WO2019025659A1 - Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer - Google Patents

Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer Download PDF

Info

Publication number
WO2019025659A1
WO2019025659A1 PCT/ES2018/070544 ES2018070544W WO2019025659A1 WO 2019025659 A1 WO2019025659 A1 WO 2019025659A1 ES 2018070544 W ES2018070544 W ES 2018070544W WO 2019025659 A1 WO2019025659 A1 WO 2019025659A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
antibody
use according
carcinoma
presenilin
Prior art date
Application number
PCT/ES2018/070544
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rogelio Gonzalez Sarmiento
Miguel RODRIGUEZ MANOTAS
Javier FERNANDEZ MATEOS
Juan Carlos GALLAR RUIZ
David FLORENCIANO GOMEZ
Original Assignee
Alzheimur 2012 S.L.
Ibsal (Instituto De Investigación Biomédica De Salamanca)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alzheimur 2012 S.L., Ibsal (Instituto De Investigación Biomédica De Salamanca) filed Critical Alzheimur 2012 S.L.
Priority to US16/636,416 priority Critical patent/US11919967B2/en
Priority to CA3073894A priority patent/CA3073894A1/en
Priority to JP2020528514A priority patent/JP7202576B2/ja
Priority to RU2020108510A priority patent/RU2020108510A/ru
Priority to AU2018311276A priority patent/AU2018311276A1/en
Publication of WO2019025659A1 publication Critical patent/WO2019025659A1/es

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to the use of anti-presenilin antibodies in the treatment of cancer. Therefore, the present invention falls within the field of medicine, more specifically, in the field of molecular biology applied to medicine, pharmacology and oncology.
  • Cancer treatment is approached by different approaches, usually combined, that can be classified into the following main groups: biological therapies, chemotherapy, hormone therapy, radiotherapy, stem cell and bone marrow transplants, surgery, and supportive therapies (p. eg bisphosphonates, erythropoietin, hematopoietic growth factors, spheroids and platelet transfusions).
  • Biological therapy also known as immunotherapy, uses substances that the body produces naturally to destroy cancer cells.
  • treatments including monoclonal antibodies, cancer growth inhibitors, angiogenesis inhibitors, vaccines and gene therapy, among others. Immunotherapy is aimed at a multiple variety of targets.
  • TK tyrosine kinase
  • PDGFR platelet-derived growth factor receptor
  • FGFR fibroblast growth factor receptor
  • VEGFR vascular endothelial growth factor receptor
  • the receptors of this family are frequently implicated in neoplasms of animals and humans and a single tumor cell can overexpress more than one type of these receptors.
  • inhibitors of tyrosine kinase activity have been developed, such as, for example, gefitinib, erlotinib and lapatinib, as well as monoclonal antibodies against the extracellular domain of the receptor.
  • trastuzumab is an anti-ErbB2 / HER2 for breast cancer
  • cetuximab is an anti-ErbB1 / EGFR for colon cancer
  • bevacizumab is an anti-VEGF for colorectal, breast and lung cancers
  • MUC1 has been used as a tumor marker in therapeutic follow-up in patients with breast cancer, known as the CA15.3 marker; it is elevated 10 to 15 times in patients with metastatic cancer, although its prognostic value is only important when analyzed together with other parameters.
  • huBrE-3 and R-1549 pemtumomab
  • CTLA4 antigen 4 of the cytotoxic T lymphocyte
  • PD1 programmed death protein 1
  • Blockade of CTLA4 receptors by antibodies directed against them or their ligands favors antitumor immunity; that is why the FDA (Food and Drug Administration) has approved the use of some of these antibodies, such as Ipilimumab, for complementary therapy in cancer.
  • the inventors have discovered the utility of an anti-presenilin antibody, or a fragment thereof, for use in the prevention and / or treatment of cancer. Specifically, the inventors have demonstrated that the use of an anti-presenilin antibody or a fragment thereof, specifically an antibody, or a fragment thereof capable of binding to the antigen comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] of the Presenilin, is useful in the prevention and / or treatment of cancer.
  • Presenilins are transmembrane proteins whose genes, preferably in humans, have a high homology among them (80% identity at the nucleotide level). In the present invention it is understood, therefore, by “presenilin” presenilin 1 comprising SEQ ID NO: 2, or presenilin 2 comprising SEQ ID NO: 3.
  • the term "antigen" for the purposes of the present invention refers to a predetermined region to which the antibody is capable of selectively binding.
  • the antigen can be a polypeptide, a carbohydrate, a nucleic acid, a lipid, a hapten or another natural or synthetic molecule.
  • the antigen is a polypeptide, more preferably, the antigen comprises SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] of presenilin for use in prevention and / or cancer treatment, in a subject.
  • the present invention relates to the use of an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] of presenilin, for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of cancer in a subject.
  • presenilin is selected from among presenilin 1 comprising SEQ ID NO: 2, or presenilin 2 comprising SEQ ID NO: 3.
  • the use of the antibody described in the present invention is useful in the prevention and / or treatment of tumors by inhibiting the growth of tumor cells, as a consequence of the inhibition and / or decreased expression of proteins such as NOTCH.
  • One of the advantages of the use of an anti-presenilin antibody that specifically binds to SEQ ID NO: 1 for the prevention and / or treatment of cancer, as described herein, is that said antibody does not pass through. the blood-brain barrier, thus avoiding the adverse effects of said fact.
  • the peptide of sequence SEQ ID NO: 1 is an eight amino acid peptide corresponding to residues 14 to 21 of the amino acid sequence of luminal loop 1 (LL1) of the first luminal region (RL1) of presenilin 1 or presenilin 2.
  • the LL1 of the RL1 of presenilin 1 comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • the LL1 of the RL1 of presenilin 2 comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 5.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the peptide of SEQ ID NO: 1 as a pharmacological target for the screening of molecules useful in the prevention and / or treatment of cancer.
  • the term "antibody” refers to immunoglobulin molecules, or to immunologically active portions of immunoglobulin molecules, ie, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with the LL1 of the RL1 of presenilin 1 (SEQ ID NO: 2) or presenilin 2 (SEQ ID NO: 3), and more specifically with the peptide of SEQ ID NO: 3, comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 5.
  • portions of immunologically active immunoglobulin molecules include F (ab) and F (ab ') 2 fragments, which can be generated by treating the antibody with an enzyme such as pepsin, or recombinantly.
  • the antibody of the invention can be polyclonal (typically includes different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen).
  • the term "monoclonal antibody” refers to a population of antibody molecules that contain only one species of an antigen binding site capable of immunoreacting with a particular antigen epitope.
  • the monoclonal antibody can be altered biochemically, by genetic manipulation, or it can be synthetic, possibly lacking the antibody in its entirety or in parts, of portions that are not necessary for the recognition of the antigen.
  • the antibody, as described in its use in the present invention is preferably a polyclonal antibody.
  • the antibody as described in the present invention is characterized in that it can be a recombinant, humanized, chimeric, synthetic antibody or a combination of any of the previous ones.
  • a "recombinant antibody” is an antibody that has been produced in a host cell transformed or transfected with a polynucleotide encoding the peptide comprising SEQ ID NO: 1, with a nucleic acid encoding the antibody of the invention , or which produces the antibody that specifically binds to SEQ ID NO: 1, or the peptide of SEQ ID NO: 1, as a result of homologous recombination.
  • a “chimeric antibody” is an antibody in which a region of the heavy and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies from a particular species or belonging to a certain class or subclass of antibodies, while the (s) remaining chain (s) is (are) identical, or homologous (s), to the corresponding sequences in antibodies derived from other species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of said antibodies, so as to exhibit the desired biological activity.
  • treatment as understood in the present invention relates to combating the effects caused as a consequence of the disease or pathological condition of interest in a subject (preferably mammal, and more preferably a human) which includes:
  • prevention is to prevent the occurrence of the disease, i.e. to prevent the occurrence of the disease or pathological condition in a subject (preferably mammal, and more preferably a human), in particular, when said subject has a predisposition for the pathological condition, but has not yet been diagnosed as having it.
  • cancer refers to a malignant tumor of unlimited potential growth that expands locally by invasion and systemically by metastasis.
  • the term cancer in the present invention encompasses solid tumors, as well as hematological tumors, such as leukemias, Lymphomas and myelodysplastic syndromes.
  • the antibody or fragment thereof that specifically binds to SEQ ID NO: 1 of presenilin, preferably human, are administered to individuals with cancer.
  • the cancer comprises solid tumors, and / or hematological tumors, such as leukemias, lymphomas and myelodysplastic syndromes.
  • the cancer is selected from the list consisting of lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer. Cutaneous melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, gastric cancer, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vagina carcinoma, vulvar carcinoma , esophageal cancer, small bowel cancer, cancer of the urethra, prostate cancer, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, central nervous system (CNS) and peripheral tumors, spinal cord tumors, brain stem glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, medulloblastomas, meningiomas, squamous cell carcinomas and / or pituitary adenoma, lymphomas and leukemias.
  • the cancer is preferably breast cancer, head and neck cancer
  • subject refers to all animals classified as mammals and includes, but is not restricted to, domestic and farm animals, primates and humans, eg, humans, primates non-humans, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats, or rodents.
  • the subject is a human male or female of any age or race.
  • Another aspect of the present invention relates to a medicament or pharmaceutical composition comprising the anti-presenilin antibody, as previously described, together with a pharmacologically acceptable carrier and / or excipient, for use in the prevention and / or treatment of cancer.
  • the present invention relates to the use of a medicament or pharmaceutical composition comprising the anti-presenilin antibody, as previously described, together with a pharmacologically acceptable carrier and / or excipient, for the preparation of a medicament or pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of cancer.
  • medicament or “pharmaceutical composition”, used interchangeably throughout the present document, as used in the present description, refers to any substance or combination of substances that is presented as possessing properties for the treatment or prevention of diseases in organisms, preferably humans, or that may be used or administered to organisms, preferably humans, in order to restore, correct or modify physiological functions exerting a pharmacological, immunological or metabolic action.
  • the medicament or pharmaceutical composition of the invention can be used either alone or in combination with other medicaments or compositions for preventing and / or improving cancer as a combination therapy, being able to be administered at the same time or at different times.
  • the preparation of the pharmaceutical composition can be carried out by any of the methods known and described in the state of the art.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a substance that is used in the composition to dilute any of the components comprised therein to a given volume or weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or one of analogous action to any of the elements comprised in the composition of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and shape to the composition.
  • Water or aqueous solutions of saline and aqueous solutions of dextrose and glycerol, particularly for injectable solutions, are preferably used as carriers.
  • excipient refers to a substance which helps the absorption of the elements of the composition of the invention, stabilizes said elements, activates or assists in the preparation of the composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, as for example is the case of starches, sugars or celluloses, the function of sweetening, the function of coloring, the protection function of the composition, as for example, to isolate it from air and / or moisture, the filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation, the disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients. mentioned in this paragraph.
  • “Pharmaceutically acceptable vehicles and / or adjuvants” are approved by the regulatory agency of a state or federal government or are listed in the United States Pharmacopoeia or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more particularly in humans. Said compounds are widely known in the state of the art.
  • Both the antibody described in the present invention and the pharmaceutical composition comprising it are used in a therapeutically effective amount, the term "therapeutically effective amount” being understood as the level, amount or concentration of antibody of the invention or pharmaceutical composition comprising it, which produces the desired effect of prevention and / or cancer treatment, preferably inhibiting the growth thereof, without causing adverse effects.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, the age, weight, sex or tolerance of the individual to whom the antibody is to be administered or to the pharmaceutical composition of the invention comprising it.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated for administration in a variety of ways known in the state of the art.
  • preparations include any solid composition (tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquid (solutions, suspensions or emulsions) for oral, topical or parenteral administration.
  • the composition of the present invention may also be in the form of sustained release drug formulations or any other system conventional release, may be contained, but without limitation, in nanoparticles, liposomes or nanospheres, in a polymeric material, in a biodegradable or non-biodegradable implant or in my own biodegradable particles, such as, for example, biodegradable microspheres.
  • it is formulated for oral, parenteral, intravenous or intratumoral administration.
  • compositions and / or its formulations may be administered to an animal, including a mammal and, thus, to man, in a variety of forms, including, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intradermal, intraspinal, intrastromal, intrasynovial, intralesional, intraarterial. , intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intracapsular, oral, enteral, parenteral, intranasal, topical, using transdermal patches, percutaneous, nasal spray, surgical implant or infusion pump.
  • a preferred route of administration of the invention for the treatment and / or prevention of cancer is intravenous administration.
  • the pharmaceutical composition of the invention is characterized in that it also comprises an antitumor agent.
  • agent or “chemotherapeutic agent”, used interchangeably throughout this document, is meant any substance capable of inhibiting cell proliferation or that is capable of inducing cell death.
  • Agents capable of inhibiting cell proliferation without causing cell death are generically referred to as cytostatic agents, while those that are capable of inducing cell death normally by activating apoptosis are generically referred to as cytotoxic agents.
  • antitumor agents suitable for use in the composition of the invention include, without limitation, (i) microtubule stabilizing agents such as taxanes, paclitaxel, docetaxel, epothilones and laulimalides, (ii) inhibitors of kinases such as Iressa (R), Gleevec, Tarceva TM, (Erlotinib HCI), BAY-43-9006, (iii) specific antibodies to receptors with kinase activity including, but not limited to, Trastuzumab (Herceptin (R)), Cetuximab (Erbitux (R)) ), Bevacizumab (Avastin TM), Rituximab (ritusan (R)), Pertuzumab (Omnitarg TM); (iv) inhibitors of mTOR route, such as rapamycin and CCI-778; (v) Apo2L1Trail, (vi) anti-angiogenic agents such as
  • antibiotic cytotoxic agents such as doxorubicin, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, epirubicin, mitomycin, mitozantrone, etc
  • alkylating agents such as Melphalan, Carmustine, Lomustine, cyclophosphamide, ifosfamide, Chlorambucil, Fotemustine, Busulfan, Temozolomide and thiotepa
  • Antineoplastic hormonal agents such as Nilutamide, Cyproterone acetate, Anastrozole, Exemestane, Tamoxifen, Raloxifene, Bicalutamide, Aminoglutethimide, Leuprorelin acetate, Toremifene citrate, Letrozole, Flutamide, Megestrol acetate and Goserelin acetate
  • gonadal hormones such as cyproterone
  • the invention in another aspect, relates to a method for the prevention and / or treatment of cancer in a subject, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of antibody or of the pharmaceutical composition comprising it, as appropriate. describes in the present invention.
  • FIG. 1 Analysis of the viability of the tumor cell lines MCF7 (A), PC3 (B), CAL33 (C), HCT1 16 (D) and MEF (E), in the presence of the polyclonal anti-presenilin 1 antibody that binds specifically to SEQ ID NO: 1, at concentrations of 5 and 50 ⁇ g / mL, during 0, 24, 48 and 72h, with respect to the control group not treated with said antibody.
  • the cell growth was measured with the MTT assay and is expressed as the percentage with respect to the control cells.
  • Fig. 2 Western blot photographs of NOTCH, NFKb and I KKb proteins in MCF7 cells treated with the anti-presenilin 1 antibody that specifically binds to SEQ ID NO: 1, at concentrations of 5 and 50 ⁇ g / mL , during 0, 24, 48 and 72h, with respect to the control group not treated with the antibody.
  • Fig. 3 Analysis of the viability of the MCF7 tumor cell lines in the presence of the moAB monoclonal antibody of the invention that binds specifically to SEQ ID NO: 1, at concentrations of 5 and 50 g / mL, for 0.24 , 48 and 72h, with respect to the control group not treated with said antibody. The cell growth was measured with the MTT assay and is expressed as the percentage with respect to the control cells.
  • Fig. 4 Photographs of the MCF7 cell line in the presence of the moAB monoclonal antibody of the invention that specifically binds to SEQ ID NO: 1, at the concentration of 5 ⁇ g / mL (A) for 72 h.
  • Figure B shows a photograph of the control group not treated with said antibody.
  • the following examples demonstrate that the use of an antibody specific to the presenilin protein directed against the LIYTPFTE peptide (SEQ ID NO: 1) which is located within the luminal 1 loop of said protein is useful in the treatment of cancer, since it is able to inhibit the proliferation of tumor cells in culture.
  • the anti-presenilin antibody directed against the peptide of SEQ ID NO: 1 used in the following examples is a polyclonal antibody.
  • Table 1 List of cell lines used in the examples of the invention. All cell lines have been acquired at the ATCC (American Type Culture Collectior ⁇ )
  • the culture media used for the growth of said cell lines were prepared from the commercial media RPMI and DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplemented with FBS (fetal bovine serum) (Sigma, St Louis, MO, USA). ) at 10% and 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). All cell lines were cultured at a temperature of 37 ° C and, 5% CO2, with DMEM except for the head and neck cancer cell line (CAL33) which was cultured in RPMI medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • CAL33 head and neck cancer cell line
  • the monoclonal antibody of the invention was tested in the MCF7 cell line cultured in EMEM medium, under the same conditions mentioned above.
  • SEQ ID NO: 1 is an 8 amino acid peptide corresponding to residues 14 to 21 of the amino acid sequence of luminal loop 1 (LL1) of the first luminal region (RL1) of presenilin 1 or 2. Said antigenic peptide of
  • SEQ ID NO: 1 was synthesized by solid phase techniques and purified by
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • the original peptide sequence of SEQ ID NO: 1 was modified by adding a cysteine residue to the N-terminus of the peptide.
  • the peptide was covalently linked by disulfide bonds to BC ("Blue Carrier Immunogenic
  • the monoclonal antibody of the invention will be referred to as moAB.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, is a tetrazolium salt which, in aqueous solution, has a yellowish color.
  • succinate dehydrogenase SDH
  • formazan which is soluble in DMSO (dimethylsulfoxide)
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the intensity of color being proportional to the number of metabolically active cells. Therefore, the MTT method is a colorimetric assay that allows to determine cell growth and survival, as well as the cytotoxic effect of any agent on cell lines in culture.
  • Fig. 2 shows representative photographs of Western Blot of said proteins in the MCF7 cell line without treatment or treated with the ani-presenilin antibody used in the invention, at the times of 0, 24, 48 and 72 hours. All antibodies are described in Table 2.
  • the cells were harvested at the aforementioned study times and the total soluble protein was extracted with PBS in the presence of protease inhibitors (cOmplete TM Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich), by 3 freeze-thaw cycles. Once quantified by the Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA), 10 micrograms of soluble total protein were subjected to 10% SDS-PAGE and subsequent transfer to the membrane of vinylidene polyfluoride. Next, the WB was carried out as standard using the concentrations of the monoclonal antibodies suggested by the commercial house.
  • protease inhibitors cOmplete TM Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich
  • WB image capture was performed with the Gel DocTM XR + documentation system (BioRad) and the relative quantification of the bands was done with the Image Lab software v5.2 (BioRad). The study by WB was repeated in three independent trials. The antibody against ⁇ -actin was used as positive charge control.
  • Example 1 The anti-presenilin 1 antibody that specifically recognizes SEQ ID NO: 1 inhibits the growth of tumor cells.
  • Fig. 1 show that treatment with 50 ⁇ g / ml of the anti-presenilin 1 polyclonal antibody that specifically binds to SEQ ID NO: 1 is capable of inhibiting the viability of tumor cell lines of different provenance , such as: breast cancer cells (MCF7), prostate cancer (PC3), head and neck cancer (CAL33), colon cancer (HCT1 16) and primary fibroblast culture (MEF), with respect to cells control, also tumor but not treated with the polyclonal anti-presenilin antibody indicated here.
  • MCF7 breast cancer cells
  • PC3 prostate cancer
  • CAL33 head and neck cancer
  • HCT1 16 colon cancer
  • MEF primary fibroblast culture
  • Fig. 3 shows that the treatment of MCF7 cells with the anti-presenilin 1 moAB of the invention, at concentrations of 5 ⁇ g / ml or 50 ⁇ g / ml, is capable of inhibiting the viability of said cell line tumor with respect to the control cells.
  • Table 3 shows the viability percentages of the moAB of the invention at the doses tested and with respect to the control.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra la presenilina, y más concretamente contra el bucle luminal de la presenilina, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho anticuerpo o de un fragmento del mismo, o de una composición farmacéutica que lo comprenda, a un sujeto que padece cáncer.

Description

USO DE UN ANTICUERPO ANTIPRESENILINA PARA LA PREVENCIÓN Y/O TRATAMIENTO DEL CÁNCER
La presente invención se refiere al uso de anticuerpos anti-presenilina en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, la presente invención se encuadra en el sector de la medicina, más concretamente, en el sector de la biología molecular aplicada a la medicina, la farmacología y la oncología.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer provoca cerca de 8 millones de muertes al año, lo que la convierte en la principal causa de muerte a nivel mundial. Incluso se espera que de aquí al 2035 cerca de 15 millones de fallecimientos por año estarán relacionados con los tumores.
El tratamiento del cáncer es abordado por diferentes aproximaciones, normalmente combinadas, que pueden clasificarse en los siguientes grupos principales: terapias biológicas, quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, trasplantes de células madre y de médula ósea, cirugía, y terapias de soporte (p.ej. bifosfonatos, eritropoyetina, factores de crecimiento hematopoiético, esferoides y transfusiones de plaquetas). La terapia biológica, también conocida como inmunoterapia, utiliza sustancias que produce el cuerpo naturalmente para destruir las células cancerosas. Hay diversos tipos de tratamientos incluyendo anticuerpos monoclonales, inhibidores del crecimiento del cáncer, inhibidores de la angiogénesis, vacunas y terapia génica, entre otros. La inmunoterapia está dirigida a una múltiple variedad de dianas.
El conocimiento de las diferentes vías moleculares, de las características de los diferentes tumores, así como de la fisiología de las células tumorales, ha permitido el diseño de nuevos fármacos para bloquear la acción de diferentes proteínas implicadas en las diferentes vías de transducción de la señal críticas para el crecimiento y la división celular. De entre las vías mejor caracterizadas están aquellas mediadas por receptores de la familia de las proteínas tirosin-quinasas (TK), siendo uno de los miembros principales de esta familia el factor de crecimiento EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), que incluye los receptores EGFR/HER1 , ErbB-2/HER2, ErbB-3/HER3 y ErbB-4/HER4, involucrados principalmente en las vías de señalización MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos), la ruta PI3K (fosfatidilinositol- 3-kinasa), que contribuye a la progresión del ciclo celular, disminuye la apoptosis y promueve la metástasis de células cancerígenas, y las vías JAK/STAT y fosfolipasa C 1 gamma (PLCvl), relacionadas con la proliferación, diferenciación, migración y apoptosis celular. Otros miembros de esta familia también son las proteínas PDGFR (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas), FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) y VEGFR (receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular). Los receptores de esta familia se encuentran frecuentemente implicados en neoplasias de animales y humanos y una sola célula tumoral puede sobre-expresar más de un tipo de estos receptores. Para estos receptores se han desarrollado inhibidores de la actividad tirosin-quinasa, tales como por ejemplo, gefitinib, erlotinib y lapatinib, así como anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del receptor. De entre los anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados para su uso en oncología, el trastuzumab es un anti-ErbB2/HER2 para el cáncer de mama, el cetuximab es un anti-ErbB1/EGFR para el cáncer de colon, y bevacizumab es un anti-VEGF para cánceres colorectales, de mama y de pulmón (cfr. G. Adams et al., Nature Biotechnology 2005, vol. 23, pp. 1 147-57). Inhibidores multidiana (como Sutent) que inhiben la actividad tirosin-quinasa de VEGFR, PDGFR y FGFR.
Alternativamente, también diferentes inmunoterapias basadas en anticuerpos monoclonales humanizados han sido diseñadas basadas en la proteína MUC1. MUC1 ha sido utilizado como marcador tumoral en seguimiento terapéutico en pacientes con cáncer de mama, conocido como el marcador CA15.3; se encuentra elevado 10 a 15 veces en pacientes con cáncer metastásico, aunque su valor pronóstico solo es importante cuando se analiza junto con otros parámetros. De entre los anticuerpos monoclonales diseñados frente a MUC1 destacan el huBrE-3 y el R-1549 (pemtumomab), utilizados en tratamientos combinados de radioinmunoterapia en cáncer de mama y otros cánceres con resultados prometedores. Por otro lado, también se ha observado que células del sistema inmunológico asociadas al microambiente tumoral expresan mayor cantidad de receptores, como el CTLA4 (antígeno 4 del linfocito T citotoxico) y la PD1 (proteína de muerte programada 1), implicados en la regulación negativa de la activación de los linfocitos y en la tolerancia inmunológica. El bloqueo de los receptores CTLA4 mediante anticuerpos dirigidos contra ellos o sus ligandos favorece la inmunidad antitumoral; es por ello que la FDA (Food and Drug Administration) ha aprobado el uso de algunos de estos anticuerpos, como el Ipilimumab, para la terapia complementaria en cáncer.
Sin embargo, la mayoría de estas terapias, las cuales generalmente han sido complementarias a los tratamientos tradicionales ya conocidos, así como a los nuevos agentes de quimioterapia diseñados, han dado resultados bastante modestos, tanto en la enfermedad local avanzada, como en el estado metastático. Por lo tanto, sigue siendo necesario el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, dirigiendo dichas estrategias a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han descubierto la utilidad de un anticuerpo anti-presenilina, o un fragmento del mismo, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer. Específicamente, los inventores han demostrado que el uso de un anticuerpo anti- presenilina o un fragmento del mismo, específicamente un anticuerpo, o un fragmento del mismo capaz de unirse al antígeno que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] de la presenilina, es útil en la prevención y/o tratamiento del cáncer.
Las presenilinas son proteínas transmembrana cuyos genes, preferiblemente en humanos, presentan una elevada homología entre ellos (80% de identidad a nivel de nucleótidos). En la presente invención se entiende, por tanto, por "presenilina" la presenilina 1 que comprende la SEQ ID NO: 2, o la presenilina 2 que comprende la SEQ ID NO: 3. El término "antígeno" a efectos de la presente invención se refiere a una región predeterminada al que el anticuerpo es capaz de unirse de manera selectiva. El antígeno puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un hapteno u otra molécula natural o sintética. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido, más preferiblemente, el antígeno comprende la SEQ ID NO: 1.
Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a la secuencia aminoacídica que comprende la SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] de la presenilina para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer, en un sujeto. Alternativamente, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a la secuencia aminoacídica que comprende la SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] de la presenilina, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento del cáncer en un sujeto.
En una realización preferida, la presenilina se selecciona de entre presenilina 1 que comprende la SEQ ID NO: 2, o la presenilina 2 que comprende la SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el uso del anticuerpo descrito en la presente invención es útil en la prevención y/o tratamiento de tumores mediante la inhibición del crecimiento de las células tumorales, consecuencia de la inhibición y/o disminución de la expresión de proteínas tales como NOTCH. Una de las ventajas del uso de un anticuerpo anti-presenilina que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, tal y como se describe en el presente documento, es que dicho anticuerpo no atraviesa la barrera hematoencefálica, evitando así los efectos adversos de dicho hecho.
El péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 es un péptido de ocho aminoácidos que corresponde a los residuos 14 a 21 de la secuencia aminoacídica del bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 ó presenilina 2. El LL1 de la RL1 de la presenilina 1 comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4. El LL1 de la RL1 de la presenilina 2 comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de SEQ ID NO: 1 como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles en la prevención y/o tratamiento del cáncer.
A efectos de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulinas, o a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con el LL1 de la RL1 de las presenilina 1 (SEQ ID NO: 2) ó presenilina 2 (SEQ ID NO: 3), y más específicamente con el péptido de SEQ ID NO: 3, que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina, o recombinantemente.
En una realización preferida, el anticuerpo de la invención puede ser policlonal (incluye típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonal (dirigido contra un único determinante en el antígeno). La expresión "anticuerpo monoclonal" alude a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de un sitio de fijación de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del antígeno. En una realización preferida el anticuerpo, según se describe su uso en la presente invención, es preferiblemente un anticuerpo policlonal.
En otra realización preferida del uso del anticuerpo según se describe en la presente invención, éste se caracteriza porque puede ser un anticuerpo recombinante, humanizado, quimérico, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con un polinucleótido que codifica para el péptido que comprende la SEQ ID NO: 1 , con un ácido nucleico codificante para el anticuerpo de la invención, o que produce el anticuerpo que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 , o el péptido de SEQ ID NO: 1 , como resultado de la recombinación homologa. Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo en el que una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie determinada o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es(son) idéntica(s), u homóloga(s), a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad biológica deseada.
El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.
A efectos de la presente invención, el término "cáncer" se refiere a un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por invasión y sistémicamente por metástasis. El término cáncer en la presente invención abarca tumores sólidos, así como tumores hematológicos, tales como las leucemias, linfomas y los síndromes mielodisplásicos. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 de la presenilina, preferiblemente humana, se administran a individuos con cáncer.
En una realización preferida del uso del anticuerpo según se describe en la invención, se caracteriza por que el cáncer comprende tumores sólidos, y/o tumores hematológicos, tales como las leucemias, linfomas y los síndromes mielodisplásicos.
En otra realización preferida, el cáncer se selecciona de la lista que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de la uretra, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, tumores del sistema nervioso central (SNC) y periférico, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas y/o adenoma de hipófisis, linfomas y leucemias. En una realización particular, el cáncer es preferiblemente cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioblastoma, linfomas y/o leucemias.
El término "sujeto" o "paciente", como se usa aquí, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un humano hombre o mujer de cualquier edad o raza. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un medicamento o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-presenilina, según se ha descrito previamente, junto con un vehículo y/o excipiente farmacológicamente aceptable, para para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer. Alternativamente, la presente invención se refiere al uso de un medicamento o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-presenilina, según se ha descrito previamente, junto con un vehículo y/o excipiente farmacológicamente aceptable, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento del cáncer.
El término "medicamento" o "composición farmacéutica", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en los organismos, preferiblemente seres humanos, o que pueda usarse o administrarse a los organismos, preferiblemente seres humanos, con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. El medicamento o composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto solo como en combinación con otros medicamentos o composiciones para prevenir y/o mejorar el cáncer a modo de terapia combinada, pudiendo ser administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes. La elaboración de la composición farmacéutica puede llevarse por cualquiera de los métodos conocidos y descritos en el estado de la técnica. El "vehículo farmacéuticamente aceptable", se refiere a una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Se emplean preferiblemente como vehículos agua o disoluciones acuosas de solución salina y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para las disoluciones inyectables. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Los "vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables" están aprobados por la agencia reguladora de un gobierno de estado o el federal o están enumerados en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Dichos compuestos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica.
Tanto el anticuerpo descrito en la presente invención como la composición farmacéutica que lo comprende, se utilizan en una cantidad terapéuticamente efectiva, entendiéndose por "cantidad terapéuticamente efectiva" el nivel, cantidad o concentración de anticuerpo de la invención o de composición farmacéutica que lo comprenda, que produzca el efecto deseado de prevención y/o tratamiento del cáncer, preferiblemente inhibiendo el crecimiento del mismo, sin causar efectos adversos. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrado el anticuerpo o a la composición farmacéutica de la invención que lo comprende.
La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida de drogas o de cualquier otro sistema convencional de liberación, así puede estar contenida, aunque sin limitarnos, en nanopartículas, liposomas o nanosferas, en un material polimérico, en un implante biodegradable o no biodegradable o en mi ero partículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables. En una realización particular del uso de la composición farmacéutica de la invención, ésta está formulada para su administración oral, parenteral, intravenosa o intratumoral.
Tal composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraespinal, intraestromal, intrasinovial, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intracapsular, oral, enteral, parenteral, intranasal, tópica, mediante parches transdérmicos, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico o bomba de infusión. Una vía de administración preferida de la invención para el tratamiento y/o prevención del cáncer es la administración intravenosa.
En otra realización particular de los usos de la composición farmacéutica de la invención, ésta se caracteriza por que comprende además un agente antitumoral.
Por "agente antitumoral" o "agente quimioterapéutico", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se entiende cualquier substancia capaz de inhibir la proliferación celular o que es capaz de inducir la muerte celular. Los agentes capaces de inhibir la proliferación celular sin provocar muerte celular se denominan de forma genérica, agentes citostáticos, mientras que aquellos que son capaces de inducir la muerte celular normalmente mediante la activación de la apoptosis se denominan de forma genérica agentes citotóxicos. Ejemplos no limitativos de agentes antitumorales adecuados para su uso en la composición de la invención incluyen, sin limitar a, (i) agentes estabilizantes de microtúbulos tales como taxanos, paclitaxel, docetaxel, epothilonas y laulimalides, (ii) inhibidores de quinasas tales como Iressa(R), Gleevec, Tarceva™, (Erlotinib HCI), BAY-43-9006, (iii) anticuerpos específicos para receptores con actividad quinasa incluyendo, sin limitarse a, Trastuzumab (Herceptin(R)), Cetuximab (Erbitux(R)), Bevacizumab (Avastin™), Rituximab (ritusan(R)), Pertuzumab (Omnitarg™); (iv) inhibidores de la ruta mTOR, tales como rapamicina y CCI-778; (v) Apo2L1Trail, (vi) agentes anti- angiogenicos tales como endostatina, combrestatina, angiostatina, trombospondina y el inhibidor del crecimiento endothelial vascular (VEGI); (vii) vacunas antineoplásicas incluyendo células T activadas, agentes inmunopotenciadores inespecíficos (por ejemplo interferones, interleuquinas); (viii) agentes citotóxicos antibióticos tales como doxorubicina, bleomcina, dactinomicina, daunorubicina, epirubicina, mitomicina, mitozantrona, etc; (ix) agentes alquilantes tales como Melphalan, Carmustina, Lomustina, ciclofosfamida, ifosfamide, Clorambucilo, Fotemustine, Busulfano, Temozolomida y thiotepa; (x) agentes hormonales antineoplasticos tales como Nilutamida, acetato de ciproterona, anastrozol, Exemestano, Tamoxifeno, Raloxifeno, Bicalutamida, Aminoglutetimida, acetato de leuprorelina, citrato de Toremifeno, Letrozol, Flutamida, acetato de Megestrol y acetato de goserelina; (xi) hormonas gonadales tales como acetato de ciproterona y acetato de medoxiprogesterone; (xii) antimetabolitos tales como Citarabina, Fluorouracilo, Gemcitabina, Topotecano, Hidroxyurea, Tioguanina, Metotrexato, Colaspasa, Raltitrexedo y capicitabina; (xiii) agentes anabólicos tales como nandrolone; (xiv) hormonas adrenales esteroideas tales como acetato de metilprednisolona, dexametasone, hidrocortisona, prednisolona y prednisona; (xv) agentes antineoplásicos tales como Carboplatino, Cisplatino, Oxaliplatino, Etoposido y Dacarbazina, (xvi) inhibidores de topoisomerasa tales como topotecana e irinotecano; (xvii) agentes epigenéticos tales como inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de metiltransferasas de histonas, inhibidores de desmetilasas de histonas e inhibidores de metiltransferasas de DNA y (xviii) agentes moduladores de la autofagia tales como cloroquina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o el tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo o de la composición farmacéutica que lo comprende, según se describe en la presente invención.
Los términos y expresiones empleados en el presente aspecto inventivo ya han sido definidos en aspectos inventivos anteriores. A su vez, todas las realizaciones particulares anteriormente descritas en la presente invención son aplicables a los métodos de la invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Análisis de la viabilidad de las líneas celulares tumorales MCF7 (A), PC3 (B), CAL33 (C), HCT1 16 (D) y MEF (E), en presencia del anticuerpo policlonal anti- presenilina 1 que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a las concentraciones de 5 y 50 μg/mL, durante 0, 24, 48 y 72h, respecto al grupo control no tratado con dicho anticuerpo. El crecimiento celular se midió con el ensayo de MTT y es expresado como el porcentaje respecto a las células control.
Fig. 2. Fotografías de Western Blot de las proteínas NOTCH, NFKb e I KKb en células MCF7 tratadas con el anticuerpo anti-presenilina 1 que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a las concentraciones de 5 y 50 μg/mL, durante 0, 24, 48 y 72h, respecto al grupo control no tratado con el anticuerpo.
Fig. 3. Análisis de la viabilidad de las líneas celulares tumorales MCF7 en presencia del anticuerpo monoclonal moAB de la invención que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a las concentraciones de 5 y 50 g/mL, durante 0, 24, 48 y 72h, respecto al grupo control no tratado con dicho anticuerpo. El crecimiento celular se midió con el ensayo de MTT y es expresado como el porcentaje respecto a las células control. Fig. 4. Fotografías de la línea celular MCF7 en presencia del anticuerpo monoclonal moAB de la invención que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a la concentración de 5 μg/mL (A) durante 72h. En la figura B se muestra una fotografía del grupo control no tratado con dicho anticuerpo. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Los siguientes ejemplos demuestran que el uso de un anticuerpo específico frente a la proteína presenilina dirigido frente al péptido LIYTPFTE (SEQ ID NO: 1) que se encuentra dentro del bucle luminal 1 de dicha proteína es útil en el tratamiento del cáncer, ya que es capaz de inhibir la proliferación de células tumorales en cultivo. El anticuerpo anti-presenilina dirigido frente al péptido de SEQ ID NO: 1 utilizado en los siguientes ejemplos es un anticuerpo policlonal.
MATERIAL Y MÉTODOS. Cultivos celulares
Para demostrar la capacidad de prevención y/o tratamiento del cáncer, preferiblemente tumores sólidos, del anticuerpo descrito en el presente documento se han utilizado líneas celulares todas ellas derivadas de diferentes tipos de cáncer (Tabla 1).
Tabla 1. Listado de líneas celulares utilizadas en los ejemplos de la invención. Todas las líneas celulares han sido adquiridas en la ATCC (American Type Culture Collectiorí)
Cáncer Línea celular Tipo
MCF7
Mama Luminal
(ATCC® HTB-22)
CAL33
Cabeza y cuello Carcinoma escamoso
(ACC 447)
HCT1 16
Colon Epitelial
(ATCC® CCL-247™)
PC3
Próstata Adenocarcinoma
(ATCC® CRL-1435™) Además de las líneas celulares de la Tabla 1 , se ha ensayado el uso del anticuerpo policlonal de la invención en un cultivo primario de fibroblastos humanos (MEF). Los medios de cultivo utilizados para el crecimiento de dichas líneas celulares se prepararon a partir de los medios comerciales RPMI y DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) suplementados con FBS (suero fetal bobino) (Sigma, St Louis, MO, USA) al 10% y penincilina-estreptomicina al 1 % (Invitrogen). Todas las líneas celulares se cultivaron a una temperatura de 37°C y, 5% de CO2, con DMEM a excepción de la línea celular del cáncer de cabeza y cuello (CAL33) que se cultivó en medio RPMI. Se mantuvieron en un incubador termostatizado a 37°C, en presencia de un 5% de CO2 y un 95% de aire (aire saturado de humedad). Específicamente, el anticuerpo monoclonal de la invención se ensayó en la línea celular MCF7 cultivada en medio EMEM, en las mismas condiciones mencionadas anteriormente.
Obtención del Anticuerpo anti-presenilina que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 1 es un péptido de 8 aminoácidos que se corresponde a los residuos 14 a 21 de la secuencia aminoacídica del bucle luminal 1 (LL1) de la primera región luminal (RL1) de la presenilina 1 o 2. Dicho péptido antigénico de
SEQ ID NO: 1 fue sintetizado mediante técnicas de fase sólida y purificado por
HPLC (cromatografía liquida de alta presión) alcanzando una pureza del 97,21 %.
Se modificó la secuencia peptídica original de la SEQ ID NO: 1 , añadiendo un residuo de cisteína al extremo N-terminal del péptido. El péptido se unió covalentemente mediante enlaces disulfuro a BC ("Blue Carrier Immunogenic
Protein" de Pierce).
Para la obtención de los anticuerpos policlonales ensayados a continuación, se inmunizaron un total de dos gallinas con el complejo BC-péptido y adyuvante de Freund (de Sigma) y se inyectaron refuerzos con intervalos de 14, 28 y 56 días. Se recogieron los huevos de cada gallina entre los días 40 y 71 posteriores al comienzo de la inmunización. Se separaron las yemas, eliminaron los lípidos y precipitaron/purificaron los anticuerpos con el kit de separación de Pierce ("Pierce Chicken IgY Purification Kit" de Thermo Scientific). Se obtuvieron dos lotes de anticuerpo correspondientes a cada uno de los animales inmunizados: PoliclonaH y Policlonal2. Por otro lado, para la obtención de los anticuerpos monoclonales ensayados a continuación, se utilizaron técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica, y más específicamente en el campo de la invención. A lo largo de los ejemplos descritos se denominará al anticuerpo monoclonal de la invención como moAB.
Ensayo de viabilidad celular MTT
El MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio, es una sal de tetrazolio que en solución acuosa presenta color amarillento. En células metabólicamente activas es reducido vía mitocondrial por la enzima succinato deshidrogenasa (SDH), dando lugar a un compuesto hidrofóbico de color azul oscuro, formazán, el cual es soluble en DMSO (dimetilsulfóxido), dando lugar a una disolución cuya absorbancia se mide a 570nm en un espectofotometro, siendo la intensidad de color proporcional a la cantidad de células metabólicamente activas. Por lo tanto, el método MTT es un ensayo colorimétrico que permite determinar el crecimiento y la supervivencia celular, así como el efecto citotóxico de cualquier agente sobre líneas celulares en cultivo.
Para llevar a cabo el ensayo MTT, se sembraron 10.000 células por pocilio (10.000 cel/ml) en 4 placas de 24 pocilios y se incubaron a 37°C y 5 % de CO2 durante 24 horas para permitir su adherencia. A continuación, se testaron diferentes concentraciones tanto del anticuerpo policlonal, como del monoclonal, 5μg/ml y 50μg/ml, por triplicado a los tiempos de 0, 24, 48 y 72 horas. Como control se utilizaron células no tratadas con el anticuerpo. Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y se añadieron 110μΙ de MTT. Transcurrida 1 h a 37°C, se aspira el sobrenadante y se añade 1 ml de DMSO para disolver los cristales de formazán depositados en el fondo de los pocilios. Por último, se determinaron las absorbancias a 570 nm mediante un lector de microplacas UltraEvolution (TecanR). Western Blot
Utilizando la técnica de Western-blot (WB) se determinó mediante anticuerpos monoclonales la cantidad de las proteínas NOTCH (anticuerpo monoclonal ab52627 de Abcam), NFKB (anticuerpo monoclonal sc.8008 de Santa Cruz Biotechnology) e IKKB (anticuerpo monoclonal D30C6 de Cell Signalling), en la línea celular de cáncer de mama MCF7. En la Fig. 2 se muestran fotografías representativas de Western Blot de dichas proteínas en la línea celular MCF7 sin tratamiento o tratada con el anticuerpo ani-presenilina utilizado en la invención, a los tiempos de 0, 24, 48 y 72 horas. Todos los anticuerpos se describen en la Tabla 2.
Tabla 2. Anticuerpos
Figure imgf000017_0001
Brevemente, las células se recogieron a los tiempos de estudio mencionados y se extrajo la proteína total soluble con PBS en presencia de inhibidores de proteasas (cOmplete™ Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich), mediante 3 ciclos de congelación-descongelación. Una vez cuantificada por el espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, USA), 10 microgramos de proteína total soluble se sometieron a PAGE-SDS al 10% y posterior transferencia a membrana de polifluoruro de vinilidieno. A continuación, se llevó a cabo el WB de forma estándar usando las concentraciones de los anticuerpos monoclonales sugeridos por la casa comercial. La captura de imagen de los WB se realizó con el sistema de documentación Gel DocTM XR+ (BioRad) y la cuantificación relativa de las bandas se realizó con el software Image Lab v5.2 (BioRad). El estudio por WB se repitió en tres ensayos independientes. Como control positivo de carga se utilizó el anticuerpo frente a la β-actina.
A modo de ejemplo se muestran en la Fig. 2 las fotografías de los resultados de Western Blot obtenidos Los resultados con la línea celular
Ejemplo 1. El anticuerpo anti-presenilina 1 que reconoce específicamente la SEQ ID NO: 1 inhibe el crecimiento de células tumorales.
Los resultados mostrados en las Fig. 1 ponen de manifiesto que el tratamiento con 50 μg/ml del anticuerpo policlonal anti-presenilina 1 que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 es capaz de inhibir la viabilidad de líneas celulares tumorales de diferente procedencia, tales como: células de cáncer de mama (MCF7), cáncer de próstata (PC3), cáncer de cabeza y cuello (CAL33), cáncer de colon (HCT1 16) y el cultivo primario de fibroblastos (MEF), respecto a las células control, también tumorales pero no tratadas con el anticuerpo policlonal anti-presenilina aquí indicado.
Además, tal y como se observa también en la Fig. 2, el tratamiento con 50 μg/ml del anticuerpo policlonal anti-presenilina 1 disminuye la viabilidad celular en función del tiempo, analizado mediante WB. A las 72 h de incubación de las células MCF7 en presencia del anticuerpo policlonal anti-presenilina se produce una inhibición de la expresión de las proteínas NOTCH, N FKB e ΙΙ<Ι<β. La ausencia de expresión de NOTCH y de las proteínas de la vía N FKB podrían ser las responsables de la disminución de la viabilidad de las células tumorales.
Adicionalmente, la Fig. 3 pone de manifiesto que el tratamiento de células MCF7 con el moAB anti-presenilina 1 de la invención, a las concentraciones de 5 μg/ml o 50 μg/ml, es capaz de inhibir la viabilidad de dicha línea celular tumoral respecto a las células control. En la Tabla 3 se muestran los porcentajes de viabilidad del moAB de la invención a las dosis testadas y respecto al control.
Tabla 3. Porcentage de viabilidad de células MCF7 tratadas con el moAB de la invención. moAB
Tiempo (h) Control (%) 50 g/ml_ 5 g/ml_
0 100 102,9 101 ,51
24 100 86,68 94,55
48 100 73, 13 90,50
72 100 43,75 68,02

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a ¡a SEQ ID NO: 1 de la preseniiina para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer.
2. Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso según la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, o cualquier combinación de los anteriores.
3. Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.
4. Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el anticuerpo es monocional o poüclonai.
5. Una composición que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer.
8. Una composición para su uso según la reivindicación 5 que comprende además al menos un agente antitumorai.
7, Un anticuerpo o una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, dónde el cáncer comprende un tumor sólido y/o un tumor hematología).
8. Un anticuerpo o una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, meianoma cutáneo, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endomefrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de la uretra, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores del eje espinal, giioma del tronco cerebral, gíiobíastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma de hipófisis, leucemia, linfoma y/o síndrome mielodispiásíco.
Un anticuerpo o una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioblastoma, leucemia, linfoma y/o síndrome mieiodispiásieo.
PCT/ES2018/070544 2017-08-04 2018-08-03 Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer WO2019025659A1 (es)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/636,416 US11919967B2 (en) 2017-08-04 2018-08-03 Anti-presenilin antibody for use in the prevention and/or treatment of cancer
CA3073894A CA3073894A1 (en) 2017-08-04 2018-08-03 Anti-presenilin antibody for use in the prevention and/or treatment of cancer
JP2020528514A JP7202576B2 (ja) 2017-08-04 2018-08-03 がんの予防および/または治療に利用するための抗プレセニリン抗体またはそのフラグメント
RU2020108510A RU2020108510A (ru) 2017-08-04 2018-08-03 Антипресенилиновое антитело для использования в профилактике и/или лечении рака
AU2018311276A AU2018311276A1 (en) 2017-08-04 2018-08-03 Anti-presenilin antibody for use in the prevention and/or treatment of cancer

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17382546.4 2017-08-04
EP17382546.4A EP3438128B1 (en) 2017-08-04 2017-08-04 Anti-presenilin antibody for use in the prevention and/or treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019025659A1 true WO2019025659A1 (es) 2019-02-07

Family

ID=59686896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2018/070544 WO2019025659A1 (es) 2017-08-04 2018-08-03 Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11919967B2 (es)
EP (1) EP3438128B1 (es)
JP (1) JP7202576B2 (es)
AU (1) AU2018311276A1 (es)
CA (1) CA3073894A1 (es)
ES (1) ES2817910T3 (es)
RU (1) RU2020108510A (es)
WO (1) WO2019025659A1 (es)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2530141A2 (es) * 2013-08-26 2015-02-26 Juan Carlos GALLAR RUIZ Péptido útil como diana farmacológica para el cribado de moléculas para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer, anticuerpo frente al mismo y uso del anticuerpo para el tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad.

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US8129334B2 (en) * 2006-03-31 2012-03-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating neurodegenerative disorders and Alzheimer'S disease and improving normal memory
EA034333B1 (ru) 2010-11-30 2020-01-29 Дженентек, Инк. Варианты антитела для переноса соединения через гематоэнцефалический барьер
TWI530489B (zh) 2011-03-22 2016-04-21 必治妥美雅史谷比公司 雙(氟烷基)-1,4-苯二氮呯酮化合物
GB201300706D0 (en) 2013-01-15 2013-02-27 Cancer Rec Tech Ltd Antibody

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2530141A2 (es) * 2013-08-26 2015-02-26 Juan Carlos GALLAR RUIZ Péptido útil como diana farmacológica para el cribado de moléculas para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer, anticuerpo frente al mismo y uso del anticuerpo para el tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Pierce Chicken IgY Purification Kit", THERMO SCIENTIFIC
G. ADAMS ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 23, 2005, pages 1147 - 57
PIERCE, BLUE CARRIER IMMUNOGENIC PROTEIN
SHIZUKA TAKAGI-NIIDOME ET AL: "Inhibition of [gamma]-Secretase Activity by a Monoclonal Antibody against the Extracellular Hydrophilic Loop of Presenilin 1", BIOCHEMISTRY, vol. 52, no. 1, 8 January 2013 (2013-01-08), pages 61 - 69, XP055165285, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/bi301252r *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3073894A1 (en) 2019-02-07
AU2018311276A1 (en) 2020-03-19
RU2020108510A (ru) 2021-09-06
JP2020535214A (ja) 2020-12-03
JP7202576B2 (ja) 2023-01-12
US20200354470A1 (en) 2020-11-12
EP3438128A1 (en) 2019-02-06
EP3438128B1 (en) 2020-05-20
ES2817910T3 (es) 2021-04-08
US11919967B2 (en) 2024-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2710211T3 (es) Combinación de un antagonista de PD-1 y un inhibidor de VEGFR para tratar el cáncer
ES2768990T3 (es) Combinación de anticuerpos anti-CTLA4 con gemcitabina para el tratamiento sinérgico de enfermedades proliferativas
ES2639857T3 (es) Anticuerpos monoclonales para el tratamiento del tumor
JP6865177B2 (ja) 医薬組み合わせおよびその使用
WO2021182573A1 (ja) 癌の治療及び/又は予防のための医薬品
JP7301264B2 (ja) CD300cの発現抑制剤または活性抑制剤を含む癌の予防または治療用薬学的組成物
CN106714822A (zh) 用于治疗癌症的组合治疗
ES2945537T3 (es) Método para producir proteína de fusión que tiene un dominio Fc de IgG
ES2731377T3 (es) Politerapia con un conjugado anticuerpo anti-HER2-fármaco y un inhibidor de bcl-2
ES2817910T3 (es) Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer
EP3125901B1 (en) Derivatives of cephalosporin for treating cancer
JP6077641B2 (ja) 新規ctlエピトープ5連結ペプチド
WO2017045595A1 (zh) 环二核苷酸cGAMP联合贝伐珠单抗在抗肿瘤中的应用
US11712466B2 (en) Vaccine composition
WO2021182571A1 (ja) 癌の治療及び/又は予防のための医薬品
BRPI0717142A2 (pt) Composição terapêutica e kit de reativos para uso terapêutico
US20160074468A1 (en) Combination anti-her2 cancer therapy using muc1 peptides and chemotherapeutics
CA2756851A1 (en) Therapeutic agent for cancer having reduced sensitivity to molecular target drug and pharmaceutical composition for enhancing sensitivity to molecular target drug
ES2742856T3 (es) Composiciones farmacéuticas y procedimientos para el tratamiento y prevención del cáncer metastático
JP6811186B2 (ja) イヌ血管内皮成長因子へ結合する抗体およびイヌ血管新生関連疾患の処置におけるその使用
KR20220120627A (ko) 수술 후 보조 요법제
CN115957321A (zh) 一种抗her2抗体在制备治疗癌症的药物中的用途
BR122023026673A2 (pt) Uso de um conjugado de anticorpo-fármaco
BR122023026675A2 (pt) Uso de um conjugado de anticorpo-fármaco
BR122023026672A2 (pt) Uso de um conjugado de anticorpo-fármaco

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18782472

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020528514

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3073894

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018311276

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20180803

Kind code of ref document: A

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18782472

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1