WO2019022311A1 - 황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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zinc oxide
composition
cmc
oxide nanocomposite
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양덕춘
김연주
조슈아마르커스
배귀식
양동욱
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경희대학교 산학협력단
한방바이오 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preparing a zinc oxide nanocomposite comprising an extract of Huangchu tree and a use thereof, and more particularly to a composition for preparing a zinc oxide nanocomposite comprising hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan;
  • a zinc oxide nanocomposite prepared by the method a functional cosmetic composition comprising the zinc oxide nanocomposite, a zinc oxide nanocomposite obtained by the method,
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer including the zinc oxide nanocomposite and a method of preventing or treating cancer using the pharmaceutical composition.
  • the metal nanocomposite is a composite in which an organic compound or a metal ion is bonded to a metal or a metal ion and is characterized by having a nano size. It has a unique particle shape and size, and has unique electromagnetic, magnetic, catalytic, and optical properties. Therefore, it has been applied in various fields such as biology and pharmacology as well as electronics and optics.
  • zinc oxide is known to have excellent optical properties, thermal properties and electric and electronic properties.
  • a high refractive index which is a kind of optical property, causes zinc oxide to exhibit an ultraviolet blocking effect.
  • zinc oxide is used for photosensitive paper and photovoltaic cells, and zinc oxide is used for the production of paints, rubbers and plastics as a function of absorbing ultraviolet rays.
  • a zinc oxide / titanium dioxide core-shell nanoparticle composite has been developed (Korean Patent Publication No. 10-1680523) that maintains the ultraviolet shielding effect of zinc oxide and improves formulation stability and feeling of use.
  • zinc oxide is also used as a component of cosmetics for ultraviolet shielding
  • the general physical / chemical method used in the production of zinc oxide nanocomposite is not environmentally friendly and uses substances that may be toxic to the human body. It is necessary to develop an applicable safe zinc oxide complex.
  • Hwigae is a plant belonging to the genus Araliaceae. It is an essential oil component such as dendropanoxide, saponin, ⁇ -Cubebene, ⁇ -Elemene, It is known that various physiologically active ingredients such as ⁇ -Selinene, ⁇ -Muurolene, Germacrene D and ⁇ -Sitosterol are included. Accordingly, it is used as a medicinal substance useful in traditional medicine as it exhibits effects such as blood circulation, liver function improvement, antioxidative action, hard tissue (bone and tooth) regeneration, immunity strengthening, nervous stability, antibacterial action and anticancer action.
  • no method has been developed for producing zinc oxide nanocomposite using Hwacheon-gil.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for producing an environmentally friendly and efficient zinc oxide nanocomposite. As a result, it has been found that the zinc oxide complex having no cytotoxicity can be produced by using the extract of Huangchu tree, Activity, moisture retention ability, ultraviolet ray protection effect, and further excellent anticancer activity, thus completing the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan; And an extract of Hokutogi tree.
  • the present invention also provides a composition for preparing a zinc oxide nanocomposite.
  • the method for preparing zinc oxide nanocomposite according to the present invention is not only environmentally friendly but also can improve the water stability, antioxidant activity and skin protection effect of zinc oxide nanocomposite using the extract of Huachiragchu tree which is a natural substance,
  • the prepared zinc oxide nanocomposite is excellent in biocompatibility and safety, and has excellent antioxidative, water retention, ultraviolet ray blocking and anticancer activities, and thus can be usefully used as a functional cosmetic composition or anticancer agent.
  • FIG. 1 is a schematic view of a method for producing zinc oxide nanocomposites (ZnONcs) according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the UV-Vis spectrum of ZnONcs prepared according to an experimental example of the present invention, wherein A is HA-ZnONcs and B is CMC-ZnONcs.
  • FIG. 3 is a graph showing the degree of UVB and UVA ray absorption of ZnONcs, wherein A is HA-ZnONcs or Rh2-HA-ZnONcs and B is CMC-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs.
  • FIG. 4 is an FE-TEM image of the ZnONcs, which relates to HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs and Rh2-CMC-ZnONcs.
  • FIG. 5 is a chromatogram showing the XRD patterns of ZnONcs, which are HA-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs and Rh2-CMC-ZnONcs.
  • FIG. 6 is a graph showing the thermal stability analysis results of the ZnONcs, wherein A is HA-ZnONcs and B is CMC-ZnONcs.
  • TGA means thermogravimetric analysis results.
  • FIG. 7 is a graph showing the thermal stability analysis results of the ZnONcs, wherein A is Rh2-HA-ZnONcs and B is Rh2-CMC-ZnONcs.
  • TGA thermogravimetric analysis
  • DSC differential scanning calorimetry.
  • FIG. 8 is a graph showing the FTIR spectrum of the ZnONcs, wherein A is HA-ZnONcs or Rh2-HA-ZnONcs, and B is CMC-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs.
  • C is a schematic diagram showing that HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs is bonded with ginsenoside Rh2 by ester bonding.
  • a and B are pH conditions, and C and D are about stability against electrolyte concentration.
  • a and C are HA-ZnONcs, B and D are CMC-ZnONcs.
  • FIG. 10 is a graph showing in vitro stability according to the period of ZnONcs, wherein A is HA-ZnONcs and B is CMC-ZnONcs.
  • FIG. 11 is a graph showing DPPH radical scavenging activity of ZnONcs, which relates to HA-ZnONcs and CMC-ZnONcs.
  • FIG. 12 is a graph showing the ABTS + radical scavenging ability of ZnONcs, which relates to HA-ZnONcs and CMC-ZnONcs.
  • A is HA-ZnONcs
  • B is CMC-ZnONcs
  • C is hyaluronic acid
  • D is carboxymethyl chitosan.
  • FIG. 14 is an LC-MS chromatogram showing ginsenoside Rh2 released from the ZnONcs, which relates to Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs.
  • FIG. 15 is a graph showing the cytotoxicity of the ZnONcs, which relates to HA-ZnONcs and CMC-ZnONcs.
  • A is the toxicity of HA-ZnONcs or Rh2-HA-ZnONcs to MCF7 breast cancer cells
  • B is toxicity of HA-ZnONcs or Rh2-HA- ZnONcs to A549 lung cancer cells
  • C is the toxicity of HA-ZnONcs or Curcumin-HA-ZnONcs to MCF7 breast cancer cells
  • D is the toxicity of HA-ZnONcs or curcumin-HA-ZnONcs to A549 lung cancer cells.
  • one aspect of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan; And a extract of Huacaraceae tree.
  • the present invention also provides a composition for preparing zinc oxide nanocomposite.
  • hyaluronic acid or carboxymethylchitosan hyaluronic acid or carboxymethylchitosan
  • a production method of a zinc oxide nanocomposite of an extract of Hokutogi tree hyaluronic acid or carboxymethylchitosan
  • the present inventors have confirmed that water stability, antioxidative activity and skin protection effect of the zinc oxide nanocomposite can be improved when zinc oxide nanocomposite is prepared by using the extract of Huangchu tree.
  • the hyaluronic acid Hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan; And / or zinc oxide nanocomposite conjugated with ginsenoside Rh2 (ginsenoside Rh2) or curcumin were excellent in antioxidative effect, water retention effect and ultraviolet ray blocking effect.
  • hyaluronic acid of the present invention is a polymer compound consisting of N-acetylglucosamine and glucuronic acid. It exists in the vitreous body of the eye, the umbilical cord, the skin, and plays a role to prevent infiltration of germs and poison penetration.
  • carboxymethyl chitosan of the present invention is a kind of water-soluble chitosan derivative, and refers to a chitosan derivative into which carboxymethyl is introduced as a hydrophilic group.
  • extract of Hokkaido tree means a component or material belonging to Hokkaido tree obtained by a conventional method using a solvent.
  • the Horticultural extract may be a Horticultural leaf extract.
  • Dendropanax morbifera refers to a plant belonging to the genus Araliaceae. It is made of essential oil, and is a pale yellow dark oil liquid with a refreshing aroma and bitter taste. Hwangchil trees can relax the mind and body and inhibit various weeds, and it can enhance the height of the kidneys and the effect of treatment of menstrual impurities in the female. It can strengthen the early immune system and bio-defense system by promoting the growth of immune cells. And has been used for treatment. However, it has not been known that it can be used for the production of zinc oxide complexes.
  • extract refers to an extract obtained by extracting the perennial ash, a diluted solution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, a controlled preparation or a purified product of the extracted solution, Itself and extracts of all formulations which can be formed using extracts.
  • the method or the extraction solvent for extracting the perennial wood and any method or solvent known in the art can be used.
  • composition for preparing zinc oxide nanocomposite may further comprise ginsenoside Rh2 or curcumin.
  • ginsenoside Rh2 of the present invention means PPD (protopanaxadiol) saponin isolated from ginseng. 20 (S) -protopanaxdiol-3-O-? -D-glucopyranoside, and is represented by the formula C 36 H 62 O 8 , and can be represented by the following formula (1).
  • the ginsenoside Rh2 may be named as "Rh2”.
  • the ginsenoside Rh2 may be commercially available, purchased from natural ginseng cultivated or harvested in the nature, or synthesized by a synthetic method, but is not limited thereto.
  • curcumin of the present invention is known as a kind of alkaloid and is mainly contained in turmeric. C 21 H 20 O 6 , and can also be represented by the following general formula (2) or (3).
  • zinc oxide nanocomposites (ZnO nanocomposites) of the present invention refers to a complex in which various compounds are bound to zinc oxide (Zn 2 O).
  • the zinc oxide nanocomposite may be one which carries a leaf extract of Huaculi leaf.
  • the zinc oxide nanocomposite is prepared by mixing zinc oxide and hyaluronic acid; Carboxymethyl chitosan; Hyaluronic acid and ginsenoside Rh2; Carboxymethyl chitosan and ginsenoside Rh2; Hyaluronic acid and curcumin; Or a combination of carboxymethyl chitosan and curcumin, but is not limited thereto.
  • the zinc oxide nanocomposite may also be named " ZnONcs ".
  • the zinc oxide nanocomposite may be prepared by adding "HA-ZnONcs” when hyaluronic acid is bonded to zinc oxide, "CMC-ZnONcs” when binding with carboxymethylchitosan, “Rh2- HA-ZnONcs “,” Rh2-CMC-ZnONcs “when carboxymethyl chitosan and ginsenoside Rh2 are bound,” Curcumin-HA-ZnONcs "when hyaluronic acid and curcumin are combined, carboxymethyl chitosan and curcumin Quot; " curcumin-CMC-ZnONcs ".
  • hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan (Examples 1 and 2)
  • zinc oxide nanocomposite was excellent in purity, thermal stability, in vitro stability and the like (Figs. 5A to 5D), and zinc oxide nanocomposite 10), UV blocking effect, antioxidative effect, moisturizing effect and the like, and showed no cytotoxicity (Tables 5 and 6 and FIGS. 12 to 15). This suggests that the composition of the present invention can be usefully used for the production of zinc oxide nanocomposite exhibiting various effects.
  • Another embodiment provides a method for preparing a zinc oxide nanocomposite comprising reacting the composition with a zinc oxide precursor or zinc oxide nanocomposite.
  • the zinc oxide nanocomposite according to the present invention is eco-friendly as compared with the conventional chemical synthesis method and physical synthesis method because it uses a natural extract, Skin protection effect can be improved.
  • the zinc oxide precursor may be in the form of a salt capable of forming zinc oxide nanoparticles by a reduction reaction.
  • a salt capable of forming zinc oxide nanoparticles by a reduction reaction.
  • Specific examples thereof include zinc nitrate hexahydrate, zinc sulfate, Or zinc acetate, more specifically, zinc nitrate hexahydrate, but is not limited thereto as long as it can produce a zinc oxide nanocomposite.
  • the zinc oxide nanocomposite may be formed by binding zinc oxide with hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan, but is not limited thereto.
  • the zinc oxide nanocomposite may be formed by binding zinc oxide with hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan, but is not limited thereto.
  • hyaluronic acid-zinc oxide nanocomposite HA-ZnONcs
  • carboxymethyl chitosan-zinc oxide composite in which hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan is bound to zinc oxide nanocomposite using zinc nitrate hexahydrate as a salt- Zinc oxide nanocomposites (CMC-ZnONcs) were prepared (Experimental Example 1), and ginsenoside Rh2 or curcumin was bound to the HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs to form ginsenoside Rh2-hyaluronic acid-zinc oxide nanocomposite HA-ZnONcs), ginsenoside Rh2-carboxymethyl chitosan-zinc oxide nanocomposite (Rh2-CMC-ZnONcs) or curcumin-hyaluronic acid-zinc oxide nanocomposite (curcumin- ).
  • Another embodiment provides a zinc oxide nanocomposite produced by the above production method.
  • the zinc oxide nanocomposite of the present invention is a naturally occurring substance, which is a physiologically effective ingredient, including Hwangchu tree extract, ginsenoside Rh2 or curcumin, and exhibits no biocompatibility and safety because it does not show toxicity to cells. Preservation effect and ultraviolet ray shielding effect, it can be used for various purposes such as medical use, biological analysis, and cosmetic use.
  • hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan prepared using a leafy leaf extract; And / or ginsenoside Rh2 or curcumin-linked zinc oxide nanocomposite are loaded with ginsenoside Rh2 with high content and excellent efficiency (Fig. 14), and are excellent in purity, thermal stability, in vitro stability and the like 5 to 10), and showed excellent UV-blocking effect, antioxidative effect, moisturizing effect, and showed no cytotoxicity (Tables 5 and 6 and FIGS. 12 to 15).
  • the zinc oxide nanocomposite prepared according to the method of the present invention can be usefully used for various purposes.
  • Another embodiment provides a functional cosmetic composition comprising the zinc oxide nanocomposite.
  • composition comprising the zinc oxide nanocomposite.
  • cosmedical, cosmeceutical refers to a cosmetic or cosmetic composition which has been introduced into a professional therapeutic function of a pharmaceutical product, and has a professional function emphasizing physiologically active effects / A product that helps to whiten skin, a product that helps to wrinkle skin, a product that helps protect skin from burning or UV rays.
  • the cosmetic composition may exhibit a function of blocking ultraviolet rays reaching the skin among the various functions, improving the moisturizing effect of the skin, or adding the antioxidative effect of the skin.
  • the cosmetic composition may be used for ultraviolet ray shielding, skin moisturizing, or antioxidative, but is not limited thereto, and the content of the zinc oxide nanocomposite contained in the composition is also not particularly limited.
  • the functional cosmetic composition according to the present invention may be formulated into one kind selected from the group consisting of lotion, nutritional cream, essence, pack or ointment. However, as long as it can be used for ultraviolet rays shielding, skin moisturizing or antioxidant, It does not.
  • the present invention relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising a lotion, a nutritional cream, an essence, a pack, an ointment, a solution, an ointment, a cream, a foam, a nutritional lotion, a softening longevity
  • the composition may be formulated into a formulation selected from the group consisting of solid oils, suspensions, emulsions, pastes, gels, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, patches and sprays But is not limited thereto.
  • the functional cosmetic composition of the present invention may further comprise at least one cosmetically acceptable carrier to be incorporated into a general skin cosmetic composition
  • the conventional ingredients include oil, water, a surfactant, a humectant, , A thickening agent, a chelating agent, a coloring matter, a preservative, a flavoring agent, and the like may be suitably compounded, but not limited thereto, and may include a suitable carrier according to the formulation.
  • hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan prepared using a leafy leaf extract; And / or the zinc oxide nanocomposite with ginsenoside Rh2 or curcumin exhibited excellent UV blocking effect, antioxidative effect, moisturizing effect, and showed no cytotoxicity (Tables 5 and 6 and Figs. 12 to 15) .
  • the zinc oxide nanocomposite prepared according to the method of the present invention can be usefully used as an effective ingredient of a functional cosmetic composition.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the zinc oxide nanocomposite.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer, comprising the zinc oxide nanocomposite.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of cancer using the zinc oxide nanocomposite according to the present invention.
  • treatment means all the actions of improving or alleviating symptoms of cancer using zinc oxide nanocomposite according to the present invention.
  • the cancer may be, for example, cancer of the colon, pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, Endometrioid carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small bowel cancer, endocrine cancer, ovarian cancer, ovary cancer, melanoma, colon cancer, ovarian cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectum cancer, , Cervical cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, urothelial carcinoma, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary adenoma And more specifically may be, but is not limited to, breast cancer or lung cancer.
  • hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan prepared using a leafy leaf extract; And / or zinc oxide nanocomposite conjugated with ginsenoside Rh2 or curcumin showed significant cytotoxicity against breast cancer or lung cancer cells (Fig. 16). This suggests that the zinc oxide nanocomposite prepared according to the method of the present invention can be effectively used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Another embodiment provides a method of preventing or treating cancer, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • individual of the present invention may refer to all animals, including humans, who have developed or are likely to develop cancer.
  • the animal may be, but is not limited to, a mammal such as a cow, a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, a nutrient, a dog, a cat,
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • administering means introducing the drug delivery composition of the present invention to a patient by any appropriate method, and the administration route of the composition is administered through any conventional route as long as it can reach the target tissue . But are not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal administration. Due to the fact that the composition of the present invention is effective for preventing or treating cancer, the administration route of the composition can be administered orally.
  • the " pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dosage level will vary depending on the species and severity, age, sex, The time of administration, the route of administration and the rate of excretion, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the zinc oxide nanocomposite may be administered at a daily dose of 0.0001 to 1000 mg / kg, specifically 0.001 to 100 mg / kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered daily or intermittently, and the number of times of administration per day may be administered once or two or three times.
  • the two active ingredients are each monoglyceride, the number of administrations may be the same or different.
  • the composition of the present invention can be used alone or in combination with other drug treatments for the prevention or treatment of cancer. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • a hyaluronic acid-zinc oxide nanocomposite (HA-ZnONCS) or a carboxymethyl chitosan-zinc oxide nanocomposite (ZnO nanocomposite) is prepared by bonding hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan to zinc oxide nanocomposites (ZnONcs) CMC-ZnONcs).
  • Zinc nitrate hexahydrate was used as a tartrate, and polymers such as hyaluronic acid or carboxymethylchitosan were selected for the purpose of steric stabilization, surface modification for bonding ginsenoside Rh2, and improvement of drug delivery ability .
  • D. morbifera Leveille was used for 6 years, and Huchilkie leaf extract was used to improve water stability, antioxidant activity and skin protection effect of ZnONcs.
  • 0.2 g of sodium hyaluronate or O-carboxymethyl chitosan was dissolved in 100 ml of Hwangbukkie leaf extract (20%, v / v) and solubilized at room temperature for 1 hour A polymer solution was prepared. Thereafter, 10 ml of 0.1 ml of zinc nitrate hexahydrate solution was added to the polymer solution, stirred for 1 hour, and then heated at 50 ⁇ ⁇ . Thereafter, 0.2 M NaOH (15 ml for HA-ZnONcs and 25 ml for CMC-ZnONcs) was added to the reaction mixture and ZnONcs was formed through the appearance of a white turbid appearance.
  • Experimental Example 2-1 Process for producing zinc oxide nanocomposite with ginsenoside Rh2 and polymer bound thereto
  • Hyaluronic acid-zinc oxide nanocomposite (Rh2-HA-ZnONcs) or ginsenoside Rh2 (ginsenoside Rh2) was prepared by binding ginsenoside Rh2 to HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared in Experimental Example 1, -Carboxymethyl chitosan-zinc oxide nanocomposite (Rh2-CMC-ZnONcs) was prepared.
  • the hydroxyl group of ginsenoside Rh2 was covalently bound to the unsubstituted carboxyl group of HA-ZnONcs and CMC-ZnONcs through Steglich esterification.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs were dispersed by ultrasonication in 50 ml of DMF (dimethylformamide). Then, EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 0.25 mmol) and DMAP (4-Dimethylaminopyridine, 0.23 mmol) were dissolved in 1 ml of the DMF containing each ZnONcs, carboxylic group was activated and then stirred continuously at room temperature for 28 minutes to prepare a reaction mixture.
  • DMF dimethylformamide
  • ginsenoside Rh2 (0.08 mmol) dissolved in 1 ml of DMF was added to the reaction mixture, and ginsenoside Rh2 was connected with HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs by stirring for 24 hours at a dark room temperature. Thereafter, to remove unreacted reagents, solid-type Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs were obtained by centrifugation at 4750 x g for 10 minutes, which was washed with distilled water and lyophilized.
  • the absorption spectra were analyzed in the range of 200-700 nm using a UV-Vis spectrophotometer (UltrospecTM 739 2100 pro) with a 10 mm quartz cuvette (2100 Pro, Amersham Biosciences Corp. USA).
  • JEM-2100F (JEOL, USA) operating at 200 kV was used as the field emission transmission electron microscope (FE-TEM) and the ZnONcs suspension was placed on a carbon-coated copper grid at FE Dried to obtain a sample.
  • FE-TEM field emission transmission electron microscope
  • X- ray diffraction (XRD) spectrum was measured by a D8 Discover with GADDS (Bruker, Germany ) operating at Cu ⁇ k ⁇ radiation (radiation) of 40 mA and a voltage of 40 kv, through a 2 ⁇ range of 20-80 ° Respectively.
  • the average size of the crystals was measured using the Debye-Scherrer equation with shape factor (K) of 0.9.
  • the zeta potential and the hydrodynamic particle size were determined using an ELS-Z2 series particle size analyzer (Otsuka Electronics Co., Ltd., Japan) at 25 DEG C. Pure water (having a refractive index of 1.3328, a viscosity of 0.8878, 78.3).
  • FTIR Fourier-transform infrared
  • TGA Thermogravimetric analysis
  • DSC differential scanning calorimetry
  • ZnO nanoparticles were easily dissociated to Zn 2+ in an acidic environment (pH ⁇ 6), and the stability of ZnONcs according to the present invention was confirmed in an acidic condition, as the pH of the skin surface was weakly acidic, ranging from 4.6 to 5.8.
  • the dissolution state of HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs was confirmed under a wide range of pH conditions (pH 2 to 10) and recorded as a UV-vis spectrum. At this time, the pH was adjusted using 0.1 M HCl and 0.2 M NaOH.
  • the ZnONcs prepared in Experimental Examples 1 and 2 specifically, HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs
  • the degree of ultraviolet blocking thereof was confirmed.
  • each ZnONcs sample was resuspended in distilled water to prepare a suspension of 200 ⁇ g / ml, and the absorbance of each sample was measured at 5 nm intervals using a UV-Vis spectrometer of 290 to 320 nm.
  • the value of EE (erythemal effect spectrum) ⁇ I (solar intensity spectrum) is a constant, and SPF is calculated by multiplying the sum by the correction factor (10).
  • a 0.6 mM DPPH solution was prepared using 80% MeOH and the absorbance was maintained at 0.7 ⁇ 0.015 by storing in the dark. Then, 50 ml of various concentrations of ZnONcs samples were added to 100 [mu] l of the DPPH solution and sonicated for 30 minutes in the dark. Finally, the mixture was centrifuged at 28,000 x g for 10 minutes to obtain a supernatant. As a negative control, vitamin K (0.5 mg / ml) and galactic acid (0.5 mg / ml) were used as the positive control group, and the reaction mixture obtained by performing the above procedure without adding ZnONcs was used. The DPPH radical scavenging activity was then expressed as percent inhibition using the following equation:
  • A is the absorbance at 517 nm.
  • ABTS salt 0.7 mM
  • potassium sulfate 2.45 mM
  • the solution was incubated overnight in the dark at room temperature, and the absorbance of the ABTS + solution was diluted with 80% EtOH and measured at 734 nm to obtain an absorbance of 0.7 +/- 0.005.
  • Ten microliters of ZnONcs samples at various concentrations were placed in 190 microliters of ABTS + solution, and the reaction mixture was incubated for 8 minutes.
  • vitamin K 0.5 mg / ml
  • galactic acid 0.5 mg / ml
  • the reaction mixture obtained by performing the above procedure without adding ZnONcs was used.
  • the ABTS + scavenging power was expressed as a percentage using the following equation:
  • A is the absorbance at 734 nm.
  • the ZnONcs prepared in Experimental Examples 1 and 2 specifically, HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs as a component of a cosmetic composition composition.
  • TEWL transepidermal water loss
  • 1 ml of various concentrations of ZnONcs samples were suspended in distilled water and incubated for 72 hours at 25 ° C and 40% relative humidity.
  • a sample without ZnONcs was used as a negative control, and pure glycerin (100%) as an endogenous humectant was used as a positive control.
  • the moisture resistance was then expressed as the weight loss of the sample before incubation (W 0 h ) and after (W 72 h )
  • the ZnONcs prepared in Experimental Examples 1 and 2 specifically, The content of ginsenoside Rh2 contained in HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs was examined.
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • HA-ZnONcs various concentrations of HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs, Rh2-CMC-ZnONcs, HA alone or ginsenoside Rh2 alone were treated for 72 hours with the cells reaching 90% density.
  • the absorbance of each sample was then measured at 570 nm using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Bio-Tek Instruments, Inc., Vinooski, VT, USA). Cells not treated with the samples were set as negative controls, which were expressed as 100% cell viability.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • UV-Vis Ultraviolet-Visible light
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically UV-Vis absorption characteristics of HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs were analyzed by the method according to Experimental Example 3.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by the extract of Hwangchujang leaf showed major absorption peaks at 360 nm or 420 nm, respectively, , And it was confirmed that they exhibited a high absorbance of 1.00, respectively.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs which were prepared without using leafy leaf extract, showed major absorbance peaks at 368 nm or 372 nm, respectively.
  • absorbance was about 0.50 or 0.70
  • UV-visible light absorbing activity was lower than that of HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by using the UV-visible light absorbing agent. Accordingly, it has been found that HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs of the present invention can be usefully used as an inorganic UV filter for a wide wavelength range.
  • the HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by using the extract of Hokutogi leaf extract has high absorbance at a wavelength of 300-400 nm indicating ultraviolet rays (UVA and UVB) Of the total.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically The structure and size of HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs were analyzed through FE-TEM according to Experimental Example 3 above.
  • the structure of HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by using the extract of Hwigookjung leaves was flower-like and had a size of 200 to 600 nm.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs in which ginsenoside Rh2 was conjugated to HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs, also exhibited a flower shape and had a size of 200 to 600 nm.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically The purity of HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs was analyzed by elemental mapping and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) according to Experimental Example 3 above.
  • EDX energy dispersive X-ray spectroscopy
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by using the extract of Hwanyeong leaves showed characteristic peaks, and HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs It was confirmed that Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs to which senoside Rh2 was bound exhibited the same characteristic peaks as those of HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs.
  • the peak of ZnONcs of the present invention is the same as the peak of ZnO having a wurtzite structure of hexagonal structure, so that the purity of ZnONcs of the present invention was confirmed to be considerably high.
  • * FWHM in Table 2 represents a full width half maximum, and lattice constants are 3.24 ⁇ (a) or 5.20 ⁇ (c).
  • * FWHM in Table 3 represents a half width, and the lattice constant is 3.24 ⁇ (a) or 5.12 ⁇ (c).
  • * FWHM in Table 4 represents the half width and the lattice constant is 3.24 ⁇ (a) or 5.20 ⁇ (c).
  • * FWHM in Table 4 represents the half width, and the lattice constant is 3.24 ⁇ (a) or 5.21 ⁇ (c).
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically Thermal stability of HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs was analyzed by thermogravimetric analysis (TGA) or differential scanning calorimetry (DSC) according to Experimental Example 3 above.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared from Hwanyeolmu leaf extract was remarkably stable up to 600 ° C., and hyaluronic acid or carboxymethyl It was confirmed that hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan bound to HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs was 11.81% or 13.63%, respectively, by confirming that chitosan was contained at 11.81% or 13.63%, respectively.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared from Hwangbukki leaf extract have better thermal stability than HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by conventional chemical methods, and polymer such as hyaluronic acid or chitosan And more.
  • Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs in which ginsenoside Rh2 is bound to the HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by using the extract of Hokutogama leaf,
  • the amount of hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan bound to the HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs was 9.96% or 9.96%, respectively, by confirming that the amount of hyaluronic acid or carboxymethyl chitosan dissociated from the ZnONcs surface was 9.96% or 9.38% 9.38%.
  • Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs prepared from Hwangbukki leaf extract have better thermal stability than HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by conventional chemical methods and hyaluronic acid or Chitosan, and the like.
  • Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs exhibit a DSC pattern similar to pure ginsenoside Rh2 at 150 ° C. or lower at which ginsenoside Rh2 is decomposed.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically The binding properties of ginsenoside Rh2 and ZnONcs in Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs were analyzed through the FTIR spectrum according to Experimental Example 3 above.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically The in vitro stability of HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs was analyzed by the method according to Experimental Example 4 above.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically In order to investigate the characteristics of HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs as cosmetic composition components, the absorbance and SPF at each wavelength were checked by the method according to Experimental Example 5-1, Protective activity and UV blocking effect were confirmed.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared using the extract of Hwangbukki leaf had an absorbance of about 1.11-1.19 at a wavelength of 290-320 nm.
  • Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs having ginsenoside Rh2 bound to HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs have an absorbance of about 1.30 to 1.41 at a wavelength of 290 to 320 nm, HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs prepared by using the extract of Hokutake japonica had a UV blocking index of about 11.2 to 11.7.
  • Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs having ginsenoside Rh2 bound to HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs have an absorbance of about 13.3 to 14.0, the HA-ZnONcs or CMC- It was found that the ultraviolet ray shielding effect was more excellent than that of the present invention.
  • ZnONcs of the present invention exhibits an excellent ultraviolet light resistance effect and thus a skin protecting activity, so that it can be effectively used as a cosmetic composition.
  • HA-ZnONcs exhibited DPPH radical scavenging ability in a concentration-dependent manner and CMC-ZnONcs showed the highest DPPH radical scavenging ability at about 3 mg / ml as shown in FIG.
  • HA-ZnONcs exhibits ABTS + radical scavenging ability in a concentration-dependent manner
  • CMC-ZnONcs exhibits the highest ABTS + radical scavenging activity at about 3 mg / ml.
  • ZnONcs of the present invention exhibits excellent antioxidative activity, and thus it can be used as a cosmetic composition.
  • HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs showed a remarkable moisturizing effect compared to hyaluronic acid or carboxymethylchitosan alone.
  • ZnONcs when treating ZnONcs at a concentration of 100 to 200 / / ml, it was confirmed that the composition exhibited a similar or better moisturizing effect to the glycerin used as a main component of a commercially available moisturizer.
  • ZnONcs of the present invention shows excellent moisturizing effect, and thus it can be used as a cosmetic composition.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically In order to characterize HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs as cosmetic composition components, the loading amount of ginsenoside Rh2 was confirmed by the method according to Experimental Example 5-5.
  • ZnONcs of the present invention can be used as a cosmetic composition because it can load a large amount of ginsenoside Rh2 exhibiting various physiological activities against skin.
  • the ZnONcs prepared in Examples 1 and 2 specifically In order to characterize HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs as cosmetic composition components, toxicity to skin cells was confirmed by the method according to Experimental Example 5-6.
  • HA-ZnONcs showed no cytotoxicity at the concentration of 0.1 ⁇ g / ml, and cell proliferation at the concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • CMC-ZnONcs showed no cytotoxicity at a concentration of 0.1 to 10 ⁇ g / ml.
  • ZnONcs of the present invention does not show toxicity to skin cells, and thus it can be used as a cosmetic composition.
  • ZnONcs namely HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs, Rh2-CMC-ZnONcs, curcumin-HA-ZnONcs or curcumin- Respectively.
  • MCF7 breast cancer cells or A549 lung cancer cells were incubated with HA-ZnONcs or CMC-ZnONcs for 72 hours after reaching a confluency of 90%; Ginsenoside Rh2 alone, Rh2-HA-ZnONcs or Rh2-CMC-ZnONcs; Or curcumin alone, curcumin-HA-ZnONcs or curcumin-CMC-ZnONcs at various concentrations.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Cell survival rate was about 10% or less.
  • ZnONcs of the present invention shows significant cytotoxicity against various cancer cells, and thus it can be used effectively for prevention or treatment of cancer.

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Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan); 및 황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물, 상기 조성물을 이용한 산화아연 나노복합체의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 산화아연 나노복합체, 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는 기능성 화장료 조성물, 및 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 이용한 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan); 및 황칠나무 추출물을 포함하는 산화아연 나노복합체 제조용 조성물, 상기 조성물을 이용한 산화아연 나노복합체의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 산화아연 나노복합체, 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는 기능성 화장료 조성물, 및 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 이용한 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
금속 나노복합체는 금속 또는 금속이온에 유기화합물 또는 금속이온이 결합하여 생성되는 복합체로서, 나노의 크기를 갖는 것이 특징이다. 독특한 입자 모양과 크기를 가지며, 독특한 전자성, 자기성, 촉매성 및 광학적인 특성을 가지므로 전자 공학, 광학뿐만 아니라 생물학, 약학 등의 분야에서 다양하게 응용되고 있다.
금속 중에서도 산화아연은 광학적 특성, 열적 특성 및 전기전자적 특성이 우수하다고 알려져 있다. 특히, 광학적 특성의 일종인 높은 굴절율은 산화아연이 자외선 차단 효과를 나타내게 한다. 이러한 특성을 바탕으로 자외선을 흡수하는 역할로서 감광지, 광전지 등에 산화아연이 이용되며, 페인트, 고무, 플라스틱의 제조에도 산화아연에 사용된다. 나아가, 산화아연의 자외선 차단 효과를 유지시키며 제형 안정성 및 사용감 등을 개선한 산화아연/이산화티탄 코어-쉘 나노입자 복합체가 개발된바 있다(한국 등록특허공보 제10-1680523호). 또한, 산화아연은 자외선 차단용 화장품의 성분으로도 사용되고 있으나, 산화아연 나노복합체의 제조에 사용되는 일반적인 물리/화학적 방법은 친환경적이지 못하며, 인체에 독성을 나타낼 수도 있는 물질을 사용한다는 점에서 피부에 적용 가능한 안전한 산화아연 복합체의 개발이 필요한 실정이었다.
한편, 황칠나무는 산형화목 두릅나무과에 속하는 식물로서, 덴드로파녹시드(dendropanoxide) 등의 정유 성분, 사포닌, α-큐베벤(α-Cubebene), β-엘레멘(β-Elemene), β-셀리넨(β-Selinene), α-무로렌(α-Muurolene), 저마크렌 D(Germacrene D), β-시토스테롤(β-Sitosterol) 등의 다양한 생리활성 성분이 포함되어 있다고 알려져 있다. 이에 따라, 정혈작용, 간기능 개선, 항산화 작용, 경조직(뼈와 치아) 재생, 면역력 강화, 신경안정, 항균작용, 항암작용 등의 효과를 나타냄에 따라, 전통의학에서는 유용한 약재로서 사용된다. 그러나, 황칠나무를 이용하여 산화아연 나노복합체를 제조하는 방법은 개발된 바 없다.
본 발명자들은 친환경적이고 효율적으로 산화아연 나노복합체를 제조하기 위한 방법을 개발하고자 예의노력 연구한 결과, 황칠나무 추출물을 이용하는 경우 세포 독성이 없는 산화아연 복합체를 제조할 수 있고, 상기 산화아연 복합체는 항산화 활성, 수분 보존 능력, 자외선 보호 효과가 우수하며, 나아가 항암 활성이 우수함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan); 및 황칠나무 추출물을 포함하는, 산화아연 나노복합체 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 산화아연 전구체 또는 산화아연 나노복합체와 반응시키는 단계를 포함하는, 산화아연 나노복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된, 산화아연 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는, 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 산화아연 나노복합체의 제조방법은 천연 물질인 황칠나무 추출물을 이용하므로 친환경적일 뿐만 아니라 산화아연 나노복합체의 물 안정성, 항산화 활성 및 피부 보호 효과를 증진시킬 수 있으며, 또한 상기 방법에 따라 제조된 산화아연 나노복합체는 생체 적합성 및 안전성이 우수하고, 항산화 효과, 수분 보존 효과, 자외선 차단 효과 및 항암 활성이 우수하므로, 기능성 화장료 조성물 또는 항암제의 성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 산화아연 나노복합체(ZnO nanocomposites; ZnONcs)의 제조방법에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따라 제조한 ZnONcs의 UV-Vis 스펙트럼을 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs 및 B는 CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 3은 상기 ZnONcs의 UVB 및 UVA 광선 흡수 정도를 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs 또는 Rh2-HA-ZnONcs, 및 B는 CMC-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 4는 상기 ZnONcs의 FE-TEM 이미지로서, HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 및 Rh2-CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 5는 상기 ZnONcs의 XRD 패턴을 보여주는 크로마토그램으로서, HA-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs 및 Rh2-CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 6은 상기 ZnONcs의 열 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs 및 B는 CMC-ZnONcs에 관한 것이다. TGA는 열중량 분석 결과를 의미한다.
도 7은 상기 ZnONcs의 열 안정성 분석 결과를 보여주는 그래프로서, A는 Rh2-HA-ZnONcs 및 B는 Rh2-CMC-ZnONcs에 관한 것이다. TGA는 열중량 분석 및 DSC는 시차 주사 열량 분석 결과를 의미한다.
도 8은 상기 ZnONcs의 FTIR 스펙트럼을 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs 또는 Rh2-HA-ZnONcs, 및 B는 CMC-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs에 관한 것이다. 한편, C는 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 에스터결합으로 결합되어 있음을 보여주는 개략도이다.
도 9는 상기 ZnONcs의 시험관 내 안정성을 보여주는 그래프로서, A 및 B는 pH 조건, C 및 D는 전해질 농도에 대한 안정성에 관한 것이다. 또한, A 및 C는 HA-ZnONcs, B 및 D는 CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 10은 상기 ZnONcs의 기간에 따른 시험관 내 안정성을 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs, 및 B는 CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 11은 상기 ZnONcs의 DPPH 라디칼 소거능을 보여주는 그래프로서, HA-ZnONcs 및 CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 12는 상기 ZnONcs의 ABTS+ 라디칼 소거능을 보여주는 그래프로서, HA-ZnONcs 및 CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 13은 상기 ZnONcs의 보습 효과를 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs, B는 CMC-ZnONcs, C는 히알루론산(hyaluronic acid) 및 D는 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan)에 관한 것이다.
도 14는 상기 ZnONcs로부터 방출된 진세노사이드 Rh2를 보여주는 LC-MS 크로마토그램으로서, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 15는 상기 ZnONcs의 세포 독성을 보여주는 그래프로서, HA-ZnONcs 및 CMC-ZnONcs에 관한 것이다.
도 16은 상기 ZnONcs의 항암 효과를 보여주는 그래프로서, A는 HA-ZnONcs 또는 Rh2-HA-ZnONcs의 MCF7 유방암 세포에 대한 독성, B는 HA-ZnONcs 또는 Rh2-HA-ZnONcs의 A549 폐암 세포에 대한 독성, C는 HA-ZnONcs 또는 커큐민(Curcumin)-HA-ZnONcs의 MCF7 유방암 세포에 대한 독성, 및 D는 HA-ZnONcs 또는 커큐민-HA-ZnONcs의 A549 폐암 세포에 대한 독성에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan); 및 황칠나무 추출물을 포함하는, 산화아연 나노복합체 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산; 및 황칠나무 추출물의 산화아연 나노복합체의 제조 용도를 제공한다.
본 발명자들은, 황칠나무 추출물을 이용하여 산화아연 나노복합체를 제조하는 경우 산화아연 나노복합체의 물 안정성, 항산화 활성 및 피부 보호 효과를 증진시킬 수 있음을 확인하였고, 상기 황칠나무를 이용하여 제조된 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan); 및/또는 진세노사이드 Rh2(ginsenoside Rh2) 또는 커큐민(curcumin);이 결합된 산화아연 나노복합체는 항산화 효과, 수분 보존 효과 및 자외선 차단 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명의 용어, "히알루론산(hyaluronic acid)"은 N-아세틸글루코사민(N -acetylglucosamine)과 글루쿠론산(glucuronic acid)으로 이루어진 고분자 화합물이다. 눈의 초자체나 탯줄, 피부 등에 존재하며, 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는 역할을 한다.
본 발명의 용어, "카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan)"은 수용성 키토산 유도체의 일종으로, 친수성기인 카복시메틸(carboxymethyl)이 도입된 키토산 유도체를 의미한다.
본 발명의 용어, "황칠나무 추출물"은 황칠나무를 용매를 이용하여 통상적인 방법으로 얻어낸 황칠나무에 속한 성분이나 물질을 의미한다.
본 발명에서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎 추출물일 수 있다.
구체적으로, 상기 용어, "황칠나무"(Dendropanax morbifera)는 산형화목 두릅나무과에 속하는 식물을 의미한다. 정유성분이 주성분으로 되어 있으며, 담황색의 진한 유상액체로서 상쾌한 향기를 지니며 쓴맛을 지닌다. 황칠나무는 심신을 편하게 하고 각종 역기를 억제시키고 남성에게는 신장 강화, 여성에게는 생리불순 치료 효과 등을 나타내며, 면역세포의 생육을 촉진시켜 조기 면역체계 및 생체방어체계를 강화시킬 수 있으므로 각종 질병의 예방 및 치료에 사용되고 있다. 그러나, 황칠나무가 산화아연 복합체의 제조에 이용될 수 있음은 공지된 바 없었다.
또한, 상기 용어, "추출물"은 상기 황칠나무를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 상기 황칠나무를 추출하는 방법 또는 추출 용매는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법 또는 용매를 사용할 수 있다.
본 발명에서, 산화아연 나노복합체 제조용 조성물은 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "진세노사이드 Rh2"는 인삼으로부터 분리된 PPD(protopanaxadiol) 계열 사포닌을 의미한다. 20(S)-protopanaxdiol-3-O-β-D- glucopyranoside라고도 하고, C36H62O8의 화학식으로 표시되며, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다. 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rh2는 "Rh2"로 혼용되어 명명될 수 있다. 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rh2는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 또는 자연계에서 재배 또는 채취한 인삼으로부터 분리된 것을 사용하거나, 또는 합성방법에 의해 합성된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017013858-appb-I000001
본 발명의 용어, "커큐민(curcumin)"은 알칼로이드의 일종으로서, 강황에 주로 포함되어 있다고 알라져 있다. C21H20O6의 화학식으로 표시되며, 하기 화학식 2 또는 3으로도 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2017013858-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2017013858-appb-I000003
본 발명의 용어, "산화아연 나노복합체"(ZnO nanocomposites; ZnONcs)는 산화아연(zinc oxide; Zn2O)에 다양한 화합물이 결합된 형태의 복합체를 의미한다.
본 발명에서, 상기 산화아연 나노복합체는 황칠나무 잎 추출물을 적재하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 산화아연 나노복합체는 산화아연에 히알루론산; 카복시메틸 키토산; 히알루론산 및 진세노사이드 Rh2; 카복시메틸 키토산 및 진세노사이드 Rh2; 히알루론산 및 커큐민; 또는 카복시메틸 키토산 및 커큐민이 결합된 것 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 산화아연 나노복합체는 "ZnONcs"로 명명될 수 있다. 또한, 상기 산화아연 나노복합체는 산화아연에 히알루론산이 결합된 경우 "HA-ZnONcs", 카복시메틸 키토산이 결합된 경우 "CMC-ZnONcs", 히알루론산 및 진세노사이드 Rh2가 결합된 경우 "Rh2-HA-ZnONcs", 카복시메틸 키토산 및 진세노사이드 Rh2가 결합된 경우 "Rh2-CMC-ZnONcs", 히알루론산 및 커큐민이 결합된 경우 "커큐민-HA-ZnONcs", 카복시메틸 키토산 및 커큐민이 결합된 경우 "커큐민-CMC-ZnONcs"로 명명될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황칠나무 잎 추출물을 사용하여 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산; 및/또는 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민이 결합된 산화아연 나노복합체를 제조하였고(실험예 1 및 2), 상기 산화아연 나노복합체는 순도, 열 안정성, 시험관 내 안정성이 등이 우수하고(도 5 내지 10), 자외선 차단 효과, 항산화 효과, 보습 효과 등이 우수하며 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(표 5 및 6, 및 도 12 내지 15). 이는, 본 발명의 조성물은 다양한 효능을 나타내는 산화아연 나노복합체의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태는 상기 조성물을 산화아연 전구체 또는 산화아연 나노복합체와 반응시키는 단계를 포함하는, 산화아연 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 산화아연 나노복합체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 산화아연 나노복합체의 제조방법은 천연 물질인 황칠나무 추출물을 이용하기 때문에, 종래의 화학적 합성방법 및 물리적 합성방법에 비해 친환경적이고, 동시에 산화아연 나노복합체의 물 안정성, 항산화 활성 및 피부 보호 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 산화아연 전구체는 환원반응에 의해 산화아연 나노입자를 형성할 수 있는 염(salt) 형태인 것일 수 있고, 구체적으로 질산아연6수화물(Zinc nitrate hexahydrate), 황산아연(Zinc sulfate) 또는 아세트산아연(zinc acetate), 더욱 구체적으로 질산아연6수화물일 수 있으나, 산화아연 나노복합체를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 목적상, 상기 산화아연 나노복합체는 산화아연에 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산이 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 목적상, 상기 산화아연 나노복합체는 산화아연에 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산이 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 염전구체로서 질산아연6수화물을 사용하여 산화아연 나노복합체에 히알루론산 또는 카르복시메틸 키토산을 결합시킨 히알루론산-산화아연 나노복합체(HA-ZnONcs) 또는 카복시메틸 키토산-산화아연 나노복합체(CMC-ZnONcs)를 제조하였고(실험예 1), 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민을 결합시켜 진세노사이드 Rh2-히알루론산-산화아연 나노복합체(Rh2-HA-ZnONcs), 진세노사이드 Rh2-카복시메틸 키토산-산화아연 나노복합체(Rh2-CMC-ZnONcs) 또는 커큐민-히알루론산-산화아연 나노복합체(커큐민-HA-ZnONcs)를 제조하였다(실험예2). 이는, 상기 산화아연 나노복합체의 제조용 조성물을 이용한 본 발명의 방법은 산화아연 나노복합체의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법에 의해 제조된, 산화아연 나노복합체를 제공한다.
이때, 상기 산화아연 나노복합체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 산화아연 나노복합체는 천연 물질로서 생리학적으로 유효한 성분인 황칠나무 추출물, 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민을 포함하고, 세포에 대하여 독성을 나타내지 않아 생체 적합성 및 안전성이 우수하며, 항산화 효과, 수분 보존 효과 및 자외선 차단 효과가 우수하므로, 의료용, 생물학적 분석용, 화장용 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황칠나무 잎 추출물을 사용하여 제조된, 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산; 및/또는 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민이 결합된 산화아연 나노복합체는 진세노사이드 Rh2를 높은 함량 및 우수한 효율로 적재하며(도 14), 순도, 열 안정성, 시험관 내 안정성이 등이 우수하고(도 5 내지 10), 자외선 차단 효과, 항산화 효과, 보습 효과 등이 우수하며 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(표 5 및 6, 및 도 12 내지 15). 이는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 산화아연 나노복합체는 다양한 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는, 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는 조성물의 기능성 화장료 용도를 제공한다.
이때, 상기 산화아연 나노복합체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "기능성 화장료(cosmedical, cosmeceutical)"는 화장품 또는 화장료 조성물에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능/효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품을 의미한다.
본 발명의 목적상, 상기 화장료 조성물은 다양한 기능 중에서도 피부에 닿는 자외선을 차단하거나, 피부의 보습 효과를 향상시키거나, 피부의 항산화 효과를 부가하는 기능을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물은 자외선 차단용, 피부 보습용 또는 항산화용일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 조성물에 포함되는 산화아연 나노복합체의 함량 또한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물은 화장수, 영양크림, 에센스, 팩 또는 연고로 구성되는 군으로부터 선택된 1종으로 제형화될 수 있으나, 자외선 차단용, 피부 보습용 또는 항산화용으로 사용될 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 화장수, 영양크림, 에센스, 팩, 연고, 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 기능성 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제형에 따른 적절한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황칠나무 잎 추출물을 사용하여 제조된, 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산; 및/또는 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민이 결합된 산화아연 나노복합체는 자외선 차단 효과, 항산화 효과, 보습 효과 등이 우수하며 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(표 5 및 6, 및 도 12 내지 15). 이는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 산화아연 나노복합체는 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 상기 산화아연 나노복합체를 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이때, 상기 산화아연 나노복합체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 산화아연 나노복합체를 이용하여 암의 발병을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 산화아연 나노복합체를 이용하여 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 암은 예를 들어 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 난소암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종을 의미할 수 있고, 더욱 구체적으로 유방암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황칠나무 잎 추출물을 사용하여 제조된, 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산; 및/또는 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민이 결합된 산화아연 나노복합체는 유방암 또는 폐암 세포에 대하여 현저한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다(도 16). 이는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 산화아연 나노복합체는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 산화아연 나노복합체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개체"는 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약물 전달용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물이 암의 예방 또는 치료에 효과가 있는 특성상, 상기 조성물의 투여 경로는 경구를 통하여 투여될 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 산화아연 나노복합체는 각각 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 구체적으로 0.001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실험예 1. 폴리머가 결합된 산화아연 나노복합체의 제조 방법
산화아연 나노복합체(ZnO nanocomposites; ZnONcs)에 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan)을 결합시켜 히알루론산-산화아연 나노복합체(HA-ZnONcs) 또는 카복시메틸 키토산-산화아연 나노복합체(CMC-ZnONcs)를 제조하였다.
구체적으로, NaOH를 사용한 공동침전방법으로 제조하였다. 염전구체로서 질산아연6수화물(zinc nitrate hexahydrate)을 사용하였고, 상기 히알루론산 또는 카르복시메틸 키토산 등의 폴리머들은 입체적 안정화, 진세노사이드 Rh2 결합을 위한 표면 변형 및 약물 전달능 향상 등을 목적으로 선택하였다. 황칠나무(D. morbifera Leveille)는 6년 된 것을 사용하였고, 황칠나무 잎 추출물은 ZnONcs의 물 안정성, 항산화 활성 및 피부 보호 효과를 향상시키기 위하여 사용하였다.
더욱 구체적으로, 히알루론산나트륨(sodium hyaluronate) 또는 O-카르복시메틸 키토산(O-carboxymethyl chitosan) 0.2 g을 100 ㎖의 황칠나무 잎 추출물(20%, v/v)에 넣어 1시간 동안 실온에서 가용화시킴으로써 폴리머 용액을 제조하였다. 이후, 0.1 ㎖의 질산아연6수화물(Zinc nitrate) 용액 10 ㎖를 상기 폴리머 용액에 첨가하여 1시간 동안 교반한 후, 50℃에서 가열하였다. 이후, 0.2 M NaOH(HA-ZnONcs의 경우 15 ㎖, CMC-ZnONcs의 경우 25 ㎖)를 반응 혼합물에 첨가하였고, 흰색의 탁한 모습이 나타나는 것을 통해 ZnONcs가 형성되는 것을 알 수 있었다. 이를 50℃에서 2시간 동안 지속적으로 교반한 후, 4750×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 ZnONcs를 수득하였다. 이를 증류수로 세척하고, 60℃에서 4시간 동안 건조시켜 남아있는 수산화아연[Zn(OH)2]을 ZnO로 전환시켰다. 이후, 상기 ZnONcs(HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs) 분말은 4℃에 보관하였다.
실험예 2. 진세노사이드 Rh2 또는 커큐민; 및 폴리머가 결합된 산화아연 나노복합체의 제조 방법
실험예 2-1. 진세노사이드 Rh2 및 폴리머가 결합된 산화아연 나노복합체의 제조 방법
상기 실험예 1에서 제조한 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2(ginsenoside Rh2)를 결합시켜 진세노사이드 Rh2-히알루론산-산화아연 나노복합체(Rh2-HA-ZnONcs) 또는 진세노사이드 Rh2-카복시메틸 키토산-산화아연 나노복합체(Rh2-CMC-ZnONcs)를 제조하였다. 진세노사이드 Rh2의 수산기는 Steglich 에스테르화(esterification)를 통해 HA-ZnONcs와 CMC-ZnONcs의 치환되지 않은 카르복실기에 공유결합하였다.
구체적으로, 100 ㎎의 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs를 DMF(dimethylformamide) 50 ㎖에 초음파로 분산시켰다. 이후, 각각의 ZnONcs가 포함된 상기 DMF 1 ㎖에 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, 0.25 mmol) 및 DMAP(4-Dimethylaminopyridine, 0.23 mmol)를 용해하여 각 폴리머의 카르복실기(carboxylic group)를 활성화시킨 후, 실온에서 28분 동안 지속적으로 교반함으로써 반응 혼합물을 제조하였다. 이후, DMF 1 ㎖에 용해한 진세노사이드 Rh2(0.08 mmol)를 상기 반응 혼합물에 첨가하였으며, 24시간 동안 어두운 실온에서 교반함으로써 진세노사이드 Rh2와 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs를 연결하였다. 이후, 미반응 시약을 제거하기 위하여 4750×g에서 10분 동안 원심분리하여 고체 형태의 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs를 수득하였고, 이를 증류수로 세척한 후 동결건조하였다.
실험예 3. ZnONcs의 특성 분석 방법
상기 실험예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 물리화학적 특성을 분석하기 위하여, 아래와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 흡수 스펙트럼은 10mm 길이의 석영 큐벳(2100 Pro, Amersham Biosciences Corp. USA)으로 자외선-가시 광선(UV-Vis) 분광 광도계(UltrospecTM 739 2100 pro)를 이용하여 200-700nm 범위에서 분석하였다.
전계 방출 투과 전자 현미경(FE-TEM)으로는 200 kV에서 작동하는 JEM-2100F(JEOL, USA)를 이용하였고, FE-TEM 이미지는 ZnONcs 현탁액을 탄소가 피복된 구리 그리드 위에 올려두고, 60℃에서 건조시켜 수득한 샘플로부터 얻었다.
X-선 회절(XRD) 스펙트럼은 40 kv의 전압 및 40 mA의 Cu·kα 방사(radiation)에서 작동하는 D8 Discover with GADDS(Bruker, Germany)로 측정하였고, 20-80°의 2θ 범위에 걸쳐 분석하였다.
결정의 평균 크기는 0.9의 형상 계수(K)를 갖는 Debye-Scherrer 방정식을 이용하여 측정하였다.
제타 전위 및 유체역학적 입자 크기는 25℃에서 ELS-Z2 시리즈 입자 크기 분석기(일본 오츠카 전자 (Otsuka Electronics Co., Ltd.)를 사용하여 결정하였다. 이때, 순수한 물(굴절률 1.3328, 점도 0.8878, 및 유전율 78.3)을 기준으로 하였다.
푸리에-변환 적외선(FTIR) 스펙트럼은 PerkinElmer Spectrum 100 분광기로 기록하였다. ZnONcs 분말을 KBr 펠렛에서 4 cm-1의 분해능으로 4000 - 450 cm-1 범위에서 스캔하였다.
열중량 분석(TGA) 및 시차 주사 열량계(DSC)는 10℃/분(Tmax = 600℃)의 램프 속도 및 N2 대기(100 ㎖/분) 조건에서 TGA Q5000 IR/SDT Q600(TA instrument, DE, USA) 장치를 이용하여 측정하였다.
실험예 4. ZnONcs의 시험관 내 안정성 확인 방법
ZnO 나노 입자는 산성 환경(pH≤6)에서 Zn2+로 쉽게 해리되며, 피부 표면의 pH가 4.6 내지 5.8의 약산성임에 따라, 산성 조건에서 본 발명에 따른 ZnONcs의 시험관 내 안정성을 확인하였다.
구체적으로, HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs(200 ㎍/㎖)의 용해 상태를 광범위한 pH 조건(pH 2 내지 10)에서 확인하였고, 이를 UV-vis 스펙트럼으로 기록하였다. 이때, pH는 0.1 M HCl 및 0.2 M NaOH를 이용하여 조절하였다.
또한, 다양한 전해질 조건(10-1 내지 10-5 M)에서 ZnONcs의 상태를 확인하였다.
실험예 5. ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성 분석 방법
실험예 5-1. 자외선 차단지수(sun protection factor) 확인 방법
상기 실험예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 분석하기 위하여, 이의 자외선 차단 정도를 확인하였다.
구체적으로, 각각의 ZnONcs 샘플을 증류수에 재현탁하여 200 ㎍/㎖의 현탁액을 제조하였고, 290 내지 320 nm의 UV-Vis 분광기를 사용하여 5 nm 간격으로 각 샘플의 흡광도를 측정하였다. 이때, EE(erythemal effect spectrum, 홍반 효과 스펙트럼)×I(solar intensity spectrum, 태양 강도 스펙트럼)의 값은 상수이며, SPF는 합계를 계산하고 보정계수(10)를 곱하여 확인하였다.
실험예 5-2. DPPH 소거활성 확인 방법
상기 실험예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 분석하기 위하여, 이의 항산화 활성을 DPPH 소거 활성을 통해 확인하였다.
구체적으로, 0.6 mM DPPH 용액을 80% MeOH를 이용하여 제조하였고, 어두운 곳에서 보관함으로써 흡광도를 0.7±0.015로 유지하였다. 이후, 다양한 농도의 ZnONcs 샘플 50 ㎖를 상기 DPPH 용액 100 ㎕에 첨가한 다음, 어두운 곳에서 30분 동안 초음파 처리하였다. 최종적으로, 혼합물을 28,000×g에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 이때, 음성 대조군으로는 ZnONcs를 첨가하지 않고 상기의 과정을 수행하여 수득한 반응 혼합물을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 비타민 C(0.5 ㎎/㎖) 및 갈릭산(0.5 ㎎/㎖)을 사용하였다. 이후, DPPH 라디칼 소거 활성은 하기의 방정식을 이용하여 저해 백분율로 나타내었다 :
Figure PCTKR2017013858-appb-I000004
여기서, A는 517 nm에서의 흡광도이다.
실험예 5-3. ABTS+ㆍ 소거능 확인 방법
상기 실험예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 분석하기 위하여, 이의 항산화 활성을 ABTS+ㆍ 소거능을 통해 확인하였다.
구체적으로, ABTS 염(0.7 mM)과 황산칼륨(2.45 mM)을 혼합하여 ABTS+를 생성시켰다. 상기 용액을 밤새 어두운 실온에서 인큐베이션하였고, ABTS+ 용액의 흡광도를 80% EtOH로 희석하여 734 nm에서 측정함으로써 0.7±0.005의 흡광도를 얻었다. 다양한 농도의 ZnONcs 샘플 10 ㎕를 ABTS+ 용액 190 ㎕에 넣었고, 반응 혼합물을 8분 동안 인큐베이션하였다. 이때, 음성 대조군으로는 ZnONcs를 첨가하지 않고 상기의 과정을 수행하여 수득한 반응 혼합물을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 비타민 C(0.5 ㎎/㎖) 및 갈릭산(0.5 ㎎/㎖)을 사용하였다. 이후, ABTS+ 소거능은 하기의 방정식을 이용하여 백분율로 나타내었다 :
Figure PCTKR2017013858-appb-I000005
여기서, A는 734 nm에서의 흡광도이다.
실험예 5-4. 보습력(moisture retention activity) 확인 방법
상기 실험예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 분석하기 위하여, 이의 보습력을 확인하였다.
구체적으로, 피부를 통한 수분의 손실(transepidermal　water loss, TEWL)을 측정하여 확인하였다. 다양한 농도의 ZnONcs 샘플 1 ㎖를 증류수에 현탁시키고 25℃, 40% 상대 습도를 갖는 조건에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 이때, 음성 대조군으로는 ZnONcs가 없는 샘플을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 내인성 보습제인 순수 글리세린(100%)을 사용하였다. 이후, 보습력은 인큐베이션 전(W0시간) 및 후(W72시간)에 따른 샘플의 중량 손실로 나타내었다:
Figure PCTKR2017013858-appb-I000006
.
실험예 5-5. ZnONcs에 포함된 진세노사이드 Rh2의 함량 확인 방법
상기 실험예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs에 포함된 진세노사이드 Rh2의 함량을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 액체크로마토그래피-질량 분석기(LC-MS)로 확인하였다. 동결건조된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs 1 ㎎을 DMSO-MeOH 혼합물(1:4, v/v)에 현탁하였고, 진세노사이드 Rh2를 복합체에서 완전히 방출시키기 위하여 실온에서 24 시간 동안 초음파 처리하였다. 이를 여과하여 상층액을 수득하였고, 진세노사이드 Rh2의 양을 LC-MS 기기[Agilent Technologies 6410 Triple Quad, Kromasil C18 컬럼 (2.1 mm × 100 mm, 2.7 ㎛)]을 사용하여 측정하였다. 각 시료의 주입량은 1 ㎕로 하였고, UV 검출은 203 nm에서 수행하였다. 0.1 % 포름산이 포함된 증류수(A 용매) 및 0.1 % 포름산이 포함된 MeOH(B 용매)를 이동상으로 사용하였고, 구체적으로 0분에는 B 용매 5% 및 A 용매 95%, 17분에는 B 용매 60% 및 A 용매 40%, 20분에는 B 용매 100%, 22분에는 B 용매 100%, 23분에는 B 용매 5% 및 A 용매 95%, 25분에는 B 용매 5% 및 A 용매 95%를 사용하였다. 이후, 진세노사이드 Rh2의 함량은 하기의 방정식을 이용하여 백분율로 나타내었다 :
Figure PCTKR2017013858-appb-I000007
실험예 5-6. ZnONcs의 시험관 내 세포 독성 확인 방법
ZnONcs의 시험관 내 세포 독성은 B16BL6 멜라닌형성세포에서 MTT 분석을 통해 확인하였다.
구체적으로, 다양한 농도의 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs, Rh2-CMC-ZnONcs, HA 단독 또는 진세노사이드 Rh2 단독을 90% 밀도에 도달한 상기 세포에 72시간 동안 처리하였다. 이후, 570nm에서 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 판독기(Bio-Tek Instruments, Inc., Vinooski, VT, USA)를 사용하여 각 샘플에 대한 흡광도를 측정하였다. 샘플을 처리하지 않은 세포를 음성 대조군으로 설정하였고, 이를 100% 세포 생존률로 나타내었다.
실험예 6. 통계 분석 방법
모든 실험은 달리 명시하지 않는 한 적어도 3번(n=3) 수행하였다. 실험 데이터는 평균±표준 오차(SEM)로 나타내었고, 대조군과 실험군 간의 통계적 유의성은 Student's t-검정으로 평가하였다. 통계적 유의성은 다음과 같이 나타내었다: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, **** P <0.0001.
실시예 1. ZnONcs의 물리화학적 특성 규명
실시예 1-1. 자외선-가시광선(UV-Vis) 흡수 특성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 자외선-가시광선(UV-Vis) 흡수 특성을 상기 실험예 3에 따른 방법으로 분석하였다.
먼저, 자외선-가시광선(UV-Vis) 스펙트럼 분석 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 각각 360 nm 또는 420 nm에서 주요 흡수 피크를 나타내며, 각각 1.00의 높은 흡광도를 나타냄을 확인하였다.
그러나, 황칠나무 잎 추출물을 이용하지 않고 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs은 각각 368 nm 또는 372 nm에서 주요 흡수 피크를 나타내었으나, 약 0.50 또는 0.70의 흡광도를 나타냄을 확인함으로써, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs보다 더 낮은 자외선-가시광선 흡수 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 넓은 파장 범위에 대한 무기물 UV 필터로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
나아가, 도 3에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 자외선(UVA 및 UVB)을 나타내는 300-400 nm의 파장에서 높은 흡광도, 즉 우수한 자외선 흡수 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
또한, 자외선(UVA 및 UVB)을 나타내는 상기 300-400 nm의 파장에서, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 결합된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs는 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs보다 더 넓은 흡수 피크를 나타내며 더 높음 흡광도를 가짐을 확인함으로써, 더 우수한 자외선 흡수 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs는 넓은 파장 범위에 대한 무기물 UV 필터로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-2. 구조 및 크기 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 구조 및 크기를 상기 실험예 3에 따른 FE-TEM을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 구조는 꽃모양이며, 200 내지 600 nm의 크기를 가짐을 알 수 있었다.
또한, 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 결합된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs도 동일하게 꽃모양을 나타내며, 200 내지 600 nm의 크기를 가짐을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 기존 산화아연의 크기는 수 나노미터 수준으로 피부에 흡수되는 문제점이 있었으나, 본 발명의 ZnONcs는 수백 나노미터 수준이므로, 피부에 흡수되는 문제점이 개선되어 생체 적합성이 우수함을 알 수 있었다.
실시예 1-3. 순도 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 순도를 상기 실험예 3에 따른 원소지도 작성 및 에너지 분산 X 선 분광법(EDX)을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 5, 및 하기 표 1 내지 4에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 특징적인 피크를 나타내며, 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 결합된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs도 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs와 동일한 특징적인 피크를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs가 나타내는 상기 피크는 육각형의 섬유아연석형 구조(wurtzite structure)를 갖는 ZnO의 피크와 동일한 것을 확인함으로써 본 발명의 ZnONcs의 순도는 상당히 높음을 확인하였다.
HA-ZnONcs의 XRD 패턴의 피크 목록
피크 피크 위치(2θ°) d-간격(d-spacing, Å) FWHM* 크기(nm)
100 31.83 2.81 0.97 8.52
002 34.51 2.60 0.59 14.11
101 36.34 2.47 0.79 10.59
102 47.61 - 3.71 2.34
110 56.70 1.62 1.57 5.75
103 63.01 1.47 1.61 5.79
103 63.16 1.47 - -
112 68.17 1.37 1.78 7.01
이때, 상기 표 2에서 *FWHM은 반치폭(Full width half maximum)을 나타내며, 격자 상수(lattice constants)는 3.24 Å(a) 또는 5.20 Å(c)이다.
Rh2-HA-ZnONcs의 XRD 패턴의 피크 목록
피크 피크 위치(2θ°) d-간격(Å) FWHM* 크기(nm)
100 31.84 2.81
002 34.55 2.59
101 36.36 2.47
102 47.40 1.91
102 47.64 1.90 - -
110 56.70 1.62
103 62.30 1.47
112 68.16 1.37
이때, 상기 표 3에서 *FWHM은 반치폭을 나타내며, 격자 상수는 3.24 Å(a) 또는 5.12 Å(c)이다.
CMC-ZnONcs의 XRD 패턴의 피크 목록
피크 피크 위치(2θ°) d-간격(Å) FWHM* 크기(nm)
100 31.82 2.81 0.93 8.89
002 34.53 2.60 0.52 16.01
101 36.36 2.47 0.83 10.08
102 47.76 - 2.06 4.22
110 56.62 1.62 1.47 6.14
103 63.08 1.47 1.80 5.18
112 68.05 1.38 2.69 3.57
004 73.07 1.30 0.73 13.56
이때, 상기 표 4에서 *FWHM은 반치폭을 나타내며, 격자 상수는 3.24 Å(a) 또는 5.20 Å(c)이다.
Rh2-CMC-ZnONcs의 XRD 패턴의 피크 목록
Peak Peak position(2θ°) d-spacing(ÅA) FWHM* Size(nm)
100 31.82 2.81
002 34.54 2.59
101 36.34 2.47
102 47.64 1.91
110 56.71 1.62
103 62.99 1.47
112 67.82 1.38
112 68.05 1.37 - -
201 69.29 1.36 - -
이때, 상기 표 4에서 *FWHM은 반치폭을 나타내며, 격자 상수는 3.24 Å(a) 또는 5.21 Å(c)이다.
실시예 1-4. 열 안정성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 열 안정성을 상기 실험예 3에 따른 열중량 분석(TGA) 또는 시차 주사 열량 분석(DSC)을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물로 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 최대 600℃까지 상당히 안정함을 확인하였고, 600℃에서 상기 ZnONcs 표면에서 해리된 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산은 각각 11.81% 또는 13.63%로 함유되어있음을 확인함으로써, 결과적으로 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 결합되어 있는 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산은 각각 11.81% 또는 13.63%임을 확인하였다.
반면에, 황칠나무 잎 추출물을 이용하지 않고, 기존의 화학적인 방법으로 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 경우, 600℃에서 상기 ZnONcs 표면에서 해리된 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산은 각각 4.48% 또는 7.91%임을 확인함으로써, 결과적으로 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 결합되어 있는 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산의 양은 각각 4.48% 또는 7.91%임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 황칠나무 잎 추출물로 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 기존의 화학적인 방법으로 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs 보다 열 안정성이 더 우수하며, 히알루론산 또는 키토산 등의 폴리머를 더 많이 포함하고 있음을 알 수 있었다.
나아가, 도 7에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 결합된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 경우, 600℃에서 ZnONcs 표면에서 해리된 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산의 양은 각각 9.96% 또는 9.38%임을 확인함으로써, 결과적으로 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 결합되어 있는 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산의 양은 각각 9.96% 또는 9.38%임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 황칠나무 잎 추출물로 제조된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs는 기존의 화학적인 방법으로 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs 보다 열 안정성이 더 우수하며, 히알루론산 또는 키토산 등의 폴리머를 더 많이 포함하고 있음을 알 수 있었다.
아울러, DSC 분석 결과를 통해, 상기 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs는 진세노사이드 Rh2가 분해되는 150℃ 이하에서는, 순수 진세노사이드 Rh2와 유사한 DSC 패턴을 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-5. 결합 특성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs에서 진세노사이드 Rh2와 ZnONcs의 결합 특성을 상기 실험예 3에 따른 FTIR 스펙트럼을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 진세노사이드 Rh2와 ZnONcs는 에스터 결합으로 공유결합되어 있음을 확인하였다.
실시예 2. ZnONcs의 시험관 내 안정성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 시험관 내 안정성을 상기 실험예 4에 따른 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, pH 4 내지 10에서 ZnONcs의 피크 위치는 거의 변하지 않으며, 넓은 범위의 전해질 조건(electrolytic conditions)에서도 동일한 위치에서 피크를 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 10에서 볼 수 있듯이, 실온에서 최소 14일 동안 안정적인 상태를 유지할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 황칠나무 잎 추출물로 제조된 ZnONcs는 다양한 pH 조건 및 전해질 조건에서도 오랜 시간 동안 안정적인 상태를 나타내므로, 피부에 도포 시에도 분해되지 않고 고유의 특성을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성 규명
실시예 3-1. 자외선 차단 효과 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 규명하고자, 상기 실험예 5-1에 따른 방법으로 각 파장에서의 흡광도 및 SPF를 확인하여 피부 보호 활성 및 자외선 차단 효과를 확인하였다.
Figure PCTKR2017013858-appb-T000001
그 결과, 상기 표 5에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 290 내지 320 nm의 파장에서 약 1.11 내지 1.19의 흡광도를 가짐을 확인하였다.
나아가, 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 결합된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs는 290 내지 320 nm의 파장에서 약 1.30 내지 1.41의 흡광도를 가짐을 확인함으로써, 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs보다 더 우수한 피부 보호 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
Figure PCTKR2017013858-appb-T000002
또한, 상기 표 6에서 볼 수 있듯이, 황칠나무 잎 추출물을 이용하여 제조된 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs는 약 11.2 내지 11.7의 자외선 차단 지수를 가짐을 확인하였다.
나아가, 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs에 진세노사이드 Rh2가 결합된 Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs는 약 13.3 내지 14.0의 흡광도를 가짐을 확인함으로써, 상기 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs보다 더 우수한 자외선 차단 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs는 우수한 자외선 자단 효과 및 이에 따른 피부 보호 활성을 나타내므로, 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-2. 항산화 효과 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 규명하고자, 상기 실험예 5-2 및 5-3에 따른 방법으로 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 확인함으로써 항산화 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, HA-ZnONcs는 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 나타내며, CMC-ZnONcs는 약 3 ㎎/㎖에서 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 12에서 볼 수 있듯이, HA-ZnONcs는 농도 의존적으로 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타내며, CMC-ZnONcs는 약 3 ㎎/㎖에서 가장 높은 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs는 우수한 항산화 활성을 나타내므로, 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-3. 보습 효과 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 규명하고자, 상기 실험예 5-4에 따른 방법으로 보습 효과를 확인하였다.
구체적으로, 도 13에서 볼 수 있듯이, HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 경우에는 히알루론산 또는 카르복시메틸 키토산 단독에 비하여 현저한 보습 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 100 내지 200 ㎍/㎖ 농도의 ZnONcs를 처리하는 경우, 시중에서 판매되는 보습제의 주요 성분으로 사용되고 있는 글리세린과 유사하거나 더 우수한 보습 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs는 우수한 보습 효과를 나타내므로, 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-4. 진세노사이드 Rh2의 적재량 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 규명하고자, 상기 실험예 5-5에 따른 방법으로 진세노사이드 Rh2의 적재량을 확인하였다.
구체적으로, 도 14에서 볼 수 있듯이, ZnONcs로부터 방출된 진세노사이드 Rh2의 양은 Rh2-HA-ZnONcs의 경우 ZnONcs 1 ㎎ 당 0.32㎍, 및 Rh2-HA-ZnONcs의 경우 ZnONcs 1 ㎎ 당 0.12 ㎍임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs는 피부에 대하여 다양한 생리활성을 나타내는 진세노사이드 Rh2를 다량으로 적재할 수 있으므로, 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-5. 세포 독성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs, 구체적으로 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs의 화장료 조성물 성분으로서의 특성을 규명하고자, 상기 실험예 5-6에 따른 방법으로 피부세포에 대한 독성을 확인하였다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있듯이, HA-ZnONcs의 경우에는 0.1 ㎍/㎖ 농도에서는 세포 독성을 전혀 나타내지 않으며, 100㎍/㎖ 농도에서는 오히려 세포의 증식이 이루어짐을 확인하였다. 또한, CMC-ZnONcs의 경우에는 0.1 내지 10 ㎍/㎖ 농도에서 세포 독성을 전혀 나타내지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs는 피부 세포에 대하여 독성을 나타내지 않으므로, 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. ZnONcs의 항암 활성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제조한 ZnONcs의 화장료 조성물로서의 특성 이외에, 또 다른 용도를 확인하기 위하여 이의 항암 활성을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 ZnONcs, 즉 HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs, Rh2-CMC-ZnONcs, 커큐민-HA-ZnONcs 또는 커큐민-CMC-ZnONcs의 항암 활성을 MTT 분석을 통해 확인하였다. MCF7 유방암세포 또는 A549 폐암 세포를 90%의 밀도(confluency)에 도달시킨 후, 72 시간 동안 HA-ZnONcs 또는 CMC-ZnONcs; 진세노사이드 Rh2 단독, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs; 또는 커큐민(curcumin) 단독, 커큐민-HA-ZnONcs 또는 커큐민-CMC-ZnONcs을 다양한 농도로 첨가하여 배양하였다. 마지막으로, 570nm에서 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 판독기(Bio-Tek Instruments, Inc., Vinooski, VT, USA)를 사용하여 형성된 포마잔(formazan)의 흡광도를 정량하였다. 한편, 상기 물질들이 처리되지 않은 세포(음성 대조군)에서 형성된 포마잔의 흡광도를 100%의 세포 생존율로 나타내었다.
그 결과, 도 16의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, Rh2-HA-ZnONcs 또는 Rh2-CMC-ZnONcs를 처리하는 경우, 10 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 유방암 또는 폐암 세포의 세포 생존율은 약 10% 이하를 나타냄을 확인하였다.
[규칙 제91조에 의한 정정 28.12.2017]　
또한, 도 16의 C 및 D에서 볼 수 있듯이, HA-ZnONcs, CMC-ZnONcs, 커큐민-HA-ZnONcs 또는 커큐민-CMC-ZnONcs를 처리하는 경우에도, 10 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 유방암 또는 폐암 세포의 세포 생존율은 약 10% 이하를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 ZnONcs는 다양한 암세포에 대하여 유의한 세포 독성을 나타내므로, 암의 예방 또는 치료 용도로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 카복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan); 및 황칠나무 추출물을 포함하는, 산화아연 나노복합체 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎 추출물인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 진세노사이드 Rh2(ginsenoside Rh2) 또는 커큐민(curcumin)을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 산화아연 나노복합체는 산화아연에 히알루론산; 카복시메틸 키토산; 히알루론산 및 진세노사이드 Rh2; 카복시메틸 키토산 및 진세노사이드 Rh2; 히알루론산 및 커큐민; 또는 카복시메틸 키토산 및 커큐민이 결합된 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항의 조성물을 산화아연 전구체 또는 산화아연 나노복합체와 반응시키는 단계를 포함하는, 산화아연 나노복합체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 산화아연 전구체는 환원반응에 의해 산화아연 나노입자를 형성할 수 있는 염(salt) 형태인 것인, 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 산화아연 전구체는 질산아연6수화물(zinc nitrate hexahydrate)인 것인, 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 산화아연 나노복합체는 산화아연에 히알루론산 또는 카복시메틸 키토산이 결합된 것인, 제조방법
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된, 산화아연 나노복합체.
  10. 제9항의 산화아연 나노복합체를 포함하는, 기능성 화장료 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 자외선 차단용인 것인, 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것인, 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화용인 것인, 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 상기　화장료　조성물은 화장수, 영양크림, 에센스, 팩 또는 연고로 구성되는 군으로부터 선택된 1종으로 제형화되는 것인,　조성물.
  15. 제9항의 산화아연 나노복합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 폐암인 것인, 약학 조성물.
  17. 제15항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
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