得る。特にＯＣＰの核形成に及ぼす影響が大きいので、少なくともＯＣＰ結晶層が所定量以上(例えば厚さ１μｍ以上)形成されるまでは母液のマグネシウムイオン含有量を上記のような数値以下に制限することが好ましい。
　母液中に浸漬される基材は、好ましくは、母液を収容した容器の底に載置するのが好ましい。浸漬時間は限定するものではないが、必要なＯＣＰ結晶層の厚みに応じて、１分、１０分、３０分、１時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、５日、１０日等、０.５時間～３０日程度の範囲のように適宜に設定することができる。
　β－ＴＣＰ基材の表面上にＯＣＰ結晶層を形成する際の母液は、ｐＨが５.５超８.０以下、好ましくはｐＨ６.０～７.６、より好ましくはｐＨ６.２～７.４程度であるし、また、母液温度は０～６０℃(好ましくは１０～５０℃、より好ましくは２０～４０℃)において可能である。それ故、母液温度を２０～４０℃の範囲内に設定すれば、上記ｐＨの数値と併せて、人体等の生命体に許容可能な条件下(すなわち、擬似生理環境場)において、β－ＴＣＰ基材と該基材の表面上に形成されたＯＣＰ結晶層を含む複合体を簡易にかつ効率的に製造できると言える。
　本発明の複合体は、骨移植(代替)材料としてのβ－ＴＣＰからなる基材と、骨誘導材料として優れたポテンシャルを有するＯＣＰ結晶層とを含むので、損傷骨などの治療や、移植用骨代替材料、新生骨誘導用足場材料等への応用が考えられる。
　特に、ＯＣＰ結晶層のＣａ／Ｐモル比が１.３７程度(Ｃａ／Ｐモル比理論値１.３３より高い変調部分)である場合、新骨形成を促進することが知られているので(先行非特許文献７参照)、そのようなＯＣＰ結晶層における変調部分を有し、また、その変調部分の広狭を調整することが可能な本発明の複合体やその製造方法によれば、前述などの用途へのより有効な活用が期待される。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。本発明の内容はこの実施例に限定されるものではない。
＜＜１.　β－ＴＣＰ基板を用いたリン酸八カルシウム結晶層の形成＞＞
＜１.１　マイクロ基板とナノ基板の準備＞
　基板作成には一般購入できる試薬グレードのβ－ＴＣＰ結晶粉末(和光、粒径分布約０.５－３　μｍの結晶粒子からなるもの)を利用し、そのまま使用した「マイクロ基板」と、このβ－ＴＣＰ結晶粉末を粉砕して得たナノ粒子のβ－ＴＣＰ結晶粉末を使用した「ナノ基板」の２種類のβ－ＴＣＰ基板を準備した。
　マイクロ基板は、購入したままのβ－ＴＣＰ結晶粉末約１０ｍｇを型に入れ、４０ＭＰａの圧力下３０分間室温で圧縮成形し、平面が２×１０ｍｍ、厚みが約０.３ｍｍの基板とした。
　ナノ粒子のβ－ＴＣＰ結晶粉末については、購入したβ－ＴＣＰ結晶粉末を９９.５％エタノール溶液(和光、分析グレード)中に分散させ、直径３０μｍのジルコニア製ビーズを有するビーズミル(AIMEX社)により平均粒子径が数百ｎｍになるまで粉砕し、９９.５％エタノール中で、室温下３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、遠心後の溶液上部の上澄みを採取し、更に上澄液を４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、遠心後の最上部上澄みを回収し、室温で自然乾燥することにより得た。ナノ結晶粒子のサイズは、走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)やＴＥＭによる観察の結果、８０ｎｍ以下であることを確認した。
　ナノ基板については、上記で得たナノ結晶粒子を用い、圧力を２０ＭＰａ、加圧時間を１０分間とした以外は上記マイクロ基板と同様にして基板とした。
＜１.２　標準リン酸カルシウム溶液(ｐＨ６.２)、組成変更リン酸カルシウム溶液(ｐＨ５.５、７.４)の調製＞
　基板浸漬に用いる溶液は、全て分析グレードの試薬(ナカライ)から作成した。試薬をミリＱ水(超純水、比抵抗：１８.２ＭΩ、ＴＯＣ：３ｐｐｂ、ミリポア社)に溶解し、１.０Ｍ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０.５０Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４＋ＫＨ２ＰＯ４(モル比１：１で混合)、１.０Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＨ、０.１０Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ・２Ｈ２Ｏのストック溶液群を作成した。各溶液は、０.２２μｍポアの酢酸セルロースフィルターによりフィルタリングした。
　ストックＫ２ＨＰＯ４＋ＫＨ２ＰＯ４溶液をミリＱ水で希釈し、５.０ｍＭリン酸イオンを含んだリン酸溶液を作成した。このリン酸溶液を、ストックＣＨ３ＣＯＯＨ及びＣＨ３ＣＯＯＮａ・２Ｈ２Ｏ溶液を用いて、２５±０.１℃でｐＨ６.３に調整した。この時の酢酸イオン濃度は５０ｍＭである。１.０Ｍ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ溶液をｐＨ調整されたリン酸溶液に体積比１：１９９で加えて最終的に標準リン酸カルシウム溶液とした。このリン酸カルシウム溶液中の最終的なカルシウムイオン及びリン酸イオン濃度はそれぞれ５.０ｍＭ、４.９ｍＭである(Ｃａ／Ｐモル比で１.０２)。標準リン酸カルシウム溶液のｐＨは６.２０±０.０１である。
　また、標準リン酸カルシウム溶液を、５０ｍＭ　酢酸ナトリウム－酢酸を用いてｐＨ５.５に、５０ｍＭトリスアミノメタンを用いてｐＨ７.４に、それぞれ調整し、カルシウムイオン濃度及びリン酸イオン濃度の変更と共に組成変更リン酸カルシウム溶液とした。
＜１.３　基板浸漬過程＞
　５０ｍＬの標準又は組成変更リン酸カルシウム溶液をパイレックス(登録商標)ビーカーに入れ、３７±０.５℃で予備加熱しておいた。２×２×０.３ｍｍに切断したβ－ＴＣＰ基板をビーカーの底に設置し、溶液の蒸発を防ぐためパラフィルム〔PARAFILM(登録商標)〕で二重に蓋をした後、３７±０.５℃のインキュベータ中で攪拌なしに保持した。浸漬時間は１分から２０時間である。
　設定時間浸漬後、成長サンプルを溶液から取り出して直ちにミリＱ水で洗浄した。その後、９９.５％エタノール(和光、分析グレード)で洗浄し、自然乾燥した。
＜＜２.　成長サンプルの観察手段、計測手段＞＞
＜２.１　Ｘ線回折(ＸＲＤ)＞
　β－ＴＣＰ基板上に析出した物質の評価を粉末ＸＲＤ(RINT2000、リガク)及び薄膜ＸＲＤ(SmartLab、リガク)で行なった。粉末ＸＲＤ測定においては(単色ＣｕＫα線、４０ｋＶ、１００ｍＡ)、サンプルは走査速度毎分２°で２θ＝３－６０°の範囲で測定を行なった。薄膜ＸＲＤ測定においては(単色ＣｕＫα線、４５ｋＶ、２００ｍＡ)、サンプルは走査速度毎分０.１°で２θχ＝３－５０°の範囲で測定を行なった。ビーム入射角度はサンプル表面に対して０.２°である。
＜２.２　走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)＞
　サンプルの成長層表面、及び医療用メスでカットした成長層断面の形態を電界放射型ＳＥＭ(FE-SEM,JSM-7000F,JEOL)により観察した。観察時の加速電圧は５ｋＶである。サンプルは観察前に白金コーティングを行なった。コーティング層の厚みは約１５ｎｍである。
＜２.３　透過電子顕微鏡(ＴＥＭ)＞
　成長サンプルの観察には、分析ＴＥＭ(Tecnai Osiris, FEI)を加速電圧２００ｋＶで用いた。観察用薄片の作成は、ガリウムイオン源を用いて通常のＦＩＢ法により行なった(FB-2100，日立)。成長後のサンプルを光硬化型樹脂に埋没させ、固化後にサンプル表面に垂直に切断する。切断された約０.５ｍｍ厚のブロックを、加速電圧４０ｋＶでＦＩＢにより約１５０ｎｍまで薄膜化し、最終的に加速電圧１０ｋＶで約１００ｎｍにする。この薄膜を、モリブデンメッシュ製ＴＥＭグリッドに設置する。選択領域電子線回折(SAED)測定をＴＥＭ観察と同時に行い、観察物の同定を行った。ＳＡＥＤ測定における典型的な測定範囲は、２００あるいは８００ｎｍφである。
＜２.４　走査ＴＥＭエネルギー分散分光分析(ＳＴＥＭ－ＥＤＳ)＞
　高速二次元元素マッピング及び各元素の含有量に関する定量的分析を、ＴＥＭに装備されているＳｕｐｅｒ－Ｘ　ＥＤＳシステムにより行った。分析に用いたビーム径は約０.５ｎｍ、電流値は約０.５５ｎＡである。各分析位置にビームが滞留する時間は１０μｓである。分析は５分以内に完了する。各元素の含有率はスペクトルのエネルギー依存性から計算され、ピーク分離手法を用いて定量値に変換する。最終的な含有率に含まれるエラーは、ピーク分離時の計算誤差である。
＜＜３.　観察・計測結果＞＞
＜３.１　基板を標準リン酸カルシウム溶液及び組成変更リン酸カルシウム溶液に浸漬した場合の成長相の種類－溶液のｐＨ効果＞
　図１ａ－ｊは、基板を２０時間浸漬した後に基板表面に形成された物質の溶液ｐＨ依存性を、表面ＳＥＭ観察及びＸＲＤ測定により評価したものである。使用した全ての溶液において、Ｃａ／Ｐモル比は１.０２で一定である。溶液中のカルシウムイオン濃度は溶液のｐＨに依存する。それらは、ｐＨ５.５で７.５ｍＭ、６.２で５.０ｍＭ、７.４で１.２ｍＭである。これらの濃度は、基板を溶液中に浸漬した場合、基板上に物質の成長は起こるが溶液中には少なくとも２０時間析出が生じない閾値濃度として設定された。
　ｐＨ５.５の組成変更されたリン酸カルシウム溶液(５０ｍＭ酢酸ナトリウム－酢酸バッファー系)中に基板を浸漬した場合、β－ＴＣＰマイクロ基板上には少数の大きな板状結晶(幅１００μｍ以上、厚さ１０μｍ以上)が成長した(図１ａ、白矢印)。これに対して、β－ＴＣＰナノ基板は浸漬後、小さな板状結晶(幅１００μｍ以下)で覆われた(図１ｂ)。β－ＴＣＰマイクロ基板上の結晶をピンセットで剥離したのちＸＲＤ測定を行なった結果、２θ＝１１.７°に鋭く強度の高いピークが観察された。このピークは第二リン酸カルシウム二水塩(ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，ＤＣＰＤ)の(０２０)回折に相当する特徴的なピークである。１１.７°以外の全てのピークもＤＣＰＤに帰属された(図１ｃ、上側カーブ)。浸漬後のナノ基板上の物質に関してもＤＣＰＤの(０２０)に相当するピークが観察された(図１ｃ、下側カーブ)。基板に由来するピークも観察されたが、これは基板上の析出物の密度が低いためである。これらの結果から、ｐＨ５.５で基板上に形成される物質はマイクロ、ナノ両基板ともＤＣＰＤであると結論される。
　標準リン酸カルシウム溶液(ｐＨ６.２)に浸漬した基板は、基板粒子のサイズによらず１０－２０μｍ幅の多角形の板状物質に覆われている。ただし、板のサイズはナノ基板の方が若干小さい(図１ｄ，ｅ)。マイクロ基板上に析出した成長層の厚みは約８０μｍ、ナノ基板上の成長層の厚みは６５μｍ程度であった。浸漬後の両基板のＸＲＤ測定の結果、２θ＝２６.１及び５５.０°に鋭い高強度のピークが観察され、それら以外のピークの強度は非常に小さかった(図１ｆ)。これらの成長層に対する薄膜ＸＲＤ測定の結果、ＯＣＰ結晶の(１００)回折を示す２θ＝４.７°にピークが観察された(図２ａ)。従って、図１ｆにおける２６.１及び５５.０°のピークはＯＣＰ結晶の(００２)及び(００４)回折に相当する。薄膜ＸＲＤ測定における(１００)以外の全てのピークもＯＣＰに帰属されたため、標準リン酸カルシウム溶液中に浸漬した両基板上に形成した物質はｃ軸配向ＯＣＰである。
　図１ｇは、ｐＨ７.４の溶液に浸漬した後のマイクロ基板表面のＳＥＭ像である。このｐＨ用に組成変更されたリン酸カルシウム溶液は、５０ｍＭトリスアミノメタンによりバッファリングされている。基板表面は、数－１０μｍ幅の密集した板状物質に覆われている。ＸＲＤ測定の結果、ｐＨ６.２の場合と同様に２θ＝２６.１及び５５.０°にピークが観察され(図１ｉ、上側カーブ)、薄膜ＸＲＤ測定の結果からはＯＣＰ(１００)回折に相当する２θ＝４.７°にピークが観察された(図２ｂ、上側カーブ)。これらの結果は、成長物質がＯＣＰであることを示している。ｃ軸配向度は、(００２)及び(００４)以外のピークが出現していることからｐＨ６.２の場合より劣っている。
　ナノ基板上に形成した物質の形態も、マイクロ基板の場合と同様に板状であった。各板のサイズはマイクロ基板上のそれに比べて不均一である(図１ｈ)。ＸＲＤ(図１ｉ、下側カーブ)及び薄膜ＸＲＤ(図２ｂ、下側カーブ)測定の結果、板はＯＣＰ結晶であり、ｃ軸配向度は(００２)ピークの強度からわかるように、マイクロ基板の場合より優れていた。
　本発明者が行った実験から、幅広い溶液ｐＨ領域でβ－ＴＣＰ基板上にＯＣＰ結晶層が形成され得ることが明らかになった。過去の研究でＯＣＰ層が形成しなかった理由の一つは、溶液組成、特にマグネシウムの含有にあると思われる。５０ｍＭトリスアミノメタンでｐＨ７.４に調整した簡易ＳＢＦ(ＮａＣｌ　１４２ｍＭ，　Ｃａ２＋　２.５ｍＭ，　ＰＯ４ ３－　１ｍＭ)を準備し、β－ＴＣＰマイクロ基板を２０時間浸漬した場合、図１ｇに見られると同様の板状ＯＣＰ結晶が形成された(図３ａ)。しかし、この簡易ＳＢＦに１.５ｍＭのＭｇＣｌ２を加えると、基板表面には微小な板の集合からなる、少量の塊が形成されるのみであった(図３ｂ)。これらの塊は、ｐＨ６.２の標準リン酸カルシウム溶液に基板を浸漬した際、成長初期ステージに見られる塊状物質と酷似している(図４参照)。これらの実験結果から、マグネシウムは明らかにＯＣＰの核形成を阻害しているといえる。
　以下のセクションでは、ｐＨ６.２の標準リン酸カルシウム溶液に基板を浸漬した場合に特化して解析を行う。この溶液条件がＯＣＰの成長に好適なためである。
＜３.２　標準リン酸カルシウム溶液にβ－ＴＣＰマイクロ基板を浸漬した場合の成長層の形成過程＞
　マイクロ基板上に成長したＯＣＰ層の厚みは８０μｍに達するため、ＸＲＤ測定の結果は、主に成長後期の情報を反映している。成長プロセスの検証を行うため、時間分割ＳＥＭ観察を行った(図４ａ－ｆ)。基板浸漬後１分で、表面には微小な板の集合からなる塊が形成する(図４ａ，白矢印)。核形成した塊の量は少なく、それらは時間経過と共にサイズと数を増加させる(図４ｂ)。浸漬後１０分では、塊中の各板はお互い融合して成長している(図４ｃ)。２０分後には、基板表面の大部分が不規則なエッジを持つ数μｍスケール幅の板に覆われる(図４ｄ)。浸漬後４０分から１時間が経過すると、これらの板はエッジが多角形の形状に変化する(図４ｅ，ｆ)。板の平均サイズは１時間経過後も増加し、２０時間後には約１０－２０μｍ幅に達する。溶液がβ－ＴＣＰに対して過飽和であるにもかかわらず、ＯＣＰ層形成初期に(＜１０分以内)元々の基板表面の成長が見られない。初期に析出した微小板からなる塊は、β－ＴＣＰマイクロ基板上に直接形成している。成長初期の板とβ－ＴＣＰマイクロ結晶の界面を高分解能ＴＥＭ(ＨＲ－ＴＥＭ)で観察した結果、板の伸長方向に平行な格子縞が観察され、それらの格子縞は基板のマイクロ結晶に直接接続していた(図５)。後に示すように、この格子縞パターンはＯＣＰ結晶に特有のものである。
　図６ａ，ｂは、基板界面から約４.５μｍ離れた成長層位置での低倍率ＴＥＭ像(図６ａ)とＳＡＥＤパターンである(図６ｂ，　図６ａの上方左向き矢印付近で測定)。図６ａにおいて、ＣＲは結晶、ＲＥは充填樹脂を示す(図８の元素マッピングイメージを参照)。ＳＡＥＤパターンから２つの面間隔ｄ、が計算された。それらは１.８７０ｎｍと０.５５０ｎｍであり、両方向の交差角は８１.０°であった。これらのｄ値は、ＯＣＰ結晶の(１００)及び(０－１１)面の面間隔に誤差範囲(＜１％)で一致する。また、ＯＣＰ結晶の［１００］及び［０－１１］方位の交差角の理論値は８１.０°であり、測定値に一致する。従って、図６ｂのＳＡＥＤパターンは晶体軸［０１１］方向から見た像である。結晶のＨＲ－ＴＥＭ観察からは伸長方向に平行な格子縞が観察された。そのＦＦＴ変換像から計算された格子縞間隔は１.８６ｎｍであり、ｄ(１００)とほぼ一致する(図６ｃ)。
基板界面から約１.３μｍ離れた成長初期領域でのＳＡＥＤパターン(図６ｄ，　図６ａの下方右向き矢印付近)は２種類のｄ値を示した。それらは１.６５５ｎｍ(左下から右上に伸びる破線)と０.５６０ｎｍ(左上から右下に伸びる破線)であり、両方向の交差角は９０.３°であった。β－ＴＣＰ、ＯＣＰ、ＨＡＰのｄ値の中で、１.６５５ｎｍは唯一ＯＣＰのｄ(１００)に相当する値である。ＨＡＰ結晶が単斜晶系であった場合、そのｄ(０１０)は１.６５５ｎｍに近い値を取るが、(０１０)回折は消滅則のため出現しない。測定されたｄ(１００)は理論値より１１.２％小さい。すなわち［１００］方向が収縮しており、ＯＣＰの構造は変調している。この収縮は、当然他のｄ(ｈｋｌ)に影響を及ぼすはずである。観察された交差角から、０.５６０ｎｍはｄ(－１１－１)に相当すると思われる。しかし、その値は理論値より２％大きい。ｄ(１００)に見られた変調が結晶構造にどのような影響を及ぼすかを詳細に検討するため、サンプルを［１００］に垂直な軸の周囲に回転させ、回転に伴って出現するＳＡＥＤパターンを解析した。その結果、図７ａに見られるように４種類のＳＡＥＤ像が得られた。これらのＳＡＥＤ像は、見やすさの観点から全て［１００］が水平になるよう傾斜させてある。次にＯＣＰのａ軸が１１.２％収縮しているとの仮定の下、［１００］に垂直方向から見たＳＡＥＤパターンのシミュレーションを行った。サンプルを［０１０］から［０－１０］方向へ仮想的に回転させた場合、９つの低指数晶体軸に対応するＳＡＥＤパターンが得られた。これらのＳＡＥＤのうち、４つのパターン(図７ｂの破線四角枠)と各々の為す角度が実験結果と最も近いことが判明した(図７ｃ)。しかしながら、これらのＳＡＥＤパターンから計算されたｄ値と、各方位間の為す角度は実験結果とは完全に一致していない。表１は、ｄ値及び各晶体軸方向と［１００］との為す角度に関して、シミュレーション及び実測値の比較である。両者間に見られる相違に関して本発明者は、ＯＣＰ結晶のａ軸だけではなく、各軸間の為す角度(恐らくγ角)が変調を受けていると推測する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図８ａ，ｂは、ＳＴＥＭ－ＥＤＳによる成長層の元素マッピングであり、それらが成長ステージにどのように依存するかを示している。スペクトル解析から、成長後期ステージ(５μｍ以上界面から離れた領域、図８ｅ上側カーブ)では、平均のＣａ／Ｐ元素％比は１.４２±０.０２であり、ＯＣＰの化学量論比１.３３より大きい。成長初期ステージ(界面から２μｍ以内の領域、図８ｅ下側カーブ)ではＣａ／Ｐ比は１.４９±０.０３であり、更に増大している。
　Ｃａ／Ｐ比が成長最終ステージにおいて１.３３に一致するか否かを確認するため、界面から約７０μｍ離れた成長層部分から結晶を剥離し、ＳＴＥＭ－ＥＤＳ分析を行った(図９)。その結果、５つの結晶に対する平均Ｃａ／Ｐ比は１.３５±０.０２であった。成長最終ステージでは、化学組成がほぼ理論値に回復している。
　ＴＥＭ観察、ＳＡＥＤ測定、そしてＳＴＥＭ－ＥＤＳ分析の結果は、ＯＣＰ結晶の構造と化学組成が変調を受けていることを示している。ＳＡＥＤパターンから明らかなように、結晶構造は、成長に伴って直ぐに正常な状態へと回復する。この変調の正体に関しては、後に議論する。
　２０時間浸漬後の基板に関するＸＲＤ測定の結果は、β－ＴＣＰに相当する高強度のピークと、ＯＣＰに相当する低強度ピークが観察された(データは示さず)。ＯＣＰ結晶は、基板のマイクロスケール結晶間に溶液が浸透して形成されたと推定される。
＜３.３　標準リン酸カルシウム溶液にβ－ＴＣＰナノ基板を浸漬した場合の成長層の形成過程＞
　２０時間浸漬後の基板上に成長するＯＣＰ自体はマイクロ基板でもナノ基板でも大差ないが、成長層の形成過程には大きな差異が認められた。
　図１０ａ－ｆは、ナノ基板上での成長層形成過程の時間分割ＳＥＭ観察の結果である。基板浸漬後１分で、表面には１００ｎｍ以下のサイズのナノ粒子が析出する(図１０ａ)。これらの粒子は急速に融合して３－５分後には木の根構造を形成する(図１０ｂ，ｃ)。木の根構造は１０分後には不規則形状の板へと変貌し(図１０ｄ)、それらは成長し、４０分から１時間後にはミクロンスケール幅の多角形板へと変化する(図１０ｅ，ｆ)。この形状はＯＣＰに特有のものである。成長に伴うナノ粒子の出現と木の根構造への変化は、マイクロ基板では観察されなかった事象である。
　図１１ａは、２０時間浸漬後のサンプル(ＦＩＢ法により作成)の低倍率ＴＥＭ画像である。ＳＥＭ観察から予測されるように、成長層は３つの領域に分類される。それらは、基板界面直上のブッシュ様針状物質からなる領域、不規則形状の板からなる領域、多角形板からなる領域である。各領域の境界は不明瞭であり、特に不規則形状板から多角形板への変化は連続的である。ブッシュ様針状物質の高倍率ＴＥＭ画像(図１１ｂ)、及び８００ｎｍφ領域でのＳＡＥＤ測定から明確な２つのＤｅｂｙｅリングが観察された(図１１ｃ、上部画像)。ＳＡＥＤ測定領域にはブッシュ様針状物質以外にも基板に由来するナノ粒子を含んでいるため、ブッシュ様針状物質のみを含む２００ｎｍφ領域での測定も行った(図１１ｃ、下部画像)。両者は一致している。２つのＤｅｂｙｅリングの中心からの距離を測定すると、０.３４５ｎｍ及び０.２８１ｎｍであることがわかった。全ての回折とそれらの相対的強度を考慮した結果、ＨＡＰのｄ(００２)(強度９９.３６％)とｄ(２１１)(強度５２.３４％)が誤差範囲(＜１％)で０.３４５ｎｍ及び０.２８１ｎｍに一致することがわかった。特に(２１１)回折は、ＨＡＰのＸＲＤパターンにおいて最高強度のピークとして出現する。一方で、得られたＤｅｂｙｅリングがＯＣＰのものであった場合、０.３４５ｎｍはＯＣＰのｄ(１２１)と誤差範囲で一致する。０.２８１ｎｍは多くの回折に対応し、それらは(１３０)，(６－２－１)，(５－３０)等である。これらのうち、(５－３０)回折は相対強度１００％であるが、(１２１)回折は２０％以下の強度しか示さない。このことは得られたＳＡＥＤパターンがＯＣＰでなくＨＡＰに対応することを示唆する。実際にパターンがＨＡＰのものであることを確認するため、ブッシュ様針状物質のＨＲ－ＴＥＭ観察を行なった(図１１ｄ、左側)。この像のＦＦＴ変換像(図１１ｄ、右側)から、２つの特徴的な距離、１.２３ｎｍ－１及び２.９３ｎｍ－１が得られた。これらの方位の交差角は９０°である。ＦＦＴの逆格子空間で得られた距離は、実空間では０.８１３ｎｍ及び０.３４１ｎｍに相当し、これらは誤差範囲で(＜１％)ＨＡＰのｄ(１００)とｄ(００２)に一致する。このことは、図１１ｄのイメージがＨＡＰのａｃ面に相当することを意味する。図にはＨＡＰのｕｎｉｔ　ｃｅｌｌに相当するサイズを書き込んである。
　基板界面から約１.５μｍの位置での不規則形状板に対するＳＡＥＤ測定の結果、０.８６２ｎｍ及び０.３４１ｎｍの面間隔が算出され、それらの方位は８８.０°で交差していた(図１１ｅ)。このＳＡＥＤパターンは、理想的なＨＡＰあるいはＯＣＰのどちらにも対応しない。ＳＡＥＤパターンがＨＡＰのものであった場合、ａｃ面を［０１０］方位から観察していることになるが、０.８６２ｎｍはＨＡＰのｄ(１００)である０.８１６ｎｍより誤差範囲を超えて大きい。更に計算された［１００］と［００１］の交差角は９０.０°であり、測定値と一致しない。一方で、ＳＡＥＤパターンがＯＣＰのものであった場合、そのパターンはやはりａｃ面を［０１０］方向から見たものに相当する。この場合、計算される［１００］と［００１］の交差角度は８７.３°であり、実測値に近い。０.３４１ｎｍの値はＯＣＰのｄ(００２)に誤差範囲(＜１％)で一致する。しかし、０.８６２ｎｍはＯＣＰのｄ(２００)である０.９３２ｎｍより７.５％小さい。不規則形状板に対するＨＲ－ＴＥＭ観察から、約１.７ｎｍ、すなわち０.８６２ｎｍのほぼ倍に当たる間隔の格子縞が観察された。この格子縞は、図６ｃに示す様に相対的に低倍率で観察されるＯＣＰ結晶に特有のパターンである。本発明者は、不規則形状板が本質的にＯＣＰの骨格を有しており、マイクロ基板上に成長したＯＣＰのように、ｄ(１００)が収縮していると結論する。
　基板界面から約７μｍ離れた位置での多角形板に対するＳＡＥＤ測定の結果を図１１ｇに示す。このパターンから０.９５２ｎｍと０.６８６ｎｍの面間隔が算出された。また、両方向の為す角度は９２.０°、すなわち－８８.０°であるため、０.９５２ｎｍはＯＣＰのｄ(２００)に対応する。しかし、その値は理論値より約２.１％大きい。一方、０.６８６ｎｍはＯＣＰのｄ(００１)に誤差範囲(＜１％)で一致する。これらのことから、ナノ基板の場合にはマイクロ基板に比べて、ｄ(１００)に見られる変調がより後期の成長ステージまで波及していることがわかる。また、ｄ(００１)の値が理論値と一致することは、構造的変調がａｂ面内で生じていることを支持する。
　成長層の二次元元素マッピングの結果を図１２ａに示す。カルシウム元素マッピング像にスーパーインポーズされた破線の四角と番号は、それぞれブッシュ様針状領域(１)、不規則形状板領域(２)、多角形板領域(３)に対する測定範囲を示す。ブッシュ様針状領域のＳＴＥＭ－ＥＤＳスペクトル(図１２ｂ、下から１番目のカーブ)から求められたＣａ／Ｐ元素％比は１.６６±０.０２であり、ＨＡＰの化学量論比に近い。この結果は、ブッシュ様針状物質がＨＡＰであることを支持する。この領域の形成は、時間分割ＳＥＭ観察における木の根構造の出現時期に対応している(図１０参照)。不規則形状板(図１２ｂ、下から２番目のカーブ)及び多角形板(図１２ｂ、下から３番目のカーブ)領域に対するＳＴＥＭ－ＥＤＳ測定の結果、平均Ｃａ／Ｐ比はそれぞれ１.５９±０.０７、１.５０±０.０３であった。これらの値は、マイクロ基板上のＯＣＰのそれよりかなり大きい。
　基板界面から約４０μｍ離れた位置でのＣａ／Ｐ比の測定を行なったところ(このサンプルは別途準備)、１.４４±０.０２であり(図１２ｂ、下から４番目のカーブ)、マイクロ基板を用いた際に界面から約５μｍ離れた成長層位置で測定された値と近い(図８を参照)。界面から４０μｍ離れた位置での多角形板のＴＥＭ像(図１３ａ)及びＳＡＥＤパターン(図１３ｂ)から１.８６０ｎｍと０.６８４ｎｍの面間隔が観察され、それらの方位の交差角は９２.０°であった。これらのｄ値はＯＣＰ結晶のｄ(１００)及びｄ(００１)に誤差範囲(＜１％)で一致する。すなわち、この領域では構造変調が解消している。基板界面から約７０μｍ離れた領域でのＣａ／Ｐ比は、ＯＣＰの化学量論比に近い値となっていた(データは示さず)。
　２０時間浸漬後の基板に対するＸＲＤ測定の結果、ＨＡＰ及びβ－ＴＣＰに相当する明確なピークが観察されたが、ＯＣＰに相当するピークは検出されなかった(データは示さず)。この結果は、ナノ基板を用いた場合に成長初期に基板上にＨＡＰが形成されるデータを支持する。
　基板の粒子サイズに応じたＯＣＰ形成過程の相違は、初期リン酸カルシウム溶液のＣａ／Ｐモル比が１.０２以外の場合でも見られた。［Ｃａ２＋］×［ＰＯ４ ３－］を１５－１６ｍＭ２に保ち、Ｃａ／Ｐ比を１.３３及び１.６７に調整した場合のＯＣＰ形成過程を調べた結果、マイクロ基板上にはＯＣＰが直接形成され、ナノ基板上にはブッシュ様針状物質から不規則形状板を経て多角形板形状のＯＣＰが形成された(図１４)。
＜＜４.　実施例等についての考察＞＞
　β－ＴＣＰ基板を構成する粒子のナノスケール化は、成長初期において基板上に形成する物質をＯＣＰからＨＡＰに変化させる。これは、粒子のナノスケール化により粒子体積に対する自由表面の増加が起こって、ナノ粒子の表面自由エネルギーがマイクロ粒子のそれに比べて増大したためである。ＨＡＰの表面エネルギーはＯＣＰあるいはβ－ＴＣＰのそれより大きく、ＯＣＰとβ－ＴＣＰの差は相対的に小さい。従って、β－ＴＣＰ基板上にＯＣＰが形成することは自然である。しかし、β－ＴＣＰ基板を構成する粒子のナノスケール化によってβ－ＴＣＰとＨＡＰ間の表面エネルギー差が減少すると、熱力学的効果(ＨＡＰに対する過飽和度)が核形成に要する表面エネルギーバリアに打ち勝ち、ＯＣＰの代わりにＨＡＰを基板上に核形成させる。ここで疑問点は、なぜナノ基板表面に形成したＨＡＰがそのまま成長せず、ＯＣＰが遅れて成長するか、である。これは、通常ＯＣＰがＨＡＰより初期に出現し、やがてＨＡＰに相転移する現象と矛盾する様に見える。この現象に関する解釈として、本発明者はＯＣＰ及びＨＡＰの成長に関して、熱力学的効果よりキネティック効果の寄与が大きかったためと推測する。本発明者の過去の研究結果から、本研究条件におけるＨＡＰのｃ軸方向への成長速度は数１０ｎｍ／ｈ以下と推測される(非特許文献４参照)。一方でＯＣＰのｃ軸方向への成長速度は、今回の観察から５００ｎｍ／ｈ－１μｍ／ｈ以上である。ＯＣＰの成長速度はＨＡＰの成長速度より少なくとも１桁以上大きく、それ故、ＯＣＰがＨＡＰに遅れて出現しても主要相として発達することは可能である。この成長様式は今回のβ－ＴＣＰ基板に特有なものではない。ＡＣＰナノ粒子基板上にＨＡＰのナノロッド構造を構築した本発明者の過去の研究(非特許文献５参照)において、溶液中にフッ素が存在するとＨＡＰが成長し、フッ素が欠如するとＯＣＰが成長した。このプロセスにおいて、初めにＨＡＰナノロッドをフッ素含有溶液中で約３０分間成長させた後に、サンプルをフッ素非含有溶液に移行すると、２０時間後にはＨＡＰナノロッド上にＯＣＰ層が形成した(図１５)。特定の条件では、ＯＣＰはＨＡＰが核形成した後に出現し、主要相として発達することがあり得る。
　ａ軸方向へのＯＣＰの構造は、ＨＡＰ類似層－遷移層－ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ層－遷移層－ＨＡＰ類似層の繰り返しからなる。酢酸やコハク酸等のカルボキシル基を有する分子は、ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ層に取り込まれ、ｄ(１００)を伸長することが知られている。一方で、ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ層中の水分子の欠損によるｄ(１００)の収縮は、ＯＣＰを１５０℃以上に加熱した時に起こる。ＡＣＰからＯＣＰへの相転移(室温)を調べた本発明者の過去の研究では、金ナノ粒子表面にカルボキシル基を結合させた添加物を溶液中に加えると、ｄ(１００)の収縮が起こり得ることが示唆された。今回の研究ではｄ(１００)の収縮に関する直接証拠を得られた。また、結晶の加熱や溶液中への添加物なしにこの収縮が起こること、基板の粒子サイズを変化させることで、収縮が解消するまでの時間をコントロールできることが明らかとなった。ＯＣＰ構造中におけるｄ(１００)の収縮は、ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ層そのものの欠損の結果として起こる。何故ならば、この層の欠損は必然的にリン酸欠損ＯＣＰを生み出し、それは今回の研究におけるＳＴＥＭ－ＥＤＳ分析の結果と調和するからである。この構造変調は、過去の研究とは異なり高結晶性ＯＣＰで起こり得ることが示された。すなわち、ＯＣＰの結晶構造は本質的に不安定であり、成長と共に理想的な構造へと熟成する。ナノ粒子基板に見られた化学組成の長時間における変調は、ＯＣＰがＨＡＰ上に成長するためと推測する。これは、ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ層欠損ＯＣＰの構造がＨＡＰ構造に似ているため、下地ＨＡＰの影響を長時間引き継ぐためである。
　以上のような考察から、次のような知見が得られた。
(１)配向ＯＣＰ結晶層を、幅広い溶液ｐＨ・体温条件下でβ－ＴＣＰ基板上に形成することができる。
(２)ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ層欠損によるＯＣＰ結晶構造と化学組成の変調が、結晶加熱あるいは溶液中への添加物なしに起こり得る。この変調は基板粒子のナノ化により助長される。
(３)ＯＣＰ結晶の構造と化学組成における変調は、ＯＣＰを骨移植(代替)材料として使用する場合に大きな影響を持つ。それ故、これらの変調の簡単なコントロールは有用である。
　本発明によれば、骨移植(代替)材料としてのβ－ＴＣＰからなる基材と、骨誘導材料として優れたポテンシャルを有するＯＣＰ結晶層とを含む複合体を、人体等の生命体に対し許容可能な条件下乃至擬似生理環境場において、簡易に形成乃至製造できるので、損傷骨などの治療や、移植用骨代替材料、新生骨誘導用足場材料等への応用、それらの材料の製造等への利用が期待される。特に、本発明の前記ＯＣＰ結晶層は、新骨形成を促進することが知られている変調部分を有し、また、その変調部分の広狭もβ－ＴＣＰ結晶粒子の粒子サイズにより調整可能であるので、前記用途などへのより有効な活用が期待される。

Claims (11)

  1. 　β－リン酸三カルシウム(以下、「β－ＴＣＰ」ということがある。)結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材の表面の少なくとも一部を、カルシウムイオン及びリン酸イオンを含有し、マグネシウムイオン含有量が０.５ｍＭ以下である母液に浸漬する工程を備える、β－ＴＣＰ基材とリン酸八カルシウム(以下、「ＯＣＰ」ということがある。)結晶層を含む複合体の製造方法。
  2. 　β－ＴＣＰ結晶粒子をマイクロメートルサイズのものとし、β－ＴＣＰ基材の表面に直接ＯＣＰ結晶を形成する請求項１に記載の複合体の製造方法。
  3. 　前記β－ＴＣＰ結晶粒子をナノメートルサイズのものとし、β－ＴＣＰ基材表面に水酸アパタイト(以下「ＨＡＰ」ということがある。)結晶層と、該ＨＡＰ結晶層上にＯＣＰ結晶層を形成する請求項１に記載の複合体の製造方法。
  4. 　前記母液は、カルシウムイオン濃度が０.２～５ｍＭ、リン酸イオン濃度が０.２～５ｍＭの水溶液である請求項１～３のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
  5. 　前記母液は、マグネシウムイオン含有量が０.１ｍＭ以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
  6. 　前記母液はｐＨが５.５を超え８.０以下である請求項４に記載の複合体の製造方法。
  7. 　前記母液の温度が０～６０℃である請求項４に記載の複合体の製造方法。
  8. 　β－ＴＣＰ結晶粒子の充填体からなるβ－ＴＣＰ基材と、該β－ＴＣＰ基材の表面上のＯＣＰ結晶層を含む複合体。
  9. 　前記β－ＴＣＰ結晶粒子がナノメートルサイズであり、β－ＴＣＰ基材とＯＣＰ結晶層との間にＨＡＰ結晶層を含む請求項８記載の複合体。
  10. 　前記β－ＴＣＰ結晶粒子がマイクロメートルサイズであり、ＯＣＰ結晶層がβ－ＴＣＰ基板の表面上に直接存在するものである請求項８に記載の複合体。
  11. 　前記ＯＣＰ結晶層は、その結晶構造及び／又は化学組成が変調した部分を含むものである請求項８～１０のいずれか１項に記載の複合体。
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