WO2019025659A1

WO2019025659A1 - Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer

Info

Publication number: WO2019025659A1
Application number: PCT/ES2018/070544
Authority: WO
Inventors: Rogelio Gonzalez Sarmiento; Miguel RODRIGUEZ MANOTAS; Javier FERNANDEZ MATEOS; Juan Carlos GALLAR RUIZ; David FLORENCIANO GOMEZ
Original assignee: Alzheimur 2012 S.L.; Ibsal (Instituto De Investigación Biomédica De Salamanca)
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2019-02-07
Also published as: RU2020108510A; CA3073894A1; AU2018311276A1; EP3438128A1; US11919967B2; JP7202576B2; ES2817910T3; JP2020535214A; US20200354470A1; EP3438128B1

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra la presenilina, y más concretamente contra el bucle luminal de la presenilina, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho anticuerpo o de un fragmento del mismo, o de una composición farmacéutica que lo comprenda, a un sujeto que padece cáncer.

Description

USO DE UN ANTICUERPO ANTIPRESENILINA PARA LA PREVENCIÓN Y/O TRATAMIENTO DEL CÁNCER

La presente invención se refiere al uso de anticuerpos anti-presenilina en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, la presente invención se encuadra en el sector de la medicina, más concretamente, en el sector de la biología molecular aplicada a la medicina, la farmacología y la oncología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer provoca cerca de 8 millones de muertes al año, lo que la convierte en la principal causa de muerte a nivel mundial. Incluso se espera que de aquí al 2035 cerca de 15 millones de fallecimientos por año estarán relacionados con los tumores.

El tratamiento del cáncer es abordado por diferentes aproximaciones, normalmente combinadas, que pueden clasificarse en los siguientes grupos principales: terapias biológicas, quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, trasplantes de células madre y de médula ósea, cirugía, y terapias de soporte (p.ej. bifosfonatos, eritropoyetina, factores de crecimiento hematopoiético, esferoides y transfusiones de plaquetas). La terapia biológica, también conocida como inmunoterapia, utiliza sustancias que produce el cuerpo naturalmente para destruir las células cancerosas. Hay diversos tipos de tratamientos incluyendo anticuerpos monoclonales, inhibidores del crecimiento del cáncer, inhibidores de la angiogénesis, vacunas y terapia génica, entre otros. La inmunoterapia está dirigida a una múltiple variedad de dianas.

El conocimiento de las diferentes vías moleculares, de las características de los diferentes tumores, así como de la fisiología de las células tumorales, ha permitido el diseño de nuevos fármacos para bloquear la acción de diferentes proteínas implicadas en las diferentes vías de transducción de la señal críticas para el crecimiento y la división celular. De entre las vías mejor caracterizadas están aquellas mediadas por receptores de la familia de las proteínas tirosin-quinasas (TK), siendo uno de los miembros principales de esta familia el factor de crecimiento EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), que incluye los receptores EGFR/HER1 , ErbB-2/HER2, ErbB-3/HER3 y ErbB-4/HER4, involucrados principalmente en las vías de señalización MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos), la ruta PI3K (fosfatidilinositol- 3-kinasa), que contribuye a la progresión del ciclo celular, disminuye la apoptosis y promueve la metástasis de células cancerígenas, y las vías JAK/STAT y fosfolipasa C 1 gamma (PLCvl), relacionadas con la proliferación, diferenciación, migración y apoptosis celular. Otros miembros de esta familia también son las proteínas PDGFR (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas), FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) y VEGFR (receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular). Los receptores de esta familia se encuentran frecuentemente implicados en neoplasias de animales y humanos y una sola célula tumoral puede sobre-expresar más de un tipo de estos receptores. Para estos receptores se han desarrollado inhibidores de la actividad tirosin-quinasa, tales como por ejemplo, gefitinib, erlotinib y lapatinib, así como anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del receptor. De entre los anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados para su uso en oncología, el trastuzumab es un anti-ErbB2/HER2 para el cáncer de mama, el cetuximab es un anti-ErbB1/EGFR para el cáncer de colon, y bevacizumab es un anti-VEGF para cánceres colorectales, de mama y de pulmón (cfr. G. Adams et al., Nature Biotechnology 2005, vol. 23, pp. 1 147-57). Inhibidores multidiana (como Sutent) que inhiben la actividad tirosin-quinasa de VEGFR, PDGFR y FGFR.

Alternativamente, también diferentes inmunoterapias basadas en anticuerpos monoclonales humanizados han sido diseñadas basadas en la proteína MUC1. MUC1 ha sido utilizado como marcador tumoral en seguimiento terapéutico en pacientes con cáncer de mama, conocido como el marcador CA15.3; se encuentra elevado 10 a 15 veces en pacientes con cáncer metastásico, aunque su valor pronóstico solo es importante cuando se analiza junto con otros parámetros. De entre los anticuerpos monoclonales diseñados frente a MUC1 destacan el huBrE-3 y el R-1549 (pemtumomab), utilizados en tratamientos combinados de radioinmunoterapia en cáncer de mama y otros cánceres con resultados prometedores. Por otro lado, también se ha observado que células del sistema inmunológico asociadas al microambiente tumoral expresan mayor cantidad de receptores, como el CTLA4 (antígeno 4 del linfocito T citotoxico) y la PD1 (proteína de muerte programada 1), implicados en la regulación negativa de la activación de los linfocitos y en la tolerancia inmunológica. El bloqueo de los receptores CTLA4 mediante anticuerpos dirigidos contra ellos o sus ligandos favorece la inmunidad antitumoral; es por ello que la FDA (Food and Drug Administration) ha aprobado el uso de algunos de estos anticuerpos, como el Ipilimumab, para la terapia complementaria en cáncer.

Sin embargo, la mayoría de estas terapias, las cuales generalmente han sido complementarias a los tratamientos tradicionales ya conocidos, así como a los nuevos agentes de quimioterapia diseñados, han dado resultados bastante modestos, tanto en la enfermedad local avanzada, como en el estado metastático. Por lo tanto, sigue siendo necesario el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, dirigiendo dichas estrategias a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han descubierto la utilidad de un anticuerpo anti-presenilina, o un fragmento del mismo, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer. Específicamente, los inventores han demostrado que el uso de un anticuerpo anti- presenilina o un fragmento del mismo, específicamente un anticuerpo, o un fragmento del mismo capaz de unirse al antígeno que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] de la presenilina, es útil en la prevención y/o tratamiento del cáncer.

Las presenilinas son proteínas transmembrana cuyos genes, preferiblemente en humanos, presentan una elevada homología entre ellos (80% de identidad a nivel de nucleótidos). En la presente invención se entiende, por tanto, por "presenilina" la presenilina 1 que comprende la SEQ ID NO: 2, o la presenilina 2 que comprende la SEQ ID NO: 3. El término "antígeno" a efectos de la presente invención se refiere a una región predeterminada al que el anticuerpo es capaz de unirse de manera selectiva. El antígeno puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un hapteno u otra molécula natural o sintética. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido, más preferiblemente, el antígeno comprende la SEQ ID NO: 1.

Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a la secuencia aminoacídica que comprende la SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] de la presenilina para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer, en un sujeto. Alternativamente, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a la secuencia aminoacídica que comprende la SEQ ID NO: 1 [LIYTPFTE] de la presenilina, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento del cáncer en un sujeto.

En una realización preferida, la presenilina se selecciona de entre presenilina 1 que comprende la SEQ ID NO: 2, o la presenilina 2 que comprende la SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el uso del anticuerpo descrito en la presente invención es útil en la prevención y/o tratamiento de tumores mediante la inhibición del crecimiento de las células tumorales, consecuencia de la inhibición y/o disminución de la expresión de proteínas tales como NOTCH. Una de las ventajas del uso de un anticuerpo anti-presenilina que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, tal y como se describe en el presente documento, es que dicho anticuerpo no atraviesa la barrera hematoencefálica, evitando así los efectos adversos de dicho hecho.

El péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 es un péptido de ocho aminoácidos que corresponde a los residuos 14 a 21 de la secuencia aminoacídica del bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 ó presenilina 2. El LL1 de la RL1 de la presenilina 1 comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4. El LL1 de la RL1 de la presenilina 2 comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de SEQ ID NO: 1 como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles en la prevención y/o tratamiento del cáncer.

A efectos de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulinas, o a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con el LL1 de la RL1 de las presenilina 1 (SEQ ID NO: 2) ó presenilina 2 (SEQ ID NO: 3), y más específicamente con el péptido de SEQ ID NO: 3, que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina, o recombinantemente.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención puede ser policlonal (incluye típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonal (dirigido contra un único determinante en el antígeno). La expresión "anticuerpo monoclonal" alude a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de un sitio de fijación de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del antígeno. En una realización preferida el anticuerpo, según se describe su uso en la presente invención, es preferiblemente un anticuerpo policlonal.

En otra realización preferida del uso del anticuerpo según se describe en la presente invención, éste se caracteriza porque puede ser un anticuerpo recombinante, humanizado, quimérico, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con un polinucleótido que codifica para el péptido que comprende la SEQ ID NO: 1 , con un ácido nucleico codificante para el anticuerpo de la invención, o que produce el anticuerpo que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 , o el péptido de SEQ ID NO: 1 , como resultado de la recombinación homologa. Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo en el que una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie determinada o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es(son) idéntica(s), u homóloga(s), a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad biológica deseada.

El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.

A efectos de la presente invención, el término "cáncer" se refiere a un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por invasión y sistémicamente por metástasis. El término cáncer en la presente invención abarca tumores sólidos, así como tumores hematológicos, tales como las leucemias, linfomas y los síndromes mielodisplásicos. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 de la presenilina, preferiblemente humana, se administran a individuos con cáncer.

En una realización preferida del uso del anticuerpo según se describe en la invención, se caracteriza por que el cáncer comprende tumores sólidos, y/o tumores hematológicos, tales como las leucemias, linfomas y los síndromes mielodisplásicos.

En otra realización preferida, el cáncer se selecciona de la lista que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de la uretra, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, tumores del sistema nervioso central (SNC) y periférico, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas y/o adenoma de hipófisis, linfomas y leucemias. En una realización particular, el cáncer es preferiblemente cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioblastoma, linfomas y/o leucemias.

El término "sujeto" o "paciente", como se usa aquí, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un humano hombre o mujer de cualquier edad o raza. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un medicamento o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-presenilina, según se ha descrito previamente, junto con un vehículo y/o excipiente farmacológicamente aceptable, para para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer. Alternativamente, la presente invención se refiere al uso de un medicamento o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-presenilina, según se ha descrito previamente, junto con un vehículo y/o excipiente farmacológicamente aceptable, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento del cáncer.

El término "medicamento" o "composición farmacéutica", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en los organismos, preferiblemente seres humanos, o que pueda usarse o administrarse a los organismos, preferiblemente seres humanos, con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. El medicamento o composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto solo como en combinación con otros medicamentos o composiciones para prevenir y/o mejorar el cáncer a modo de terapia combinada, pudiendo ser administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes. La elaboración de la composición farmacéutica puede llevarse por cualquiera de los métodos conocidos y descritos en el estado de la técnica. El "vehículo farmacéuticamente aceptable", se refiere a una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Se emplean preferiblemente como vehículos agua o disoluciones acuosas de solución salina y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para las disoluciones inyectables. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Los "vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables" están aprobados por la agencia reguladora de un gobierno de estado o el federal o están enumerados en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Dichos compuestos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica.

Tanto el anticuerpo descrito en la presente invención como la composición farmacéutica que lo comprende, se utilizan en una cantidad terapéuticamente efectiva, entendiéndose por "cantidad terapéuticamente efectiva" el nivel, cantidad o concentración de anticuerpo de la invención o de composición farmacéutica que lo comprenda, que produzca el efecto deseado de prevención y/o tratamiento del cáncer, preferiblemente inhibiendo el crecimiento del mismo, sin causar efectos adversos. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrado el anticuerpo o a la composición farmacéutica de la invención que lo comprende.

La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida de drogas o de cualquier otro sistema convencional de liberación, así puede estar contenida, aunque sin limitarnos, en nanopartículas, liposomas o nanosferas, en un material polimérico, en un implante biodegradable o no biodegradable o en mi ero partículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables. En una realización particular del uso de la composición farmacéutica de la invención, ésta está formulada para su administración oral, parenteral, intravenosa o intratumoral.

Tal composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraespinal, intraestromal, intrasinovial, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intracapsular, oral, enteral, parenteral, intranasal, tópica, mediante parches transdérmicos, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico o bomba de infusión. Una vía de administración preferida de la invención para el tratamiento y/o prevención del cáncer es la administración intravenosa.

En otra realización particular de los usos de la composición farmacéutica de la invención, ésta se caracteriza por que comprende además un agente antitumoral.

Por "agente antitumoral" o "agente quimioterapéutico", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se entiende cualquier substancia capaz de inhibir la proliferación celular o que es capaz de inducir la muerte celular. Los agentes capaces de inhibir la proliferación celular sin provocar muerte celular se denominan de forma genérica, agentes citostáticos, mientras que aquellos que son capaces de inducir la muerte celular normalmente mediante la activación de la apoptosis se denominan de forma genérica agentes citotóxicos. Ejemplos no limitativos de agentes antitumorales adecuados para su uso en la composición de la invención incluyen, sin limitar a, (i) agentes estabilizantes de microtúbulos tales como taxanos, paclitaxel, docetaxel, epothilonas y laulimalides, (ii) inhibidores de quinasas tales como Iressa(R), Gleevec, Tarceva™, (Erlotinib HCI), BAY-43-9006, (iii) anticuerpos específicos para receptores con actividad quinasa incluyendo, sin limitarse a, Trastuzumab (Herceptin(R)), Cetuximab (Erbitux(R)), Bevacizumab (Avastin™), Rituximab (ritusan(R)), Pertuzumab (Omnitarg™); (iv) inhibidores de la ruta mTOR, tales como rapamicina y CCI-778; (v) Apo2L1Trail, (vi) agentes anti- angiogenicos tales como endostatina, combrestatina, angiostatina, trombospondina y el inhibidor del crecimiento endothelial vascular (VEGI); (vii) vacunas antineoplásicas incluyendo células T activadas, agentes inmunopotenciadores inespecíficos (por ejemplo interferones, interleuquinas); (viii) agentes citotóxicos antibióticos tales como doxorubicina, bleomcina, dactinomicina, daunorubicina, epirubicina, mitomicina, mitozantrona, etc; (ix) agentes alquilantes tales como Melphalan, Carmustina, Lomustina, ciclofosfamida, ifosfamide, Clorambucilo, Fotemustine, Busulfano, Temozolomida y thiotepa; (x) agentes hormonales antineoplasticos tales como Nilutamida, acetato de ciproterona, anastrozol, Exemestano, Tamoxifeno, Raloxifeno, Bicalutamida, Aminoglutetimida, acetato de leuprorelina, citrato de Toremifeno, Letrozol, Flutamida, acetato de Megestrol y acetato de goserelina; (xi) hormonas gonadales tales como acetato de ciproterona y acetato de medoxiprogesterone; (xii) antimetabolitos tales como Citarabina, Fluorouracilo, Gemcitabina, Topotecano, Hidroxyurea, Tioguanina, Metotrexato, Colaspasa, Raltitrexedo y capicitabina; (xiii) agentes anabólicos tales como nandrolone; (xiv) hormonas adrenales esteroideas tales como acetato de metilprednisolona, dexametasone, hidrocortisona, prednisolona y prednisona; (xv) agentes antineoplásicos tales como Carboplatino, Cisplatino, Oxaliplatino, Etoposido y Dacarbazina, (xvi) inhibidores de topoisomerasa tales como topotecana e irinotecano; (xvii) agentes epigenéticos tales como inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de metiltransferasas de histonas, inhibidores de desmetilasas de histonas e inhibidores de metiltransferasas de DNA y (xviii) agentes moduladores de la autofagia tales como cloroquina.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o el tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo o de la composición farmacéutica que lo comprende, según se describe en la presente invención.

Los términos y expresiones empleados en el presente aspecto inventivo ya han sido definidos en aspectos inventivos anteriores. A su vez, todas las realizaciones particulares anteriormente descritas en la presente invención son aplicables a los métodos de la invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Análisis de la viabilidad de las líneas celulares tumorales MCF7 (A), PC3 (B), CAL33 (C), HCT1 16 (D) y MEF (E), en presencia del anticuerpo policlonal anti- presenilina 1 que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a las concentraciones de 5 y 50 μg/mL, durante 0, 24, 48 y 72h, respecto al grupo control no tratado con dicho anticuerpo. El crecimiento celular se midió con el ensayo de MTT y es expresado como el porcentaje respecto a las células control.

Fig. 2. Fotografías de Western Blot de las proteínas NOTCH, NFKb e I KKb en células MCF7 tratadas con el anticuerpo anti-presenilina 1 que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a las concentraciones de 5 y 50 μg/mL, durante 0, 24, 48 y 72h, respecto al grupo control no tratado con el anticuerpo.

Fig. 3. Análisis de la viabilidad de las líneas celulares tumorales MCF7 en presencia del anticuerpo monoclonal moAB de la invención que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a las concentraciones de 5 y 50 g/mL, durante 0, 24, 48 y 72h, respecto al grupo control no tratado con dicho anticuerpo. El crecimiento celular se midió con el ensayo de MTT y es expresado como el porcentaje respecto a las células control. Fig. 4. Fotografías de la línea celular MCF7 en presencia del anticuerpo monoclonal moAB de la invención que se une específicamente a la SEQ I D NO: 1 , a la concentración de 5 μg/mL (A) durante 72h. En la figura B se muestra una fotografía del grupo control no tratado con dicho anticuerpo. EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Los siguientes ejemplos demuestran que el uso de un anticuerpo específico frente a la proteína presenilina dirigido frente al péptido LIYTPFTE (SEQ ID NO: 1) que se encuentra dentro del bucle luminal 1 de dicha proteína es útil en el tratamiento del cáncer, ya que es capaz de inhibir la proliferación de células tumorales en cultivo. El anticuerpo anti-presenilina dirigido frente al péptido de SEQ ID NO: 1 utilizado en los siguientes ejemplos es un anticuerpo policlonal.

MATERIAL Y MÉTODOS. Cultivos celulares

Para demostrar la capacidad de prevención y/o tratamiento del cáncer, preferiblemente tumores sólidos, del anticuerpo descrito en el presente documento se han utilizado líneas celulares todas ellas derivadas de diferentes tipos de cáncer (Tabla 1).

Tabla 1. Listado de líneas celulares utilizadas en los ejemplos de la invención. Todas las líneas celulares han sido adquiridas en la ATCC (American Type Culture Collectiorí)

Cáncer Línea celular Tipo

MCF7

Mama Luminal

(ATCC^® HTB-22^™)

CAL33

Cabeza y cuello Carcinoma escamoso

(ACC 447)

HCT1 16

Colon Epitelial

(ATCC® CCL-247™)

PC3

Próstata Adenocarcinoma

(ATCC® CRL-1435™) Además de las líneas celulares de la Tabla 1 , se ha ensayado el uso del anticuerpo policlonal de la invención en un cultivo primario de fibroblastos humanos (MEF). Los medios de cultivo utilizados para el crecimiento de dichas líneas celulares se prepararon a partir de los medios comerciales RPMI y DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) suplementados con FBS (suero fetal bobino) (Sigma, St Louis, MO, USA) al 10% y penincilina-estreptomicina al 1 % (Invitrogen). Todas las líneas celulares se cultivaron a una temperatura de 37°C y, 5% de CO2, con DMEM a excepción de la línea celular del cáncer de cabeza y cuello (CAL33) que se cultivó en medio RPMI. Se mantuvieron en un incubador termostatizado a 37°C, en presencia de un 5% de CO2 y un 95% de aire (aire saturado de humedad). Específicamente, el anticuerpo monoclonal de la invención se ensayó en la línea celular MCF7 cultivada en medio EMEM, en las mismas condiciones mencionadas anteriormente.

Obtención del Anticuerpo anti-presenilina que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 1 es un péptido de 8 aminoácidos que se corresponde a los residuos 14 a 21 de la secuencia aminoacídica del bucle luminal 1 (LL1) de la primera región luminal (RL1) de la presenilina 1 o 2. Dicho péptido antigénico de

SEQ ID NO: 1 fue sintetizado mediante técnicas de fase sólida y purificado por

HPLC (cromatografía liquida de alta presión) alcanzando una pureza del 97,21 %.

Se modificó la secuencia peptídica original de la SEQ ID NO: 1 , añadiendo un residuo de cisteína al extremo N-terminal del péptido. El péptido se unió covalentemente mediante enlaces disulfuro a BC ("Blue Carrier Immunogenic

Protein" de Pierce).

Para la obtención de los anticuerpos policlonales ensayados a continuación, se inmunizaron un total de dos gallinas con el complejo BC-péptido y adyuvante de Freund (de Sigma) y se inyectaron refuerzos con intervalos de 14, 28 y 56 días. Se recogieron los huevos de cada gallina entre los días 40 y 71 posteriores al comienzo de la inmunización. Se separaron las yemas, eliminaron los lípidos y precipitaron/purificaron los anticuerpos con el kit de separación de Pierce ("Pierce Chicken IgY Purification Kit" de Thermo Scientific). Se obtuvieron dos lotes de anticuerpo correspondientes a cada uno de los animales inmunizados: PoliclonaH y Policlonal2. Por otro lado, para la obtención de los anticuerpos monoclonales ensayados a continuación, se utilizaron técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica, y más específicamente en el campo de la invención. A lo largo de los ejemplos descritos se denominará al anticuerpo monoclonal de la invención como moAB.

Ensayo de viabilidad celular MTT

El MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio, es una sal de tetrazolio que en solución acuosa presenta color amarillento. En células metabólicamente activas es reducido vía mitocondrial por la enzima succinato deshidrogenasa (SDH), dando lugar a un compuesto hidrofóbico de color azul oscuro, formazán, el cual es soluble en DMSO (dimetilsulfóxido), dando lugar a una disolución cuya absorbancia se mide a 570nm en un espectofotometro, siendo la intensidad de color proporcional a la cantidad de células metabólicamente activas. Por lo tanto, el método MTT es un ensayo colorimétrico que permite determinar el crecimiento y la supervivencia celular, así como el efecto citotóxico de cualquier agente sobre líneas celulares en cultivo.

Para llevar a cabo el ensayo MTT, se sembraron 10.000 células por pocilio (10.000 cel/ml) en 4 placas de 24 pocilios y se incubaron a 37°C y 5 % de CO2 durante 24 horas para permitir su adherencia. A continuación, se testaron diferentes concentraciones tanto del anticuerpo policlonal, como del monoclonal, 5μg/ml y 50μg/ml, por triplicado a los tiempos de 0, 24, 48 y 72 horas. Como control se utilizaron células no tratadas con el anticuerpo. Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y se añadieron 110μΙ de MTT. Transcurrida 1 h a 37°C, se aspira el sobrenadante y se añade 1 ml de DMSO para disolver los cristales de formazán depositados en el fondo de los pocilios. Por último, se determinaron las absorbancias a 570 nm mediante un lector de microplacas UltraEvolution (TecanR). Western Blot

Utilizando la técnica de Western-blot (WB) se determinó mediante anticuerpos monoclonales la cantidad de las proteínas NOTCH (anticuerpo monoclonal ab52627 de Abcam), NFKB (anticuerpo monoclonal sc.8008 de Santa Cruz Biotechnology) e IKKB (anticuerpo monoclonal D30C6 de Cell Signalling), en la línea celular de cáncer de mama MCF7. En la Fig. 2 se muestran fotografías representativas de Western Blot de dichas proteínas en la línea celular MCF7 sin tratamiento o tratada con el anticuerpo ani-presenilina utilizado en la invención, a los tiempos de 0, 24, 48 y 72 horas. Todos los anticuerpos se describen en la Tabla 2.

Tabla 2. Anticuerpos

Brevemente, las células se recogieron a los tiempos de estudio mencionados y se extrajo la proteína total soluble con PBS en presencia de inhibidores de proteasas (cOmplete™ Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich), mediante 3 ciclos de congelación-descongelación. Una vez cuantificada por el espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, USA), 10 microgramos de proteína total soluble se sometieron a PAGE-SDS al 10% y posterior transferencia a membrana de polifluoruro de vinilidieno. A continuación, se llevó a cabo el WB de forma estándar usando las concentraciones de los anticuerpos monoclonales sugeridos por la casa comercial. La captura de imagen de los WB se realizó con el sistema de documentación Gel DocTM XR+ (BioRad) y la cuantificación relativa de las bandas se realizó con el software Image Lab v5.2 (BioRad). El estudio por WB se repitió en tres ensayos independientes. Como control positivo de carga se utilizó el anticuerpo frente a la β-actina.

A modo de ejemplo se muestran en la Fig. 2 las fotografías de los resultados de Western Blot obtenidos Los resultados con la línea celular

Ejemplo 1. El anticuerpo anti-presenilina 1 que reconoce específicamente la SEQ ID NO: 1 inhibe el crecimiento de células tumorales.

Los resultados mostrados en las Fig. 1 ponen de manifiesto que el tratamiento con 50 μg/ml del anticuerpo policlonal anti-presenilina 1 que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1 es capaz de inhibir la viabilidad de líneas celulares tumorales de diferente procedencia, tales como: células de cáncer de mama (MCF7), cáncer de próstata (PC3), cáncer de cabeza y cuello (CAL33), cáncer de colon (HCT1 16) y el cultivo primario de fibroblastos (MEF), respecto a las células control, también tumorales pero no tratadas con el anticuerpo policlonal anti-presenilina aquí indicado.

Además, tal y como se observa también en la Fig. 2, el tratamiento con 50 μg/ml del anticuerpo policlonal anti-presenilina 1 disminuye la viabilidad celular en función del tiempo, analizado mediante WB. A las 72 h de incubación de las células MCF7 en presencia del anticuerpo policlonal anti-presenilina se produce una inhibición de la expresión de las proteínas NOTCH, N FKB e ΙΙ<Ι<β. La ausencia de expresión de NOTCH y de las proteínas de la vía N FKB podrían ser las responsables de la disminución de la viabilidad de las células tumorales.

Adicionalmente, la Fig. 3 pone de manifiesto que el tratamiento de células MCF7 con el moAB anti-presenilina 1 de la invención, a las concentraciones de 5 μg/ml o 50 μg/ml, es capaz de inhibir la viabilidad de dicha línea celular tumoral respecto a las células control. En la Tabla 3 se muestran los porcentajes de viabilidad del moAB de la invención a las dosis testadas y respecto al control.

Tabla 3. Porcentage de viabilidad de células MCF7 tratadas con el moAB de la invención. moAB

Tiempo (h) Control (%) 50 g/ml_ 5 g/ml_

0 100 102,9 101 ,51

24 100 86,68 94,55

48 100 73, 13 90,50

72 100 43,75 68,02

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a ¡a SEQ ID NO: 1 de la preseniiina para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer.

2. Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso según la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, o cualquier combinación de los anteriores.

3. Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.

4. Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el anticuerpo es monocional o poüclonai.

5. Una composición que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer.

8. Una composición para su uso según la reivindicación 5 que comprende además al menos un agente antitumorai.

7, Un anticuerpo o una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, dónde el cáncer comprende un tumor sólido y/o un tumor hematología).

8. Un anticuerpo o una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, meianoma cutáneo, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endomefrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de la uretra, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores del eje espinal, giioma del tronco cerebral, gíiobíastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma de hipófisis, leucemia, linfoma y/o síndrome mielodispiásíco.

Un anticuerpo o una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioblastoma, leucemia, linfoma y/o síndrome mieiodispiásieo.