WO2019004814A1 - Vlps derivadas de virus de planta con dsrna encapsidado y método de sintesis - Google Patents

Vlps derivadas de virus de planta con dsrna encapsidado y método de sintesis Download PDF

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WO2019004814A1
WO2019004814A1 PCT/MX2018/000060 MX2018000060W WO2019004814A1 WO 2019004814 A1 WO2019004814 A1 WO 2019004814A1 MX 2018000060 W MX2018000060 W MX 2018000060W WO 2019004814 A1 WO2019004814 A1 WO 2019004814A1
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dsrna
virus
capsid protein
vlps
assembly
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Application number
PCT/MX2018/000060
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Inventor
Rubén Darío CADENA NAVA
Alfredo NUÑEZ RIVERA
José Norberto ZAMUDIO OCADIZ
Original Assignee
Universidad Nacional Autónoma de México
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Definitions

  • the present invention belongs to the field of bionanotecnofog ⁇ a and refers to bionanopartscuias that are called virus-like particles with dsRNA known as virus-iike partlcles or VLPs or simply VLPs-dsRNA that are formed by an in vitro method of encapsidation of ribonucleic acid of double chain (dsRNA) variable length within viral capsids and their use as vectors for transport and delivery of dsRNA to target cells,
  • dsRNA double chain
  • the dsRNA is a molecule characteristic of many types of viruses, plants and animates. It can be found by conforming the genome, in the case of dsRNA viruses, or synthesized in a transitory period during the repication of its genome.
  • RIMAi RIMA interference
  • the interference RNA is a conserved biological response to the presence of double-stranded RNA, which causes the specific sequence silencing of a given gene.
  • the vehicles that carry out the transfer of dsRNA so that it can be introduced into the cell are known as vectors and can include pyramids, phages, viruses, pseudoviruses, etc.
  • vectors can include pyramids, phages, viruses, pseudoviruses, etc.
  • non-viral vectors are cationic molecules and polymers, as seen in the cases of W09219752 (A1) and WO2010131907 respectively. Both are able to encapsulate the dsRNA through electrostatic interactions in stable complexes, which can protect the dsRNA from degradation and promote cellular uptake, however, the inadequate release of dsRNA in the cytosol often constitutes one of the main obstacles to efficient delivery in these non-viral systems. In Azizgolshani et al., 2013) it is shown that plant VLPs release their position in the cytosol.
  • Lipid vectors can perform the release of dsRNA from the endosome through the fusion mechanism of the membrane, however, they have the drawback of being highly toxic for in vivo applications and usually have low manipulation and functionalization capacity.
  • VLPs virus-iike particles
  • bionanoparticles do not present infectious characteristics because they lack their genetic material and can be produced in large quantities in a short time (Chen et al., 2013). These particles can be used as basic scaffolding for the design and manufacture of nanostructured materials, so they have been used to encapsulate diverse materials in a precise and controlled manner, such as metals, medicines, DNA and proteins; and thus, be used as viral vectors.
  • the development of VLP technology has made it possible to generate vaccines against viral diseases, for example, the Gardasii vaccine against the human papillomavirus (HPV) and Recombivax HB for the hepatitis virus (Roldao et al., 2010 ).
  • the advantages of using these VLPs are low costs and high production yields (Pokorski et al., 2011).
  • VLPs are classified according to the type of virus from which the viral capsid proteins were obtained to form them, that is, VLPs can be created from viruses that infect bacteria, from viruses that infect plants, from viruses that They infect animals or even viruses that infect humans. Its activity, action, reaction and efficiency will be different depending on its origin.
  • VLPs of animal origin as a vehicle for the delivery of genes to mammalian cells has been explored since 2000 and under diverse approaches (Schaffer ei a !, 2008, Lavil et et al., 2001, Soong et al, 2000 ). Lourenco and Roy (2011), for example, synthesized VLPs from the Bluetongue Virus (BTV) with which they transfected insect cells (KC celis).
  • BTV Bluetongue Virus
  • VLPs from the Virus of Hypodermal Infection and Hernatopoietic Necrosis (IHHNV) in E. cois with the capacity to encapsulate fragments of RNA / dsDNA up to 500 base pairs and deliver their position in shrimp hemocities.
  • IHHNV Hernatopoietic Necrosis
  • patent application US20100188769A1 it can be observed use of VLPs from influenza.
  • These vectors derived from viruses that infect mammals have shown to be efficient, but their potentially inflammatory, immunogenic and mutagenic effects make them risky for biological safety, and most of their nucleocapsids are enveloped by a lipid bilayer, which makes them more complex and more unstable.
  • patent application US2Q180194613A1 describes the use of capsids derived from the virus of a bacteriophage and encapsidated RNA.
  • VLPs derived from viruses that infect plants have advantages over VLPs derived from viruses that infect animals, mainly in the difference of the toxicity that they can present, since these can be used in in vivo applications without toxic effects for the cells.
  • the capsid proteins of a plant virus are naturally biocompatible, so they can be used as suitable vehicles by not producing an immune system response in mammals (Kaiser et al., 2007, Singh et al., 2007).
  • Another advantage over viruses that infect animals is that plant viruses are easy to propagate, purify and manage. In addition, they are chemically and structurally more stable (Lavelle et al., 2007, Young et al., 2008, Koudelka et al., 2009).
  • the capsid increases resistance to degradation or inactivation by temperature and variations in pH.
  • viruses that infect plants are more stable than viruses that infect animals in a wide range of different solvents, which is essential to carry out the chemical modification of the surface of the viral capsids for directed shipment.
  • cowpea chlorotic mottle virus As an example of plant viruses, the capsid of cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) has been one of the most studied in recent years as it has demonstrated the ability to self-assemble in vitro, and pack a wide range of cargo non-viral, including: heterologous ssRIMAs (Hiebert et al., 1968; Bancroft et al., 1989; Rao et al., 2006, patent application US20150140663A1) and synthetic anionic polymers (Douglas, et al., 1998; Hu, et al. al., 2008; Brasch and Cornelissen, 2012, Cadena- Nava et al., 2012).
  • heterologous ssRIMAs Hiebert et al., 1968; Bancroft et al., 1989; Rao et al., 2006, patent application US20150140663A1
  • synthetic anionic polymers Douglas, et al., 1998; Hu, et
  • Plant capsids of plant viruses closely related to CCMV have also been functionalized and chemically modified, such as cucumber mosaic virus C V. These capsids have been oriented and absorbed by mammalian cells to direct drugs and imaging (Destito et al., 2007, Gonzases et al., 2009, Yildiz et al, 2011, Steinmetz, 2010, Wu et al., 2012).
  • the CCMV capsid protein is exploited for its unique ability to self-assemble spontaneously around negatively charged molecules of very different length and sequence, in the case of RNA.
  • the CCMV is a spherical virus that can be reconstituted in vitro from its purified components, from the viral RNA genome and the capsid protein (CP). In addition, it can encapsulate, through spontaneous auto-assembly, not only its viral genome, but also RNA molecules.
  • the resulting VLPs are resistant to aggregation and their protein capsid protects their charge of RNA against nuclease-like enzymes (RNases) (Cadena-Nava, et al., 2012, patent application US20150140863A1).
  • RNases nuclease-like enzymes
  • VLPs derived from plant viruses As vectors it is found in the patent application US 2015140663A1 where it has been demonstrated that VLPs derived from plant viruses can be used for the transmission of genes to mammalian cells (Azizgolshani et al., 2013).
  • mRNA messenger RNA
  • the transfer of genes is by means of messenger RNA (mRNA), which is single chain, which results in a different therapeutic action to the gene synthesis, to which the present invention is focused, as in the case of the patent application US20140255439, Sa which uses VLPs derived from the papaya mosaic virus, but encapsidating only single chain RNA (ssRNA).
  • the main difference of the method of the patent application WO2010047839A1 with the method of the present invention is given in that the latter uses the capsid protein of the native virus, that is, the plant virus capsid protein is used without make any modification or mutation, while in the aforementioned patent application, specifically uses recombinant mutant proteins of the cowpea mosaic virus, that is, a modification is made or propose the use of hybrid proteins of viruses where the N part is replaced. -terminal of the protein, in these cases the N-terminal part of! CCMV, by a peptide of the bacteriophage MS2 protein, The method of the present invention saves the step of the modification of the capsid protein, which impacts on the time and cost of production.
  • the method of the present invention also allows the incorporation of chains between 20 and 10,000 base pairs in length. Thanks to this increase in size, it allows its application to be in any kingdom's genes.
  • the advantages of the method of the present invention are: the use of the native virus without modifications; Independent of the form of synthesis of the dsRNA; the length of the nucleotides, and that can be used with any type of plant virus, but it is extensive to any other, such as the BMV or another virus in e! cua! the N-terminal part is positively charged and exposed so that it infects with the double-stranded RIMA that is highly negatively charged.
  • the synthesized particles are biodegradable, and the method of assembling the virus-like particle with dsRNA (VLP-dsRNA) is carried out in vitro from purified components, which avoids the use of cell cultures and provides the synthesis of particles in a controlled, monodisperse, well-defined, robust, free of unwanted contaminant molecules that can be absorbed into specific cells. It is the first time that the eneapsidation of double-stranded RNA is performed using capsid proteins from a virus whose genome is single-stranded RNA. Therefore, it is the first time that interference dsRNA has been encapsidated in capsids derived from pineapple viruses, obtaining the VLPs-dsRNA particles.
  • Figure 1 illustrates the flow chart of the method of the present invention.
  • Figure 2 shows the images of the VLPs with short dsRNA obtained by means of transmission electron microscopy.
  • Image a) corresponds to the 3: 1 ratio of CP-dsR A; image b) to the 6: 1 ratio and image c) to the 8: 1 ratio.
  • the scale bar corresponds to 50 nm.
  • Figure 3 shows the image of electrophoresis in ge! of 1% agarose, the DNA ladder is shown in lane 1; the DNA obtained by PCR of 577 base pairs is shown in lane 2; lane 3: dsRNA-583 base pairs obtained by transcription and replication from the DNA obtained by PCR.
  • Figure 4 presents the analysis of the formation of VLP-dsRNA with an RNA of 563 base pairs (by means of EfvISA in 1% agarose gels.
  • Figure 5 shows the micrographs obtained by TEM of the CP CC1VIV assemblies with dsRNA of 583 base pairs at an 8: 1 mass ratio of CP to dsRNA. Spherical shaped particles and tubes are observed. In the image there are procapsids of the VLPs before acidifying the sample. In b we have the VLPs after acidification and dialysis in assembly buffer at pH 7.2.
  • Figure 8 shows the micrographs obtained by TEM of the assemblies of! Example 3 CP BMV-dsRNA of 22 base pairs (GFP) at an 8: 1 mass ratio of CP to siRNA
  • Figure 7 presents the table of micrographs obtained by TEM for different types of VLPs-dsRNA.
  • VLPs with a spherical size of 15 to 35 nanometers are presented, and in the form of nanofubes with a diameter of 15 to 30 nanometers and with a length of 50 to 1000 nanometers formed from proteins that constitute the capsid of virus that infects to plants virus with double chain encapsidated dsRNA.
  • the present invention proposes a new approach in the use of these nanoparticles based on the proteins that make up the capsid of a plant virus and that contain dsRNA of variable length (short dsRNA or long dsRNA) encapsidated (VLPs-dsRNA), as vectors for the transport and delivery of dsRNA to target cells, with the purpose of silencing a specific gene.
  • VLPs-dsRNA variable length sRNA or long dsRNA encapsidated
  • the present invention exploits the ability of the spontaneous auto-assembly of the capsid proteins of plant virus around dsRNA molecules, in addition to its ability to package dsRNA of any length and protect it from degradation at all. It refers to the use of VLP as dsRNA vectors that, depending on the sequence, can silence specific genes and, therefore, their application in the biomedical, veterinary and agricultural areas, among others.
  • the present invention also refers to an in vito method for the encapsidation of variable length dsRNA within plant virus capsids (VLPs), which takes advantage of the capacity of! Spontaneous self-assembly of the capsid proteins of plant viruses around dsRNA molecules allowing it to package any RNA at all.
  • the method comprises 3 steps, a) purification of the viral capsid protein, b) assembly and c) stabilization.
  • the purification step of the viral capsid protein is carried out by means of a disassembly buffer solution with a high concentration of salts around the pH and a pH greater than 7.
  • the buffer solution causes the capsid of the virus the precipitation of the native RNA is disassembled and promoted, facilitating its removal by ultra centrifugation.
  • the assembly step comprises combining the viral capsid protein of the plant and a dsRNA in a solution containing at least 0.5 M sai and subsequently dialyzing it in a buffer solution of neutral pH, between 7.0 and 7.4, in vitro.
  • the buffer solution promotes the spontaneous self-assembly of the capsid proteins of the plant virus around the dsRNA.
  • the stabilization step comprises incubating the mixture resulting from the assembly step, in an acid pH stabilizing buffer, between 4.8 and 8.
  • the stabilization solution promotes protein-protein interactions.
  • a characterization can be carried out by electrophoretic mobility shift tests (EMSA) and / or transmission electron microscopy (TEM) and / or others, in order to analyze and verify a correct synthesis of the VLPs-ds NA.
  • ESA electrophoretic mobility shift tests
  • TEM transmission electron microscopy
  • dsRNA molecules means any type of virus containing an N ⁇ terminal positively charged, serves to form VLPs with dsRIMA, due to interactions with electroestáficas any negatively charged, in this case the dsRNA molecules.
  • viruses that infect plants are preferred since they are significantly more robust and therefore protect their contents more efficiently than other types of viruses.
  • plant viruses include, but are not limited to, bromoviruses, geminiviruses, CCMV, CPIV1V, CRMV, RCNMV, among others.
  • the viral capsid protein comes from the native virus or its expression in a heterologous system. These viral capsid proteins are used without modifications, mutations or some type of hybridization and can be obtained directly from plants or recombinantly in any other protein expression system.
  • e! Used dsRNA can be synthesized by various methods and the size of! dsRNA is between 20 and 10,000 base pairs.
  • the dsRNA used in this invention can be synthesized by various methods not excluding those known in the prior art, including any other method that is capable of synthesizing or obtaining dsRNA either as a primary, secondary or waste product, even if it is used with or without any prior treatment,
  • a preferred embodiment of the present invention consists in the use of CCMV viral capsid and dsRNA. Another preferred embodiment is the use of the viral capsid of BMV and dsRNA.
  • the disassembly buffer has a pH greater than 7 and is composed of CaCb, Tris-HCl, EDTA, DTT and PMSF.
  • the purification step of the present invention is carried out by dialysis with slow agitation in a time lapse of between 10 to 24 hours and at a temperature between 0 to 20 degrees centigrade.
  • the assembly buffer has a pH greater than 7 and is composed of NaCl, KCl, MgC, DTT and Tris-HCl.
  • the assembly stage is carried out by dialysis, in a period of between 2 to 24 hours and at a temperature between 0 to 20 degrees centigrade.
  • the mass proportions of the combination of the viral capsid protein and the dsRNA are controlled, this ratio being 3: 1, 6: 1 and 8: 1, preferably in a 6 ratio: 1 and 8: 1, and more preferably in an 8: 1 ratio for efficient obtaining of VLPs-dsRNA.
  • the stabilizing buffer has a pH of between 4.5 and 8, and is composed of 50 mM sodium acetate and 8 m magnesium acetate.
  • the purification step of the present invention is carried out by dialysis for a period of time between 2 to 24 hours and at a temperature between 0 to 20 degrees centigrade.
  • Characterization can be carried out by means of electrophoresis in native 1% agarose gels, sucrose or cesium gradients, light scattering, and transmission electron microscopy.
  • This example illustrates the in vitro packaging of a short dsRNA (22 base pairs or siRNA) by the capsid protein of cowpea chlorotic mottle virus (CCMV).
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • T7 RNA polymerase bacteriophage T7 polymerase enzyme
  • This enzyme is dependent on the promoter sequence (GGATCCTAATACGACTCACTATAG) to make the transcription of the gene of interest. It has a very low nucleotide incorporation error rate and requires double-stranded DNA as a template and which contains the promoter sequence 17 at the beginning of the gene or sequence to be transcribed.
  • T7 RiboMAX kit from Promega was used. In vitro transcription was performed in 20 pl volumes in previously sterilized microcentrifuge tubes.
  • Each reaction contained the ribonudeotides uracil, adenine, guanine and cytosine at a concentration of 25 rnfvl, 6 iL of DNA (hybridized oligonucleotides), 4 pL of RiboMAX TM T7 buffer 5x, 2 pL of enzyme mixture 17 and 2 ⁇ of free water of nucleases.
  • the microcentrifuge tubes are placed in a thermoblock at 37 ° C for four hours. After the reaction was finished, DNase A was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes, in order to eliminate the DNA.
  • RNAs were obtained by means of the hybridization of the transcribed RNAs.
  • the obtained transcripts (ssRNA) were mixed and heated at 93 ° C for 5 minutes, and then the thermal equilibrium was reached at room temperature.
  • the double-stranded RNAs obtained were subsequently analyzed by means of native polyacrylamide gels.
  • the capsid protein is obtained from the disassembly of the viruses, at a high concentration of salts and a pH higher than 7.
  • the disassembly buffer 0.5 M CaCl 2l 0.05 M Tris-HC ⁇ Ph 7.5, 1 mlVt EDTA, 1 mM DTT, 0.5 m PMSF ⁇ causes the capsid decoupled, leaving! RNA suspended, and calcium ions cause their precipitation for subsequent removal by ultracentrifugation.
  • the purified virus solution was placed in a cellulose dialysis membrane previously sterilized, with a pore size of 8000 to 12000 Da, in a disassembly buffer in a period of 24 h at 4 ° C, with slow agitation. Once this time had elapsed, the solution was removed from the dialysis membrane and placed inside an ultracentrifuge ultra-ciara tube. The final volume was centrifuged at 50000 rpm for a period of 480 min at 4 ° C in a 90 Ti rotor in a Beckman XPN100 ultracentrifuge. immediately after the ultracentrifugation the solution was extracted in fractions of 300 ⁇ , from top to bottom, taking care not to disturb the solution and kept at 4 ° C.
  • the synthesis of the VLPs with the NA was done by e! self-assembly of the CCMV capsid proteins around the siRNA molecules.
  • the mass ratios of CP: dsRNA used were 3: 1, 6: 1 and 8: 1.
  • the different proportions were dialysed for 24 hours in assembly buffer (50 mM NaCl, 10 M KCl, 5 mM gCI2, 1 m DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 7.2) at a temperature of 4 ° C. Subsequently the assemblies were recovered, e!
  • the procapsids and CP-dsRNA complexes were acidified in an acid pH stabilizing buffer (50 mM sodium acetate, 8 mM magnesium acetate, pH 4.5).
  • TEM transmission electron microscopy
  • CCMV cyperotic cowpea virus
  • the protein of The capsid of the CCMV phytopathogenic virus is of special interest because it has been shown that it is capable of packaging heteorologist material spontaneously, with high efficiency, as well as double-stranded RNA molecules.
  • the CCMV capsid protects the packaged dsRNA against nuclease degradation, serves as a robust external scaffold with the ability to direct its charge to specific cells and is capable of more efficiently encapsidating a broad range of RNA sequences.
  • the dsRNA used can be synthesized by various methods. Next, the one developed for this example is mentioned for illustrative purposes,
  • a dsRNA of 560 base pairs which is a fragment of a virus from a virus that infects crustaceans, was selected for the specific oligonucleotides: sense (T7VP-F) 5 ! -TAATAC GACTCACTATAGGGCGGCCATCCTCGCCATCACTG-S 'and antisense (Phi6VP ⁇ R) 5'- GGAAAAAAAATTTCCACCGGCGGTAGCTGC-3', by the FAST PCR program.
  • the sense oligonucleotide was modified 5 'with the transcription promoter T7 and Phi6 for the antisense.
  • the corresponding oligonucleotides were synthesized by the company IDT.
  • the program used for the PCR consisted of 35 cells, with a denaturation temperature of 98 ° C, 55-78 ° C of alignment and extension of 72 ° C.
  • the PCR was carried out in a BIO-RAD thermocycler, yCycier TM model.
  • the PCR product was analyzed by electrophoresis to determine its size.
  • the dsRNA was synthesized by the "Replicator RNAi Kit” system of Thermo Scientific that combines the in vitro transcription and the replication of a template DNA.
  • DNA The template used for the synthesis of dsRNA is produced by PCR using a high-fidelity DNA polymerase (Phusion DNA Polymerase).
  • the oligonucleotides for the PCR are designed so that the product resulting from the PCR contained the T7 promoter sequence at one end and the one at the end. Phi8 RNA promoter replicates in the other.
  • the PCR product was purified and transcribed into single-stranded RNA by T7 RNA polymerase. This single-stranded RNA was replicated in the double-stranded RNA with the Phi6 RNA repuccase in the same incubation stage, see Figure 3.
  • RNAi In vitro transcription of both strands of RNAi was performed simultaneously for 4 h at 37 ° C (time recommended by the manufacturer). The DNA was removed with DNase I and the reaction was filtered with a centricon of 100 kDaltons to remove enzymes and nucleotides. Finally, the products were evaluated by means of electrophoresis in 1% agarose gels, and by UV-vis spectrophotometry, to verify the integrity and concentrations of the dsRNA.
  • Step a) of purification of the capsid protein
  • the protein of the capsid is obtained from! disassembly of the virus, at a high concentration of salts and a pH greater than 7.
  • the disassembly buffer (0.5 M CaCl 2 , 0.05 M Tris-HCl Ph 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM P SF) two effects: the swelling of the viruses until the capsid protein decouples, leaving the RNA suspended, ye!
  • the second effect is due to the presence of calcium ions, which, when bound to the RNA, cause its precipitation, and this facilitates its subsequent removal by ultracentrifugation.
  • the purified virus solution was placed in a cellulose dialysis membrane previously sterilized, with a pore size of 8000 to 12000 Da, in a disassembly buffer in a period of 24 h at 4 ° C, with slow agitation. Once this time had elapsed, the solution of the dialysis membrane was removed and placed inside an ultracentrifuge ultracentrifuge tube. The final volume of the solution in the tube was 1.2 ml. It was centrifuged at 50000 rpm for a period of 480 min at 4 ° C in a 90 Ti rotor in a Beckman XP! M10Q ultracentrifuge. Immediately after ultracentrifugation, the solution was extracted in 300 ⁇ fractions, from top to bottom, taking care of Do not disturb " solution " and kept at 40 ° C.
  • the purity and concentration of each fraction was then measured in a UV-Vis spectrophotometer (model Nanodrop brand Thermo Scientific), keeping it at 4 ° C, and discarding those fractions that did not have the minimum purity of 99.5%, that is, the The ratio obtained for the absorbances at the characteristic points of the protein and the nucleic acids (A860 / A260) should be equal to or greater than 1.5. Fractions with a purity equal to or greater than 1.5 and with A280 greater than 0.08 were mixed to subsequently dialyze 12 hrs in protein buffer (1 M NaCl, 0.02 M Tris-HCl pH 7.2, 1 m EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF).
  • VLPs with e! Long dsRNA was performed by autoensing the capsid proteins of the CCVM around the dsRIMA molecules. For this case, it was considered to use an 8: 1 ratio of CP to dsRNA in order to ensure the encapsidation of the total dsRNA produced according to the results obtained with the siRNA,
  • the mixture was dialyzed for 24 hours in assembly buffer (50 mM NaCl, 10 mM KCL 5 mM MgCb, 1 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 7.2) at a temperature of 4 ° C. Subsequently the assemblies were recovered, the volume obtained was measured and stored at 4 ° C, or at -20 ° C to be stored for periods longer than 1 week.
  • assembly buffer 50 mM NaCl, 10 mM KCL 5 mM MgCb, 1 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 7.2
  • an intermediate stage of characterization was carried out for the verification and evaluation of the assembly stage.
  • This intermediate step is optional within the methodology of the present invention. It was carried out by means of the electrophoretic mobility test (EMSA) on an agarose gel a! 1% using the assembly buffer adjusted to a pH of 6 as run buffer.
  • the image of Figure 4 shows the formation of the VLPs by EMSA. In lane 1 you have the DNA ladder; in 2 the CCMV virus, which is used as a standard; in lane 3 the VLPs can be observed and in the 4 the free dsRNA. Ethidium bromide was used to visualize the gel.
  • the procapsids and CP-dsRNA complexes were acidified in an acid pH stabilizing buffer (50 mM sodium acetate, 8 mM magnesium acetate, pH 4.5) , to promote protein-protein interactions (Bancroft, 1970).
  • an acid pH stabilizing buffer 50 mM sodium acetate, 8 mM magnesium acetate, pH 4.5
  • the synthesized VLPs are finally shown, as expected they have two types of morphology: spherical and tubular. According to the measurements, the spherical capsids have a diameter of 25.83 nm and correspond to a capsid similar to that of the native CCMV virus.
  • the VLP ' s in the form of nanotubes have a diameter of 21.7 nm. It is very likely that the dsRNAs are arranged longitudinally in bundles inside the nanotubes; The length of these was not determined because they are very long and some curved which made the measurement difficult.
  • TEM transmission electron microscopy
  • the VLPs obtained correspond to two types of morphologies: icosahedral and nanotubes tai as seen in the image of Figure 5b.
  • the average diameter of the procapsids was 21 nm; the diameter of the icosahedral VLPs was 26 nm, and the diameter of the nanotubes corresponded to 21 nm.
  • This example illustrates the in vitro packaging of a short dsRNA (22 base pairs) by the prophecy of the bromine mosaic virus capsid (BMV).
  • BMV bromine mosaic virus capsid
  • T7 RIMA polymerase The in vitro synthesis of RIMA was carried out using a system that uses the bacteriophage 17 polymerase enzyme (T7 RIMA polymerase). This enzyme is dependent on the promoter sequence (GGATCCTAATACGACTCACTATAG) to make the transcription of the gene of interest. It has a very low nucleotide incorporation error rate and requires double-stranded DNA as a template and which contains the T7 promoter sequence at the beginning of the gene or sequence to be transcribed. To perform the in vitro transcription of ssRNA, the T7 RiboMAX kit from Promega was used. In vitro transcription was performed in 20 ⁇ volumes in enzyme-free microcentrifuge tubes.
  • Each reaction contained the ribonucleotides uracil, adenine, guanine and cytosine at a concentration 25 mM, 8 ⁇ of DNA (hybridized oligonucleotides), 4 ⁇ of RiboMAX TM T7 buffer 5x, 2 ⁇ of the enzyme T7 mixture and 2 pL of free water of nucleases.
  • the microcentrifuge tubes are placed in a thermoblock at 37 ° C for four hours. After the reaction was finished, DNase A was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes, in order to eliminate the DNA.
  • RNAs were obtained by hybridization of the transcribed RNAs.
  • the obtained transcripts (ssRNA) were mixed and heated at 93 ° C for 5 minutes, and then the thermal equilibrium was reached at room temperature.
  • the double-strand RNAs obtained were subsequently analyzed by means of native polyacrylamide gels. Step a) of purification of the capsid protein.
  • the capsid protein is obtained from the disassembly of the virus, at a high concentration of salts and a pH greater than 7.
  • the disassembly buffer 0.5 M CaC, 0.05 M Trss-HCI Ph 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF
  • the purified virus solution was placed in a cellulose dialysis membrane previously sterilized, with a pore size of 8000 to 12000 Da, in a disassembly buffer in a period of 24 h at 4 ° C, with slow agitation. After this time, the solution was removed from the dialysis membrane and placed inside an ultra-clear ultracentrifuge tube. The final volume was centrifuged at 290420 xg for a period of 126 min at 4 ° C in a 90 Ti rotor in a Beckman XP 100 ultracentrifuge. Immediately after the ultracentrifugation the solution was extracted in 300 ⁇ fractions, from top to bottom, taking care of not disturbing the solution and kept at 4 ° C.
  • the concentration and purity of the protein is measured and stored at 4 ° C.
  • the concentration of BMV capsid proteins in mg / m! was obtained by means of the relation: (1197.7 A280 - 24.032) / 1000, Stage b) Assembly.
  • VLPs with e! dsRNA were performed by self-assembly of the BMV capsid proteins around the dsRNA molecules.
  • the best conditions for the synthesis of VLPs were also determined, making assemblies at three different proportions of the capsid protein (CP) of the BMV with the dsRNA.
  • the different proportions were dialyzed for 24 hours in buffer of assembly (50 mM NaCl, 10 mM KCI, 5 m MgCl 2, 1 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 7.2) at a temperature of 4 ° C.
  • the assemblies were recovered, the volume obtained was measured and stored at 4 ° C. Again it was verified that Sa ratio 8: 1 provided an increase in the formation of VLPs.
  • the procapsids and CP-dsRNA complexes were acidified and acidified in an acid pH stabilizing buffer solution (50 m sodium acetate, 8 mM magnesium acetate, pH 4.5).
  • FIG. 6 shows the micrographs obtained.
  • the VLPs obtained correspond to icosahedral morphologies.
  • the average diameter of the VLPs-dsRNA was 28 nm.

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Abstract

Se describen partículas tipo virus con dsRNA encapsidado que presentan una estructura con morfologías esféricas y nanotubulares, y que se componen de una cápside formada por proteínas estructurales de un virus que infecta plantas y un dsRNA de doble cadena de entre 20 y 10´000 pares de bases de longitud. Se describe su uso como vector para el transporte de dsRNA a células blanco con la finalidad de bloquear la expresión de genes. Se describe además el método in vitro de encapsidación del dsRNA de longitud variable dentro de cápsides de virus de plantas (VLPs) compuesto por tres etapas: de purificación, ensamblaje y estabilización.

Description

VLPs DERIVADAS DE VIRUS DE PLANTA CON dsRNA ENCAPSIDADO Y
MÉTODO DE SINTESIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de ¡a bionanotecnofogía y se refiere a bionanopartscuias que se denominan partículas tipo virus con dsRNA conocidas como virus-iike partlcles ó VLPs o simplemente VLPs-dsRNA que se forman por un método in vitro de encapsidación de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA) de longitud variable dentro de cápsides virales y su uso como vectores para el transporte y entrega del dsRNA a células blanco,
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El dsRNA es una molécula característica de muchos tipos de virus, plantas y animaies. Puede encontrarse conformando el genoma, en el caso de los virus de dsRNA, o bien sintetizarse en un periodo transitorio durante la repíicación de su genoma. A finales de la década de los noventa Fire y colaboradores (1998) descubrieron que cuando el dsRNA es introducido a un organismo, desencadena un proceso de supresión génica secuencia-específico ai que nombraron RIMA de interferencia (RIMAi). Más tarde se reconoció que este proceso de silenciamiento de genes es un proceso altamente conservado en un sinnúmero de especies (Meister et al, 2004; Ryther et al, 2005).
Por lo tanto, el RNA de interferencia es una conservada respuesta biológica a la presencia de RNA de doble cadena, lo cual origina el silenciamiento específico de secuencia de un gen determinado.
Es por ello que se ha trabajado en la transferencia de RNAi a células somáticas con un fin terapéutico, sin embargo, el gran reto para el desarrollo de una terapia basada en dsRNA es ¡a necesidad de un sistema de entrega a! interior de ¡as células que sea seguro y eficiente (Whitehead et al., 2009).
Los vehículos que llevan a cabo la transferencia de dsRNA para que pueda ser introducido dentro de ¡a célula, son conocidos como vectores y pueden incluir piásmidos, fagos, virus, pseudovirus, etc. Podemos distinguir dos categorías principales en vectores usados en terapia génica: virales y no virales.
Entre los vectores no virales más comunes se encuentran los I ¡pidos catiónicos y polímeros, como se ve en los casos de W09219752 (A1 ) y WO2010131907 respectivamente. Ambos son capaces de encapsular el dsRNA a través de interacciones electrostáticas en complejos estables, que pueden proteger el dsRNA de la degradación y promover la absorción celular, sin embargo, la inadecuada liberación de dsRNA en el citosol a menudo constituye uno de los principales obstáculos para la entrega eficiente en estos sistemas no virales. En Azizgolshani et al., 2013) se demuestra que los VLP de plantas liberan su cargo en el citosol.
Los vectores lipidíeos pueden realizar la liberación del dsRNA del endosoma a través del mecanismo de fusión de la membrana, no obstante, tienen el inconveniente de ser altamente tóxicos para las aplicaciones in vivo y suelen tener baja capacidad de manipulación y funcionalización.
Los vectores poliméricos, comúnmente utilizan el efecto de esponja de protones para la liberación del endosoma pero su problemática reside en la baja capacidad de manipulación y funcionalización al tener una composición estructural indefinida. En el caso de los vectores virales, estos están siendo desarrollados principalmente gracias a ia bionanotecnología, la cual se enfoca en la investigación y en el desarrollo de nuevos materiales a escala nanométrica para fines específicos, basados en bíomoiéculas, tales como ácidos nucleicos, proteínas y carbohidratos. Dentro de estos materiales naturales se encuentran las cápsides virales conocidas como virus-iike particles ó VLPs, que recientemente han recibido gran atención debido al alto potencial que presentan dentro de este campo, en particular en el área de la ciencia de materiales y ia nanomedicina. En general, las proteínas de las cápsides virales pueden ser utilizadas para formar VLPs. Lo atractivo de estas bionanopartículas es que no presentan características infecciosas al carecer de su material genético y pueden ser producidas en grandes cantidades en poco tiempo (Chen et al., 2013). Estas partículas pueden ser utilizadas como andamiajes básicos para el diseño y fabricación de materiales nanoestructurados, por lo que se han utilizado para encapsular diversos materiales de manera precisa y controlada, como metales, medicamentos, DNA y proteínas; y así, ser utilizados como vectores virales. El desarrollo de la tecnología de las VLPs ha hecho posible la generación de vacunas contra enfermedades virales, por ejemplo, la vacuna Gardasii contra el virus del papiloma humano (VPH) y Recombivax HB para el virus de la hepatitis (Roldao et al., 2010). Las ventajas del uso de estos VLPs son los bajos costos y los altos rendimientos de producción (Pokorski et al., 2011).
Estas VLPs se clasifican de acuerdo al tipo de virus del cual se obtuvieron las proteínas de las cápsides virales para formarlas, es decir, las VLPs pueden ser creadas a partir de virus que infectan a bacterias, de virus que infectan a plantas, de virus que infectan a animales o incluso, de virus que infectan a humanos. Su actividad, acción, reacción y eficiencia serán diferentes dependiendo de su origen. El uso de VLPs de origen animal como vehículo para la entrega de genes a células de mamífero se ha explorado desde el 2000 y bajo enfoques diversos (Schaffer ei a!, 2008; Lavil!ette et al., 2001 ;Soong et al, 2000). Lourenco y Roy (2011 ), por ejemplo, sintetizaron VLPs ¡n vito a partir del Virus de ía Lengua Azul (BTV) con las que transfectaron células de insecto (KC celis). Hou y colaboradores (2009), por su parte, produjeron VLPs del Virus de la Infección Hipodermal y Necrosis Hernatopoyética (IHHNV) en E. cois con la capacidad de encapsular fragmentos de RNA/dsDNA de hasta 500 pares de bases y entregar su cargo en hemociíos de camarón. En la solicitud de patente US20100188769A1 puede observarse e! uso de VLPs provenientes de influenza. Estos vectores derivados de virus que infectan a mamíferos han mostrado ser eficientes, pero sus efectos potencialmente inflamatorios, inmunogénicos y mutagénicos los hacen riesgosos para la seguridad biológica, además la mayoría de sus nucleocápsides están envueltas por una bicapa de lípidos, lo que los vuelve más complejos y más inestables. Por su parte, la solicitud de patente US2Q180194613A1 describe el uso de cápsides derivadas del virus de un bacteriófago y que encapsida RNA.
Las VLPs derivadas de virus que infectan plantas tienen ventajas sobre ¡as VLPs derivadas de virus que infectan animales, principalmente en la diferencia de la toxicidad que pueden presentar, ya que estas pueden ser usadas en aplicaciones in vivo sin efectos tóxicos para las células. Las proteínas de la cápsíde de un virus de planta son naturalmente biocompatíbles, por lo cuai, pueden ser usadas como vehículos adecuados al no producir respuesta del sistema inmune en mamíferos (Kaiser et al., 2007, Singh et al., 2007). Otra ventaja sobre los virus que infectan animales, es que los virus de plantas son fáciles de propagar, purificar y manejar. Además, son química y estructuralmente más estables (Lavelle et al., 2007, Young et al., 2008, Koudelka et al., 2009). La cápside incrementa la resistencia a degradación o inactivación por temperatura y variaciones en el pH. Además, los virus que infecían plantas son más estables que los virus que infectan animales en un rango amplio de diferentes solventes, lo cual es esencial para llevar a cabo la modificación química de la superficie de las cápsides virales para el envío dirigido.
Como ejemplo de virus de planta, la cápside del virus del moteado clorótico del caupí (CCMV) ha sido una de las más estudiadas en Sos últimos años ya que ha demostrado tener capacidad de auto-ensamblarse in vitro, y empaquetar una amplia gama de carga no viral, incluyendo: ssRIMAs heterólogos (Hiebert et al., 1968; Bancroft et al., 1989; Rao et al., 2006, solicitud de patente US20150140663A1 ) y polímeros aniónicos sintéticos (Douglas, et al., 1998; Hu, et al., 2008; Brasch y Cornelissen, 2012, Cadena- Nava et al., 2012). También se han funcionalizado y modificado químicamente cápsides de virus de plantas estrechamente relacionadas con el CCMV, tal como el virus mosaico del pepino C V. Estas cápsides han sido orientadas y absorbidas por células de mamífero para dirigir fármacos e imagenología (Destito et al., 2007; Gonzases et al., 2009; Yildiz et al, 2011 ; Steinmetz, 2010; Wu et al., 2012).
La proteína de la cápside del CCMV es explotada por su capacidad única de auto- ensamble espontáneamente alrededor de moléculas cargadas negativamente de muy diversa longitud y secuencia, en el caso de RNA. El CCMV es un virus esférico que puede ser reconstituido in vitro a partir de sus componentes purificados, a partir del genoma de RNA viral y la proteína de la cápside (CP). Además, puede encapsidar, a través del auto- ensamble espontáneo, no sólo su genoma viral, sino también oirás moléculas de RNA. Las VLPs resultantes son resistentes a ¡a agregación y su cápside de proteínas protegen su cargo de RNA contra enzimas tipo nucleasas (RNasas) (Cadena-Nava, et al., 2012, solicitud de patente US20150140863A1 ).
Por otro lado, es importante resaltar la finalidad terapéutica que tiene la transferencia de genes. Por ejemplo, el uso de las VLP derivadas de virus de plantas corno vectores se encuentra en ¡a solicitud de patente US 2015140663A1 dónde se ha demostrado que las VLPs derivadas de virus de plantas pueden ser utilizadas para el envío de genes a células de mamíferos (Azizgolshani eí al., 2013). Sin embargo, la transferencia de genes es por medio de RNA mensajero (mRNA) , el cual es de cadena sencilla, lo que resulta en una distinta acción terapéutica al sISenciamiento de genes, a la cual va enfocada la presente invención, ai igual que en ei caso de ¡a solicitud de patente US20140255439, Sa cual utiliza VLPs derivadas del virus de mosaico de papaya, pero encapsídando únicamente RNA de cadena sencilla (ssRNA). Específicamente, para la encapsidación y traslado de dsRNA con el uso de VLPs derivadas de virus de plantas, se puede hacer mención a la solicitud de patente, WO2010047839 A1. Sin embargo, la presente invención mejora el método de encapsidación de la solicitud de patente mencionada, lo que a su vez provoca mejorías en las partículas resultantes VLP-dsRNA,
Las principal diferencia del método de la solicitud de patente WO2010047839A1 con el método de la presente invención, se da en que este último utiliza la proteína de la cápside del virus nativo, es decir, la proteína de la cápside de virus de planta se utiliza sin hacer ninguna modificación o mutación, mientras que en la solicitud de patentes mencionada, utiliza específicamente proteínas recombinantes muíantes del virus del mosaico del caupí, es decir, se realiza una modificación o proponen el uso de proteínas híbridas de virus en donde se sustituye la parte N-terminal de ¡a proteína, en estos casos la parte N-terminal de! CCMV, por un péptido de la proteína del bacteriófago MS2, El método de la presente invención ahorra el paso de la modificación de la proteína de cápside, lo que impacta en el tiempo y costo de producción. Otra diferencia respecto a ía solicitud de patente WO2010047839A1 es que esa invención se enfoca ai uso de CCMV, mientras que Sa presente invención permite el uso de diferentes tipos de virus derivados de plantas, tales como el CCMV, e! Virus del mosaico del bromo (BMV), CPMV, CRMV, RCN V, entre otros,
Otra diferencia respecto a la solicitud de patente WO201 QQ47839A1 es que el método de síntesis de! dsRNA influye en la metodología propuesta, mientras que en la presente invención, la forma de síntesis de! dsRNA del gen específico es totalmente independiente, por lo que no se ¡imita a! uso de dsRNA obtenido mediante un método de síntesis específico.
El método de ¡a presente invención permite además la incorporación de cadenas entre 20 y 10,000 pares de bases de longitud. Gracias a este incremento de tamaño, permite que su aplicación sea en genes de cualquier reino.
Por lo tanto, las ventajas del método de la presente invención son: el uso del virus nativo sin modificaciones; ¡a independencia de la forma de síntesis del dsRNA; la longitud de los nucleótidos, y que puede ser utilizado con cualquier tipo de virus de planta, sino que es extensivo a cualquier otro, tal como el BMV u otro virus en e! cua! la parte N-terminal este cargada positivamente y expuesta para que inferactue con el RIMA de doble cadena que está altamente cargada negativamente. Las partículas sintetizadas son biodegradable, y eí método de ensamblaje de la partícula tipo virus con dsRNA (VLP- dsRNA) se realiza in vitro a partir de componentes purificados, lo cual evita el uso de cultivos de células y proporciona la síntesis de partículas de manera controlada, monodispersas, bien definidas, robustas, libres de moléculas contaminantes no deseadas y que pueden ser absorbidas a células específicas. Es ¡a primera vez que se realiza la eneapsidación de RNA de cadena doble utilizando proteínas de la cápside de un virus cuyo genoma es RNA de cadena sencilla. Por lo cual es la primera vez que se encapsida dsRNA de interferencia en cápsides derivadas de virus de plañías obteniendo las partículas VLPs-dsRNA.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, así como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de una modalidad particularmente preferida de la presente invención, cuando se lea en relación con los dibujos que se acompañan, en los cuales:
La figura 1 ilustra el diagrama de flujo del método de la presente invención.
La figura 2 muestra las imágenes de las VLPs con dsRNA corto obtenidas por con medio de microscopía electrónica de transmisión. La imagen a) corresponde a la proporción 3:1 de CP-dsR A; la imagen b) a la proporción 6:1 y la imagen c) a la proporción 8:1. La barra de escala corresponde a 50 nm.
La figura 3 muestra la imagen de la electroforesis en ge! de agarosa al 1 %, la escalera de ADN se muestra en el carril 1 ; el ADN obtenido mediante PCR de 577 pares de bases se muestra en el carril 2; carril 3: dsRNA-de 583 pares de bases obtenido mediante transcripción y replicación a partir del ADN obtenido medíante PCR.
La figura 4 presenta el análisis de la formación de las VLP-dsRNA con un RNA de 563 pares de bases (por medio de EfvISA en geles de agarosa al 1 %. Carril 1 : escalera de DNA; carril 2: virus nativo CCMV; carril 3: VLPs-dsRNA (RNA de 583 pares de bases), carril 4: dsRNA de 583 pares de bases libre.
La figura 5 muestra las micrografías obtenidas mediante TEM de los ensambles de CP CC1VIV con dsRNA de 583 pares de bases a una razón en masa 8:1 de CP a dsRNA. Se observan partículas con forma esférica y tubos. En la imagen a se tienen ¡as procápsides de las VLPs antes de acidificar la muestra. En b se tienen las VLPs posterior a la acidificación y diálisis en buffer de ensamble a pH 7.2. La figura 8 muestra las micrografías obtenidas mediante TEM de los ensambles de! ejemplo 3 CP BMV-dsRNA de 22 pares de bases (GFP) a una razón en masa 8:1 de CP a siRNA
La figura 7 presenta la tabla de micrografías obtenidas mediante TEM para diferentes tipos de VLPs-dsRNA.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
En esta invención se presentan VLPs con un tamaño esférico de 15 a 35 nanómetros, y en forma de nanofubos con un diámetro de 15 a 30 nanómetros y con longitud de 50 a 1000 nanómetros formadas a partir de proteínas que constituyen la cápside de virus que infecta a plantas virus con dsRNA encapsidado de doble cadena. Particularmente, la presente invención propone un nuevo enfoque en la utilización de estas nanopartículas a base de las proteínas que conforman la cápside de un virus de planta y que contiene dsRNA de longitud variable (dsRNA corto o dsRNA largo) encapsidado (VLPs-dsRNA), como vectores para el transporte y entrega de dsRNA a células blanco, con ia finalidad de silenciar un gen específico. La presente invención aprovecha la capacidad del auto-ensamble espontáneo de las proteínas de ia cápside de virus de planta alrededor de moléculas de dsRNA, además de su capacidad para empaquetar dsRNA de cualquier longitud y protegerlo de la degradación en absoluto. Se refiere al uso de la VLP como vectores de dsRNA que dependiendo de la secuencia puede silenciar genes específicos y, por lo tanto, su aplicación en el área biomédica, veterinaria y agrícola, entre otras.
La presente invención, también se refiere a un método in vito para la encapsidación de dsRNA de longitud variable dentro de cápsides de virus de plantas (VLPs), el cual aprovecha la capacidad de! auto-ensamble espontáneo de las proteínas de la cápside de virus de planta alrededor de moléculas de dsRNA lo que le permite empaquetar cualquier RNA en absoluto. El método comprende 3 etapas, a) purificación de la proteína de la cápside viral, b) ensamblaje y c) estabilización.
En la presente invención, la etapa de purificación de la proteína de la cápside viral se realiza por medio de una solución amortiguadora de desensamble con una concentración elevada de sales alrededor del y un pH mayor a 7. La solución amortiguadora provoca que la cápside del virus se desensamble y se promueva la precipitación del RNA nativo, facilitando su remoción mediante ultra centrifugación. En la presente invención, la etapa de ensamblaje comprende combinar la proteína de la cápside viral de planta y un dsRNA en una solución que contenga al menos 0,5 M de sai y posteriormente se dializa en una solución amortiguadora de ensamblaje de pH neutro, entre 7,0 y 7.4, de manera in vitro. La solución amortiguadora promueve el autoensamble espontaneo de las proteínas de la cápside del virus de planta alrededor del dsRNA. Las cantidades relativas de la combinación de la proteína de la cápside viral y el dsRNA son controladas, con la intención de que el ensamblaje eficiente puede ser controlado. En ia presente invención, la etapa de estabilización comprende incubar la mezcla resultante de la etapa de ensamblaje, en una solución amortiguadora de estabilización de pH ácido, entre 4.8 y 8. La solución de estabilización fomenta las interacciones proteína- proteína.
Ai final del método de tres etapas, se puede llevar a cabo una caracterización mediante ensayos de cambio de la movilidad electroforótica (EMSA) y/o microscopía electrónica de transmisión (TEM) y/o otros, con ¡a finalidad de analizar y verificar ¡a correcta síntesis de las VLPs-ds NA.
En la presente invención» cualquier tipo de virus que contenga una parte N~terminal con carga positiva, sirve para formar las VLPs con dsRIMA, debido a las interacciones electroestáficas con cualquier tipo de moléculas cargadas negativamente, en este caso el dsRNA.
En la presente invención, se prefiere el uso de virus que infectan plantas ya que son significativamente más robustos y por tanto protegen su contenido de manera más eficiente que otros tipos de virus. Ejemplos de estos virus de planta incluyen, pero no se limitan, a bromovirus, geminivirus, CCMV, CPIV1V, CRMV, RCNMV, entre otros.
En la presente invención, la proteína de la cápside viral proviene del virus nativo o de su expresión en un sistema heterólogo. Estas proteínas de la cápside viral se utilizan sin realizarle modificaciones, mutaciones o algún tipo de hibridación y puede ser obtenida directamente de las plantas o de forma recombinante en cualquier otro sistema de expresión en proteínas. En !a presente invención e! dsRNA utilizado puede ser sintetizado por diversos métodos y el tamaño de! dsRNA está entre 20 y 10,000 pares de bases. El dsRNA utilizado en esta invención puede ser sintetizado por diversos métodos no excluyentes a los conocidos en el arte previo, incluyendo cualquier otro método que sea capaz de sintetizar u obtener dsRNA ya sea como producto primario, secundario o desecho, aun si este es utilizado con o sin ningún tratamiento previo,
Una modalidad preferida de la presente invención consiste en la utilización de cápside viral de CCMV y dsRNA. Otra modalidad preferida es la utilización de la cápside viral de BMV y dsRNA.
En ¡a etapa de purificación de la presente invención, la solución amortiguadora de desensamble tiene un pH mayor a 7 y está compuesta por CaCb, Tris-HCI , EDTA, DTT y PMSF. La etapa de purificación de la presente invención se lleva a cabo mediante diálisis con una agitación lenta en un lapso de tiempo de entre 10 a 24 horas y en una temperatura entre 0 a 20 grados centígrados.
En la etapa de ensamblaje de la presente invención, la solución amortiguadora de ensamblaje tiene un pH mayor a 7 y está compuesta por NaCI, KCI, MgC , DTT y Tris- HCI. La etapa de ensamblaje se ¡leva a cabo mediante diálisis, en un lapso de entre 2 a 24 horas y a una temperatura entre 0 a 20 grados centígrados.
En la etapa de ensamblaje de la presente invención se controlan las proporciones de masa de la combinación de la proteína de la cápside viral y el dsRNA, siendo esta proporción 3:1 , 6:1 y 8:1, preferentemente en una proporción 6:1 y 8:1, y más preferentemente en una proporción 8:1 para la obtención eficiente de VLPs-dsRNA. En ¡a etapa de estabilización de la presente invención, la solución amortiguadora de estabilización tiene un pH de entre 4.5 y 8, y está compuesta por acetato de sodio 50 mM y acetato de magnesio 8 m . La etapa de purificación de la presente invención se lleva a cabo mediante diálisis un lapso de tiempo de entre 2 a 24 horas y en una temperatura entre 0 a 20 grados centígrados.
La caracterización se puede realizar por medio de electroforesis en geles nativos de agarosa al 1 %, gradientes de sacarosa o cesio, dispersión de luz, y microscopía electrónica de transmisión.
El método de encapsidación de dsRNA en cápsídes virales de plantas, será más claramente ilustrado por medio de los ejemplos que a continuación se describe, el cual se presenta con propósitos meramente ilustrativos, por lo que no limita la presente invención. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de las propiedades, capacidades y alcances de la invención, pero no son limitantes de su verdadero alcance. Se describen los siguientes datos y resultados experimentales, esto con la finalidad de aportar ios elementos necesarios para llevar cabo la invención, mas no son limitativos del alcance de la misma:
EJEMPLO 1.
Este ejemplo ilustra el empaquetamiento in vitro de un dsRNA corto (22 pares de bases ó siRNA), por la proteína de la cápside del virus del moteado clorótico del caupí (CCMV). En ios ejemplos siguientes se describe la síntesis del dsRNA a utilizar, con la intención de demostrar que el método funciona independientemente de la síntesis. Síntesis del dsRNA del gen específico:
La síntesis in vitro de RNA se realizó mediante un sistema que utiliza la enzima polimerasa del bacteriófago T7 (T7 RNA polimerasa), Esta enzima es dependiente de la secuencia promotora (GGATCCTAATACGACTCACTATAG) para hacer la transcripción del gen de interés. Tiene una tasa de error de incorporación de nucleóíidos muy baja y requiere como molde ADN de doble cadena y que contenga la secuencia promotora 17 al comienzo del gen o secuencia a transcribir. Para realizar la transcripción in vitro de ssRNA se utilizó el kit T7 RiboMAX de la compañía Promega. La transcripción in vitro se realizó en volúmenes de 20 pl en tubos de microcentrífuga previamente esterilizados. Cada reacción contenía los ribonudeótidos uracilo, adenina, guanina y citosina a una concentración 25 rnfvl, 6 iL de DNA (oligonucleótidos hibrídizados), 4 pL de RiboMAX™ T7 buffer 5x, 2 pL de ía mezcla de enzima 17 y 2 μί de agua libre de nucleasas. Una vez mezclados todos los componentes, ¡os tubos de microcentrífuga se colocan en un termoblock a 37°C durante cuatro horas. Después de haber terminado la reacción se adicionó DNasa A y se incubó a 37°C durante 30 minutos, con la finalidad eliminar el DNA.
Finalmente se obtuvieron los RNAs de doble cadena medíante la hibridación de los RNAs transcritos. Los transcritos (ssRNA) obtenidos se mezclaron y calentaron a 93 °C durante 5 minutos, y posteriormente se alcanzó el equilibrio térmico a temperatura ambiente. Los RNAs de doble cadena obtenidos fueron analizados posteriormente por medio de geles nativos de poliacrilamida.
Etapa a) de purificación de la proteína de la cápside
La proteína de la cápside se obtiene a partir del desensamble de los virus, a una concentración elevada de sales y un pH mayor a 7. El amortiguador de desensamble (0.5 M CaCI2l 0.05 M Tris-HCÍ Ph 7.5, 1 mlVt EDTA, 1 mM DTT, 0.5 m PMSF} provoca que la cápside se desacople, dejando a! RNA suspendido, y los iones de calcio causan su precipitación para su remoción posterior mediante ultracentrifugación.
La solución de virus purificado se colocó en una membrana de diálisis de celulosa previamente esterilizada, con un tamaño de poro de 8000 a 12000 Da, en amortiguador de desensamble en un lapso de 24 h a 4°C, con agitación lenta. Una vez transcurrido este tiempo se retiró la solución de la membrana de diálisis y se colocó dentro de un tubo ultra ciara de ultracentrífuga. El volumen final se centrifugó a 50000 rpm por un periodo de 480 min a 4°C en un rotor 90 Ti en una ultracentrífuga Beckman XPN100. inmediatamente finalizada ¡a ultracentrifugación se extrajo la solución en fracciones de 300 μΙ, de arriba hacia abajo, cuidando de no perturbar la solución y se mantuvo a 4°C.
Después se midió la pureza y la concentración de cada fracción en un espectrofotometro UV-Vis (modelo Nanodrop marca Thermo Scientific), manteniéndolo a 4°C, y desechando aquéllas fracciones que no tenían la pureza mínima de 99.5 %, es decir, la relación obtenida de las absorbancias en los puntos característicos de la proteína y los ácidos nucleicos (A880/A280) debía ser igual o mayor a 1.5. Las fracciones con una pureza igual o mayor a 1.5 y con A280 mayor a 0.08 se mezclaron para posteriormente dializarse 12 h en amortiguador de proteína (1 M NaCI, 0.02 Tris-HCI pH 7.2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM P SF). Finalmente se mide la concentración y pureza de la proteína, y se almacenó a 4 °C. La concentración de las proteínas de la cápside del CCMV en mg/ml se obtuvo por medio de la relación: (1 197.7 A280 - 24.032)/1000.
Etapa b) de ensamblaje
La síntesis de las VLPs con el ds NA, se realizó mediante e! autoensamble de las proteínas de la cápside del CCMV alrededor de las moléculas de siRNA. Para verificar el método, en este ejemplo también se determinaron las mejores condiciones de síntesis de VLPs, realizando ensambles a tres proporciones diferentes de la proteína de la cápside de! CCMV con ei dsRNA. Las proporciones en masa de CP: dsRNA usadas íueron 3:1 , 6:1 y 8:1. Las diferentes proporciones se dializaron durante 24 horas en amortiguador de ensamble (50 mM NaCI, 10 M KCI, 5 mM gCI2, 1 m DTT, 50 mM Tris-HCI, pH 7,2) a una temperatura de 4°C. Posteriormente se recuperaron los ensambles, se midió e! volumen obtenido y se almacenaron a 4°C. obtuvieron los siguientes resultados: para la razón 3:1 se puede observar una escasa o nula formación VLPs, (Figura 2a); a la razón 6:1 se puede observar ia formación de VLPs en mayor densidad (Figura 2b); a la razón de 8:1 se observa un incremento en las VLPs con morfología tubular (Figura 2c). Por lo tanto, se verificó que la relación 8:1 proporcionaba un incremento en formación de VLPs.
Etapa c) de estabilizador^
Para finalizar la síntesis de las VLP-dsRNA las procápsides y complejos CP-dsRNA se acidificaron en una solución amortiguadora de estabilización de pH ácido (50 mM de acetato de sodio, 8 mM de acetato de magnesio, pH de 4.5).
Al finalizar se realizó una caracterización por medio de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) fue posible analizar los ensambles de dsRNA de 22 pares de bases con CP del virus CC V. Las VLPs obtenidas corresponden a dos tipos de morfologías: icosaédricas. ES diámetro promedio de las procápsides fue de 21 nm; el diámetro de las VLPs icosaédricas fue de 26 nm en promedio, cubriendo un rango de 15 a 30 nm., y el diámetro de los nanotubos correspondió a 21 nm el promedio, cubriendo un rango de 15 a 30 nanómetros y con longitud de 50 a 1000 nanómetros. EJEMPLO 2
Este ejemplo ilustra el empaquetamiento in vito de un dsRNA largo por la proteína de la cápside de! virus moteado cíorótico del caupí (CCMV). En particular, la proteína de la cápside del virus fitopatógeno CCMV es de especial interés porque se ha demostrado que es capaz de empaquetar material heteorólogo de forma espontánea, con alta eficiencia, así como también moléculas de RNA de doble cadena. Además, ¡a cápside del CCMV protege ei dsRNA empaquetado contra la degradación de nucleasas, sirve como un andamio externo robusto con la capacidad de dirigir su cargo hacia células específicas y es capaz de encapsidar de manera más eficiente una amplia gama de secuencias de RNA.
Síntesis del dsRNA de! gen específico;
En la presente invención, ei dsRNA utilizado, puede ser sintetizado por diversos métodos, A continuación, se menciona el desarrollado para este ejemplo con fines ilustrativos,
Previo a la síntesis de dsRNA, se seleccionó para este ejemplo un dsRNA de 560 pares de bases, el cual es un fragmento de un gen de un virus que infecta crustáceos, se diseñaron los oligonucleótidos específicos: sentido (T7VP-F) 5!-TAATAC GACTCACTATAGGGCGGCCATCCTCGCCATCACTG-S' y antisentido (Phi6VP~R) 5'- GGAAAAAAAATTTCCACCGGCGGTAGCTGC-3', mediante el programa FAST PCR. El oligonucieótido sentido se modificó en 5' con el promotor de transcripción T7 y Phi6 para el antisentido, Los oligonucleótidos correspondientes fueron sintetizados por la compañía IDT. Ei programa usado para la PCR consistió de 35 cíelos, con una temperatura de desnaturalización de 98 °C, 55-78 °C de alineación y de extensión de 72 °C. La PCR fue llevada a cabo en un termociclador marca BIO-RAD, modelo yCycier™. El producto de PCR fue analizado por electroforesis para determinar su tamaño.
Ei dsRNA se sintetizó mediante el sistema "Replicator RNAi Kit" de Thermo Scientific que combina la transcripción in vitro y la replicación de un DNA molde. Ei DNA molde utilizado para la síntesis de dsRNA es producido por PCR usando una DNA polimerasa de alta fidelidad {Phusion DNA Polymerase). Los oligonucleótidos para la PCR se diseñan de manera que el producto resultante de la PCR contuviera la secuencia del promotor T7 en un extremo y la de! promotor Phi8 RNA repllcasa en el otro. El producto de PCR se purificó y se transcribió en RNA de una sola hebra por T7 RNA polimerasa. Este RNA de cadena simple se replicó en el RNA de doble cadena con la Phi6 RNA repücasa en la misma etapa de incubación, ver Figura 3.
En el carril 2 de la Figura 3, podemos observar el producto mediante PCR del fragmento del gen 563 pares de bases, en el carril 3 dsRNA obtenido mediante transcripción y replicación por medio de la T7 RNA polimerasa y la Phi 6 ARN replicasa.
Lo cual nos muestra la alta eficiencia de la síntesis del dsRNA usando este procedimiento.
El éxito de tener una mayor proporción de RNA de doble cadena, nos asegura la puesta en marcha del mecanismo de RNA de Interferencia en las células dónde éste se introduzca.
La transcripción in vitro de ambas cadenas del RNAi se realizó simultáneamente durante 4 h a 37 °C (tiempo recomendado por el fabricante). El DNA fue eliminado con DNasa I y la reacción se filtró con un centricon de 100 kDaltons para eliminar enzimas y nucleótidos. Finalmente, los productos fueron evaluados por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1 %, y por espectrofotometría UV-vis, para verificar la integridad y concentraciones de los dsRNA.
Etapa a) de purificación de la proteína de la cápside.
La proteína de la cápsíde se obtiene a partir de! desensamble de ios virus, a una concentración elevada de sales y un pH mayor a 7. El amortiguador de desensamble (0.5 M CaCI2, 0.05 M Tris-HCI Ph 7.5, 1 mM EDTA. 1 mM DTT, 0.5 mM P SF) provoca dos efectos: el hinchamiento de los virus hasta que la proteína de la cápside se desacopla, dejando al RNA suspendido, y e! segundo efecto se da por la presencia de iones de calcio, los cuales ai unirse al RNA, causan su precipitación, y esto facilita su remoción posterior mediante ultracentrifugación.
La solución de virus purificado se colocó en una membrana de diálisis de celulosa previamente esterilizada, con un tamaño de poro de 8000 a 12000 Da, en amortiguador de desensamble en un lapso de 24 h a 4 °C, con agitación lenta. Una vez transcurrido este tiempo se retiró la solución de ¡a membrana de diálisis y se colocó dentro de un tubo ultraclaro de ultracentrífuga. El volumen final de la solución en el tubo fue de 1.2 mi. Se centrifugó a 50000 rpm por un periodo de 480 min a 4°C en un rotor 90 Ti en una ultracentrífuga Beckman XP!M10Q, Inmediatamente finalizada ¡a ultracentrifugación se extrajo la solución en fracciones de 300 μΙ, de arriba hacia abajo, cuidando de no perturbar ¡a" solución y se mantuvo a 40 °C.
Después se midió ¡a pureza y la concentración de cada fracción en un espectrofotómetro UV-Vis (modelo Nanodrop marca Thermo Scientific), manteniéndolo a 4 °C, y desechando aquéllas fracciones que no tenían la pureza mínima de 99.5 %, es decir, la relación obtenida de las absorbancias en los puntos característicos de la proteína y los ácidos nucleicos (A860/A260) debía ser igual o mayor a 1.5. Las fracciones con una pureza igual o mayor a 1.5 y con A280 mayor a 0.08 se mezclaron para posteriormente dializarse 12 hrs en amortiguador de proteína (1 M NaCI, 0.02M Tris-HCI pH 7.2, 1 m EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF). Finalmente se mide la concentración y pureza de la proteína, y se almacenó a 4°C. La concentración de las proteínas de la cápside del CCIV1V en mg/ml se obtuvo por medio de la relación: (1197.7 A280 - 24.032)71000. Etapa b) de ensamblaje
La síntesis de las VLPs con e! dsRNA largo se realizó mediante el autoensarnbíe de las proteínas de la cápside del CCVM alrededor de las moléculas de dsRIMA. Para este caso se consideró utilizar una razón 8:1 de CP a dsRNA con la finalidad de asegurar la encapsidación del total del dsRNA producido de acuerdo a los resultados obtenidos con el siRNA,
La mezcla se dializó durante 24 horas en amortiguador de ensamble (50 mM NaCI, 10 mM KCL 5 mM MgCb, 1mM DTT, 50 mM Tris-HCI, pH 7,2) a una temperatura de 4 °C. Posteriormente se recuperaron los ensambles, se midió el volumen obtenido y se almacenaron a 4°C, o a -20 °C para ser almacenados a periodos mayores a 1 semana.
Específicamente para este ejemplo, se realizó una etapa intermedia de caracterización para la verificación y evaluación de la etapa de ensamblaje. Esta etapa intermedia es opcional dentro de la metodología de la presente invención. Se realizó mediante el ensayo de movilidad electroforética (EMSA) en un gel de agarosa a! 1 % usando como amortiguador de corrida el amortiguador de ensamblaje ajustado a un pH 6, La imagen de la Figura 4 se muestra la formación de las VLPs mediante EMSA. En el carril 1 se tiene la escalera de DNA; en el 2 el virus CCMV, el cual es usado como estándar; en el carril 3 se pueden observar las VLPs y en el 4 el dsRNA libre. Para visualizar el gel se utilizó bromuro de etidío. En la imagen se observa que una parte de los ensambies migran de forma muy parecida que el virus CCIvlV, mientras que la mayoría se encuentra muy cercano al pozo en donde fue colocado. Sin embargo, se puede observar que ios ensambies VLPs se desplazan de manera significativamente diferente en comparación con el dsRNA libre. Etapa c) de estabilización
Para finalizar la síntesis de las VLP-dsRNA (dsRNA largo) las procápsides y complejos CP-dsRNA se acidificaron en una solución amortiguadora de estabilización de pH ácido (50 mM de acetato de sodio, 8 mM de acetato de magnesio, pH de 4.5), para fomentar las interacciones proteína-proteína (Bancroft, 1970), En la Figura 5b se muestran finalmente las VLP sintetizadas, tal como se esperaba estas tienen dos tipos de morfología: esférica y tubular. De acuerdo con las mediciones, las cápsídes esféricas tienen un diámetro de 25.83 nm y corresponden a una cápside similar al del virus nativo CCMV. Por otro lado, las VLP's en forma de nanotubos tienen diámetro de 21.7 nm. Es muy probable que los dsRNAs estén ordenados longitudinalmente en manojos en el interior de los nanotubos; la longitud de estos no fue determinada debido a que son muy largos y algunos curvados lo que dificultó la medición.
Al finalizar, se llevó a cabo un análisis por medio de TEM de esta muestra, lo que permitió explicar la migración electroforética de la muestra obtenida en el análisis E SA. Por medio de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) fue posible analizar los ensambles de dsRIMA de 583 pares de bases con del virus CCMV. Las VLPs obtenidas corresponden a dos tipos de morfologías: icosaédricas y nanotubos tai como se observa en ía imagen de la Figura 5b. El diámetro promedio de las procápsides fue de 21 nm; el diámetro de las VLPs icosaédricas fue de 26 nm, y el diámetro de ios nanotubos correspondió a 21 nm.
EJEMPLO 3
Este ejemplo ilustra el empaquetamiento in vitro de un dsRNA corto (22 pares de bases) por la profeína de la cápside del virus del mosaico del bromo (BMV). Se describe nuevamente la síntesis del dsRNA, ya que es distinta a la metodología utilizada en el ejemplo 2. De esta manera se señala que el método objeto de la presente invención funciona independientemente de la síntesis, tamaño del dsRNA y del tipo de virus de planta siempre y cuando la parte N-terminal de la proteína de !a cápside este cargada positivamente. Los siguientes pasos del método fueron los mismos utilizados en el ejemplo 1.
Síntesis del dsRNA deí gen específico:
La síntesis in vitro de RIMA se realizó mediante un sistema que utiliza la enzima polimerasa del bacteriófago 17 (T7 RIMA polimerasa). Esta enzima es dependiente de la secuencia promotora (GGATCCTAATACGACTCACTATAG) para hacer la transcripción del gen de interés. Tiene una tasa de error de incorporación de nucleótidos muy baja y requiere como molde ADN de doble cadena y que contenga la secuencia promotora T7 al comienzo del gen o secuencia a transcribir. Para realizar ¡a transcripción in vitro de ssRNA se utilizó el kit T7 RiboMAX de la compañía Promega. La transcripción in vitro se realizó en volúmenes de 20 μΙ en tubos de microcentrífuga libres de enzimas. Cada reacción contenía los ribonucieótidos uracilo, adenina, guanina y citosina a una concentración 25 mM, 8 μί de DNA (oligonucleótidos hibridizados), 4 μί de RiboMAX™ T7 buffer 5x, 2 μί de la mezcla de enzima T7 y 2 pL de agua libre de nucleasas. Una vez mezclados todos ios componentes, los tubos de microcentrífuga se colocan en un termoblock a 37°C durante cuatro horas. Después de haber terminado la reacción se adicionó DNasa A y se incubó a 37°C durante 30 minutos, con la finalidad eliminar el DNA.
Finalmente se obtuvieron los RNAs de doble cadena mediante la hibridación de los RNAs transcritos. Los transcritos (ssRNA) obtenidos se mezclaron y calentaron a 93 °C durante 5 minutos, y posteriormente se alcanzó el equilibrio térmico a temperatura ambiente. Los RNAs de doble cadena obtenidos fueron analizados posteriormente por medio de geles nativos de poliacriíamida. Etapa a) de purificación de la proteína de la cápside.
La proteína de la cápside se obtiene a partir del desensamble de ios virus, a una concentración elevada de sales y un pH mayor a 7. El amortiguador de desensamble (0.5 M CaC , 0.05 M Trss-HCI Ph 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF) provoca que la cápside se desacopie, dejando al RNA suspendido, y los iones de calcio causan su precipitación para su remoción posterior mediante ultracentrifugación.
La solución de virus purificado se colocó en una membrana de diálisis de celulosa previamente esterilizada, con un tamaño de poro de 8000 a 12000 Da, en amortiguador de desensamble en un lapso de 24 h a 4 °C, con agitación lenta. Una vez transcurrido este tiempo se retiró la solución de la membrana de diálisis y se colocó dentro de un tubo ultra claro de ultracentrífuga. El volumen final se centrifugó a 290420 x g por un periodo de 126 min a 4°C en un rotor 90 Ti en una ultracentrífuga Beckman XP 100. Inmediatamente finalizada la ultracentrifugación se extrajo la solución en fracciones de 300 μΙ, de arriba hacia abajo, cuidando de no perturbar la solución y se mantuvo a 4°C.
Después se midió la pureza y la concentración de cada fracción en un espectrofotómetro UV-Vis (modelo Nanodrop marca Thermo Scientific), manteniéndolo a 4°C, y desechando aquéllas fracciones que no tenían la pureza mínima de 99.5 %, es decir, la relación obtenida de las absorbancias en los puntos característicos de la proteína y los ácidos nucleicos (A860/A260) debía ser igual o mayor a 1.5. Las fracciones con una pureza igual o mayor a 1.5 y con A280 mayor a 0.08 se mezclaron para posteriormente dializarse 12 h en amortiguador de proteína (1 M NaCi, 0.Q2M Tris-HCI pH 7.2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF). Finalmente se mide la concentración y pureza de la proteína, y se almacenó a 4 °C. La concentración de las proteínas de la cápside del BMV en mg/m! se obtuvo por medio de la relación: (1197.7 A280 - 24,032)/1000, Etapa b) de ensamblaje.
La síntesis de las VLPs con e! dsRNA, se realizó mediante el autoensamble de las proteínas de la cápside del BMV alrededor de las moléculas de dsRNA. Para verificar el método, en este ejemplo también se determinaron las mejores condiciones de síntesis de VLPs, realizando ensambles a tres proporciones diferentes de la proteína de la cápside (CP) del BMV con el dsRNA, Las diferentes proporciones se dializaron durante 24 horas en amortiguador de ensamble (50 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 m MgCI2, 1 mM DTT, 50 mM Tris-HCI, pH 7.2) a una temperatura de 4°C. Posteriormente se recuperaron los ensambles, se midió el volumen obtenido y se almacenaron a 4°C.Nuevamente se verificó que Sa relación 8:1 proporcionaba un incremento en formación de VLPs.
Etapa c) de estabilización.
Para finalizar la síntesis de las VLP-dsRIMA las procápsides y complejos CP-dsRNA se acidificaron se acidificaron en una solución amortiguadora de estabilización de pH ácido (50 m de acetato de sodio, 8 mM de acetato de magnesio, pH de 4.5).
Finalmente, por medio de la microscopía electrónica de transmisión (TE ) fue posible analizar los ensambles de dsRNA de 22 pares de bases con CP del virus BMV, la figura 6 muestra las micrografías obtenidas. Las VLPs obtenidas corresponden a morfologías icosaédricas. El diámetro promedio de ias VLPs-dsRNA fue de 28 nm.
Aun cuando en la anterior descripción se ha hecho referencia a ciertas modalidades de la presente invención, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a dichas modalidades, pero sin apartarse del verdadero alcance de la invención. Por lo tanto, la presente invención no debe ser restringida excepto por lo establecido en el estado de la técnica y por las reivindicaciones anexas.

Claims

1 .- Una partícula tipo virus con dsRNA encapsidado, caracterizada porque presenta un tamaño esférico de 15 a 35 nanómetros, en forma de nanotubos con un diámetro de 15 a 30 nanómetros y con longitud de 50 a 1000 nanómetros y porque se compone de una cápside formada por proteínas estructurales de un virus que infecta plantas y un dsRNA de doble cadena. 2.~ La partícula tipo virus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el tamaño del dsRNA está entre 20 y 10ΌΟΟ pares de bases de longitud.
3. ~ La partícula tipo virus de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque el dsRNA tiene carga negativa.
4. - La partícula tipo virus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la proteína de la cápside viral contiene una parte N~terminal con carga positiva.
5. - La partícula tipo virus de conformidad con las reivindicaciones 1 y 4, caracterizada porque el virus se selecciona de entre bromovirus, geminivirus, CCMV,
CPMV, CRMV, RCNMV. entre otros.
6. - Un vector para el transporte de dsRNA a células blanco, caracterizado porque se compone de una cápside formada por proteínas estructurales de un virus que infecta plantas y un dsRNA de doble cadena.
7.~ Un vector de conformidad con ia reivindicación 6, caracterizado porque presenta un tamaño esférico de 15 a 35 nanómeiros. en forma de nanotubos con un diámetro de 15 a 30 nanómeiros y con longitud de 50 a 1000 nanómetros. 8.- Un vector de conformidad con ia reivindicación 6, caracterizado porque el tamaño de! dsRNA está entre 20 y 10*000 pares de bases de longitud.
9, - Un vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el dsRNA tiene carga negativa.
10. - Un vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína de la cápside viral contiene una parte N-terminal con carga positiva.
1 - Un vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el virus se selecciona de entre bromovirus, geminivirus, CCMV, CPMV, CRMV, RCNMV, entre oíros.
12. ~ Uso del vector de las reivindicaciones 6 a 1 1 para bloquear la expresión de genes,
13. - Un método in viíro de encapsidación un ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA) de longitud variable dentro de cápsides de virus de plantas (VLPs), caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(a) Purificación de la proteína de la cápside de un virus que infecta plantas, se realiza en una solución amortiguadora de desensamble dei virus con una concentración elevada de sales y un pH mayor a 7; (b) ensamblaje, comprende combinar !a proteína de ia cápside viral de planta del inciso anterior y un dsRNA en una solución amortiguadora de ensamblaje de pH neutro, entre 7 y 7.4; y
(c) estabilización, incubar ia mezcla resultante del inciso anterior en una solución amortiguadora de pH ácido.
14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la solución amortiguadora de desensamble de la etapa de purificación está compuesta por CaCI2, Tris-HCI, EDTA, DTT y P SF.
15. - El método de conformidad con ías reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque la etapa de purificación se lleva a cabo mediante diálisis con una agitación lenta en un lapso de tiempo de entre 10 a 30 horas y en una temperatura entre 0 a 20 °C. 18.- ES método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dsRNA de la etapa de ensamblaje está entre 20 y 10/000 pares de bases de longitud.
17.- El método de conformidad con ias reivindicaciones 13 y 18, caracterizado porque el dsRNA puede ser sintetizado por cualquier tipo de método conocido incluyendo cualquier método que sea capaz de sintetizar u obtener dsRNA ya sea como producto primario, secundario o desecho, aun si este es utilizado con o sin ningún tratamiento previo.
18.- E¡ método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proteína de ía cápside viral en la etapa de ensamblaje contiene una parte N-terminal con carga positiva.
19. - E! método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque eí dsRNA tiene carga negativa.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el virus se selecciona de entre bromovirus, gemirtivirus, CC V, CP V, CR V, RCNMV, entre otros.
21. - El método de conformidad con las reivindicaciones 13 y 18, caracterizado porque la proteína de la cápside viral puede ser sintetizado por cualquier tipo de método conocido.
22. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque ia solución amortiguadora de ensamblaje está compuesta por NaCI, KCl, gC , DTT y Tris- HCI.
23. - E3 método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque ia etapa de ensamblaje se lleva a cabo mediante diálisis con una agitación lenta en un lapso de tiempo de entre 20 a 30 horas y en una temperatura entre 0 a 25 °C. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque ia proporción de masa de la combinación de la proteína de ia capside viral y e! dsRNA en la etapa de ensamblaje es de a 3:1 , 4:1 , 5:1 , 8:1 7:1 y 8:1.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proporción de masa de la combinación de la proteína de la capside viral y el dsRNA en ia etapa de ensamblaje es de a 6:1 a 8:1.
26.- E! método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque ia proporción de masa de la combinación de la proteína de la capside vira! y el dsRNA en la etapa de ensamblaje es de 8:1. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la solución amortiguadora de estabilización tiene un pH entre 4.5 y 6; y está compuesta por CHsCOONa y {CH3COG)2!Vtg.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la etapa de estabilización se lleva a cabo mediante diálisis en un lapso de tiempo de entre 2 a 30 horas y en una temperatura entre 0 a 25 eC.
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