WO2019045116A1 - コンフォメーション病の予防又は治療剤、及びコンフォメーション病医薬のスクリーニング方法 - Google Patents

コンフォメーション病の予防又は治療剤、及びコンフォメーション病医薬のスクリーニング方法 Download PDF

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prion
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健太 照屋
桂子 西澤
堂浦　克美
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for conformational disease, and a method of screening for a conformational disease drug.
  • Conformational disease or protein conformational disease is a group of diseases in which the conformation (conformation) of a specific host protein is changed and it becomes poorly soluble and accumulates in cells, tissues and organs, leading to a pathological condition. Examples of diseases have been reported (see Non-Patent Documents 1 to 3). These include Alzheimer's disease, chronic Lewy body disease, prion disease, polyglutamine disease, Parkinson's disease, and intractable neurological diseases represented by myotonic lateral sclerosis. In conformational diseases, a specific protein is rendered intractable by taking a conformation rich in structural components called a ⁇ -sheet structure different from the original conformation. Among the conformational diseases, a group of diseases in which such abnormal conformational proteins accumulate in extracellular tissues to form poorly soluble substances (amyloid) are called amyloidosis.
  • amyloidosis a group of diseases in which such abnormal conformational proteins accumulate in extracellular tissues to form poorly soluble substances
  • inclusion body there is also a disease group in which such abnormal conformational proteins accumulate in cells to form a poorly soluble substance called "inclusion body".
  • the former includes various amyloidosis diseases such as familial amyloid polyneuropathy, AA amyloidosis, AL amyloidosis, dialysis amyloidosis, senile amyloidosis, etc., and the latter includes polyglutamine disease, Parkinson's disease, myotrophic lateral sclerosis, It includes chronic Lewy body disease, Huntington's disease, Pick's disease, multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, frontotemporal dementia and the like. Moreover, there are Alzheimer's disease and prion disease etc. as what is seen in either.
  • conformational diseases In conformational diseases, inhibition of poorly soluble aggregates of proteins and elimination of poorly soluble aggregates are common drug discovery targets.
  • conformational diseases in Alzheimer's disease, which has been studied, development of passive immunotherapy in which an antibody against aggregating amyloid ⁇ and aggregating tau protein is administered to patients is active, and some promising results are reported. (See Non-Patent Documents 10 to 11).
  • the prion disease known as a representative of the disease caused by the abnormal aggregation protein
  • the prion disease is a disease in which the central nerve is affected by the prion, and the main body of the prion is the abnormally aggregated prion protein
  • abnormally aggregated prion protein is called abnormal prion protein.
  • Today, poorly soluble aggregating proteins that appear in other conformational diseases have also been shown to behave in the same way as abnormal prion proteins in prion diseases (ie, disease transmission), and are similar to prions. It is considered.
  • the immunotherapy for Alzheimer's disease has been described above, some effects have been reported in several articles in immunotherapy for prion protein even in prion disease (Non-patent Document 14).
  • An object of the present invention is, in view of the above background, to provide a preventive or therapeutic agent for conformational disease, and a screening method for a conformational disease drug.
  • the present inventors have conducted researches to solve the above-mentioned problems, and have found that abnormal proteins causing conformational diseases are cross-linked with each other in the process of aggregation to be oligomer proteins. Then, it was found that by using the oligomeric protein as an antigen by inactivating the oligomeric protein, active immunization was possible, and the present invention was completed.
  • One form of the present invention is an inactivated oligomeric protein in which a plurality of abnormal proteins that cause conformational diseases are cross-linked.
  • another embodiment of the present invention is a preparation step of preparing an aberrant protein causing a conformational disease, a crosslink step of subjecting the aberrant protein to a crosslinking treatment to form an oligomer, and a crosslinked oligomer protein
  • a method for producing an inactivated oligomeric protein, comprising a recovery step of recovering and a treatment step of inactivating the recovered oligomeric protein.
  • another aspect of the present invention is an agent for the prophylaxis or treatment of a conformational disease, comprising the above-mentioned inactivated oligomeric protein, which comprises the therapeutic agent and a pharmaceutically acceptable carrier, or the prophylaxis or treatment of a conformational disease It is a pharmaceutical composition for treatment.
  • another aspect of the present invention is a step of contacting a candidate compound with a oligomeric protein cross-linked with a plurality of abnormal proteins causing conformational disease, and the activity of the oligomeric protein contacted with the candidate compound and And / or a measuring step of measuring the structure, a screening method of a conformational disease drug, or a contacting step of contacting a candidate compound with an abnormal protein causing the conformational disease, applying a crosslink treatment to the abnormal protein
  • a screening method of a conformation disease medicine which comprises a crosslinking step of forming an oligomer, and a measuring step of measuring the activity and / or the structure of the crosslinked oligomer protein.
  • an inactivated oligomeric protein that can be used as a preventive or therapeutic agent for a conformational disease, and the inactivated oligomeric protein can be used for active immunity as an antigen of a conformational disease, Progress can be improved.
  • the oligomeric proteins are cross-linked at the interface of abnormal proteins, and can be utilized to produce an antibody that specifically recognizes the interface.
  • the oligomeric protein is contacted with a candidate compound for a conformational disease drug, and the change in the activity of the oligomeric protein is measured, or the abnormal protein is contacted with a candidate compound for a conformational disease drug, the oligomeric protein By measuring the change in formation activity of H. pylori, screening of a conformational disease drug may be possible.
  • FIG. 7 It is a drawing-substituting photograph of the western blot of the electrophoresis image which shows the test result of abnormal prion protein crosslink reaction by UV irradiation in each compound mixing (Experimental example 7). It is a drawing-substituting photograph of the western blot of the electrophoresis image which shows the result verified about the effect of the methylene blue discovered in Experimental example 7 (Experimental example 8).
  • FIG. 13 is a drawing-substituting photograph of a western blot of electrophoretic images showing test results of abnormal prion protein crosslinking reaction by ammonium persulfate and N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine (Experimental Example 9).
  • Compound B known to exhibit anti-prion activity, Doxycycline (DOX), a drawing as a substitute for a drawing of a western blot of an electrophoresis image showing the results of testing the effect on abnormal prion protein crosslinking reaction, And a graph in which the signal intensity corresponding to the crosslink reaction product (dimer) in the western blot is plotted on the vertical axis, and the final concentration of the anti-prion compound added to the cell lysate is plotted on the horizontal axis (Experimental Example 10).
  • DOX Doxycycline
  • FIG. 16A is a drawing substitute photograph of a western blot of electrophoretic images showing results of detection of abnormal proteins when cross-linked with a prion-infected cell lysate using glutaraldehyde, which is a general bivalent crosslinking agent ( Experimental Example 15). It is a drawing-substituting photograph of the western blot of the electrophoresis image which shows the result of having detected the total prion protein without PK process similarly to the case of FIG. 24 (Experimental example 15).
  • FIG. 18 is a graph showing the prion activity of the abnormal prion protein crosslinking reaction product inactivated in Experimental Example 16 in a mouse bioassay (Experimental Example 17).
  • One embodiment of the present invention is an inactivated oligomeric protein in which a plurality of abnormal proteins that cause conformational diseases are cross linked.
  • the present inventors focused on the agglutination of abnormal proteins, taking prion disease as an example of conformational diseases, and by processing prion-infected cells with a specific compound or the like, abnormal prion protein crosses. It has been found that oligomerization of linked dimers, trimers, tetramers, etc. is promoted. On the other hand, in the case of normal prion protein, promotion of crosslinking did not occur. In addition, the phenomenon occurred not only in prion-infected cells but also in cell lysates and extracts of prion-infected tissues in individuals.
  • crosslink is different in concept from “crosslinking” in which functional groups react with each other in a chemical reaction to link.
  • the “crosslink” is a crosslinker described later, in which a plurality of abnormal proteins causing conformational diseases form a multimer.
  • a conformational disease is a disease in which the three-dimensional structure (conformation) of a specific host protein is changed to be poorly soluble and accumulated in cells, tissues, and organs to cause a pathological condition.
  • Alzheimer's disease severe chronic Lewy body disease, prion disease, polyglutamine disease, Parkinson's disease, neurological intractable disease represented by myotonic lateral sclerosis, familial amyloid polyneuropathy, AA amyloidosis, AL amyloidosis And dialysis amyloidosis, including amyloidosis such as senile amyloidosis.
  • Crosslinking of aberrant proteins occurs, for example, by adding the following compounds. Primulin, Congo red, Methylene blue, luciferin, 1,3-bis (3,4-dihydroxyphenyl) propane-1,3-dione, Thioflavin T, dye-based / light-emitting compounds such as Compound B, ammonium persulfate, N, N, N Radical generators such as N ', N'- tetramethylethylenediamine, etc. Furthermore, cross-linking also occurs by the irradiation of ultraviolet light. The cross linking of abnormal proteins can be generated by using one or more of these in combination.
  • the addition amount of the compound causing the cross linking can be appropriately set depending on the type of the compound, the type of the conformational disease, the material to be used, the treatment method thereof and the like. For example, when using primulin to crosslink abnormal proteins of prion disease, it is preferable to add 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the oligomeric protein of this embodiment is one in which abnormal proteins that cause conformational diseases are cross-linked to form multimers. Oligomers are typically dimers, may be trimers, may be tetramers, may be pentamers, may be hexamers, many of which are dimeric. Body or trimer.
  • the number of residues of the monomer forming the oligomeric protein of the present embodiment is not particularly limited, it contains a crosslink site and does not contain a large number of amino acids other than the crosslink site because of ease of handling and ease of molecular design. It is preferably a fragment. Therefore, it may be fragmented by an enzyme treatment described later.
  • the number of residues of the monomer is not particularly limited as long as it contains a crosslink site, but may be 5 or more, 8 or more, or 10 or more. Also, it may be 25 or less, 20 or less, or 15 or less.
  • the molecular weight of the oligomeric protein of the present embodiment is not particularly limited, but may be 1000 or more, 1500 or more, 2000 or more, 5000 or less, or 4000 or less. It may be 3000 or less.
  • the crosslink site of the oligomeric protein of this embodiment occurs at the interface of the aberrant protein that causes a conformational disease.
  • a structural model of the aberrant prion protein has been proposed (Non-patent Document 13).
  • the crosslink site of the abnormal prion protein corresponds to interface 2 or interface 3 in the structural model.
  • the amino acid residue near 110 is involved. As used herein, the vicinity is ⁇ 5 residues, may be ⁇ 3 residues, ⁇ 2 residues, or ⁇ 1 residues.
  • the method for producing an oligomeric protein in which aberrant proteins causing conformational diseases are cross-linked is shown below.
  • the manufacturing method is another embodiment of the present invention.
  • the production method according to the present embodiment includes a preparation step of preparing an abnormal protein causing a conformational disease, a crosslinking step of subjecting the abnormal protein to a crosslinking treatment to form an oligomer, and a crosslinked oligomer protein A recovery step of recovering the oligomer protein.
  • abnormal proteins that cause conformational diseases are prepared.
  • the origin of the aberrant protein is not particularly limited, and may be from human, from experimental animals such as mouse and rat, from cells, and may be those produced in a test tube.
  • An abnormal prion protein can be obtained from the brain of a patient infected with prion disease, the brain of an infected animal, infected cells and the like.
  • it may be an individual (for example, a mouse, a rat, etc.) carrying an abnormal protein, and may be a cell lysate containing the abnormal protein.
  • it may be an E. coli recombinant protein resembling an abnormal protein, or a synthetic peptide resembling an abnormal protein.
  • a denaturation step may be performed to inactivate the prepared protein.
  • activation means that the cross-linked abnormal protein is maintained without losing the lethality to experimental animals such as mice and rats that can be administered, and humans while maintaining the antigenicity of the proteins. . Whether or not the oligomeric protein has been inactivated can be confirmed by a bioassay or the like. Inactivation is carried out according to a conventional method.
  • denaturation of abnormal proteins is carried out with protein denaturants such as sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, urea, formic acid and the like.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • guanidine hydrochloride guanidine hydrochloride
  • guanidine thiocyanate urea
  • formic acid formic acid and the like.
  • the denaturation step may be performed on the abnormal protein after the cross linking step.
  • the cross linking step is a step of cross-linking the abnormal protein.
  • Crosslinking is performed by a method such as adding a compound that causes the above-described crosslinking, irradiating ultraviolet light, or the like.
  • the addition amount of the compound and the irradiation amount of the ultraviolet light are appropriately set according to the type of conformation disease, the type of the compound, the material to be used, and the treatment method thereof.
  • the wavelength of the ultraviolet light is not particularly limited, but may be, for example, 365 nm.
  • Whether cross-linked or not can be determined by, for example, enzymatically treating the protein with proteinase K and detecting the molecular weight by SDS-PAGE.
  • Crosslinking forms an oligomer, and a high molecular weight band representing a dimer, trimer or the like is observed in which the band has moved compared to the monomer.
  • the step of recovering the cross-linked oligomeric protein can be performed according to a conventional method.
  • fragmentation may be performed by enzyme treatment or the like so as to remove portions other than the crosslink portion.
  • isolation formation of the crosslink portion may be further performed.
  • the oligomeric proteins obtained by the above method are very useful for the treatment of conformational diseases.
  • the inactivated oligomeric protein obtained by inactivating the oligomeric protein can be used as a preventive or therapeutic agent for a conformational disease, and the conformation can be obtained by adding a pharmaceutically acceptable carrier thereto. It becomes possible to use as a pharmaceutical composition for prevention or treatment of a disease.
  • vaccination with an inactivated oligomeric protein as an antigen enables active immunotherapy, can delay the progression of conformational disease, and can improve symptoms.
  • some of them may be substituted, deleted or modified, and they may be peptides having similar activities, and recombinant proteins having similar activities.
  • another aspect of the present invention relates to the steps of contacting a candidate compound with the above-mentioned oligomeric protein and the oligomeric protein obtained by the above-mentioned production method, and the activity and / or structure of the oligomeric protein with which the candidate compound was contacted.
  • Measuring a conformational disease drug, or contacting the candidate protein with the abnormal protein causing the conformational disease, cross-linking the abnormal protein to form an oligomer It is a screening method of a conformation disease medicine including a cross-linking step, and a measurement step of measuring the activity and / or structure of the cross-linked oligomeric protein.
  • Cross-linked oligomeric proteins that cause conformational diseases are cross-linked to preserve the interface structure. Therefore, by contacting a candidate compound as a therapeutic drug with the oligomeric protein and measuring the activity and / or structure of the oligomeric protein, it is possible to directly understand whether the candidate compound has any effect on the conformational disease. be able to. Alternatively, by measuring the formation activity of the oligomeric protein after contacting the aberrant protein with the candidate compound, it can be understood directly whether the candidate compound has any effect on the conformational disease. In particular, if contact of the candidate compound results in a phenomenon such as relaxation, bending, structural change, or reduction in crosslinking efficiency of the oligomer protein cross-linking site, the candidate compound has a conformational disease. It can be judged that the compound contributes to the elimination of the aggregation of Therefore, the screening method of the present embodiment makes it possible to conduct a direct assay on candidate compounds for a therapeutic agent for conformational disease.
  • abnormal prion protein and amyloid A which are representative of abnormal aggregation proteins.
  • FIG. 1 shows the chemical structural formula of primulin, and the compound primulin (primuline, also known as direct yellow-7, cas # 8064-60-6) was purchased from MP Biosciences and used without purification. Twelve samples of each cell lysate were prepared, and primulin was added to six samples. The final concentrations are 0, 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 ⁇ M. Meanwhile, the remaining six samples were subjected to proteolytic treatment.
  • Proteolysis was performed by adding proteinase K (PK: Proteinase K) derived from Tritirachium album to a final concentration of 10 ⁇ g / mL in 20 ⁇ L cell lysate and reacting (proteolysis) at 37 ° C. for 30 minutes After that, phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF) was added to a final concentration of 1 mM to stop the proteolysis reaction.
  • PK treatment A sample treated with PK after 30 minutes of primulin treatment and a sample treated with primulin after 30 minutes of PK treatment were prepared.
  • PrPres an abnormal prion protein
  • SDS-PAGE buffer for electrophoresis
  • the sample at this stage is referred to as an SDS-PAGE sample.
  • the SDS-PAGE sample is electrophoresed on a 15% Tris-glycine SDS-PAGE gel according to the method of Ishikawa, Doura et al. [Journal of General Virology, 2004, Vol. 85, 1785-1790], and Western blot is applied to PrPres. Detected.
  • the electrophoresed protein is blotted to a nylon membrane (PVDF membrane, manufactured by Millipore), a mouse monoclonal antibody against prion protein (SPI-BIO, SAF 83 (diluted 1: 5000)), and an alkali
  • the prion protein was detected using a phosphatase-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin antibody (Promega Corp. (20,000-fold dilution)) and a chemiluminescence detection reagent (Amersham CDP-Star detection reagent).
  • FIG. 2 shows the results of examining the difference between the target of the primulin crosslink action and the prion strain using cell lysates of N167 and ScN2a.
  • Lanes 1 to 6 were treated with PK after treatment with primulin
  • lanes 7 to 12 were treated with primulin after treatment with PK
  • the concentration of stimulin added was 0 ⁇ M for lanes 1 and 7
  • the following lanes 2 and 8, lanes 3 and 9, lanes 4 and 10, lanes 5 and 11, and lanes 6 and 12 are 10, 2, 0.4, 0.08, and 0.016 ⁇ M, respectively.
  • the upper blot shows the results using N167 and the lower blot shows the results using ScN2a cell lysate.
  • PrPres is a proteolysis-resistant partial product in which the N-terminal region has been cleaved by PK treatment of aberrant prion protein. That is, PrPres and the abnormal prion protein differ in molecular size.
  • Example 1 The results of Example 1 indicate that the action of primulin is likely to act on the aberrant prion protein which has not been cleaved, and the action on PrPres is somewhat weak. Therefore, it can be said that this experimental example depicts biochemical differences other than the molecular size of the abnormal prion protein and PrPres on the western blot.
  • Lanes 1-6 are the results in the presence of primulin and lanes 7-12 in the absence of primulin.
  • the action time is 0 minutes for lanes 1 and 7, below lanes 2 and 8, lanes 3 and 9, lanes 4 and 10, lanes 5 and 11, and lanes 6 and 12 for 60 minutes, 120 minutes, 180 minutes, and 240, respectively. Minutes, 360 minutes. It can be seen that the crosslink reaction formation is predominantly promoted in the presence of primulin. Also, its action is reaction time dependent.
  • UV irradiation of primulin-treated cells promotes the cross-linking reaction of abnormal prion protein. That is, ascorin is an interprotein cross-linking photosensitizer of abnormal prion protein, and abnormal prion protein crosslinking reaction by combination of primulin and UV irradiation is dependent on UV irradiation time. At the same time, it was found that UV irradiation promotes the abnormal prion protein crosslinking reaction even in the absence of primulin.
  • the sugar chain of the prion protein was removed. That is, PNGase F derived from Flavobacterium meningosepticum is added to the SDS-PAGE sample according to the instruction manual of NEB to remove sugar chains on proteins contained in the SDS-PAGE sample. The reaction was done. After a reaction time of 1 hour at 37 ° C., a 5-fold concentrated SDS-PAGE buffer was added, and a heat denaturation treatment at 95 ° C. for 5 minutes was added.
  • this sugar chain removal and reaction termination treatment is referred to as deglycosylation treatment.
  • the samples subjected to these treatments were electrophoresed in the same manner as in Experimental Example 1, and PrPres was detected by Western blotting.
  • FIG. 5 shows the results of examining the UV irradiation time dependency of the abnormal prion protein crosslinking reaction using the lysate of N167 cells cultured in the presence or absence of primulin.
  • Lanes 1 to 5 use lysates of cells cultured in the presence of primulin and lanes 6 to 10 in the absence of primulin.
  • the UV irradiation time is 0 minutes for lanes 1 and 6, and lanes 2 and 7, lanes 3 and 8, lanes 4 and 9, and lanes 5 and 10 for 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes and 60 minutes, respectively.
  • the dimer band as observed in the abnormal prion protein cross-linking reaction is a fact frequently observed in PrPres detection experiments, but there has been no report specifying the conditions for development. Although experiments with commercially available crosslinkers have been reported, they are a very common method using purified proteins and, as observed here, are crosslinks in cell lysates that contain impurities. The observation of is unique. Furthermore, since the use of primulin significantly accelerates the abnormal prion protein crosslinking reaction by UV irradiation, it has become clear that primulin acts as a photosensitizer in the abnormal prion protein crosslinking reaction.
  • Example 4 Abnormal prion protein crosslinking reaction by primulin or UV irradiation as in the experimental examples so far does not act on normal prion protein.
  • ⁇ -actin which is known to be in a state of aggregation and dissociation in cells, is not detected as a crosslink reaction under the conditions of Western blot detection.
  • prion non-infected Neuro2a cells were cultured in a scale cell culture flask with a base area of 25 cm 2 and lysed with a lysis solution to obtain 1 mL of a cell lysate.
  • a 150 ⁇ L aliquot of each tube was added to 6 tubes to give A, B, C, D, E, and F.
  • Primulin was added so that tubes C and D had a final concentration of 1 ⁇ M and E and F had a final concentration of 5 ⁇ M.
  • Tubes B, D, F were UV irradiated for 30 minutes at a distance of 15 cm, while tubes A, C, E were stored in the dark.
  • FIG. 6 shows a normal type prion protein which has been deglycosylated and which has not been subjected to PK treatment
  • FIG. Lanes 1-6 of each of FIGS. 6 and 7 correspond to tubes AF of [Method]. That is, lanes 1 and 2 are in the absence of primulin, and lanes 3 and 4 below, and lanes 5 and 6 are 1 ⁇ M and 5 ⁇ M, respectively. Although a slight photobleaching effect was observed in lane 6, which is the most severe reaction condition, no crosslink reaction by UV irradiation was observed regardless of the presence or absence of primulin.
  • mice were inoculated intracranially with mouse prion strain (22 L prion, 1% (w / v) PBS suspension), and brains were collected after rearing until the end of disease onset.
  • the collected brain (260 mg) was placed in a disruption tube and frozen at -80.degree.
  • PBS (2340 ⁇ L) was added, and 10% (w / v) brain homogenate was prepared by crushing with a stainless steel stirrer, and 200 ⁇ L each was dispensed into a sealable tube. The following operation was performed on two of them. 2 ⁇ L of proteinase E (10 mg / mL aqueous solution) was added to each tube, and allowed to react at 37 ° C.
  • Each tube was centrifuged (16,100 ⁇ g, 90 minutes), and the collected supernatants were collected, and then passed through a filtration membrane (filtration diameter: 0.45 ⁇ m) to obtain a filtrate (2000 ⁇ L).
  • the filtrate was divided into four 480 ⁇ L aliquots.
  • Primulin was added to three of them to a final concentration of 20 ⁇ M, and UV irradiation was performed for 30 minutes at a distance of 10 cm. The remaining one was an untreated sample.
  • washing solution [17.5% (w / v) iodooxanol, 0.1% (w / v) sarcosyl in PBS] to each precipitate, and after stirring, 16.2 ⁇ L of 4% (W / v) phosphotungstic acid aqueous solution (pH 7.4) was added, centrifugation (16100 ⁇ g, 90 minutes) was performed, and the supernatant was discarded to obtain a precipitate. To the precipitate, 200 ⁇ L of a washing solution was added, and PK treatment (final concentration 10 ⁇ g / mL, 37 ° C., 60 minutes) was performed.
  • an SDS-PAGE sample was prepared according to Experimental Example 1, and deglycosylation was performed according to Experimental Example 3.
  • one untreated sample and three UV-irradiated samples in the presence of can be obtained.
  • one untreated sample (10 ⁇ L) and one UV-irradiated sample in the presence of primulin (10 ⁇ L) were used, and the amount corresponding to 1/200 of them was subjected to SDS-PAGE electrophoresis as in Experimental Example 1.
  • detected PrPres by Western blot The remaining whole amount was subjected to SDS-PAGE electrophoresis, and the acrylamide gel was silver-stained according to the instruction of the protein silver staining kit [(Silver Stain II kit Wako) Wako].
  • FIG. 8 shows the results of cross-linking reaction by UV treatment in the presence of primulin on prion-infected mouse brain samples. Due to UV treatment in the presence of primulin, formation of aberrant prion protein crosslinking reaction was observed also in mouse-infected brain samples. This result indicates that abnormal prion protein crosslinking reaction can occur regardless of the origin of the biological material. On the other hand, as shown in FIG. 9, since no noticeable band fluctuation is observed in silver staining, the contaminating proteins in the crudely purified fraction form a crosslink reaction product unfavorably to UV treatment in the presence of primulin. It turns out that it has not occurred.
  • ⁇ Method ⁇ Cell lysates of N167 prion persistently infected cells were obtained according to Experimental Example 2, and 125 ⁇ L of each was added to 9 tubes to obtain A, B, C, D, E, F, G, H, and I.
  • the compounds shown below were added to tubes B to I to a final concentration of 50 ⁇ M.
  • the lysis solution was added to the tube A in the same amount as the other tubes.
  • the compounds added are primulin, riboflavin, indocyanine green, Evans blue, methyl violet, sudan black, fluorescein, congo red for tubes B, C, D, E, F, G, H, I.
  • the tubes A to I were subjected to UV irradiation for 15 minutes at a distance of 7 cm. Thereafter, PK treatment, SDS-PAGE sample preparation, and deglycosylation treatment were performed according to Experimental Example 3, and PrPres was detected according to Experimental Example 1.
  • FIG. 13 The chemical structural formula of the compound used in FIG. 12 is shown in FIG. 13, and the experimental results of the abnormal prion protein crosslinking reaction by UV irradiation in the presence of the compound are shown.
  • Experimental Example 7 representative compounds in which light is involved in the reaction were selected. Lanes 1 to 12 in FIG. 13 correspond to tubes 1 to 12 in [Method]. Similar to the experimental examples so far, the abnormal prion protein crosslinking action by UV irradiation is shown in the comparison of lanes 1 and 2, and in the comparison of lanes 3 and 4, primulin sensitization of the abnormal prion protein crosslink reaction It has been shown to act as an agent. Luciferin and methylene blue were characteristic of the newly investigated compounds.
  • Experimental Example 8 As a result of examining the effect of methylene blue found in Experimental Example 7, it was shown that methylene blue concentration up to about several ⁇ M to about 150 ⁇ M is suitable for the abnormal prion protein crosslinking reaction by addition.
  • ⁇ Method ⁇ Cell lysates of N167 prion persistently infected cells were obtained according to Experimental Example 2, and 160 ⁇ L of each was added to eight tubes to obtain 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
  • the concentration of methylene blue added is 0 ⁇ M for Tube 1 and 300, 150, 75, 38, 19, 9.5 and 4.8 ⁇ M for Tubes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 respectively.
  • PK treatment and SDS-PAGE sample preparation were performed to detect PrPres.
  • FIG. 14 shows the concentration dependency of the abnormal prion protein crosslinking reaction using methylene blue N167 cell lysate.
  • Lanes 1 to 12 in FIG. 14 correspond to tubes 1 to 12 in [Method].
  • the intensity of the band indicating the dimer is the strongest in lanes 5 to 8, and the band intensity of the dimer decreases as the methylene blue concentration increases, but the band corresponding to the trimer is more clearly shown in lane 3 It was recognized in ⁇ 5.
  • Lane 2 where the methylene blue concentration was 300 ⁇ M, all the band intensities of the monomer and multimer decreased.
  • a cell lysate of N167 prion persistently infected cells was obtained according to Experimental Example 2, and 500 ⁇ L each was dispensed into eight tubes. Add 0.05 mg, 0.5 mg, and 5 mg of ammonium persulfate to tubes 2 and 6, 3 and 7, 4 and 8, respectively, and add N, N, N ', N'- to tubes 6, 7, and 8, respectively. 0.01 ⁇ L, 0.1 ⁇ L and 1 ⁇ L of tetramethylethylenediamine were respectively added. After reaction at 37 ° C.
  • each tube sample was divided into half for PK treatment and for non-treatment, PK treatment for PK treatment according to Experimental Example 3, SDS-PAGE sample preparation, deglycosylation according to Experimental Example 3 Chain processing was performed.
  • PK treatment was not performed, and SDS-PAGE sample preparation and deglycosylation treatment were performed according to Experimental Example 3 except for the PK treatment step.
  • Detection of PrPres was performed according to Experimental Example 1 for all the samples.
  • FIG. 15 shows the effect on the abnormal prion protein to which ammonium persulfate is added, with or without PK treatment.
  • Samples 1 to 4 correspond to tubes 1 to 4 in [Method].
  • lane 3 which is a sample containing 0.5 mg of ammonium persulfate, a signal of dimer size due to remarkable abnormal prion protein cross linking was observed.
  • FIG. 16 shows the effect on the abnormal prion protein to which ammonium persulfate and N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine were added, with or without PK treatment.
  • Samples 5-8 correspond to tubes 5-8 of [Method]. As in FIG.
  • the final concentrations for tubes B and G, tubes C and H, tubes D and I, and tubes E and J are 0.5, 2, 10 and 20 ⁇ M, respectively.
  • the lysis solution was added to tubes A and F in the same amount as the other tubes. After the addition, tubes A to J were placed at a distance of 10 cm for UV irradiation for 30 minutes.
  • PK treatment was performed according to Experimental Example 3
  • SDS-PAGE sample preparation was performed, and after deglycosylation, PrPres was detected according to Experimental Example 1.
  • Compound B (comp B) and doxycycline (DOX) are compounds that have been known to show anti-prion activity so far.
  • Compound B is described in [Kawagoe K, Motoki K, Odagiri T, et al. Hydrazone derivative. WIPO Publication No. WO / 2004/087641, October 14, 2004] with respect to manufacture [Kawasaki Y, Kawagoe K, Chen C, et al. Journal of Virology, 2007, 81, 12889-12898.
  • [Page] it is shown that cells and animals exert their anti-prion activity by inhibiting the structural conversion from normal prion protein to aberrant prion protein.
  • two anti-prion compounds can influence the results of abnormal prion protein crosslinking reaction by UV irradiation, and the difference in their actions between compound B and doxycycline is the abnormal prion protein crosslinking reaction. It was shown to be reflected in the result. Therefore, it is possible to classify a compound known as an anti-prion compound and deduce the mechanism of action, using the difference in the influence on the abnormal prion protein cross-linking reaction as an index. The results of this experiment show that the abnormal prion protein crosslink reaction system can be used as a simple in vitro selection system for anti-prion candidate compounds.
  • FIG. 18 shows the results of examining the effect of urea solution on the abnormal prion protein crosslinking reaction product.
  • Lanes 1 to 5 in FIG. 18 correspond to tubes A to E in [Method].
  • the signal intensity of the overall PrPres band in each lane was attenuated by the presence of urea, but the degree of attenuation was not dependent on the concentration of urea.
  • the ratio of the signal intensity of the monomer band to the dimer band is constant over lanes 1-5. That is, the dissociation of the multimer into the monomer was not observed even by the addition of the urea solution.
  • the abnormal prion protein crosslinking reaction occurs in a contaminating system called prion persistently infected cell lysate and in the presence of a considerable surfactant in the lysate, under the experimental conditions described in the cited literature. It is largely different, reflecting the structural features of the abnormally aggregated protein and the specificity of the reaction.
  • a cell lysate of N167 prion persistently infected cells is obtained according to Experimental Example 2, 180 ⁇ L each is added to 16 tubes, primulin is added to a final concentration of 10 ⁇ M, A, B, C, D, E, F , G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, tubes B, C, D, F, G, H with EDTA added lysis solution, tubes J, K, L, N, O , P, to which a copper sulfate addition lysis solution was added.
  • the final concentrations for tubes B and F, tubes C and G, and tubes D and H are 5000, 1000 and 200 ⁇ M, tubes J and N, tubes K and O, and tubes L and P are 1000, 200 and 50 ⁇ M, respectively. is there.
  • the lysis solution was added to tubes A, E, I and M in the same amount as the other tubes.
  • tubes E, F, G, H, M, N, O, P 2 were subjected to UV irradiation for 15 minutes at a distance of 7 cm. Meanwhile, tubes A, B, C, D, I, J, K, L were stored in a cool and dark place.
  • PK treatment was performed according to Experimental Example 1 to prepare a sample of SDS-PAGE, and detection of PrPres was performed.
  • FIG. 19 shows the results of investigation of abnormal prion protein crosslinking reaction by UV irradiation when EDTA or copper ion is added.
  • Lanes 1 to 16 in FIG. 19 correspond to tubes A to P in [Method]. EDTA did not affect the reaction in the comparison in lanes 1-4 and lanes 5-8. On the other hand, in the comparison of lanes 9 to 12 and lanes 13 to 16, a decrease in the signal intensity of the monomer band of abnormal prion protein is observed by addition of copper ions, and abnormal prion protein crosslink reaction is suppressed It was done. Therefore, it is possible that the 51st to 91st amino acid sequences are indirectly involved in the efficiency of the abnormal prion protein crosslinking reaction.
  • reagents such as copper ion and EDTA can not be used because they cause cell damage, but evaluation in the experimental system using cell lysate as in this experimental example is abnormal It is useful in evaluating reagents that act on prion proteins.
  • a cell lysate of N167 prion persistently infected cells is obtained according to Experimental Example 2, 180 ⁇ L each is added to 16 tubes, primulin is added to a final concentration of 10 ⁇ M, A, B, C, D, E, F , G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, tubes B, C, D for valine, tubes F, G, H for tyrosine, tubes J, K, L for histidine, tubes Tryptophan was added to N, O and P.
  • the final concentrations of each of tubes B, F, J and N, tubes C, G, K and O, and tubes D, H, L and P are 100, 20 and 5 mM, respectively.
  • the lysis solution was added to tubes A, E, I and M in the same amount as the other tubes. After the addition, the tubes A to P were placed at a distance of 7 cm and subjected to UV irradiation for 15 minutes. After the reaction, PK treatment was performed according to Experimental Example 1 to prepare a sample of SDS-PAGE, and detection of PrPres was performed.
  • FIG. 20 shows the results of abnormal prion protein crosslink reaction under the conditions in which valine, tyrosine, histidine, and tryptophan coexist and the amino acid concentration is changed. No inhibitory effect was observed on the abnormal prion protein crosslink reaction for any amino acid. This can be said to be a natural result in view of the abnormal prion protein cross-linking reaction occurring specifically in the contaminating system. From the results in this experimental example, it is inferred that the crosslinks in the abnormal prion protein are formed in portions where the abnormal prion proteins that are substrates are temporally stable and located in the vicinity of an extreme.
  • PrPres signal was carried out using 1E4, 3C10, 6D11, 6H4, SAF70, SAF83, M20 as primary antibodies for lanes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 respectively, and thereafter with experimental example 1 I did the same.
  • M20 used anti-goat IgG as a secondary antibody and the rest used anti-mouse IgG.
  • FIG. 21 shows the results of detection of PrPres using various primary antibodies. In the detection using 1E4 and 3C10, the dimer signal detection rate was significantly lower than in the case of using the other five antibodies.
  • FIG. 22 is a graph in which the ratio of the dimer signal intensity to the monomer signal intensity is determined for the result of FIG. 21 and the ratio is shown on the vertical axis. It is clear that the detection using 1E4 and 3C10 has a significantly lower dimer signal detection rate than using the other five antibodies.
  • the position of the epitope on the prion protein that each antibody recognizes is shown in FIG. In both 1E4 and 3C10, the epitope is located in a very narrow region around amino acid residue # 110, and from these results, it is shown that the cross linking reaction in the abnormal prion protein is related to amino acid residue # 110 Indicated.
  • This region is a reactive phase in which abnormal prion proteins interact with each other according to the abnormal prion protein model (BH4 model) (Structure, 2014, Vol. 22, No. 4, 560-571) of Shirai et al. And 3 are indicated, and it is not contradicted that cross-linking reaction by UV irradiation occurs in this region.
  • BH4 model abnormal prion protein model
  • ⁇ result ⁇ Glutaraldehyde is a compound having two aldehyde groups in a molecule widely used for fixation of tissues and the like.
  • a general cross-linking agent in a contaminating system such as a cell lysate, it was examined how the detection of prion protein and ⁇ -actin showed.
  • Lanes 1 to 6 in FIG. 24, FIG. 25 and FIG. 26 correspond to tubes A to F in [Method], respectively.
  • FIGS. 24, 25 and 26 show the detection of PrPres, total prion protein without PK treatment, and ⁇ -actin, respectively.
  • PrPres shown as a 17 kDa band in FIG. 24 and the fragmented abnormal prion protein shown as a 17 kDa band in FIG. 25 are detected in the presence of glutaraldehyde as shown in each of lanes 5 and 6 The efficiency has dropped significantly.
  • the aberrant and normal full-length prion protein shown as a 23 kDa band in FIG. 25 has a reduced detection sensitivity in the presence of a low concentration of glutaraldehyde.
  • bands corresponding to dimers and trimers of abnormal prion protein are not detected in lanes 3 to 6 of FIGS. 24 and 25.
  • ⁇ -actin is known as a protein that polymerizes and depolymerizes in cells, but multimeric bands are not detected in lanes 3 to 6 in FIG. Detection efficiency is decreasing. As shown in lanes 5 and 6, a low concentration of glutaraldehyde detects a monomer signal to the extent that no glutaraldehyde is added as shown in lanes 1 and 2. Therefore, it is impossible to specifically crosslink the abnormal prion protein by means of a general bivalent reactive crosslinker.
  • a cell lysate of N167 prion persistently infected cells is obtained according to Experimental Example 2, and each 1 mL of the solution is put into 12 tubes, 6 of which are 1,3-bis (3, 4-dimethoxyphenyl) propane-1,3-dione was added to a final concentration of 20 ⁇ M, and UV irradiation was performed for 80 minutes at a distance of 10 cm. The remaining six were stored in a cool and dark place. After completion of the reaction, 12 tubes were subjected to PK treatment according to Experimental Example 1 to prepare SDS-PAGE samples as follows.
  • the pellet after centrifugation of the cell lysate was dissolved in 15 ⁇ L of SDS-PAGE sample buffer, and heat denaturation was applied at 95 ° C. for 5 minutes.
  • Six UV-irradiated samples and six tubes stored in a cold and dark place were combined into one tube each to give a solution of 90 ⁇ L each.
  • 60 ⁇ L of water was added to each sample, and to the stirred solution, 150 ⁇ L of chloroform, 600 ⁇ L of methanol, and 450 ⁇ L of water were sequentially added in this order, and centrifuged at 6000 ⁇ g for 10 minutes.
  • the upper aqueous layer was removed, and 450 ⁇ L of methanol was added thereto to carry out centrifugation in the same manner, and then the upper organic layer was removed to obtain a proteinaceous precipitate.
  • the precipitate was washed with 450 ⁇ L of methanol, similarly centrifuged, and the upper layer was discarded.
  • the process of obtaining protein precipitate from the above protein aqueous solution is called chloroform-methanol precipitation.
  • the washed precipitate was air-dried, 20 ⁇ L of 8 M aqueous solution of guanidine thiocyanate was added to the residue, and reacted at 60 ° C. for 1 hour.
  • the SDS-PAGE sample buffer contains the strong detergent sodium dodecyl sulfate.
  • guanidine thiocyanate is known to be a strong denaturant of proteins.
  • lane 1 is the cross-linked untreated sample
  • lane 2 is the cross-linked treated with UV irradiation in the presence of 1,3-bis (3,4-dimethoxyphenyl) propane-1,3-dione.
  • a sample is shown. From this result, it was shown that the crosslink reaction product of abnormal prion protein is not affected even in a series of protein denaturation treatment and denaturant removal treatment.
  • the right side of the figure shows the densitometry of the band signal of lane 2, but from this data, it is possible that the monomer and the dimer are generated at a concentration ratio of 7: 3 under the reaction conditions of this experimental example. Indicated.
  • Experimental Example 17 By administering the sample obtained in Experimental Example 16 to inactivation of prion activity leading to death of the mouse without cleaving the crosslinker, it is verified that the inactivation of prion activity is indeed sufficient. Do.
  • a sample obtained by performing denaturation treatment and desalting treatment after the crosslinking reaction corresponds to 150 cm 2 of N167 prion persistently infected cells. This was suspended in 500 ⁇ L of PBS, and 20 ⁇ L each was administered into the brain of Tga20 mice.
  • a sample obtained by suspending a protein obtained from a cell lysate corresponding to 25 cm 2 of N167 prion persistently infected cells in 500 ⁇ L of PBS was prepared, and 20 ⁇ L each was administered into the brain of Tga20 mice. Both groups were then reared as usual and assessed for prion activity with the survival time from the day of dosing to the death of the mice.
  • FIG. 28 shows the survival rate of each group on the vertical axis, and the number of days after administration of each sample on the horizontal axis.
  • the solid line is a group of mice that received the inactivated sample after the crosslink reaction
  • the dotted line is a group of mice that received the non-inactivated prion sample as a control.
  • the mice receiving the prion sample died about 93 days after administration, whereas the mice receiving the inactivated sample did not appear to die after more than 200 days after administration . From the above, it was judged that the protein was sufficiently inactivated, and the feeding was discontinued 206 days after administration.
  • E. coli recombinant prion protein do not have the activity of "prion" which invades the brain of a mouse individual and leads to death. In addition, it does not infect cells and induce the production of proteolytic enzyme partially resistant prion protein.
  • the prion protein is given a sugar chain and a lipid called glycosyl phosphate inositol after translation to become a mature body.
  • E. coli recombinant proteins do not receive such chemical modifications.
  • a DNA sequence corresponding to amino acids 89 to 231 of mouse prion protein was incorporated into a protein expression plasmid vector using a commonly known method. Plasmid DNA was prepared and introduced into E. coli for protein expression by transformation, and the E. coli was cultured to induce expression. The expressed protein was obtained as an inclusion body in E. coli. The recovered E. coli was disrupted in [300 mM sodium chloride, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5] (hereinafter buffer H), and centrifuged to obtain a precipitate containing the target protein. The precipitate was suspended in PBS and recovered by centrifugation again.
  • buffer H [300 mM sodium chloride, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5]
  • the obtained dry powdered mouse prion protein (89-231) was dissolved in a small amount of 6 M aqueous urea solution and diluted with a 100-fold volume of lysis solution. Under these conditions, the protein gradually begins to aggregate and precipitate and can be visually confirmed.
  • This diluted solution is used as a reaction raw material, and after standing at room temperature for 2 days, the same test product subjected to UV irradiation treatment in the presence of primulin as in Example 1, and UV irradiation treatment in the presence of primulin simultaneously with dilution Prepared the test item that you did.
  • FIG. 29 shows the results of examining the multimerization reaction efficiency of the sample reacted at a time of 2 days after dilution and the sample reacted immediately after dilution.
  • One lane of A is a Coomassie brilliant blue stained image after SDS-PAGE of a mouse prion protein (89-231) sample reacted for two days from dilution.
  • Lane 1 of B is a silver stained image after SDS-PAGE of a mouse prion protein (89-231) sample reacted immediately after dilution. It can be seen that when the reaction is carried out immediately after dilution, clear multimers are formed.
  • C is a silver stained image after SDS-PAGE of a sample (lane 1) which has not been subjected to a reaction treatment of E. coli recombinant mouse prion protein (23-231) and a sample (lane 2) which has been subjected to reaction treatment.
  • ABC m lanes are molecular weight markers.
  • mouse prion protein (89-231) no clear multimer was detected in mouse prion protein (23-231).
  • Mouse prion protein (89-231) is considered to be more easily aggregated than mouse prion protein (23-231), and the efficiency of the crosslink reaction was good.
  • mouse prion protein (89-231) proceeds to form a precipitate that is visibly large, and crosslink reaction occurs when mouse prion protein (89-231) is separated from the uniform aqueous phase as a solid phase. It can be interpreted that does not occur.
  • a dry powder of mouse prion protein (89-231) was obtained which contains crosslink multimers in an amount capable of inoculating experiments in mice as an antigen.
  • Experimental Example 19 It was verified whether the sample obtained in Experimental Example 18 actually functions as a vaccine for prion and can induce anti-prion activity in a mouse individual. It was shown that the accumulation of abnormal prion protein can be suppressed by administering a mouse prion protein (89-231) containing crosslink multimers after denaturation treatment.
  • FIG. 30 shows the results of Western blotting of abnormal prion protein.
  • A is a negative control that has not been vaccinated or prion-infected
  • B is a mouse that has been prion-infected after vaccination
  • C is a positive control that has been infected with prion without vaccination.
  • a strong signal of abnormal prion protein was observed only in the positive control of C.
  • the signals shown by the rice marks in the figure are nonspecific reactions.
  • the signal intensity of the band corresponding to the abnormal prion protein is represented by a bar graph in FIG. As can be seen from FIGS. 30 and 31, vaccinated B had acquired resistance to prion infection.
  • Amyloid A is an abnormal protein that deposits on systemic organs in AA amyloidosis. It has been shown that in a mouse vaccinated with an inactivated amyloid A crosslinking product prepared from an organ containing amyloid A as an antigen, the onset of AA amyloidosis can be suppressed.
  • amyloid A For detection of amyloid A, a goat polyclonal antibody against mouse serum amyloid A1 (manufactured by R & D, 2000-fold dilution) and an alkaline phosphatase conjugate donkey anti-goat immunoglobulin antibody (manufactured by Promega, 20000-fold dilution) were used.
  • the cross-linked sample was centrifuged (40,000 ⁇ g, 20 minutes) to discard the supernatant, and the precipitate was suspended by adding saline. After repeating this 10 times of centrifugation (40,000 ⁇ g, 20 minutes) and washing the precipitate, the obtained precipitate is suspended in water and centrifuged (30000 ⁇ g, 60 minutes) and then suspended. Qing was discarded.
  • the inactivated amyloid A crosslink reaction was mixed with Freund's complete adjuvant (manufactured by Difco Laboratories) as an antigen to inoculate 0.1 mg of protein per rat subcutaneously on the back of Balb / c mice. Twenty-one days after the initial inoculation, the same sample was mixed with Freund's incomplete adjuvant (manufactured by Difco Laboratories) to boost the back subcutaneous with 0.1 mg of protein per animal.
  • FIG. 32 shows the results of cross-linking reaction by UV treatment in the presence of primulin on mouse organ homogenates containing amyloid A. By UV treatment in the presence of primulin, the formation of an amyloid A crosslinking reaction was observed. Next, the effect of vaccination is shown in FIG.
  • mice inoculated with the inactivated amyloid A crosslink reaction no amyloid accumulation was observed even when AA amyloidosis was induced. That is, vaccination with the inactivated amyloid A crosslink reagent as an antigen suppressed amyloid deposition on organs caused by experimental AA amyloidosis induction. Since the yellow-green birefringence image is not clear in black and white figures, the results of qualitatively showing amyloid accumulation are summarized in the table in FIG.

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Abstract

コンフォメーション病の予防又は治療剤、及びコンフォメーション病医薬のスクリーニング方法を提供する。　コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質が、クロスリンクされた不活化オリゴマータンパク質を用いることで、コンフォメーション病の予防又は治療が可能となり、該不活化オリゴマータンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、コンフォメーション病の予防又は治療のための医薬組成物が提供される。

Description

コンフォメーション病の予防又は治療剤、及びコンフォメーション病医薬のスクリーニング方法
　本発明は、コンフォメーション病の予防又は治療剤、及びコンフォメーション病医薬のスクリーニング方法に関する。
　コンフォメーション病あるいはタンパク質コンフォメーション病は、特定の宿主タンパク質についてその立体構造（コンフォメーション）が変化されて難溶性となって細胞や組織や臓器に蓄積し病的状態をもたらす疾患群であり、各種疾患例が報告されている（非特許文献１～３参照）。これには、アルツハイマー病、び慢性レビー小体病、プリオン病、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症に代表される神経難病が含まれる。
　コンフォメーション病では、特定のタンパク質が本来のコンフォメーションとは異なるβシート構造と呼ばれる構造成分に富むコンフォメーションをとって難分解性となる。コンフォメーション病のうちこのような異常なコンフォメーションをとったタンパク質が細胞外の組織に蓄積して難溶性物質（アミロイド）を形成する疾患群はアミロイドーシスと呼ばれる。
　一方、このような異常なコンフォメーションをとったタンパク質が細胞内に蓄積して「インクルージョンボディ（封入体）」と呼ばれる難溶性物質を形成する疾患群もある。前者には、家族性アミロイドポリニューロパチー、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、老人性アミロイドーシス等の各種アミロイドーシスの疾患が含まれ、後者にはポリグルタミン病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、び慢性レビー小体病、ハンチントン病、ピック病、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、前頭側頭型痴呆などが含まれる。また、どちらにも見られるものとしてはアルツハイマー病やプリオン病などがある。
　これらのコンフォメーション病の原因タンパク質は疾患によって異なり、タンパク質の一次構造上の共通点は無いものの、コンフォメーションの異常化のメカニズムや異常化タンパク質の沈着を促進するメカニズムには共通点があると考えられており、コンフォメーション病全般あるいは複数のコンフォメーション病に共通した治療化合物の開発が可能である（非特許文献４～５参照）。実際に、これまでにアルツハイマー病、アミロイドーシス全般、プリオン病に共通する薬効を示すことが期待される薬物開発の報告が多数ある（例えば、非特許文献６～９参照）。しかし、これらコンフォメーション病については、原因及びその作用機構が徐々に解明されつつあるが、現在まで予防及び治療に決定的に有効な医薬品は見出されていない。
　コンフォメーション病では、タンパク質の難溶凝集体化の阻害や難溶凝集体の排除が共通の創薬標的である。コンフォメーション病の中でも研究が進んでいるアルツハイマー病では凝集性アミロイドβや凝集性タウ蛋白に対する抗体を患者に投与する受動免疫療法の開発が盛んであり、一部では有望な結果が報告されている（非特許文献１０～１１参照）。しかし、それぞれのコンフォメーション病には、それぞれの凝集性タンパク質に最適化された抗体が選抜される必要があり、もともと難溶性である凝集体タンパク質は非自己として認識されないため、凝集体タンパク質だけを認識する特異抗体を作成することは極めて困難であり、ましてや様々な難溶凝集性タンパク質を対象にした汎用的な開発手段は開発されていない。
　一方、能動免疫療法では抗原となるタンパク質をどのように調製するのか、タンパク質のどの領域を認識させるのか等、安全で効果的な抗体産生を誘導させる工夫が課題となっている。これらの課題を克服するためにＤＮＡワクチン、粘膜免疫などが開発されているが、かならずしも毒性凝集体の形成を特異的に阻害しているわけではない。すなわち、凝集体タンパク質だけを認識するわけではなく、本来は凝集体タンパク質も自己のタンパク質で構成されているため免疫寛容であるべき凝集体化していない正常なタンパク質も認識する。また、多量体化凝集体の形成は阻害しても、毒性の強いオリゴマー凝集体の形成は阻害できないことも知られている（非特許文献１２参照）。
　さらに、難溶凝集体の化学構造については、様々なモデルが提唱されているものの、その難溶性という物性から正確な化学構造は解明されていない（例えば、非特許文献１３参照）。そのため、化学構造に基づくインシリコでのドラッグデザインも不可能な状況である。
　ここで、異常凝集タンパク質が起こす疾患の代表として知られているプリオン病についてより詳細に説明すると、プリオン病はプリオンにより中枢神経が侵される疾患であり、プリオンの本体は異常凝集したプリオン蛋白質であることが判明しており、異常凝集プリオン蛋白質は異常型プリオン蛋白質と呼ばれている。今日、他のコンフォメーション病で出現する難溶凝集性タンパク質も、プリオン病の異常型プリオン蛋白質と同様な挙動（すなわち、疾患伝播性）を示すことが証明されており、プリオンと同様なものと考えられている。アルツハイマー病の免疫療法について前記したが、プリオン病でもプリオン蛋白質に対する免疫療法において、若干の効果が複数の論文で報告されている（非特許文献１４）。しかし、いずれも正常型プリオン蛋白質を標的としており異常型プリオン蛋白質の阻害を標的としているものはない。したがって、前記したように難溶凝集性タンパク質を標的としたプリオン病の予防及び／又は治療薬の開発は、コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬の開発にも通じている。
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　本発明の目的は、上記のような背景に鑑み、コンフォメーション病の予防又は治療剤、及びコンフォメーション病医薬のスクリーニング方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく研究をすすめ、コンフォメーション病を引き起こす異常型のタンパク質は、凝集化する過程で、相互にクロスリンクされてオリゴマータンパク質となるとの知見を得た。そして、当該オリゴマータンパク質を不活化させて抗原として用いることで、能動免疫が可能となることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明の一形態は、コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質がクロスリンクされた不活化オリゴマータンパク質である。
　また、本発明の別の形態は、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質を準備する準備ステップ、前記異常型タンパク質にクロスリンク処理を施し、オリゴマーを形成させるクロスリンクステップ、クロスリンクされたオリゴマータンパク質を回収する回収ステップ、及び回収されたオリゴマータンパク質を不活化処理する処理ステップ、を含む不活化オリゴマータンパク質の製造方法である。
　また、本発明の別の形態は、上記不活化オリゴマータンパク質からなる、コンフォメーション病の予防又は治療剤であり、該治療剤と薬学的に許容される担体とを含む、コンフォメーション病の予防又は治療のための医薬組成物である。
　また、本発明の別の形態は、コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質がクロスリンクされたオリゴマータンパク質に、候補化合物を接触させる接触ステップ、及び前記候補化合物を接触させたオリゴマータンパク質の活性及び／若しくは構造を測定する測定ステップ、を含む、コンフォメーション病医薬のスクリーニング方法、又は、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質に、候補化合物を接触させる接触ステップ、該異常型タンパク質にクロスリンク処理を施し、オリゴマーを形成させるクロスリンクステップ、及びクロスリンクさせたオリゴマータンパク質の活性及び／若しくは構造を測定する測定ステップ、を含む、コンフォメーション病医薬のスクリーニング方法である。
　本発明により、コンフォメーション病の予防又は治療剤として使用できる不活化オリゴマータンパク質を提供することができ、当該不活化オリゴマータンパク質はコンフォメーション病の抗原として能動免疫に活用され得るとともに、コンフォメーション病の進行を改善することができる。
　また、当該オリゴマータンパク質は、異常型タンパク質のインターフェースにてクロスリンクされており、当該インターフェースを特異的に認識する抗体を製造するために活用され得る。
　更に、当該オリゴマータンパク質に、コンフォメーション病医薬の候補化合物を接触させ、オリゴマータンパク質の活性の変化を測定することで、あるいは、異常型タンパク質にコンフォメーション病医薬の候補化合物を接触させ、当該オリゴマータンパク質の形成活性の変化を測定することで、コンフォメーション病医薬のスクリーニングが可能となり得る。
プリムリンの化学構造式を示す図である。 プリオン持続感染細胞の細胞溶解液にプリムリンを添加した場合におけるプリムリンによる異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の作用対象とプリオン株の違いについて試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１）。 プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を用いてプリムリンによる異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の作用時間依存性について試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例２）。 実験例２において、プリムリン存在下で生成された異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物の量を縦軸、反応時間を横軸としてプロットしたグラフである。 プリムリン存在下で培養したプリオン持続感染細胞の細胞溶解液を用いた異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応のＵＶ照射時間依存性について評価した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例３）。 プリオン非感染細胞の細胞溶解液を用いてプリムリン存在下ＵＶ照射による正常型プリオン蛋白質に対する効果を試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例４）。 プリオン非感染細胞の細胞溶解液を用いてプリムリン存在下ＵＶ照射によるβアクチンに対する効果を試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例４）。 脳抽出溶液を用いたプリムリン存在下でのＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の試験結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例５）。 実験例５の試験結果において脳抽出溶液中の全タンパク質の電気泳動像の銀染色の図面代用写真である。 実験例６の試験に用いた化合物の化学構造式を示す図である。 各化合物混在下でのＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の試験結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例６）。 実験例７の試験に用いた化合物の化学構造式を示す図である。 各化合物混在下でのＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の試験結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例７）。 実験例７において発見されたメチレンブルーの効果について検証した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例８）。 過硫酸アンモニウムによる異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の試験結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例９）。 過硫酸アンモニウム及びN，N，N´，N´－テトラメチルエチレンジアミンによる異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の試験結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例９）。 抗プリオン活性を示すことが知られているコンパウンドＢ（ｃｏｍｐＢ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）について、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応への効果を試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真、並びにウエスタンブロットにおけるクロスリンク反応物（二量体）に相当するシグナル強度を縦軸に、抗プリオン化合物の細胞溶解液への添加終濃度を横軸にプロットしたグラフである（実験例１０）。 生成した異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物に対する尿素溶液の効果について試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１１）。 ＥＤＴＡあるいは銅イオンを添加した際のＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応について試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１２）。 バリン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを共存させ、それらアミノ酸濃度を変化させた条件下における異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１３）。 プリムリン存在下ＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物を各種抗プリオン蛋白質抗体で検出した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１４）。 図２１の結果について、異常型タンパク質の単量体シグナルに対するクロスリンク反応物（二量体）シグナルの強度比率を抗体別に示したグラフである。 実験例１４で用いた抗プリオン蛋白質抗体のプリオン蛋白質上のエピトープの位置を示す図である。 一般的な二価架橋剤であるグルタルアルデヒドを用いてプリオン感染細胞溶解液でクロスリンクを行った時の、異常型タンパク質を検出した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１５）。 図２４の場合と同様、ＰＫ処理なしの総プリオン蛋白質を検出した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１５）。 図２４の場合と同様、βアクチンを検出した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１５）。 異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物を、強力なタンパク質変性処理を行った後に精製したものの電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１６）。 実験例１６で不活化した異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物のプリオン活性をマウスによるバイオアッセイで示したグラフである（実験例１７）。 擬似異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物として遺伝子組換えタンパク質を検討した結果を示す電気泳動像のタンパク質染色の図面代用写真である（実験例１８）。 不活化した擬似異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物をワクチン接種し、プリオンを腹腔感染させたマウスの脾臓中の異常型プリオン蛋白質を検出した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例１９）。 図３０の異常型プリオン蛋白質シグナルを定量化したグラフである。 ＡＡアミロイドーシスをおこす異常型タンパク質であるアミロイドＡを含む組織溶解液を用いて、プリムリン存在下ＵＶ照射によるアミロイドＡに対する効果を試験した結果を示す電気泳動像のウエスタンブロットの図面代用写真である（実験例２０）。 不活化したアミロイドＡクロスリンク反応物をワクチン接種し、ＡＡアミロイドーシスを誘導したマウスの脾臓と肝臓の組織中のアミロイドをコンゴ―レッド染色し偏光顕微鏡下で検出した結果を示す組織の図面代用写真である（実験例２０）。 図３３の結果をまとめた表である。
　以下、本発明について詳細に説明するが、本発明は説明に用いた具体的な形態のみに限定されるものではない。
　本発明の一実施形態は、コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質がクロスリンクされた、不活化オリゴマータンパク質である。
　本発明者らは、コンフォメーション病に関して、プリオン病を例として異常タンパク質の凝集に着目し研究を進めたところ、特定の化合物などでプリオン病感染細胞を処理することで、異常型プリオン蛋白質がクロスリンクされた２量体、３量体、４量体などのオリゴマー形成が促進されることを見出した。一方で、正常型プリオン蛋白質では、クロスリンクの促進は生じなかった。また、当該現象は、プリオン感染細胞のみならず、セルライセートや、個体におけるプリオン感染組織の抽出液でも生じた。
　本発明者らは、当該クロスリンクの位置を特定すべく更に研究を進めたところ、異常型プリオン蛋白質構造モデル（非特許文献１３）で示されるインターフェースと合致することに想到した。本発明はこのような知見に基づいてなされたものである。
　なお、本明細書において「クロスリンク」とは、化学反応において官能基同士が反応して結びつく「架橋」とは概念が異なるものである。本明細書において「クロスリンク」とは、後述するクロスリンク剤により、コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質が多量体を形成するものである。
　コンフォメーション病は、特定の宿主タンパク質についてその立体構造（コンフォメーション）が変化されて難溶性となって細胞や組織や臓器に蓄積し病的状態をもたらす疾患である。典型的には、アルツハイマー病、び慢性レビー小体病、プリオン病、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症に代表される神経難病や家族性アミロイドポリニューロパチー、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、老人性アミロイドーシスなどのアミロイドーシスが含まれる。
　異常型タンパク質のクロスリンクは、例えば以下の化合物を添加することで生じる。
　プリムリン、コンゴーレッド、メチレンブルー、ルシフェリン、１，３－ｂｉｓ（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ－１,３－ｄｉｏｎｅ、チオフラビンＴ、コンパウンドＢなどの色素系・発光系化合物、過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミンなどのラジカル発生剤、など。
　更には紫外線の照射によっても、クロスリンクが生じる。
　これらのものを１種又は２種以上組み合わせて使用することで、異常型タンパク質のクロスリンクを生じさせることができる。
　クロスリンクを生じさせる化合物の添加量は、化合物の種類、コンフォメーション病の種類、用いる材料やその処理方法などにより適宜設定できる。一例をあげると、プリオン病の異常型タンパク質をクロスリンクするためにプリムリンを使用する場合、０．５μＭ～５０μＭ添加することが好ましい。
　本実施形態のオリゴマータンパク質は、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質が、クロスリンクされて多量体を形成するものである。オリゴマーは典型的には２量体であり、３量体であってよく、４量体であってよく、５量体であってよく、６量体であってよいが、その多くは２量体あるいは３量体である。
　本実施形態のオリゴマータンパク質を形成する単量体の残基数は特に限定されないが、ハンドリングの容易性及び分子デザインの容易性から、クロスリンク部位を含みかつクロスリンク部位以外のアミノ酸を多く含まないフラグメントであることが好ましい。そのため、後述する酵素処理により断片化されていてもよい。
　単量体の残基数はクロスリンク部位を含むものであれば特段限定されないが、５以上であってよく、８以上であってよく、１０以上であってよい。また、２５以下であってよく、２０以下であってよく、１５以下であってよい。
　本実施形態のオリゴマータンパク質の分子量は特に限定されないが、１０００以上であってよく、１５００以上であってよく、２０００以上であってよく、また５０００以下であってよく、４０００以下であってよく、３０００以下であってよい。
　本実施形態のオリゴマータンパク質のクロスリンク部位は、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質のインターフェースで生じる。コンフォメーション病を引き起こす異常型蛋白質の構造は未だ不明確な部分もあるものの、例えば異常プリオンタンパク質の構造モデルが提唱されているなど、明らかになりつつある（非特許文献１３）。本発明者らの実験では、異常プリオン蛋白質のクロスリンク部位が、当該構造モデルにおけるインターフェース２又はインターフェース３に相当することが確認された。また、異常型プリオン蛋白質の場合には、アミノ酸残基１１０番近傍が関係している。ここでいう近傍は±５残基であり、±３残基であってよく、±２残基であってよく、±１残基であってよい。
　コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質が、クロスリンクされたオリゴマータンパク質の製造方法を以下に示す。当該製造方法は本発明の別の実施形態である。
　本実施形態に係る製造方法は、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質を準備する準備ステップ、前記異常型タンパク質にクロスリンク処理を施し、オリゴマーを形成させるクロスリンクステップ、及びクロスリンクされたオリゴマータンパク質を回収する回収ステップ、を含むオリゴマータンパク質の製造方法である。
　準備ステップでは、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質を準備する。異常型タンパク質の由来は特に限定されず、ヒト由来であってよく、マウス、ラットなどの実験動物由来であってもよく、細胞由来であってもよく、試験管内で作製されたものでもよい。異常型プリオン蛋白質であれば、プリオン病の感染患者脳や感染動物脳や感染細胞などから得ることができる。
　また、異常型タンパク質を保有する個体（例えばマウス、ラットなど）であってよく、異常型タンパク質を含むセルライセートであってよい。また、異常型タンパク質に似せた大腸菌組換えタンパク質であってもよく、異常型タンパク質に似せた合成ペプチドであってもよい。
　オリゴマータンパク質を抗原（ワクチン）として用いる場合には、準備したタンパク質を不活化させる変性ステップを行ってもよい。本明細書において「不活化」とは、クロスリンクした異常型タンパク質の抗原性は保持しつつ、投与対象であり得るマウス、ラット等の実験動物やヒトに対して致死させない状態であることをいう。オリゴマータンパク質が不活化したか否かは、バイオアッセイ等で確認することができる。
　不活化は常法に従い行われる。例えば、ソディウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）、グアニジン塩酸、グアニジンチオシアン酸、尿素、ぎ酸などのタンパク質変性剤で異常型タンパク質の変性が行われる。なお、変性ステップは、クロスリンクステップ後の異常型タンパク質に対して行ってもよい。
　クロスリンクステップは、異常型タンパク質にクロスリンク処理を施すステップである。クロスリンクには、上記説明したクロスリンクを生じさせる化合物を添加させること、紫外線を照射するなどの方法により行われる。化合物の添加量、紫外線の照射量は、コンフォメーション病の種類、化合物の種類、用いる材料やその処理方法により適宜設定される。また、紫外線の波長も特段限定されないが、例えば３６５ｎｍであってよい。
　クロスリンクされたか否かは、例えばプロテイナーゼＫなどでタンパク質を酵素処理し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量を検出することで、判断することができる。クロスリンクすることでオリゴマーが形成され、単量体と比較してバンドが移動した、２量体、３量体等を表す高分子量バンドが観察される。
　クロスリンクされたオリゴマータンパク質を回収するステップは、常法に従い行うことができる。この際、酵素処理等により、クロスリンク部分以外を除くよう、断片化してもよい。また、更にクロスリンク部分の単離生成を行ってもよい。
　上記方法により得られたオリゴマータンパク質は、コンフォメーション病の治療に対し、非常に有用なものとなる。オリゴマータンパク質を不活化処理して得られた、不活化オリゴマータンパク質は、コンフォメーション病の予防又は治療剤として用いることが可能であり、これに薬学的に許容される担体を加えることで、コンフォメーション病の予防又は治療のための医薬組成物として用いることが可能となる。医薬組成物の一例として、不活化オリゴマータンパク質を抗原としてワクチン注射することで、能動免疫療法が可能となり、またコンフォメーション病の進行を遅らせることが可能となり、症状が改善し得る。
　なお、本実施形態において、不活化の対象である、「コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質がクロスリンクされたオリゴマータンパク質」は、当該タンパク質フルレングスでなくても、その活性中心を保持しつつ、その一部を置換、削除など改変したものであってよく、同様の活性を有するペプチドであってよく、同様の活性を有する組換えタンパク質であってよい。
　また、クロスリンク部位のインターフェース構造を解明することで、インターフェースを特異的に認識する抗体や化合物をデザインすることが可能となり、クロスリンクを阻害する治療薬・予防薬を得ることができる。
　また、本発明の別の形態は、上記オリゴマータンパク質、又上記製造方法で得られたオリゴマータンパク質に、候補化合物を接触させるステップ、及び前記候補化合物を接触させたオリゴマータンパク質の活性及び／又は構造を測定するステップ、を含む、コンフォメーション病医薬のスクリーニング方法、又は、コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質に、候補化合物を接触させる接触ステップ、該異常型タンパク質にクロスリンク処理を施し、オリゴマーを形成させるクロスリンクステップ、及びクロスリンクさせたオリゴマータンパク質の活性及び／又は構造を測定する測定ステップ、を含む、コンフォメーション病医薬のスクリーニング方法である。
　クロスリンクされた、コンフォメーション病を引き起こすオリゴマータンパク質は、クロスリンクにより、インターフェースの構造が保たれる。そのため、治療医薬としての候補化合物を当該オリゴマータンパク質に接触させ、オリゴマータンパク質の活性及び／又は構造を測定することで、直接的に候補化合物がコンフォメーション病に何らかの作用を与えるか否かを理解することができる。又は、異常型タンパク質に候補化合物を接触させた後にオリゴマータンパク質の形成活性を測定することで、直接的に候補化合物がコンフォメーション病に何らかの作用を与えるか否かを理解することができる。特に、候補化合物の接触により、オリゴマータンパクのクロスリンク部位が、緩む、撓む、構造が変化する、又はクロスリンク効率が低下する、などの現象が生じた場合、当該候補化合物は、コンフォメーション病の凝集が解消することに貢献する化合物であると判断できる。そのため、本実施形態のスクリーニング方法により、コンフォメーション病治療薬の候補化合物に対する直接的なアッセイを行うことが可能となる。
　以下、本発明に関連する実験について、異常凝集タンパク質の代表である異常型プリオン蛋白質およびアミロイドＡを用いて説明する。
＜実験例１＞
　プリオン感染細胞の細胞溶解液をもちいて、異なるプリオン株であってもプリムリンの異常型プリオン蛋白質クロスリンク作用が発揮されることを観察した。また正常型プリオン蛋白質除去処理とプリムリン処理によるクロスリンク反応の順序を入れ替えることによって、クロスリンク反応がプリオン蛋白質の分子種の内で、異常型プリオン蛋白質に起こり、かつ異常型プリオン蛋白質では部分分解の有無にかかわらずに起こることが判明した。
〔方法〕
　プリオン持続感染細胞としては、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞、あるいは２２Ｌ株がＮｅｕｒｏ２ａに持続感染したＮ１６７細胞を用いた。細胞培養は、細胞培養フラスコ(底面積９．７ｃｍ２)にて培養し、細胞密度がコンフルエントとなった時点で培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水［ＰＢＳ、ｐＨ６．５］で細胞を洗浄した。洗浄液を十分に除き、リシス液［０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ＮＰ－４０(商品名、和光純薬工業(株)オクチルフェニルエーテル)、残部ＰＢＳ］０．５ｍＬを用いて細胞を溶解した。軽く遠心分離して高分子核酸を除いた上清を細胞溶解液とした。図１はプリムリンの化学構造式を表しており、化合物プリムリン（ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ、別名ｄｉｒｅｃｔ ｙｅｌｌｏｗ－７、ｃａｓ＃　８０６４－６０－６）はＭＰバイオサイエンス社より購入したものを精製せずに使用した。各々の細胞溶解液を１２サンプルずつ準備し、６サンプルにプリムリンを添加した。終濃度は、０、 １０、 ２、 ０．４、 ０．０８、０．０１６μＭである。一方、残りの各々６サンプルについてタンパク質分解処理を行った。タンパク質分解処理は、２０μＬ細胞溶解液にトリチラキウム　アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ（ＰＫ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で３０分反応(タンパク質分解)させた後、フェニルメタンスルホニルフロライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ： ＰＭＳＦ）を終濃度１ｍＭとなるように加えてタンパク質分解反応をとめた。以下、このタンパク質分解・停止反応処理をＰＫ処理と呼ぶこととする。３０分間のプリムリン処理後にＰＫ処理したサンプルと、ＰＫ処理後に３０分間のプリムリン処理したサンプルを準備した。その後に、タンパク質分解処理抵抗性である異常型プリオン蛋白質（以下ＰｒＰｒｅｓと呼ぶ）を遠心処理（９，０００×ｇ, １分間）で沈殿物として回収し、この沈殿全量に対し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）用バッファー［１％ＳＤＳ(ソディウムドデシルサルフェート)、０．０５％ブロモフェノールブルー、４％グリセロール、１％βメルカプトエタノール、２５ｍＭトリス塩酸 ｐＨ ６．８］２０μＬを加えて懸濁し、９５℃、５分間の熱変性処理を加えて試料を調製した。以下、この段階の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルと呼ぶこととする。ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルをイシカワ、ドウウラらの方法［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、８５巻、１７８５－１７９０頁］に準じ、１５％トリス・グリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法でＰｒＰｒｅｓを検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をナイロンメンブラン（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレイン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ－ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈））、及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製（２００００倍希釈））、化学発光検出試薬（アマーシャム社製、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）を使用してプリオン蛋白質の検出を行った。
〔結果〕
　図２にＮ１６７およびＳｃＮ２ａの細胞溶解液をもちいてプリムリンのクロスリンク作用の作用対象とプリオン株の違いについて調べた結果を示す。レーン１～６は、ＰＫ処理ののちプリムリンを作用させたもの、レーン７～１２はプリムリンを作用させたのちにＰＫ処理したものであり、添加したプリムリンの濃度は、レーン１及び７が０μＭ、以下レーン２及び８、 レーン３及び９、 レーン４及び１０、レーン５及び１１、レーン６及び１２がそれぞれ、１０、 ２、 ０．４、 ０．０８、 ０．０１６μＭである。上段のブロットはＮ１６７の、下段のブロットはＳｃＮ２ａの細胞溶解液を用いた結果を示している。プリオン株に関係なく、プリムリンの濃度に依存性に異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物が観察された。プリムリン作用とＰＫ処理の順番については、プリムリンを作用させたのちＰＫ処理を行った方（レーン７～１２）が、ＰＫ処理を行ったのちプリムリンを作用させた方（レーン１～６）よりも対応するプリムリン濃度において顕著にクロスリンク反応物の含量が増加している。ＰｒＰｒｅｓは異常型プリオン蛋白質に対するＰＫ処理によってＮ末端領域が切断されたタンパク質分解抵抗性の部分産物である。すなわちＰｒＰｒｅｓと異常型プリオン蛋白質とは分子サイズにおいて異なる。実施例１の結果はプリムリンの作用は切断を受けていない異常型プリオン蛋白質に作用し易く、ＰｒＰｒｅｓには作用がやや弱いことを示している。従って本実験例は異常型プリオン蛋白質とＰｒＰｒｅｓの分子サイズ以外の生化学的差異をウエスタンブロット上で描出しているものといえる。
＜実験例２＞
　プリムリンによる異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は作用時間依存的である。
〔方法〕
　実験例１に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞を２５ｃｍ２のスケールで培養し、細胞溶解液１ｍＬを得た。終濃度、１０μＭになるようにプリムリンを添加し添加後０、６０、１２０、１８０、２４０、３６０分に１５０μＬのサンプルを採取した。サンプルは採取後冷凍し、全サンプル採取後ＰＫ処理を行い、ＰｒＰｒｅｓを遠心処理によって回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルを調製した。実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。比較のため、プリムリンを含まない細胞溶解液に対して同様の処理を行い、サンプルを得た。実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。得られた画像から生成したクロスリンク反応物の量をその画素密度から定量して、エクセル上にプロットするとともに、一次反応を想定した解析式へのフィッティングを行った。
〔結果〕
　図３にＮ１６７細胞溶解液をもちいてプリムリンのクロスリンク作用の作用時間依存性について調べた結果を示す。レーン１～６は、プリムリン存在下、レーン７～１２はプリムリン非存在下での結果である。作用時間は、レーン１、７が０分, 以下レーン２、８、レーン３、９、 レーン４、１０、レーン５、１１、レーン６、１２がそれぞれ、６０分、 １２０分、 １８０分、 ２４０分、 ３６０分である。プリムリン存在下で圧倒的にクロスリンク反応物形成が促進されていることがわかる。また、その作用は反応時間依存的である。図４は生成したクロスリンク反応物の相対的な量を縦軸、時間を横軸としてプロットしたもので、一次反応の時間に対する成長曲線を実線で示している。以上のことからプリムリンによる異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は時間依存的であるといえる。
＜実験例３＞
　プリムリン処理細胞にＵＶを照射すると、異常型プリオン蛋白質のクロスリンク反応が促進される。すなわち、プリムリンは異常型プリオン蛋白質のタンパク質間クロスリンク光反応増感剤であり、プリムリンとＵＶ照射の併用による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は、ＵＶ照射時間依存的である。同時に、プリムリン非存在下でも、ＵＶ照射によって異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が促進されることが判明した。
〔方法〕
　プリムリンを含まずあるいは、終濃度２μＭでプリムリンを含む培養液を用いＮ１６７プリオン持続感染細胞を底面積２５ｃｍ２のスケールの細胞培養フラスコで培養し、リシス液で細胞を溶解して、細胞溶解液１ｍＬを得た。１５ｃｍの距離をおいてＵＶランプ（フナコシ社、ハンディタイプ；主波長３６５nm）の照射を行い、０、１５、３０、４５、６０分に１９５μＬのサンプル細胞溶解液を採取した。サンプルは採取後冷凍し、全サンプル採取後、ＰＫ処理を行いＰｒＰｒｅｓを遠心処理によって回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルを調製した。クロスリンク反応物の分子量を見やすくするために、プリオン蛋白質の糖鎖を除く処理を行った。すなわち、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルに対してフラボバクテリウム　メニンゴセプチキュム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来ＰＮＧａｓｅ　ＦをＮＥＢ社の取扱説明書通りに添加して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルに含まれる蛋白質上の糖鎖除去反応を行った。３７℃、１時間の反応時間を経たのち、５倍濃縮ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用バッファーを加え、９５℃、５分間の熱変性処理を加えた。以下、この糖鎖除去・反応停止処理を脱糖鎖処理と呼ぶこととする。これらの処理を行った試料を実験例１と同様に電気泳動し、ウエスタンブロット法でＰｒＰｒｅｓを検出した。
〔結果〕
　図５にプリムリン存在下、あるいは非存在下で培養したＮ１６７細胞の溶解液をもちいた異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応のＵＶ照射時間依存性について調べた結果を示す。レーン１～５は、プリムリン非存在下、レーン６～１０はプリムリン存在下で培養した細胞の溶解液を用いている。ＵＶ照射時間は、レーン１、６が０分、 以下レーン２、７、 レーン３、８、 レーン４、９、レーン５、１０がそれぞれ、１５分、 ３０分、 ４５分、 ６０分である。
　まず、これまでの図２、図３において観測されていた異常型プリオン蛋白質のバンドはプリオン蛋白質一分子あたり、０箇所、１か所、２か所に糖鎖修飾を受けた三種類の分子種を検出していたが、実験例３において糖鎖除去処理を施した結果では、レーン１に見られるようにバンドは糖鎖修飾が０箇所のバンドに収束している。この無糖鎖修飾のＰｒＰｒｅｓの分子量は１７ｋＤａ（単量体サイズ）である。一方、ＵＶ照射処理したレーンにおいては３４ｋＤａ（二量体サイズ）と５１ｋＤａ（三量体サイズ）に明瞭なバンドが検出される。これらのバンドは１７ｋＤａに対して整数倍であり、熱変性処理時には強力なタンパク質変性剤や還元剤を含んでいることからも、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物であることに矛盾しない。糖鎖除去処理においてこれらのバンドは消失しないことから、クロスリンク反応は異常型プリオン蛋白質上の糖鎖部分で起こっているのではないことが明らかである。
　プリムリン存在、非存在によらず、ＵＶ照射依存的に異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が進行していることが確認できる。プリムリンの使用とＵＶ照射の二つの手法により、レーン７、８では異常型プリオン蛋白質に由来する単量体がほとんど検出されず、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物である二量体や三量体が主たるＰｒＰｒｅｓの成分となっていることがわかる。しかしながらレーン９、１０で見られるように促進反応が過剰になると全体的なＰｒＰｒｅｓの検出感度の低下が確認された。この光ブリーチ効果の要因は不明である。
　以上のことから、ＵＶ照射は異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を誘起することを示している。異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応で観察されるような二量体のバンドは、ＰｒＰｒｅｓの検出実験ではしばしば観測されていた事実であるが、発生条件を明記した報告はこれまでにない。市販のクロスリンカーを用いた実験は報告されているものの、それらは精製タンパク質を用いたごく一般的な方法であり、ここでの観察のように、不純物を含むような細胞溶解液でのクロスリンクの観察は独自のものである。さらにプリムリンの使用はＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を大幅に促進されることから、プリムリンは異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応において光増感剤として働くことが明らかとなった。
＜実験例４＞
　これまでの実験例のようなプリムリンあるいはＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は正常型プリオン蛋白質には作用しない。また、細胞内で凝集・解離平衡状態にあることが知られているβアクチンもウエスタンブロット検出の条件下においてクロスリンク反応物は検出されない。
〔方法〕
　実験例１に準じてプリオン非感染Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を底面積２５ｃｍ２のスケールの細胞培養フラスコで培養、リシス液で溶解し、細胞溶解液１ｍＬを得た。１５０μＬずつ６本のチューブにとり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆとした。チューブＣ、Ｄは終濃度１μＭになるように、Ｅ、Ｆは終濃度５μＭになるようにプリムリンを添加した。チューブＢ、Ｄ、Ｆは１５ｃｍの距離をおいて３０分間のＵＶの照射を行い、一方チューブＡ、Ｃ、Ｅは暗所に保存した。照射反応終了後、それぞれのチューブから１２．５μＬの反応溶液をそれぞれ、正常型プリオン蛋白質検出用とβアクチン検出用の２本ずつ、計１２本採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルを調製した。正常型プリオン蛋白質検出用サンプルは実験例３に準じて脱糖鎖処理を行い、実験例１に準じて正常型プリオン蛋白質の検出を行った。βアクチン用のサンプルは脱糖鎖処理を行わず、一次抗体として抗βアクチン抗体を用いるほかは実験例１と同様に、目的蛋白質であるβアクチンを検出した。
〔結果〕
　異常型プリオン蛋白質のクロスリンク反応をもたらす条件での、正常型プリオン蛋白質とβアクチンに対する影響を調べた。図６は脱糖鎖処理をした、ＰＫ処理を行わない正常型プリオン蛋白質、図７はβアクチンを検出したものである。図６、７の各々のレーン１～６は、［方法］のチューブＡ～Ｆに対応している。すなわち、レーン１、２がプリムリン非存在下, 以下レーン３、４、 レーン５、６がそれぞれ、１μＭ、５μＭである。一番過酷な反応条件であるレーン６においては軽度の光ブリーチ効果が認められるものの、プリムリン存在、非存在によらず、ＵＶ照射によるクロスリンク反応は認められなかった。仮にクロスリンクにより二量体を形成すれば、正常型プリオン蛋白質、βアクチンについて、それぞれ、４６ｋＤａ、８０ｋＤａにバンドが検出されることが期待される。従って、これまでの実施例においてプリムリン添加、ＵＶ照射、およびそれらの併用によるクロスリンク反応物の形成は、異常型プリオン蛋白質において特異的な反応であることが明らかとなった。
＜実験例５＞
　プリオン感染マウスの脳から得た異常型プリオン蛋白質を含む粗精製画分の溶液に対してプリムリン存在下、ＵＶ 照射処理において、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が観測されることを示した。
〔方法〕
　マウスプリオン株（２２Ｌプリオン、１％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ懸濁液）をマウス（ＩＣＲ）に脳内接種し、発病末期まで飼育した後に、脳を採取した。採取した脳（２６０ｍｇ）を破砕用チューブに入れ、－８０℃で凍結させた。ＰＢＳ（２３４０μＬ）を添加し、ステンレス製撹拌子で破砕することによって１０％（ｗ／ｖ）の脳ホモジネートを作製し、密閉可能なチューブに２００μＬずつ分注した。そのうち２本のチューブに対して以下の操作を行った。それぞれのチューブにプロテネースＥ（１０ ｍｇ／ｍＬ水溶液）２μＬを添加し、３７℃、３０分間反応させた。その後、ＥＤＴＡ（０．５Ｍ水溶液、ｐＨ８．０）４．１μＬを添加し最終濃度１０ｍＭとした。４％サルコシルを含むＰＢＳを２０６μＬ添加し攪拌後に、ベンゾネース０．８３μＬを添加し３７℃、３０分間反応させた。反応液に４％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸水溶液（ｐＨ７．４）を３３．５μＬ、６０％（ｗ／ｖ）ヨードオキサノール７０５．３μＬを加え、さらに、４％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸水溶液（ｐＨ７．４）を５７．２μＬ添加した。それぞれのチューブについて遠心分離（１６１００×ｇ、９０分間）を行い、回収した上清をまとめたのち、濾過膜（濾過径０．４５μｍ）に通過させ濾液（２０００μＬ）を得た。濾液を４８０μＬずつ４本のチューブに分注した。そのうちの３本に最終濃度２０μＭになるようにプリムリンを添加し、１０ｃｍの距離を置いた３０分間のＵＶ照射を行った。残りの一本は無処理サンプルとした。反応後すべてのサンプルに０．３％ＰＴＡ液［２％（ｗ／ｖ）サルコシル、０．３％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸、ＰＢＳ］４８０μＬを添加することによってヨードオキサノール含有量を１７．５％（ｗ／ｖ）に調整したのち、遠心分離（１６１００×ｇ、 ９０分間）を行い、上清を廃棄した。各々の沈殿物に対して洗浄液［１７．５％（ｗ／ｖ）ヨードオキサノール、０．１％（ｗ／ｖ）サルコシルを含むＰＢＳ］２００μＬを添加し、攪拌後、１６．２μＬの４％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸水溶液（ｐＨ ７．４）を添加し、遠心分離（１６１００×ｇ、 ９０分間）を行い、上清を廃棄し、沈殿物を得た。沈殿物に対して洗浄液２００μＬを添加し、ＰＫ処理（終濃度１０μｇ／ｍＬ、３７℃、６０分間）を行った。ＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭになるように添加し、撹拌後、１６．２μＬの４％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸水溶液（ｐＨ７．４）を添加し、遠心分離（１６１００×ｇ、３０分間）を行い、上清を廃棄し、沈殿物を得た。沈殿物に対して洗浄液２００μＬを添加し、撹拌後に１６．２μＬの４％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸水溶液（ｐＨ７．４）を添加し、遠心分離（１６１００×ｇ、３０分間）を行い、上清を廃棄し、沈殿物を得た。この洗浄工程をさらに２回繰り返したのち、実験例１に準じてＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルを作製、さらに、実験例３に準じて脱糖鎖処理を行った。これらの処理を行った結果、無処理の試料１本とプリムリン存在下ＵＶ照射処理の試料３本が得られる。それらのうち、無処理の試料１本（１０μＬ）とプリムリン存在下ＵＶ照射処理の試料１本（１０μＬ）を用い、その１／２００に相当する量を実験例１と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動し、ウエスタンブロット法でＰｒＰｒｅｓを検出した。残り全量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、アクリルアミドゲルをタンパク質銀染色キット［（銀染色ＩＩキット　ワコー）Ｗａｋｏ社］の説明書通りに銀染色した。
〔結果〕
　図８にプリオン感染マウス脳サンプルに対してのプリムリン存在下ＵＶ処理によるクロスリンク反応の結果を示す。プリムリン存在下ＵＶ処理により、マウス感染脳サンプルにおいても異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物の形成が観察された。この結果は、生物材料の由来を問わず異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が起こりえることを示している。一方、図９で示されているように、銀染色では目立ったバンドの変動は観察されないことから粗精製画分中の混入タンパク質ではプリムリン存在下ＵＶ処理に対してむやみにクロスリンク反応物形成が生じていないことがわかる。
＜実験例６＞
　プリムリンと同等、あるいは、類似した効果を持つ化合物の探索をおこない、コンゴーレッドが同様の異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の増感剤としての効力を持つことを示した。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１２５μＬずつ９本のチューブにとり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉとした。チューブＢ～Ｉに終濃度５０μＭになるように以下に示す化合物を添加した。チューブＡには他のチューブと同量となるようにリシス液を添加した。添加した化合物は、チューブＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉに対して、プリムリン、リボフラビン、インドシアニングリーン、エバンスブルー、メチルバイオレット、スーダンブラック、フルオロセイン、コンゴーレッドである。チューブＡ～Ｉに対して７ｃｍの距離をおいて１５分間のＵＶ照射を行った。その後、実験例３に準じてＰＫ処理、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製、脱糖鎖処理を行い、実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　図１０に使用した化合物の化学構造式を、図１１に様々な化合物混在下でのＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の実験結果を示す。ここでは汎用されている色素系化合物についての検討を行った。図１１の各々のレーン１～９は、［方法］のチューブＡ～Ｉに対応している。ここまでの実験例と同様に、レーン１、２の比較においてプリムリンは異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の増感剤として作用している。レーン１とレーン３～８の比較において、特筆するべき効果を発揮するものは見つからなかった。レーン９のコンゴ－レッドではプリムリンに比べてより容易にクロスリンク反応物（多量体）を形成することがわかった。しかしながらその反応の激しさのため、反応条件をコントロールすることが困難であると考えられた。
＜実験例７＞
　実験例６と同様に、プリムリンと同等、あるいは、類似した効果を持つ他の化合物の探索をおこない、ルシフェリンが同様の異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の増感剤としての効力を持つことが明らかになった。一方、メチレンブルーの添加は異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を促進したが、ＵＶ照射効果は見られなかった。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、２００μＬずつ１２本のチューブにとり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２とした。チューブ３～１２に終濃度５０μＭになるように以下に示す化合物を添加した。チューブ１、２には他のチューブと同量となるようにリシス液を添加した。添加した化合物は、チューブ３、４にプリムリン、チューブ５、６にメチレンブルー、チューブ７、８にルミノール、チューブ９、１０にルシフェリン、チューブ１１、１２にαけい皮酸である。チューブ２、４、６、８、１０、１２に対して７ｃｍの距離をおいて１５分間のＵＶ照射を行った。その後、実験例３に準じてＰＫ処理、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製、脱糖鎖処理を行い、実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　図１２に使用した化合物の化学構造式を、図１３に化合物混在下でのＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の実験結果を示す。実験例７においては反応に光が関与する代表的な化合物を選択した。図１３の各々のレーン１～１２は、［方法］のチューブ１～１２に対応している。ここまでの実験例と同様、レーン１，２の比較においてＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク作用が示されており、レーン３，４の比較においてプリムリンが異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の増感剤として作用していることが示されている。新規に調べた化合物で特徴的であったのはルシフェリンとメチレンブルーである。レーン９、１０の比較において、ルシフェリンはプリムリンと同様にＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の増感作用を発揮した。一方、レーン５、６の比較においては、多量体を示すバンドの強度は同等であった。このことは、メチレンブルーはＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を促進しないことを意味しているが、レーン１、５の比較において顕著な多量体を示すバンドのシグナル増強が見られる。すなわち、メチレンブルーはプリムリン、コンゴ－レッド、ルシフェリンとは異なる作用様式で異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を起こしている。
＜実験例８＞
　実験例７において発見したメチレンブルーの効果について検証した結果、添加による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は、数μＭ～１５０μＭ程度までのメチレンブルー濃度が適していることが示された。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１６０μＬずつ８本のチューブにとり、１、２、３、４、５、６、７、８とした。添加したメチレンブルーの濃度は、チューブ１が０μＭ, 以下チューブ２、３、４、５、６、７、８がそれぞれ、３００、１５０、７５、３８、１９、９．５、４．８μＭである。その後、実験例１に準じてＰＫ処理、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製を行い、ＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　図１４にメチレンブルーのＮ１６７細胞溶解液をもちいた異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の濃度依存性について調べた結果を示す。図１４の各々のレーン１～１２は、［方法］のチューブ１～１２に対応している。二量体を示すバンドの強度はレーン５～８において最も強く、以下メチレンブルー濃度が大きくなるにつれて二量体のバンド強度は減少したが、代わりに三量体に相当するバンドがより明瞭にレーン３～５で認められた。しかし、メチレンブルー濃度が３００μＭであるレーン２では単量体・多量体の全てのバンド強度が減少していた。
＜実験例９＞
　一般的なラジカル反応剤も、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を起こすことを示した。
［方法］
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、５００μＬずつ８本のチューブに分注した。チューブ２と６、３と７、４と８には過硫酸アンモニウムをそれぞれ０．０５ｍｇ、０．５ｍｇ、５ｍｇを添加し、チューブ６、７、８にはさらにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミンをそれぞれ０．０１μＬ、０．１μＬ、１μＬを添加した。３７℃で１時間反応させた後に、それぞれのチューブのサンプルをＰＫ処理用と無処理用に半分ずつに分け、ＰＫ処理用は実験例３に準じてＰＫ処理、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製、脱糖鎖処理を行った。無処理用はＰＫ処理を実施せず、ＰＫ処理工程を除いて実験例３に準じてＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製、脱糖鎖処理を行った。全てのサンプルについて実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
［結果］
　図１５に過硫酸アンモニウムを添加した異常型プリオン蛋白質への効果を、ＰＫ処理の無し有りで示す。サンプル１～４は、［方法］のチューブ１～４に対応している。過硫酸アンモニウム０．５ｍｇ添加サンプルであるレーン３では、顕著な異常プリオン蛋白のクロスリンクによる二量体サイズのシグナルが観察された。図１６には、過硫酸アンモニウムとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミンを添加した異常型プリオン蛋白質への効果を、ＰＫ処理の無し有りで示す。サンプル５～８は、［方法］のチューブ５～８に対応している。図１５と同様に、過硫酸アンモニウム０．５ｍｇとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン０．１μＬを添加したサンプルであるレーン７では、顕著な異常プリオン蛋白質のクロスリンクによる二量体サイズのシグナルが観察された。したがって、ラジカル反応剤も異常型プリオン蛋白質のクロスリンク反応を誘導することが示された。
＜実験例１０＞
　ＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を活用して抗プリオン化合物を分類することが可能であり、この指標を用いて化合物の作用機序を考察することができる。また、このことは逆に、ＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を抗プリオン化合物の探索に利用できることを示している。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１８０μＬずつ１０本のチューブにとり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊとし、チューブＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅに正常型プリオン蛋白質から異常型プリオン蛋白質への構造変換を阻害することが知られているコンパウンドＢ（ｃｏｍｐＢ：　４－［（Ｅ）－｛２‐［４－（１，３－ｏｘａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌｉｄｅｎｅ｝ｍｅｔｈｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、チューブＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊに異常型プリオン蛋白質の構造を弛緩させることが知られているドキシサイクリン（ＤＯＸ）を添加した。各終濃度はチューブＢ、Ｇ、チューブＣ、Ｈ、チューブＤ、Ｉ、チューブＥ、Ｊがそれぞれ、０．５、２、１０、 ２０μＭである。チューブＡ、Ｆには他のチューブと同量となるようにリシス液を添加した。添加後、チューブＡ～Ｊを１０ｃｍの距離をおいて３０分間のＵＶ照射を行った。反応終了後、実験例３に準じてＰＫ処理を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプル調製を行い、脱糖鎖処理後に、実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　コンパウンドＢ（ｃｏｍｐＢ）およびドキシサイクリン（ＤＯＸ）はこれまでの報告で抗プリオン活性を示すことが知られている化合物である。例えば、コンパウンドＢは、［Ｋａｗａｇｏｅ Ｋ, Ｍｏｔｏｋｉ Ｋ, Ｏｄａｇｉｒｉ Ｔ, ｅｔ ａｌ．Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ. ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ. ＷＯ/２００４/０８７６４１, ２００４年１０月１４日］で製造に関して、［Ｋａｗａｓａｋｉ Ｙ, Ｋａｗａｇｏｅ Ｋ, Ｃｈｅｎ Ｃ, ｅｔ ａｌ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　２００７年, ８１巻，１２８８９－１２８９８頁］で正常型プリオン蛋白質から異常型プリオン蛋白質への構造変換を阻害することで細胞や動物で抗プリオン活性を発揮することが示されている。また、ドキシサイクリンに関しては［ＴａｇｌｉａｖｉｎｉＦ, Ｆｏｒｌｏｎｉ Ｇ, Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｌ, ｅｔ ａｌ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、３００巻５号、１３０９－１３２２頁］において異常型プリオン蛋白質の構造を弛緩させる作用が報告されている。本実験例では、この二つの化合物の異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応への影響を試験した。図１７上段のウエスタンブロットのレーン１～１０はそれぞれ、［方法］のチューブＡ～Ｊに対応している。図１７下段のグラフは上記ウエスタンブロットの二量体サイズに相当する各レーンのバンドの強度について、レーン２～５はレーン１、レーン７～１０はレーン６の強度を基準とした比として、添加した化合物の濃度を横軸にして表している。グラフから明らかなように、コンパウンドＢを添加したときには実験例１のプリムリンで観察されたように添加濃度依存的に二量体バンドのシグナル強度が増強した。一方、ドキシサイクリンを添加したときには添加濃度依存的に二量体バンドのシグナル強度が減弱した。このように二つの抗プリオン化合物はＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の結果に影響を与えることができ、また、コンパウンドＢとドキシサイクリンではそれらの作用の違いが異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の結果に反映されることが示された。したがって、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応に与える影響の差異を指標に、抗プリオン化合物として知られる化合物を分類し作用機序を推測することが可能である。また、本実験例の結果は、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応系が抗プリオン候補化合物の簡便な試験管内選抜系として使えることを示している。
＜実験例１１＞
　プリムリン存在下ＵＶ照射によって生成した異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物は尿素溶液処理によって単量体に戻らない。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、２００μＬずつ５本のチューブにとり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅとし、各チューブに終濃度５０μＭになるようにプリムリンを添加後、７ｃｍの距離をおいて１５分間のＵＶ照射を行った。その後、実験例１に準じてＰＫ処理をおこない遠心によってＰｒＰｒｅｓの沈殿物を得た。沈殿物を８μＬの濃度の異なる尿素水溶液で溶解させた。尿素溶液の尿素濃度はチューブＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅにおいて０、２、４、６、８Ｍである。室温で１０分間放置したのち、５倍濃度のＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーを各チューブに添加し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプル調製を行い、実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　これまでの実験例で観察されてきた異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物の性質について調査を行った。図１８に異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物への尿素溶液の効果について調べた結果を示す。図１８の各々のレーン１～５は、［方法］のチューブＡ～Ｅに対応している。各レーンの全体のＰｒＰｒｅｓのバンドのシグナル強度は尿素の存在によって減弱傾向にあったが、減弱の程度は尿素の濃度に依存しなかった。単量体バンドと二量体バンドのシグナル強度の比については、レーン１～５にわたって一定している。すなわち、尿素溶液の添加によっても多量体の単量体への解離は観測されなかった。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは蛋白質の種類によって稀に、多量体が検出されることがある。これまでの実験例では、サンプルバッファー中に０．５％のβメルカプトエタノールと１％のドデシル硫酸ナトリウムが、還元剤とタンパク質可溶化・変性剤としてすでに含まれていた。通常の蛋白質ではこのサンプルバッファーを添加し加熱すると完全に単量体として可溶化され、単量体として然るべき分子量を示す位置に検出される。これはごくごく広範に利用されている実験法である。しかしながら特殊な蛋白質、例えば、トランスサイレチンでは、これまでの実験例の条件によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいては、四量体に相当する分子量のバンドが検出される。しかし、サンプルバッファーに尿素を添加することで[Ｊｅｎｎｅ　ＤＥ, Ｄｅｎｚｅｌ　Ｋ, Ｂｌａｔｚｉｎｇｅｒ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６年、９３巻、６３０２－６３０７頁]、尿素の濃度が２．５Ｍ程度でトランスサイレチンは完全に単量体に相当する分子量のバンドで検出されることが知られている。この引用文献では、精製トランスサイレチンを使用した実験であり、多量体を形成する要因が分子間の強固な水素結合によるものであることを示している。本実験例の結果は、プリムリン存在下ＵＶ照射によって誘起される異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物は、分子間の強固な水素結合によるものではないことを示している。また、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が、プリオン持続感染細胞溶解液という夾雑系で、かつ、溶解液中に相当な界面活性剤が存在する下で起こる点は、引用文献にある実験条件とは大きく異なるところであり、異常凝集タンパク質の構造的特徴と反応の特異性を反映している。
＜実験例１２＞
　ＥＤＴＡや銅イオンが、ＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応に与える影響を調べた結果、ＥＤＴＡは影響を与えないが、銅イオンは異常型プリオン蛋白質に影響し異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の効率を下げた。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１８０μＬずつ１６本のチューブにとり、プリムリンを終濃度１０μＭになるように添加し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐとし、チューブＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨにＥＤＴＡ添加リシス溶液、チューブＪ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｏ、Ｐに硫酸銅添加リシス溶液を加えた。各終濃度はチューブＢ、Ｆ 、チューブＣ、Ｇ、チューブＤ、Ｈがそれぞれ、５０００、１０００、 ２００μＭ、チューブＪ、Ｎ 、チューブＫ、Ｏ、チューブＬ、Ｐがそれぞれ、１０００、 ２００、 ５０μＭである。チューブＡ、Ｅ、Ｉ、Ｍには他のチューブと同量となるようにリシス溶液を添加した。添加後、チューブＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ を７ｃｍの距離をおいて１５分間のＵＶ照射を行った。その間チューブＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌは冷暗所に保存した。反応後に実験例１に準じてＰＫ処理を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプル調製を行い、ＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　プリオン蛋白質の５１－９１番アミノ酸配列の領域は銅イオンとの結合が報告されている[Ｈｏｒｎｓｈａｗ　ＭＰ, Ｍｃｄｅｒｍｏｔｔ　ＪＲ, Ｃａｎｄｙ　ＪＭ, Ｌａｋｅｙ　ＪＨ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１９９５年，２１４巻，９９３－９９９頁]。この領域は、正常型プリオン蛋白質を分解し、異常型プリオン蛋白質をその痕跡を示すタンパク質分解酵素耐性コア（ＰｒＰｒｅｓと同意）へとなすＰＫ処理において切断される部分である。プリムリン、ＵＶ照射、その併用による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応では、実験例１で観察されたようにＰｒＰｒｅｓではクロスリンク反応効率が低下するため、クロスリンク反応にはこの５１－９１番アミノ酸配列の間接的な関与、すなわち、クロスリンクがかかるときには補助的に関わるが、直接クロスリンクを受ける領域ではない可能性が示唆されていた。そこでこの５１－９１番アミノ酸配列への構造的な摂動を目的として、キレート剤や銅イオンを添加し、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応を実施した。図１９にＥＤＴＡや銅イオンを添加した際のＵＶ照射による異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応について調べた結果を示す。図１９の各々のレーン１～１６は、［方法］のチューブＡ～Ｐに対応している。レーン１～４、レーン５～８における比較においてＥＤＴＡは反応に影響を与えなかった。一方、レーン９～１２、レーン１３～１６における比較においては、銅イオンの添加によって異常型プリオン蛋白質の単量体バンドのシグナル強度の低下が見られ、かつ、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は抑制された。したがって、５１－９１番アミノ酸配列が異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の効率に間接的に関与している可能性がある。生細胞を用いた通常の化合物選抜系においては、銅イオンやＥＤＴＡなどの試薬は細胞障害を招くため使用できないが、本実験例のように細胞溶解液を用いた実験系での評価は異常型プリオン蛋白質に作用する試薬を評価する上で有用である。
＜実験例１３＞
　異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応は、ＵＶの波長領域に吸収特性があるアミノ酸の添加によっても阻害を受けない。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１８０μＬずつ１６本のチューブにとり、プリムリンを終濃度１０μＭになるように添加し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐとし、チューブＢ、Ｃ、Ｄにバリン、チューブＦ、Ｇ、Ｈにチロシン、チューブＪ、Ｋ、Ｌにヒスチジン、チューブＮ、Ｏ、Ｐにトリプトファンを添加した。各終濃度はチューブＢ、Ｆ、Ｊ、Ｎ、チューブＣ、Ｇ、Ｋ、Ｏ、チューブＤ、Ｈ、 Ｌ、Ｐがそれぞれ、１００、２０、 ５ｍＭである。チューブＡ、Ｅ、Ｉ、Ｍには他のチューブと同量になるようにリシス液を添加した。添加後、チューブＡ～Ｐ を７ｃｍの距離をおいて１５分間のＵＶ照射を行った。反応後に実験例１に準じてＰＫ処理を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプル調製を行い、ＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　発明者の実験例とは使用する溶媒条件、反応条件等は異なるものの、光反応によるクロスリンクについて精製蛋白質と化合物フルオロセインを利用した報告がある[Ｗｅｂｓｔｅｒ　Ａ, Ｂｒｉｔｔｏｎ　Ｄ, Ａｐａｐ-Ｂｏｌｏｇｎａ　Ａ, Ｋｅｍｐ　Ｇ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９年，１７９巻，１５４－１５７頁]。その報告において反応様式は示されていないもののフィブリノーゲンの分子間のクロスリンクが還元剤を含まないＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて示されている。また、１０ｍＭ程度で、ＵＶの波長領域に吸収特性があるアミノ酸であるトリプトファンやチロシンによって、精製フィブリノーゲンの光誘起クロスリンクが阻害されることが示されている。そこで、本実験例ではＵＶの波長領域に吸収を持つアミノ酸を共存させることにより、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が阻害されるか否かを試験した。
　図２０はバリン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを共存させ、それらアミノ酸濃度を変化させた条件下における異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応の結果を示している。どのアミノ酸に対しても異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応に対する阻害効果は見られなかった。このことは、異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応が夾雑系で特異的に起こっていることからすると、当然の結果であると言える。本実験例における結果から、異常型プリオン蛋白質におけるクロスリンクは基質である異常型プリオン蛋白質同士が時間的に安定かつ極近傍に位置する部分で形成されることが推察される。
＜実験例１４＞
　異常型プリオン蛋白質におけるクロスリンク反応は、抗プリオン蛋白質抗体パネルを用いた解析から、アミノ酸残基１１０番近傍が関係していることが示唆された。この領域は、Ｓｈｉｒａｉらの異常型プリオン蛋白質モデル（ＢＨ４モデル）（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１４年, ２２巻４号, ５６０－５７１頁）では異常型プリオン蛋白質でプリオン蛋白質同士が相互作用するインターフェース２及び３に関与する位置にある。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、プリムリンを終濃度２０μＭになるように添加し、１５分間のＵＶ照射を行った。反応後に実験例３に準じてＰＫ処理を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプル調製を行い、脱糖鎖処理を施して最終的に９０μＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルを得た。レーン１～７に４．８μＬずつ添加し、実験例１に準じてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動並びにナイロンメンブレインへのブロッティングを行った。ＰｒＰｒｅｓシグナルの検出を、レーン１、２、３、４、５、６、７に対して一次抗体として、それぞれ１Ｅ４、３Ｃ１０、６Ｄ１１、６Ｈ４、ＳＡＦ７０、ＳＡＦ８３、Ｍ２０を用い、その後は実験例１と同様に行った。これらの抗体うち、Ｍ２０は二次抗体としてａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ、残りはａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧを利用した。
〔結果〕
　ここまでの実験例では抗体としてＳＡＦ８３を使用してＰｒＰｒｅｓの単量体シグナルや多量体シグナルの検出を行ってきた。ＳＡＦ８３のプリオン蛋白質上でのエピトープの位置は１２６－１６４番アミノ酸配列にある。さて、クロスリンク反応が起こると、その部位を含めた近傍にあるエピトープと特異抗体による抗原抗体反応が影響を受ける可能性が高い。そこで多種類の抗体を利用することによってクロスリンク部位を探った。図２１はさまざまな一次抗体を用いてＰｒＰｒｅｓを検出した結果を示している。１Ｅ４と３Ｃ１０を用いた検出では他の５種類の抗体を用いた場合よりも二量体シグナル検出率が顕著に低下していた。図２２は、図２１の結果について単量体シグナル強度に対する二量体シグナル強度の比率を求めたものであり、縦軸にその比率を示したグラフである。１Ｅ４と３Ｃ１０を用いた検出では他の５種類の抗体を用いた場合よりも二量体シグナル検出率が有意に低下していることが明瞭である。各抗体が認識するプリオン蛋白質上のエピトープの位置を図２３に示した。１Ｅ４と３Ｃ１０はともにアミノ酸残基１１０番付近の極めて狭い領域にエピトープが位置しており、これらの結果から、異常型プリオン蛋白質におけるクロスリンク反応はアミノ酸残基１１０番近傍が関係していることが示された。この領域はＳｈｉｒａｉらの異常型プリオン蛋白質モデル（ＢＨ４モデル）（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１４年, ２２巻４号, ５６０－５７１頁）によると、異常型プリオン蛋白質同士が相互作用する反応性局面であるインターフェース２及び３に関与する領域であることが示されており、この領域でＵＶ照射によるクロスリンク反応が生じても全く矛盾しない。
＜実験例１５＞
　グルタルアルデヒドのような一般的な二価架橋剤による架橋では異常型プリオン蛋白質に特異的なクロスリンクは不可能であることを示した。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１８０μＬずつ６本のチューブにとり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆとし、チューブＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆにグルタルアルデヒドを添加した。各終濃度はチューブＣ、Ｄ、チューブＥ、Ｆがそれぞれ、０．１、０．０２％である。チューブＡ、Ｂにはその他のチューブと同量となるようにリシス液を添加した。添加後、チューブＢ、Ｄ、Ｆを１５ｃｍの距離をおいて３０分間のＵＶ照射を行った。反応終了後に、βアクチン検出用に各チューブ１０μＬ、ＰＫ処理前の総プリオン蛋白質検出用に２０μＬのサンプルを採取した。残りを実験例３に準じてＰＫ処理を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプル調製を行い、脱糖鎖処理後に、実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。βアクチンおよび、ＰＫ処理前の総プリオン蛋白質の検出は実験例４に準じた操作を行った。
〔結果〕
　グルタルアルデヒドは組織の固定等に汎用される分子内に２個のアルデヒド基を有する化合物である。一般的な架橋剤を用いて細胞溶解液のような夾雑系でクロスリンクを行なった時、プリオン蛋白質やβアクチンの検出がどのような様態を示すか試験した。図２４、図２５、図２６のレーン１～６はそれぞれ、［方法］のチューブＡ～Ｆに対応している。図２４、図２５、図２６はそれぞれＰｒＰｒｅｓ、ＰＫ処理無しの総プリオン蛋白質、βアクチンを検出したものである。
　図２４において１７ｋＤａのバンドとして示されるＰｒＰｒｅｓ、ならびに図２５において１７ｋＤａのバンドとして示される断片化異常型プリオン蛋白質は、各図レーン５、６に示されているように、グルタルアルデヒド存在下において、検出効率が著しく低下している。また、図２５において２３ｋＤａのバンドとして示される異常型・正常型の全長のプリオン蛋白質はレーン５、６において示されているように低濃度のグルタルアルデヒド存在下で検出感度が低下している。しかし、図２４、図２５のレーン３～６には異常型プリオン蛋白質の二量体や三量体に相当するようなバンドは検出されない。一方、βアクチンは細胞内で重合・脱重合を行う蛋白質として知られているが、図２６のレーン３～６において多量体バンドは検出されておらず、かつ、グルタルアルデヒド高濃度存在時には抗体による検出効率が低下している。レーン５、６において示されているように低濃度のグルタルアルデヒドであればレーン１、２に示されるグルタルアルデヒド無添加時と遜色のない程度に単量体のシグナルが検出されている。
　したがって異常型プリオン蛋白質特異的にクロスリンクさせることは、一般的な二価反応性のクロスリンカーを用いた手法では不可能である。
＜実験例１６＞
　異常型プリオン蛋白質クロスリンク反応物から、治療用生物材料あるいは治療薬創製用生物材料を製造する過程として必要な、タンパク質変性剤処理としてソディウムドデシルサルフェート添加熱処理に加えてグアニジンチオシアン酸処理を行った場合でも、クロスリンク反応物は影響を受けないことを電気泳動パターンで示した。
〔方法〕
　実験例２に準じてＮ１６７プリオン持続感染細胞の細胞溶解液を得て、１ｍＬずつ１２本のチューブにとり、そのうち６本に対してプリムリンと同等なクロスリンク活性をもつ１，３－ｂｉｓ（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｏｎｅを終濃度２０μＭになるように添加し、１０ｃｍの距離をおいて８０分間のＵＶ照射を行った。残りの６本は冷暗所に保存した。反応終了後、１２本のチューブを実験例１に準じてＰＫ処理を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルを次のように調製した。細胞溶解液の遠心後の沈殿を１５μＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーに溶解し、９５℃、５分間の熱変性処理を加えた。ＵＶ照射を行ったサンプル６本分、冷暗所保存の６本分をそれぞれ１本ずつのチューブにまとめ、９０μＬずつの溶液とした。各々のサンプルに水６０μＬを添加、攪拌後した液に対して、クロロホルム１５０μＬ、メタノール６００μＬ、水４５０μＬをこの順番に加え、６０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。上部の水層を除去し、そこにメタノール４５０μＬを加え同様に遠心分離を行った後に、上部の有機層を除き、タンパク質性の沈殿を得た。沈殿にメタノール４５０μＬを添加し、同様に遠心分離を行い、上層を廃棄することによって沈殿物を洗浄した。以上のタンパク質水溶液からタンパク質沈殿を得る処理をクロロホルム－メタノール沈殿と呼ぶ。洗浄した沈殿物を風乾後、その残渣に２０μＬの８Ｍグアニジンチオシアン酸水溶液を添加し、６０℃で１時間反応させた。反応後に８０μＬの水を加えた合計１００μＬのサンプルに対してクロロホルム－メタノール沈殿を行い、風乾後の残渣に１５μＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、その一部をウエスタンブロット用サンプルとし、実験例１に準じてＰｒＰｒｅｓの検出を行った。
〔結果〕
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーは、強力な界面活性剤ソディウムドデシルサルフェートを含んでいる。また、グアニジンチオシアン酸はタンパク質の強力な変性剤であることが知られている。治療用生物材料あるいは治療薬創製用生物材料を製造することを目的とする場合、感染性を持つ異常型プリオン蛋白質は強力なタンパク質変性により十二分に感染性を除去する必要があると同時に、生体に使用する以上、上記の強力なタンパク質変性剤も十二分に除去した試験物を調製する必要がある。この実験例で示した一連の方法で、タンパク質の徹底した変性による感染性の除去と使用した変性剤の除去が可能である。図２７のウエスタンブロットの結果では、レーン１はクロスリンク未処理のサンプル、レーン２は１，３－ｂｉｓ（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｏｎｅ存在下ＵＶ照射によるクロスリンク処理のサンプルを示している。この結果から、一連のタンパク質変性処理ならびに変性剤除去処理においても、異常型プリオン蛋白質のクロスリンク反応物は影響を受けないことが示された。
　既知量の組換えプリオン蛋白質を標準として定量したところ、レーン１に相当するサンプルにおいては、１５０ｃｍ２のＮ１６７プリオン持続感染細胞から４８μｇ相当の異常型プリオン蛋白質が、レーン２に相当するサンプルにおいては、同プリオン持続感染細胞から５２μｇ相当の異常型プリオン蛋白質が得られた。したがって、１，３－ｂｉｓ（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｏｎｅ存在下ＵＶ処理では、その反応により異常型プリオン蛋白質が損失を被ることはない。また、図の右には、レーン２のバンドシグナルのデンシトメトリーを示しているが、このデータから本実験例の反応条件では単量体と二量体が濃度比７：３で生じることが示された。
＜実験例１７＞
　クロスリンク体を開裂させることなく、マウスを死に至らしめるプリオン活性の不活化に関する実験例１６において得られた試料をマウスに投与することによって、実際にそのプリオン活性の不活化が十分であるか検証する。
［方法］
　実験例１６において、クロスリンク反応後に変性処理・脱塩処理を行って得られた試料は、Ｎ１６７プリオン持続感染細胞の１５０ｃｍ２に相当する。これを５００μＬのＰＢＳで懸濁し、２０μＬずつＴｇａ２０マウスの脳内に投与した。対照として、Ｎ１６７プリオン持続感染細胞２５ｃｍ２に相当する細胞溶解液から得られたタンパク質を、５００μＬのＰＢＳに懸濁した試料を調製し、２０μＬずつＴｇａ２０マウスの脳内に投与した。その後、両群とも通常通りに飼育し、投与日からマウスの死亡までの生存期間をもってプリオン活性について評価した。
［結果］
　図２８は、縦軸に各群の生存率、横軸に各試料の投与後の日数である。実線は、クロスリンク反応後に不活化処理した試料を投与したマウスの群、点線は対照とした不活化していないプリオンの試料を投与したマウスの群である。プリオンの試料を投与したマウスは投与後９３日ほどで死亡するのに対して、不活化処理後の試料を投与したマウスは、投与後２００日以上経過しても死亡するマウスは見られなかった。以上のことから十分に不活化できていると判断し、投与後２０６日をもって飼育を打ち切った。
＜実験例１８＞
　実験例１４の結果より、アミノ酸残基１１０番近傍部を認識する抗体の産生は、異常型プリオン蛋白質の正常型プリオン蛋白質との接触によって伝播・進行するプリオン病の予防或いは進行阻止能を発揮する可能性がある。この可能性の検証にあたり、異常型タンパク質伝播をその特徴とするプリオン病特有の以下の問題点を解決する必要がある。すなわち、抗原となるプリオン蛋白質クロスリンク反応物の動物への投与は、プリオン病の発症原因となってはならない。また、多量のプリオン蛋白質クロスリンク反応物を必要とするため、実験例５に準じた抗原となるプリオン蛋白質クロスリンク反応物では、免疫を行うのに十分な量の試料を得ることが容易ではない。そこで、疑似タンパク質として大腸菌組換えプリオン蛋白質をその原料として実施例１と同様な方法によりクロスリンク反応物試料を製造する方法の開発をおこなう。
　なお、通常、大腸菌組換えプリオン蛋白質の凝集体は、マウス個体の脳を侵し、死に至らしめる「プリオン」の活性をもたない。また、細胞に感染してタンパク質分解酵素部分抵抗性プリオン蛋白質の生産を誘起することもない。マウス等の個体や神経芽細胞腫細胞のような培養細胞においては、プリオン蛋白質は翻訳後に糖鎖とグライコシルリン酸イノシトールという脂質が付与されて、成熟体となる。一方、大腸菌組換え蛋白質では、このような化学的修飾を受けない。これらの相違点は、上述した予想されうる２つの問題を回避できる。
［方法］
　通常知られている方法を用いて、マウスプリオン蛋白質の８９番から２３１番のアミノ酸に対応するＤＮＡ配列をタンパク質発現プラスミドベクターに組み込んだ。プラスミドＤＮＡを調製し、タンパク質発現用の大腸菌に形質転換によって導入し、その大腸菌を培養して発現誘導を行った。発現タンパク質は大腸菌内に封入体として得られた。回収した大腸菌を、［３００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５］（以下、バッファーＨ）中で破砕し、遠心分離により目的タンパク質を含む沈殿物を得た。沈殿物をＰＢＳで懸濁、再び遠心分離することによって回収した。回収した沈殿物に対して、６Ｍ尿素を含むバッファーＨを加え、沈殿タンパク質の抽出を行った後に、遠心分離によってタンパク質抽出液を得た。タンパク質抽出液を分子量分画８０００の透析膜を用いて、バッファーＨに対して透析を行った。透析の内側の液を回収したのち、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフによって、溶離液として０．１％トリフルオロ酢酸を含む水から０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルへの直線濃度勾配での溶出によって精製を行った。得られた画分を凍結乾燥して、脱塩粉末状のマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）を得た。典型的には５００ｍＬの培養液から５．０ｍｇの乾燥粉末が得られた。同様にして全長に相当するマウスプリオン蛋白質（２３－２３１）の乾燥粉末も調製した。
　得られた乾燥粉末状のマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）を少量の６Ｍ尿素水溶液に溶かし、１００倍容量のリシス液で希釈した。この条件下で、当該タンパク質は徐々に凝集・沈殿が始まり、肉眼で確認できる。この希釈液を反応原料とし、２日間室温にて放置した後に、実施例１と同様の、プリムリン存在下でのＵＶ照射処理を行った試験物と、希釈と同時にプリムリン存在下でのＵＶ照射処理を行った試験物を用意した。それぞれの試験物はその反応処理後に反応液の５倍容量のメチルアルコールを添加し、蛋白質沈殿を形成させ、大気圧下で乾燥させたのち、０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水・アセトニトリル（１：１）に溶解させ凍結乾燥させることによってタンパク質粉末を得た。この一部をとり、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロットで分析した。マウスプリオン蛋白質（２３－２３１）についても同様な処理を行い、希釈後直ちに反応させた試料、反応そのものをさせなかった試料の比較を行った。
［結果］
　図２９に希釈から２日間の時間をおいて反応させた試料と希釈後直ちに反応させた試料の多量体形成反応効率について調べた結果を示す。Ａの１レーンは、希釈から２日間の時間をおいて反応させたマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のクマシーブリリアントブルー染色像である。Ｂの１レーンは希釈後直ちに反応させたマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の銀染色像である。希釈後直ちに反応させた場合には明瞭な多量体が形成されることがわかる。Ｃは大腸菌組換えマウスプリオン蛋白質（２３－２３１）の反応処理を行っていない試料（１レーン）と反応処理を行った試料（２レーン）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の銀染色像である。ＡＢＣのｍレーンは分子量マーカーである。マウスプリオン蛋白質（８９－２３１）と同一反応条件において、マウスプリオン蛋白質（２３－２３１）では明瞭な多量体は検出されなかった。マウスプリオン蛋白質（８９－２３１）はマウスプリオン蛋白質（２３－２３１）に比べて、より凝集しやすいとされておりクロスリンク反応の効率が良かった。その一方で、マウスプリオン蛋白質（８９－２３１）の凝集化が進行し、視認できるほど大きな沈殿となり、均一の水相からマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）が固相として、相分離するとクロスリンク反応が生じないと解釈できる。本項目の成果物として、抗原としてマウスに接種実験が可能な量のクロスリンク多量体を含むマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）の乾燥粉末を得た。
＜実験例１９＞
　実験例１８で得た試料が実際にプリオンに対するワクチンとして機能し、抗プリオン活性をマウス個体で誘起することが可能か検証した。クロスリンク多量体を含むマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）を変性処理後に投与することで、異常型プリオン蛋白質の蓄積を抑制できることが示された。
［方法］ 
　５週令のＢａｌｂ／ｃマウスをＡ、Ｂ、Ｃに分け、通常の方法で飼育した。実験例１８において調製した大腸菌組換えマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）クロスリンク反応物を含む凍結乾燥品０．２ｍｇを完全フロイントアジュバント（製造元Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２００μＬで懸濁し、Ｂマウスに皮下注射した。この接種日を第１日とする。第２１日に、大腸菌組換えマウスプリオン蛋白質（８９－２３１）クロスリンク反応物を含む凍結乾燥品０．２ｍｇを不完全フロイントアジュバント（製造元Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２００μＬで懸濁し、Ｂマウスに追加の皮下注射を行った。第３５日に、ＢマウスとＣマウスのそれぞれに、ＲＭＬプリオン(感染マウス脳１％（ｗ／ｖ）懸濁液)を腹腔内に１００μＬ投与した。その後、第８０日に各マウスを麻酔下で解剖を行い脾臓の一部を採取・秤量した。脾臓からの異常型プリオン蛋白質の検出にあたり、採取した脾臓は参考文献［Ｇｒａｔｈｗｏｈｌ　ＫＵＤ，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ　Ｍ，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６年、１４１巻、１８６３－１８７４頁］を元に抽出を行い、ウエスタンブロットにより異常型プリオン蛋白質の蓄積量を評価した。
［結果］ 
　図３０に異常型プリオン蛋白質のウエスタンブロットの結果を示す。Ａはワクチン接種もプリオン感染もさせていないネガティブコントロールであり、Ｂはワクチン接種後にプリオン感染させたマウス、Ｃはワクチンを接種しないでプリオンを感染させたポジティブコントロールである。Ｃのポジティブコントロールでのみ異常型プリオン蛋白質の強いシグナルが観察された。なお、図中の米印で示すシグナルは非特異的な反応である。異常型プリオン蛋白質に相当するバンドのシグナル強度を図３１に棒グラフで表した。図３０と図３１からわかるように、ワクチン接種したＢはプリオン感染に対して抵抗性を獲得していた。
＜実験例２０＞
　アミロイドＡは、ＡＡアミロイドーシスにおいて全身臓器に沈着する異常型タンパク質である。アミロイドＡを含む臓器から作製した不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を、抗原としてワクチン接種を行なったマウスでは、ＡＡアミロイドーシスの発症を抑制できることが示された。
［方法］ 
　実験的にＡＡアミロイドーシスを誘導したＢａｌｂ／ｃマウスまたはＩＬ－１ｒａＫＯマウスから脾臓および肝臓を採取し、適当量の生理食塩水中で破砕し、１０％臓器ホモジネートを得た。このホモジネートに最終濃度１０μＭとなるようにプリムリンを添加し、３０分間ＵＶ照射した。
　このサンプルの一部を分取し、実験例１と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動し、ウエスタンブロット法を実施した。アミロイドＡの検出には、マウス血清アミロイドＡ１に対するヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、２０００倍希釈）及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートロバ抗ヤギ免疫グロブリン抗体（プロメガ社製、２００００倍希釈）を使用した。
　クロスリンク処理後のサンプルを遠心分離（４００００×ｇ、２０分間）して上清を廃棄し、沈殿物に対して生理食塩水を加えて懸濁した。これを遠心分離（４００００×ｇ、２０分間）して沈殿物を洗浄する作業を１０回繰り返した後に、得られた沈殿物を水に懸濁し、遠心分離（３００００×ｇ、６０分間）後に上清を廃棄した。残った沈殿物を再び水に懸濁し、遠心分離（３００００×ｇ、６０分間）して洗浄する作業をさらに３回繰り返し、上清を回収した。３回分の上清をプールして遠心分離（１０００００×ｇ、６０分間）し、得られた沈殿物を少量の水に懸濁したものをクロスリンク処理アミロイドＡ粗精製物とした。クロスリンク処理アミロイドＡ粗精製物に対し、最終濃度３Ｍとなるようにグアニジンチオシアン酸を添加し、２５℃にて２４時間処理した後に、透析によりグアニジンチオシアン酸を除去した。透析後のサンプルを不活化アミロイドＡクロスリンク反応物とした。不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を抗原として、フロイント完全アジュバント（製造元Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合してＢａｌｂ／ｃマウスの背部皮下に１匹あたりタンパク質として０．１ｍｇを接種した。初回接種の２１日後に同サンプルをフロイント不完全アジュバント（製造元Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合して背部皮下に１匹あたりタンパク質として０．１ｍｇを追加接種した。この追加接種から４週間後に、１０ｍＬあたり６００ｍｇの乾燥ウシ型結核死菌（製造元Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して乳化したフロイント完全アジュバントを、マウス背部皮下に１匹あたり０．３ｍＬ投与し、ＡＡアミロイドーシスを誘導した。ＡＡアミロイドーシス誘導の２週間後に脾臓および肝臓を採取し、臓器へのアミロイド沈着をコンゴーレッド染色にて病理組織学的に評価した。
［結果］ 
　図３２に、アミロイドＡを含むマウス臓器ホモジネートに対してのプリムリン存在下ＵＶ処理によるクロスリンク反応の結果を示す。プリムリン存在下ＵＶ処理により、アミロイドＡクロスリンク反応物の形成が観察された。
次に、ワクチン接種の効果を図３３に示す。（１）無処置マウス、（２）不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を接種したが、アミロイドーシスを誘導しなかったマウス、（３）不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を接種せず、アミロイドーシスを誘導したマウス、（４）不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を接種し、アミロイドーシスを誘導したマウスにおいて、コンゴーレッド染色した脾臓および肝臓の病理組織切片像を示す。ワクチン接種なしで、ＡＡアミロイドーシスを誘導したマウスでは、コンゴーレッド染色により偏光顕微鏡下で黄緑色の複屈折像を呈するアミロイドが脾臓や肝臓に相当量蓄積していることが観察された。一方、不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を接種したマウスでは、ＡＡアミロイドーシスを誘導してもアミロイド蓄積が観察されなかった。すなわち、不活化アミロイドＡクロスリンク反応物を抗原とするワクチン接種が、実験的ＡＡアミロイドーシス誘導によって引き起こされる臓器へのアミロイド沈着を抑制した。白黒図では黄緑色の複屈折像がわかりにくいため、アミロイド蓄積を定性的に示した結果を図３４に表としてまとめた。
　なお、本発明については、具体的な実施例を参照して詳細に説明されるが、本発明の趣旨及び範囲から離れることなく、種々の変更、改変を施すことができることは当業者には明らかである。

Claims (9)

  1. 　コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質が、クロスリンクされた不活化オリゴマータンパク質。
  2. 　前記異常型タンパク質が、タンパク質のフラグメントである、請求項１に記載の不活化オリゴマータンパク質。
  3. 　前記クロスリンクは、前記異常型タンパクのインターフェースで生じる、請求項１又は２に記載の不活化オリゴマータンパク質。
  4. 　抗原として用いられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の不活化オリゴマータンパク質。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の不活化オリゴマータンパク質からなる、コンフォメーション病の予防又は治療剤。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の不活化オリゴマータンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、コンフォメーション病の予防又は治療のための医薬組成物。
  7. 　コンフォメーション病を予防する又は改善するためのワクチンである、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　コンフォメーション病を引き起こす複数の異常型タンパク質が、クロスリンクされたオリゴマータンパク質に、候補化合物を接触させる接触ステップ、及び
    　前記候補化合物を接触させたオリゴマータンパク質の活性及び／又は構造を測定する測定ステップ、を含む、
    コンフォメーション病医薬のスクリーニング方法。
  9. 　コンフォメーション病を引き起こす異常型タンパク質を準備する準備ステップ、
    　前記異常型タンパク質に、候補化合物を接触させる接触ステップ、
    　前記候補化合物に接触させた異常型タンパク質にクロスリンク処理を施し、オリゴマーを形成させるクロスリンクステップ、及び
    　前記候補化合物を接触させたオリゴマータンパク質の活性及び／又は構造を測定する測定ステップ、を含む、コンフォメーション病医薬のスクリーニング方法。
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"Clarification of interface between monomers of protein aggregate on cell", 2015 IMPLEMENTATION STATUS REPOR T, 6 January 2017 (2017-01-06), pages 1, Retrieved from the Internet <URL:http://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-15K01804/15K018042015hokoku> [retrieved on 20181026] *

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