WO2018230319A1 - イメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置およびマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法 - Google Patents

イメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置およびマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法 Download PDF

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WO2018230319A1
WO2018230319A1 PCT/JP2018/020343 JP2018020343W WO2018230319A1 WO 2018230319 A1 WO2018230319 A1 WO 2018230319A1 JP 2018020343 W JP2018020343 W JP 2018020343W WO 2018230319 A1 WO2018230319 A1 WO 2018230319A1
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observation
image
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confocal
multispectral
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PCT/JP2018/020343
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Inventor
木島　公一朗
バーラム ジャラリ
Original Assignee
木島　公一朗
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01B—MEASURING LENGTH, THICKNESS OR SIMILAR LINEAR DIMENSIONS; MEASURING ANGLES; MEASURING AREAS; MEASURING IRREGULARITIES OF SURFACES OR CONTOURS
    • G01B11/00—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques
    • G01B11/24—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques for measuring contours or curvatures
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a multispectral coded confocal observation device having a guidance function of an observation position for an apparatus user, and an image guidance method of an observation position in confocal observation using multispectral coding.
  • the multispectral coded confocal observation device uses a light source in a wide wavelength band and irradiates light diffracted by a diffraction grating at different angles depending on the wavelength to different positions of the object to be observed, thereby converting the position information into wavelength information.
  • it means an observation device that obtains positional information of the non-observed object by measuring the reflectance of each wavelength from the non-observed object.
  • Patent Document 1 The technology of the confocal microscope using multispectral coding invented by Web, Robert H. et al. (Patent Document 1) is a one-dimensional position of an unobserved object by diffracting light using a multispectral coding technique. This is a method of acquiring one-dimensional position information without using a driving component by converting information into wavelength information and measuring the reflectance of each wavelength. Then, by combining with a means for moving the head in an axis different from the direction in which the light spreads by this diffraction, it is possible to obtain a two-dimensional image even though the moving mechanism is uniaxial.
  • the light emitted from the light source 1 in the wide wavelength range passes through the optical fiber 11 and the circulator 15 and is then emitted into the space from the end of the fiber 12. Then, the light is collimated by the collimating lens 21 and irradiated to the grating 30.
  • the light in the wide wavelength range irradiated on the grating 30 is diffracted to an angle corresponding to the wavelength, and then focused by the objective lens 22 at a different position for each wavelength in the observation sample 10.
  • Reflected light from the observation sample is diffracted by the grating at a diffraction angle corresponding to each wavelength, and is guided through the optical fiber 12 again. After being guided to the optical fiber 13 by the circulator 15, it is guided to the wavelength meter 35.
  • the reflectance of each wavelength in the observation sample 10 that is, the reflectance of each position can be obtained.
  • the confocal observation apparatus 201 using multispectral coding does not have a function of outputting information that presents information indicating which position is being observed, in addition to the wavelength information output by the wavelength meter 35. Therefore, when an observer wants to specify a place to observe, the camera 40 is prepared as shown in FIG.
  • the image observed by the camera 40 is an image observed using the optical lens 41 different from the objective lens 22 of the confocal microscope 201 using multispectral encoding, the camera 40 is removed. Alignment is required whenever the observation system changes.
  • Patent Document 2 Barram Jalari et al. Reported a confocal observation device (Patent Document 2) using multispectral coding in which position information is converted into time information by guiding wavelength information converted from position information to a distributed optical fiber. . Since this method can read information such as the amount of light at each wavelength, that is, the reflectance at each position at high speed, it has made it possible to observe an observation object that changes at high speed.
  • FIG. 2 shows a configuration example in which a confocal observation device 202 using multispectral coding for acquiring position information at high speed is attached to the optical microscope 101.
  • the confocal observation apparatus 202 includes a grating unit 203 and a light source unit 204 including a light source, a dispersed optical fiber, and a light receiving unit.
  • the grating unit 203 and the light source unit 204 are optically connected by the optical fiber 12.
  • the grating unit 203 is connected to the camera connection unit 81 of the optical microscope 101.
  • the collimating lens 21 converts the light into parallel light and irradiates the grating 30.
  • Light in a wide wavelength range irradiated on the grating 30 is diffracted to an angle corresponding to each wavelength, and then focused by the scan lens 23 at a different position for each wavelength on the imaging surface 45 of the camera connection unit 81.
  • the observation surface of the observation sample 10 disposed at the focal position of the objective lens 24 is in a confocal positional relationship with the imaging surface 45 that is an imaging position by the imaging lens 25.
  • the light focused on a different position for each wavelength on the surface 45 is reduced and projected onto the observation surface of the observation sample 10 at a predetermined magnification.
  • the light reflected from the observation surface of the observation sample 10 passes through the objective lens 24, the imaging lens 25, and the scan lens 23, is reflected by the grating 30, and then guides the optical fiber 12 through the collimator lens 21. Thereafter, the light is guided through the circulator 15 and the wavelength dispersion fiber 14 with an optical amplification function, and is incident on the light receiving element 36.
  • the light emitted from the pulse laser light source 2 having a wide wavelength range has an extremely short pulse time when it is emitted from the pulse laser light source 2, but the pulse time is somewhat due to the wavelength dispersion existing in the optical fibers 11 and 12.
  • the pulse time is somewhat extended by the wavelength dispersion existing in the optical fiber 12, and then the pulse time is positively extended by the wavelength dispersion fiber 14 with an optical amplification function,
  • the wavelength information is sufficiently converted into time information at the time of incidence on the light receiving element 36, and the intensity of each wavelength, that is, the position of the observation sample 10 is obtained by analyzing the amount of light received by the light receiving element with the digitizer 37. Information will be obtained.
  • the optical camera 42 is connected to the other camera connection part 82 of the optical microscope 101.
  • the image of the observation sample 10 mounted on the sample stage 9 is imaged on the image sensor 43 in the camera 42 by the objective lens 24 and the imaging lens 25 according to the insertion / extraction of the switching mirror 51. It is an arrangement.
  • the image observed by the objective lens 24 in the configuration of the optical microscope 101 shown in FIG. 2 is the image plane in the grating unit 203 disposed in the camera connection unit 81 when the switching mirror 51 is inserted in the optical path.
  • the switching mirror 51 is retracted to the retracting position 52 in the switching mirror unit 55 and excluded from the optical path, the image is disposed at the image forming position in the camera 42 connected to the camera connection unit 82.
  • the observation mirror 10 can be observed by the camera 42 by retracting the switching mirror 51, and can be observed by the confocal observation device 202 using multispectral coding by inserting the switching mirror 51 into the optical path. It becomes. If the optical microscope 101 is modified to replace the switching mirror 51 with a dichroic mirror that reflects near-infrared wavelengths and transmits visible light, it is possible to perform both microscopic image observation and multispectral coding without moving the switching mirror 51. Observation by the focus observation device 202 is possible.
  • microscope image observation and multispectral encoding can be used without moving the switching mirror 51.
  • both the laser beam emitted from the confocal observation device 202 and the reflected light from the observation sample 10 are partially transmitted through the mirror unit. As a result, signal quality is deteriorated due to insufficient light quantity.
  • FIG. 3 shows the structure of the observation sample 10 as an example.
  • a flow path 91 having both a straight line portion 91a and a curved line portion 91b is formed, and the cell 95 flows in the direction indicated by the arrow 92 together with the liquid therein, and the observer determines the size of the cell 95.
  • Observation is performed at the first observation position 96. Since the wavelength used for observation in the confocal observation apparatus 202 using multispectral coding is generally a near infrared wavelength that cannot be observed by an imaging element made of a silicon material, a half mirror is used as the switching mirror 51. Even if they are arranged, the observation position by the confocal observation device 202 cannot be observed by the camera 42.
  • the observer searches for the position of the sample stage 9 on which the sample 10 is mounted at a position where the cell 95 can be sufficiently observed while observing the signal output from the digitizer 37 in a state where the cell 95 flows in the flow channel 91.
  • the observation position is adjusted.
  • preliminary measurement for position adjustment is performed in a state where the cells 95 are flowed through the flow channel 91, a part of the owned cells 95 is consumed in the adjustment step before the observation is started.
  • a preliminary measurement for position adjustment is required every time the observation sample 10 is replaced.
  • the grating unit 203 is connected from the camera connection unit 81 of the optical microscope 101. It is necessary to remove it once, attach it again so that it becomes a predetermined angle, and perform a preliminary measurement for position adjustment again.
  • the purpose of the measurement is to detect whether circulating cancer cells (CTC) are present in the blood collected from the patient, a part of the blood collected from the patient is wasted by performing a preliminary measurement. Therefore, it is desirable not to perform preliminary measurement.
  • CTC circulating cancer cells
  • the present invention has been made in consideration of the above points, and intends to propose a confocal observation apparatus in which the observation position can be easily adjusted. It is another object of the present invention to propose a confocal observation apparatus and a position adjustment method that can omit a preliminary measurement process for position adjustment in which measurement is performed by the confocal observation apparatus.
  • information on the observation target is acquired by irradiating the observation target with laser light emitted from a pulsed laser light source and detecting wavelength information of the reflected light.
  • an observation block is magnified or reduced in size with an optical block in which a movable mirror and a movable grating for adjusting the observation position and an image sensor for observing an image of the observation target are arranged.
  • the observation position is easily adjusted by connecting to the optical system housing with one optical connection portion and displaying information on the irradiation position of the laser beam on the observation target to the operator.
  • the information on the irradiation position of the laser light on the observation target is information superimposed on the image information on the observation target photographed by the image sensor.
  • an optical system housing for performing an observation or reduction observation of an observation object, a movable mirror and a movable grating for adjusting the observation position, and an imaging device for observing an image of the observation object.
  • the optical connection part that connects the arranged optical blocks has the function of being a rotatable optical connection part.
  • the image guidance method of the observation position for the operator in the multispectral coded confocal observation apparatus of the present invention includes the position information of the movable mirror and the movable grating for adjusting the observation position even in a state where the pulse laser light source does not emit light.
  • the observation position can be easily adjusted by providing the operator with an image obtained by superimposing the information on the observation position on the image of the observation sample by the image sensor from the wavelength information of the pulse laser light source.
  • the observation position can be easily adjusted without performing preliminary measurement. There is no need to use a sample for preliminary measurement for adjusting the observation position.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a confocal microscope using multispectral encoding.
  • FIG. It is a confocal observation apparatus block diagram combined with the optical microscope. It is a schematic explanatory drawing of an observation sample. It is a confocal observation apparatus block diagram by 1st Embodiment. It is a confocal observation apparatus block diagram combined with the optical microscope. It is observation position guidance explanatory drawing. It is an apparatus block diagram for obtaining calibration information. It is a process flow figure for obtaining calibration information. It is a guidance image creation flowchart. It is a confocal observation apparatus block diagram by 2nd Embodiment. It is observation position guidance explanatory drawing. It is a confocal observation apparatus block diagram by 3rd Embodiment. It is observation position guidance explanatory drawing. It is a confocal observation apparatus block diagram combined with a telescope lens.
  • FIG. 5 shows a configuration example in which the confocal observation device 205 is attached to the camera connection unit 83 of the optical microscope 101.
  • the confocal observation device 205 includes a grating unit 206 and a light source unit 207.
  • the grating unit 206 and the light source unit 207 are optically connected by the optical fiber 12, and a fiber connector 71 attached to the optical fiber 12 is connected to the grating unit 206.
  • the grating unit 206 and the optical microscope 101 are connected to each other by forming the camera connector 84 corresponding to the camera connection unit 83 of the optical microscope 101 on the grating unit 206. Connected.
  • the light emitted from the pulsed laser light source 2 having a wide wavelength range passes through the optical fiber 11, the circulator 15 and the optical fiber 12, and then is emitted from the end of the optical fiber connector 71 to the space.
  • the collimated lens 21 converts the light into parallel light, reflects the movable mirror 32, and irradiates the movable grating 31.
  • the light in the wide wavelength range irradiated on the movable grating 31 is diffracted to an angle corresponding to each wavelength, and then aligned with the position corresponding to each wavelength on the first imaging surface 45 of the camera connection unit 83 by the scan lens 23. Be burned
  • a dichroic mirror 53 that reflects visible light and transmits near-infrared light that is the wavelength band of the pulse laser 2 is disposed. Since the dichroic mirror 53 is disposed on the imaging surface of the camera connection portion 83 that is in a confocal positional relationship with the observation surface of the observation sample 10 disposed at the focal position of the objective lens 24 in the optical microscope 101, Two are formed, a first imaging surface 45 on which light in the near-infrared light band that is the wavelength band of the pulse laser 2 is imaged and a second imaging surface 46 on which visible light is imaged. The light focused on different positions for each wavelength on the first imaging plane 45 is transmitted through the dichroic mirror 53 and then at a magnification determined by the imaging lens 25 and the objective lens 24. Is reduced and projected.
  • the reflected light of the laser light projected onto the observation surface of the observation sample 10 is transmitted through the objective lens 24, the imaging lens 25, the dichroic mirror 53, and the scan lens 23, and then reflected by the movable grating 31 and the movable mirror 32.
  • the light is condensed by the collimating lens 21 and guided again through the optical fiber 12. Thereafter, the light is guided through the circulator 15 and the dispersion fiber 14 with an optical amplification function, and is incident on the light receiving element 36.
  • the light emitted from the pulse laser light source 2 having a wide wavelength range has an extremely short pulse time when it is emitted from the pulse laser light source 2, but the pulse time is somewhat due to the wavelength dispersion existing in the optical fibers 11 and 12.
  • the pulse time is somewhat extended by the wavelength dispersion existing in the optical fiber 12, and then the pulse time is positively extended by the wavelength dispersion fiber 14 with an optical amplification function,
  • the wavelength information is sufficiently converted into time information at the time of incidence on the light receiving element 36, and the intensity of each wavelength, that is, the position of the observation sample 10 is obtained by analyzing the amount of light received by the light receiving element with the digitizer 37. Information will be obtained.
  • the wavelength dispersion fiber 14 with an optical amplification function only needs to have a function with different propagation speeds depending on the wavelength of incident light, but the signal noise is obtained by optical amplification at the same time as time dispersion gives dispersion. This is a desirable configuration.
  • the movable grating 31 and the movable mirror 32 are mounted on the scan motors 33 and 34, respectively, so that the reflection angle can be adjusted.
  • the movable grating 31 is formed with a one-dimensional grating, and the movable direction of the movable grating 31 is the direction indicated by the arrow 33a, that is, the imaging.
  • the surface 45 is movable in a direction parallel to the direction of the diffracted light of the one-dimensional grating, and the movable direction of the movable mirror 32 is perpendicular to the direction of the diffracted light of the one-dimensional grating on the imaging surface 45 as indicated by an arrow 34a. It shall be movable.
  • the second imaging plane 46 of the grating unit 206 has a confocal positional relationship with the observation position of the observation sample 10 disposed at the focal position of the objective lens 24 via the dichroic mirror 53 that reflects visible light.
  • an observation image of the observation sample 10 can be acquired by the imaging element 44 arranged on the second imaging surface 46.
  • the mounting direction of the image sensor 44 is described as an arrangement in which the diffraction direction by the movable grating 31 is parallel to the y direction of the image data.
  • the first imaging surface 45 and the second imaging surface 46 are both confocal surfaces of the observation surface of the observation sample 10 observed by the objective lens 24, the diffraction angle depending on the wavelength of the movable grating 31, the movable grating, and so on. From the relationship between the position of the focal point on the first imaging plane 45 depending on the position of the movable mirror 32 and the position of the movable mirror 32, the first coupling of the respective wavelengths emitted from the light source 2 according to the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32. The in-focus position on the image plane can be obtained as information on the corresponding position in the image information captured by the image sensor 44.
  • the observation position of the confocal observation device 205 can be displayed according to the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 as shown in FIG. For example, when light in a wavelength range of 1300 nm to 1500 nm is emitted from the light source 2 and used for measurement, the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 with respect to two wavelengths of 1300 nm and 1500 nm.
  • the positions in the image picked up by the imaging device 44 corresponding to the imaging position 99a in the observation sample 10 of 1300 nanometer light and the imaging position 99b in the observation specimen 10 of 1500 nanometer light are calculated, and 99a Is a guidance image for an observer in which a line segment 99 connecting 99 and 99b is superimposed on an observation image observed by the image sensor 44.
  • the calculation of the observation position, the generation of the guidance image, and the analysis of the observation data from the digitizer 37 are performed by the computer 110 connected to the grating unit 206 and the light source unit 207 by the signal cables 120 and 121, and the guidance image and the observation data are calculated.
  • the analysis result is displayed on the display monitor 111 connected to the computer 110 via the signal cable 122.
  • the observer can set the measurement position by adjusting the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 without flowing the cells through the flow path 91 in the observation sample 10 according to the guidance shown in FIG. Position adjustment can be performed without waste.
  • Position adjustment can be performed without waste.
  • the relationship between the diffraction angle depending on the wavelength of the movable grating 31, the focal point on the first imaging plane 45 based on the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32, and the observation position on the image sensor 44, which are necessary for guiding the observation range A method will be described.
  • FIG. 7 is an apparatus configuration diagram for obtaining calibration information of the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 in the wavelength range used for the measurement of the confocal observation apparatus 205.
  • the wavelength for calibration and the wavelength of visible light emitted from the variable wavelength light source 3 are emitted from the optical fiber connector 73 via the optical fiber 16.
  • the calibration base 8 having the optical fiber adapter 75 is mounted on the sample stage 9, and the light emitted from the optical fiber connector 73 can be regarded as a point light source located in the observation range by the objective lens 24 of the optical microscope 101. Adjust the position.
  • the wavelength range to be calibrated and the wavelength tunable light source 3 corresponding to visible light do not perform the operation of emitting light simultaneously.
  • the position of the point light source is reproducible, it is an independent light source that emits each wavelength. Can be substituted. Further, the optical power meter 39 to which the optical fiber connector 74 and the optical fiber 17 are connected to the fiber adapter 72 of the grating unit 206 is connected to the fiber adapter 72.
  • the wavelength of the wavelength tunable light source 3 is set to a visible light wavelength, which is a wavelength that can be observed with the image sensor 44 (step 1).
  • the position of the sample stage 9 is adjusted, and the point light source of the optical fiber connector 73 is focused on a position where it can be observed by the image sensor 44, and the position of the point light source on the image (first light emission point position) coordinates ( P1x, P1y) is recorded (step 2).
  • the wavelength of the wavelength tunable light source 3 is set to the first calibration wavelength: L1, for example, 1300 nanometers (step 3).
  • the output of the optical power meter 39 is adjusted so that the light having the first calibration wavelength emitted from the optical fiber connector 73 is coupled to the optical fiber connector 74 most.
  • the position of the maximum movable grating 31 is adjusted to M1fg, and the position of the movable mirror 32 is adjusted to M1fm (step 4).
  • the position M1fg of the movable grating 31 and the position M1fm of the movable mirror 32 at which the light having the first calibration wavelength emitted from the optical fiber connector 73 reaches the optical power meter 39 via the optical fiber connector 74 at the maximum are emitted from the optical fiber connector 74.
  • the first calibration wavelength of the first calibration wavelength emitted from the light source 2 is used. This is the position where the light is focused on the position of the optical fiber connector 73 observed as the light emitting point in Step 2. That is, it indicates that the position information of the position observed as the light emitting point in Step 2 is acquired. Therefore, the wavelength of the first calibration wavelength set in step 3 as calibration information: L1, the position of the movable grating 31 obtained in step 4, M1fg, and the position of the movable mirror 32: M1fm (scanmi motors 33, 34).
  • step 5 The wavelength of the wavelength tunable light source 3 is set to the second calibration wavelength: L2, for example, 1500 nanometers (step 6). Similar to the method of step 4, the second calibration wavelength light emitted from the optical fiber connector 73 is coupled most to the optical fiber connector 74 by scanning the positions of the scan motors 33 and 34 in two dimensions. Then, the position of the movable grating 31 and the movable mirror 32 at which the output of the optical power meter 39 is maximized is adjusted (step 7).
  • step 8 the wavelength of the second calibration wavelength, the position of the movable grating 31: M1sg, the position of the movable mirror 32: M1sm, and the coordinates (P1x, P1y) of the emission point position observed by the image sensor 44 are recorded ( Step 8).
  • the position of the sample stage 9 is adjusted, the position of the light emission point (fiber optic connector 73) is changed to the second light emission point position (P2x, P2y), and the above steps 1 to 8 are repeated to obtain the second light emission position.
  • the positions of the first light emission point position and the second light emission point position are the diffraction angles of the movable grating 31 in the range observed by the confocal observation device 205 in the image observed by the image sensor 44.
  • (Pfx, Pfy) Whether or not (Pfx, Pfy) is irradiated depends on the coordinates (P1x, P1y) of the first light emission position, the position M1fg of the movable grating 31 and the position M1fm of the movable mirror 32 at the first calibration wavelength, and the second Can be expressed approximately by the position M2sg of the movable grating 31 and the position M2sm of the movable mirror 32 at the first calibration wavelength as in the equations (1) and (2). .
  • Pfx P1x + (P2x ⁇ P1x) ⁇ (Mm ⁇ M1fm) / (M2fm ⁇ M1fm) (1)
  • Pfy P1y + (P2y ⁇ P1y) ⁇ (Mg ⁇ M1fg) / (M2fg ⁇ M1fg) (2)
  • Which coordinate (Psx, Psy) of the image observed by the image sensor 44 is irradiated with the light of the second calibration wavelength L2 is determined by the first light emitting position coordinate (P1x, P1y).
  • the position M2sm can be expressed approximately as shown in Equation (3) and Equation (4).
  • the reason for the approximation is that the approximation that the position of the movable grating 31 and the movable mirror 32 and the position of the light emitting point observed by the image sensor 44 can be expressed by a linear linear approximation formula is used. There is no practical problem.
  • the position of the light emitting point is increased, or the distance from the optical axis of the microscope, that is, the center of the image sensor 44 is positioned at the center of the optical axis of the optical microscope 101. If it is, the accuracy can be improved by performing correction corresponding to the distance from the center of the image captured by the image sensor 44.
  • the coordinates of the focal position 99a based on the first calibration wavelength and the focal position 99b based on the second calibration wavelength shown in FIG. 6 can be obtained, and these coordinate positions are superimposed on the captured image on the image sensor 44. can do. Furthermore, by superimposing a line segment 99 having both ends of the focal coordinates 99a and 99b of the first calibration wavelength and the second calibration wavelength on the captured image, the first wavelength and the second wavelength are respectively set at both ends. It is possible to convey the observation position to the operator in an easy-to-understand manner when measuring in the wavelength range.
  • FIG. 9 shows a guidance image creation flow for notifying the operator of the observation position.
  • the position information Mg of the movable grating 31 and the position information Mm of the movable mirror 32 are acquired (step 1 and step 2).
  • the coordinates of the focal position in the observation wavelength band are calculated by the method shown in the above equations (1) to (4) (step 3).
  • an image of the observation sample 10 is taken by the imaging device 44 (step 4).
  • a guidance image is created by superimposing the coordinates and line segment of the focal position in the calculated observation wavelength band on the photographed image (step 5).
  • the guidance image is displayed on the monitor display 111 so that the operator can recognize it (step 6).
  • Steps 1, 2, and 3 may be performed only when the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 and the observation wavelength are changed, or may be repeatedly performed during position adjustment.
  • the flow shown in FIG. 9 only needs to use the position information of the movable grating 31 and the movable mirror 32 output from the confocal observation device 205, the image information of the image sensor 44, and the wavelength information of the pulse laser light source 2.
  • the coordinate calculation in step 4, the image creation in step 5, and the image display in step 6 may be performed by the computer 110 and the display monitor 111 to which the confocal observation device 205 is connected. Absent.
  • the measurement position based on the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 is indicated to the operator by the guidance image, so that even when the irradiation position of the laser beam is not located at the target observation position, the target observation position is obtained.
  • the irradiation position of the laser beam can be adjusted to the target observation position without performing preliminary measurement. Can do.
  • the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 are input values, and the coordinates of the observation position in the image are output values.
  • the coordinate information of the observation position to be performed can be rewritten into an input value as the input value and the position of the movable grating 31 and the movable mirror 32 as the output value.
  • FIG. 10 the confocal observation apparatus 208 by 2nd Embodiment is shown.
  • This is a configuration example using a grating unit 209 having a VIPA (Virtually Imaged Phase Array) element 29.
  • VIPA Virtual Imaged Phase Array
  • the diffraction direction by the VIPA element 29 is provided.
  • the beam collimated by the collimating lens 21 is converged in one direction by the cylindrical lens 26, is incident on the inclined VIPA element 29, and then collimated by the collimating lens 27, whereby the optical axis is changed for each wavelength. A shifted light beam is formed.
  • the scan lens 23 can focus on different positions in the two dimensions for each wavelength on the imaging plane 45. Therefore, by connecting the confocal observation device 208 to the optical microscope 101 via the camera connector 84, two-dimensional observation of the sample becomes possible.
  • FIG. 11 shows an example of the guidance image of the observation position in the two-dimensional observation of the observation sample 10.
  • a rectangle having 98a and 98b obtained from the position of the image on the imaging plane 45 irradiated with light in the observation wavelength band as diagonal vertices and sides parallel to the diffraction angles of the VIPA element 29 and the movable grating 31 By superimposing the region 98 on the captured image, the observer can make adjustments without performing preliminary measurement.
  • calibration is performed at two wavelengths corresponding to the diagonal vertices 98a and 98b determined by the installation angle of the VIPA element 29 and the grating of the movable grating 31 within the wavelength range of the light source used for measurement.
  • the rectangular region 98 can be easily obtained by setting the wavelength range to be used when constructing the observation result image from the measurement data.
  • the confocal observation apparatus 210 is a configuration example in which a grating section 211 is provided in which a rotatable camera connector 85 is attached to the grating section 206 shown in the first embodiment.
  • the confocal observation apparatus 210 can rotate the diffraction direction of the light by the movable grating 31 with respect to the observation sample 10 by the rotatable camera connector 85 in conjunction with the imaging element 44, so that the desired observation position as shown in FIG.
  • This is an observation apparatus capable of easily performing observation such as 97.
  • FIG. 14 shows the confocal observation device 205 according to the embodiment of the present invention shown in FIG. 4 connected to the telescope lens housing 102 having the camera connecting portion 89 via the camera connector 84, and the telescope lens housing 102.
  • This is an optical system for observing an observation sample 109 formed by the telescope lens 28 in a reduced size, not an enlarged size. Since the confocal observation apparatus shown in FIG. 14 can observe a large sample at high speed, it can be applied to, for example, chassis deformation observation when an impact load is applied in the chassis design of an automobile.
  • the confocal observation device 205 of the present invention has a diffraction angle depending on the wavelength of the movable grating 31 and the positional relationship of the focal point on the first imaging plane 45 depending on the positions of the movable grating 31 and the movable mirror 32 as shown in FIG. If it is obtained by the calibration method shown in FIG. 8, the observation position can be guided in the image observed by the image sensor 44 regardless of the optical system connected to the camera connector 84.
  • the observation of cells flowing in the flow channel was used as an observation sample as an example, but the observation target is observation of laser processing, observation of displacement of a micro actuator, and deformation observation when an impact is applied.
  • the observation target is observation of laser processing, observation of displacement of a micro actuator, and deformation observation when an impact is applied.
  • any observation object can be used as long as shape information is obtained by wavelength spectroscopy of reflected light from the observation object.
  • a dichroic mirror that reflects visible light and transmits near-infrared light is used to create two imaging positions in the confocal observation device grating section, in the present invention, visible light is reflected and near-red light is reflected.
  • dichroic mirrors that transmit external light
  • the switching wavelength of the dichroic mirror does not need to be switched between visible light and near-infrared light, and the switching wavelength can be shifted to the long wavelength side or the short wavelength side if there is no problem with the observation of the multispectral coded confocal microscope. Is possible.
  • the present invention can be used in industries related to observation of high-speed phenomena that can be optically observed, for example, observation of the shape of flowing cells.
  • SYMBOLS 1 Light source, 2 ... Pulse laser light source, 3 ... Wavelength variable light source, 9 ... Sample stage, 10 ... Observation sample, 11, 12, 13 ... Optical fiber, 14 ... Dispersion optical fiber with an optical amplification function, 15: Circulator, 16, 17: Optical fiber, 21: Collimate lens, 22: Objective lens, 23: Scan lens, 24: Objective lens, 25: Imaging lens, 26: Cylindrical lens, 27 ... Collimating lens, 28 ... Telescope lens, 29 ... VIPA element, 30 ... Grating, 31 ... Movable grating, 32 ... Movable mirror, 33, 34 ... Scan motor, 33a, 34a ...
  • Scan motor Rotation direction, 35 ?? Wavemeter, 36 ?? Light receiving element, 37 ?? Digitizer, 39 > Optical power meter , 40... Camera, 41... Optical lens, 42... Camera, 43 and 44... Image sensor, 45 and 46.
  • Co PC 111 ... Monitor display, 120, 121, 122 ... Signal cable, 201, 202 ... Conventional confocal observation device, 203 ... Conventional confocal observation device grating section, 204 ... Confocal observation device light source , 205, 208, 210 ... Confocal observation device, 206, 209, 211 ... Confocal observation device grating unit, 207 ... Confocal observation device light source unit

Abstract

本発明は、マルチスペクトル符号化共焦点観察装置において観察位置の調節を容易にする。 本発明の共焦点観察装置においては、観察位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティング、および観察対象の画像を観察する撮像素子が配置されている光学ブロックを、観察対象を拡大観察あるいは縮小観察光学系の筐体に１つの光学接続部にて接続し、観察対象におけるレーザ光の照射位置の情報を撮像素子により撮影された観察対象の画像情報に重畳して表示することにより観察位置の調整を容易にする。

Description

イメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置およびマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法
　本発明は、装置使用者に対する観察位置のガイダンス機能を有するマルチスペクトル符号化共焦点観察装置およびマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法に関するものである。ここで、マルチスペクトル符号化共焦点観察装置とは、広波長帯域の光源を用い回折格子により波長により異なる角度に回折した光を被観察物の異なる位置に照射することにより位置情報を波長情報に対応させることにより、非観察物からの各波長の反射率を測定することにより非観察物の位置情報を得る観察装置を意味するものとする。
　ウェブ，ロバート　エイチらが発明したマルチスペクトル符号化を用いた共焦点顕微鏡の技術（特許文献１）は、マルチスペクトル符号化の手法を用いて光を回折させることにより非観察物の１次元の位置情報を波長情報に変換し、各波長の反射率を測定することにより駆動部品を用いずに１次元の位置情報を取得する方法である。そして、この回折により光が広がる方向と異なる軸にヘッドを移動させる手段と組み合わせることにより、移動機構が１軸であるにもかかわらず２次元の画像を得ることが可能となる。
　ウェブ，ロバート　エイチらが発明したマルチスペクトル符号化を用いた共焦点顕微鏡２０１を図１を用いて説明する。広波長範囲の光源１より出射される光は光ファイバー１１およびサーキュレーター１５を透過した後ファイバー１２の端より空間に出射される。そしてコリメートレンズ２１により平行化され、グレーティング３０に照射される。グレーティング３０に照射された広波長範囲の光はそれぞれ波長に対応した角度に回折した後、対物レンズ２２により観察試料１０において各波長ごとに異なる位置に合焦される。観察試料からの反射光は各波長に対応した回折角でグレーティングにより回折されることとなり、再び光ファイバー１２を導光する。サーキュレーター１５により光ファイバー１３に導かれた後、波長計３５に導かれる。波長計３５により各波長ごとの光量を測定することにより、観察試料１０における各波長の反射率すなわち各位置の反射率を得ることができる。マルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置２０１においては、波長計３５により出力される波長情報以外に、どの位置を観察しているかの情報を提示する情報を出力する機能がない。そこで、観察者が観察する場所を指定したい場合には、図１に示すようにカメラ４０を準備し、共焦点顕微鏡２０１が観察試料１０のどのあたりを観察しているのかの情報を取得しなければならない。しかし、このカメラ４０により観察している画像は、マルチスペクトル符号化を用いた共焦点顕微鏡２０１の対物レンズ２２とは異なる光学レンズ４１を用いて観察した画像であるので、カメラ４０を取り外した場合など観察系の変更がある都度に位置合わせを必要とする。
　近年バーラム　ジャラリらにより、位置情報を変換した波長情報を分散光ファイバーに導波させることにより位置情報を時間情報に変換したマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置（特許文献２）が報告された。この方法は、高速で各波長の光量すなわち各位置の反射率などの情報を読み取ることができることから、高速に変化する観察対象を観察することを可能にした。
特許第４７０９９６９号公報 米国特許第８３７６２１８号明細書
ところで、上述した高速に変化する観察対象を観察する用途においては、高速に変化する観察対象に観察位置を合わせる必要があるので、図１に示したような異なる光学系のカメラの画像からの位置合わせではなく、光学顕微鏡などにマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置を取り付け、目視あるいはカメラで観察した状態で所定の位置をする観察を行うことが望ましいと考えられる。
図２は、高速に位置情報を取得するマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置２０２を光学顕微鏡１０１に取り付けた構成例を示す。ここで、共焦点観察装置２０２は、グレーティング部２０３と、光源、分散光ファイバーおよび受光部などよりなる光源部２０４よりなり、グレーティング部２０３と光源部２０４は光ファイバー１２により光学的に接続がなされている。グレーティング部２０３は光学顕微鏡１０１のカメラ接続部８１に接続されている。
広波長範囲を有するパルスレーザ光源２より出射された光は、光ファイバー１１、サーキュレーター１５および光ファイバー１２を透過した後、光ファイバー１２の端より空間に出射される。そしてコリメートレンズ２１により平行光とされ、グレーティング３０に照射される。グレーティング３０に照射された広波長範囲の光はそれぞれの波長に対応する角度に回折した後、スキャンレンズ２３によりカメラ接続部８１の結像面４５において波長ごとに異なる位置に合焦される。光学顕微鏡１０１において、対物レンズ２４の焦点位置に配置されている観察試料１０の観察面は、結像レンズ２５による結像位置である結像面４５と共焦の位置関係であるので、結像面４５において波長ごとに異なる位置に合焦した光は所定の倍率で、観察試料１０の観察面に縮小投影され合焦する。観察試料１０の観察面から反射した光は、対物レンズ２４、結像レンズ２５、スキャンレンズ２３を透過した後、グレーティング３０により反射した後、コリメートレンズ２１により光ファイバー１２を導光する。その後サーキュレーター１５、光増幅機能付き波長分散ファイバー１４を導光し、光受光素子３６に入射される。ここで、広波長範囲を有するパルスレーザ光源２より出射した光は、パルスレーザ光源２より出射した時点では極めて短いパルス時間であったが、光ファイバー１１および１２に存在する波長分散により多少パルス時間が延ばされ、さらに観察試料１０から反射した後、光ファイバー１２に存在する波長分散により多少パルス時間が延ばされた後、光増幅機能付き波長分散ファイバー１４により積極的にパルス時間が長められ、光受光素子３６に入射される時点では、波長情報が十分に時間情報に変換されており、光受光素子の受光量をデジタイザー３７により時間解析することにより各波長の強度、すなわち、観察試料１０の位置情報が得られることとなる。
光学顕微鏡１０１の他のカメラ接続部８２には、光学カメラ４２が接続されている。光学顕微鏡１０１においては、試料ステージ９に搭載された観察試料１０の像は、対物レンズ２４および結像レンズ２５によりカメラ４２内の撮像素子４３にも切り替えミラー５１の抜き差しに応じて結像される配置となっている。図２において示した光学顕微鏡１０１の構成において対物レンズ２４により観察される像は、切り替えミラー５１が光路に挿入されている場合には、カメラ接続部８１に配置されたグレーティング部２０３における結像面４５に結像し、切り替えミラー５１が切り替えミラーユニット５５における退避位置５２に退避し光路から除外された場合には、カメラ接続部８２に接続されたカメラ４２内の結像位置に配置された撮像素子４３に結像するように配置されている。すなわち、切り替えミラー５１を退避させることによりカメラ４２により観察試料１０の顕微鏡観察が可能であり、切り替えミラー５１を光路に挿入することによりマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置２０２による観察が可能となる。なお切り替えミラー５１を近赤外波長を反射し可視光を透過するダイクロイックミラーに交換する改造を光学顕微鏡１０１に行えば、切り替えミラー５１の移動なしに顕微鏡画像観察とマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置２０２による観察が可能となる。また切り替えミラー５１を近赤外波長および可視光をともに、反射・透過するハーフミラーに交換する改造を光学顕微鏡１０１に行えば、切り替えミラー５１の移動なしに顕微鏡画像観察とマルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置２０２による観察が可能となるが、ハーフミラーを用いる場合においては、共焦点観察装置２０２から出射するレーザ光および観察試料１０からの反射光がともにミラー部で一部透過してしまうので、光量不足による信号品質の劣化をもたらすこととなる。
図３に例として観察試料１０の構造を示す。直線部９１ａおよび曲線部９１ｂをともに有する流路９１が形成されており、その中に液体とともに細胞９５が矢印９２に示す方向に流れてくる構成であり、観察者はこの細胞９５の大きさを第１の観察位置９６にて観測を行う。マルチスペクトル符号化を用いた共焦点観察装置２０２において観察に用いる波長は、シリコン材料よりなる撮像素子による観察ができない近赤外波長であることが一般的であるので、切り替えミラー５１にハーフミラーを配置しても共焦点観察装置２０２による観察位置をカメラ４２にて観察することができない。
したがって、観察者は流路９１に細胞９５を流した状態において、デジタイザー３７から出力される信号を見ながら、細胞９５を十分に観察できる位置に試料１０を搭載する試料ステージ９の位置を探す方法により、観察位置の調整を行うこととなる。この方法においては、流路９１に細胞９５を流した状態で位置調整のための予備測定を行うこととなるので、所有する細胞９５の一部を観察の開始する前の調整工程に消費してしまうという欠点があるとともに、観察試料１０を交換する度に位置調整のための予備測定が必要となるという欠点が存在する。さらには、観察試料１０を交換しなくても観察位置を第１の観察位置９６から第２の観察位置９７に切り替えようとする場合には、光学顕微鏡１０１のカメラ接続部８１からグレーティング部２０３を一旦取り外し、所定の角度となるように改めて取り付け、さらに再度位置調整のための予備測定を行う必要がある。
また、０．８ミクロンメートルから約１．７ミクロンメートルまでの波長範囲に感度のあるＩｎＧａＡｓ材料よりなる赤外線カメラをカメラ接続部８２に接続し、切り替えミラー５１にハーフミラーを配置する方法を用いる場合には、共焦点観察装置２０２による観察位置を観察することができるが、可視光による観察試料１０の画像を取得することができないことに加え、前述のように光量不足による信号品質の劣化を生じることとなる。
図２に示した構成において共焦点観察装置２０２による観察位置の調整が容易でない原因の１つとして、光ファイバー１１より可視光の波長の光を入射させた場合には、グレーティング３０により観察を行う波長帯域の角度とは異なる角度に回折してしまうために、観察試料１０において観察する場所とは異なる位置に合焦してしまうことがある。そこで、観察位置の調整が容易な共焦点観察装置が望まれている。測定を行う目的が、患者から採取した血液内に循環癌細胞（ＣＴＣ）があるかどうかの検出を行う場合などにおいては、予備測定を行うことにより患者から採取した血液の一部を無駄にしてしまうこととなるので、予備測定は行わないことが望ましい。
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、観察位置の調整が容易な共焦点観察装置を提案しようとするものである。また共焦点観察装置による測定を行う位置調整のための予備測定工程を省略することができる共焦点観察装置および位置調整のための方法を提案しようとするものである。
　かかる課題を解決するため本発明の共焦点観察装置においては、パルスレーザ光源から出射されるレーザ光を観察対象に照射し、その反射光の波長情報を検出することにより観察対象の情報を取得するマルチスペクトル符号化共焦点観察装置において、観察位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティング、および観察対象の画像を観察する撮像素子が配置されている光学ブロックを、観察対象の拡大観察あるいは縮小観察を行う光学系の筐体に１つの光学接続部にて接続し、観察対象におけるレーザ光の照射位置の情報を作業者に表示することにより、観察位置の調整を容易にした。また、観察対象におけるレーザ光の照射位置の情報は、撮像素子により撮影された観察対象の画像情報に重畳した情報である。さらに本発明の共焦点観察装置においては、観察対象の拡大観察あるいは縮小観察を行う光学系の筐体と、上記観察位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティングおよび観察対象の画像を観察する撮像素子が配置されている光学ブロックとを接続する光学接続部は、回転可能な光学接続部である機能を有する。
　さらに本発明のマルチスペクトル符号化共焦点観察装置における作業者への観察位置のイメージガイダンス方法は、パルスレーザ光源を発光しない状態においても、上記観察位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティングの位置情報と上記パルスレーザ光源の波長情報から、撮像素子による観察試料の画像に観察位置の情報を重畳した画像を作業者に提供することにより、観察位置の調整を容易にすることができる。
　以上のように本発明によれば、マルチスペクトル符号化共焦点観察装置において、予備測定を行わなくても観察位置の調整を容易に行うことができるので、作業が短時間になるだけでなく、観察位置調整のための予備測定に試料を供する必要がなくなる。
マルチスペクトル符号化を用いた共焦点顕微鏡概略図である。 光学顕微鏡と組み合わせた共焦点観察装置構成図である。 観察試料の概略説明図である。 第１の実施の形態による共焦点観察装置構成図である。 光学顕微鏡と組み合わせた共焦点観察装置構成図である。 観察位置ガイダンス説明図である。 校正情報を得るための装置構成図である。 校正情報を得るための工程フロー図である。 ガイダンス画像作成フロー図である。 第２の実施の形態による共焦点観察装置構成図である。 観察位置ガイダンス説明図である。 第３の実施の形態による共焦点観察装置構成図である。 観察位置ガイダンス説明図である。 テレスコープレンズとの組み合わせた共焦点観察装置構成図である。
第１の実施の形態による共焦点観察装置２０５を図４に示す。また図５は共焦点観察装置２０５を光学顕微鏡１０１のカメラ接続部８３に取り付けた構成例を示す。共焦点観察装置２０５は、グレーティング部２０６と光源部２０７よりなり、グレーティング部２０６と光源部２０７は光ファイバー１２により光学的に接続されており、光ファイバー１２に取り付けられたファイバーコネクタ７１がグレーティング部２０６に備えられた光ファイバーアダプタ７２と勘合し、光ファイバー１２の抜き差しがなされた場合にも位置再現性の高い接続がなされる構成となっている。グレーティング部２０６と光学顕微鏡１０１との接続は、光学顕微鏡１０１のカメラ接続部８３に対応するカメラコネクタ８４がグレーティング部２０６に形成されていることにより、カメラ接続部８３とカメラコネクタ８４の勘合により光学的に接続されている。
　広波長範囲を有するパルスレーザ光源２より出射された光は、光ファイバー１１、サーキュレーター１５および光ファイバー１２を透過した後、光ファイバーコネクタ７１の端より空間に出射される。そしてコリメートレンズ２１により平行光とされ、可動ミラー３２を反射し、可動グレーティング３１に照射される。可動グレーティング３１に照射された広波長範囲の光はそれぞれの波長に対応する角度に回折した後、スキャンレンズ２３によりカメラ接続部８３の第１の結像面４５に波長ごとに対応する位置に合焦される
グレーティング部２０６のカメラコネクタ８４の直近には可視光を反射しパルスレーザ２の波長帯域である近赤外光を透過するダイクロイックミラー５３が配置されている。光学顕微鏡１０１における対物レンズ２４の焦点位置に配置されている観察試料１０の観察面と共焦の位置関係となるカメラ接続部８３の結像面は、ダイクロイックミラー５３が配置されていることにより、パルスレーザ２の波長帯域である近赤外光帯域の光が結像する第１の結像面４５と可視光の光が結像する第２の結像面４６の２つが形成される。第１の結像面４５において前記各波長ごとに異なる位置に合焦した光は、ダイクロイックミラー５３を透過した後、結像レンズ２５および対物レンズ２４により定められる倍率で、観察試料１０の観察面に縮小投影され合焦する。
観察試料１０の観察面に縮小投影されたレーザ光の反射光は、対物レンズ２４、結像レンズ２５、ダイクロイックミラー５３、スキャンレンズ２３を透過した後、可動グレーティング３１および可動ミラー３２により反射し、コリメートレンズ２１により集光され光ファイバー１２を再び導光する。その後サーキュレーター１５、光増幅機能付き分散ファイバー１４を導光し、光受光素子３６に入射される。ここで、広波長範囲を有するパルスレーザ光源２より出射した光は、パルスレーザ光源２より出射した時点では極めて短いパルス時間であったが、光ファイバー１１および１２に存在する波長分散により多少パルス時間が延ばされ、さらに観察試料１０から反射した後、光ファイバー１２に存在する波長分散により多少パルス時間が延ばされた後、光増幅機能付き波長分散ファイバー１４により積極的にパルス時間が長められ、光受光素子３６に入射される時点では、波長情報が十分に時間情報に変換されており、光受光素子の受光量をデジタイザー３７により時間解析することにより各波長の強度、すなわち、観察試料１０の位置情報が得られることとなる。なお、光増幅機能付き波長分散ファイバー１４においては、入射光の波長に応じて伝搬速度が異なる機能を有していればよいが、時間分散が分散を与えると同時に光増幅することにより信号のノイズを減らすことができ望ましい構成となる。
ここで可動グレーティング３１および可動ミラー３２はそれぞれスキャンモーター３３、３４に搭載されていることにより反射角度の調整が可能な構成となっている。ここで、第１の実施例の共焦点観察装置２０５においては、可動グレーティング３１は１次元のグレーティングが形成された構成とし、可動グレーティング３１の可動方向は、矢印３３ａが示す方向、すなわち、結像面４５において１次元グレーティングの回折光の方向と平行方向に可動することとし、可動ミラー３２の可動方向は矢印３４ａに示すように結像面４５において１次元グレーティングの回折光の方向と垂直方向に可動することとする。
グレーティング部２０６の第２の結像面４６は可視光を反射するダイクロイックミラー５３を介して、対物レンズ２４の焦点位置に配置されている観察試料１０の観察位置と共焦の位置関係であるので、光学顕微鏡１０１において透過照明あるいは落射照明により可視光の照明がなされた際に、第２の結像面４６に配置した撮像素子４４により観察試料１０の観察像を取得することができる。なお、本実施例においては、撮像素子４４の取り付け方向は、可動グレーティング３１による回折方向が画像データのｙ方向と平行になるような配置として説明を行う。
第１の結像面４５と第２の結像面４６は、ともに対物レンズ２４により観察される観察試料１０の観察面の共焦面であるので、可動グレーティング３１の波長による回折角、可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置による第１の結像面４５における合焦点の位置の関係から、可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置に応じて光源２から出射されるそれぞれの波長の第１の結像面における合焦位置を、撮像素子４４により撮像される画像情報における対応位置の情報として得ることができる。撮像素子４４が配置されている第２の結像面４６とレーザ光の合焦位置である第１の結像面４５は、対物レンズ２４および結像レンズ２５により結像する観察試料１０の観察位置と対応していることから、図６に示すように共焦点観察装置２０５の観察位置を可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置に応じて表示することができる。例えば１３００ナノメートルから１５００ナノメートルの波長範囲の光が光源２から出射され測定に用いられるとした場合に、１３００ナノメートルと１５００ナノメートルの２つの波長に関して、可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置情報から、１３００ナノメートルの光の観察試料１０における結像位置９９ａと１５００ナノメートルの光の観察試料１０における結像位置９９ｂに対応する撮像素子４４により撮像された画像における位置を算出し、９９ａと９９ｂを結ぶ線分９９を撮像素子４４により観察される観察画像に重畳した観察者向けガイダンス画像である。なお、観察位置の算出およびガイダンス画像の生成およびデジタイザー３７からの観察データの解析は、グレーティング部２０６および光源部２０７に信号ケーブル１２０および１２１で接続されたコンピュータ１１０によりなされ、ガイダンス画像および観察データの解析結果はコンピュータ１１０に信号ケーブル１２２で接続されたディスプレイモニター１１１により表示される。
観察者は図６に示したガイダンスにより、観察試料１０における流路９１に細胞を流すことなく可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置を調整することにより測定位置を設定することができるので、細胞を無駄にすることなく位置調整を行うことができる。観察範囲をガイダンスするために必要な、可動グレーティング３１の波長による回折角、可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置による第１の結像面４５における合焦点と撮像素子４４における観察位置の関係を得る方法を説明する。
図７は、共焦点観察装置２０５の測定に用いる波長範囲における可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置の校正情報を得るための装置構成図である。波長可変光源３より出射される校正を行う波長および可視光の波長が光ファイバー１６を介して光ファイバーコネクタ７３より出射される。光ファイバーアダプタ７５を有する校正用ベース８を試料ステージ９に搭載し、光ファイバーコネクタ７３より出射される光が、光学顕微鏡１０１の対物レンズ２４による観察範囲に位置する点光源とみなせるように、試料ステージ９の位置を調整する。ここで、校正を行う波長範囲および可視光に対応する波長可変光源３は、同時に発光させる動作を行わないので、点光源の位置の再現性があれば、それぞれの波長を発光する独立の光源での代用が可能である。また、グレーティング部２０６のファイバーアダプタ７２に勘合する光ファイバーコネクタ７４と光ファイバー１７が接続されている光パワーメーター３９をファイバーアダプタ７２に接続する。
図８に示した校正情報を得るための工程フロー図を用いて、校正方法の説明を行う。波長可変光源３の波長を撮像素子４４での観察が可能な波長である可視光波長に設定する（ステップ１）。次に試料ステージ９の位置を調整し、光ファイバーコネクタ７３部の点光源が撮像素子４４にて観察できる位置に合焦させ、その点光源の画像上の位置（第１の発光点位置）座標（Ｐ１ｘ，Ｐ１ｙ）を記録する（ステップ２）。波長可変光源３の波長を第１の校正波長：Ｌ１、例えば１３００ナノメートルに設定する（ステップ３）。スキャンモーター３３、３４の位置を２次元でスキャンすることにより、光ファイバーコネクタ７３より出射される第１の校正波長の光が、光ファイバーコネクタ７４に最も多く結合するように、光パワーメーター３９の出力が最大となる可動グレーティング３１の位置：Ｍ１ｆｇ、可動ミラー３２の位置：Ｍ１ｆｍに調整する（ステップ４）。光ファイバーコネクタ７３より出射した第１の校正波長の光が、光ファイバーコネクタ７４を介して光パワーメーター３９に最大で到達する可動グレーティング３１の位置Ｍ１ｆｇ、可動ミラー３２の位置Ｍ１ｆｍは、光ファイバーコネクタ７４から出射した第１の校正波長の光ファイバーコネクタ７３に結合する位置でもあるので、図５に示した共焦点観察装置２０５を光学顕微鏡１０１と組み合わせた例において、光源２から出射される第１の校正波長の光が、ステップ２において発光点として観察された光ファイバーコネクタ７３の位置に焦点を結ぶ位置である。すなわち、ステップ２において発光点として観察された位置の位置情報を取得することを示している。したがって、校正情報としてステップ３で設定した第１の校正波長の波長：Ｌ１と、ステップ４で得られた可動グレーティング３１の位置：Ｍ１ｆｇ、および可動ミラー３２の位置：Ｍ１ｆｍ（スキャンミモーター３３、３４の位置）と、ステップ２で得られた撮像素子４４で観察された画像における発光点の座標（Ｐ１ｘ，Ｐ１ｙ）を記録する（ステップ５）。波長可変光源３の波長を第２の校正波長：Ｌ２、例えば１５００ナノメートルに設定する（ステップ６）。ステップ４の手法と同様に、スキャンモーター３３、３４の位置を２次元でスキャンすることにより、光ファイバーコネクタ７３より出射される第２の校正波長の光が、光ファイバーコネクタ７４に最も多く結合するように、光パワーメーター３９の出力が最大となる可動グレーティング３１、可動ミラー３２の位置に調整する（ステップ７）。ステップ５と同様に第２の校正波長の波長、可動グレーティング３１の位置：Ｍ１ｓｇおよび可動ミラー３２の位置：Ｍ１ｓｍ、撮像素子４４により観察された発光点位置の座標（Ｐ１ｘ，Ｐ１ｙ）を記録する（ステップ８）。試料ステージ９の位置を調整し、発光点（光ファイバーコネクタ７３）の位置を第２の発光点位置（Ｐ２ｘ，Ｐ２ｙ）に変更し、上記ステップ１からステップ８を繰り返すことにより、第２の発光位置における第１の校正波長：Ｌ１における可動グレーティング３１の位置：Ｍ２ｆｇ、可動ミラー３２の位置：Ｍ２ｆｍさらに、第２の発光位置における第２の校正波長：Ｌ２における可動グレーティング３１の位置：Ｍ２ｓｇ、可動ミラー３２の位置：Ｍ２ｓｍを記録する（ステップ９）。なお、第１の発光点位置と第２の発光点位置の関係から、可動グレーティング３１を搭載しているスキャンモーター３３および、可動ミラー３２を搭載しているスキャンモーター３４の設定位置情報を算出することとなるので、第１の発光点位置と第２の発光点位置の位置は、撮像素子４４により観察される画像において、共焦点観察装置２０５による観察を行う範囲において、可動グレーティング３１の回折角に平行な方向および垂直な方向のそれぞれにおいて、十分に離れている位置に設定する。
つぎに観察位置のガイダンス情報を算出する取得式について説明を行う。可動グレーティング３１の位置がＭｇに設定されていて、可動ミラー３２の位置がＭｍに設定している場合において、第１の校正波長Ｌ１の光が撮像素子４４にて観察されている画像のどの座標（Ｐｆｘ，Ｐｆｙ）に照射されるかどうかは、第１の発光位置の座標（Ｐ１ｘ，Ｐ１ｙ）において、第１の校正波長における可動グレーティング３１の位置Ｍ１ｆｇおよび可動ミラー３２の位置Ｍ１ｆｍ、さらに第２の発光位置の座標（Ｐ２ｘ，Ｐ２ｙ）において、第１の校正波長における可動グレーティング３１の位置Ｍ２ｓｇおよび可動ミラー３２の位置Ｍ２ｓｍにより、式（１）、式（２）のように近似的に表現できる。
Ｐｆｘ＝Ｐ１ｘ＋（Ｐ２ｘ－Ｐ１ｘ）×（Ｍｍ－Ｍ１ｆｍ）／（Ｍ２ｆｍ－Ｍ１ｆｍ）・・・（１）
Ｐｆｙ＝Ｐ１ｙ＋（Ｐ２ｙ－Ｐ１ｙ）×（Ｍｇ－Ｍ１ｆｇ）／（Ｍ２ｆｇ－Ｍ１ｆｇ）・・・（２）
第２の校正波長Ｌ２の光が撮像素子４４にて観察されている画像のどの座標（Ｐｓｘ，Ｐｓｙ）に照射されるかどうかは、第１の発光位置の座標（Ｐ１ｘ，Ｐ１ｙ）において、第２の校正波長における可動グレーティング３１の位置Ｍ１ｓｇおよび可動ミラー３２の位置Ｍ１ｓｍ、さらに第２の発光位置の座標（Ｐ２ｘ，Ｐ２ｙ）において、第２の校正波長における可動グレーティング３１の位置Ｍ２ｓｇおよび可動ミラー３２の位置Ｍ２ｓｍにより、式（３）、式（４）のように近似的に表現できる。
Ｐｓｘ＝Ｐ１ｘ＋（Ｐ２ｘ－Ｐ１ｘ）×（Ｍｍ－Ｍ１ｓｍ）／（Ｍ２ｓｍ－Ｍ１ｓｍ）・・・（３）
Ｐｓｙ＝Ｐ１ｙ＋（Ｐ２ｙ－Ｐ１ｙ）×（Ｍｇ－Ｍ１ｓｇ）／（Ｍ２ｓｇ－Ｍ１ｓｇ）・・・（４）
なお近似的という理由は、可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置と撮像素子４４により観察される発光点の位置が１次線形近似式で現すことができるという近似を用いているためであるが、実用上問題はない。なお精度を高めたい場合においては、校正作業において、発光点の位置を増やすこと、あるいは、顕微鏡の光軸からの距離、すなわち撮像素子４４の中心が光学顕微鏡１０１の光軸の中心に位置している場合には、撮像素子４４により撮影される画像の中心からの距離に対応する補正を行うことにより精度向上が可能である。
上述した校正方法により、図６に示す第１の校正波長による焦点位置９９ａおよび第２の校正波長による焦点位置９９ｂの座標を得ることができ、これらの座標位置を撮像素子４４における撮像画像に重畳することができる。さらには、第１の校正波長と第２の校正波長の焦点座標である９９ａおよび９９ｂを両端とした線分９９を撮影画像に重畳することにより、第１の波長と第２の波長をそれぞれ両端とする波長範囲で測定を行う場合における観察位置を作業者にわかりやすく伝えることが可能となる。
作業者に観察位置を知らせるガイダンス画像の作成フローを図９に示す。可動グレーティング３１の位置情報Ｍｇおよび可動ミラー３２の位置情報Ｍｍを取得する（ステップ１およびステップ２）。取得した位置情報を用いて上記式（１）から式（４）に示した方法により観察波長帯域における焦点位置の座標を算出する（ステップ３）。一方、撮像素子４４により観察試料１０の画像を撮影する（ステップ４）。その撮影された画像に、算出した観察波長帯域における焦点位置の座標および線分を重畳することによりガイダンス画像を作成する（ステップ５）。ガイダンス画像を作業者が認識できるようモニターディスプレイ１１１に表示する（ステップ６）。なお、撮像素子４４により位置調整中は試料ステージ９の移動に備え、ステップ４、ステップ５、ステップ６の工程を繰り返し行うことが望ましい。ステップ１、ステップ２、ステップ３は、可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置および観察波長の変更があった場合にのみ行うこと、あるいは、位置調整中繰り返し行うことのどちらでもよい。なお、図９に示したフローは、共焦点観察装置２０５から出力される可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置情報、撮像素子４４の画像情報、パルスレーザ光源２の波長情報を用いていればよく、ステップ４の座標算出、ステップ５の画像作成、ステップ６の画像表示は共焦点観察装置２０５が接続されたコンピュータ１１０およびディスプレイモニター１１１にて行われればよく、共焦点観察装置２０５において行う必要はない。
可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置による測定位置をガイダンス画像により作業者に示すことにより、目標とする観察位置にレーザ光の照射位置が位置していない場合においても、目標とする観察位置となるように可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置をディスプレイモニター１１１に表示されるガイダンス画像を見ながら調整することにより、予備測定を行うことなく目標とする観察位置にレーザ光の照射位置を調整することができる。
また、式（１）から式（４）に示した関係式は、可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置が入力値であり、画像における観察位置の座標が出力値となっているが、観察を行いたい観察位置の座標情報を入力値として可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置を出力値とした形式に書き換えることも可能である。
上述した観察範囲をガイダンスするために必要な、可動グレーティング３１の波長による回折角、可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置による第１の結像面４５における合焦点と撮像素子４４における観察位置の関係は、光学顕微鏡１０１を用いて取得したが、ガイダンスに用いている情報は、光学顕微鏡１０１内の対物レンズ２４および結像レンズ２５の光学情報とは関連がないので、可動グレーティング３１の波長による回折角、可動グレーティング３１と可動ミラー３２の位置による第１の結像面４５における合焦点と撮像素子４４における観察位置の関係を一度取得しておけば、カメラコネクタ８４に接続される光学系に依存することなく、撮像素子４４により観察される画像に観察位置を重畳したガイダンスを行うことができる。
図１０において、第２の実施の形態による共焦点観察装置２０８を示す。ＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ　Ｉｍａｇｅｄ　Ｐｈａｓｅ　Ａｒｒａｙ）素子２９を有するグレーティング部２０９を用いた構成例であり、ＶＩＰＡ素子２９による回折方向を可動グレーティング３１による回折方向とほぼ直交する方向にＶＩＰＡ素子２９を配置することにより、コリメートレンズ２１により平行化されたビームをシリンドリカルレンズ２６により１方向に収束し、傾斜されて配置されているＶＩＰＡ素子２９に入射させた後コリメートレンズ２７により平行化することにより波長ごとに光軸がシフトした光束を形成する。そして、可動グレーティング３１に反射させることにより２次元に広がった回折光を形成することができるので、スキャンレンズ２３により結像面４５において波長ごとに２次元で異なる位置に合焦することができる。したがって、共焦点観察装置２０８をカメラコネクタ８４を介して光学顕微鏡１０１に接続することにより試料の２次元観察が可能となる。
　図１１において、観察試料１０の２次元観察における観察位置のガイダンス画像例を示す。観察波長帯域の光が照射される結像面４５における像の位置から構成手段により求められた９８ａおよび９８ｂを対角頂点とし、ＶＩＰＡ素子２９および可動グレーティング３１の回折角に平行な辺とする矩形領域９８を撮影画像に重畳することにより、観察者は予備測定を行うことなく調整を行うことができる。なお、この実施例においては、測定に用いる光源の波長範囲内において、ＶＩＰＡ素子２９の設置の角度と可動グレーティング３１のグレーティングにより決定される対角頂点９８ａおよび９８ｂに対応する２つの波長にて校正を行うとともに、測定データから観察結果の画像を構成する際に用いる波長範囲とすることにより、容易に矩形領域９８を得ることができる。
図１２において、第３の実施の形態による共焦点観察装置２１０を示す。共焦点観察装置２１０は第１の実施例に示したグレーティング部２０６に回転可能なカメラコネクタ８５が装着されたグレーティング部２１１とした構成例である。共焦点観察装置２１０は、回転可能なカメラコネクタ８５により観察試料１０に対する可動グレーティング３１による光の回折方向を撮像素子４４と連動して回転させることができるので、図３に示したよう観察希望位置９７などの観察を簡易に行うことができる観察装置である。回転可能なカメラコネクタ８５により観察試料１０に対する可動グレーティング３１による光の回折方向を回転させた場合においても、撮像素子４４と可動グレーティング３１および可動ミラー３２との位置関係が変化していないので、第１の実施の形態の説明において記した校正情報は変化していない。したがって、図１３に観察位置の観察者向けガイダンスの重畳画像例を示すように、１３００ナノメートルと１５００ナノメートルの２つの波長に関して、可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置の関係から、１３００ナノメートルの光の観察試料１０における結像位置９９ａと１５００ナノメートルの光の観察試料１０における結像位置９９ｂから導いた観察範囲９９を観察画像に重畳することにより観察者に、ガイダンスすることができる。
図１４は、図４に示した本発明の実施例である共焦点観察装置２０５をカメラ接続部８９を有するテレスコープレンズ筐体１０２にカメラコネクタ８４を介して接続し、テレスコープレンズ筐体１０２のテレスコープレンズ２８により結像する観察試料１０９を拡大ではなく縮小した観察を行う光学システムである。図１４に示す共焦点観察装置は、大型の試料の高速観察が可能となるので、例えば自動車のシャーシ設計における衝撃荷重が加わった場合のシャーシの変形観察などへの適用が可能となる。本発明の共焦点観察装置２０５は、上述したように、可動グレーティング３１の波長による回折角、可動グレーティング３１および可動ミラー３２の位置による第１の結像面４５における合焦点の位置関係が図７、図８に示した校正方法により得られていれば、カメラコネクタ８４に接続される光学系にかかわらず、撮像素子４４により観察される画像に観察位置のガイダンスが可能である。
　本発明の実施例においては、観察試料として流路中を流れる細胞観察を例として用いたが、観察対象はレーザ加工の観察および微小アクチュエーターの変位観察、さらには、衝撃が加わった場合の変形観察などパルスレーザ光を光源とした場合に観察対象からの反射光の波長分光により形状情報が得られる観察対象であればよい。また、共焦点観察装置グレーティング部において２つの結像位置を作成するために可視光を反射し近赤外光を透過するダイクロイックミラーを用いたが、本発明においては、可視光を反射し近赤外光を透過するダイクロイックミラーに限定されるものではなく、可視光を透過し近赤外光を反射するダイクロイックミラーを用い撮像素子とマルチスペクトル符号化共焦点顕微鏡の光路を切り替えることも可能であり、ダイクロイックミラーの切り替え波長も可視光と近赤外光で切り替える必要もなく、マルチスペクトル符号化共焦点顕微鏡の観察に支障が生じなければ切り替え波長を長波長側あるいは短波長側にシフトすることも可能である。
　本発明は、たとえば流れる細胞の形状観察など光学的に観察が可能な高速現象の観察に関連する産業おいて利用することができる。
　　１……光源、２……パルスレーザ光源、３……波長可変光源、９……試料ステージ、１０……観察試料、１１、１２、１３……光ファイバー、１４……光増幅機能付き分散光ファイバー、１５……サーキュレーター、１６、１７……光ファイバー、２１……コリメートレンズ、２２……対物レンズ、２３……スキャンレンズ、２４……対物レンズ、２５……結像レンズ、２６……シリンドリカルレンズ、２７……コリメートレンズ、２８……テレスコープレンズ、２９……ＶＩＰＡ素子、３０……グレーティング、３１……可動グレーティング、３２……可動ミラー、３３、３４……スキャンモーター、３３ａ、３４ａ……スキャンモーター回転方向、３５……波長計、３６……光受光素子、３７……デジタイザー、３９……光パワーメーター、４０……カメラ、４１……光学レンズ、４２……カメラ、４３、４４……撮像素子、４５、４６……結像面、５１……切り替えミラー、５２……退避位置、５３……ダイクロイックミラー、５５……切り替えミラーユニット、７１、７３、７４……光ファイバーコネクタ、７２、７５……光ファイバーアダプタ、８１、８２、８３、８６……カメラ接続部、８４、８５……カメラコネクタ、９１……流路、９１ａ……流路直線部、９１ｂ……流路曲線部、９２……流路流れ負方向、９５……細胞、９６、９７……観察位置、９８、９９……観察位置ガイダンス、９８ａ、９８ｂ、９９ａ、９９ｂ……観察位置ガイダンス特定波長位置、１０１……光学顕微鏡、１０２……テレスコープレンズ筐体、１０９……観察試料、１１０……コンピュータ、１１１……モニターディスプレイ、１２０、１２１、１２２……信号ケーブル、２０１、２０２……従来の共焦点観察装置、２０３……従来の共焦点観察装置グレーティング部、２０４……共焦点観察装置光源部、２０５、２０８、２１０……共焦点観察装置、２０６、２０９、２１１……共焦点観察装置グレーティング部、２０７……共焦点観察装置光源部

Claims (10)

  1. 　パルスレーザ光源から出射されるレーザ光を観察対象に照射し、その反射光の波長情報を検出することにより観察対象の情報を取得するマルチスペクトル符号化共焦点観察装置において、
    観察対象におけるレーザ光の照射位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティング、および観察対象の画像を取得する撮像素子が配置されている光学ブロックは、
    観察対象の拡大観察あるいは縮小観察を行う結像光学系を有する筐体と１つの光学接続部にて接続されており、
    観察対象におけるレーザ光の照射位置の情報を出力することを特徴とするイメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置。
  2. 　上記観察対象におけるレーザ光の照射位置の情報は、上記撮像素子により撮影された観察対象の画像情報に重畳された情報であることを特徴とする請求項１に記載のイメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置。
  3. 　上記反射光の波長情報を検出する方法は、観察対象からの反射光を分散を有する光ファイバーを導光させた光を光受光素子で受光した反射光強度の時間情報から波長情報を算出する方法であることを特徴とする請求項１および請求項２に記載のイメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置。
  4. 上記光学接続部は、回転可能な光学接続部であることを特徴とする請求項１および請求項２および請求項３に記載のイメージガイダンス付きマルチスペクトル符号化共焦点観察装置。
  5. 　パルスレーザ光源から出射されるレーザ光を観察対象に照射し、その反射光の波長情報を検出することにより観察対象の情報を取得するマルチスペクトル符号化共焦点観察装置において、
    観察対象の拡大観察あるいは縮小観察を行う結像光学系の筐体と接続された観察対象におけるレーザ光の照射位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティング、および観察対象の画像を取得する撮像素子が配置されており、
    上記観察対象におけるレーザ光の照射位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティングの位置情報と、上記パルスレーザ光源の波長情報と、上記撮像素子により撮像された観察対象の画像情報とにより、観察のためのガイダンス情報を作成することを特徴とするマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法。
  6. 　上記観察対象におけるレーザ光の照射位置を調整する可動ミラーおよび可動グレーティング、および上記観察対象の画像を取得する撮像素子は、観察対象の拡大観察あるいは縮小観察を行う結像光学系の筐体と１つの接続部により接続されたことを特徴とする請求項５に記載のマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法。
  7. 　上記観察のためのガイダンス情報は、上記パルスレーザ光源を発光させない状態において作成することを特徴とする請求項５および請求項６に記載のマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法。
  8. 　上記観察のためのガイダンス情報は、観察対象を置く位置に発光点を配置することにより作成することを特徴とする請求項５および請求項６よび請求項７に記載のマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法。
  9. 　上記観察のためのガイダンス情報は、上記撮像素子により撮像された観察対象の画像情報に、観察対象におけるレーザ光の照射位置が重畳された画像情報であることを特徴とする請求項５および請求項６および請求項７および請求項８に記載のマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法。
  10. 　上記反射光の波長情報を検出する方法は、観察対象からの反射光を分散を有する光ファイバーを導光させた光を光受光素子で受光した反射光強度の時間情報から波長情報を算出する方法であることを特徴とする請求項５および請求項６および請求項７および請求項８および請求項９に記載のマルチスペクトル符号化共焦点観察における観察位置のイメージガイダンス方法。
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