WO2019031785A9 - 유전자 패널에 기초한 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 염기서열의 변이 검출 디바이스 - Google Patents

유전자 패널에 기초한 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 염기서열의 변이 검출 디바이스 Download PDF

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김상우
김준호
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a mutation of a base sequence based on a gene panel and a device for detecting a base sequence variation using the same.
  • a gene panel is a gene mutation test method in which a mutation for a plurality of target genes is composed of one panel and can be utilized in connection with diagnosis or treatment of a disease. Genetic variation can be detected on the basis of next generation sequencing (NGS) using these gene panels.
  • NGS next generation sequencing
  • the next-generation sequencing technology is a high-throughput sequencing method that can generate multiple sequencing results.
  • This high-density parallel sequencing, along with the gene panel, can be used to detect efficient sequencing of nucleotide sequences.
  • the range of the frequency of the base sequence variation that can be detected may be different depending on the platform of the next generation sequence analysis, and furthermore, the analysis method of the base sequence analysis data.
  • genes with a low ratio of nucleotide sequence variation of 1% or less have a false positive rate of 99% or more in normal genes in the next- positive) may be difficult to detect.
  • the inventors of the present invention have proposed a method of increasing the depth by reading the same gene spot several times in order to solve the problems of the next generation sequencing method applied to the gene panel. Through this, the researchers attempted to increase the limit of detection of low frequency nucleotide sequence variation, but recognized that the false positive rate, that is, the error of analysis for detection, also increases.
  • cancer can be accompanied by various genetic mutations, and somatic mutations among genetic mutations can affect cancer development or cancer progression. These somatic mutations, unlike germline mutations, often have less than 1% expression, making it difficult to detect mutations. Furthermore, even patients with the same cancer, each of the patients may have other genetic mutations. For this reason, there is a continuing need to develop methods for detecting mutations with high sensitivity and accuracy, in particular new mutation detection methods applicable to gene panels.
  • the inventors of the present invention have recognized that by correcting the mutation probability value using a replicate, the false positive rate can be reduced, and a method of detecting a mutation of a base sequence capable of detecting a mutation with a low sensitivity with high sensitivity can be provided.
  • the inventors of the present invention have invented a method for detecting a mutation of a low base sequence associated with a disease with high sensitivity by applying the above detection method to a gene panel.
  • a problem to be solved by the present invention is to provide a method for obtaining a target gene for a target sample by using a probe for a target gene provided by a gene panel,
  • the present invention provides a mutation detection method of a nucleotide sequence capable of detecting a mutation of a low frequency base sequence by reducing the error of analysis by providing a mutation probability value corrected according to analysis, and a device using the same.
  • the inventors of the present invention have recognized that new low frequency mutations associated with the disease can also be detected by providing a method for detecting a nucleotide sequence variation which is applicable to a gene panel and has improved sensitivity.
  • another object of the present invention is to provide a method for detecting a nucleotide sequence variant, which matches a nucleotide sequence variant determined by a method for detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention and a nucleotide sequence variation associated with a disease, And a device using the same.
  • a method for detecting a mutation of a base sequence which comprises the steps of: detecting a target gene using a gene panel including a probe for a plurality of target genes; Step of acquiring a plurality of target genes for a sample Each of a plurality of target genes is subjected to base sequencing plural times by using next generation sequencing (NGS), and the same base sequence or sequence
  • NGS next generation sequencing
  • the method comprising the steps of: collecting a plurality of base sequences, including non-identical base sequences; matching a plurality of base sequences with a reference base sequence; comparing a plurality of base sequences with reference base sequences Determining non-matching nucleotide sequences, and calculating the corrected results according to statistical analysis of the non-matching nucleotide sequences A mismatch based on a mutation probability of the locus (locus) in which the cost does not match sequences calculated by the following formula, determining a nucleotide sequence variation candidates
  • a method for detecting a nucleotide sequence comprising the steps of obtaining a predetermined base sequence variation and matching the base sequence variation candidate with a predetermined base sequence variation to provide information on whether the base sequence variation candidate matches the predetermined base sequence variation
  • the method comprising the steps of:
  • nucleotide sequence variation candidate when the nucleotide sequence variation candidate is different from the predetermined base sequence variation and the gene position of the base sequence variation candidate is different from the gene sequence of the predetermined base sequence variation, And providing information on the nucleotide sequence variation candidate and the gene locus thereof.
  • the next generation nucleotide sequence analysis is a next generation nucleotide sequence analysis according to a plurality of analysis platforms, and the step of collecting a plurality of nucleotide sequences is performed by a plurality of analysis platforms,
  • Each of the non-nucleotide sequences may comprise collecting a plurality of nucleotide sequences analyzed with different assay platforms.
  • the step of determining the nucleotide sequence variation candidate further includes a step of confirming a correlation between the nucleotide sequence variation candidate and the anticancer agent against the cancer treatment effect can do.
  • identifying the correlation may comprise identifying a target sequence variation that is the subject of the anticancer agent.
  • the step of determining the nucleotide sequence variation candidate is a step of determining the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the mismatching nucleotide sequence in the mismatched nucleotide sequence calculated by the calibrated calculation method according to the statistical analysis of the non- Determining a nucleotide sequence variation candidate for the target gene in the target sample based on the mutation probability value and the analysis error probability value.
  • the analysis error probability value determines an analysis error profile including an analysis error for each type of variation of the base sequence and a base call quality score of the analysis error according to the analysis platform type of the gene panel, Based on the analysis error probability value for the type of mutation of at least one base sequence can be corrected.
  • the analysis error profile may further include information on base sequences existing before and after the inconsistent locus of the gene.
  • Illumina hybrid-capture or Illumina Amplicon can be used when the analysis panel type is Illumina SureSelect.
  • the probability of the analysis error for the type of mutation from C to A and the mutation type from G to T among the analysis errors by the type of the mutation of the nucleotide sequence differs from the case of the analysis error of the mutation type of the remaining nucleotide sequence It can be higher than probability.
  • mutation of the nucleotide sequence from G to A, C to T, T to A, A to T, T may be higher than the probability of an analysis error of the variant type of the remaining base sequence.
  • IonTorrent Amplicon when the analysis panel type is AmpliSeq cancer panel, IonTorrent Amplicon may be used.
  • the IonTorrent Amplicon when used for the nucleotide sequence analysis, the nucleotide sequence is changed from G to A, from C to T, from A to C, from T to G, from T to C, and from A to G
  • the probability of the analysis error for the variant type may be higher than the probability of the analysis error for the variant type of the remaining base sequence.
  • the step of determining the nucleotide sequence variation candidate comprises determining the nucleotide sequence variation candidate for the target gene in the target sample based on the ratio of the mutation probability value to the analysis error probability value of the inconsistent locus of the gene locus
  • the method comprising the steps of:
  • the ratio can be calculated by the following equation (1).
  • the target gene is selected from the group consisting of ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53 or VHL genes.
  • the base sequence mutation may be a low frequency somatic mutation.
  • the reference nucleotide sequence may be a nucleotide sequence that does not contain a nucleotide sequence variation with respect to the same target gene locus as the target sample.
  • the statistical analysis can utilize at least one of the standard deviation and the mean value of the BAF value of the inconsistent locus for each of the plurality of base sequences.
  • a device for detecting a variation in a base sequence comprising a processor operatively connected to a communication unit, the processor including a probe for a plurality of target genes through a communication unit
  • a plurality of target genes are obtained for one target sample using a genetic panel and each of a plurality of target genes is subjected to base sequencing a plurality of times using a next generation nucleotide sequence analysis to obtain the same base
  • a plurality of base sequences including a sequence or an unequal base sequence are collected and a plurality of base sequences are matched with a reference base sequence and a plurality of base sequences are selected from among a plurality of base sequences, Based on the statistical analysis of non-matching nucleotide sequences, On the basis of the mutation probabilities for locus that matches the fire within the nucleotide sequence does not match the calculated specified calculation scheme, it is configured to determine the base sequence variation candidates for the gene of interest in the target sample.
  • the processor can be configured to further provide information on whether or not the base sequence variation candidate matches the predetermined base sequence variation by matching the base sequence variation candidate with the predetermined base sequence variation.
  • a processor is characterized in that when the nucleotide sequence variation candidate is different from the predetermined base sequence variation and the locus of the base sequence variation candidate is different from the locus of the predetermined base sequence variation, And may be further configured to provide information about different base sequence variation candidates and their genetic loci.
  • a processor for determining a mutation probability value and an analysis error probability value for an inconsistent locus in an unmatched base sequence, calculated by a calibrated calculation method according to a statistical analysis of an unmatched base sequence, , It can be configured to determine the nucleotide sequence variation candidates for the plurality of target genes in the target sample.
  • the processor can be further configured to determine a nucleotide sequence variation candidate for the target gene in the target sample, based on the ratio of the mutation probability value to the analysis error probability value of the unmatched locus.
  • the ratio can be calculated by Equation (1).
  • the present invention provides a mutation probability value that is corrected according to statistical analysis of a plurality of base sequences obtained by acquiring a target gene provided by a gene panel for one sample and performing a base sequence analysis for a plurality of times, .
  • the present invention has the effect of detecting the mutation of the low frequency base sequence.
  • the present invention has the effect of effectively detecting variations of various base sequences associated with a disease, which exist at a low frequency, by applying a method for detecting a mutation of a base sequence with enhanced sensitivity to a gene panel.
  • the method for detecting a base sequence variation is not limited to the platform type in the base sequence analysis based on the genetic panel, and provides a mutation probability value calculated by a properly calibrated method according to the analyzed base sequence data can do. Accordingly, the present invention has an effect of detecting a base sequence with improved sensitivity.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a base sequence variation detecting device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating a method of detecting a variation of a base sequence according to an embodiment of the present invention.
  • 3A and 3B show a plurality of base sequences for a target gene according to a next-generation sequencing analysis.
  • FIG. 3C is a flowchart for explaining correction of the analysis error probability value provided in the method of detecting a variation of base sequence according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3D shows a mutation probability model and an analysis error probability model provided by the method for detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4A shows the results of evaluating the method of detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention and a conventional detection method applied to an Illumina SureSelect arm panel.
  • FIG. 4B shows the results of evaluating the method of detecting the mutation of the base sequence according to an embodiment of the present invention and the conventional detection method applied to the Ion AmpliSeq arm panel.
  • FIG. 4C shows a result of evaluation of a new low frequency variation detected by applying the nucleotide sequence variation detection method according to an embodiment of the present invention.
  • Fig. 5 shows the result of evaluating the data obtained by sequencing the nucleic acid sequences with a plurality of analysis platforms, the method of detecting the mutation of the nucleotide sequence according to an embodiment of the present invention, and the conventional detection method.
  • Figure 6a shows the results of sensitivity and false positive rates of mutation detection as measured by applying the mutation detection method of the conventional base sequence to Illumina hybrid-capture.
  • Figure 6b shows the results of sensitivity and false positive rates of mutation detection as measured by applying the method of detecting mutations in the conventional base sequence to Illumina Amplicon.
  • FIG. 6C shows the results of the sensitivity and false positive rate of mutation detection, as measured by applying the method of detecting mutations in the conventional base sequence to IonTorrent Amplicon.
  • target gene may refer to a gene in a whole DNA sequence including a genetic region to be sequenced.
  • the target gene site may include a specific nucleotide sequence variation.
  • the target gene can be subjected to base sequence analysis to search for a nucleotide sequence variation gene region therefrom.
  • nucleotide sequence variation may refer to a variation of a nucleotide sequence that occurs due to various factors.
  • a mutation in a nucleotide sequence can be a mutation associated with a disease, particularly a somatic mutation, and furthermore, a mutation in a nucleotide sequence due to a genetic disease.
  • the nucleotide sequence variation is not limited to the above.
  • somatic mutations can be associated with cancer. Even in patients with the same cancer, each of the patients may have a somatic mutation with a different genetic mutation. Thus, obtaining accurate information on mutations by detecting mutations in the target gene may be important in the treatment of cancer, particularly in the selection of effective anti-cancer agents. As such, disease-associated mutations may be present at low frequency in an individual. Thus, detection of low frequency mutations with high sensitivity may be important in diagnosing diseases and setting effective treatment directions.
  • the term "gene panel” is a gene mutation detection method in which a mutation for a plurality of target genes consists of one panel.
  • This panel of genes can be based on next generation sequencing (NGS), which can be used to search for mutations in the genes associated with cancer, or in conjunction with the diagnosis or treatment of autoimmune diseases, genetic disorders have.
  • NGS next generation sequencing
  • the user can perform an analysis on the region to be analyzed for the base sequence, and furthermore, on the region to search for the base sequence variation.
  • the user can perform simultaneous analysis of a plurality of target genes in one analysis through the gene panel.
  • the gene panel may comprise a probe having a complementary base sequence for each of the target genes, and each probe may specifically bind to the target gene region in the target sample by hybridization .
  • the Cancer Gene Panel can be used to screen for a variety of cancer genes, including ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, SMRCB1, SMO, SMC, SMRCB1, SMRCB1, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, STK11, < / RTI > TP53 or the VHL gene.
  • cancer genes including ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4,
  • the above probes can be used to search for sequence variations for the desired gene.
  • the target gene to which the probe is attached can be amplified by PCR, so that it can be prepared as a library for base sequence analysis, and the nucleotide sequence variation candidate for the target gene can finally be determined through the next generation nucleotide sequence analysis.
  • next generation nucleotide sequence analysis is one of DNA sequencing techniques for genomic DNA. It can analyze nucleotide sequences at high speed by treating DNA fragments in parallel. With this feature, next-generation sequencing can be called high-throughput sequencing, massive parallel sequencing, or second-generation sequencing. Next-generation sequencing can be used as a variety of analytical platforms depending on the purpose. For example, the platform for the next generation sequencing analysis is the Roche 454, GS FLX Titanium, Illumina MiSeq, Illumina HiSeq, Illumina Genome Analyzer IIX, Life Technologies SOLiD4, Life Technologies Ion Proton, Life Technologies Ion Proton, Complete Genomics, Helicos Biosciences Heliscope , And Pacific Biosciences SMRT.
  • next-generation sequencing technique can be used to detect the mutation of the nucleotide sequence together with the gene panel as described above.
  • the analysis platform may be Illumina hybrid-capture, Illumina Amplicon, and if the panel of genes used is IonTorrent, the analysis platform is IonTorrent It can be Amplicon. However, it is not limited thereto.
  • the range of the detectable nucleotide sequence variation can be changed according to the method of analyzing the data of the nucleotide sequence analysis. That is, the detection of nucleotide sequence variations at low frequencies may depend not only on the type of gene panel and analysis platform, but also on the method of ultimately sequencing analyzed data. Accordingly, by applying the method to a gene panel, a method of detecting a mutation in a new base sequence that can effectively detect a mutation of various base sequences associated with a disease, which exists at a low frequency, may be required.
  • the term "subject sample” may be a biological sample obtained from a patient who wishes to ascertain a variation of the base sequence, and the term “reference base sequence” Or a nucleotide sequence in which no mutation of the nucleotide sequence is observed.
  • the subject sample may be a tumor cell, which may have somatic mutation.
  • the reference nucleotide sequence may be, but not limited to, data previously sequenced against normal cells.
  • the mutation of the nucleotide sequence in the target gene for the target sample can be detected by comparing it with the reference nucleotide sequence for the target gene. For example, the base sequence of the target sample is analyzed and then matched with the reference sample sequence. Then, the gene locus of the target sample inconsistent with the nucleotide sequence of the reference sample can be selected, and the mutation candidate of the nucleotide sequence in the target sample can be determined based on the mutation probability value for the inconsistent locus of the gene.
  • genetic locus may mean a nucleotide sequence at a specific position in the nucleotide sequence of the analyzed genome.
  • the nucleotide sequence of the gene locus may be a single nucleotide sequence, but is not limited thereto and may be two or more consecutive nucleotide sequences.
  • the "mutation probability value" can be an index for determining whether the locus of the target sample inconsistent with the reference sample is an error in sequence analysis or a genetic sequence variation.
  • the determination of the nucleotide sequence variation candidate for the target gene in the target sample can be performed based on the mutation probability value for the locus of the inconsistent target sample calculated by the calibrated calculation method according to the statistical analysis of a plurality of base sequences.
  • the term "plurality of base sequences” may refer to a plurality of base sequences collected by performing a plurality of base sequence analysis on the same target gene in a target sample. At this time, optionally, a plurality of base sequences can be respectively performed by different analysis platforms. Furthermore, each of the plurality of base sequences may include a plurality of leads generated as the depth increases. That is, each of the plurality of base sequences may include a base sequence of the same target gene. Furthermore, a plurality of base sequences may be non-identical base sequences. That is, the result of a single base sequence analysis on a sample to analyze the nucleotide sequence of the genome, and furthermore, the gene, may include an error in analysis.
  • the accuracy of nucleotide sequence variation detection can be higher than when one nucleotide sequence analysis is performed.
  • the probability of mutation may vary depending on the result of a plurality of base sequences analyzed for one target gene. For example, when a base sequence of one target gene is analyzed a plurality of times and each of a plurality of base sequences obtained through the above process is matched with a base sequence of a reference sample, Can be displayed constantly. In this case, the inconsistent locus of the gene may be more likely to be a variation of the base sequence than the locus of the non-identical locus. By contrast, if a locus that is inconsistent with a reference sample between multiple nucleotide sequences appears inconsistently, the inconsistent gene locus may be more likely to be an analysis error than a locus that is not.
  • BA allele frequency refers to the number of alleles obtained by analyzing a plurality of leads for one locus, and the number of bases ). ≪ / RTI > Therefore, the mutation probability may vary depending on the BAF value for the locus of the gene that does not coincide with the reference sample in the plurality of nucleotide sequences of each of the plurality of nucleotide sequences.
  • the locus of the inconsistent locus is a locus in which the BAF value between the plurality of nucleotide sequences is not constant
  • the probability of mutation is higher than the place.
  • the probability of mutation for an inconsistent locus may be related to the deviation of the BAF value for inconsistent loci between multiple nucleotide sequences.
  • the term "caliated calculation scheme based on statistical analysis of a plurality of base sequences" is based on a BAF value for one inconsistent locus of a plurality of nucleotide sequences
  • the mutation probability value may be calculated using the mutation probability value.
  • the calculation method based on the BAF value may have a small standard deviation of BAF values for loci that are inconsistent with reference samples between a plurality of base sequences.
  • the method of calculating the mutation probability value can be corrected so that the standard deviation of the BAF value for the locus that is inconsistent with the reference sample has a mutation probability value higher than that of the locus having a large value.
  • the present invention is not limited to this, and the calculation method corrected based on the BAF value can correct the mutation probability value in various ways. For example, if the standard deviation of the BAF value for a locus that is inconsistent with the reference sample between a plurality of base sequences is large, the corrected calculation method based on the BAF value is a BAF value May be a method that is calibrated to have a mutation probability value that is lower than a small gene spot.
  • the base sequence variation detection method according to an embodiment of the present invention when used for base sequence analysis by an analysis platform in which a plurality of base sequences are different from each other, it is possible to detect the base sequence variation with high accuracy without being limited to the platform type have.
  • the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention can determine a base sequence variation candidate based on a mutation probability value and an analysis error probability value calculated by a properly calibrated method according to the analyzed base sequence data.
  • the analysis error probability value may be a corrected analysis error probability value considering the type of mutation of the base sequence.
  • the corrected analysis error probability value considering the type of mutation of the base sequence can be corrected on the basis of the analysis error profile including the analysis error according to the mutation type of the base sequence and the base call quality score thereof according to the analysis platform type . More specifically, the probability of mutation of one locus can be increased as the base call quality score increases. Accordingly, the analysis error probability value considering the type of mutation of the base sequence selects the mutation type of the base sequence of the analysis error having a high base call quality score according to the analysis platform, and determines the analysis error profile including information on the base sequence quality score. The analysis error probability value for the type of mutation of the base sequence can then be corrected based on the determined analysis error profile.
  • the method of detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention can provide detection of sensitivity-enhanced base sequence variation even when a plurality of base sequence data analyzed by different assay platforms are used.
  • the nucleotide sequence variation candidate determined by the method for detecting the nucleotide sequence variation improved in sensitivity by using a plurality of data obtained by sequencing the target gene can be matched with the predetermined sequence variation.
  • the "predetermined base sequence variation” may include all base sequence variations that may be present in the desired gene. For example, if the gene panel is a cancer gene panel, the predetermined base sequence variation may be a mutation associated with cancer.
  • the determined nucleotide sequence variation candidate may be a nucleotide sequence variation newly discovered for a specific disease. Accordingly, the determined nucleotide sequence variation candidate is different from the predetermined nucleotide sequence variation, and the locus of the nucleotide sequence variation candidate may be different from the locus of the predetermined nucleotide sequence variation.
  • the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention may further provide information on a new base sequence variation candidate for a target gene and its gene locus.
  • the target sample when the target sample is a tumor cell, the target gene may be a cancer-associated gene.
  • an effective anticancer agent may be different depending on the base sequence variation candidates of the target sample.
  • the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention can further provide confirmation of a correlation between a nucleotide sequence variation candidate for cancer treatment effect and an anticancer agent. This makes it possible to determine the target base sequence mutation which is a target of the action of a specific anticancer agent, and furthermore, an effective anticancer agent against the base sequence mutation candidate can be determined.
  • a base sequence variation detection device 100 includes a communication unit 110, an input unit 120, a display unit 130, a storage unit 140, and a processor 150.
  • the base sequence variation detection device 100 can acquire a plurality of base sequences obtained by analyzing base sequence analysis of a target sample a plurality of times by a next generation base sequence analysis method.
  • the mutation detection device 100 of the base sequence can acquire a predetermined base sequence variation.
  • the input unit 120 is not limited to a keyboard, a mouse, a touch screen panel, and the like. The user can set the base sequence variation detection device 100 through the input unit 120 and direct the operation thereof.
  • the display unit 130 may display menus that allow the user to easily set the base sequence variation detecting device 100 from the user. Further, through the display unit 130, the base sequence mutation candidate for the target gene in the target sample, which is determined on the basis of the mutation probability value for the inconsistent locus of the gene, and whether or not the predetermined base sequence mutation coincides with the determined base sequence mutation candidate Information can be provided to the user. Further, when the predetermined base sequence variation is different from the determined base sequence variation candidate through the display unit 130, information on the base sequence variation candidate can be further provided to the user.
  • the display unit 130 may be a display device including a liquid crystal display device, an organic light emitting display device, and the like, and menus may be displayed to a user.
  • the display unit 130 may be implemented in various forms or methods within the scope of achieving the objects of the present invention, in addition to those described above.
  • the storage unit 140 may store a plurality of base sequences obtained through the communication unit 110.
  • a nucleotide sequence variation candidate for a target gene in a target sample determined based on a mutation probability value for an inconsistent locus of the gene can be stored.
  • the storage unit 140 may store information on whether the determined base sequence variation candidate matches the predetermined base sequence variation, and if the determined base sequence variation candidate is different from the predetermined base sequence variation, the new base sequence variation candidate And more information about the locus.
  • the processor 150 performs various instructions for operating the base sequence variation detection device 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the processor 150 is first connected to the communication unit 110 and acquires a plurality of target genes for one target sample using a gene panel including probes for a plurality of target genes through the communication unit 110. [ Next, each of a plurality of target genes is subjected to base sequencing multiple times using next generation nucleotide sequence analysis, and a plurality of base sequences including the same base sequence or non-identical base sequences for each of a plurality of target genes are collected do.
  • the reference nucleotide sequence is matched with a plurality of base sequences, and base sequences that do not match the reference nucleotide sequence with respect to a plurality of target genes among the plurality of base sequences are determined. Finally, based on the mutation probability values for unmatched loci in unmatched nucleotide sequences, calculated by a calcu- lated calculation method according to statistical analysis of non-matching nucleotide sequences, To determine a base sequence variation candidate.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating a method of detecting a variation of a base sequence according to an embodiment of the present invention.
  • a target gene is obtained for one target sample using a gene panel including probes for a plurality of target genes (S210).
  • each of the probes can specifically bind to the target gene region in the target sample by hybridization.
  • each of a plurality of target genes is subjected to base sequencing multiple times by a next-generation sequencing method, and a plurality of base sequences including the same base sequence or a non-identical base sequence for each of a plurality of target genes are collected (S220).
  • the target sample may include a plurality of leads, and the plurality of leads may be mapped to collect base sequences for each of a plurality of target genes.
  • the nucleotide sequence analysis for the reference sample can be performed together with the nucleotide sequence analysis of the target sample.
  • the collecting step S220 can be performed by a plurality of analysis platforms, and as a result, a plurality of base sequences, which are analyzed with different analysis platforms, can be collected.
  • the reference nucleotide sequence is matched with a plurality of nucleotide sequences (S230).
  • the reference nucleotide sequence and the plurality of nucleotide sequences for one target gene may be matched, respectively.
  • a plurality of nucleotide sequences for a reference nucleotide sequence and a target gene may be compared by gene locus.
  • nucleotide sequences that do not match the reference nucleotide sequence with respect to the plurality of target genes are determined (S240). For example, in step S240 of determining non-matching nucleotide sequences, it is possible to search for a gene spot that does not match the reference nucleotide sequence in at least one of the plurality of nucleotide sequences. At this time, the gene locus that is inconsistent with the reference nucleotide sequence for the target gene may be an error in the base sequence mutation or the base sequence analysis.
  • a nucleotide sequence variation candidate for the target gene is determined (S250).
  • the inconsistent gene locus in the plurality of nucleotide sequences may be selectively detected on the basis of the mutation probability value and the analysis error probability value for the unmatched nucleotide sequence in the non- The nucleotide sequence variation of the sample can be determined as a candidate.
  • the inconsistent locus of the gene can be determined as a candidate for the nucleotide sequence variation of the target sample.
  • a plurality of nucleotide sequences may be two nucleotide sequences.
  • the inconsistent locus of the two nucleotide sequences can be determined as a nucleotide sequence variation candidate of the target sample, based on the probability value calculated by multiplying the mutation probability value for the inconsistent locus of each of the two nucleotide sequences.
  • the inconsistent locus of the gene may be determined as an analysis error regardless of the mutation probability value. For example, if the mapping quality of the reference sample and the target sample is below a predetermined level, then the majority of bases in the analyzed sample of interest will have a base call quality score below a predetermined level, Indicates a predetermined level or more, the locus of these target samples may be determined as an analysis error, regardless of the mutation probability value. In addition, when the unmatched locus of each of the plurality of leads indicates a predetermined level or more, and when the mutation appears in the matching control data, the locus of these sample samples can be determined as an analysis error regardless of the mutation probability value . However, the determination of the analysis error for the locus of the gene is not limited to the above.
  • step S250 of determining the nucleotide sequence variation candidate the correlation between the nucleotide sequence variation candidate and the anticancer agent may be selectively confirmed for the cancer treatment effect. This makes it possible to determine the target base sequence mutation which is a target of the action of a specific anticancer agent, and furthermore, an effective anticancer agent against the base sequence mutation candidate can be determined.
  • the nucleotide sequence variation candidate determined through the step S250 of determining the nucleotide sequence variation candidate may optionally be matched with the predetermined nucleotide sequence variation candidate. Thereby, further information on whether or not the nucleotide sequence variation candidate matches the predetermined base sequence variation can be further provided.
  • the predetermined base sequence variation is not limited to any one of the base sequence variation detection steps described above, and can be easily obtained.
  • the nucleotide sequence variation candidate when the determined nucleotide sequence variation candidate is different from the predetermined nucleotide sequence variation and the gene locus of the nucleotide sequence variation candidate is different from the locus of the predetermined nucleotide sequence variation, the nucleotide sequence variation candidate different from the predetermined base sequence variation and the More information about the gene locus can be provided.
  • the method of detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention provides a nucleotide sequence variation candidate determined in consideration of various variables and thus a method of detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention and a device using the same, It is possible to detect the base sequence variation based on the panel and provide it to the user.
  • 3A and 3B show a plurality of base sequences for a target gene according to a next-generation sequencing analysis.
  • each of the squares may mean the degree of discrepancy with the reference sequence for the locus, i.e. BAF.
  • the cutoff value can be a reference that can be mutated based on the BAF value for the locus, and conventional techniques can determine the mutation based on this cutoff value.
  • a locus having a BAF value of greater than or equal to a cutoff for each locus it may be represented by a nucleotide sequence, in which the mutation occurs.
  • a mutation candidate in the method of detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention, can be determined by applying a flexible criterion for each type of mutation based on the mutation probability value and the analysis error probability value.
  • the place (C) where the genuine mutation occurs for the target gene can not be called as a mutation based on the simple cutoff used by conventional techniques.
  • the method of detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention gives a very low analysis error probability value to a corresponding spot.
  • an improved mutation probability value is given despite the low BAF.
  • (C) can be judged as a mutation in the method of detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention. As a result, base sequence mutations can be detected with improved sensitivity.
  • the place (B) where the analysis error occurs with respect to the target gene can be called as a mutation based on a simple cutoff used by conventional techniques.
  • a high analysis error probability value can be given to a corresponding spot.
  • a low level mutation probability value Can be given in the method of detecting a base sequence mutation according to an embodiment of the present invention.
  • (B) position can be determined as an analysis error in the method of detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention.
  • the method of detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention can determine a base sequence variation with an improved accuracy.
  • a plurality of nucleotide sequence analysis data for example, Rep.1 and Rep.2 for one target gene site should be considered in order to improve the accuracy of detection of nucleotide sequence variation.
  • a gene locus having a constant BAF value e.g., (A) and (C) positions of Rep.1 and Rep.2 and a locus with an unequal BAF value And (B) position of Rep.2 should be corrected to have different mutation probability values and analysis error probability values by analyzing the mutation pattern of the corresponding type.
  • the method for detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention can be carried out by performing a plurality of nucleotide sequence analyzes on one target gene, such as Rep.1 and Rep.2, And provides a corrected mutation probability value calculation method considering the BAF value for the locus. That is, the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention is a method for detecting a base sequence variation in the case of inconsistent digits having a constant BAF value (for example, (A) position and (C) position in Rep.1 and Rep.2) , And a calculation method corrected to have a high mutation probability value can be provided.
  • a constant BAF value for example, (A) position and (C) position in Rep.1 and Rep.2
  • the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention is characterized in that, in the case of an inconsistent spot having a non-constant BAF value (for example, the position (B) of Rep.1 and Rep.2) Can be provided with a modified mutation probability value having a low mutation probability value.
  • the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention can provide a base sequence variation detection with improved accuracy and sensitivity when applied to a gene panel.
  • FIG. 3C is a flowchart for explaining correction of the analysis error probability value provided in the method of detecting a variation of base sequence according to an embodiment of the present invention.
  • the analysis error probability value is provided as a corrected value considering the type of mutation of the base sequence.
  • an analysis error profile including an analysis error of the base sequence variation type and a base call quality score thereof is determined according to the analysis platform type (S310). More specifically, a base call quality score may be associated with an analysis error in the sequencing step. For example, a locus with an analysis error in the sequencing step may have a low base call quality score, and a locus with a mutation may have a high base call quality score. However, the analysis errors and mutation probabilities generated in the library preparation stage before the sequencing may not depend on the base call quality score.
  • the analysis error profile can be determined based on the ratio of the analysis errors generated in the library production step to the total analysis errors for each type of variation of the base sequence according to the analysis platform type.
  • a base call quality score may be used as an index for correcting an analysis error in consideration of a variation sequence of a base sequence. That is, the type of variation of the base sequence of the analysis error with high base call quality score according to the analysis platform can be selected as the correction target.
  • the base call quality score of variant type A to variant C and variant type G to T may be higher than variants of the other variants.
  • the C to A mutation and G to T mutation types are analytical errors, but mutations can lead to detection errors.
  • the mutation type of the nucleotide sequence is G to A, C to T, T to A, A to T, T to C, and A to G
  • the base call quality score of the variant type may be higher than the variance of the remaining types.
  • the type of mutation of the base sequence is G to A, C to T, A to C, T to G, T to C, and A to G
  • the base call quality score of the variant type may be higher than the variance of the remaining types.
  • the step of determining the analysis error profile can determine the analysis error profile including the base sequence quality score and the analysis error according to the variation type of the base sequence according to the above-described analysis platform type.
  • the analysis error profile may further include information on a base sequence existing before or after the inconsistent gene spot among a plurality of base sequences.
  • the analysis error probability value for the base sequence variation type is corrected according to the analysis platform type based on the analysis error profile determined in step S310 of determining the analysis error profile (S320). For example, for Illumina hybrid-capture, the probability of analysis error for the type of mutation from C to A and from G to T among the analysis errors for each base sequence variation is corrected to be higher than the analysis error probability value for the other base sequence variation types can do. Also, for Illumina Amplicon, the type of mutation of the base sequence is G to A mutation, C to T mutation, T to A mutation, A to T mutation, T to C mutation, and A to G mutation type It is possible to correct the probability value of the analysis error to be higher than the probability value of the analysis error of the mutation type of the remaining base sequence.
  • mutation types from base sequence to G to A, from C to T, from A to C, from T to G, from T to C, and from A to G Can be corrected to be higher than the probability value of the analysis error of the mutation type of the remaining base sequence.
  • the analysis error probability value for the inconsistent locus of the locus is calculated as the analysis error probability value corrected through the analysis error probability value correction step (S320). Accordingly, the base sequence variation candidates of the target sample can be determined based on the analysis error probability value and the mutation probability value, which are calculated in consideration of the base sequence for the inconsistent locus of the gene.
  • nucleotide sequence variation candidate of a target sample based on the mutation probability value and the analysis error probability value for an inconsistent locus of the gene, provided in the method for detecting the mutation of the base sequence according to an embodiment of the present invention Will be described in detail.
  • FIG. 3D shows a mutation probability model and an analysis error probability model provided by the method for detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention.
  • the six points on the x-axis of the graph mean the BAF values for the locus of the inconsistency with the reference sample represented by each of the six base sequences, and the y-axis represents the probability value. More specifically, the x-axis represents the BAF value of the three base sequences for two inconsistent loci generated as a result of sequencing three times for each of the subject samples. Furthermore, Mutation Probability Model 1 and Mutation Probability Model 2 are probability density functions of mutations made on the basis of the BAF values for inconsistent loci of three nucleotide sequences. In addition, the analysis error probability model 1 and the analysis error probability model 2 are analytical error probability density functions for inconsistent loci indicating different base sequence types based on the above-described analysis error profile.
  • the standard deviation of the BAF values of the three base sequences corresponding to the three black points of the mutation probability model 1 for the inconsistent locus of the gene corresponds to the three white points of the mutation probability model 2 Is smaller than the three base sequences. Accordingly, it can be seen that the mutation probability value of the mutation probability model 1 with a small deviation of the BAF value is higher than that of the mutation probability model 2 where the BAF value deviation is relatively large. As a result, when the mutation probability value of the mutation probability model 1 having a small deviation of the BAF value is higher than the analysis error probability value of the analysis error probability model 1, the inconsistent locus of the mutation probability model 1 can be determined as the nucleotide sequence candidate of the target sample have.
  • the inconsistent locus of the mutation probability model 2 can not be determined as a nucleotide sequence candidate of the target sample .
  • the determination of the mutation candidate of the base sequence of the target sample can be determined as a ratio value calculated from the equation (2) set in consideration of the ratio of the mutation probability value to the calculated analysis error probability value.
  • k is the number of the plurality of base sequences
  • X i is the BAF value for the ith gene locus
  • Mut is a mutation
  • TE is an analysis error.
  • S i may be a value obtained by taking a log of a ratio of a probability value obtained by adding mutation probability values of k nucleotide sequences to a probability value obtained by adding analysis probability values of k nucleotide sequences.
  • a method for detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention and a device for detecting a basin sequence using the same, when applied to a gene panel It is possible to detect the mutation of the nucleotide sequence related to the disease with high sensitivity by determining the inconsistent locus of the gene as the nucleotide sequence variation candidate of the target sample based on the ratio of the mutation probability value to the analysis error probability value of the locus.
  • conventional detection methods were Single, Intersection, BAMerge and Union.
  • Single is a nucleotide sequence variation detection method using a single nucleotide sequence analysis method.
  • Intersection can represent a detection method that determines nucleotide sequence variation based on crossed gene locus after multiple sequencing.
  • BAMerge can represent a detection method that combines the results of multiple sequencing analyzes and determines base sequence variations based on this.
  • Example 1 the evaluation of the cancer panel using the method of detecting the base sequence variation according to the embodiment of the present invention was evaluated in Example 1, the evaluation of the cancer panel in which Single was applied was evaluated in Comparative Example 1, , The evaluation of the arm panel using BAMerge is shown in Comparative Example 3, and the evaluation of the arm panel using Union is shown in Comparative Example 4, respectively.
  • Comparative Example 4 the evaluation of the arm panel using Union is shown in Comparative Example 4, respectively.
  • reference materials containing 35 cancer panel hotspot mutations and reference standards without mutations were used.
  • the mutations contained in the reference material include p.Q61H, p.Q61L, p.Q61R and p.Q61K mutations of the NRAS gene, p.F1174L mutation of the ALK gene, p.R132H and p.R132C mutations of the IDH1 gene, The p.E542K and p.E545K mutations of the gene, the p.D842V mutation of the PDGFRA gene, the p.D816V mutation of the KIT gene, the p.T790M, p.L858R and p.L861Q mutations of the EGFR gene, the p.Y1253D mutation of the MET gene , P.V600G and p.V600M mutations of the BRAF gene, p.V617F mutation of the JAK2 gene, p.Q209L mutation of the GNAQ gene, p.T315I mutation of the ABL1 gene, p.T3
  • the reference material was sequenced three times and the reference material was sequenced once.
  • nucleotide sequence analysis data (Rep.1, Rep.2 and Rep.3) for the three reference materials were used in the examples and the respective comparative examples. Specifically, in the following, (a) a combination of Rep.1 and Rep.2, (b) a combination of Rep.1 and Rep.3, (c) a combination of Rep.2 and Rep.3, , Rep.2, and Rep.3 (d).
  • FIG. 4A shows the results of evaluating the method of detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention and a conventional detection method applied to an Illumina SureSelect arm panel.
  • FIG. 4B shows the results of evaluating the method of detecting the mutation of the base sequence according to an embodiment of the present invention and the conventional detection method applied to the Ion AmpliSeq arm panel.
  • FIG. 4a (a) the detection method of the present invention and four conventional detection methods are applied to Illumina SureSelect arm panel and Illumina hybrid-capture, and evaluation results on these methods are shown in the matrix. At this time, each cell in the matrix is indicated as a blank when the mutation is detected, and a hatch when the mutation is not detected. Specifically, in the evaluation results of Example 1, in contrast to Comparative Examples 1 to 4, it was found that all 35 mutations were detected.
  • the false positive rate in the results of the Example 1 evaluation appears to be about 2 to 3 times lower than the false positive rate in the results of Comparative Examples 1 to 4. That is, the method of detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention can provide not only a low false positive rate when applied to an Illumina SureSelect arm panel but also a sensitive mutation detection.
  • the detection method of the present invention and the four conventional detection methods are applied to an Ion Amplifyq arm panel and an IonTorrent Amplicon, and evaluation results of these methods are shown in a matrix.
  • each cell in the matrix is indicated as a blank when the mutation is detected, and a hatch when the mutation is not detected.
  • the misjudgment as an error in the p.Q61L mutation of the NRAS gene and the p.E545K mutation of the PIK3CA gene, All the remaining mutations appear to be detected, except for excessive mismatches.
  • the p.Q61L and p.Q61R mutations of the NRAS gene the p.D816V mutation of the KIT gene, P.V600G mutation of the BRAF gene, p.G12A, p.G12D, p.G12V, p.G12C, p.G12R and p.G12S mutations of the KRAS gene.
  • most conventional detection methods appear to have not made calls to the above mutations (No call) and recognized the mutant sites as triallelic sites. Referring to (b) of FIG.
  • the false positive rate in the evaluation results of Example 1 is up to 40-fold different from the false positive rate in the results of Comparative Examples 1 to 4. That is, the method of detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention shows a low false positive rate when applied to an Ion Amplifyq female panel, as in the case of the application to the Illumina SureSelect arm panel (FIG. 4A) In addition, sensitive mutation detection can be provided.
  • the target sample is a sample of brain disease
  • the analysis of newly discovered mutations in the gene provided by the cancer panel in each sample is performed. More specifically, ddPCR (droplet digital PCR) is used in this analysis, and each droplet can contain one DNA strand, and PCR is performed on each droplet, The presence or absence of a mutation in the DNA strand can be confirmed. Also, in this analysis, a blank template for identifying background noise, a negative containing DNA of a non-mutated sample, and a mutated DNA for a brain disease sample DdPCR is performed on the droplet that can be measured.
  • ddPCR droplet digital PCR
  • FIG. 4C shows a result of evaluation of a new low frequency variation detected by applying the nucleotide sequence variation detection method according to an embodiment of the present invention.
  • each point may mean one droplet, the droplet not containing DNA is black, the droplet containing normal DNA is green, the droplet containing mutant DNA is blue, and one The droplets containing the normal DNA and the mutated DNA in the droplet are displayed in orange.
  • the method of detecting a nucleotide sequence variation according to an embodiment of the present invention is applied to a brain disease sample, the p.G9673V mutation of the TSC1 gene, the p.E275 * gene of the AKT3 gene, Mutations, p.H777N mutations in the TSC2 gene, p.R832L mutations in the PIK3CA gene, p.V600E mutations in the BRAF gene, and p.S2215F mutations in the MTOR gene.
  • the nucleotide sequence variation candidates determined according to the nucleotide sequence variation detection method according to an embodiment of the present invention can be detected with high sensitivity, so that a new nucleotide sequence variation different from the nucleotide sequence variation provided by the gene panel is detected . Accordingly, in the method for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention, it is possible to confirm whether or not a base sequence variation candidate determined and a predetermined base sequence variation match. Further, when the determined nucleotide sequence variant is a nucleotide sequence variation newly discovered for a specific disease, it is possible to provide further information on a candidate nucleotide sequence for the target gene and its gene locus.
  • Example 1 a method for detecting a mutation of a base sequence applicable to a gene panel according to an embodiment of the present invention and a device for detecting a base sequence variation using the same, We confirmed that mutation detection with low frequency can be detected more effectively by correcting the mutation probability value considering the type of nucleotide sequence variation.
  • the method of detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention can detect nucleotide sequence variation with high sensitivity and accuracy in all results applied to Illumina SureSelect arm panel and Ion Amplifyq arm panel.
  • the method of detecting a mutation of a base sequence according to an embodiment of the present invention maintains a low false positive rate, and it is confirmed that the detection error is reduced. Accordingly, when the method and device for detecting a base sequence variation according to an embodiment of the present invention are applied to various gene panels, it is possible to provide not only sensitivity but also high-precision analysis in detection of base sequence variation .
  • Example 2 Evaluation of mutation detection method of the nucleotide sequence of the present invention - Multi-nucleotide sequence analysis platform
  • BAMerge and Intersection are the same base sequence mutation detection methods as those used in the evaluation of Example 1 and Union can be a detection method for determining nucleotide sequence variation based on the union of a plurality of base sequence analysis data.
  • Example 1 the evaluation of the arm panel using the method of detecting the variation of the base sequence according to one embodiment of the present invention was evaluated in Example 1, the evaluation of the arm panel in which BAMerge was applied was compared with Comparative Example 1, And the evaluation of the arm panel to which the Intersection was applied is shown in Comparative Example 3.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 an F-score related to detection accuracy, recall, accuracy of detection, and recall rate was evaluated.
  • Fig. 5 shows the result of evaluating the data obtained by sequencing the nucleic acid sequences with a plurality of analysis platforms, the method of detecting the mutation of the nucleotide sequence according to an embodiment of the present invention, and the conventional detection method.
  • Example 5 a plurality of nucleotide sequence data, each of which has been subjected to nucleotide sequence analysis on different analysis platforms using Illumina hybrid-capture and Illumina Amplicon for the same target gene, The result of evaluation by applying the mutation detection method of the nucleotide sequence and the conventional detection method is shown.
  • Example 1 it appears to have a value as high as the accuracy of Comparative Example 3.
  • the F-score in Example 1 has a higher value than that in Comparative Examples 1 to 3, and particularly about 70 times higher than the F-score of Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • Example 1 a plurality of nucleotide sequence data obtained by using Illumina hybrid-capture and IonTorrent Amplicon for the same target gene were analyzed by different assay platforms, respectively, according to one embodiment of the present invention
  • the result of evaluation by applying the mutation detection method of the nucleotide sequence and the conventional detection method is shown.
  • Example 1 the accuracy is comparable to that of Comparative Example 3, so that a much higher accuracy is obtained than in Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • the F-score in Example 1 is higher than in all of Comparative Examples 1 to 3.
  • the recall number in Example 1 was lower than that in Comparative Example 3.
  • Example 1 a higher precision is obtained in Comparative Examples 1 to 3.
  • the accuracy in Example 1 is about 60 times higher than that in Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • the F-score in Example 1 is higher than in all Comparative Examples 1 to 3, and the recall number in Example 1 is lower than that in Comparative Examples 1 to 3.
  • the method of detecting a base sequence variation is not limited to the platform type in the base sequence analysis when applied to the user's panel,
  • the nucleotide sequence variation candidate can be determined by providing the mutation probability value calculated by the method described above, and the nucleotide sequence variation can be detected with improved accuracy.
  • Comparative Example 1 Evaluation of conventional low frequency mutation detection method
  • Figure 6a shows the results of sensitivity and false positive rates of mutation detection as measured by applying the mutation detection method of the conventional base sequence to Illumina hybrid-capture.
  • Figure 6b shows the results of sensitivity and false positive rates of mutation detection as measured by applying the method of detecting mutations in the conventional base sequence to Illumina Amplicon.
  • FIG. 6C shows the results of the sensitivity and false positive rate of mutation detection, as measured by applying the method of detecting mutations in the conventional base sequence to IonTorrent Amplicon.
  • the conventional method for detecting somatic mutation was to detect a somatic mutation at a low frequency using MuTect, which is one of the somatic mutation detection methods.
  • B blood samples were serially diluted in A blood samples to obtain A blood samples containing 0.5% B blood samples, A blood samples containing 1% B blood samples, and 5% B blood samples
  • a blood sample containing a blood sample and a 10% B blood sample is prepared to prepare an artificial somatic mutation sample. That is, for the A blood sample, the B blood sample can be a somatic mutation, and its four concentrations can mean the frequency of the somatic mutation.
  • MuTect was applied to the analysis platforms of Illumina hybrid-capture, Illumina Amplicon, and IonTorrent Amplicon for four prepared artificial somatic mutation samples.
  • the sensitivity of detection is lower for the A blood sample containing 0.5% B blood sample than the other concentrations. Also, as the depth increases, the false positive rate also increases. In other words, the detection sensitivity of the Illumina hybrid-capture with MuTect is low for detection of low frequency somatic mutation.
  • the sensitivity of the detection for the blood sample A containing 0.5% of the blood sample B is lower than that of the other concentrations, the difference in the sensitivity depending on the concentration is larger than the result of the application to the Illumina hybrid- .
  • the false positive rate increases significantly in all four concentration samples. That is, in the case of Illumina hybrid-capture with MuTect, the detection error may be increased when the depth is increased for low-frequency somatic mutation detection.
  • the sensitivity of detection for A blood samples containing 0.5% B blood samples is significantly lower than that for other concentrations, and the false positive rate also increases with increasing depth.
  • the sensitivity of detection can be low for the detection of a low frequency of somatic mutation, and the false positive rate increases as the depth increases. Errors can also increase. That is, when the conventional method for detecting mutation of base sequence is applied to gene panel, it is possible to detect base sequence variation of low frequency with low sensitivity. Thus, conventional methods of detecting mutations in a base sequence may not be suitable for searching for mutations associated with diseases that are present at low frequencies when applied to gene panels.
  • S250 a step of determining a nucleotide sequence variation candidate

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Abstract

본 발명은, 복수의 목적 유전자에 대한 프로브를 포함하는 유전자 패널을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 복수의 목적 유전자를 획득하는 단계, 차세대 염기서열 분석을 이용하여, 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계, 참조 염기서열과 복수 개의 염기서열을 매칭하는 단계, 복수 개의 염기서열 중 복수의 목적 유전자에 대하여 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들을 결정하는 단계 및 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 대상샘플 내의 복수의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 포함하는, 염기서열 변이의 검출방법을 제공한다.

Description

유전자 패널에 기초한 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 염기서열의 변이 검출 디바이스
본 발명은 유전자 패널에 기초한 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 염기서열의 변이 검출 디바이스에 관한 것이다.
유전자 패널 (gene panel) 은 복수 개의 목적 유전자에 대한 돌연변이가 하나의 패널로 구성된, 유전자 변이 검사 방법으로서, 질환의 진단 또는 치료와 연관되어 활용될 수 있다. 이러한 유전자 패널을 이용하여 차세대 염기서열 분석 (NGS, next generation sequencing) 을 기초로 하여 유전자 변이를 검출할 수 있다.
차세대 염기서열 분석기술은 다수의 염기서열 분석 결과물을 산출할 수 있는 고 처리량 염기서열 분석법 (high-throughput sequencing) 이다. 이러한 높은 밀도의 병행 염기서열 분석 (parallel sequencing) 은 유전자 패널과 함께, 효과적인 염기서열 변이 검출에 이용될 수 있다.
그러나, 동일한 유전자 패널을 이용하더라도, 차세대 염기서열 분석의 플랫폼, 나아가 염기서열 분석 데이터의 분석 방법에 따라서 검출 가능한 염기서열 변이 빈도의 범위는 상이할 수 있다. 또한, 라이브러리 제작을 위한 중합효소 연쇄반응도중 생겨나는 편향현상으로 인해, 1 % 이하의 낮은 비율의 염기서열 변이를 갖는 유전자는, 차세대 염기서열 분석 단계에서 99 % 이상의 정상 유전자에서 나타난 거짓 양성 (false positive) 에 묻혀 검출이 어려울 수 있다.
이에 따라, 유전자 패널에 적용가능하며, 질환과 연관된 저빈도의 돌연변이를 민감도 높게 검출할 수 있는, 새로운 염기서열의 변이 검출방법이 요구되고 있는 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 발명의 연구자들은 유전자 패널에 적용되는 차세대 염기서열 분석 방법의 문제점을 해결하기 위해 동일한 유전자 자리를 여러 번 읽는, 뎁스 (depth) 를 높이는 방법을 제안하였다. 이를 통해, 연구자들은 저빈도의 염기서열 변이 검출의 한계 수치를 높이고자 하였으나, 이로 인해 거짓 양성 비율 (false positive rate), 즉 검출을 위한 분석의 오류도 함께 증가한다는 것을 인지하였다.
특히, 유전자 패널을 이용하여 암과 연관된 염기서열의 변이를 탐색하고자 할 때, 민감도 높게 염기서열 변이를 검출함으로써 정확한 정보를 획득하는 것은 암의 치료, 특히 효과적인 항암제의 선정에 있어서 중요할 수 있다. 암은 다양한 유전체 변이를 동반할 수 있고, 유전체 변이 중 체성 돌연변이 (somatic mutation) 는 암의 발생 또는 암의 진행에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 체성 돌연변이는 배선 돌연변이 (germline mutation) 와 다르게 그 발현 비율이 1 % 미만인 경우도 많아 돌연변이를 찾아내는데 어려움이 많다. 나아가, 동일한 암을 갖는 환자라도, 환자들 각각은 다른 유전체 돌연변이를 가지고 있을 수 있다. 이러한 이유로, 민감도 및 정확도 높게 돌연변이를 검출하는 방법 특히, 유전자 패널에 적용 가능한 새로운 돌연변이 검출 방법에 대한 개발은 지속적으로 요구되었다.
한편, 본 발명의 발명자들은 리플리케이트 (replicate) 를 이용하여 돌연변이 확률값을 보정함으로써 거짓 양성 비율을 줄이고, 민감도 높은 저빈도의 돌연변이 검출이 가능한 염기서열의 변이 검출방법을 제공할 수 있음을 인식하였다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은 이상의 검출 방법을 유전자 패널에 적용함으로써, 질환과 연관된 저빈도의 돌연변이를 민감도 높게 검출할 수 있는, 새로운 염기서열의 변이 검출방법을 발명하였다.
이에 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 유전자 패널이 제공하는 목적 유전자에 대한 프로브를 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 목적 유전자를 획득하고, 이를 복수 회 염기서열 분석하여 획득한 복수 개의 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된, 돌연변이 확률값을 제공함으로써, 분석의 오류를 줄여 저빈도 염기서열의 변이를 검출할 수 있는, 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 디바이스를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 발명자들은 유전자 패널에 적용 가능하고 민감도가 향상된 염기서열 변이 검출방법을 제공함으로써, 질환과 연관된 새로운 저빈도의 돌연변이 또한 탐색할 수 있음을 인식하였다.
이에, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법으로 결정된, 염기서열 변이 후보와 질환과 연관된 염기서열 변이를 매칭하고, 이에 대한 일치 유무의 정보를 더 제공하는 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 디바이스를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법은 복수의 목적 유전자에 대한 프로브 (probe) 를 포함하는 유전자 패널 (gene panel) 을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 복수의 목적 유전자를 획득하는 단계 차세대 염기서열 분석 (NGS, next generation sequencing) 을 이용하여, 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계, 참조 염기서열과 복수 개의 염기서열을 매칭 (matching) 하는 단계, 복수 개의 염기서열 중, 복수의 목적 유전자에 대하여 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들을 결정하는 단계 및 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리 (locus) 에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 대상샘플 내의 복수의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 미리 결정된 염기서열 변이를 획득하는 단계 및 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이를 매칭함으로써, 염기서열 변이 후보와 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무의 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 염기서열 변이 후보가 미리 결정된 염기서열 변이와 상이하고, 염기서열 변이 후보의 유전자 자리가 미리 결정된 염기서열 변이의 유전자 자리와 상이한 경우, 미리 결정된 염기서열 변이와 상이한 염기서열 변이 후보 및 그 유전자 자리에 대한 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 차세대 염기서열 분석은 복수의 분석 플랫폼에 따른 차세대 염기서열 분석이고, 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계는, 복수의 분석 플랫폼에 의해 수행되고, 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열 각각은 서로 상이한 분석 플랫폼으로 분석된, 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 목적 유전자가 암 연관 유전자인 경우, 상기 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계는 암 치료효과에 대한 상기 염기서열 변이 후보와 항암제의 상관관계를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 상관관계를 확인하는 단계는 항암제의 작용의 대상이 되는 표적 염기서열 변이를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계는 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 분석에러 확률값은 유전자 패널의 분석 플랫폼 유형에 따라 염기서열의 변이 유형별 분석에러 및 분석에러의 base call quality 점수를 포함하는 분석에러 프로파일을 결정하고, 분석에러 프로파일을 기초로, 적어도 하나의 염기서열의 변이 유형에 대한 분석에러 확률값이 보정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 분석에러 프로파일은, 상기 불 일치하는 유전자 자리의 전, 후로 존재하는 염기서열의 정보를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 분석 패널 유형이 Illumina SureSelect일 경우, Illumina hybrid-capture 또는 Illumina Amplicon을 이용할 수 있다. 이때, Illumina hybrid-capture로 염기서열 분석될 경우, 염기서열의 변이 유형별 분석에러 중 C에서 A로 변이 및 G에서 T로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률은 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률보다 높을 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, Illumina Amplicon으로 염기서열 분석될 경우, 염기서열의 변이 유형 중 G에서 A로 변이, C에서 T로 변이, T에서 A로 변이, A에서 T로 변이, T에서 C로 변이 및 A에서 G로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률은 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률보다 높을 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 분석 패널 유형이 AmpliSeq cancer panel일 경우, IonTorrent Amplicon이 이용될 수 있다. 이때, IonTorrent Amplicon으로 염기서열 분석될 경우, 염기서열의 변이 유형 중 G에서 A로 변이, C에서 T로 변이, A에서 C로 변이, T에서 G로 변이, T에서 C로 변이 및 A에서 G로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률은 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률보다 높을 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계는 불 일치하는 유전자 자리의 분석에러 확률값에 대한 돌연변이 확률값의 비율을 기초로, 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 비율은, 하기 수학식 1로 산출될 수 있다.
Figure PCTKR2018008891-appb-M000001
(여기서, k는 복수 개의 염기서열의 개수이고, Xi는 i번째 유전자 자리에 대한 BAF (B allele frequency) 값이고, Mut는 돌연변이고, TE는 분석에러이다.)
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 목적 유전자는 ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53 또는 VHL 유전자 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 염기서열 변이는 저빈도 체성 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 참조 염기서열은 상기 대상샘플과 동일한 목적 유전자 자리에 대하여, 염기서열 변이를 포함하지 않은 염기서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 통계적 분석은 복수 개의 염기서열 각각에 대한 불 일치하는 유전자 자리의 BAF값의 표준편차 및 평균값 중 적어도 하나를 이용할 수 있다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출 디바이스는 통신부와 동작 가능하게 연결된 프로세서를 포함하고, 프로세서는 통신부를 통해 복수의 목적 유전자에 대한 프로브를 포함하는 유전자 패널을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 복수의 목적 유전자를 획득하고, 차세대 염기서열 분석을 이용하여, 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열을 수집하고, 참조 염기서열과 복수 개의 염기서열을 매칭하고, 복수 개의 염기서열 중, 복수의 목적 유전자에 대하여 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들을 결정하고, 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 구성된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 프로세서는 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이를 매칭함으로써, 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무의 정보를 더 제공하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 프로세서는 염기서열 변이 후보가 미리 결정된 염기서열 변이와 상이하고, 염기서열 변이 후보의 유전자 자리가 미리 결정된 염기서열 변이의 유전자 자리와 상이한 경우, 미리 결정된 염기서열 변이와 상이한 염기서열 변이 후보 및 그 유전자 자리에 대한 정보를 더 제공하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 프로세서는 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로, 대상샘플 내의 상기 복수의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 프로세서는 불 일치하는 유전자 자리의 분석에러 확률값에 대한 돌연변이 확률값의 비율을 기초로, 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 더 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 비율은, 상기 수학식 1로 산출될 수 있다.
본 발명은 하나의 대상샘플에 대하여 유전자 패널이 제공하는 목적 유전자를 획득하고, 이를 복수 회 염기서열 분석하여 획득한, 복수 개의 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된, 돌연변이 확률값을 제공함으로써, 분석에러를 줄일 수 있다. 이를 통해, 본 발명은 저빈도 염기서열의 변이를 검출할 수 있는 효과가 있다. 이에 따라, 본 발명은 민감도 향상된 염기서열의 변이 검출방법을 유전자 패널에 적용함으로써, 저빈도로 존재하는, 질환과 연관된 다양한 염기서열의 변이를 효과적으로 검출 할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법은 유전자 패널에 기초한 염기서열 분석에 있어서 플랫폼 유형에 제한되지 않고, 분석된 염기서열 데이터에 따라 알맞게 보정된 방법으로 산출된 돌연변이 확률값을 제공할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 향상된 민감도로 염기서열을 검출할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법은 민감도 향상에 따라, 유전자 패널이 제공하는 돌연변이 정보 이외에, 질병과 연관된 새로운 저빈도의 돌연변이를 탐색할 수 있고, 이에 대한 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출 디바이스의 개략적인 구성을 도시한 블록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 3a 및 3b는 차세대 염기서열 분석에 따른, 목적 유전자에 대한 복수 개의 염기서열을 도시한 것이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는 분석에러 확률값의 보정을 설명하기 위한 순서도이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는 돌연변이 확률모델 및 분석에러 확률모델을 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 Illumina SureSelect 암 패널에 적용함에 따라 평가된 결과를 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 Ion AmpliSeq 암 패널에 적용함에 따라 평가된 결과를 도시한 것이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법을 적용하여 검출한 새로운 저빈도의 변이에 대한 평가 결과를 도시한 것이다.
도 5는 복수의 분석 플랫폼으로 염기서열 분석된 데이터를, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 적용하여 평가된 결과를 도시한 것이다.
도 6a는 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 Illumina hybrid-capture에 적용함에 따라 측정된, 변이 검출의 민감도 및 거짓 양성 비율의 결과를 도시한 것이다.
도 6b는 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 Illumina Amplicon에 적용함에 따라 측정된, 변이 검출의 민감도 및 거짓 양성 비율의 결과를 도시한 것이다.
도 6c는 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 IonTorrent Amplicon에 적용함에 따라 측정된, 변이 검출의 민감도 및 거짓 양성 비율의 결과를 도시한 것이다.
발명의 이점, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우, '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "목적 유전자"는 전체 DNA 염기서열 중, 염기서열 분석하고자 하는 유전자 영역 (genetic region) 을 포함하는 유전자를 의미할 수 있다. 이때, 목적 유전자 자리는 특정한 염기서열 변이를 포함할 수 있다. 이에 따라, 목적 유전자를 염기서열 분석함으로써, 이에 대한 염기서열 변이 유전자 영역을 탐색할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "염기서열 변이"는 여러 가지 요인으로 인해, 유전체 일어나는 염기서열의 변이를 의미할 수 있다. 예를 들어, 염기서열의 변이는 질환과 연관된 돌연변이, 특히 체성 돌연변이일 수 있고, 나아가, 유전병으로 인한 염기서열의 변이일 수 있다. 그러나, 염기서열 변이는 전술한 것에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 염기서열 변이는 샘플의 오염으로 인한 염기서열의 변이, 산모의 혈액 내에서, 모체 DNA와 함께 소량으로 존재하는 태아의 DNA로 인해 나타날 수 있는, 대립유전자에 의한 염기서열 변이, 뇌 세포 안에서 소량으로 존재하는 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
한편, 체성 돌연변이는 암과 연관될 수 있다. 동일한 암을 갖는 환자라도, 환자들 각각은 다른 유전체 돌연변이를 갖는, 체성 돌연변이를 가지고 있을 수 있다. 이에, 목적 유전자에 대한 돌연변이를 검출함으로써 돌연변이에 대한 정확한 정보를 획득하는 것은 암의 치료, 특히 효과적인 항암제의 선정에 있어서 중요할 수 있다. 이와 같이, 질환 연관된 돌연변이들은 개체 내에서 저빈도로 존재할 수 있다. 이에 따라, 저빈도의 돌연변이를 민감도 높게 검출하는 것은 질환의 진단 나아가 효과적인 치료 방향 설정에 있어서 중요할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "유전자 패널 (gene panel)"은 복수개의 목적 유전자에 대한 돌연변이가 하나의 패널로 구성된, 유전자 변이 검사 방법이다. 이러한 유전자 패널은 차세대 염기서열 분석 (NGS, next generation sequencing) 에 기초로 할 수 있으며, 이는 암과 연관된 유전자 변이를 탐색하는데 이용되거나, 자가면역질환, 유전자 질환의 진단 또는 치료와 연관되어 활용될 수 있다. 유전자 패널을 통해 이용자는 염기서열 분석하고자 하는 영역, 나아가 염기서열 변이를 탐색하고자 하는 영역에 대한 분석을 수행할 수 있다. 또한, 이용자는 유전자 패널을 통해 한번의 분석에서 복수개의 목적 유전자에 대한 동시 분석을 수행할 수 있다. 유전자 패널은 목적 유전자 각각에 대한 상보적 염기서열을 갖는 프로브 (probe) 를 포함할 수 있고, 각각의 프로브는 대상샘플내의 목적 유전자 영역에 대하여 혼성화 반응 (hybridization) 에 의해 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 암 유전자 패널은 ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53 또는 VHL 유전자에 대한 프로브를 포함할 수 있다. 이상의 프로브들은 목적 유전자에 대한 염기서열 변이들을 탐색하는 데 이용될 수 있다. 이처럼, 프로브가 부착된 목적 유전자는 PCR을 통해 증폭됨으로써, 염기서열 분석을 위한 라이브러리로 제작될 수 있고, 차세대 염기서열 분석을 통해 최종적으로 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보가 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "차세대 염기서열 분석"은 유전체의 염기서열 분석기술 중 하나로, DNA 조각을 병렬로 처리함으로써 염기서열을 고속으로 분석할 수 있다. 이러한 특징으로, 차세대 염기서열 분석은 고 처리율 시퀀싱 (high-throughput sequencing), 대용량 병렬 시퀀싱 (massive parallel sequencing) 또는 2세대 시퀀싱 (second-generation sequencing) 으로 불릴 수 있다. 차세대 염기서열 분석은 목적에 따라 다양한 분석 플랫폼으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 차세대 염기서열 분석의 분석 플랫폼은 Roche 454, GS FLX Titanium, Illumina MiSeq, Illumina HiSeq, Illumina Genome Analyzer IIX, Life Technologies SOLiD4, Life Technologies Ion Proton, Life Technologies Ion Proton, Complete Genomics, Helicos Biosciences Heliscope, Pacific Biosciences SMRT등이 있을 수 있다. 이러한 차세대 염기서열 분석기술은 전술한 바와 같이 유전자 패널과 함께 염기서열의 변이 검출에 이용 될 수 있다. 예를 들어, 질환과 관련된 염기서열의 변이 검출을 위해 이용된 유전자 패널이 Illumina일 경우, 분석 플랫폼은 Illumina hybrid-capture, Illumina Amplicon일 수 있고, 이용된 유전자 패널이 IonTorrent일 경우, 분석 플랫폼은 IonTorrent Amplicon일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 동일한 유전자 패널, 염기서열 분석 플랫폼에 대하여, 검출 가능한 염기서열 변이 빈도의 범위는 염기서열 분석된 데이터의 분석 방법에 따라서 달라질 수 있다. 즉, 저빈도로 존재하는 염기서열 변이의 검출은 유전자 패널, 분석 플랫폼의 종류뿐만 아니라, 최종적으로 염기서열 분석된 데이터의 분석 방법에 의존적일 수 있다. 이에 따라, 유전자 패널에 적용함으로써, 저빈도로 존재하는, 질환과 연관된 다양한 염기서열의 변이를 효과적으로 검출 할 수 있는 새로운 염기서열의 변이 검출방법이 요구될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "대상샘플"은 염기서열의 변이를 확인하고자 하는 환자로부터 수득한 생물학적 시료일 수 있고, 본 명세서에서 사용되는 용어, "참조 염기서열"은 대상샘플과 대조적으로 목적 유전자에 대하여 염기서열의 변이가 나타나지 않은 염기서열일 수 있다. 예를 들어, 대상샘플은 체성 돌연변이를 가질 수 있는, 종양세포일 수 있다. 나아가, 참조 염기서열은 정상의 세포에 대하여 미리 염기서열 분석된 데이터가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대상샘플에 대한 목적 유전자 내의 염기서열의 변이는 목적 유전자 에 대한 참조 염기서열과 비교함으로써 검출할 수 있다. 예를 들어, 대상샘플의 염기서열을 분석한 후, 참조샘플 염기서열과 매칭한다. 그 다음, 참조샘플의 염기서열과 불 일치하는 대상샘플의 유전자 자리를 선별하고, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로 대상샘플 내의 염기서열의 변이 후보를 결정할 수 있다.
여기서, "유전자 자리"는 분석된 유전체의 염기서열 중 특정한 위치의 염기서열을 의미할 수 있다. 유전자 자리의 염기서열은 단일 염기서열일 수 있으나 이에 제한되지 않고 연속된 2개 이상의 염기서열일 수도 있다. 또한, "돌연변이 확률값"은 참조샘플과 불 일치하는 대상샘플의 유전자 자리가 염기서열 분석의 에러인지, 진짜 염기서열 변이인지 결정할 수 있는 지표가 될 수 있다. 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이후보의 결정은 복수 개의 염기서열의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된 불 일치하는 대상샘플의 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "복수 개의 염기서열"은 대상샘플내의 동일한 목적 유전자에 대하여 복수 회 염기서열 분석하여 수집한 복수 개의 염기서열을 의미할 수 있다. 이때, 선택적으로 복수 개의 염기서열은 각각 다른 분석 풀랫폼에 의해 수행될 수 있다. 나아가, 복수 개의 염기서열 각각은 뎁스 (depth) 가 높아짐에 따라 생성된 복수 개의 리드를 포함할 수 있다. 즉, 복수 개의 염기서열 각각은 동일한 목적 유전자의 염기서열을 포함할 수 있다. 나아가, 복수 개의 염기서열은 동일하지 않은 염기서열일 수 있다. 즉, 유전체의 염기서열을 분석하고자 하는 샘플, 나아가 유전자에 대한 한 번의 염기서열 분석결과는 분석의 오류를 포함할 수 있다. 이에 따라, 하나의 목적 유전자에 대해 복수 회의 염기서열 분석을 수행하여 수득한 복수 개의 염기서열을 고려할 경우, 1 회의 염기서열 분석을 수행하였을 때 보다 염기서열 변이 검출의 정확도가 높을 수 있다. 구체적으로, 하나의 목적 유전자에 대해 분석된 복수 개의 염기서열의 결과에 따라 돌연변이 확률이 달라질 수 있다. 예를 들어, 하나의 목적 유전자의 염기서열을 복수 회 분석하고, 이를 통해 획득한 복수 개의 염기서열 각각을 참조샘플의 염기서열과 매칭하였을 때, 복수 개의 염기서열간의 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리가 일정하게 나타날 수 있다. 이러한 경우, 이 불 일치하는 유전자 자리는 그렇지 않은 유전자 자리보다 염기서열의 변이일 확률이 높을 수 있다. 이와 대조적으로, 복수 개의 염기서열간의 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리가 일정하지 않게 나타나는 경우, 불 일치하는 유전자 자리는 그렇지 않은 유전자 자리보다 분석에러일 확률이 높을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "BAF (B allele frequency)"는 하나의 유전자 자리에 대하여 복수 개의 리드로 분석됨에 따라 수득한, 염기의 전체 개수 대비 참조샘플의 염기서열과 불 일치하는 염기 (B allele) 의 빈도를 의미할 수 있다. 이에, 복수 개의 염기서열 각각이 갖는 복수 개의 염기서열 내의 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값에 따라 돌연변이 확률은 달라질 수 있다. 예를 들어, 각각의 복수 개의 염기서열이 참조샘플과 불 일치하는, 하나의 유전자 자리에 대해 일정한 BAF값을 갖는 경우, 이 불 일치하는 유전자 자리는 복수 개의 염기서열간의 BAF값이 일정하지 않은 유전자 자리보다, 돌연변이일 확률이 높을 수 있다. 즉, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률은 복수 개의 염기서열간의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값의 편차와 연관되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "복수 개의 염기서열의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식"은 복수 개의 염기서열 각각의, 복수 개의 염기서열 내에 존재하는 하나의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값을 기초로 보정된 돌연변이 확률값의 산출방식일 수 있다. 구체적으로, BAF값을 기초로 보정된 산출방식은 복수 개의 염기서열 간의 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값의 표준편차가 작을 수 있다. 이러한 경우의 돌연변이 확률값의 산출 방식은 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값의 표준편차가 큰 유전자 자리보다 높은 돌연변이 확률값을 갖도록 보정될 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 BAF값을 기초로 보정된 산출방식은 다양한 방식으로 돌연변이 확률값을 보정할 수 있다. 예를 들어, BAF값을 기초로 보정된 산출방식은 복수 개의 염기서열 간의 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값의 표준편차가 큰 경우, 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값의 표준편차가 작은 유전자 자리보다 낮은 돌연변이 확률값을 갖도록 보정된 방식일 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법은 복수 개의 염기서열 각각이 서로 상이한 분석 플랫폼에 의해 염기서열 분석된 경우, 플랫폼 유형에 제한되지 않고 정확도 높게 염기서열 변이를 검출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법은 분석된 염기서열 데이터에 따라 알맞게 보정된 방법으로 산출된 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로 염기서열 변이 후보를 결정할 수 있다. 특히 분석에러 확률값은 염기서열의 변이 유형을 고려하여 보정된 분석에러 확률값일 수 있다. 구체적으로, 염기서열의 변이 유형을 고려하여 보정된 분석에러 확률값은, 분석 플랫폼 유형에 따라 염기서열의 변이 유형별 분석에러 및 이들의 base call quality 점수를 포함하는 분석에러 프로파일을 기초로 보정될 수 있다. 보다 구체적으로, 하나의 유전자 자리는 base call quality 점수가 높아짐에 따라 이의 돌연변이 확률이 높아질 수 있다. 이에 따라, 염기서열의 변이 유형을 고려한 분석에러 확률값은 분석 플랫폼에 따른 base call quality 점수가 높은 분석에러의 염기서열의 변이 유형을 선별하고, 이에 대한 정보를 포함하는 분석에러 프로파일을 결정한다. 그 다음, 결정된 분석에러 프로파일을 기초로 염기서열의 변이 유형에 대한 분석에러 확률값이 보정될 수 있다. 이와 같은 보정을 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은 서로 상이한 분석 플랫폼으로 분석된 복수 개의 염기서열 데이터를 이용하더라도, 민감도 향상된 염기서열 변이의 검출을 제공할 수 있다.
목적 유전자에 대하여 염기서열 분석된 복수개의 데이터를 활용하여 검출의 민감도가 향상된 염기서열 변이의 검출방법으로 결정된, 염기서열 변이 후보는 미리 결정된 염기서열 변이와 매칭될 수 있다. 이를 통해, 염기서열 변이 후보와 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무를 확인할 수 있다. "미리 결정된 염기서열 변이"는 목적 유전자 내에 존재할 수 있는 모든 염기서열 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 패널이 암 유전자 패널일 경우, 미리 결정된 염기서열 변이는 암과 연관된 돌연변이일 수 있다.
결정된 염기서열 변이 후보는 특정 질환에 대하여 새롭게 밝혀진 염기서열 변이일 수 있다. 이에 따라, 결정된 염기서열 변이 후보는 미리 결정된 염기서열 변이와 상이하고, 염기서열 변이 후보의 유전자 자리가 미리 결정된 염기서열 변이의 유전자 자리와 상이할 수 있다. 이상의 경우, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법은, 목적 유전자에 대한 새로운 염기서열 변이 후보와 이의 유전자 자리에 대한 정보를 더 제공할 수 있다.
또한, 대상샘플이 종양세포일 경우, 목적 유전자는 암 연관 유전자일 수 있다. 이때, 대상샘플이 갖는 염기서열 변이 후보에 따라, 개체에 대하여 효과적인 항암제가 다를 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법은 암 치료효과에 대한 염기서열 변이 후보와 항암제의 상관관계의 확인을 더 제공할 수 있다. 이를 통해, 특정 항암제의 작용의 대상이 되는 표적 염기서열 변이가 결정될 수 있고, 나아가, 염기서열 변이 후보에 대하여 효과적인 항암제가 결정될 수 있다.
이하에서는, 도 1을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출 디바이스를 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출 디바이스의 개략적인 구성을 도시한 블록도이다. 도 1을 참조하면, 염기서열의 변이 검출 디바이스 (100) 는 통신부 (110), 입력부 (120), 표시부 (130), 저장부 (140) 및 프로세서 (150) 를 포함한다.
통신부 (110) 를 통해, 염기서열의 변이 검출 디바이스 (100) 는 차세대 염기서열 분석방법으로, 하나의 대상샘플을 복수 회 염기서열 분석하여 획득한 복수 개의 염기서열을 획득할 수 있다. 선택적으로, 염기서열의 변이 검출 디바이스 (100) 는 미리 결정된 염기서열 변이를 획득할 수 있다.
입력부 (120) 는 키보드, 마우스, 터치 스크린 패널 등 제한되지 않는다. 사용자는 입력부 (120) 를 통해 염기서열의 변이 검출 디바이스 (100) 를 설정하고, 이의 동작을 지시할 수 있다.
표시부 (130) 는 사용자로부터 용이하게 염기서열의 변이 검출 디바이스 (100) 의 설정이 가능한 메뉴들을 표시할 수 있다. 더 나아가, 표시부 (130) 를 통해, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로 결정된 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보 및 결정된 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무의 정보가 사용자에게 제공될 수 있다. 나아가, 표시부 (130) 를 통해 미리 결정된 염기서열 변이와 결정된 염기서열 변이 후보가 상이한 경우, 이에 대한 정보를 사용자에게 더 제공할 수 있다. 이때, 표시부 (130) 는 액정 표시 장치, 유기 발광 표시 장치 등을 포함하는 표시 장치로서, 메뉴들이 사용자에게 디스플레이 되도록 할 수 있다. 또한, 표시부 (130) 는 전술된 것 이외에 본 발명의 목적을 달성할 수 있은 범위 내에서 다양한 형태 또는 방법으로 구현될 수 있다.
저장부 (140) 는 통신부 (110) 를 통해 획득한 복수 개의 염기서열을 저장할 수 있다. 또한, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로 결정된 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 저장할 수 있다. 선택적으로, 저장부 (140) 는 결정된 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무의 정보를 저장할 수 있고, 결정된 염기서열 변이 후보가 미리 결정된 염기서열 변이와 상이한 경우, 새로운 염기서열 변이 후보와 그 유전자 자리에 대한 정보를 더 저장할 수 있다.
프로세서 (150) 는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출 디바이스 (100) 를 동작시키기 위한 다양한 명령들을 수행한다. 프로세서 (150) 는 먼저 통신부 (110) 와 연결되어, 통신부 (110) 를 통해 복수의 목적 유전자에 대한 프로브를 포함하는 유전자 패널을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 복수의 목적 유전자를 획득한다. 그 다음, 차세대 염기서열 분석을 이용하여, 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열이 수집된다. 다음으로, 참조 염기서열과 복수 개의 염기서열을 매칭하고, 복수 개의 염기서열 중, 복수의 목적 유전자에 대하여 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들이 결정된다. 마지막으로, 프로세서는 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 대상샘플 내의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 구성된다.
이하에서는, 도 2를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에 대해 구체적으로 설명한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법을 설명하기 위한 순서도이다.
먼저, 복수의 목적 유전자에 대한 프로브를 포함하는 유전자 패널을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 목적 유전자를 획득한다 (S210). 이때, 각각의 프로브는 대상샘플내의 목적 유전자 영역에 대하여 혼성화 결합에 의해 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 획득하는 단계 (S210) 에서는 암 유전자 패널이 제공하는 ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53 또는 VHL 유전자에 대한 프로브를 이용하여, PCR을 통해 각각의 목적 유전자들을 증폭함으로써, 이들 목적 유전자에 대한 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제작이 수행될 수 있다.
그 다음, 차세대 염기서열 분석방법으로, 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열을 수집한다 (S220). 예를 들어, 대상샘플은 복수 개의 리드를 포함할 수 있고, 이 복수 개의 리드들은 매핑 (mapping) 되어 복수의 목적 유전자 각각에 대한 염기서열이 수집될 수 있다. 선택적으로, 수집하는 단계 (S220) 에서는 참조 염기서열이 없는 경우, 참조샘플에 대한 염기서열분석이 대상샘플의 염기서열 분석과 함께 수행될 수 있다. 또한, 수집하는 단계 (S220) 는 복수의 분석 플랫폼에 의해 수행될 수 있고, 이의 결과로 서로 상이한 분석플랫폼으로 분석된, 복수개의 염기서열이 수집될 수 있다.
그 다음, 참조 염기서열과 복수 개의 염기서열을 매칭한다 (S230). 매칭하는 단계 (S220) 에서는 참조 염기서열과 하나의 목적 유전자에 대한 복수 개의 염기서열 각각이 매칭될 수 있다. 예를 들어, 매칭하는 단계 (S220) 에서는 참조 염기서열과 목적 유전자에 대한 복수 개의 염기서열들이 유전자 자리 별로 비교될 수 있다.
다음으로, 복수 개의 염기서열 중, 복수의 목적 유전자에 대하여 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들을 결정한다 (S240). 예를 들어, 매칭되지 않는 염기서열들을 결정하는 단계 (S240) 에서는 복수 개의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열에서 참조 염기서열과 불 일치하는 유전자 자리를 탐색할 수 있다. 이때, 목적 유전자에 대한 참조 염기서열과 불 일치하는 유전자 자리는 염기서열 변이 또는 염기서열 분석의 에러일 수 있다.
마지막으로, 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리 (locus) 에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 대상샘플 내의 상기 복수의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정한다 (S250). 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계 (S250) 에서는 선택적으로, 매칭되지 않는 염기서열 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로, 복수 개의 염기서열 내의 불 일치하는 유전자 자리를 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정할 수 있다. 구체적으로, 불 일치하는 자리의 분석에러 확률값에 대한 돌연변이 확률값의 비율이 미리 결정된 수준 이상인 경우, 불 일치하는 유전자 자리는 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계 (S250) 에서는 복수 개의 염기서열이 두 개의 염기서열일 수 있다. 이러한 경우, 두 개의 염기서열 각각의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 곱하여 산출된 확률값을 기초로, 두 개의 염기서열 내의 불 일치하는 유전자 자리는 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정될 수 있다. 다양한 실시예에 따르면, 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계 (S250) 에서 불 일치하는 유전자 자리는 돌연변이 확률값과 무관하게, 분석에러로 결정될 수 있다. 예를 들어, 참조샘플과 대상샘플의 매핑 퀄리티가 미리 결정된 수준 이하일 경우, 분석된 대상샘플의 염기들의 대다수가 base call quality 점수가 미리 결정된 수준 이하일 경우, 유전자 자리에 대한 복수의 리드들이 삽입 또는 결실이 미리 결정된 수준 이상을 나타내는 경우, 이들 대상샘플의 유전자 자리는 돌연변이 확률값과 상관없이, 분석에러로 결정될 수 있다. 또한, 복수의 리드들 각각의 불 일치하는 유전자 자리가 미리 결정된 수준 이상을 나타내는 경우, 변이가 매칭 대조군 데이터에서 나타난 경우, 이들 대상샘플의 유전자 자리는 돌연변이 확률값과 상관없이, 분석에러로 결정될 수 있다. 그러나, 유전자 자리에 대한 분석에러의 결정은 전술한 것에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 목적 유전자가 암 연관 유전자인 경우, 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계 (S250) 에서는 선택적으로, 암 치료효과에 대한, 염기서열 변이 후보와 항암제의 상관관계의 확인이 이루어질 수 있다. 이를 통해, 특정 항암제의 작용의 대상이 되는 표적 염기서열 변이가 결정될 수 있고, 나아가, 염기서열 변이 후보에 대하여 효과적인 항암제가 결정될 수 있다.
염기서열 변이 후보를 결정하는 단계 (S250) 를 통해 결정된 염기서열 변이 후보는 선택적으로, 미리 결정된 염기서열 변이 후보와 매칭될 수 있다. 이를 통해, 염기서열 변이 후보와 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무의 정보가 더 제공될 수 있다. 이때, 미리 결정된 염기서열 변이는 전술한 염기서열 변이 검출 단계들 중 어느 하나에 제한되지 않고, 용이하게 획득될 수 있다. 나아가, 결정된 염기서열 변이 후보가 미리 결정된 염기서열 변이와 상이하고, 염기서열 변이 후보의 유전자 자리가 미리 결정된 염기서열 변이의 유전자 자리와 상이한 경우, 미리 결정된 염기서열 변이와 상이한 염기서열 변이 후보 및 그 유전자 자리에 대한 정보는 더 제공할 수 있다.
이상의 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법은 다양한 변수들을 고려하여 결정한 염기서열 변이 후보를 제공함으로써, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법 및 이를 이용한 디바이스는 민감도 높게 유전자 패널을 기초로 염기서열 변이를 검출하여 이를 사용자에게 제공할 수 있다.
이하에서는, 도 3a 및 3b를 참조하여, 본 발명의 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는, 목적 유전자에 대한 복수 개의 염기서열을 이용하여 분석에러 확률값을 보정하는 방법을 구체적으로 설명한다.
도 3a 및 3b는 차세대 염기서열 분석에 따른, 목적 유전자에 대한 복수 개의 염기서열을 도시한 것이다.
먼저, 도 3a를 참조하면, (A) 자리 내지 (C) 자리를 포함하는 목적 유전자에 대하여 2 회 차세대 염기서열 분석을 이용하여 염기서열 분석된 결과인 Rep.1, Rep.2가 나타난다. 구체적으로, 각각의 정사각형들은 유전자 자리에 대하여 참조 염기서열과 불일치의 정도, 즉 BAF를 의미할 수 있다. 한편, cutoff 값은 유전자 자리에 대한 BAF값을 기초로 돌연변이로 콜 (call) 할 수 있는 기준이 될 수 있으며, 종래의 기법들은 이러한 cutoff 값을 기초로 돌연변이를 결정할 수 있다. 이에 따라, 각 유전자 자리에 대하여 cutoff 이상의 BAF 값을 갖는 유전자 자리의 경우, 돌연변이가 나타난 자리, 즉 염기서열 변이로 표시될 수 있다. 그러나, 단순히 고정된 cutoff 값에 의존하는 기존 방법들은 복수 개의 염기서열 분석 데이터가 없을 경우 다수의 거짓 양성 (false positive) 변이를 포함하는 결과를 낳게 된다. 도 3a의 예시에서 복수 개의 염기서열 분석 데이터 (Rep.1과 Rep.2) 를 동시에 고려하지 않을 경우 Rep.1은 6개의 거짓 양성 변이가, Rep.2는 5개의 거짓 양성 변이가 돌연변이로 콜될 수 있다. 한편, 두 개의 염기서열 분석 데이터를 동시에 고려하여 함께 관찰되는 자리만을 변이 후보로 남길 경우, 분석에러가 일어난 (B) 자리를 제외한 다른 모든 거짓 양성 변이를 제거할 수 있어 정확도 향상에 크게 기여할 수 있다. 즉, 저빈도 염기서열 변이 검출의 정확도 향상을 위해서는 하나의 목적 유전자 자리에 대한 복수 개의 염기서열 분석 데이터가 필요함을 확인할 수 있다.
그러나, 종래의 cutoff 의존적인 검출 방식에 단순히 복수 개의 염기서열 분석 데이터를 추가한다고 해서 문제를 충분히 해결할 수는 없다. 예를 들어, 저빈도 염기서열 변이 검출을 위한 고심도 (high-depth) 시퀀싱 데이터에서는 (B) 자리와 같이 cutoff 값을 넘어서는 분석에러가 복수 개의 염기서열 분석 데이터에서 중복적으로 나타나 여전히 거짓 양성 변이를 많이 생성하는 경우가 빈번하게 발생한다. 또한, 일괄적인 cutoff의 적용은 돌연변이가 일어난 (C) 자리와 같이 실제 돌연변이가 존재함에도 불구하고 BAF가 cutoff보다 낮아 검출해내지 못하는 거짓 음성 (false negative) 를 많이 만들어 낼 수 있다. 이를 해결하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법에서는 돌연변이 확률값과 분석에러 확률값에 기반하여 변이 유형별로 유연한 판단 기준을 적용함으로써 돌연변이 후보를 결정할 수 있다.
구체적으로, 도 3b의 (b)를 참조하면, 목적 유전자에 대하여 진짜 돌연변이가 일어난 자리인 (C) 자리는 종래의 기법들이 사용하는 단순 cutoff에 기반하면 돌연변이로 콜될 수 없다. 그러나, 해당 타입의 염기서열 변이가 분석에러로써 관찰된 경우가 거의 없는 것을 고려하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법에서는 해당 자리에 매우 희박한 분석에러 확률값을 부여하게 된다. 또한 두 번의 염기서열 분석 결과 모두에서 일관된 BAF가 관찰되기 때문에, 낮은 BAF에도 불구하고 향상된 돌연변이 확률값이 부여된다. 이 두 요소를 종합적으로 고려하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법에서는 (C) 자리를 돌연변이로 판단할 수 있다. 그 결과, 향상된 민감도로 염기서열 변이를 검출 할 수 있다.
도 3b의 (c)를 참조하면, 목적 유전자에 대하여 분석에러가 일어난 자리 (B) 자리는 종래의 기법들이 사용하는 단순 cutoff에 기반할 경우 돌연변이로 콜될 수 있다. 반면, 해당 타입의 염기서열 변이가 분석에러로써 높은 BAF로 매우 빈번하게 나타나는 것을 고려한 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법에서는, 해당 자리에 높은 분석에러 확률값을 부여할 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법에서는, 두 번의 염기서열 분석 결과에서 서로 상이한 BAF가 관찰되는 것을 고려하여, 높은 BAF에도 불구하고 (B) 자리에 대해 낮은 수준의 돌연변이 확률값을 부여할 수 있다. 이 두 요소를 종합적으로 고려하여 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법에서는 (B) 자리를 분석에러로 결정할 수 있다. 그 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이의 검출 방법은 향상된 정확도로 염기서열 변이를 결정할 수 있다.
도 3b의 결과로, 염기서열 변이 검출의 정확도 향상을 위해서는 하나의 목적 유전자 자리에 대한 복수 개의 염기서열 분석 데이터 (예를 들어, Rep.1 및 Rep.2) 가 고려되어야 한다는 것을 확인할 수 있다. 나아가, 일정한 BAF값을 갖는 유전자 자리 (예를 들어, Rep.1 및 Rep.2의 (A) 자리 및 (C) 자리) 와 일정하지 않은 BAF 값을 갖는 유전자 자리 (예를 들어, Rep.1 및 Rep.2의 (B) 자리) 는 해당 유형의 변이 패턴을 분석하여 서로 상이한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 갖도록 보정되어야 한다는 점을 확인할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은, Rep.1 및 Rep.2와 같이, 하나의 목적 유전자에 대하여 복수 번의 염기서열 분석을 수행함으로써, 참조 염기서열과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값을 고려하여 보정된 돌연변이 확률값 산출 방식을 제공한다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은 일정한 BAF값을 갖는 불 일치하는 자리의 경우 (예를 들어, Rep.1 및 Rep.2의 (A) 자리및 (C) 자리), 이에 대하여 높은 돌연변이 확률값을 갖도록 보정된 산출방식을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은 비일정한 BAF값을 갖는 불 일치하는 자리의 경우 (예를 들어, Rep.1 및 Rep.2의 (B) 자리), 이에 대하여 상대적으로 낮은 돌연변이 확률값을 갖도록 보정된 산출방식을 제공할 수 있다. 이로써, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은, 유전자 패널에 적용 했을 때, 정확도 및 민감도가 향상된 염기서열 변이 검출을 제공할 수 있다.
이하에서는, 도 3c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 분석에러 확률값의 보정방법에 대해 구체적으로 설명한다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는 분석에러 확률값의 보정을 설명하기 위한 순서도이다.
먼저, 분석에러 확률값은 염기서열의 변이 유형을 고려하여 보정된 값으로 제공된다. 구체적으로, 분석 플랫폼 유형에 따라 염기서열의 변이 유형별 분석에러 및 이들의 base call quality 점수를 포함하는 분석에러 프로파일을 결정한다 (S310). 보다 구체적으로, base call quality 점수는 시퀀싱 단계에서 생긴 분석에러와 연관될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱 단계에서의 분석에러를 갖는 유전자 자리는 낮은 base call quality 점수를 가질 수 있고, 돌연변이를 갖는 유전자 자리는 높은 base call quality 점수를 가질 수 있다. 그러나, 염기서열 분석 전 단계의 라이브러리 제작 단계에서 생긴 분석에러와 돌연변이 확률은 base call quality 점수에 의존적이지 않을 수 있다. 이에 따라, 분석에러 프로파일을 결정하는 단계 (S310) 에서는 분석 플랫폼유형에 따른 염기서열의 변이 유형별 전체 분석에러에 대한 라이브러리 제작 단계에서 생긴 분석에러의 비율을 기초로, 분석에러 프로파일을 결정할 수 있다. 예를 들어, 분석에러 프로파일을 결정하는 단계 (S310) 에서는 염기서열의 변이 유형을 고려한 분석에러의 보정을 위해, base call quality 점수를 하나의 지표로 이용할 수 있다. 즉, 분석 플랫폼에 따른 base call quality 점수가 높은 분석에러의 염기서열의 변이 유형은 보정 대상으로 선별될 수 있다. 다양한 실시예에 따르면, 분석 플랫폼이 Illumina hybrid-capture일 경우, 염기서열의 변이 유형별 분석에러 C에서 A로 변이 및 G에서 T로 변이 유형의 base call quality 점수는 나머지 유형의 변이보다 높을 수 있다. 즉, Illumina hybrid-capture 에서, C에서 A로 변이 및 G에서 T로 변이 유형은 분석에러이지만, 돌연변이로 출력되는 검출의 오류를 범할 수 있다. 또한, 분석 플랫폼이 Illumina Amplicon일 경우, 염기서열의 변이 유형 중 G에서 A로 변이, C에서 T로 변이, T에서 A로 변이, A에서 T로 변이, T에서 C로 변이 및 A에서 G로 변이 유형의 base call quality 점수는 나머지 유형의 변이보다 높을 수 있다. 더 나아가, 분석 플랫폼이 IonTorrent Amplicon일 경우, 염기서열의 변이 유형 중 G에서 A로 변이, C에서 T로 변이, A에서 C로 변이, T에서 G로 변이, T에서 C로 변이 및 A에서 G로 변이 유형의 base call quality 점수는 나머지 유형의 변이보다 높을 수 있다. 결과적으로, 분석에러 프로파일을 결정하는 단계 (S310) 에서는 전술한 분석 플랫폼 유형에 따른 염기서열의 변이 유형별 분석에러 및 이의 base call quality 점수를 포함하는 분석에러 프로파일을 결정할 수 있다. 또한, 분석에러 프로파일은 복수 개의 염기서열 중 불 일치하는 유전자 자리의 전, 후로 존재하는 염기서열의 정보를 더 포함할 수 있다.
그 다음, 분석에러 프로파일을 결정하는 단계 (S310) 에서 결정된 분석에러 프로파일을 기초로 분석 플랫폼 유형에 따라 염기서열 변이 유형에 대한 분석에러 확률값이 보정된다 (S320). 예를 들어, Illumina hybrid-capture에 대하여, 염기서열의 변이 유형별 분석에러 중 C에서 A로 변이 및 G에서 T로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률값을 나머지 염기서열 변이 유형의 분석에러 확률값보다 높게 보정할 수 있다. 또한, Illumina Amplicon에 대하여, 염기서열의 변이 유형 중 G에서 A로 변이, C에서 T로 변이, T에서 A로 변이, A에서 T로 변이, T에서 C로 변이 및 A에서 G로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률값을 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률값보다 높게 보정할 수 있다. 더 나아가, IonTorrent Amplicon에 대하여, 염기서열의 변이 유형 중 G에서 A로 변이, C에서 T로 변이, A에서 C로 변이, T에서 G로 변이, T에서 C로 변이 및 A에서 G로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률값을 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률값보다 높게 보정할 수 있다. 결과적으로, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 분석에러 확률값은, 분석에러 확률값 보정단계 (S320) 를 통해 보정된, 분석에러 확률값으로 산출된다. 이에 따라, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 염기서열을 고려하여 산출된 분석에러 확률값 및 돌연변이 확률값을 기초로 대상샘플의 염기서열 변이 후보가 결정될 수 있다.
이하에서는, 도 3d를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는, 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로 대상샘플의 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법에서 제공하는 돌연변이 확률모델 및 분석에러 확률모델을 도시한 것이다.
구체적으로, 그래프의 x축의 6 개의 점들은 6 개의 염기서열 각각이 나타내는 참조샘플과 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값을 의미하고, y축은 확률값을 의미한다. 보다 구체적으로, x축은 대상샘플 각각에 대하여 3 회씩 염기서열 분석한 결과로 생성된, 두 개의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 3 개의 염기서열의 BAF값을 나타낸다. 더 나아가, 돌연변이 확률모델 1 및 돌연변이 확률모델 2는 3 개의 염기서열의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 BAF값을 기초로 만들어진 돌연변이의 확률밀도함수이다. 또한, 분석에러 확률모델 1 및 분석에러 확률모델 2는 전술한 분석에러 프로파일을 기초로 만들어진, 서로 다른 염기서열 유형을 나타내는 불 일치하는 유전자 자리에 대한 분석에러 확률밀도함수이다. 그래프의 x축을 참조하면, 불 일치하는 유전자 자리에 대하여, 돌연변이 확률모델 1의 3 개의 검은점에 해당하는 3 개의 염기서열의 BAF값의 표준편차는 돌연변이 확률모델 2의 3 개의 흰 점에 해당하는 3 개의 염기서열들 보다 작은 것을 알 수 있다. 이에 따라, BAF값의 편차가 작은 돌연변이 확률모델 1의 돌연변이 확률값이, BAF값의 편차가 상대적으로 큰 돌연변이 확률모델 2보다 높은 것을 알 수 있다. 결과적으로, BAF값의 편차가 작은 돌연변이 확률모델 1의 돌연변이 확률값이 분석에러 확률모델 1의 분석에러 확률값보다 높아, 돌연변이 확률모델 1의 불 일치하는 유전자 자리는 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정될 수 있다. 이와 대조적으로, BAF값의 편차가 큰 돌연변이 확률모델 2의 돌연변이 확률값이 분석에러 2의 분석에러 확률값보다 낮아, 돌연변이 확률모델 2의 불 일치하는 유전자 자리는 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정될 수 없다.
이에 따라, 대상샘플의 염기서열의 변이 후보의 결정은 산출된 분석에러 확률값에 대한 상기 돌연변이 확률값의 비율을 고려하여 설정한 수학식 2로 부터 산출된 비율값으로 결정될 수 있다.
Figure PCTKR2018008891-appb-M000002
여기서, k는 복수 개의 염기서열의 개수이고, Xi는 i번째 유전자 자리에 대한 BAF값이고, Mut는 돌연변이고, TE는 분석에러이다. 구체적으로, Si는 k 개의 염기서열 들 각각의 분석에러 확률값을 합한 확률값에 대한 k 개의 염기서열 들 각각의 돌연변이 확률값을 합한 확률값의 비율에 로그를 취한 값을 의미할 수 있다. 결과적으로, 수학식 2로 산출된 불 일치하는 유전자 자리의 비율값이, 미리 결정된 수준 이상일 경우, 이 불 일치하는 유전자 자리를 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 염기서열의 변기 검출 디바이스는 유전자 패널에 적용될 경우, 다양한 변수를 고려하여 산출한 복수 개의 염기서열 내의 참조샘플과 불 일치하는 자리에 대한 분석에러 확률값에 대한 돌연변이 확률값의 비율을 기초로 불 일치하는 유전자 자리를 대상샘플의 염기서열 변이 후보로 결정함으로써, 민감도 높게 질환과 연관된 염기서열의 변이를 검출할 수 있는 효과가 있다.
실시예 1 : 본 발명의 염기서열의 변이 검출방법에 대한 평가 - 암 패널
이하에서는, 도 4a 및 4b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법과 종래의 검출방법에 대하여 암 패널에 적용한 결과를 설명한다. 본 평가에서, 종래의 검출방법은 Single, Intersection, BAMerge 및 Union을 이용하였다. 구체적으로 Single은 한번의 염기서열 분석 방법을 이용한 염기서열 변이 검출 방법이다. Intersection은 복수 번의 염기서열 분석 후 교차되는 유전자 자리를 기초로 염기서열 변이를 결정하는 검출방법을 나타낼 수 있다. 나아가, BAMerge는 복수 번의 염기서열 분석 결과를 합쳐, 이를 기초로 염기서열 변이를 결정하는 검출방법을 나타낼 수 있다. 설명의 간명함을 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법을 적용한 암 패널에 대한 평가를 실시예 1, Single를 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 1, Intersection를 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 2, BAMerge를 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 3, Union을 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 4로 나타내어 설명한다. 본 평가에서는 35 개의 암 패널 핫스팟 돌연변이를 포함하는 표준물질 및 돌연변이를 포함하지 않는 참조 표준물질이 이용되었다. 이때, 표준물질이 포함하는 돌연변이는 NRAS 유전자의 p.Q61H, p.Q61L, p.Q61R 및 p.Q61K 돌연변이, ALK 유전자의 p.F1174L 돌연변이, IDH1 유전자의 p.R132H 및 p.R132C 돌연변이, PIK3CA 유전자의 p.E542K 및 p.E545K 돌연변이, PDGFRA 유전자의 p.D842V 돌연변이, KIT 유전자의 p.D816V 돌연변이, EGFR 유전자의 p.T790M, p.L858R 및 p.L861Q 돌연변이, MET 유전자의 p.Y1253D 돌연변이, BRAF 유전자의 p.V600G 및 p.V600M 돌연변이, JAK2 유전자의 p.V617F 돌연변이, GNAQ 유전자의 p.Q209L 돌연변이, ABL1 유전자의 p.T315I 돌연변이, FGFR2 유전자의 p.S252W 돌연변이, KRAS 유전자의 p.A146T, p.Q61H, p.Q61L, p.G12A, p.G12D, p.G12V, p.G12C, p.G12R 및 p.G12S 돌연변이, FLT3 유전자의 p.D835Y 돌연변이, MEK1/MAP2K1 유전자의 p.P124L 돌연변이, IDH2 유전자의 p.R172K 및 p.R140Q 돌연변이와 GNA11 유전자의 p.Q209L 돌연변이이다. 표준물질은 3 회, 참조 표준물질은 1회 염기서열 분석하였다. 이의 결과로, 실시예 및 각각의 비교예에서는 3 개의 표준물질에 대한 염기서열 분석 데이터 (Rep.1, Rep.2 및 Rep.3) 가 이용되었다. 구체적으로, 이하에서는 Rep.1와 Rep.2를 조합한 (a), Rep.1와 Rep.3을 조합한 (b), Rep.2와 Rep.3을 조합한 (c)와 Rep.1, Rep.2 및 Rep.3을 조합한 (d)의 분석결과가 나타난다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 Illumina SureSelect 암 패널에 적용함에 따라 평가된 결과를 도시한 것이다. 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 Ion AmpliSeq 암 패널에 적용함에 따라 평가된 결과를 도시한 것이다.
도 4a의 (a)를 참고하면, 본 발명의 검출방법 및 4 가지의 종래의 검출방법을 Illumina SureSelect 암 패널 및 Illumina hybrid-capture에 적용하고, 이들 방법에 대하여 평가한 결과가 매트릭스 상에 나타낸다. 이때, 매트릭스 내의 각각의 칸들은 돌연변이를 검출한 경우 빈칸으로, 돌연변이를 검출하지 못한 경우 해칭으로 표시된다. 구체적으로, 실시예 1의 평가 결과에서는 비교예 1 내지 비교예 4 와 대조적으로, 35 개의 돌연변이를 모두 검출한 것으로 나타난다. 비교예 1 내지 비교예 4의 결과를 참조하면, 종래의 검출방법을 적용한 Illumina SureSelect 암 패널의 경우, NRAS 유전자의 p.Q61L 및 p.Q61R 돌연변이, BRAF 유전자의 p.V600G 돌연변이, KRAS 유전자의 p.G12A, p.G12D, p.G12V, p.G12C, p.G12R 및 p.G12S 돌연변이와 FLT3 유전자의 p.D835Y 돌연변이를 모두 검출하지 못했다. 특히, 종래의 검출방법들은 대부분, 이상의 돌연변이들에 대하여 콜을 하지 못하거나 (No call), 돌연변이 사이트들을 삼중대립 사이트 (Triallelic site) 로 인식한 것으로 나타난다. 도 4a의 (b)를 참조하면, 실시예 1 평가 결과에서의 거짓 양성 비율은 비교예 1 내지 비교예 4의 결과에서의 거짓 양성 비율보다 약 2 내지 3 배 낮은 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은, Illumina SureSelect 암 패널에 적용했을 때, 낮은 거짓 양성 비율을 나타낼 뿐만 아니라, 민감도 높은 돌연변이 검출을 제공할 수 있다.
도 4b의 (a)를 참고하면, 본 발명의 검출방법 및 4 가지의 종래의 검출방법을 Ion Ampliseq 암 패널 및 IonTorrent Amplicon에 적용하고, 이들 방법에 대하여 평가한 결과가 매트릭스 상에 나타낸다. 이때, 매트릭스 내의 각각의 칸들은 돌연변이를 검출한 경우 빈칸으로, 돌연변이를 검출하지 못한 경우 해칭으로 표시된다. 구체적으로, 실시예 1의 평가 결과에서는 NRAS 유전자의 p.Q61L 돌연변이에 대하여 분석에러로 잘못 콜한 결과 (Misjudgement as an error) 와 PIK3CA 유전자의 p.E545K 돌연변이에 대하여 이들에 대한 자리들이 참조 염기서열과 과도하게 매칭되지 않은 결과들 (Excessive mismatches) 을 제외한, 나머지의 모든 돌연변이들은 검출된 것으로 나타난다. 이와 대조적으로, 비교예 1 내지 비교예 4의 결과를 참조하면, 종래의 검출방법을 적용한 Ion Ampliseq 암 패널의 경우, NRAS 유전자의 p.Q61L 및 p.Q61R 돌연변이, KIT 유전자의 p.D816V 돌연변이, BRAF 유전자의 p.V600G 돌연변이, KRAS 유전자의 p.G12A, p.G12D, p.G12V, p.G12C, p.G12R 및 p.G12S 돌연변이를 검출하지 못한 것으로 나타난다. 특히, 종래의 검출방법들은 대부분, 이상의 돌연변이들에 대하여 콜을 하지 못하거나 (No call), 돌연변이 사이트들을 삼중대립 사이트 (Triallelic site) 로 인식한 것으로 나타난다. 도 4b의 (b)를 참조하면, 실시예 1의 평가 결과에서의 거짓 양성 비율은 비교예 1 내지 비교예 4의 결과에서의 거짓 양성 비율보다 최대 40 배 차이나는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출 방법은, Illumina SureSelect 암 패널에 적용했을 때의 결과 (도 4a) 와 마찬가지로, Ion Ampliseq 암 패널 에 적용했을 경우 또한, 낮은 거짓 양성 비율을 나타낼 뿐만 아니라, 민감도 높은 돌연변이 검출을 제공할 수 있다.
이하에서는, 도 4c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법에서 제공하는, 미리 결정된 염기서열 변이 후보와 결정된 염기서열 변이 후보의 일치 유무의 정보를 제공하는 단계를 구체적으로 설명한다. 이때, 대상 샘플은 뇌 질환 샘플을 이용하였고, 각 샘플 내에서 암 패널이 제공하는 유전자에 대하여 새롭게 발견된 돌연변이들에 대한 분석이 수행된다. 보다 구체적으로, 본 분석에는 ddPCR (droplet digital PCR) 이 이용되며, 각각의 드롭렛 (droplet) 은 DNA 한 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 드롭렛에 대하여 PCR이 진행됨으로써, 드롭렛이 포함하는 DNA 가닥에 대한 돌연변이 존재의 유무가 확인될 수 있다. 또한, 본 분석에서는 것은 백그라운드 노이즈 (background noise) 를 확인하기 위한 빈 드롭렛 (No template), 변이가 없는 샘플의 DNA를 포함하는 드롭렛 (Negative), 뇌 질환 샘플에 대하여 돌연변이의 DNA를 포함할 수 있는 드롭렛 (Sample) 에 대하여 ddPCR이 진행된다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법을 적용하여 검출한 새로운 저빈도의 변이에 대한 평가 결과를 도시한 것이다. 이때, 각각의 점들은 하나의 드롭렛을 의미할 수 있고, DNA를 포함하지 않는 드롭렛은 검정색, 정상의 DNA를 포함하는 드롭렛은 초록색, 돌연변이의 DNA를 포함하는 드롭렛은 파란색, 하나의 드롭렛에 정상의 DNA와 돌연변이의 DNA를 함께 포함하는 드롭렛은 주황색으로 표시된다.
구체적으로, 뇌 질환 샘플에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법을 적용했을 때, 기존의 방법들이 검출하지 못했던, TSC1 유전자의 p.G9673V 돌연변이, AKT3 유전자의 p.E275* 돌연변이, TSC2 유전자의 p.H777N 돌연변이, PIK3CA 유전자의 p.R832L 돌연변이, BRAF 유전자의 p.V600E 돌연변이, MTOR 유전자의 p.S2215F 돌연변이의 새로운 저빈도의 돌연변이들이 발견되었다. 이들 돌연변이에 대한 분석 결과, 뇌 질환 샘플에 대하여 TSC1 유전자의 p.G9673V 돌연변이, AKT3 유전자의 p.E275* 돌연변이, TSC2 유전자의 p.H777N 돌연변이, PIK3CA 유전자의 p.R832L 돌연변이, BRAF 유전자의 p.V600E 돌연변이, MTOR 유전자의 p.S2215F 돌연변이 자리에 대하여 TSC2 유전자의 p.H777N 돌연변이를 제외한 나머지 5 개의 돌연변이 자리에서 돌연변이 DNA를 갖는 드롭렛이 나타났다. 이의 결과로, 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법에 따라 결정된 염기서열 변이 후보들은 민감도 높은 검출이 제공됨에 따라, 유전자 패널이 제공하는 염기서열 변이와 상이한 새로운 염기서열 변이가 검출될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법에서는 결정된 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이의 일치 유무를 확인할 수 있다. 나아가, 결정된 염기서열 변이 후보가 특정 질환에 대하여 새롭게 밝혀진 염기서열 변이일 경우, 목적 유전자에 대한 새로운 염기서열 변이 후보와 이의 유전자 자리에 대한 정보를 더 제공할 수 있다.
이상의 실시예 1의 결과로, 본 발명의 일 실시예에 따른, 유전자 패널에 적용 가능한 염기서열의 변이 검출방법 및 이를 이용한 염기서열의 변이 검출 디바이스는 하나의 대상샘플에 대한 복수 회의 염기서열 분석, 염기서열 변이 유형을 고려한 돌연변이 확률값 보정함으로써, 보다 효과적으로 저빈도의 돌연변이를 검출할 수 있음을 확인하였다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법은 Illumina SureSelect 암 패널 및 Ion Ampliseq 암 패널에 적용한 모든 결과에서, 염기서열 변이가 높은 민감도 및 정확도로 검출될 수 있었다. 이와 함께 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법은 낮은 거짓 양성 비율을 유지하여 검출의 오류가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른, 염기서열 변이 검출 방법 및 디바이스는 다양한 유전자 패널에 적용되었을 때, 염기서열 변이 검출에 있어서, 민감도뿐만 아니라, 정밀도 높은 분석을 제공할 수 있는 효과가 있다.
실시예 2 : 본 발명의 염기서열의 변이 검출방법에 대한 평가 - 다중 염기서열 분석 플랫폼
이하에서는, 도 5를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법과 종래의 검출방법을 복수의 분석 플랫폼에 적용한 결과를 설명한다. 본 평가에서, 종래의 검출방법은 BAMerge, Union 및 Intersection을 이용하였다. BAMerge 및 Intersection은 실시예 1의 평가에 이용된 방법과 동일한 염기서열 변이 검출방법이고, Union은 복수 의 염기서열 분석 데이터의 합집합을 기초로, 염기서열 변이를 결정하는 검출방법일 수 있다. 설명의 간명함을 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법을 적용한 암 패널에 대한 평가를 실시예 1, BAMerge를 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 1, Union를 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 2, Intersection를 적용한 암 패널에 대한 평가를 비교예 3으로 나타내어 설명한다. 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에서는 검출의 정밀도, 리콜 (Recall), 검출의 정확률 및 재현률과 관련이 있는 F-점수가 평가되었다.
도 5는 복수의 분석 플랫폼으로 염기서열 분석된 데이터를, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 적용하여 평가된 결과를 도시한 것이다.
도 5의 (a)를 참조하면, 동일한 목적 유전자에 대하여 Illumina hybrid-capture 및 Illumina Amplicon을 이용하여, 각각 상이한 분석 플랫폼으로 염기서열 분석된, 복수 개의 염기서열 데이터를 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 적용하여 평가된 결과가 나타난다. 실시예 1에서는 비교예 3의 정밀도 다음으로 높은 값을 갖는 것으로 나타난다. 또한, 실시예 1에서의 F-점수는 모든 비교예 1 내지 비교예 3 에서보다 높은 값을 갖고, 특히, 비교예 1 및 비교예 2의 F-점수보다 약 70 배 높은 F-점수가 나타난다.
도 5의 (b)를 참조하면, 동일한 목적 유전자에 대하여 Illumina hybrid-capture 및 IonTorrent Amplicon을 이용하여, 각각 상이한 분석 플랫폼으로 염기서열 분석된, 복수 개의 염기서열 데이터를 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 적용하여 평가된 결과가 나타난다. 실시예 1에서는 비교예 3의 정밀도와 비슷한 수준의 값을 나타냄으로써, 비교예 1 및 비교예 2에서 보다 월등히 높은 정밀도가 나타난다. 실시예 1에서의 F-점수는 모든 비교예 1 내지 비교예 3 에서보다 높게 나타난다. 실시예 1에서의 리콜수는 비교예 3 다음으로 낮았다.
도 5의 (c)를 참조하면, 동일한 목적 유전자에 대하여 Illumina Amplicon 및 IonTorrent Amplicon을 이용하여, 각각 상이한 분석 플랫폼으로 염기서열 분석된, 복수 개의 염기서열 데이터를 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변이 검출방법 및 종래의 검출방법을 적용하여 평가된 결과가 나타난다. 실시예 1에서는 비교예 1 내지 비교예 3에서 보다 높은 정밀도가 나타난다. 특히, 실시예 1에서의 정밀도는 비교예 1 및 비교예 2 에서의 정밀도보다 약 60배 높은 정밀도가 나타난다. 또한, 실시예 1에서의 F-점수는 모든 비교예 1 내지 비교예 3 에서보다 높게 나타나고, 실시예 1에서의 리콜수는 비교예 1 내지 비교예 3보다 낮게 나타난다.
이상의 실시예 2의 결과로, 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열 변이 검출방법은 유저자 패널에 적용될 때, 염기서열 분석에 있어서 플랫폼 유형에 제한되지 않고, 분석된 염기서열 데이터에 따라 알맞게 보정된 방법으로 산출된 돌연변이 확률값을 제공함으로써, 염기서열 변이 후보를 결정하여, 향상된 정밀도로 염기서열 변이를 검출할 수 있는 효과가 있다.
비교예 1 : 종래의 저빈도 돌연변이의 검출방법에 대한 평가
이하에서는, 도 6a, 6b 및 도 6c를 참조하여, 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 설명한다.
도 6a는 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 Illumina hybrid-capture에 적용함에 따라 측정된, 변이 검출의 민감도 및 거짓 양성 비율의 결과를 도시한 것이다. 도 6b는 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 Illumina Amplicon에 적용함에 따라 측정된, 변이 검출의 민감도 및 거짓 양성 비율의 결과를 도시한 것이다. 도 6c는 종래의 염기서열의 변이 검출방법을 IonTorrent Amplicon에 적용함에 따라 측정된, 변이 검출의 민감도 및 거짓 양성 비율의 결과를 도시한 것이다.
구체적으로, 종래의 체성 돌연변이의 검출방법은 체성 돌연변이 검출방법 중 하나인 MuTect을 이용하여, 저빈도로 나타나는 체성 돌연변이를 검출하고자 하였다.
이에 대한 평가를 위해 4가지의 샘플을 이용한다. 구체적으로, A 혈액 샘플에 B 혈액 샘플을 연속 희석하여, 0.5 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플, 1 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플, 5 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플 및 10 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플을 준비하여, 인공 체성 돌연변이 샘플을 준비한다. 즉, A 혈액 샘플에 대하여 B 혈액 샘플은 체성 돌연변이 일 수 있으며, 이의 4 가지 농도는, 체성 돌연변이의 빈도를 의미할 수 있다.
다음으로, 준비된 4 가지의 인공 체성 돌연변이 샘플에 대하여 MuTect을 Illumina hybrid-capture, Illumina Amplicon 및 IonTorrent Amplicon의 분석 플랫폼에 적용하여 평가한다.
도 6a를 참조하면, 0.5 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플에 대하여 검출의 민감도가 다른 농도에 비하여 낮은 것을 알 수 있다. 또한, 뎁스가 높아짐에 따라, 거짓 양성 비율도 함께 증가하는 것을 확인할 수 있다. 즉, MuTect을 적용한 Illumina hybrid-capture의 경우, 저빈도의 체성 돌연변이 검출에 대하여 검출 민감도가 떨어지는 것을 알 수 있다.
도 6b를 참조하면, 0.5 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플에 대하여 검출의 민감도는 다른 농도에 비하여 낮지만, 도 5a의 Illumina hybrid-capture에 적용한 결과 보다는, 농도 별 민감도의 차이가 크지 않은 것을 알 수 있다. 그러나, 거짓 양성 비율은 뎁스가 높아짐에 따라, 4 가지 농도의 샘플 모두에서 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다. 즉, MuTect을 적용한 Illumina hybrid-capture의 경우, 저빈도의 체성 돌연변이 검출을 위해 뎁스를 높였을 때, 검출의 오류가 나타날 확률이 높아질 수 있다.
도 6c를 참조하면, 0.5 %의 B 혈액 샘플이 들어있는 A 혈액 샘플에 대하여 검출의 민감도는 다른 농도에 비하여 크게 낮고, 뎁스가 높아짐에 따라 거짓 양성 비율 또한 상승하는 것을 확인할 수 있다.
이상의 비교예 1의 결과로, 기존의 체성 돌연변이 검출방법을 적용한 분석 플랫폼 모두, 저빈도의 체성 돌연변이의 검출에 대하여, 검출의 민감도가 낮을 수 있고, 뎁스가 높아짐에 따라 거짓 양성 비율이 높아져 분석의 오류 또한, 증가할 수 있다. 즉, 종래의 염기서열의 변이 검출방법은 유전자 패널에 적용했을 때, 저조한 민감도로 저빈도의 염기서열 변이를 검출할 수 있다. 이에 따라, 종래의 염기서열의 변이 검출방법은 유전자 패널에 적용될 경우, 저빈도로 존재하는 질환과 연관된 돌연변이를 탐색하는 것에 적합하지 않을 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
[부호의 설명]
100: 염기서열의 변이 검출 디바이스
110: 통신부
120: 입력부
130: 표시부
140: 저장부
150: 프로세서
S210: 획득화는 단계
S220: 수집하는 단계
S230: 매칭하는 단계
S240: 매칭되지 않는 염기서열을 결정하는 단계
S250: 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계
S310: 분석에러 프로파일을 결정하는 단계
S320: 분석에러 확률값을 보정하는 단계

Claims (23)

  1. 복수의 목적 유전자에 대한 프로브 (probe) 를 포함하는 유전자 패널 (gene panel) 을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 상기 복수의 목적 유전자를 획득하는 단계;
    차세대 염기서열 분석 (NGS, next generation sequencing) 을 이용하여, 상기 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 상기 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계;
    참조 염기서열과 상기 복수 개의 염기서열을 매칭 (matching) 하는 단계;
    상기 복수 개의 염기서열 중, 상기 복수의 목적 유전자에 대하여 상기 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들을 결정하는 단계; 및
    상기 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 상기 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리 (locus) 에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 복수의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 포함하는, 염기서열 변이의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    미리 결정된 염기서열 변이를 획득하는 단계; 및
    상기 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이를 매칭함으로써, 상기 염기서열 변이 후보와 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 일치유무의 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 염기서열 변이의 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 염기서열 변이 후보가 상기 미리 결정된 염기서열 변이와 상이하고, 상기 염기서열 변이 후보의 유전자 자리가 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 유전자 자리와 상이한 경우,
    상기 미리 결정된 염기서열 변이와 상이한 상기 염기서열 변이 후보 및 그 유전자 자리에 대한 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 염기서열 변이의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 차세대 염기서열 분석은 복수의 분석 플랫폼에 따른 차세대 염기서열 분석이고,
    상기 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계는, 상기 복수의 분석 플랫폼에 의해 수행되고
    상기 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열 각각은 서로 상이한 분석 플랙폼으로 분석된, 복수 개의 염기서열을 수집하는 단계를 포함하는, 염기서열 변이의 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 목적 유전자가 암 연관 유전자인 경우,
    상기 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계는,
    암 치료효과에 대한 상기 염기서열 변이 후보와 항암제의 상관관계를 확인하는 단계를 더 포함하는, 염기서열 변이의 검출 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 상관관계를 확인하는 단계는,
    상기 항암제의 작용의 대상이 되는 표적 염기서열 변이를 확인하는 단계를 포함하는, 염기서열 변이의 검출 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계는,
    상기 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 상기 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 더 포함하는, 염기서열의 변이 검출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 분석에러 확률값은,
    상기 유전자 패널의 분석 플랫폼 (platform) 유형에 따라 염기서열의 변이 유형별 분석에러 및 상기 분석에러의 base call quality 점수를 포함하는 분석에러 프로파일을 결정하고,
    상기 분석에러 프로파일을 기초로, 적어도 하나의 염기서열의 변이 유형에 대한 분석에러 확률값이 보정된, 염기서열의 변이 검출방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 분석에러 프로파일은,
    상기 불 일치하는 유전자 자리의 전, 후로 존재하는 염기서열의 정보를 더 포함하는, 염기서열의 변이 검출방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 분석 플랫폼 유형이 Illumina 염기서열 분석 플랫폼일 경우,
    상기 염기서열의 변이 유형별 분석에러 중 A에서 G로 변이, T에서 C로 변이, A에서 T로 변이, T에서 A로 변이, C에서 T로 변이 및 G에서 A로 변이, C에서 A로 변이 및 G에서 T로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률은 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률보다 높은, 염기서열의 변이 검출방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 분석 플랫폼 유형이 IonTorrent 염기서열 분석 플랫폼일 경우,
    상기 염기서열의 변이 유형 중 A에서 G로 변이, T에서 C로 변이, C에서 A로 변이, G에서 T로 변이, G에서 A로 변이 및 C에서 T로 변이 유형에 대한 분석에러의 확률은 나머지 염기서열의 변이 유형의 분석에러의 확률보다 높은, 염기서열의 변이 검출방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계는,
    상기 불 일치하는 유전자 자리의 상기 분석에러 확률값에 대한 상기 돌연변이 확률값의 비율을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하는 단계를 더 포함하는, 염기서열의 변이 검출방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 비율은,
    하기 수학식 1로 산출되는, 염기서열의 변이 검출방법.
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2018008891-appb-I000001
    (여기서, k는 복수 개의 염기서열의 개수이고, Xi는 i번째 유전자 자리에 대한 BAF (B allele frequency) 값이고, Mut는 돌연변이고, TE는 분석에러이다.)
  14. 제1항에 있어서,
    상기 목적 유전자는,
    ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53 또는 VHL 유전자 중 적어도 하나인, 염기서열 변이의 검출방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 염기서열 변이는 저빈도 체성 돌연변이인, 염기서열 변이의 검출방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 참조 염기서열은,
    상기 대상 샘플과 동일한 목적 유전자 자리에 대하여, 염기서열 변이를 포함하지 않은 염기서열인, 염기서열 변이의 검출방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 통계적 분석은,
    상기 복수 개의 염기서열 각각에 대한 불 일치하는 유전자 자리의 BAF값의 표준편차 및 평균값 중 적어도 하나를 이용하는, 염기서열의 변이 검출방법.
  18. 통신부와 동작 가능하게 연결된 프로세서를 포함하고,
    상기 프로세서는,
    상기 통신부를 통해 복수의 목적 유전자에 대한 프로브를 포함하는 유전자 패널을 이용하여, 하나의 대상샘플에 대하여 상기 복수의 목적 유전자를 획득하고,
    차세대 염기서열 분석을 이용하여, 상기 복수의 목적 유전자 각각을 복수 회 염기서열 분석하여, 상기 복수의 목적 유전자 각각에 대한 동일한 염기서열 또는 동일하지 않은 염기서열을 포함하는, 복수 개의 염기서열을 수집하고,
    참조 염기서열과 상기 복수 개의 염기서열을 매칭하고,
    상기 복수 개의 염기서열 중, 상기 복수의 목적 유전자에 대하여 상기 참조 염기서열과 매칭되지 않는 염기서열들을 결정하고,
    상기 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 상기 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 구성된, 염기서열의 변이 검출 디바이스.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 프로세서는,
    상기 염기서열 변이 후보와 미리 결정된 염기서열 변이를 매칭함으로써, 상기 염기서열 변이 후보와 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 일치유무의 정보를 더 제공하도록 구성된, 염기서열 변이의 검출 디바이스.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 프로세서는,
    상기 염기서열 변이 후보가 상기 미리 결정된 염기서열 변이와 상이하고, 상기 염기서열 변이 후보의 유전자 자리가 상기 미리 결정된 염기서열 변이의 유전자 자리와 상이한 경우,
    상기 미리 결정된 염기서열 변이와 상이한 상기 염기서열 변이 후보 및 그 유전자 자리에 대한 정보를 더 제공하도록 구성된, 염기서열 변이의 검출 디바이스.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 프로세서는,
    상기 매칭되지 않는 염기서열들의 통계적 분석에 따라 보정된 산출방식으로 산출된, 상기 매칭되지 않는 염기서열들 내의 불 일치하는 유전자 자리에 대한 돌연변이 확률값 및 분석에러 확률값을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 복수의 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 구성된, 염기서열의 변이 검출 디바이스.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 프로세서는,
    상기 불 일치하는 유전자 자리의 상기 분석에러 확률값에 대한 상기 돌연변이 확률값의 비율을 기초로, 상기 대상샘플 내의 상기 목적 유전자에 대한 염기서열 변이 후보를 결정하도록 더 구성된, 염기서열의 변이 검출 디바이스.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 비율은,
    하기 수학식 1로 산출되는, 염기서열의 변이 검출 디바이스.
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2018008891-appb-I000002
    (여기서, k는 복수 개의 염기서열의 개수이고, Xi는 i번째 유전자 자리에 대한 BAF (B allele frequency) 값이고, Mut는 돌연변이고, TE는 분석에러이다.)
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