WO2018235766A1 - 反応処理装置 - Google Patents

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WO2018235766A1
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air
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air communication
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福澤　隆
磨 川口
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日本板硝子株式会社
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the present invention relates to a reaction processing apparatus used for polymerase chain reaction (PCR).
  • Genetic testing is widely used for testing in various medical fields, identification of agricultural crops and pathogenic microorganisms, food safety evaluation, and testing for pathogenic viruses and various infectious diseases.
  • a method of analyzing a part of the DNA and analyzing the obtained product is known.
  • the method using PCR is a technique of interest for selectively amplifying a portion of a very small amount of DNA collected from a living body or the like.
  • PCR applies a predetermined thermal cycle to a sample obtained by mixing a biological sample containing DNA and a PCR reagent consisting of primers, enzymes and the like, repeatedly causing denaturation, annealing and extension reactions to make specific portions of DNA It is to be selectively amplified.
  • PCR it is common practice to put a predetermined amount of a sample of interest in a reaction processing container such as a PCR tube or a microplate (microwell) in which a plurality of holes are formed, but in recent years, it has been formed on a substrate It has been put to practical use to carry out using a reaction processing container (also called a chip) provided with a fine flow path (for example, Patent Document 1).
  • a reaction processing container also called a chip
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a reaction processing apparatus capable of preventing or at least suppressing carryover in PCR.
  • a reaction processing apparatus includes a reaction processing container including a flow path through which a sample moves and a pair of air communication ports provided at both ends of the flow path, and a flow path Temperature control means for providing a first temperature range maintained at a first temperature and a second temperature range maintained at a second temperature higher than the first temperature between a pair of air communication ports in And a liquid transfer system that discharges and sucks air to move and stop in the flow path.
  • the air communication port far from the second temperature region of the pair of air communication ports of the reaction processing container is in communication with the liquid transfer system through the tube, and the second temperature region of the pair of air communication ports of the reaction processing container The air communication port closer to the air pressure is released to the atmospheric pressure.
  • the liquid delivery system discharges air from the first air port into the chamber having the inner space having a fixed volume, the first air port and the second air port connecting the inner space and the outside, and the inner space of the chamber.
  • a second pump arranged to discharge air from the second air port into the internal space of the chamber.
  • the first air port of the chamber is in communication with the air communication port of the pair of air communication ports of the reaction processing container which is far from the second temperature region through the tube, and the second air port of the chamber is opened to atmospheric pressure.
  • the first pump and the second pump may be controlled to alternately perform the air discharge operation.
  • a filter may be provided at one end of the flow path of the reaction processing vessel, which is far from the second temperature region, of both ends of the flow path.
  • reaction processing apparatus capable of preventing or at least suppressing carryover in PCR.
  • FIG.1 (a), FIG.1 (b), and FIG.1 (c) are the figures for demonstrating the reaction processing container which can be used with the reaction processing apparatus which concerns on embodiment of this invention. It is a top view of the substrate with which a reaction processing container is provided. It is sectional drawing of a reaction processing container, Comprising: It is a figure for demonstrating the relationship between each site
  • FIGS. 1 (a), 1 (b) and 1 (c) are diagrams for explaining a reaction treatment container 10 that can be used in a reaction treatment apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • 1 (a) is a plan view of the reaction processing container 10
  • FIG. 1 (b) is a front view of the reaction processing container 10
  • FIG. 1 (c) is a bottom view of the reaction processing container 10.
  • FIG. 2 is a plan view of the substrate 14 provided in the reaction processing container 10.
  • FIG. 3 shows a conceptual cross-sectional view for explaining the reaction processing container 10.
  • the reaction processing container 10 is a flow path sealing film for sealing the resinous substrate 14 having the grooved flow passage 12 formed on the lower surface 14 a and the flow passage 12 attached on the lower surface 14 a of the substrate 14.
  • It comprises the second sealing film 20 for sealing the first sample inlet 45 and the second sample inlet 46.
  • FIG. 3 is a view for explaining how these are arranged with respect to the substrate 14.
  • the substrate 14 is preferably made of a material that is stable against temperature changes and is not easily attacked by the sample solution used. Furthermore, the substrate 14 is preferably formed of a material having good moldability, good transparency and barrier properties, and low autofluorescence. As such a material, inorganic materials such as glass and silicon (Si), resins such as acrylic, polypropylene and silicone, and cycloolefin polymer resin (COP) are preferable.
  • Si glass and silicon
  • resins such as acrylic, polypropylene and silicone
  • COP cycloolefin polymer resin
  • An example of the dimensions of the substrate 14 is 76 mm long, 26 mm short, and 3 mm thick.
  • a groove-shaped flow passage 12 is formed in the lower surface 14 a of the substrate 14.
  • most of the flow path 12 is formed in a groove shape exposed to the lower surface 14 a of the substrate 14. This is to facilitate molding by injection molding using a mold or the like.
  • the flow path sealing film 16 is pasted on the lower surface 14 a of the substrate 14.
  • the cross-sectional shape of the groove is not particularly limited, and may be rectangular or U-shaped (round).
  • molding it may have a shape which narrows in the depth direction from the lower surface 14a, for example, may be trapezoidal shape.
  • An example of the dimensions of the flow channel 12 is at most 0.7 mm wide and 0.7 mm deep.
  • the flow path sealing film 16 may have adhesiveness on one main surface, and a functional layer that exhibits adhesiveness or adhesiveness upon application of energy such as pressing or ultraviolet light, heating, etc. is on one main surface. It may be formed, and has the function of being able to be in close contact with the lower surface 14a of the substrate 14 and to be integrated easily. It is desirable that the flow path sealing film 16 be formed of a material having low self-fluorescent property including an adhesive. In this respect, a transparent film made of a resin such as cycloolefin polymer, polyester, polypropylene, polyethylene or acrylic is suitable, but not limited thereto. Moreover, the flow path sealing film 16 may be formed of plate-like glass or resin. In this case, since the rigid property can be expected, it helps prevent the reaction processing container 10 from being warped or deformed.
  • a first air communication port 24 communicating with one end 12 a of the flow path 12 is formed in the substrate 14.
  • a second air communication port 26 communicating with the other end 12 b of the flow path 12 is formed.
  • the pair of first air communication ports 24 and the second air communication ports 26 are formed to be exposed to the lower surface 14 a of the substrate 14. That is, the surface on which the pair of first air communication ports 24 and the second air communication port 26 are exposed is the same as the surface on which the flow path 12 is formed.
  • a first filter 28 is provided between the first air communication port 24 and one end 12 a of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a second filter 30 is provided between the second air communication port 26 and the other end 12 b of the flow path 12 in the substrate 14.
  • the pair of first filters 28 and second filters 30 provided at both ends of the flow channel 12 are excellent in low impurity characteristics and allow only air to pass so that PCR does not interfere with amplification or detection of the target DNA by PCR. Or prevent contamination so that the quality of the target DNA is not degraded.
  • As a filter material although what carried out the water-repellent treatment of polyethylene can be used as an example, it can select from well-known materials if it is a thing provided with said function.
  • the dimensions of the first filter 28 and the second filter 30 may be dimensioned to fit tightly in the filter installation space formed on the substrate 14 and may be, for example, 4 mm in diameter and 2 mm in thickness.
  • the flow path 12 is in two systems immediately before the second filter. A part of the evaporated sample may be in the form of droplets and adhere to the inside of the flow path, and in particular in the vicinity of the second filter 30 scheduled to be maintained at a relatively high temperature, the deposited droplets are the sample liquid There is a risk that it may interfere with the transmission, and there are two systems to compensate for it.
  • the flow path 12 is provided with a reaction region between which the temperature of a plurality of levels can be controlled by a reaction processing device described later between the pair of first air communication ports 24 and the second air communication ports 26.
  • the sample can be provided with a thermal cycle by moving the sample back and forth continuously through the reaction area where multiple levels of temperature are maintained.
  • the reaction region of the flow path 12 is a reaction region (hereinafter referred to as “high temperature region 36”) maintained at a relatively high temperature (about 95 ° C.) when the reaction processing container 10 is mounted on a reaction processing device described later. And a reaction zone (hereinafter referred to as “medium-temperature zone 38") maintained at a lower temperature (about 62 ° C.) than the high-temperature zone 36.
  • the high temperature region 36 is located on the right side of the paper surface in the flow path 12, and one end thereof is a second air communication port via the connection flow path 261 between the second filter 30, the second air communication port 26 and the second filter 30. The other end is in communication with the intermediate temperature region 38 via the connection flow path 40.
  • the medium temperature area 38 is located at the center of the paper surface in the flow path 12 and one end thereof communicates with the high temperature area 36 via the connection flow path 40 and the other end communicates with the low temperature area 34 described later via the connection area 41. doing.
  • the high temperature area 36 and the medium temperature area 38 each include a serpentine flow path which is continuously folded in combination of a curved portion and a straight portion.
  • a serpentine flow path which is continuously folded in combination of a curved portion and a straight portion.
  • the connection channel 40 may be a linear channel.
  • Flow path 12 further includes an area (hereinafter referred to as “low temperature area 34”) maintained at a lower temperature than intermediate temperature area 38.
  • the temperature may be controlled to be maintained at a temperature lower than the medium temperature region, but may not be particularly controlled.
  • the low temperature region 34 is located on the left side of the drawing in the flow passage 12, and one end thereof is connected to the first air communication via the first filter 28 and the connection flow passage 241 between the first air communication port 24 and the first filter 28. The other end is in communication with the medium temperature area 38 through the connection area 41.
  • the low temperature region 34 is used to perform so-called dispensing for extracting a predetermined amount of sample.
  • the low temperature region 34 includes a dispensing flow channel 42 for defining a predetermined amount of sample, two branch flow channels (first branch flow channel 43 and second branch flow channel 44) branched from the distribution flow channel 42, and a first A first sample inlet 45 disposed at an end of the branch flow channel 43 and a second sample inlet 46 disposed at an end of the second branch flow channel 44 are provided.
  • the first sample inlet 45 is in communication with the dispensing channel 42 via the first branch channel 43.
  • the second sample inlet 46 is in communication with the dispensing channel 42 via the second branch channel 44.
  • the dispensing channel 42 is a serpentine channel in order to dispense a predetermined amount of sample with a minimum area.
  • the first sample inlet 45 and the second sample inlet 46 are formed to be exposed on the upper surface 14 b of the substrate 14. That is, the surface on which the first sample inlet 45 and the second sample inlet 46 are exposed is the surface opposite to the surface on which the flow path 12 is formed.
  • a branch point at which the first branch flow path 43 branches from the dispensing flow path 42 is a first branch point 431 and a branch point at which the second branch flow path 44 branches from the dispensing flow path 42 is a second branch point 441
  • the volume of the sample to be subjected to PCR is substantially determined by the volume in the dispensing channel 42 between the first branch point 431 and the second branch point 441.
  • the first filter 28 and the second filter 30 are exposed to the lower surface 14 a of the substrate 14. Since the flow path 12 is formed on the lower surface 14 a of the substrate 14, the flow path sealing film 16 for sealing the flow path 12 is the first filter 28 shown in FIG.
  • the filter 30 may also have an outer shape that simultaneously seals. The corner portion may have a rounded shape to prevent peeling.
  • a polypropylene film 9795 manufactured by 3M Co., Ltd. is used as the flow path sealing film 16.
  • the first air communication port 24 and the second air communication port 26 are also exposed on the lower surface 14a of the substrate 14. However, as shown in FIG. 1C, the flow path sealing film is used to seal them. A first sealing film 18 separate from 16 was used.
  • the second sealing film 20 is the upper surface 14b of the substrate 14. Paste to In the state where the first sealing film 18 and the second sealing film 20 are attached in addition to the flow path sealing film 16, all the flow paths are closed spaces.
  • a pressurized pump (described later) as a liquid feeding means is connected only to the first air communication port 24, and the second air communication port 26 is opened to the atmospheric pressure.
  • the connection between the pressure type pump and the first air communication port 24 and the opening of the second air communication port 26 are performed by peeling off the first sealing film 18 in the portions corresponding to these, and the first air communication port 24 and the second air communication port Make 26 exposed.
  • the first sealing film 18 may be formed with a non-tacky tab 181 so that the first sealing film 18 can be easily held by fingers and easily peeled off.
  • the communication ports may be opened by piercing the corresponding portions of the first air communication port 24 and the second air communication port 26 of the first sealing film 18 with a needle or the like.
  • the first sealing film 18 be a film made of a material or thickness which is easily pierced by a needle.
  • the second air communication port 26 may be connected to a pressure pump, and the first air communication port 24 may be opened to atmospheric pressure.
  • the introduction of the sample into the reaction processing container 10 through the first sample introduction port 45 and the second sample introduction port 46 is the first sample introduction port within the range in which the connection flow paths 241 and 261 of the second sealing film 20 are not exposed. Only the corresponding portions of 45 and the second sample introduction port 46 are peeled off from the substrate 14 once, and after introduction of a predetermined amount of sample, the second sealing film 20 is again attached back to the upper surface 14 b of the substrate 14. Therefore, as the 2nd sealing film 20, a film provided with adhesiveness which lasts for pasting / peeling of several cycles is desirable.
  • the second sealing film 20 may be a mode in which a new film is attached after the introduction of a sample, and in this case, the importance of the characteristics relating to repeated application / peeling can be alleviated.
  • the first sealing film 18 and the second sealing film 20 have a pressure-sensitive adhesive layer formed on one main surface, or a functional layer that exhibits adhesiveness or adhesiveness by pressing. May be formed.
  • a transparent film made of a resin such as cycloolefin polymer, polyester, polypropylene, polyethylene or acrylic is suitable, but not limited thereto.
  • the characteristics such as adhesiveness do not deteriorate to such an extent that the use is affected even by multiple adhesion / peeling, but after peeling and introducing a sample etc., a new film is adhered
  • the importance of the characteristics relating to attachment / peeling can be mitigated.
  • a polypropylene film 9793 manufactured by 3M Co., Ltd. is used as the first sealing film 18 and the second sealing film 20 .
  • a sample to be amplified is prepared by thermal cycling.
  • a sample for example, one obtained by adding a fluorescent probe, a thermostable enzyme and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) as PCR reagents to a mixture containing one or more types of DNA Can be mentioned.
  • primers that specifically react with the DNA to be reacted are mixed.
  • a commercially available reagent kit for real-time PCR can also be used.
  • the second sealing film 20 may be formed with a non-tacky tab 201 so that the second sealing film 20 can be easily held by fingers and easily peeled off. The operator holds the tab 201 and peels off the second sealing film 20 to, for example, the dotted line (A) shown in FIG.
  • FIG. 4 schematically shows a state in which the sample 50 is introduced into the reaction processing container 10.
  • the sample 50 is introduced into the dispensing channel 42 from any one of the first sample inlet 45 and the second sample inlet 46.
  • an appropriate amount of sample 50 may be directly introduced, for example, by a pipette or a syringe.
  • surplus ones beyond the volume of the branch flow channel are accumulated in the other sample introduction port.
  • the sample inlet portion may be made to have a certain space for the purpose of utilizing it as a kind of reservoir.
  • pressurization from the first air communication port 24 causes the sample 50 filled in the dispensing channel 42 between the first branch point 431 and the second branch point 441 to be subjected to PCR.
  • the low temperature region 34 of the reaction processing vessel 10 performs a dispensing function of extracting a predetermined amount of sample.
  • the second sealing film 20 is attached again to the substrate 14, and the first sample inlet 45 and the second sample inlet 46 are sealed.
  • the tab 201 may be cut off because it becomes unnecessary after sealing. Instead of the peeled second sealing film 20, a new second sealing film 20 may be attached. Thus, the introduction of the sample 50 into the reaction processing container 10 is completed.
  • the dispensing function in the above reaction processing container does not prevent introduction while precisely dispensing the sample with a pipettor. In this case, since the sample is dispensed in advance, the tip of the sample introduced from one of the sample inlets may not reach the branch point on the other sample inlet side.
  • FIG. 5 is a schematic view for explaining the reaction treatment apparatus 100 according to the embodiment of the present invention.
  • the flow channel 12 and the first air communication port 24 and the second air communication port 26 exist in the surface 14 a of the reaction processing container 10, so the flow channel 12 and the liquid feeding system
  • the connection portion from 120 is actually disposed on the same side of the substrate 14, here, the connection portion from the flow path 12 and the liquid feeding system 120 is dare to facilitate understanding of the drawing for the sake of explanation. It should be noted that what is described to be disposed on the different side of the substrate 14 and that the temperature regions exist between the pair of air communication openings is conceptually expressed in an easy-to-understand manner.
  • the reaction processing apparatus 100 includes a container setting unit (not shown) in which the reaction processing container 10 is installed, a temperature control system 102, and a CPU 105.
  • the temperature control system 102 has a high temperature region 36 in the flow path 12 of the reaction processing container 10 at about 95 ° C. and an intermediate temperature region 38 with It is configured to be able to accurately maintain and control the low temperature region 34 at about 30 ° C. to 40 ° C. at 62 ° C.
  • the temperature control system 102 adjusts the temperature of each temperature region of the thermal cycle region, and more specifically, the high temperature heater 104 for heating the high temperature region 36 of the flow passage 12 and the flow passage 12
  • a medium temperature heater 106 for heating the medium temperature area 38
  • a low temperature heater 112 for heating the low temperature area 34 of the flow path 12
  • a temperature sensor for example, a thermocouple
  • high temperature heater driver 108 for controlling the temperature of high temperature heater 104
  • middle temperature heater driver 110 for controlling the temperature of middle temperature heater 106
  • low temperature heater for controlling the temperature of low temperature heater 112
  • the actual temperature information measured by the temperature sensor is sent to the CPU 105.
  • the CPU 105 controls each heater driver such that the temperature of each heater becomes a predetermined temperature based on the actual temperature information of each temperature region.
  • Each heater may be, for example, a resistive heating element or a Peltier element.
  • the temperature control system 102 may further include other components for improving the temperature controllability of each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 100 further includes a liquid sending system 120 that discharges and sucks air to move and stop the sample 50 in the flow path 12 of the reaction processing container 10.
  • FIG. 6 is a schematic diagram for explaining the configuration of the liquid delivery system 120.
  • the liquid delivery system 120 includes a chamber 125, a first pump 122, a second pump 124, a first pump driver 126 for driving the first pump 122, and a second pump for driving the second pump 124.
  • a driver 128 and a tube 130 are provided.
  • the first pump driver 126 and the second pump driver 128 are controlled by the CPU 105.
  • the chamber 125 has an inner space 125a having a fixed volume, and a first air port 125b and a second air port 125c communicating the inner space 125a with the outside.
  • the first pump 122 and the second pump 124 are disposed in the internal space 125 a of the chamber 125.
  • the first pump 122 and the second pump 124 may be, for example, micro-blower pumps comprising diaphragm pumps.
  • a micro blower pump model MZB1001T02 manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd. can be used as the first pump 122 and the second pump 124.
  • the first pump 122 is disposed such that the air discharged from the discharge port 122 a is discharged from the first air port 125 b of the chamber 125.
  • the second pump 124 is disposed such that the air discharged from the discharge port 124 a is discharged from the second air port 125 c of the chamber 125.
  • the first air port 125 b of the chamber 125 is in communication with the air communication port far from the high temperature region 36 of the pair of air communication ports of the reaction processing container 10 via the tube 130, that is, the first air communication port 24.
  • the second air port 125c of the chamber 125 is opened to the atmospheric pressure.
  • the CPU 105 controls the first pump 122 and the second pump 124 to alternately perform the air discharge operation via the first pump driver 126 and the second pump driver 128.
  • the inside of the tube 130 has a positive pressure, and the air is discharged from the tube 130 to the first air communication port 24 of the reaction processing container 10.
  • the first pump 122 is stopped and the discharge operation of the second pump 124 is performed, air is discharged from the chamber 125 second air port 125 c to cause the internal space 125 a of the chamber 125 to have a negative pressure
  • the inside of the tube 130 also has a negative pressure, and air is sucked into the tube 130 from the first air communication port 24 of the reaction processing vessel 10.
  • the sample 50 can be reciprocated within the flow path by discharge or suction of air by the tube 130, and can be repeatedly exposed to each temperature region of the flow path 12 of the reaction processing container 10, as a result It becomes possible to give a cycle.
  • the target DNA in the sample 50 is selectively amplified by repeatedly applying the steps of denaturation in the high temperature region 36 and annealing / extension steps in the moderate temperature region 38.
  • the high temperature area 36 can be regarded as a denaturation temperature area
  • the medium temperature area 38 can be regarded as an annealing / elongation temperature area.
  • the time for staying in each temperature region can be appropriately set by changing the time for the sample 50 to stop at a predetermined position in each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 100 further includes a fluorescence detector 140.
  • the predetermined fluorescent probe is added to the sample 50. Since the intensity of the fluorescence signal emitted from the sample 50 increases as the amplification of DNA proceeds, the intensity value of the fluorescence signal can be used as an index as a determination material of the progress of PCR and the termination of the reaction.
  • the fluorescence detector 140 is a very compact optical system, which can be measured quickly and can detect fluorescence regardless of whether it is a bright place or a dark place.
  • An optical fiber type fluorescence detection made by Nippon Sheet Glass Co., Ltd. Container FLE-510 can be used.
  • This optical fiber type fluorescence detector can be tuned so that the wavelength characteristic of its excitation light / fluorescence is suited to the fluorescence characteristic emitted by the sample 50, and an optical / detection system which is optimum for a sample having various characteristics. It is possible to provide, and because of the small diameter of the light beam provided by the fiber-optic fluorescence detector, it is also suitable for detecting fluorescence from samples present in small or narrow areas such as flow channels The speed is also excellent.
  • the fiber optic fluorescence detector 140 includes an optical head 142, a fluorescence detector driver 144, and an optical fiber 146 connecting the optical head 142 and the fluorescence detector driver 144.
  • a light source for excitation light LED, laser, or other light source adjusted to emit a specific wavelength
  • an optical fiber type multiplexer / demultiplexer a photoelectric conversion element (PD, APD, photo mar, etc.)
  • a photodetector (not shown) or the like is included, and it comprises a driver or the like for controlling these.
  • the optical head 142 is composed of an optical system such as a lens, and has functions of directional irradiation of excitation light to a sample and collection of fluorescence emitted from the sample. The collected fluorescence is separated from the excitation light by the optical fiber type multiplexer / demultiplexer in the fluorescence detector driver 144 through the optical fiber 146, and converted into an electric signal by the photoelectric conversion element.
  • the optical head 142 is disposed so as to detect fluorescence from the sample 50 in the flow path connecting the high temperature area 36 and the intermediate temperature area 38.
  • the reaction proceeds by repeatedly reciprocating the sample 50 in the flow path, and the predetermined DNA contained in the sample 50 is amplified. Therefore, the progress of the amplification of the DNA is monitored by monitoring the variation of the detected fluorescence amount. Can be known in real time.
  • the output value from the fluorescence detector 140 is used to control movement of the sample 50.
  • the fluorescence detector is not limited to the optical fiber type fluorescence detector as long as it exhibits the function of detecting the fluorescence from the sample.
  • the movement of applying thermal cycles to the sample 50 by the reaction processing apparatus 100 will be described with reference to FIG.
  • the reaction processing container 10 filled with the sample 50 is set in the reaction processing apparatus 100, and the first air communication port 24 of the reaction processing container 10 is connected to the first air port 125b of the chamber 125 via the tube 130 to perform the reaction processing.
  • the second air communication port 26 of the container 10 is opened to atmospheric pressure. Thereafter, only the first pump 122 is operated to make the inside of the tube 130 a positive pressure, and the sample 50 in the low temperature region 34 is moved to the middle temperature region 38 or the high temperature region 36.
  • only the second pump 124 is operated.
  • the inside of the tube 130 becomes negative pressure, so the sample 50 moves from the high temperature region 36 toward the middle temperature region 38.
  • the first pump 122 is operated in the case of moving the sample 50 from the intermediate temperature area 38 toward the high temperature area 36.
  • the inside of the tube 130 becomes positive pressure, so the sample 50 moves from the intermediate temperature area 38 toward the high temperature area 36.
  • the sample 50 can be continuously reciprocated between the high temperature region 36 and the intermediate temperature region 38 to give the sample 50 a thermal cycle. .
  • FIG. 7 is a view showing how a sample in the flow path of the reaction processing container 10 is subjected to a thermal cycle.
  • the sample 50 filled in the dispensing channel 42 between the first branch point 431 and the second branch point 441 of the low temperature region 34 is between the high temperature region 36 and the middle temperature region 38. It has been moved.
  • the liquid delivery system 120 is connected only to the first air communication port 24 far from the high temperature region 36 via the tube 130, and The air communication port 26 was opened to atmospheric pressure.
  • Carryover in PCR is considered to be caused by some amplified DNA fragments floating or adhering in the form of an aerosol or the like in the air in the tube 130 and this is mixed with the sample in the reaction processing vessel 10 . Aerosols of DNA fragments are considered to often occur when the liquid in which the DNA fragments are mixed is vaporized.
  • the vaporization phenomenon naturally naturally occurs as the vapor pressure of the sample (solution) increases, so the air communication port on the side of the high temperature region 36 where the vaporization phenomenon occurs relatively easily (that is, the second air communication port 26 near the high temperature region 36) is opened.
  • the DNA fragment can be introduced into the tube 130 by communicating the liquid delivery system 120 only with the air communication port on the side of the medium temperature area 38 where the vaporization phenomenon is relatively unlikely to occur (that is, the first air communication port 24 far from the high temperature area 36). It is difficult to be carried in as an aerosol, and carryover can be prevented or at least suppressed.
  • U unit of [U / ⁇ L] is a unit of the amount of enzyme activity, and the enzyme can convert 1 ⁇ mol (1 ⁇ 10 -6 mol) of substrate per minute under optimum conditions
  • the amount of is defined as 1 U and roughly represents the amount of enzyme.
  • (Iv) 1 ⁇ L of the standard sample having a different concentration prepared in (ii) was added to 24 ⁇ L of this reagent as a sample. Furthermore, a reagent to which a standard sample was not added was prepared as a negative control (negative control) sample.
  • a negative control is a control (sample) that should be determined as negative in the control experiment of the effect, and in this case, even when PCR is performed, the result is that bacteria are not included (negative).
  • the opposite is a positive control (positive control), which corresponds to the above standard sample and results in containing bacteria (positive) by performing PCR.
  • a sample containing a sample having a concentration of 1 ⁇ 10 6 Copies / ⁇ L was used as a positive control sample, and PCR amplification was performed alternately with the negative control sample. 15 ⁇ L of the sample was introduced into the above-described reaction processing vessel 10 with a pipettor. Furthermore, since the reaction processing container 10 is provided with the dispensing channel 42 capable of dispensing, even if the reaction processing container 10 is changed, erroneous determination of the result due to the difference in sample volume at each time can be made. It is possible to reduce.
  • the sample to be subjected to the thermal cycle repeats reciprocating movement between the high temperature area 36 and the medium temperature area 38 in the reaction processing container 10 described above.
  • Thermal cycling conditions hold the sample for 10 seconds in a medium temperature area 38 (annealing / elongation area) maintained at 62 ° C., and hold the sample for 3 seconds in a high temperature area 36 (thermal denaturation area) maintained at 95 ° C. And, this was repeated as one cycle.
  • the temperature of the low temperature region 34 was maintained at about 30 to 40.degree.
  • FIG. 8 shows the amplification result of PCR by the reaction processing apparatus 100 according to the present embodiment.
  • the horizontal axis is the cycle number (C)
  • the vertical axis is the fluorescence signal intensity (arbitrary unit).
  • the above-described reaction processing apparatus 100 was used to measure the intensity of the fluorescence signal detected by the fluorescence detector 140 with respect to the cycle number. As the analyte in the sample is amplified, the intensity of the fluorescence signal increases.
  • FIG. 8 shows the results of alternately performing PCR of a positive control sample and PCR of a negative control sample three times each. As shown in FIG.
  • the fluorescence signal intensity in the case of the positive control sample rises rapidly from around 26 cycles, and it can be seen that the sample in the positive control sample is amplified.
  • the fluorescence signal intensity in the case of the negative control sample is substantially constant (background level) even after 50 cycles, and no carryover occurs or is negligible.
  • FIG. 9 also shows amplification results of PCR by the reaction processing apparatus 100 according to the present embodiment.
  • PCR was performed on a sample containing six specimens with an initial concentration of 1 ⁇ 10 1 to 1 ⁇ 10 6 Copies / ⁇ L (10-fold increments). It can be seen from FIG. 9 that as the initial analyte concentration increases, the number of cycles at which the fluorescence signal intensity rises, that is, the number of cycles at which amplification of the analyte starts decreases.
  • FIG. 10 is a table showing Ct values (the number of threshold cycles) for six samples having an initial sample concentration of 1 ⁇ 10 1 to 1 ⁇ 10 6 Copies / ⁇ L.
  • the Ct value was set to 10% of the plateau of each amplification curve.
  • FIG. 11 shows a calibration curve in which the relationship between the initial concentration and the Ct value shown in FIG. 10 is plotted.
  • the slope (S) of the calibration curve is obtained from FIG.
  • the PCR efficiency (10 (-1 / S) -1) is calculated, it is 91.2%, which indicates that good PCR is performed.
  • FIG. 12 is a diagram for explaining a reaction processing apparatus 200 according to a comparative example.
  • the reaction treatment apparatus 200 according to this comparative example differs from the liquid delivery system 120 of the reaction treatment apparatus 100 shown in FIG. 5 in the configuration of the liquid delivery system 220.
  • the liquid delivery system 220 includes a first pump 222, a second pump 224, a first pump driver 226 for driving the first pump 222, and a second pump driver 228 for driving the second pump 224.
  • a first tube 230 and a second tube 232 are provided.
  • the first pump 222 and the second pump 224 are not in the chamber but at atmospheric pressure.
  • the first air communication port 24 of the reaction processing container 10 is in communication with the discharge port of the first pump 222 through the first tube 230
  • the second air communication port 26 of the reaction processing container 10 is the second tube 232. It communicates with the discharge port of the 2nd pump 224 via. Even if packings 234 and 236 and seals for securing air tightness are disposed at the connection portion of the first air communication port 24 and the first tube 230 and at the connection portion of the second air communication port 26 and the second tube 232, respectively. Good.
  • the sample 50 can be reciprocated within the flow path 12 of the reaction processing vessel 10 by alternately discharging the first pump 222 and the second pump 224 in the liquid delivery system 220 configured and arranged in this manner. .
  • FIG. 13 shows the amplification result of PCR by the reaction processing apparatus 200 according to the comparative example.
  • the horizontal axis is the cycle number (C)
  • the vertical axis is the fluorescence signal intensity (arbitrary unit).
  • the samples were prepared in the same manner as the experiment described in FIG. 8 and positive and negative controls were prepared, and PCR was alternately performed twice.
  • the amplification curve shown in FIG. 13 shows that for the positive control, the same result as the amplification result shown in FIG. 8 is obtained, but also for the negative control, the fluorescence signal intensity starts to rise after 30 cycles.
  • the Ct values of the first negative control and the second negative control were 41.89 and 41.41, respectively.
  • the level of this Ct value corresponds to the initial concentration of the sample of approximately 1 ⁇ 10 2 Copies / ⁇ L in the calibration curve shown in FIG. 11.
  • the initial concentration of the sample is If it is 1 ⁇ 10 2 Copies / ⁇ L or less, there is a possibility that it may be unclear whether the detection is actually positive or the detection due to carryover.
  • filters are provided at both ends of the flow path 12 of the reaction processing vessel 10. These filters are effective in preventing or suppressing carryover.
  • a filter that is, the first filter 28
  • it is desirable that a filter be provided at least at one end 12a of the flow path far from the high temperature region 36.
  • FIG. 14 is a view for explaining another embodiment of the reaction treatment apparatus.
  • a reaction processing apparatus 400 shown in FIG. 14 is an apparatus for performing a thermal cycle on a reaction processing container 510 provided with three levels of reaction regions of a high temperature region 536, an intermediate temperature region 538 and a low temperature region 534.
  • the reaction processing container 510 is provided with a first air communication port 524 and a second air communication port 526 at both ends of the flow path.
  • the reaction processing apparatus 400 includes two fluorescence detectors (a first fluorescence detector 251 and a second fluorescence detector 252).
  • the first fluorescence detector 251 has a first optical head 151 for detecting fluorescence from the sample 50 passing through a region between the high temperature region 536 and the middle temperature region 538 of the flow path of the reaction processing container 510;
  • a fluorescence detector driver 152 and a first optical fiber 153 connecting the first optical head 151 and the first fluorescence detector driver 152 are provided.
  • the second fluorescence detector 252 includes a second optical head 154 for detecting fluorescence from the sample 50 passing through a region between the medium temperature region 538 and the low temperature region 534 of the flow path of the reaction processing container 510, and A fluorescence detector driver 155 and a second optical fiber 156 connecting the second optical head 154 and the second fluorescence detector driver 155 are provided.
  • the liquid delivery system 120 via the tube 130 to the first air communication port 524 which is the air communication port far from the high temperature region 536.
  • the second air communication port 526 which is the air communication port closer to the high temperature region 536, is connected to the atmosphere and the effect of preventing or suppressing carryover is obtained.
  • the thermal cycle conditions hold the sample 50 for 3 seconds in the high temperature area 536 maintained at 95 ° C., and hold the sample 50 for 10 seconds in the low temperature area 534 maintained at 55 ° C.
  • the sample 50 is to be held for 10 seconds in an intermediate temperature area 538 maintained at 0 ° C., and this is repeated as one cycle.
  • the sample 50 may be held for about 2 minutes in the high temperature region 536 before starting the thermal cycle for the activation of the polymerase.
  • the present invention is applicable to polymerase chain reaction (PCR).
  • Sequence number 1 Forward PCR primer Sequence number 2: Reverse PCR primer sequence number 3: Probe

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Abstract

反応処理装置１００は、試料５０が移動する流路１２と、流路１２の両端に設けられた一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６とを備える反応処理容器１０と、流路１２における第１空気連通口２４と第２空気連通口２６の間に、中温領域３８と、高温領域３６とを提供する温度制御システム１０２と、試料５０を流路１２内で移動および停止させるために空気の吐出および吸引を行う送液システム１２０とを備える。反応処理容器１０の一対の空気連通口のうち高温領域３６から遠い方の第１空気連通口２４は、チューブ１３０を介して送液システム１２０に連通される。反応処理容器１０の一対の空気連通口のうち高温領域３６に近い方の第２空気連通口２６は、大気圧に開放される。

Description

反応処理装置
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置に関する。
　遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲを用いた方法は、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。
　ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。
　ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブ又は複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応処理容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応処理容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている（例えば特許文献１）。
特開２００９－２３２７００号公報
　ところで、ＰＣＲは、数百万ものＤＮＡの複製を合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の検体ＤＮＡから反応を開始する場合、前に行った反応の生成物のコンタミネーションが問題となる。以前に行った反応の生成物が、次の反応に影響を及ぼすような現象は、「キャリーオーバー」と称される。キャリーオーバーの防止や低減は非常に重要である。例えば標的配列を含む以前の反応生成物が反応系に１コピー混入しただけで結果の解釈を誤らせる可能性があるからである。
　本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＣＲにおけるキャリーオーバーを防止または少なくとも抑制できる反応処理装置を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料が移動する流路と、流路の両端に設けられた一対の空気連通口とを備える反応処理容器と、流路における一対の空気連通口の間に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも高い第２温度に維持された第２温度領域とを提供する温度制御手段と、試料を流路内で移動および停止させるために空気の吐出および吸引を行う送液システムとを備える。反応処理容器の一対の空気連通口のうち第２温度領域から遠い方の空気連通口は、チューブを介して送液システムに連通され、反応処理容器の一対の空気連通口のうち第２温度領域に近い方の空気連通口は、大気圧に開放される。
　送液システムは、一定の体積を有する内部空間と、内部空間と外部とを連通する第１空気口および第２空気口とを有するチャンバと、チャンバの内部空間に第１空気口から空気を吐出するよう配置された第１ポンプと、チャンバの内部空間に第２空気口から空気を吐出するよう配置された第２ポンプとを備えてもよい。チャンバの第１空気口は、チューブを介して反応処理容器の一対の空気連通口のうち第２温度領域から遠い方の空気連通口に連通され、チャンバの第２空気口は、大気圧に開放され、第１ポンプと第２ポンプは、交互に空気の吐出動作を行うよう制御されてもよい。
　反応処理容器の流路の両端のうち少なくとも第２温度領域から遠い方の流路端部に、フィルタが設けられてもよい。
　本発明によれば、ＰＣＲにおけるキャリーオーバーを防止または少なくとも抑制できる反応処理装置を提供できる。
図１（ａ）、図１（ｂ）および図１（ｃ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 反応処理容器が備える基板の平面図である。 反応処理容器の断面図であって、各部位と基板の主面との関係を説明するための図である。 試料が反応処理容器内に導入された様子を模式的に示す図である。 本発明の実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 送液システムの構成を説明するための概略図である。 反応処理容器の流路内の試料にサーマルサイクルを与えている様子を示す図である。 本実施形態に係る反応処理装置によるＰＣＲの増幅結果を示す図である。 本実施形態に係る反応処理装置によるＰＣＲの増幅結果を示す図である。 初期の検体濃度が異なる６個の検体に対するＣｔ値を示す表である。 図１０に示す初期濃度とＣｔ値の関係をプロットした検量線を示す図である。 比較例に係る反応処理装置を説明するための図である。 比較例に係る反応処理装置によるＰＣＲの増幅結果を示す図である。 反応処理装置の別の実施形態を説明するための図である。
　以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
　図１（ａ）、図１（ｂ）および図１（ｃ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、反応処理容器１０の正面図であり、図１（ｃ）は、反応処理容器１０の底面図である。図２は、反応処理容器１０が備える基板１４の平面図である。
　図３に反応処理容器１０の説明のための概念的な断面図を示す。反応処理容器１０は、下面１４ａに溝状の流路１２が形成された樹脂性の基板１４と、基板１４の下面１４ａ上に貼られた流路１２を封止するための流路封止フィルム１６と、同じく基板１４の下面１４ａに貼られた第１空気連通口２４および第２空気連通口２６を封止するための第１封止フィルム１８と、基板１４の上面１４ｂ上に貼られた第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を封止するための第２封止フィルム２０とから成る。図３は、これらが基板１４に対してどのように配置されているかを説明した図である。
　基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリプロピレン、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンポリマー樹脂（ＣＯＰ）が好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７６ｍｍ、短辺２６ｍｍ、厚み３ｍｍである。
　基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されている。反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。溝の断面形状は特に限定されるものではなく矩形状やＵ字形状（丸形状）でもよい。また、成形の際の離型性をよくするために下面１４ａから深さ方向にテーパー状に狭まる形状を備えていてもよく、例えば台形状であってもよい。流路１２の寸法の一例は、最大で幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。
　流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。
　基板１４には、流路１２の一端１２ａに通じる第１空気連通口２４が形成されている。同様に流路１２の他端１２ｂに通じる第２空気連通口２６が形成されている。一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６は、基板１４の下面１４ａに露出するように形成されている。すなわち一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６が露出している面は流路１２が形成されている面と同一である。
　基板１４中における第１空気連通口２４と流路１２の一端１２ａとの間には、第１フィルタ２８が設けられている。基板１４中における第２空気連通口２６と流路１２の他端１２ｂとの間には、第２フィルタ３０が設けられている。流路１２の両端に設けられた一対の第１フィルタ２８および第２フィルタ３０は、低不純物特性が良好であるほか、空気のみを通し、ＰＣＲによって目的のＤＮＡの増幅やその検出を妨げないように、または目的のＤＮＡの品質が劣化しないようにコンタミネーションを防止する。フィルタ材料としては、例としてポリエチレンを撥水処理したものを用いることができるが、上記の機能を備えるようなものであれば公知の材料から選択できる。第１フィルタ２８および第２フィルタ３０の寸法は、基板１４に形成されたフィルタ設置スペースに隙間なく収まるような寸法に形成され、例えば直径４ｍｍ、厚さ２ｍｍであってよい。
　また、流路１２は第２フィルタ直前で２系統になっている。蒸発した試料の一部が液滴となって流路内部に付着する場合があり、特に比較的高温に維持されることが予定されている第２フィルタ３０付近では付着した液滴が試料の液送を妨げる虞があり、それを補償するために２系統となっている。
　流路１２は、一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６の間に、後述する反応処理装置により複数水準の温度の制御が可能な反応領域を備える。複数水準の温度が維持された反応領域を連続的に往復するように試料を移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。
　流路１２の反応領域は、後述の反応処理装置に反応処理容器１０が搭載された際に、比較的高温（約９５℃）に維持される反応領域（以下「高温領域３６」と称する）と、高温領域３６よりも低温（約６２℃）に維持される反応領域（以下「中温領域３８」と称する）とを含む。高温領域３６は、流路１２における紙面右側に位置しており、その一端は第２フィルタ３０と第２空気連通口２６と第２フィルタ３０間の接続流路２６１を介して第２空気連通口２６に連通し、他端は接続流路４０を介して中温領域３８と連通している。中温領域３８は、流路１２における紙面中央に位置しており、その一端は接続流路４０を介して高温領域３６と連通し、他端は接続領域４１を介して後述する低温領域３４と連通している。
　高温領域３６および中温領域３８はそれぞれ、曲線部と直線部とを組み合わせた連続的に折り返す蛇行状の流路を含んでいる。このように蛇行状の流路とした場合、後述の温度制御手段を構成するヒータ等の限られた実効面積を有効に使うことができ、反応領域内での温度のばらつきを低減することが容易であるとともに、反応処理容器の実体的な大きさを小さくでき、反応処理装置の小型化に貢献できるという利点がある。一方、接続流路４０は、直線状の流路であってよい。
　流路１２はさらに、中温領域３８よりも低温に維持される領域（以下「低温領域３４」と称する）を含む。低温領域においては中温領域よりも低い温度で維持されるように制御されてもよいが、特に制御しなくてもよい。低温領域３４は、流路１２における紙面左側に位置しており、その一端は第１フィルタ２８と、第１空気連通口２４と第１フィルタ２８間の接続流路２４１を介して第１空気連通口２４と連通し、他端は接続領域４１を介して中温領域３８と連通している。
　低温領域３４は、所定量の試料を抽出する所謂分注を行うために利用される。低温領域３４は、所定量の試料を規定するための分注流路４２と、分注流路４２から分岐する２つの支流路（第１支流路４３および第２支流路４４）と、第１支流路４３の端に配置された第１試料導入口４５と、第２支流路４４の端に配置された第２試料導入口４６とを備える。第１試料導入口４５は、第１支流路４３を介して分注流路４２と連通している。第２試料導入口４６は、第２支流路４４を介して分注流路４２と連通している。分注流路４２は、最小限の面積で所定量の試料を分注するために蛇行状の流路とされている。第１試料導入口４５および第２試料導入口４６は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。すなわち、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６が露出している面は流路１２が形成されている面と反対側の面である。第１支流路４３が分注流路４２から分岐する分岐点を第１分岐点４３１とし、第２支流路４４が分注流路４２から分岐する分岐点を第２分岐点４４１としたとき、ＰＣＲに供される試料の体積は第１分岐点４３１と第２分岐点４４１の間の分注流路４２内の体積によってほぼ決まる。
　上述のように、第１フィルタ２８、第２フィルタ３０は、基板１４の下面１４ａに露出している。基板１４の下面１４ａには流路１２が形成されているので、流路１２を封止するための流路封止フィルム１６は図１（ｃ）で示したような第１フィルタ２８、第２フィルタ３０も同時に封止するような外形を有していてもよい。コーナー部は剥がれにくいように丸みを帯びた形状であってもよい。この実施形態においては流路封止フィルム１６として株式会社３Ｍ社製のポリプロピレンフィルム９７９５を用いた。
　また、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６も基板１４の下面１４ａに露出しているが、これらを封止するために図１（ｃ）で示したように流路封止フィルム１６とは別体の第１封止フィルム１８を用いた。
　さらに、第１試料導入口４５、第２試料導入口４６、接続流路２４１および２６１を封止するために図１（ａ）で示したように第２封止フィルム２０が基板１４の上面１４ｂに貼り付けられる。流路封止フィルム１６に加え、第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０を貼った状態では、全流路は閉空間となっている。
　本実施形態に係る反応処理装置１００では、第１空気連通口２４にのみ送液手段である加圧式ポンプ（後述する）が接続され、第２空気連通口２６は大気圧に開放される。加圧式ポンプと第１空気連通口２４の接続と第２空気連通口２６の開放は、これらに対応する部分の第１封止フィルム１８を剥がして第１空気連通口２４および第２空気連通口２６を露出させて行う。第１封止フィルム１８には、剥がすときに手指で持ちやすく容易に剥がす作業をできるように粘着性のないタブ１８１が形成されていてもよい。また、これらの連通口の開放は、ニードル等で第１封止フィルム１８の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６の該当箇所に穿孔することにより行ってもよい。このとき、第１封止フィルム１８は、ニードルによる穿孔が容易な材質や厚みから成るフィルムが好ましい。また逆に、第２空気連通口２６を加圧式ポンプと接続し、第１空気連通口２４を大気圧に開放してもよい。
　第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を通じての試料の反応処理容器１０内への導入は、第２封止フィルム２０の接続流路２４１および２６１が露出しない範囲で第１試料導入口４５および第２試料導入口４６の該当する部分のみを一旦、基板１４から剥がして行い、所定量の試料の導入後には第２封止フィルム２０を再び基板１４の上面１４ｂに戻し貼り付ける。そのため、第２封止フィルム２０としては、数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また第２封止フィルム２０は、試料導入後には新しいフィルムを貼り付ける態様であってもよく、この場合は繰り返しの貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。
　第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０は、流路封止フィルム１６と同様に、一方の主面に粘着剤層が形成され、または押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が形成されていてもよい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン又はアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また上述したように複数回の貼り付け／剥離によっても、その粘着性等の特性が使用に影響をきたす程度に劣化しないことが望ましいが、剥離して試料等の導入後に、新たなフィルムを貼り付ける態様である場合は、この貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。本実施形態においては、第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０として株式会社３Ｍ社製のポリプロピレンフィルム９７９３等を用いた。
　次に、以上のように構成された反応処理容器１０の使用方法について説明する。まず、サーマルサイクルにより増幅すべき試料を準備する。試料としては、例えば、一または二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として蛍光プローブ、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応するプライマーを混合する。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。
　次に、第２封止フィルム２０を接続流路２４１および２６１が露出しない範囲で第１試料導入口４５および第２試料導入口４６の該当する部分のみを基板１４から剥がし、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を露出、開放する。
　第２封止フィルム２０には、剥がすときに手指で持ちやすく容易に剥がす作業をできるように粘着性のないタブ２０１が形成されていてもよい。作業者はタブ２０１を持って、例えば図１（ａ）で示した点線（Ａ）の所まで第２封止フィルム２０を剥がす。
　次に、試料導入口に試料をピペッター、スポイトやシリンジ等で導入する。図４は、試料５０が反応処理容器１０内に導入された様子を模式的に示す。図４では、導入された試料５０と反応処理容器１０との関係を説明するためにフィルム等の記載を省略した。試料５０は、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６のいずれか一方から分注流路４２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイトで適量の試料５０を直接導入してよい。いずれか一方の試料導入口から導入された試料のうち、支流路の体積を超えて余剰なものはもう一方の試料導入口に溜まる。それ故試料導入口部分を一種のリザーバーとして活用する目的で、ある一定のスペースを有するように作製してもよい。後述するように、第１空気連通口２４からの加圧により、第１分岐点４３１および第２分岐点４４１間の分注流路４２に充填された試料５０がＰＣＲに供されることになる。このように、反応処理容器１０の低温領域３４は、所定量の試料を抽出する分注機能を果たす。
　次に、第２封止フィルム２０を再び基板１４に貼り戻し、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を封止する。封止した後は不要となるのでタブ２０１は切り取っておいてもよい。剥がした第２封止フィルム２０に代えて、新たな第２封止フィルム２０を貼ってもよい。以上で反応処理容器１０への試料５０の導入は完了である。
　上記の反応処理容器における分注機能は、ピペッターで試料を精密に分注しながら導入することを妨げるものではない。この場合、予め分注されているのであるから、いずれか一方の試料導入口から導入された試料の先端がもう一方の試料導入口側の分岐点に到達しなくてもよい。
　図５は、本発明の実施形態に係る反応処理装置１００を説明するための模式図である。上で説明した反応処理容器１０の形態においては、流路１２と第１空気連通口２４、第２空気連通口２６は反応処理容器１０の面１４ａに存在するため、流路１２と送液システム１２０からの接続部分は基板１４の同じ側に配置されるのが実際であるが、ここでは説明のために図面を理解しやすくするため、流路１２と送液システム１２０からの接続部分はあえて基板１４の異なる側に配置されるように記載されていること、また一対の空気連通口の間に各温度領域が存在するということを概念的にわかりやすく表現している点に留意されたい。
　本実施形態に係る反応処理装置１００は、反応処理容器１０が設置される容器設置部（図示せず）と、温度制御システム１０２と、ＣＰＵ１０５とを備える。温度制御システム１０２は、図５に示すように、容器設置部に設置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における高温領域３６を約９５℃、中温領域３８を約６２℃、低温領域３４を約３０℃～４０℃に精度よく維持、制御できるように構成されている。
　温度制御システム１０２は、サーマルサイクル領域の各温度領域の温度を調節するものであって、具体的には、流路１２の高温領域３６を加熱するための高温用ヒータ１０４と、流路１２の中温領域３８を加熱するための中温用ヒータ１０６と、流路１２の低温領域３４を加熱するための低温用ヒータ１１２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ１０４の温度を制御する高温用ヒータドライバ１０８と、中温用ヒータ１０６の温度を制御する中温用ヒータドライバ１１０と、低温用ヒータ１１２の温度を制御する低温用ヒータドライバ１１４とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ１０５に送られる。ＣＰＵ１０５は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム１０２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。
　本実施形態に係る反応処理装置１００は、さらに、試料５０を反応処理容器１０の流路１２内で移動および停止させるために空気の吐出および吸引を行う送液システム１２０を備える。
　図６は、送液システム１２０の構成を説明するための概略図である。送液システム１２０は、チャンバ１２５と、第１ポンプ１２２と、第２ポンプ１２４と、第１ポンプ１２２を駆動するための第１ポンプドライバ１２６と、第２ポンプ１２４を駆動するための第２ポンプドライバ１２８と、チューブ１３０とを備える。第１ポンプドライバ１２６および第２ポンプドライバ１２８は、ＣＰＵ１０５により制御される。
　チャンバ１２５は、一定の体積を有する内部空間１２５ａと、内部空間１２５ａと外部とを連通する第１空気口１２５ｂおよび第２空気口１２５ｃとを有する。チャンバ１２５の内部空間１２５ａには、第１ポンプ１２２および第２ポンプ１２４が配置される。第１ポンプ１２２および第２ポンプ１２４は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。第１ポンプ１２２は、吐出口１２２ａから吐出された空気がチャンバ１２５の第１空気口１２５ｂから排出されるように配置される。第２ポンプ１２４は、吐出口１２４ａから吐出された空気がチャンバ１２５の第２空気口１２５ｃから排出されるように配置される。
　チャンバ１２５の第１空気口１２５ｂは、チューブ１３０を介して反応処理容器１０の一対の空気連通口のうち高温領域３６から遠い方の空気連通口、すなわち第１空気連通口２４に連通される。一方、チャンバ１２５の第２空気口１２５ｃは、大気圧に開放される。このような接続状態において、ＣＰＵ１０５は、第１ポンプドライバ１２６および第２ポンプドライバ１２８を介して、第１ポンプ１２２と第２ポンプ１２４が交互に空気の吐出動作を行うよう制御する。第１ポンプ１２２の吐出動作が行われ、第２ポンプ１２４が停止されるとき、チューブ１３０内は正圧となり、チューブ１３０から反応処理容器１０の第１空気連通口２４に空気が吐出される。一方、第１ポンプ１２２が停止され、第２ポンプ１２４の吐出動作が行われるとき、チャンバ１２５第２空気口１２５ｃから空気が吐出されることによってチャンバ１２５の内部空間１２５ａが負圧となるので、チューブ１３０内も負圧となり、反応処理容器１０の第１空気連通口２４からチューブ１３０に空気が吸引される。チューブ１３０による空気の吐出または吸引により、試料５０を流路内で往復式に移動させて、反応処理容器１０の流路１２の各温度領域に繰り返し曝すことができ、その結果、試料５０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域３６において変性、中温領域３８においてアニーリング・伸長の各工程を繰り返し与えることにより、試料５０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域３６は変性温度域、中温領域３８はアニーリング・伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料５０が各温度領域の所定の位置で停止する時間を変えることによって適宜設定することができる。
　本実施形態に係る反応処理装置１００は、さらに、蛍光検出器１４０を備える。上述したように、試料５０には所定の蛍光プローブが添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料５０から発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。
　蛍光検出器１４０としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料５０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適しており応答スピードも優れている。
　光ファイバ型の蛍光検出器１４０は、光学ヘッド１４２と、蛍光検出器ドライバ１４４と、光学ヘッド１４２と蛍光検出器ドライバ１４４とを接続する光ファイバ１４６とを備える。蛍光検出器ドライバ１４４には励起光用光源（ＬＥＤ、レーザその他特定の波長を出射するように調整された光源）、光ファイバ型合分波器および光電変換素子（ＰＤ，ＡＰＤ又はフォトマル等の光検出器）（いずれも図示せず）等が含まれており、これらを制御するためのドライバ等からなる。光学ヘッド１４２はレンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。集光された蛍光は光ファイバ１４６を通じて蛍光検出器ドライバ１４４内の光ファイバ型合分波器により励起光と分けられ、光電変換素子によって電気信号に変換される。
　本実施形態に係る反応処理装置１００においては、高温領域３６と中温領域３８とを接続する流路内の試料５０からの蛍光を検出することができるように光学ヘッド１４２が配置される。試料５０は流路内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料５０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる。また、本実施形態に係る反応処理装置１００においては、後述するように、蛍光検出器１４０からの出力値を利用して、試料５０の移動制御に活用する。蛍光検出器は、試料からの蛍光を検出する機能を発揮するものであれば光ファイバ型蛍光検出器に限定されない。
　図５を参照して、反応処理装置１００により試料５０にサーマルサイクルを与える動きについて説明する。試料５０が充填された反応処理容器１０を反応処理装置１００にセットし、反応処理容器１０の第１空気連通口２４をチューブ１３０を介してチャンバ１２５の第１空気口１２５ｂに接続し、反応処理容器１０の第２空気連通口２６を大気圧に開放する。その後、第１ポンプ１２２のみを作動させることによりチューブ１３０内を正圧とし、低温領域３４内の試料５０を中温領域３８または高温領域３６に移動させる。試料５０を高温領域３６から中温領域３８に向かって移動させる場合は、第２ポンプ１２４のみを動作させる。これによりチューブ１３０内が負圧となるので、試料５０は高温領域３６から中温領域３８に向かって移動する。一方、試料５０を中温領域３８から高温領域３６に向かって移動させる場合は、第１ポンプ１２２のみを動作させる。これによりチューブ１３０内が正圧となるので、試料５０は中温領域３８から高温領域３６に向かって移動する。その後、第１ポンプ１２２と第２ポンプ１２４を交互に動作させることにより試料５０を高温領域３６と中温領域３８との間で連続的に往復移動させて、試料５０にサーマルサイクルを与えることができる。
　図７は、反応処理容器１０の流路内の試料にサーマルサイクルを与えている様子を示す図である。図７に示す反応処理容器１０では、低温領域３４の第１分岐点４３１および第２分岐点４４１間の分注流路４２に充填された試料５０が、高温領域３６と中温領域３８の間を移動されている。
　以上説明したように、本実施形態に係る反応処理装置１００では、高温領域３６から遠い第１空気連通口２４にのみチューブ１３０を介して送液システム１２０を接続し、高温領域３６に近い第２空気連通口２６は大気圧に開放した。ＰＣＲにおけるキャリーオーバーは、増幅された一部のＤＮＡ断片がチューブ１３０内の空気中にエアロゾル等の形態で浮遊もしくは付着し、これが反応処理容器１０内の試料に混じりこんだことにより生じると考えられる。ＤＮＡ断片のエアロゾルは、ＤＮＡ断片が混ざった液体が気化するときに発生することが多いと考えられる。気化現象は当然に試料（溶液）の蒸気圧が高いほど生じやすいので、気化現象の比較的生じやすい高温領域３６側の空気連通口（すなわち高温領域３６に近い第２空気連通口２６）は開放し、気化現象の比較的生じにくい中温領域３８側の空気連通口（すなわち高温領域３６から遠い第１空気連通口２４）のみに送液システム１２０を連通することで、ＤＮＡ断片がチューブ１３０内にエアロゾルとして持ち込まれにくく、キャリーオーバーを防止または少なくとも抑制することができる。
　以上のように構成された反応処理装置１００の効果を確認するために、特定の菌株を本実施形態に係る反応処理装置１００により、ＰＣＲで増幅する実験を行った。ＰＣＲに供する試料の調整は以下のようにした。ここでは、大阪市水道局のホームページに公開された文献「遺伝子検査法を用いた大腸菌迅速測定法」（http://www.city.osaka.lg.jp/suido/cmsfiles/contents/0000245/245422/6_250227.pdf）に記載の事項を参考にした。
（ｉ）フォワードプライマーに5'-GTG TGA TAT CTA CCC GCT TCG C-3'（配列番号１）；リバースプライマーに5'-AGA ACG GTT TGT GGT TAA TCA GGA-3'（配列番号２）を用い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして5'-FAM-TCG GCA TCC GGT CAG TGG CAG T-MGB-3'（配列番号３）を選定した。また、各プライマーの濃度（最終濃度）は、それぞれ９００ｎＭ（ｎＭ：ナノモラー：ナノモル／リットル）、９００ｎＭ及び２５０ｎＭとした。
（ｉｉ）上記（ｉ）で増幅される領域の鋳型ＤＮＡを合成ＤＮＡ製造メーカーに依頼し１×１０６Ｃｏｐｉｅｓ／μＬ濃度で作製。これから１０倍の希釈列からなる標準検体（１×１０１～１×１０６Ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）を作製した。
（ｉｉｉ）さらに、試薬には、ＤＮＡポリメラーゼとしてタカラバイオ株式会社製ＳｐｅｅｄＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．１Ｕ／μＬと、これに付属の×１０Ｆａｓｔ　ｂｕｆｆｅｒ　ＩとｄＮＴＰ　Ｍｉｘとを説明書通りに混合して添加した。なお、［Ｕ／μＬ］の「Ｕ」＝ユニットは、酵素活性量の単位であり、至適条件で酵素が１分間に１μｍｏｌ(１×１０－６ｍｏｌ)の基質を変換することができる酵素の量が１Ｕと定義され、大まかには酵素の量を表す。
（ｉｖ）この試薬２４μＬに、（ｉｉ）で作成した濃度の異なる標準検体１μＬを添加し試料とした。さらに、ネガティブコントロール（ネガコン）の試料として標準検体を添加しない試薬を準備した。なお、ネガティブコントロールとは、効果の対照実験で陰性と結果されるべき対照（試料）であり、この場合はＰＣＲを行っても、菌は含まれない（陰性）という結果をもたらすものである。この反対はポジティブコントロール（ポジコン）であり、上記の標準検体が該当し、ＰＣＲを行うことにより菌が含まれる（陽性）という結果をもたらすものである。
　上記のようにして作製した試料のうち、濃度が１×１０６Ｃｏｐｉｅｓ／μＬの検体を含む試料をポジコン試料とし、ネガコン試料と交互にＰＣＲによる増幅を行った。試料の１５μＬを、上述した反応処理容器１０にピペッターで導入した。さらに反応処理容器１０には分注をすることのできる分注流路４２が備えられているので、反応処理容器１０を変更しても、その都度の試料のボリュームの違いによる結果の誤判定を低減することが可能となっている。
　サーマルサイクルに供される試料は、上述の反応処理容器１０における高温領域３６と中温領域３８の間で往復移動を繰り返す。サーマルサイクル条件は、６２℃に維持された中温領域３８（アニーリング・伸長領域）で試料を１０秒間保持し、９５℃に維持された高温領域３６（熱変性領域）で試料を３秒間保持するものとし、これを１サイクルとして繰り返した。低温領域３４の温度は、３０～４０℃程度に維持した。
　図８は、本実施形態に係る反応処理装置１００によるＰＣＲの増幅結果を示す。図８において、横軸はサイクル数（Ｃ）であり、縦軸は蛍光信号強度（任意単位）である。上述の反応処理装置１００を用いて、サイクル数に対する蛍光検出器１４０で検出される蛍光信号の強度を測定した。試料中の検体が増幅すると、蛍光信号の強度が増加する。図８は、ポジコン試料のＰＣＲとネガコン試料のＰＣＲを交互に３回ずつ行った結果を示す。図８に示すように、ポジコン試料の場合の蛍光信号強度は、２６サイクル付近から急激に立ち上がっており、ポジコン試料中の検体が増幅していることが分かる。一方、ネガコン試料の場合の蛍光信号強度は、５０サイクルを行った後もほぼ一定（バックグラウンドレベル）であり、キャリーオーバーは発生していないか無視できる程度に小さいことが分かる。
　図９も、本実施形態に係る反応処理装置１００によるＰＣＲの増幅結果を示す。ここでは、初期濃度が１×１０１～１×１０６Ｃｏｐｉｅｓ／μＬ（１０倍きざみ）の６個の検体を含む試料に対しＰＣＲを行った。図９から、初期の検体濃度が高くなるにつれ、蛍光信号強度が立ち上がるサイクル数、すなわち検体の増幅が開始するサイクル数が少なくなることが分かる。
　図１０は、初期の検体濃度が１×１０１～１×１０６Ｃｏｐｉｅｓ／μＬの６個の検体に対するＣｔ値（スレッシュホールドサイクル数）を示す表である。ここでは、Ｃｔ値を各増幅曲線のプラトーの１０％に定めた。
　図１１は、図１０に示す初期濃度とＣｔ値の関係をプロットした検量線を示す。図１１から検量線の傾き（Ｓ）を求めると、－３．５５となる。また、ＰＣＲ効率（１０（－１／Ｓ）－１）を計算すると、９１．２％となり、良好なＰＣＲがなされていることが分かる。
　次に、比較例について説明する。図１２は、比較例に係る反応処理装置２００を説明するための図である。この比較例に係る反応処理装置２００は、送液システム２２０の構成が図５に示す反応処理装置１００の送液システム１２０と異なる。送液システム２２０は、第１ポンプ２２２と、第２ポンプ２２４と、第１ポンプ２２２を駆動するための第１ポンプドライバ２２６と、第２ポンプ２２４を駆動するための第２ポンプドライバ２２８と、第１チューブ２３０と、第２チューブ２３２とを備える。
　送液システム２２０では、第１ポンプ２２２および第２ポンプ２２４はチャンバ内でなく、大気圧中に配置されている。そして、反応処理容器１０の第１空気連通口２４は、第１チューブ２３０を介して第１ポンプ２２２の吐出口に連通され、反応処理容器１０の第２空気連通口２６は、第２チューブ２３２を介して第２ポンプ２２４の吐出口に連通される。第１空気連通口２４と第１チューブ２３０の接続部および第２空気連通口２６と第２チューブ２３２の接続部にはそれぞれ気密性を確保するためのパッキン２３４，２３６やシールが配置されてもよい。
　このように構成および配置された送液システム２２０において、第１ポンプ２２２と第２ポンプ２２４を交互に吐出動作させると、試料５０を反応処理容器１０の流路１２内で往復移動させることができる。
　図１３は、比較例に係る反応処理装置２００によるＰＣＲの増幅結果を示す。図１３において、横軸はサイクル数（Ｃ）であり、縦軸は蛍光信号強度（任意単位）である。試料は図８で説明した実験と同様に調整して得たポジコンとネガコンを準備したうえで、交互に２回ずつＰＣＲを行った。図１３に示す増幅曲線から、ポジコンについては図８に示す増幅結果と同様の結果が得られているが、一方、ネガコンについても、３０サイクル以上で蛍光信号強度が立ち上がり始めることが分かる。１回目のネガコンと２回目のネガコンのＣｔ値は、それぞれ４１．８９および４１．４１であった。このＣｔ値のレベルは、図１１に示す検量線においては検体の初期濃度がほぼ１×１０２Ｃｏｐｉｅｓ／μＬに対応するものであり、比較例に係る反応処理装置２００では、検体の初期濃度が１×１０２Ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以下であった場合は、実際に陽性であるのか、キャリーオーバーに起因する検出なのか分からなくなってしまう虞が生じる。
　一方、本発明の実施形態に係る反応処理装置１００においては、このようなキャリーオーバーの防止を図ることができるので、例えば１×１０１Ｃｏｐｉｅｓ／μＬレベルかそれ以下の初期濃度であっても、定量可能である。
　図８に示す増幅結果から分かるように、送液システム１２０を反応処理容器１０の第１空気連通口２４のみに連通した本実施形態に係る反応処理装置１００では、ネガコンにおいてキャリーオーバーは発生しなかった。一方、図１３に示す増幅結果から分かるように、送液システム２２０を反応処理容器１０の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６に連通した比較例に係る反応処理装置２００では、ネガコンにおいてキャリーオーバーが発生した。従って、これらの実験結果から、ＰＣＲにおけるキャリーオーバーは、ポジコンで増幅されたＤＮＡ断片がチューブ内の空気中にエアロゾルとして浮遊し、これが反応処理容器１０内の試料に混じりこんだことが原因と考えられる。
　また、本実施形態においては、反応処理容器１０の流路１２の両端にフィルタが設けられている。これらのフィルタは、キャリーオーバーを防止または抑制する上で有効である。特に、ＤＮＡ断片がチューブ１３０内にエアロゾルとして持ち込まれにくくなることを考慮すると、少なくとも高温領域３６から遠い方の流路の一端１２ａにフィルタ（すなわち第１フィルタ２８）が設けられること望ましい。
　図１４は、反応処理装置の別の実施形態を説明するための図である。図１４に示す反応処理装置４００は、高温領域５３６、中温領域５３８および低温領域５３４の３水準の反応領域を備える反応処理容器５１０に対してサーマルサイクルを行うための装置である。反応処理容器５１０は、流路の両端に第１空気連通口５２４および第２空気連通口５２６を備える。
　反応処理装置４００は、２つの蛍光検出器（第１蛍光検出器２５１および第２蛍光検出器２５２）を備える。第１蛍光検出器２５１は、反応処理容器５１０の流路の高温領域５３６と中温領域５３８との間の領域を通過する試料５０からの蛍光を検出するための第１光学ヘッド１５１と、第１蛍光検出器ドライバ１５２と、第１光学ヘッド１５１と第１蛍光検出器ドライバ１５２とを接続する第１光ファイバ１５３とを備える。第２蛍光検出器２５２は、反応処理容器５１０の流路の中温領域５３８と低温領域５３４との間の領域を通過する試料５０からの蛍光を検出するための第２光学ヘッド１５４と、第２蛍光検出器ドライバ１５５と、第２光学ヘッド１５４と第２蛍光検出器ドライバ１５５とを接続する第２光ファイバ１５６とを備える。
　図１４に示すような３水準の反応領域を備える反応処理容器５１０に対しても、高温領域５３６から遠い方の空気連通口である第１空気連通口５２４にチューブ１３０を介して送液システム１２０を接続し、高温領域５３６に近い方の空気連通口である第２空気連通口５２６は大気圧に開放することにより、キャリーオーバーの防止または抑制効果が得られる。
　反応処理装置４００において、サーマルサイクル条件は、例えば、９５℃に維持された高温領域５３６で試料５０を３秒間保持し、５５℃に維持された低温領域５３４で試料５０を１０秒間保持し、７０℃に維持された中温領域５３８で試料５０を１０秒間保持するものとし、これを１サイクルとして繰り返す。３水準の反応領域でＰＣＲを行う場合、試料５０の調整の容易性や添加剤の選択の幅の拡大等の観点において有利である。さらに、ポリメラーゼの活性化のためにサーマルサイクルを開始する前に高温領域５３６で２分間程度試料５０を保持してもよい。
　以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
　１０，５１０　反応処理容器、　１２　流路、　１４　基板、　１６　流路封止フィルム、　１８　第１封止フィルム、　２０　第２封止フィルム、　２４，５２４　第１空気連通口、　２６，５２６　第２空気連通口、　２８　第１フィルタ、　３０　第２フィルタ、　３４，５３４　低温領域、　３６，５３６　高温領域、　３８，５３８　中温領域、　４０，４１　接続領域、　４２　分注流路、　４３　第１支流路、　４４　第２支流路、　４５　第１試料導入口、　４６　第２試料導入口、　５０　試料、　１００，２００，４００　反応処理装置、　１０２　温度制御システム、　１０４　高温用ヒータ、　１０５　ＣＰＵ、　１０６　中温用ヒータ、　１０８　高温用ヒータドライバ、　１１０　中温用ヒータドライバ、　１１２　低温用ヒータ、　１１４　低温用ヒータドライバ、　１２０，２２０　送液システム、　１２２，２２２　第１ポンプ、　１２４，２２４　第２ポンプ、　１２５　チャンバ、　１２５ａ　内部空間、　１２５ｂ　第１空気口、　１２５ｃ　第２空気口、　１２６，２２６　第１ポンプドライバ、　１２８，２２８　第２ポンプドライバ、　１３０，２３０，２３２　チューブ、　１３６，２３４，２３６　パッキン、　１４０　蛍光検出器、　１４２　光学ヘッド、　１４４　蛍光検出器ドライバ、　１４６　光ファイバ、　１５１　第１光学ヘッド、　１５２　第１蛍光検出器ドライバ、　１５３　第１光ファイバ、　１５４　第２光学ヘッド、　１５５　第２蛍光検出器ドライバ、　１５６　第２光ファイバ、　１８１，２０１　タブ、　２４１，２６１　接続流路、　２５１　第１蛍光検出器、　２５２　第２蛍光検出器、　４３１　第１分岐点、　４４１　第２分岐点。
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。
配列番号１：フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２：リバースＰＣＲプライマー
配列番号３：プローブ

Claims (3)

  1. 　試料が移動する流路と、前記流路の両端に設けられた一対の空気連通口とを備える反応処理容器と、
    　前記流路における前記一対の空気連通口の間に、第１温度に維持された第１温度領域と、前記第１温度よりも高い第２温度に維持された第２温度領域とを提供する温度制御手段と、
    　試料を前記流路内で移動および停止させるために空気の吐出および吸引を行う送液システムと、
    　を備える反応処理装置であって、
    　前記反応処理容器の前記一対の空気連通口のうち前記第２温度領域から遠い方の空気連通口は、チューブを介して前記送液システムに連通され、
    　前記反応処理容器の前記一対の空気連通口のうち前記第２温度領域に近い方の空気連通口は、大気圧に開放されることを特徴とする反応処理装置。
  2. 　前記送液システムは、
    　一定の体積を有する内部空間と、内部空間と外部とを連通する第１空気口および第２空気口とを有するチャンバと、
    　前記チャンバの内部空間に前記第１空気口から空気を吐出するよう配置された第１ポンプと、
    　前記チャンバの内部空間に前記第２空気口から空気を吐出するよう配置された第２ポンプと、を備え、
    　前記チャンバの第１空気口は、前記チューブを介して前記反応処理容器の前記一対の空気連通口のうち前記第２温度領域から遠い方の空気連通口に連通され、
    　前記チャンバの第２空気口は、大気圧に開放され、
    　前記第１ポンプと前記第２ポンプは、交互に空気の吐出動作を行うよう制御されることを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
  3. 　前記反応処理容器の前記流路の両端のうち少なくとも前記第２温度領域から遠い方の流路端部に、フィルタが設けられることを特徴とする請求項１または２に記載の反応処理装置。
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