WO2018207918A1 - 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法 - Google Patents

移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018207918A1
WO2018207918A1 PCT/JP2018/018351 JP2018018351W WO2018207918A1 WO 2018207918 A1 WO2018207918 A1 WO 2018207918A1 JP 2018018351 W JP2018018351 W JP 2018018351W WO 2018207918 A1 WO2018207918 A1 WO 2018207918A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
protein
antibody
isolated
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/018351
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智宏 赤澤
絵里子グレース 須藤
洋 馬渕
Original Assignee
国立大学法人 東京医科歯科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 東京医科歯科大学 filed Critical 国立大学法人 東京医科歯科大学
Priority to JP2019517719A priority Critical patent/JPWO2018207918A1/ja
Priority to US16/612,236 priority patent/US11613733B2/en
Priority to EP18798420.8A priority patent/EP3739038A4/en
Publication of WO2018207918A1 publication Critical patent/WO2018207918A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating, purifying or concentrating mesenchymal stem cells. More specifically, the present invention relates to a method for separating, purifying, or concentrating mesenchymal stem cells from fresh tissue isolated from a living body, using the expression of a marker protein on the cell surface as an index. The present invention also relates to a method for producing mesenchymal stem cells that can be used for cell transplantation and the like, and a kit used for such a method.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells present in bone marrow, synovium, fat, and umbilical cord, and have been reported to have the ability to differentiate into cartilage, bone, fat, and nerve cells (Non-patent Document 1). ). Since it can be separated from adult tissues, it is used for regeneration treatment of damaged parts of meniscus and cartilage (Non-patent Document 2). However, these transplanted cells are obtained by culturing a variety of cell populations collected from tissues, and other cells constituting the tissue are mixed in addition to mesenchymal stem cells.
  • Non-patent Document 3 mesenchymal stem cells have been reported not only to regenerate tissues but also to promote immune tolerance by transplanting simultaneously with transplantation of blood cells. There is a concern that the effects may be diminished by the presence of miscellaneous cells other than mesenchymal stem cells.
  • Non-patent Documents 4 and 5 As an evaluation method for mesenchymal stem cells, analysis of the degree of cell proliferation and surface antigen expression of cells after culture has been performed (Non-patent Documents 4 and 5). However, it is clear that cells other than mesenchymal stem cells contained in various bone marrow cells proliferate, and cells other than mesenchymal stem cells express mesenchymal cell-like antigens by culture. (Non-Patent Document 6).
  • Non-patent Documents 7 and 8 a system for selectively separating mesenchymal stem cells of humans and mice before culturing using a plurality of surface markers has already been established (Non-patent Documents 7 and 8).
  • LNGFR CD271
  • THY-1 CD90
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 7
  • PDGFR ⁇ CD140a is used for isolation of mouse mesenchymal stem cells.
  • Sca-1 Non-patent Document 8
  • different antibodies are used for different animal species.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • mesenchymal stem cells can be purified and concentrated easily and efficiently by separating cells expressing CD73 protein on the surface from fresh tissue isolated from a living body. It was. According to the present invention, it is possible to establish a culture system of mesenchymal stem cells that selectively isolates only mesenchymal stem cells with a single antibody before culturing and enhances the engraftment efficiency in the transplanted part. According to the present invention, it has been found that the same antigen is recognized between different animal species, and thus it is possible to evaluate the safety and efficacy in non-clinical studies using cells expressing the same antigen, A stable transplantation effect is expected by using freshly purified cells rather than a mixed cell population.
  • Embodiment 1 A method of purifying mesenchymal stem cells (MSCs) comprising the steps of i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, and ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface.
  • Embodiment 2 The method of embodiment 1, characterized in that the CD73 protein is used as the only positive selection marker.
  • Embodiment 3 Embodiment 3.
  • the method of embodiment 1 or 2 characterized in that none of CD29, CD44, CD90, CD271, CD140a, or leptin receptor is used as a selectable marker for purifying MSC.
  • Embodiment 4 Embodiment 4.
  • Embodiment 5 Embodiment 5.
  • the method of embodiment 4 wherein the blood cells / endothelial cells are removed using CD31, CD45, GPA, and / or Ter119 as a negative selection marker for removing blood cells / endothelial cells.
  • Embodiment 6 Embodiment 6.
  • the method of embodiments 1-5 characterized in that CD73 protein is used as the only selectable marker for MSC purification.
  • Embodiment 8 The method according to any one of embodiments 1 to 7, further comprising the step of treating a population of fresh cells isolated from a living body with collagenase.
  • Embodiment 9 Embodiment 7. The method according to embodiments 1 to 6, characterized in that the fresh cell population isolated from the living body is derived from peripheral blood.
  • Embodiment 10 Embodiments 1-9, characterized in that a population of fresh cells isolated from a living body is isolated from a living body after G-CSF, GM-CSF, or AM3100 (prerixafor) is administered to the living body Method.
  • Embodiment 11 The method according to any one of embodiments 1 to 10, wherein cells expressing CD73 protein on the surface are isolated using a carrier or FACS to which an anti-CD73 antibody is bound.
  • Embodiment 12 The method of embodiment 11, wherein the carrier to which the anti-CD73 antibody is bound is a magnetic bead.
  • Embodiment 13 The method of embodiment 11, wherein the column is packed with a carrier to which an anti-CD73 antibody is bound.
  • Embodiment 14 i) providing a population of fresh cells isolated from a living body; and ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface using a carrier to which an anti-CD73 antibody is bound.
  • a method for purifying stem cell (hMSC) Using CD73 protein as the only positive selection marker, None of CD29, CD44, CD90, CD271, CD140a, or leptin receptor is used as a selectable marker, A purification method, characterized in that cell adhesion culture is not performed prior to isolation of cells expressing CD73 protein on the surface.
  • Embodiment 15 i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, and iii) growing the cells isolated in step ii.
  • a method for producing mesenchymal stem cells (MSC) for transplantation comprising: Embodiment 16 i) preparing a population of fresh cells isolated from the living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, and iii) inducing differentiation into the cells isolated in step ii
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Embodiment 16 i) preparing a population of fresh cells isolated from the living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, and iii) inducing differentiation into the cells isolated in step ii
  • a method for producing a cell for transplantation comprising a step.
  • Embodiment 17 The method of embodiments 1 to 16, characterized in that GMP grade antibodies are used
  • Embodiment 18 A kit for use in the method of embodiments 1-16 comprising a carrier conjugated with an anti-CD73 antibody.
  • Embodiment 19 The kit of embodiment 18, wherein the carrier to which the anti-CD73 antibody is conjugated is a magnetic bead.
  • Embodiment 20 The kit of embodiment 18, wherein the column is packed with a carrier conjugated with an anti-CD73 antibody.
  • Embodiment 21 A kit for use in the method of embodiments 1-16 comprising a conjugated anti-CD73 antibody.
  • Embodiment 22 Embodiment 20. Kit according to embodiments 18-21, characterized in that GMP grade antibodies are used.
  • Embodiment 23 A cell composition comprising cells obtained by the method of embodiments 1-16.
  • Embodiment 24 A method for producing a CD73-positive cell composition comprising the steps of i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, and ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface.
  • Embodiment 25 A method for producing a CD73-positive cell composition, further comprising the step of growing the cells isolated in step ii.
  • Embodiment 26 26.
  • Embodiment 27 27. The method according to any one of embodiments 24-26, wherein no cell adhesion culture is performed prior to isolation of cells expressing CD73 protein on the surface.
  • Embodiment 28 28 28.
  • Embodiment 29 The method according to embodiments 24-27, comprising the step of removing blood cells / endothelial cells prior to isolation of cells expressing CD73 protein on the surface.
  • Embodiment 29 Embodiment 29.
  • the method according to embodiments 24-28 characterized in that the fresh cell population isolated from the living body is derived from bone marrow, subcutaneous fat, visceral fat, villi, chorion, or amniotic membrane.
  • Embodiment 30 30.
  • the method of embodiments 24-29 characterized in that FACS is used to isolate cells that express CD73 protein on their surface.
  • Embodiment 31 Embodiment 24.
  • the method according to embodiments 24-30 characterized in that GMP grade antibodies are used.
  • Embodiment 32 The method according to embodiments 32.
  • a method for producing a CD73 positive cell composition comprising: i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body; and ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface using FACS.
  • a population of fresh cells isolated from the living body is derived from subcutaneous fat or visceral fat, Using the CD73 protein as the only selectable marker, A method for producing a CD73 positive cell composition, characterized in that cell adhesion culture is not performed prior to isolation of cells expressing CD73 protein on the surface.
  • Embodiment 33 A CD73-positive cell composition obtained by the method of Embodiments 24-32.
  • Embodiment 34 35. The CD73 positive cell composition of embodiment 33, wherein the purity of the CD73 positive cell is at least 90%.
  • Embodiment 35 Comprising at least 10 3 CD73-positive cells, CD73-positive cell composition embodiment 33 or 34.
  • Embodiment 36 A composition for improving transplantation efficiency, comprising the CD73-positive cell composition of embodiments 33-35.
  • Embodiment 37 36.
  • An anti-inflammatory composition comprising the CD73 positive cell composition of embodiments 33-35.
  • Embodiment 38 An immunosuppressive composition comprising the CD73 positive cell composition of embodiments 33-35.
  • Embodiment 39 A composition for use in the treatment of muscle injury or disease comprising the CD73-positive cell composition of embodiments 33-35 and a muscle satellite cell.
  • Embodiment 40 A composition for use in the treatment of inflammatory bowel disease, comprising the CD73 positive cell composition of embodiments 33-35.
  • Embodiment 41 A composition for use in the treatment or prevention of GVHD, comprising the CD73 positive cell composition of embodiments 33-35.
  • Embodiment 42 36 A method for increasing the efficiency of cell therapy, comprising administering the CD73-positive cell composition of any one of embodiments 33 to 35 at the same time as another cell in a cell therapy using another cell.
  • Embodiment 43 36 The CD73-positive cell composition according to any of embodiments 33 to 35, for co-administration with an allogeneic cell in order to increase cell therapy efficiency in cell therapy using an allogeneic cell.
  • CD73 positive cell is expressing the marker of a mesenchymal stem cell in a human and mouse
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the ratio of CD73 positive cells contained in human mesenchymal tissue (bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, amnion, chorion, villi, and umbilical cord).
  • FIG. 7 is a graph showing the results of examining the colony forming ability of CD73 positive cells obtained from bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, amniotic membrane, chorion, and villi.
  • FIG. 8 is a photograph of a culture dish showing the results of examining the colony forming ability of CD73 positive cells obtained from bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, amniotic membrane, chorion, and villi.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of examining the colony forming ability of CD73 positive cells obtained from bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, amniotic membrane, chorion, and villi.
  • FIG. 8 is a photograph of a culture dish showing
  • FIG. 9 is a graph showing the results of examining the proliferation ability of CD73 positive cells separated from subcutaneous fat, visceral fat, chorion, and villi. The relative number of cells on the 14th day of culture (Day 14) when the culture start time (Day 0) is 1 is shown.
  • FIG. 10 is a diagram showing an experimental protocol using a mouse model of ulcerative colitis.
  • FIG. 11 is a photograph and a graph showing the effect of administration of CD73 positive cells in a mouse model of ulcerative colitis. The photograph on the left shows the large intestine removed on the 8th day of the experiment. The graph on the right is a graph showing the results of analyzing the length of the colon.
  • FIG. 10 is a diagram showing an experimental protocol using a mouse model of ulcerative colitis.
  • FIG. 11 is a photograph and a graph showing the effect of administration of CD73 positive cells in a mouse model of ulcerative colitis. The photograph on the left shows the large intestine removed on the 8th day of the experiment. The graph on
  • FIG. 12 is a photograph and a graph showing the results of histological examination of the site of rectal inflammation.
  • the photograph on the left shows that the administration of CD73 positive cells causes the transplanted cells to home to the inflamed part and retain the colon structure.
  • the right graph shows that the inflammation score is significantly lower in the CD73 positive cell administration group.
  • FIG. 13 is an image showing the results of administering skeletal muscle stem cells (satellite cells) from allogeneic mice to mice that have caused muscle damage by administering cardiotoxin (CTX) to the anterior tibial muscle. Allogeneic CD73 positive cells were co-administered.
  • CTX cardiotoxin
  • FIG. 14 is an image showing the results of administering skeletal muscle stem cells (satellite cells) of allogeneic mice to mice that caused muscle damage by administering cardiotoxin (CTX) to the anterior tibial muscle. Allogeneic CD73 positive cells were co-administered.
  • skeletal muscle stem cells satellite cells
  • CTX cardiotoxin
  • MSC mesenchymal stem cells
  • MSC Mesenchymal stem cells
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • Mesenchymal stem cells are pluripotent adult stem cells that exist in multiple tissues such as umbilical cord, bone marrow, and adipose tissue. Although mesenchymal stem cells (MSCs) are rare cells, it is estimated that they are present in the bone marrow at a rate of 1 per 10,000 to 100,000 nucleated bone marrow cells.
  • Mesenchymal stem cells (MSCs) have self-proliferating ability and can differentiate into various cell types such as osteoblasts (bone cells), chondrocytes, muscle cells, adipocytes, etc. Is expected.
  • the mesenchymal stem cell is 1) Adhering to a plastic culture vessel, (2) CD105 (endoglin), CD73 (ecto 5′-nucleotidase), CD90 (Thy-1) as positive markers, CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79 ⁇ , CD19, HLA-Class II (DR) is used as a negative marker, and (3) cells have the ability to differentiate into bone, fat, and cartilage.
  • the MSC property of growing by adhering to a plastic culture vessel is used.
  • MSCs To be identified as MSCs, more than 95% of the cultured cell population must express CD73, CD90 and CD105, and CD11b or CD14, CD34, CD45, CD19 or CD79 ⁇ , and HLA -It must be negative ( ⁇ 2% positive cells) for DR, but note that these antigen profiles are revealed after culturing the cells in an artificial environment Should.
  • mesenchymal stem cells are often isolated by growing cells attached to a culture dish after culturing cells obtained from tissues such as bone marrow for a long time. Due to the heterogeneity of the contained cells, the quality of the stem cells finally obtained varies. Therefore, a technique for isolating mesenchymal stem cells using surface antigen markers has been developed. For example, Ogata et al. Have shown that human MSCs can be purified using two cell surface markers, LNGFR and THY-1. (Ogata et al., PLoS One. 2015 Jun 8; 10 (6): e0129096.)
  • CD73 (ecto-5'-nucleotidase) CD73 is an enzyme called ecto-5'-nucleotidase and generally has a function of converting AMP into adenosine. Traditionally, CD73 has been included as one of the positive markers that define MSC. However, it has not been known so far that MSC can be isolated using only the expression of CD73 as an index. The present inventors have surprisingly and surprisingly found that human, mouse and rat MSCs can be substantially purified using the expression of CD73 alone as an index.
  • One embodiment of the present invention comprises a step of i) providing a population of fresh cells isolated from a living body, and ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface.
  • the present invention relates to a method for purifying stem cells (MSC).
  • the fresh cell means a cell that has not been subjected to the culture process immediately after being separated from the living body, but the fresh cell may be one that has been cryopreserved immediately after being separated from the living body.
  • the MSC purification method can also be regarded as an MSC isolation method or an enrichment method.
  • the population of cells treated by the methods of the present disclosure has an increase in the proportion of MSCs in the cell population by at least 10% compared to the population of cells before treatment.
  • the process of isolating cells expressing CD73 protein on the surface is performed in vitro or ex vivo, using a carrier such as sorting using flow cytometry (FACS), affinity chromatography, immunopanning, or magnetic beads.
  • FACS flow cytometry
  • affinity chromatography affinity chromatography
  • immunopanning or magnetic beads.
  • magnetic beads magnetic beads.
  • the sorting method is not limited to these.
  • the MSC purification method described in this specification can be said to be a CD73-positive cell purification method, isolation method, or concentration method.
  • the cell purification method according to the disclosure of the present specification may be hereinafter referred to as “fresh purification method”.
  • the step of preparing a fresh population of cells isolated from a living body does not include a surgical step of isolating tissue from a human body.
  • One embodiment of the present invention may further comprise the step of isolating a fresh cell population (tissue) from the living body.
  • One embodiment of the present invention relates to a method characterized by using CD73 protein as the only positive selection marker. That is, none of CD29, CD44, CD90, CD271, CD140a or leptin receptor used as a marker when identifying cultured cells as MSC is used as a positive selection marker for purifying MSC. In one embodiment of the invention, CD29, CD44, CD90, CD271, CD140a or leptin receptor is not used as a selectable marker and is not used as a negative selectable marker. In one embodiment of the invention, CD73 protein is used as the only selectable marker for MSC purification.
  • one or more cells selected from CD235a, CD45, CD11b, CD105, CD90, CD10, CD140b, CD14, CD19, CD79 ⁇ , CD34, CD45, HLA-DR, CD31, and GPA Surface markers are not used as selection markers.
  • the method according to such an embodiment can be regarded as having a significant cost advantage over the method using a plurality of antibodies. Such a viewpoint is particularly important in situations where the use of GMP grade antibodies is required. Further, it is not required to use an expensive multi-color FACS system, and simple isolation using a carrier such as magnetic beads becomes possible.
  • One embodiment of the present invention relates to a method of using CD31, CD45, GPA, and / or Ter119 as a negative selection marker for removing blood cells / endothelial cells.
  • CD31, CD45, GPA, and / or Ter119 as a negative selection marker for removing blood cells / endothelial cells.
  • Examples of the cell supply source when preparing fresh cells isolated from a living body include mammalian bone marrow, umbilical cord, umbilical cord blood, peripheral blood, synovial membrane, and adipose tissue.
  • One preferred source of cells is bone marrow, and bone marrow such as spine, sternum, rib, femur, tibia, and iliac can be used as bone marrow.
  • Examples of mammals include, but are not limited to, humans, mice, and rats.
  • the MSC purification method using CD73 as an index according to the present disclosure has an excellent advantage that it can be commonly applied to humans, mice, and rats.
  • the purification method according to the present disclosure is used for purification of human mesenchymal stem cells (hMSC).
  • the source of cells when preparing fresh cells isolated from a living body can include visceral fat, subcutaneous fat, amniotic membrane, chorion, and villi.
  • Adipose tissues such as subcutaneous fat and visceral fat have the advantage that they can be obtained relatively easily.
  • Villi can also be a good source for obtaining cells because they can be obtained in significant amounts (less than 500 g from one pregnant woman).
  • cells When tissue isolated from a living body contains blood cells, cells may be selected and removed using the expression of CD45 protein and CD235a protein on the cell surface as an index, but the surface marker is not limited thereto.
  • CD31 protein can also be used.
  • the selection method include, but are not limited to, flow cytometry using fluorescently labeled antibodies, methods using magnetic beads, immunopanning, affinity chromatography, and the like.
  • the selection of CD45 ⁇ CD235a ⁇ cells or the like may be before MSC isolation (purification or concentration), simultaneously or after isolation (purification or concentration).
  • a fluorescent dye that stains dead cells such as propidium iodide (PI) is reacted with a cell population, and the cells stained with fluorescence are removed.
  • the dead cells may be removed in advance.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for purifying mesenchymal stem cells (MSC), which includes a step of removing blood cells / endothelial cells.
  • the purification method of this embodiment includes, for example, i) preparing a fresh cell population isolated from a living body, ii) removing blood cells / endothelial cells, and iii) cells expressing CD73 protein on the surface. Isolating. More specifically, blood cells / endothelial cells can be removed using CD31, CD45, GPA, and / or Ter119 as a negative selection marker for removing blood cells / endothelial cells.
  • mesenchymal stem cells (MSCs) can be purified after removal of blood cells / endothelial cells using CD73 protein as the only selectable marker for MSC purification.
  • an antibody that specifically recognizes CD73 protein can be used.
  • the antibody may be labeled with a fluorescent dye such as FITC, PE, or APC.
  • Usable antibodies include, for example, clone AD2 (BD Bioscience) in the case of human CD73 antibody.
  • the characteristics of the antibody used (monoclonal / polyclonal antibody, isotype, full length / fragment, etc.) and the concentration of the antibody are considered by those skilled in the art in consideration of the tissue from which the cell is derived, the activity of the antibody, the method of using the antibody, etc. It can be determined as appropriate.
  • the amino acid sequence of the CD73 protein of mammals including human, mouse and rat and the nucleic acid sequence encoding the same are known, and anti-CD73 antibodies may be prepared and used based on such information.
  • anti-CD73 antibodies may be prepared and used based on such information.
  • antibodies that recognize human, mouse, and rat CD73 proteins the same antibodies may be used, or different antibodies may be used for each animal species.
  • GMP grade antibodies are used.
  • Isolation of cells expressing CD73 protein on the surface can be performed, for example, using flow cytometry (FACS), immunopanning, affinity chromatography, or using a carrier such as magnetic beads.
  • FACS flow cytometry
  • affinity chromatography affinity chromatography
  • magnetic beads a carrier such as magnetic beads
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • cells are stained with a fluorescent antibody, and the fluorescence emitted by individual cells is measured and analyzed to sort specific cells.
  • a BD FACSAria (trademark) cell sorter manufactured by BD Bioscience can be used as the FACS system.
  • a CD73 + cell is selected using a fluorescently labeled anti-CD73 antibody, and those skilled in the art can appropriately set a cell sorter.
  • CD31 ⁇ CD45 ⁇ CD235a ⁇ may be added to the conditions in order to remove blood cells / endothelial cells, but such a negative selection marker is not limited thereto.
  • Isolation of cells can also be performed using a carrier such as beads (microspheres) bound with anti-CD73 antibody.
  • the carrier can be a bead, such as a magnetic bead, but is not limited thereto.
  • beads another simple substance such as agarose can be used, and the beads may be magnetic agarose beads.
  • Various beads (microspheres) are commercially available and can be used in the present invention.
  • the bond between the antibody and the carrier may be a covalent bond, a hydrogen bond or the like, but is not particularly limited.
  • the anti-CD73 antibody need not be directly bound to the carrier, but may be indirectly bound. Separation of the antibody and the carrier can be facilitated by interposing a linker (for example, biotin-avidin system) between the antibody and the carrier.
  • a linker for example, biotin-avidin system
  • cells can be isolated using a carrier in which an anti-CD73 antibody is bound to cells and bound to another antibody that recognizes the anti-CD73 antibody.
  • CD34 + CD133 + cells may be removed using Miltenyi TM magnetic bead selection or the like prior to isolation of cells with a carrier to which an anti-CD73 antibody is bound.
  • Purification can also be performed by affinity chromatography by filling a column with a carrier bound with an anti-CD73 antibody and passing a cell sample therethrough.
  • One aspect of the present invention relates to a method for producing mesenchymal stem cells (MSC) for transplantation.
  • One aspect of such a production method is, for example, i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, and iii) expanding the cells isolated in step ii. Details regarding steps i and ii are as described elsewhere herein.
  • any method known for MSC culture can be used.
  • Mesenchymal stem cell growth media are known to those skilled in the art, and various media are commercially available. The culture conditions and period can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • One embodiment of the present invention relates to a cell population or cell composition containing MSC produced by the above method.
  • the present inventors have found that a cell population purified by separating cells expressing CD73 protein on the surface has high engraftment efficiency in the transplanted part.
  • the cell population containing MSC according to the present invention contains at least 2% of MSC in the cell population, preferably 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% Or 80% or more, more preferably 90% or more.
  • the ratio of MSC to the whole can be measured using a marker on the cell surface as an index.
  • the cell population containing MSC produced by the above method can be used for transplantation into a living body.
  • the transplantation may be aimed at direct regeneration of a defective or damaged tissue, or may be aimed at an indirect effect by factors secreted by MSC.
  • MSC has been shown to have therapeutic effects in patients with acute myocardial infarction, stroke, multiple system atrophy (MSA), graft-versus-host disease, and spinal cord injury.
  • transplantation may be performed after some differentiation induction is performed on the MSC as described below.
  • genetic modification can be applied to MSCs prior to transplantation using gene editing techniques or the like.
  • One aspect of the present invention is: i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, iii) isolated in step ii. And iv) a method of treating a disease or injury comprising the step of transplanting the expanded cells into a patient.
  • the injury can be, for example, meniscal damage.
  • One embodiment of the present invention can be, for example, a cell composition for use in the treatment of meniscal injury.
  • One embodiment of the production method the present invention cells for transplant to a process for the preparation of cells for transplantation.
  • Such cell production methods include, for example, i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, and iii) step ii. A step of inducing differentiation into the isolated cell. Details regarding steps i and ii are as described elsewhere herein.
  • any method known for inducing differentiation of MSC can be used.
  • Mesenchymal stem cells have multipotency into osteoblasts, bone cells, and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells can be differentiated into chondrocytes, muscle cells, stromal cells, tendon cells, etc., depending on the differentiation induction conditions.
  • Methods for inducing differentiation of mesenchymal stem cells are known to those skilled in the art, and various culture media for inducing differentiation are commercially available. The culture conditions and period can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the chondrocyte induction medium can be purchased from LONZA Corporation and used.
  • One aspect of the present invention is: i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, iii) isolated in step ii.
  • the present invention relates to a method for treating a disease or injury, comprising a step of inducing differentiation into a differentiated cell, and iv) a step of transplanting the cell in which differentiation is induced into a patient.
  • the injury can be, for example, meniscal damage.
  • One embodiment of the present invention can be a cell composition comprising differentiated cells for use, for example, in the treatment of meniscal injury.
  • Kits One aspect of the present invention relates to kits for use in the isolation, purification or enrichment of mesenchymal stem cells (MSCs).
  • the kit according to one embodiment includes an anti-CD73 antibody.
  • the antibody is preferably GMP grade.
  • a kit for isolating MSCs by flow cytometry includes, for example, fluorescently labeled anti-CD73 antibody, anti-CD31 antibody, and anti-CD45 antibody.
  • the kit for flow cytometry may further include another antibody that recognizes another marker for removing blood cells / endothelial cells, and the anti-CD31 antibody and the anti-CD45 antibody recognize another antibody that recognizes another marker. May be replaced.
  • the kit for isolating MSC using a carrier such as beads (microspheres) contains a carrier to which an anti-CD73 antibody is bound.
  • the bond between the antibody and the carrier may be a covalent bond, a hydrogen bond, or the like, but is not particularly limited.
  • the anti-CD73 antibody need not be directly bound to the carrier, but may be indirectly bound.
  • the kit according to one embodiment can include, for example, an anti-CD73 antibody and a carrier bound to another antibody that binds to the anti-CD73 antibody.
  • the carrier can be a bead, such as a magnetic bead, but is not limited thereto.
  • a simple substance such as agarose can be used instead of the bead, and the bead can be a magnetic agarose bead.
  • Various beads (microspheres) are commercially available and can be used in the present invention.
  • the kit for isolating MSC using affinity chromatography includes a column packed with a carrier to which an anti-CD73 antibody is bound.
  • the kit according to one embodiment can include, for example, a buffer for use in elution of cells bound to the column.
  • one aspect of the present invention relates to a method for producing a CD73 positive cell composition.
  • One aspect of such a production method is, for example, i) preparing a population of fresh cells isolated from a living body, ii) isolating cells expressing CD73 protein on the surface, and Optionally iii) expanding the cells isolated in step ii. Details regarding steps i and ii are as described elsewhere herein.
  • the step of growing the cells includes, for example, cell culture for 3 to 30 days, alternatively 10 to 20 days, for example 14 days.
  • the cell composition obtained by such a method has at least 10 3 , for example, at least 10 4 , preferably 10 5 or more, more preferably 10 6 or more, and even more preferably 10 7 or more CD73 positive cells. including.
  • cells other than CD73 positive cells may be mixed in this cell composition, it is preferable that the purity of CD73 positive cells is high.
  • the purity of CD73 positive cells in the present cell composition is at least 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, 90% or more, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more. It is. From the viewpoint of increasing purity, separation of cells by FACS is preferred.
  • the cells contained in the present cell composition are preferably human cells, but are not particularly limited. In one embodiment of the present invention, the cell composition containing CD73 positive cells is contained in one container.
  • This cell composition can be used, for example, for transplantation for therapeutic purposes.
  • Cell transplantation can be performed, for example, for the purpose of regenerating damaged sites, for the purpose of regenerating tissues with reduced function, or for the purpose of suppressing inflammation or immune reactions.
  • the target of transplantation is preferably a human, but is not particularly limited.
  • One aspect of the present invention is at least 10 3 , for example 10 4 or more, preferably 10 5 or more, more preferably 10 6 or more, more preferably 10 7 for use in the treatment of a disease or injury. It relates to a cell composition comprising one or more CD73 positives.
  • Diseases or injuries to be treated include, for example, inflammatory diseases, immune disorders, autoimmune diseases, collagen diseases, allergic diseases, graft-versus-host disease (GVHD), inflammatory bowel diseases, ulcerative colitis, Crohn's disease, Muscle damage, muscle rupture, congenital or acquired myopathy, muscular dystrophy, congenital myopathy, distal myopathy, myotonic disorder, inflammatory myopathy, periodic limb paralysis, metabolic myopathy, myasthenia gravis , Including, but not limited to, congenital myasthenia syndrome, mitochondrial disease, and sarcopenia.
  • the cell composition may be transplanted with other cells or tissues.
  • Transplantation efficiency improving composition One aspect of the present invention relates to a composition for improving the transplantation efficiency or engraftment rate of a graft (cell or tissue) comprising the CD73 positive cell composition according to the present invention.
  • a composition for improving the transplantation efficiency or engraftment rate of a graft comprising the CD73 positive cell composition according to the present invention.
  • the present inventors co-administered CD73-positive cells of the allogeneic family (derived from the same type of mouse as the skeletal muscle satellite cells), and surprisingly, the skeletal muscle satellite cells derived from the other family were produced as regenerating muscles. I found that I can wear it.
  • One embodiment of the present invention also relates to a method for treating a disease or injury, comprising transplanting a target cell or tissue and a CD73 positive cell together. More specifically, one aspect of the present invention relates to a method for regenerating muscle tissue comprising administering a CD73 positive cell composition together with muscle satellite cells to a subject in need of treatment.
  • one aspect of the present invention relates to the use of CD73 positive cells to improve the transplantation efficiency or engraftment of the cell or tissue of interest.
  • a preferable graft (cell or tissue) is of the same type or other type, the present invention is not limited to this, and a heterologous type or autologous cell or tissue may be used.
  • the CD73 positive cells may be either allogeneic or autologous. Specific disease states include graft versus host disease (GVHD).
  • one embodiment of the present invention relates to a method for increasing the efficiency of cell therapy, comprising administering a CD73-positive cell composition simultaneously with cells of another family in cell therapy using other cells. Furthermore, one aspect of the present invention relates to a CD73-positive cell composition for co-administration with an allogeneic cell in order to increase cell therapy efficiency in cell therapy using an allogeneic cell.
  • Anti-inflammatory composition relates to an anti-inflammatory composition comprising the CD73 positive cell composition of the present invention.
  • the present inventors have clarified that the pathological condition can be improved by administration of CD73 positive cells in a mouse model of ulcerative colitis. Further, it has been shown that infiltration of inflammatory cells can be suppressed by simultaneously transplanting CD73 positive cells at the time of transplantation of muscle satellite cells to a muscle injury site. Therefore, it will be understood by those skilled in the art that CD73 positive cells can be used to suppress the inflammatory response of the living body.
  • One embodiment of the present invention also relates to a method for treating an inflammatory disease, comprising administering CD73 positive cells to a subject in need of treatment.
  • one aspect of the present invention relates to a method for treating inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease) comprising administering a CD73 positive cell composition to a subject in need of treatment.
  • inflammatory bowel disease ulcerative colitis, Crohn's disease
  • one aspect of the present invention relates to the use of CD73 positive cells for use in inhibiting inflammatory responses or treating inflammatory diseases.
  • Immunosuppressive composition One aspect of the present invention relates to an immunosuppressive composition or an immune tolerance inducing composition comprising the CD73 positive cell composition according to the present invention.
  • the present inventors co-administered CD73-positive cells of the allogeneic family (derived from the same type of mouse as the skeletal muscle satellite cells), and surprisingly, the skeletal muscle satellite cells derived from the other family were produced as regenerating muscles. I found that I can wear it. When cells or tissues are transplanted into a living body, normally, unless an immunosuppressive agent is administered, other cells cannot engraft after transplantation. It is understood that can be suppressed or immune tolerance can be induced.
  • One embodiment of the present invention also relates to an immunosuppression (immune tolerance induction) method comprising administering CD73 positive cells to a subject in need of treatment. Furthermore, one aspect of the present invention relates to the use of CD73 positive cells for use in suppressing immune responses (inducing immune tolerance) or treating immune diseases.
  • the present inventors examined the function of CD73 positive cells contained in human, mouse and rat bone marrow tissues. Cells were selected from bone marrow tissue using the surface antigen of CD73 as an index, and it was verified whether CD73-positive cells contained cells exhibiting a phenotype of mesenchymal stem cells. In addition, it was verified that the grafts were efficiently engrafted when transplanted into the subcutaneous tissue. Specific experimental examples are shown below.
  • Example 1 Surface antigen analysis of CD73 + cells present in bone marrow tissue> (Collecting and preparing bone marrow cells) Materials were human bone marrow mononuclear cells (Catalog Number: 2M-125C) (20 years old or less, male), rats (Lewis, 8-10 weeks old, male), mice (C57BL / 6-J) purchased by LONZA. 6-9 weeks old). Frozen human bone marrow mononuclear cells (2M-125C) that had been stored in liquid nitrogen were removed and warmed in a 37 ° C. thermostat for 1 minute.
  • human bone marrow mononuclear cells Catalog Number: 2M-125C
  • rats Lewis, 8-10 weeks old, male
  • mice C57BL / 6-J
  • HBSS ( ⁇ ) solution Hanks' Balanced Salt Solution
  • ⁇ Hanks' Balanced Salt Solution
  • Centrifugation was performed at room temperature for 5 minutes in a centrifuge (800 g), the supernatant was removed, and then the cell pellet was resuspended in fresh HBSS ( ⁇ ) solution to obtain a human bone marrow cell suspension.
  • Rat and mouse bone marrow cells were collected from adult femur, tibia and iliac.
  • the removed femur, tibia, and iliac bone were washed with PBS ( ⁇ ) after removing the outer muscles and connective tissue with a nonwoven fabric.
  • PBS ⁇
  • osteotomy scissors Matsuyoshi Medical General
  • surgical scissors Muromachi Kikai
  • the bone fragments were washed with HBSS ( ⁇ ) solution, and blood cells were washed away.
  • the remaining bone fragments were further minced and placed in 0.2% collagenase solution (wako) (DMEM) supplemented with 25 U / ml DNase 1 (Sigma) and shaken at 37 ° C.
  • DMEM collagenase solution
  • 25 U / ml DNase 1 Sigma
  • the collagenase-treated bone fragments were further minced with scissors, washed with HBSS ( ⁇ ) solution while gradually crushing with a pestle, and filtered with a 70 ⁇ m mesh cell strainer (Falcon). Centrifugation was performed at 800 ° C. for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed. Then, the cell pellet was resuspended in fresh HBSS ( ⁇ ) solution to obtain rat and mouse bone marrow cell suspensions. In order to remove the red blood cells, the cell pellet after centrifugation was subjected to hemolysis with ACK solution (LONZA) or water. Red blood cell debris and the like were removed with a cell strainer to obtain a bone marrow suspension.
  • ACK solution LONZA
  • Bone marrow cells (2.0 ⁇ 10 8 to 4.0 ⁇ 10 8 ) obtained by the above method were suspended in 1 ml of HBSS ( ⁇ ) solution and added to a 15 ml centrifuge tube. 2 to 3 ⁇ L of 1-fold diluted APC or PE labeled anti-human CD73 antibody, PE-cy7 labeled anti-CD31 antibody, PE-cy7 labeled anti-CD45 antibody, PE-cy7 labeled anti-CD235a antibody (antibody amount 0.45 to 0.7 ⁇ g) ) Suspended in a cell suspension and dispensed 200 ⁇ L into a tube.
  • APC-labeled anti-human CD29 antibody, APC-labeled anti-CD44 antibody, FITC-labeled anti-CD90 antibody, PE-labeled anti-CD271 antibody and APC-labeled anti-leptin receptor antibody are added to each tube, and 30 minutes on ice The antibody was stained and immunostained (using an antibody manufactured by BD and an antibody manufactured by R & D).
  • APC or PE-labeled anti-mouse CD73 antibody, PE-cy7-labeled anti-CD31 antibody, PE-cy7-labeled anti-CD45 antibody, and PE-cy7-labeled anti-Ter119 antibody were suspended in the cell suspension, and 200 ⁇ L was dispensed into a tube.
  • As mouse mesenchymal stem cell markers FITC-labeled anti-mouse CD29 antibody, FITC-labeled anti-CD44 antibody, PE-labeled anti-CD90 antibody, APC-labeled anti-CD140a antibody, biotin-labeled anti-leptin receptor antibody, and PE-labeled streptavidin were added to each tube.
  • the antibody was stained with light on ice for 30 minutes for staining (using an antibody manufactured by BD).
  • 1-fold diluted APC-labeled anti-rat CD73 antibody, biotin-labeled anti-CD31 antibody, biotin-labeled anti-CD45 antibody, and PEcy7-labeled streptavidin were suspended in the cell suspension, and 200 ⁇ L was dispensed into a tube.
  • FITC-labeled anti-rat CD29 antibody PE-labeled anti-CD44 antibody, FITC-labeled anti-CD54 antibody, and BV421-labeled anti-CD90 antibody were added to each tube, and light-shielded for 30 minutes on ice for immunoantibody staining. (Use antibody from BD). Thereafter, 500 ⁇ L of HBSS ( ⁇ ) solution was added, and centrifuged at 800 g at 4 ° C. for 5 minutes.
  • the precipitated cell population was suspended in 3 mL of an HBSS ( ⁇ ) solution to which propidium iodide (hereinafter referred to as PI) was added at a concentration of 2 ⁇ g / mL to prepare about 1 ⁇ 10 7 cells.
  • a cell suspension obtained using a meshed 5 ml round tube (BD) was used for analysis by the following flow cytometer.
  • a gate was set for the cell population negative for blood cells / endothelial marker and positive for CD73 marker, and expression analysis of the mesenchymal stem cell marker in the cell population was performed.
  • CD73 positive cells present in human and mouse bone marrow were all positive for CD29, CD44, CD90, CD271 (human), CD140a (mouse), and leptin receptor (see FIG. 1, Tables 1 and 2).
  • CD73 positive cells present in human adipose tissue were separable with the above-mentioned antibody (clone AD2), and expressed mesenchymal stem cell markers CD29, CD44, and CD90 (see FIG. 2).
  • the CD73 positive cells present in rat bone marrow were generally positive for CD29, CD44, CD54, and CD90 (see FIG. 3 and Table 3).
  • Example 2 Analysis of colony forming ability of CD73 + cells> (Effect of cell purification by CD73)
  • the CD73 positive cells shown in Example 1 were separated using a flow cytometer. 200 ⁇ L of mesenchymal stem cell growth medium (DMEM + 20% FBS + 1% penicillin / streptomycin) was added to a 96-well plate, and 1 cell was sorted with respect to 1 well. The plate was cultured in an incubator at 37 ° C., and after 14 days, wells in which colonies were formed were counted.
  • DMEM + 20% FBS + 1% penicillin / streptomycin mesenchymal stem cell growth medium
  • the colony forming ability which is also a characteristic of mesenchymal stem cells, has a forming ability of 13 times or more compared with whole bone marrow cells (Whole Bone Marrow: WBM) (see FIG. 4). .
  • Example 3 Analysis of engraftment function of CD73 + cells> (Evaluation of engraftment rate by subcutaneous transplantation of mesenchymal stem cells) After CD73 positive cells were isolated and passaged 2 times in a mesenchymal stem cell growth medium, when the number of cells reached 1.0 ⁇ 10 6 to 3.0 ⁇ 10 6 , they were added to a 15 ml centrifuge tube and centrifuged. did. The pellet cells were suspended in chondrocyte induction medium (LONZA) + TGFb3 + BMP6, centrifuged at 200 g for 4 minutes, and cultured in a 37 ° C. incubator. Every 4 days, a new chondrocyte induction medium was replaced and differentiation induction was performed for 2 weeks.
  • chondrocyte induction medium LONZA
  • the obtained chondrocyte pellet was transplanted into the rat subcutaneous tissue of the rat, and the tissue was collected after 2 weeks to prepare a frozen section and a paraffin-embedded section.
  • the frozen section was stained with Iba1 antibody (Wako), which is a macrophage marker, Aggrecan antibody (developmentalDevelopStudies Hybridoma Bank) staining the cartilage matrix, and DAPI (Vector) staining the cell nucleus.
  • the paraffin sections were stained with safranin O (Mudo Chemical), which stains the cartilage matrix.
  • Example 4 Separation of CD73 positive cells from human mesenchymal tissue>
  • the bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, amniotic membrane, chorion, villi and umbilical cord were crushed and then treated with a 0.2% collagenase solution at 37 ° C. for 1 hour.
  • Cells were labeled with an antibody that specifically recognizes the CD73 protein and analyzed by flow cytometry.
  • CD73 positive cells were 9.5% in the bone marrow, 3.07% in the visceral fat, 20.78% in the subcutaneous fat, 17.41% in the amniotic membrane, 2.35% in the chorion, and 4 in the villi. 0.03% and 2.11% in the umbilical cord were found (see FIG. 6).
  • Example 5 Analysis of colony forming ability of CD73 + cells> The colony forming ability of CD73 positive cells obtained from bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, amniotic membrane, chorion, and villi was examined. CD73 positive cells were not obtained from the umbilical cord. As a result, by using the fresh purification method according to the present invention, out of CD73 positive cells of each tissue, cells having colony forming ability are separated from bone marrow, visceral fat, subcutaneous fat, chorion, and villi with high efficiency. It was found that this is possible (see FIGS. 7 and 8).
  • Example 6 Analysis of proliferation ability of CD73 + cells> The proliferation ability of CD73 positive cells isolated from subcutaneous fat, visceral fat, chorion, and villi was examined. As a result, CD73 positive cells isolated from subcutaneous fat, visceral fat, chorion, and villi proliferate in 14 days of culture, and it is possible to obtain about 100 times the number of cells compared to before culture. (See FIG. 9). Therefore, the fresh purification according to the present invention may reduce the number of administered cells used for transplantation to a living body as compared with the conventional method.
  • Example 7 Mouse model of ulcerative colitis> Mice that caused ulcerative colitis by administering 3% dextran sulfate sodium (DSS) with water were transplanted with CD73 positive cells and MSCs by existing separation methods (see FIG. 10). More specifically, CD73 positive cells were obtained from the subcutaneous fat of 8-week-old male C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) mice, and Vehicle and fresh purified on the first and fifth days of 3% DSS administration CD73 positive cells or MSCs by existing isolation methods (cells cultured for 14 days or 18 days, respectively) were intravenously administered (IV) to 10-week old male C57BL / 6-N mice. Thereafter, DSS administration was discontinued and the large intestine was examined on the 8th day.
  • DSS dextran sulfate sodium
  • ⁇ Example 8 Co-transplantation of skeletal muscle satellite cells and CD73 positive cells> Allogeneic mouse skeletal muscle stem cells (satellite cells) were administered to mice that caused muscle damage by administering cardiotoxin (CTX) to the anterior tibial muscle. Usually, other cells cannot engraft unless an immunosuppressant is administered. However, it has been found that co-administration of CD73 positive cells from the same species of another family (derived from the same type of mouse as the skeletal muscle satellite cells) allows the skeletal muscle satellite cells from other families to be engrafted as regenerative muscle. (See FIGS. 13 and 14).
  • SM / C-2.6 positive muscle satellite cells derived from C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) mice and CD73 positive cells derived from 8-week-old male C57BL / 6-N mice were used.
  • Muscle satellite cells were cultured for 5 days in a medium containing laminin.
  • CD73 positive cells were cultured for 2 weeks.
  • 8-week-old male BALBcA mice were used.
  • Muscle satellite cells were transplanted with 6.0 ⁇ 10 5 cells.
  • CD73 positive cells either 6.0 ⁇ 10 3 cells (SC + CD73-L) or 6.0 ⁇ 10 4 cells (SC + CD73-M) were used for transplantation.
  • Transplantation was performed 1 day after muscle damage was caused by administration of snake venom (CTX), and analysis was performed 14 days after transplantation. As shown in FIGS. 13 and 14, especially when 6.0 ⁇ 10 4 CD73-positive cells are transplanted together with muscle satellite cells (SC + CD73-M), cells derived from allogeneic mice constitute regenerative muscles. The muscle regeneration was promoted.
  • CTX snake venom
  • mesenchymal stem cells can be purified and concentrated easily and efficiently by separating cells expressing CD73 protein on the surface from fresh tissue isolated from a living body. It was. According to the present invention, it is possible to establish a culture system of mesenchymal stem cells that selectively isolates only mesenchymal stem cells with a single antibody before culturing and enhances the engraftment efficiency in the transplanted part. Since the selection is based on a single antibody, there is a significant cost advantage over methods using multiple antibodies. In addition, since the selection is based on a single antibody, the use of an expensive multicolor FACS system is not required, and isolation using magnetic beads or the like becomes possible.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

本発明は、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮する方法を提供する。より具体的には、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮することが可能となる。本発明により、培養前に間葉系幹細胞のみを単一抗体により選択的に分離し、移植部への生着効率を高める間葉系幹細胞の培養系を確立することができる。

Description

移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法 関連出願の相互参照
　本願は、特願２０１７－０９５２１６号（出願日：２０１７年５月１２日）の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
　本発明は、間葉系幹細胞を分離、純化または濃縮する方法に関する。より詳細には、生体から単離された新鮮な組織から、細胞表面のマーカータンパク質の発現を指標にして、間葉系幹細胞を分離、純化または濃縮する方法に関する。また、本発明は、細胞移植などに利用可能な間葉系幹細胞の製造方法、およびそのような方法に用いるキットにも関する。
　間葉系幹細胞は、骨髄や滑膜、脂肪、臍帯の中に存在する体性幹細胞であり、軟骨や骨、脂肪、神経細胞への分化能を有することが報告されている（非特許文献１）。成人の組織からも分離できることから、半月板や軟骨の損傷部の再生治療に用いられている（非特許文献２）。しかしながら、それらの移植細胞は、組織から採取した雑多な細胞集団を培養により増やしたものであり、間葉系幹細胞以外にも組織を構成するその他の細胞が混在している。
　近年、間葉系幹細胞は組織再生のみならず、血球系細胞の移植の際に同時に移植することで免疫寛容を促すという効果が報告されている（非特許文献３）。間葉系幹細胞以外の雑多な細胞が混在することでその効果が減弱することが懸念される。
　間葉系幹細胞の評価法として、細胞増殖の程度や、培養後の細胞の表面抗原発現の解析が行われている（非特許文献４および５）。しかし、雑多な骨髄細胞の中に含まれる間葉系幹細胞以外の細胞までもが増殖すること、さらに、間葉系幹細胞以外の細胞が培養によって間葉系細胞様の抗原発現をすることが明らかにされた（非特許文献６）。
　これまでに、複数の表面マーカーを用いて、ヒトやマウスの間葉系幹細胞を培養前に選択的に分離する系は既に確立されている（非特許文献７および８）。しかしながら、ヒト間葉系幹細胞の分離にはＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）およびＴＨＹ－１（ＣＤ９０）（特許文献１、非特許文献７）に特異的な抗体、マウス間葉系幹細胞の分離にはＰＤＧＦＲα（ＣＤ１４０ａ）およびＳｃａ－１（非特許文献８）に特異的な抗体が使用されており、動物種ごとに異なる抗体が用いられている。
特開２００９－６０８４０号公報
Colter, D. C., Sekiya, I. & Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci. 2001;98:7841-7845. Sekiya I., Muneta T., Horie M. & Koga H. Arthroscopic Transplantation of Synovial Stem Cells Improves Clinical Outcomes in Knees With Cartilage Defects. Clin Orthop Relat Res. 2015;473:2316-26. Salem, H. K. & Thiemermann, C. Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status. 2010;28:585-596. De Bari, C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P. & Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum.2001;44: 1928-1942. Harting, M., Jimenez, F., Pati, S., Baumgartner, J. & Cox, C., Jr. Immunophenotype characterization of rat mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2008;10:243-253. Guanerio J., Coltella N., Ala U., Tonon G., Pandolfi PP. & Bernardi R. Bone Marrow Endosteal Mesenchymal Progenitors Depend on HIF Factors for Maintenance and Regulation of Hematopoiesis. Stem Cell Reports. 2014;2:794-809 Mabuchi, Y. et al. LNGFR(+)THY-1(+)VCAM-1(hi+) cells reveal functionally distinct subpopulations in mesenchymal stem cells. Stem Cell Reports.2013;1:152-165. Morikawa, S. et al. Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med. 2009;206:2483-2496.
　本発明は、ヒトを含む哺乳動物の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を簡便に分離、純化または濃縮する方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、細胞移植などに利用可能な間葉系幹細胞の製造方法、およびそのような方法に用いるキットを提供することも別の目的の一つとしている。
　本発明者らは、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮できることを見出した。本発明により、培養前に間葉系幹細胞のみを単一抗体により選択的に分離し、移植部への生着効率を高める間葉系幹細胞の培養系を確立することができる。本発明により、異なる動物種間で同一の抗原が認識されることが見出されたことより、同一抗原を発現する細胞を用いた非臨床試験での安全性、有効性の評価が可能となり、雑多な細胞集団ではなく新鮮純化細胞を用いることで、安定した移植効果が期待される。
　本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の態様を包含する：
実施態様１
　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、およびｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法。
実施態様２
　ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用いることを特徴とする、実施態様１の方法。
実施態様３
　ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをもＭＳＣを純化するための選択マーカーとして用いないことを特徴とする、実施態様１または２の方法。
実施態様４
　血球／内皮細胞を除去する工程をさらに含むことを特徴とする実施態様１～３の方法。
実施態様５
　血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を用いて血球／内皮細胞を除去することを特徴とする実施態様４の方法。
実施態様６
　ＣＤ７３タンパク質をＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、実施態様１～５の方法。
実施態様７
　生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、脂肪組織、臍帯、胎盤、滑膜、または歯髄由来であることを特徴とする、実施態様１～６の方法。
実施態様８
　生体から単離された新鮮な細胞の集団をコラゲナーゼで処理する工程をさらに含むことを特徴とする、実施態様１～７の方法。
実施態様９
　生体から単離された新鮮な細胞の集団が末梢血由来であることを特徴とする、実施態様１～６の方法。
実施態様１０
　生体から単離された新鮮な細胞の集団がＧ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、またはＡＭ３１００（プレリキサフォル）を生体に投与した後に生体から単離されることを特徴とする、実施態様１～９の方法。
実施態様１１
　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体またはＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、実施態様１～１０の方法。
実施態様１２
　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体が磁気ビーズである、実施態様１１の方法。
実施態様１３
　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体がカラムに充填されている、実施態様１１の方法。
実施態様１４
　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
ｉｉ）抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の純化方法であって、
　ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用い、
　ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをも選択マーカーとして用いず、
　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、純化方法。
実施態様１５
　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む、移植用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法。
実施態様１６
　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程を含む、移植用の細胞の製造方法。
実施態様１７
　ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、実施態様１～１６の方法。
実施態様１８
　抗ＣＤ７３抗体の接合した担体を含む、実施態様１～１６の方法に用いるためのキット
。
実施態様１９
　抗ＣＤ７３抗体の接合した担体が磁気ビーズである、実施態様１８のキット。
実施態様２０
　抗ＣＤ７３抗体の接合した担体がカラムに充填されている、実施態様１８のキット。
実施態様２１
　標識の接合した抗ＣＤ７３抗体を含む、実施態様１～１６の方法に用いるためのキット
。
実施態様２２
　ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、実施態様１８～２１のキット。
実施態様２３
　実施態様１～１６の方法により得られる細胞を含む細胞組成物。
実施態様２４
　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
実施態様２５
　工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程をさらに含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
実施態様２６
　ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、実施態様２４または２５の方法。
実施態様２７
　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、実施態様２４～２６の方法。
実施態様２８
　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、血球／内皮細胞を除去する工程を含まないことを特徴とする実施態様２４～２７の方法。
実施態様２９
　生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛、絨毛膜、または羊膜由来であることを特徴とする、実施態様２４～２８の方法。
実施態様３０
　ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、実施態様２４～２９の方法。
実施態様３１
　ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、実施態様２４～３０の方法。
実施態様３２
　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
ｉｉ）ＦＡＣＳを用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法であって、
　生体から単離された新鮮な細胞の集団が皮下脂肪または内臓脂肪由来であり、
　ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用い、
　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
実施態様３３
　実施態様２４～３２の方法により得られるＣＤ７３陽性細胞組成物。
実施態様３４
　ＣＤ７３陽性細胞の純度が少なくとも９０％である、実施態様３３のＣＤ７３陽性細胞組成物。
実施態様３５
　少なくとも１０３個のＣＤ７３陽性細胞を含む、実施態様３３または３４のＣＤ７３陽性細胞組成物。
実施態様３６
　実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、移植効率改善組成物。
実施態様３７
　実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、抗炎症組成物。
実施態様３８
　実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、免疫抑制組成物。
実施態様３９
　実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物と筋サテライト細胞とを含む、筋損傷または筋疾患の治療に用いるための組成物。
実施態様４０
　実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、炎症性腸疾患の治療に用いるための組成物。
実施態様４１
　実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、ＧＶＨＤの治療または予防に用いるための組成物。
実施態様４２
　他家細胞を用いた細胞治療において、実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を他家の細胞と同時に投与することを含む、細胞治療の効率を上げる方法。
実施態様４３
　他家細胞を用いた細胞治療において、細胞治療効率を上げるために他家細胞と同時投与するための、実施態様３３～３５のＣＤ７３陽性細胞組成物。
ヒトおよびマウス骨髄においてＣＤ７３陽性細胞が間葉系幹細胞のマーカーを発現していることを示す図である。 ヒト脂肪組織中のＣＤ７３陽性細胞の表面抗原解析データを示す図である。 ラット骨髄においてＣＤ７３陽性細胞が間葉系幹細胞のマーカーを発現していることを示す図である。 ＣＤ７３抗体を用いて新鮮純化された細胞集団が、全骨髄細胞と比較し高いコロニー形成能力を有していることを示す図である。 ＣＤ７３抗体によって分離、培養された細胞集団が効率よく移植部に生着し、マクロファージの浸潤を抑制していることを示す画像である。 図６は、ヒト間葉系組織（骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛、および臍帯）に含まれるＣＤ７３陽性細胞の割合を分析した結果を示す図である。 図７は、骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛から得られるＣＤ７３陽性細胞のコロニー形成能力を調べた結果を示すグラフである。 図８は、骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛から得られるＣＤ７３陽性細胞のコロニー形成能力を調べた結果を示す培養皿の写真である。 図９は、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛膜、絨毛から分離したＣＤ７３陽性細胞の増殖能力を調べた結果を示すグラフである。培養開始時（Ｄａｙ０）を１とした場合の培養１４日目（Ｄａｙ１４）における相対的な細胞数が示されている。 図１０は、潰瘍性大腸炎マウスモデルを用いた実験のプロトコルを示す図である。 図１１は、潰瘍性大腸炎マウスモデルにおけるＣＤ７３陽性細胞の投与の影響を示す写真およびグラフである。左の写真は実験の８日目に摘出した大腸を示している。右のグラフは結腸の長さを分析した結果を示すグラフである。 図１２は、直腸炎症部位の組織学的検討の結果を示す写真およびグラフである。左の写真は、ＣＤ７３陽性細胞の投与により、移植した細胞が炎症部にホーミングし、大腸の構造を保持する効果があることを示している。右のグラフは、ＣＤ７３陽性細胞投与群では炎症度スコアが有意に低くなっていること示している。 図１３は、カルディオトキシン（ＣＴＸ）を前脛骨筋に投与することで筋損傷を引き起こしたマウスに、同種他家マウスの骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を投与した結果を示す画像である。同種他家のＣＤ７３陽性細胞を共投与した。 図１４は、カルディオトキシン（ＣＴＸ）を前脛骨筋に投与することで筋損傷を引き起こしたマウスに、同種他家マウスの骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を投与した結果を示す画像である。同種他家のＣＤ７３陽性細胞を共投与した。
　上述のとおり、本発明者らは、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮できることを見出した。以下に、本発明を詳細に説明する。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
　間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、臍帯、骨髄、脂肪組織などの複数の組織に存在する多能性の成体幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は稀な細胞であるが、骨髄には１万から１０万個の有核骨髄細胞につき１個の割合で存在すると推定されている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は自己増殖能を有し、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などの様々な細胞種に分化することができることから、再生医療への応用が期待されている。
　Dominici et al., Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement., Cytotherapy. 2006;8(4):315-7による定義では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、（１）プラスチック培養容器に接着し、（２）ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ７３（エクト５’－ヌクレオチダーゼ）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）を陽性マーカー、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＣｌａｓｓＩＩ（ＤＲ）を陰性マーカーとし、（３）骨、脂肪、軟骨への分化能を有する細胞であるとされている。従来的な間葉系幹細胞の単離方法では、プラスチック培養容器に接着して増殖するというＭＳＣの性質が利用される。
　ＭＳＣとして同定されるためには、培養された細胞集団の９５％よりも多くがＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現しなければならず、そして、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９またはＣＤ７９α、およびＨＬＡ－ＤＲに関して陰性（≦２％の陽性細胞）でなければならない、とされているが、これらの抗原プロファイルは、人工的な環境下において細胞を培養した後に明らかにされるものであることに留意すべきである。
　上述のように、間葉系幹細胞は多くの場合、骨髄等の組織から得た細胞を長期間培養した後に、培養皿に付着した細胞を増殖させることによって単離されているが、開始材料に含まれる細胞の不均一性などにより、最終的に得られる幹細胞の品質にばらつきが生じている。そのため、表面抗原マーカーを用いて間葉系幹細胞を単離する技術が開発されており、例えば、Ogataらは細胞表面マーカーとしてＬＮＧＦＲとＴＨＹ－１の２つを用いてヒトＭＳＣを純化できることを示している（Ogata et al., PLoS One. 2015 Jun 8;10(6):e0129096.）。
ＣＤ７３（ecto-5'-nucleotidase）
　ＣＤ７３はエクト－５’－ヌクレオチダーゼとも呼ばれる酵素であり、一般にＡＭＰをアデノシンに変換する働きを有する。従来から、ＣＤ７３は、ＭＳＣを定義する陽性マーカーの一つに含められている。しかしながら、これまでＣＤ７３のみの発現を指標にしてＭＳＣを単離できることは知られていなかった。本発明者らは、予想外かつ驚くべきことに、ＣＤ７３のみの発現を指標にして、ヒト、マウスおよびラットのＭＳＣを実質的に純化できることを見出した。
純化方法
　本発明の一つの態様は、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、およびｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法に関する。ここで、新鮮な細胞とは、生体から分離した直後の、培養工程に付していない細胞を意味するが、新鮮な細胞は、生体から分離した直後に凍結保存されたものであってもよい。なお、本明細書における発明の詳細な説明の文脈において、ＭＳＣの純化方法は、ＭＳＣの単離方法あるいは濃縮方法とみなすこともできる。本開示の方法により処理した細胞の集団は、処理前の細胞の集団に比べて、細胞集団中におけるＭＳＣの比率が少なくとも１０％高まっている。ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏで行われ、フローサイトメトリーを用いた選別（ＦＡＣＳ）、アフィニティー・クロマトグラフィー、イムノパニング、磁気ビーズなどの担体を用いた分離を利用することができるが、選別の方法はこれらに限定はされない。
　本明細書に記述されるＭＳＣの純化方法は、別の言い方をすれば、ＣＤ７３陽性細胞の純化方法、単離方法、あるいは濃縮方法であるとも言える。また、本明細書の開示に従う細胞の純化方法は以下、「新鮮純化法」と呼ぶ場合がある。
　本明細書における発明の詳細な説明の文脈において、生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程は、人体から組織を単離する外科的な工程は含まないと解される。本発明の一つの態様は、生体から新鮮な細胞の集団（組織）を単離する工程をさらに含むことができる。
　本発明の一つの態様は、ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用いることを特徴とする方法に関する。すなわち、培養された細胞をＭＳＣとして同定する際にマーカーとして用いられるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａまたはレプチンレセプターのいずれをもＭＳＣを純化するための陽性選択マーカーとしては使用しない。本発明の一つの態様では、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａまたはレプチンレセプターは、選択マーカーとしては使用せず、陰性選択マーカーとしても使用しない。本発明の一つの態様では、ＣＤ７３タンパク質がＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いられる。
　本発明の一部の態様では、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ７９α、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３１、およびＧＰＡから選択される１または複数の細胞表面マーカーも選択マーカーとして使用しない。
　単一のマーカーを指標にして選択することから、このような態様に係る方法は、複数の抗体を用いる方法に比べてコスト面で大きな優位性があるとみなされうる。このような視点は、ＧＭＰグレードの抗体の使用が要求される状況では特に重要となる。また、高価なマルチカラーＦＡＣＳシステムの使用が要求されず、磁気ビーズ等の担体を用いた簡便な単離も可能となる。
　本発明の一つの態様は、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとして用いる方法に関する。後述するように、ＦＡＣＳを用いて細胞の純化を行う場合は、これらの陰性選択マーカーを用いることで容易に細胞の純度を高めることができる。
　生体から単離された新鮮な細胞を用意する際における細胞の供給源としては、例えば、哺乳動物の骨髄、臍帯、臍帯血、末梢血、滑膜、脂肪組織などが挙げられる。好ましい細胞の供給源の一つは骨髄であるが、骨髄は、脊椎、胸骨、肋骨、大腿骨、脛骨、腸骨等の骨髄を用いることができる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラットを挙げることができるが、これらに限定はされない。本開示に係るＣＤ７３を指標とするＭＳＣの純化方法は、ヒト、マウス、ラットに共通して適用可能であるという優れた利点を有している。好ましくは、本開示に係る純化方法は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の純化に利用される。
　生体から単離された新鮮な細胞を用意する際における細胞の供給源としては、上記のものに加えて、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛を挙げることができる。皮下脂肪、内臓脂肪などの脂肪組織には、比較的、容易に入手されうるという利点がある。また、絨毛もかなりの量（１人の妊婦から５００ｇ弱）を得ることができることから、細胞を入手するための良いソースとなりうる。
　生体から単離した組織から目的の細胞を調製する際、組織中に含まれる間葉系幹細胞と他の細胞とを解離させるために、組織材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行うことができる。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられる酵素が使用できるが、好ましくはコラゲナーゼで処理される。より具体的には、例えば、０．２％コラゲナーゼ溶液により３７℃で１時間処理する。また、末梢血から細胞を得る場合、例えば、材料を低張溶液で処理するなどして、材料に混入している赤血球を予め溶血しておくことが好ましい。細胞を得る際、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、またはＡＭ３１００（プレリキサフォル）を生体に投与した後に生体から単離した細胞の集団を用いてもよい。
　生体から単離した組織に血球細胞が含まれている場合には、細胞表面のＣＤ４５タンパク質とＣＤ２３５ａタンパク質の発現を指標に細胞を選別して取り除いてもよいが、表面マーカーはこれらに限定されず、例えば、ＣＤ３１タンパク質等も利用できる。選別方法としては、蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーや、磁気ビーズ、イムノパニング、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。なお、ＣＤ４５－ＣＤ２３５ａ－細胞等の選別は、ＭＳＣの単離（純化、濃縮）前であっても、同時であっても、単離（純化、濃縮）後であってもよい。また、生体から単離した組織から目的の細胞を調製する際、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの死細胞を染色する蛍光色素と細胞集団とを反応させ、蛍光で染色された細胞を除去することにより、予め死細胞を除去してもよい。
　本発明の一つの態様は、血球／内皮細胞を除去する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法に関する。この態様の純化方法は、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）血球／内皮細胞を除去する工程、およびｉｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む。より具体的には、血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を用いて血球／内皮細胞を除去することができる。本開示の方法においては、血球／内皮細胞を除去した後、ＣＤ７３タンパク質をＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いて、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化することができる。
　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する際には、例えば、ＣＤ７３タンパク質を特異的に認識する抗体を使用することができる。抗体は、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ等の蛍光色素で標識されていてもよい。使用可能な抗体は、例えば、ヒトＣＤ７３抗体の場合、クローンＡＤ２（ＢＤバイオサイエンス）などである。使用する抗体の特徴（モノクローナル／ポリクローナル抗体、アイソタイプ、全長／断片、等）や抗体の濃度は、当業者であれば、細胞の由来する組織、抗体の活性、抗体の使用方法等を考慮して適宜決定することができる。ヒト、マウス、ラットを含む哺乳動物のＣＤ７３タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は公知であり、それらの情報をもとに抗ＣＤ７３抗体を作製して使用してもよい。ヒト、マウス、ラットのＣＤ７３タンパク質を認識する抗体としては、同一の抗体を用いても、各動物種ごとに異なる抗体を用いてもよい。単離したＭＳＣをヒトの再生医療に利用する場合は、ＧＭＰグレードの抗体が利用される。
　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離は、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）やイムノパニング、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いて、あるいは磁気ビーズなどの担体を用いて行うことができる。本開示に係るＭＳＣ純化方法においては、上述のように、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、従来的なＭＳＣの単離に用いられる接着培養工程は行われない。
　ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）では、蛍光抗体で細胞を染色し、個々の細胞が発する蛍光を測定して分析することによって、特定の細胞を分取（ソーティング）する。ＦＡＣＳシステムとしては、例えば、ＢＤバイオサイエンス社のＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーターを使用することができる。蛍光標識した抗ＣＤ７３抗体を用いてＣＤ７３＋細胞を選別するが、当業者であれば、セルソーターの設定は適宜行うことができる。また、ＣＤ７３＋細胞を選別する際、血球／内皮細胞を取り除くためにＣＤ３１－ＣＤ４５－ＣＤ２３５ａ－を条件に加えてもよいが、このような陰性選択マーカーは、これらに限定はされない。
　細胞の単離は、抗ＣＤ７３抗体の結合したビーズ（マイクロスフェア）などの担体を用いて行うこともできる。担体はビーズ、例えば磁気ビーズであることができるが、これに限定はされない。ビーズの代わりにアガロースなどの別の単体を用いることもでき、ビーズは磁気アガロースビーズであってもよい。様々なビーズ（マイクロスフェア）が市販されており、本発明において利用することができる。
　抗体と担体との結合は、共有結合、水素結合等でありうるが、特に限定はされない。抗ＣＤ７３抗体は担体に直接結合している必要はなく、間接的に結合するものであってもよい。抗体と担体との間にリンカー（例えば、ビオチン－アビジン系）を介在させることにより、抗体と担体との分離を容易にすることができる。また、例えば、抗ＣＤ７３抗体を細胞に結合させ、抗ＣＤ７３抗体を認識する別の抗体に結合した担体を用いて、細胞の単離を行うこともできる。
　骨髄細胞を用いる場合、抗ＣＤ７３抗体の結合した担体による細胞の単離に先立ち、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）磁気ビーズ選択などを用いて、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞を取り除いてもよい。
　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体をカラムに充填し、そこに細胞試料を通過させることによって、アフィニティー・クロマトグラフィーにより純化を行うこともできる。
移植用間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法
　本発明の一つの態様は、移植用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法に関する。このような製造方法に係る態様の一つは、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む。工程ｉおよびｉｉに関する詳細は、本明細書中の他の部分に述べられているとおりである。
　工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程には、ＭＳＣの培養について知られている任意の方法を用いることができる。間葉系幹細胞増殖培地は、当業者に公知であり、様々な培地が市販されている。培養条件、期間は当業者が適宜決定することができる。
　本発明の一つの態様は、上記の方法により製造されるＭＳＣを含む細胞集団あるいは細胞組成物に関する。本発明者らは、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することによって純化した細胞集団は、移植部への生着効率が高いことを見出した。本発明に係るＭＳＣを含む細胞集団は細胞集団中に少なくともＭＳＣを２％以上含み、好ましくは１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、または８０％以上、さらに好ましくは９０％以上含む。全体に占めるＭＳＣの割合は、細胞表面のマーカーを指標にして測定することができる。
　上記の方法により製造されたＭＳＣを含む細胞集団は、生体への移植に用いることができる。移植は、欠損あるいは傷害した組織の直接的な再生を目的としたものでも、あるいはＭＳＣが分泌する因子による間接的な効果を目的としたものであってもよい。例えば、ＭＳＣは、急性心筋梗塞、脳卒中、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、移植片対宿主病、および脊髄損傷の患者において、治療効果が得られる可能性が示されている。
　特定の組織の再生を目的とする場合は、下記においても述べるように、ＭＳＣに何らかの分化誘導を行った後、移植を行ってもよい。また、遺伝子編集技術等を用いて、移植前にＭＳＣに遺伝子改変を加えておくこともできる。
　本発明の一つの態様は、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程、およびｉｖ）増殖させた細胞を患者に移植する工程を含む、疾患または傷害の治療方法に関する。傷害は例えば、半月板の損傷でありうる。本発明の一つの態様は、例えば、半月板損傷の治療に用いるための細胞組成物でありうる。
移植用細胞の製造方法
　本発明の一つの態様は、移植用の細胞の製造方法に関する。このような細胞の製造方法は、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程を含む。工程ｉおよびｉｉに関する詳細は、本明細書中の他の部分に述べられているとおりである。
　工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程には、ＭＳＣの分化誘導について知られている任意の方法を用いることができる。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞への多分化能を有する。間葉系幹細胞は、分化誘導の条件に応じて、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等へも分化させることができる。間葉系幹細胞の分化誘導方法は、当業者に公知であり、様々な分化誘導用培地が市販されている。培養条件、期間は当業者が適宜決定することができる。例えば、軟骨細胞誘導培地は、ＬＯＮＺＡ社等から購入して使用することができる。
　本発明の一つの態様は、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程、およびｉｖ）分化を誘導した細胞を患者に移植する工程を含む、疾患または傷害の治療方法に関する。傷害は例えば、半月板の損傷でありうる。本発明の一つの態様は、例えば、半月板損傷の治療に用いるための、分化を誘導した細胞を含む細胞組成物でありうる。
キット
　本発明の一つの態様は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離、純化または濃縮に用いるためのキットに関する。一つの態様に係るキットは、抗ＣＤ７３抗体を含む。抗体は好ましくはＧＭＰグレードである。
　フローサイトメトリーによってＭＳＣを単離するためのキットは、例えば、蛍光標識した抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体を含む。フローサイトメトリー用のキットは、血球／内皮細胞を取り除くための他のマーカーを認識する別の抗体をさらに含んでいてもよく、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体は他のマーカーを認識する別の抗体と置き換えてもよい。
　ビーズ（マイクロスフェア）などの担体を用いてＭＳＣを単離するためのキットは、抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を含む。抗体と担体との結合は、共有結合、水素結合等でありうるが、特に限定はされない。抗ＣＤ７３抗体は担体に直接結合している必要はなく、間接的に結合するものであってもよい。一つの態様に係るキットは、例えば、抗ＣＤ７３抗体と、抗ＣＤ７３抗体に結合する別の抗体に結合した担体を含むことができる。
　担体はビーズ、例えば磁気ビーズであることができるが、これに限定はされない。ビーズの代わりにアガロースなどの別の単体を用いることもでき、ビーズは磁気アガロースビーズであることができる。様々なビーズ（マイクロスフェア）が市販されており、本発明において利用することができる。
　アフィニティー・クロマトグラフィーを用いてＭＳＣを単離するためのキットは、抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を充填したカラムを含む。一つの態様に係るキットは、例えば、カラムに結合した細胞の溶出に用いるためのバッファーを含むことができる。
ＣＤ７３陽性細胞組成物
　本発明の細胞純化方法を用いることにより、高純度なＣＤ７３陽性細胞集団または細胞組成物を得ることができる。よって、本発明の一つの態様は、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法に関する。このような製造方法に係る態様の一つは、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、および場合によりｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む。工程ｉおよびｉｉに関する詳細は、本明細書中の他の部分に述べられているとおりである。細胞を増殖させる工程は例えば、３～３０日間、あるいは１０～２０日間、例えば１４日間の細胞培養を含む。このような方法により得られる細胞組成物は、少なくとも１０３個、例えば、少なくとも１０４個、好ましくは１０５個以上、より好ましくは１０６個以上、さらに好ましくは１０７個以上のＣＤ７３陽性細胞を含む。なお、本細胞組成物にはＣＤ７３陽性細胞以外の細胞が混入していても良いが、ＣＤ７３陽性細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物におけるＣＤ７３陽性細胞の純度は、少なくとも５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上である。純度を高めるという観点からは、ＦＡＣＳによる細胞の分離が好ましい。本細胞組成物に含まれる細胞は、好ましくはヒトの細胞であるが、特に限定はされない。本発明の一つの態様では、ＣＤ７３陽性細胞を含む細胞組成物は１つの容器に納められている。
　本細胞組成物は、例えば、治療を目的とした移植に用いることができる。細胞の移植は、例えば、損傷した部位の再生を目的として、機能の低下した組織の再生を目的として、あるいは炎症や免疫反応の抑制を目的として、行うことができる。移植の対象は、好ましくはヒトであるが、特に限定はされない。本発明の一つの態様は、疾患または傷害の治療に用いるための、少なくとも１０３個、例えば、１０４個以上、好ましくは１０５個以上、より好ましくは１０６個以上、さらに好ましくは１０７個以上のＣＤ７３陽性を含む細胞組成物に関する。治療の対象となる疾患または傷害は例えば、炎症性疾患、免疫異常、自己免疫疾患、膠原病、アレルギー疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、筋損傷、筋断裂、先天性または後天性の筋疾患、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、遠位型ミオパチー、筋強直性疾患、炎症性筋疾患、周期性四肢麻痺、代謝性筋疾患、重症筋無力症、先天性筋無力症候群、ミトコンドリア病、 およびサルコペニアを含むが、これらに限定はされない。本細胞組成物は、他の細胞または組織と一緒に移植されてもよい。
移植効率改善組成物
　本発明の一つの態様は、本発明に係るＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、移植片（細胞または組織）の移植効率または生着率を改善するための組成物に関する。細胞または組織を生体に移植する場合、通常は、免疫抑制剤を投与しない限り、他家の細胞は移植後に生着できない。本発明者らは、同種他家（骨格筋サテライト細胞と同じ種のマウス由来）のＣＤ７３陽性細胞を共投与することで、驚くべきことに、他家由来の骨格筋サテライト細胞が再生筋として生着可能となることを見出した。ＣＤ７３陽性細胞を共投与した場合、移植部位への炎症細胞の浸潤が抑制される。よって、当業者には、ＣＤ７３陽性細胞を目的とする移植片（細胞または組織）と共に移植することで、移植片の生着率を高めることができることが理解される。また、本発明の一つの態様は、目的とする細胞または組織とＣＤ７３陽性細胞とを一緒に移植することを含む、疾患または傷害の治療方法に関する。より具体的には、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞組成物を筋サテライト細胞と共に投与することを含む、筋組織の再生方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、目的とする細胞または組織の移植効率または生着率を改善するための、ＣＤ７３陽性細胞の使用に関する。なお、好ましい移植片（細胞または組織）は同種他家のものであるが、これに限定はされず、異種他家または、自家の細胞もしくは組織が使用されてもよい。また、ＣＤ７３陽性細胞も、同種他家または自家のいずれであってもよい。具体的な病態としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：graft versus host disease）が挙げられる。
　また、本発明の一つの態様は、他家細胞を用いた細胞治療において、ＣＤ７３陽性細胞組成物を他家の細胞と同時に投与することを含む、細胞治療の効率を上げる方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、他家細胞を用いた細胞治療において、細胞治療効率を上げるために他家細胞と同時投与するための、ＣＤ７３陽性細胞組成物に関する。
抗炎症組成物
　本発明の一つの態様は、本発明に係るＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、抗炎症組成物に関する。本発明者らは、潰瘍性大腸炎マウスモデルにおいて、ＣＤ７３陽性細胞の投与により、病態の改善が得られることを明らかにした。また、筋サテライト細胞の筋損傷部位への移植の際にＣＤ７３陽性細胞を同時に移植することにより、炎症細胞の浸潤を抑制できることを示している。よって、当業者には、ＣＤ７３陽性細胞を用いて、生体の炎症反応を抑制できることが理解される。また、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞を投与することを含む、炎症性疾患の治療方法に関する。より具体的には、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞組成物を投与することを含む、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）の治療方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、炎症反応の抑制あるいは炎症性疾患の治療に用いるためのＣＤ７３陽性細胞の使用に関する。
免疫抑制組成物
　本発明の一つの態様は、本発明に係るＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、免疫抑制組成物または免疫寛容誘導組成物に関する。本発明者らは、同種他家（骨格筋サテライト細胞と同じ種のマウス由来）のＣＤ７３陽性細胞を共投与することで、驚くべきことに、他家由来の骨格筋サテライト細胞が再生筋として生着可能となることを見出した。細胞または組織を生体に移植する場合、通常は、免疫抑制剤を投与しない限り、他家の細胞は移植後に生着できないことから、当業者には、ＣＤ７３陽性細胞を用いて、生体の免疫反応を抑制しうること、あるいは免疫寛容を誘導しうることが理解される。また、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞を投与することを含む、免疫抑制（免疫寛容誘導）方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、免疫反応の抑制（免疫寛容の誘導）あるいは免疫疾患の治療に用いるためのＣＤ７３陽性細胞の使用に関する。
　以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。本発明者らは、ヒト、マウス、ラットの骨髄組織に含まれるＣＤ７３陽性細胞の機能について調べた。骨髄組織からＣＤ７３の表面抗原を指標とした細胞選別を行い、ＣＤ７３陽性細胞に間葉系幹細胞の表現型を示す細胞が含まれているかどうかを検証した。また、皮下組織への移植を行った際に、効率よく生着することを検証した。以下、具体的な実験例を示す。
＜例１：骨髄組織に存在するＣＤ７３＋細胞の表面抗原解析＞
（骨髄細胞の採取・調製）
　材料は、ＬＯＮＺＡ社により購入したヒト骨髄単核球細胞（カタログ番号：２Ｍ－１２５Ｃ）（２０歳以下、男性）、ラット（Ｌｅｗｉｓ、８～１０週齢、オス）、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｊ、６～９週齢）を使用した。液体窒素により保存されていた凍結ヒト骨髄単核球細胞（２Ｍ－１２５Ｃ）を取り出し、３７℃の恒温槽で１分温めた。その後、あらかじめ３７℃に温めておいた９ｍｌのＨＢＳＳ（－）溶液（Hanks’ Balanced Salt Solution）に素早く解凍した。遠心機（８００ｇ）にて室温で５分間遠心分離し、上清を除去した後に細胞ペレットを新しいＨＢＳＳ（－）溶液にて再懸濁し、ヒト骨髄細胞懸濁液を得た。
　ラットおよびマウスの骨髄細胞ついては、成体の大腿骨、脛骨、腸骨から採取した。取り出した大腿骨、脛骨、腸骨を不織布により外側の筋肉や結合組織を除去した後にＰＢＳ（－）にて洗浄した。骨切りハサミ（松吉医療総合）および外科用ハサミ（室町機器）にて合計１５０～２００回刻んだ後、ＨＢＳＳ（－）溶液を用いて骨片を洗浄し、血球系細胞を洗い流した。残った骨片を更に細かく刻み、２５Ｕ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ１（シグマ）を添加した０．２％コラゲナーゼ溶液（ｗａｋｏ）（ＤＭＥＭ）に入れ、３７℃で１時間１００ｒ／分の速度で振盪した。コラゲナーゼ処理した骨片をさらにハサミで刻み、乳棒にて徐々に砕きながらＨＢＳＳ（－）溶液で洗浄し、７０μｍメッシュのセルストレーナー（ファルコン）にて濾過した。遠心機８００ｇにて４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した後に細胞ペレットを新しいＨＢＳＳ（－）溶液にて再懸濁し、ラットおよびマウス骨髄細胞懸濁液を得た。赤血球細胞を除去するため、遠心分離後の細胞ペレットに対し、ＡＣＫ溶液（ＬＯＮＺＡ）もしくは水による溶血操作を行った。セルストレーナーで赤血球の破片等を除去し、骨髄懸濁液を得た。
（細胞表面の抗体染色）
　上記方法によって得られた骨髄細胞２．０×１０８～４．０×１０８個をＨＢＳＳ（－）溶液１ｍｌに懸濁し、１５ｍｌ遠沈管に添加した。１倍希釈のＡＰＣまたはＰＥ標識抗ヒトＣＤ７３抗体、ＰＥ－ｃｙ７標識抗ＣＤ３１抗体、ＰＥ－ｃｙ７標識抗ＣＤ４５抗体、ＰＥ－ｃｙ７標識抗ＣＤ２３５ａ抗体を２～３μＬ（抗体量０．４５～０．７μｇ）細胞浮遊液に懸濁し、チューブに２００μＬ分注した。ヒト間葉系幹細胞マーカーとして、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ２９抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ９０抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ２７１抗体およびＡＰＣ標識抗レプチンレセプター抗体を各チューブに添加し、氷上で３０分間遮光し免疫抗体染色をした（ＢＤ社製抗体、およびＲ＆Ｄ社製抗体を使用）。１倍希釈のＡＰＣまたはＰＥ標識抗マウスＣＤ７３抗体、ＰＥ－ｃｙ７標識抗ＣＤ３１抗体、ＰＥ－ｃｙ７標識抗ＣＤ４５抗体、ＰＥ－ｃｙ７標識抗Ｔｅｒ１１９抗体を細胞浮遊液に懸濁し、チューブに２００μＬ分注した。マウス間葉系幹細胞マーカーとして、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ２９抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ９０抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ１４０ａ抗体およびビオチン標識抗レプチンレセプター抗体、ＰＥ標識ストレプトアビジンを各チューブに添加し、氷上で３０分間遮光し免疫抗体染色をした（ＢＤ社製抗体を使用）。１倍希釈のＡＰＣ標識抗ラットＣＤ７３抗体、ビオチン標識抗ＣＤ３１抗体、ビオチン標識抗ＣＤ４５抗体、ＰＥｃｙ７標識ストレプトアビジンを細胞浮遊液に懸濁し、チューブに２００μＬ分注した。ラット間葉系幹細胞マーカーとして、ＦＩＴＣ標識抗ラットＣＤ２９抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４４抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５４抗体、ＢＶ４２１標識抗ＣＤ９０抗体を各チューブに添加し、氷上で３０分間遮光し免疫抗体染色をした（ＢＤ社製抗体を使用）。その後、ＨＢＳＳ（－）溶液５００μＬを加え、４℃下８００ｇで５分間遠心した。沈殿した細胞集団を、２μｇ／ｍＬの濃度でヨウ化プロピジウム（以下ＰＩ）を加えたＨＢＳＳ（－）溶液３ｍＬで懸濁し、１×１０７細胞程度になるように調製した。この細胞懸濁液に対し、メッシュ付き５ｍｌラウンドチューブ（ＢＤ）を用いて得られた細胞浮遊液を以下のフローサイトメーターによる解析に用いた。
（ＣＤ７３細胞の細胞表面抗原解析）
　表面抗原抗体と反応させたヒト、マウスおよびラットの骨髄細胞をフローサイトメーターを用いて解析した。フローサイトメーターには、ＦＡＣＳＡｒｉａを使用した。生細胞分画であるＰＩ陰性細胞集団をゲートし、ダブレット細胞をゲートアウトした後、その中で縦軸を血球／内皮マーカー（ヒト：ＣＤ３１／ＣＤ４５／ＧＰＡ；マウス：ＣＤ３１／ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９；ラット：ＣＤ３１／ＣＤ４５）に、また横軸をＣＤ７３マーカーにて展開した。血球／内皮マーカー陰性、およびＣＤ７３マーカー陽性細胞集団にゲートを設定し、その細胞集団における間葉系幹細胞マーカーの発現解析を行った。その結果、ヒトとマウスの骨髄に存在するＣＤ７３陽性細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１（ヒト）、ＣＤ１４０ａ（マウス）、レプチンレセプターすべて陽性であった（図１、表１および２参照）。さらに、ヒト脂肪組織中に存在するＣＤ７３陽性細胞も前述の抗体（クローンＡＤ２）にて分離可能であり、間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０を発現していた（図２参照）。ラット骨髄に存在するＣＤ７３陽性細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０がおおむね陽性であった（図３および表３参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜例２：ＣＤ７３＋細胞のコロニー形成能力解析＞
（ＣＤ７３による細胞純化の効果）
　実施例１に示したＣＤ７３陽性細胞をフローサイトメーターにて分離した。９６ｗｅｌｌプレートに２００μＬの間葉系幹細胞増殖培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を添加し、１ｗｅｌｌに対し１細胞をソーティングした。プレートは３７℃のインキュベーターにて培養し、１４日後にコロニーが形成されてているｗｅｌｌのカウントを行った。
　その結果、間葉系幹細胞の特徴でもあるコロニー形成能力は、全骨髄細胞（Ｗｈｏｌｅ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ：ＷＢＭ）と比較し、１３倍以上の形成能力を有していることが分かった（図４参照）。
＜例３：ＣＤ７３＋細胞の生着機能解析＞
（間葉系幹細胞の皮下移植による生着率の評価）
　ＣＤ７３陽性細胞を分離し、間葉系幹細胞増殖培地で２継代した後、細胞数が１．０×１０６～３．０×１０６個になったところで、１５ｍｌ遠沈管に添加し遠心分離した。ペレット細胞に対し、軟骨細胞誘導培地（ＬＯＮＺＡ）＋ＴＧＦｂ３＋ＢＭＰ６に懸濁し、４分２００ｇにて遠心後３７℃のインキュベーターにて培養した。４日ごとに新しい軟骨細胞誘導培地を交換し、２週間分化誘導を行った。
　得られた軟骨細胞ペレットをラットの頭部皮下組織に移植し、２週間後に組織を採取し、凍結切片の作成およびパラフィン包埋切片を作成した。凍結切片においては、マクロファージのマーカーであるＩｂａ１抗体（Ｗａｋｏ）、軟骨基質を染めるＡｇｇｒｅｃａｎ抗体（Developmental Studies Hybridoma Bankより入手）、細胞の核を染めるＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて染色を行った。パラフィン切片においては、軟骨基質を染めるサフラニンＯ（武藤化学）による染色を行った。
　移植細胞を検証した結果、ＣＤ７３陽性細胞を純化した細胞集団では、移植後の軟骨形成能力が高く、またマクロファージの浸潤が少ないことが確認された。一方、細胞を純化せずに培養した全骨髄細胞では、軟骨形成能力が低下しており、マクロファージの浸潤が確認された（図５参照）。
＜例４：ヒト間葉系組織からのＣＤ７３陽性細胞の分離＞
　骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛、臍帯を破砕したのちに、０．２％コラゲナーゼ溶液により３７℃で１時間処理した。ＣＤ７３タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて細胞を標識し、フローサイトメトリーで解析した。結果として、ＣＤ７３陽性細胞細胞は、骨髄に９．５％、内臓脂肪に３．０７％、皮下脂肪に２０．７８％、羊膜に１７．４１％、絨毛膜に２．３５％、絨毛に４．０３％、臍帯に２．１１％存在することが明らかとなった（図６参照）。
＜例５：ＣＤ７３＋細胞のコロニー形成能力解析＞
　骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛から得られるＣＤ７３陽性細胞のコロニー形成能力を調べた。臍帯からは、ＣＤ７３陽性細胞は得られなかった。結果として、本発明に係る新鮮純化法を用いることにより、各組織のＣＤ７３陽性細胞のうち、骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、絨毛膜、絨毛からコロニー形成能を有する細胞を高効率で分離することが可能であることが明らかとなった（図７および８参照）。
＜例６：ＣＤ７３＋細胞の増殖能力解析＞
　皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛膜、絨毛から分離したＣＤ７３陽性細胞の増殖能力を調べた。結果として、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛膜、絨毛から分離したＣＤ７３陽性細胞は、１４日間の培養で増殖し、培養前に比べて１００倍程度の細胞数を得ることが可能であることが示された（図９参照）。よって、本発明に係る新鮮純化によって、生体への移植に用いる投与細胞数を従来法より減らせる可能性がある。
＜例７：潰瘍性大腸炎マウスモデル＞
　３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲水投与することによって潰瘍性大腸炎を引き起こしたマウスに対し、ＣＤ７３陽性細胞と既存分離法によるＭＳＣを移植した（図１０参照）。より具体的には、８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスの皮下脂肪からＣＤ７３陽性細胞を取得し、３％ＤＳＳ投与の１日目と５日目にＶｅｈｉｃｌｅ、新鮮純化ＣＤ７３陽性細胞、または既存分離法によるＭＳＣ（それぞれ１４日または１８日間培養した細胞）を１０週齢のオスＣ５７ＢＬ／６－Ｎマウスに静脈投与（Ｉ．Ｖ．）した。その後、ＤＳＳ投与を中止し、８日目に大腸を調べた。
　潰瘍性大腸炎の指標の一つとして、大腸の長さに短縮が見られることが知られている。結果として、細胞投与をしなかったＶｅｈｉｃｌｅ群、既存分離法のＭＳＣを投与した群に比べて、ＣＤ７３陽性細胞を投与した群では、大腸長の短縮の抑制が認められた（図１１参照）。投与したＣＤ７３陽性細胞がレシピエント側のマウス自身の上皮細胞を刺激し、再生を促したと考えられる。
　直腸炎症部位の組織学的検討によって、ＣＤ７３陽性細胞の投与により、移植した細胞が炎症部にホーミングし、大腸の構造を保持する効果があることが認められた。これは、既存分離法のＭＳＣを投与した群ではほとんど認められなかった現象である（図１２参照）。また、炎症度スコアも、ＣＤ７３陽性細胞投与群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べて有意に低くなっていた（図１２参照）。
＜例８：骨格筋サテライト細胞とＣＤ７３陽性細胞の共移植＞
　カルディオトキシン（ＣＴＸ）を前脛骨筋に投与することで筋損傷を引き起こしたマウスに、同種他家マウスの骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を投与した。通常の場合は、免疫抑制剤を投与しない限り、他家の細胞は生着できない。しかしながら、同種他家（骨格筋サテライト細胞と同じ種のマウス由来）のＣＤ７３陽性細胞を共投与することで、他家由来の骨格筋サテライト細胞が再生筋として生着可能になることが見出された（図１３および１４参照）。
　ドナー側には、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ　（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウス由来のＳＭ／Ｃ－２．６陽性筋サテライト細胞と、８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６－Ｎマウス由来のＣＤ７３陽性細胞を用いた。筋サテライト細胞はラミニンを含む培地中で５日間培養したものを用いた。ＣＤ７３陽性細胞は２週間培養したものを用いた。レシピエント側には、８週齢のオスＢＡＬＢｃＡマウスを用いた。筋サテライト細胞は６．０×１０５個の細胞を移植した。ＣＤ７３陽性細胞は６．０×１０３個の細胞（ＳＣ＋ＣＤ７３－Ｌ）または６．０×１０４個の細胞（ＳＣ＋ＣＤ７３－Ｍ）のいずれかを移植に用いた。移植は蛇毒（ＣＴＸ）の投与により筋損傷を生じさせた１日後に行い、解析は移植から１４日後に行った。図１３および１４に示されるとおり、６．０×１０４個のＣＤ７３陽性細胞を筋サテライト細胞と一緒に移植した場合（ＳＣ＋ＣＤ７３－Ｍ）には特に、他家マウス由来の細胞が再生筋を構成し、筋再生の促進が認められた。
　本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
　本発明者らは、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮できることを見出した。本発明により、培養前に間葉系幹細胞のみを単一抗体により選択的に分離し、移植部への生着効率を高める間葉系幹細胞の培養系を確立することができる。単一抗体により選択することから、複数の抗体を用いる方法に比べてコスト面で大きな優位性がある。また、単一抗体による選択であるため、高価なマルチカラーＦＡＣＳシステムの使用が要求されず、磁気ビーズ等を用いた単離が可能となる。さらに、本発明により、異なる動物種間で同一の抗原が認識されることが見出されたことより、同一抗原を発現する細胞を用いた非臨床試験での安全性、有効性の評価が可能となり、雑多な細胞集団ではなく新鮮純化細胞を用いることで、安定した移植効果が期待される。

Claims (43)

  1. 　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、およびｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法。
  2. 　ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 　ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをも選択マーカーとして用いないことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
  4. 　血球／内皮細胞を除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を用いて血球／内皮細胞を除去することを特徴とする請求項４記載の方法。
  6. 　ＣＤ７３タンパク質をＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 　生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、脂肪組織、臍帯、胎盤、滑膜、または歯髄由来であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　生体から単離された新鮮な細胞の集団をコラゲナーゼで処理する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 　生体から単離された新鮮な細胞の集団が末梢血由来であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  10. 　生体から単離された新鮮な細胞の集団がＧ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、またはＡＭ３１００（プレリキサフォル）を生体に投与した後に生体から単離されることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体またはＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体が磁気ビーズである、請求項１１記載の方法。
  13. 　抗ＣＤ７３抗体の結合した担体がカラムに充填されている、請求項１１記載の方法。
  14. 　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
    ｉｉ）抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の純化方法であって、
    　ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用い、
    　ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをも選択マーカーとして用いず、
    　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、純化方法。
  15. 　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む、移植用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法。
  16. 　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程を含む、移植用の細胞の製造方法。
  17. 　ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項記載の方法。
  18. 　抗ＣＤ７３抗体の接合した担体を含む、請求項１～１６のいずれか一項記載の方法に用いるためのキット。
  19. 　抗ＣＤ７３抗体の接合した担体が磁気ビーズである、請求項１８記載のキット。
  20. 　抗ＣＤ７３抗体の接合した担体がカラムに充填されている、請求項１８記載のキット。
  21. 　標識の接合した抗ＣＤ７３抗体を含む、請求項１～１６のいずれか一項記載の方法に用いるためのキット。
  22. 　ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、請求項１８～２１のいずれか一項記載のキット。
  23. 　請求項１～１６のいずれか一項記載の方法により得られる細胞を含む細胞組成物。
  24. 　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
  25. 　工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項２４に記載のＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
  26. 　ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、請求項２４～２６のいずれか一項記載の方法。
  28. 　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、血球／内皮細胞を除去する工程を含まないことを特徴とする請求項２４～２７のいずれか一項記載の方法。
  29. 　生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛、絨毛膜、または羊膜由来であることを特徴とする、請求項２４～２８のいずれか一項記載の方法。
  30. 　ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、請求項２４～２９のいずれか一項記載の方法。
  31. 　ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、請求項２４～３０のいずれか一項記載の方法。
  32. 　ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
    ｉｉ）ＦＡＣＳを用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法であって、
    　生体から単離された新鮮な細胞の集団が皮下脂肪または内臓脂肪由来であり、
    　ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用い、
    　ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
  33. 　請求項２４～３２のいずれか一項記載の方法により得られるＣＤ７３陽性細胞組成物。
  34. 　ＣＤ７３陽性細胞の純度が少なくとも９０％である、請求項３３記載のＣＤ７３陽性細胞組成物。
  35. 　少なくとも１０３個のＣＤ７３陽性細胞を含む、請求項３３または３４記載のＣＤ７３陽性細胞組成物。
  36. 　請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、移植効率改善組成物。
  37. 　請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、抗炎症組成物。
  38. 　請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、免疫抑制組成物。
  39. 　請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物と筋サテライト細胞とを含む、筋損傷または筋疾患の治療に用いるための組成物。
  40. 　請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、炎症性腸疾患の治療に用いるための組成物。
  41. 　請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、ＧＶＨＤの治療または予防に用いるための組成物。
  42. 　他家細胞を用いた細胞治療において、請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を他家の細胞と同時に投与することを含む、細胞治療の効率を上げる方法。
  43. 　他家細胞を用いた細胞治療において、細胞治療効率を上げるために他家細胞と同時投与するための、請求項３３～３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物。
PCT/JP2018/018351 2017-05-12 2018-05-11 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法 WO2018207918A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019517719A JPWO2018207918A1 (ja) 2017-05-12 2018-05-11 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法
US16/612,236 US11613733B2 (en) 2017-05-12 2018-05-11 Method for purifying mesenchymal stem cells to improve transplantation efficiency
EP18798420.8A EP3739038A4 (en) 2017-05-12 2018-05-11 MESENCHYMATIC STEM CELL PURIFICATION METHOD TO IMPROVE TRANSPLANT EFFICIENCY

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017095216 2017-05-12
JP2017-095216 2017-05-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018207918A1 true WO2018207918A1 (ja) 2018-11-15

Family

ID=64104598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/018351 WO2018207918A1 (ja) 2017-05-12 2018-05-11 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11613733B2 (ja)
EP (1) EP3739038A4 (ja)
JP (1) JPWO2018207918A1 (ja)
WO (1) WO2018207918A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114990056B (zh) * 2022-06-20 2024-04-12 南京周子未来食品科技有限公司 一种高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009060840A (ja) 2007-09-06 2009-03-26 Keio Gijuku ヒト間葉系幹細胞濃縮方法
JP2015500810A (ja) * 2011-11-30 2015-01-08 アドバンスド セル テクノロジー、インコーポレイテッド 間葉系間質細胞及びその関連用途
JP2016513962A (ja) * 2013-03-13 2016-05-19 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド 療法および予防のための細胞を単離する方法
JP2016519938A (ja) * 2013-05-20 2016-07-11 セル セラピー リミテッドＣｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ 特定の間葉系幹細胞において、細胞の集団を同定するための、マルチカラーフローサイトメトリー方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1028737E (pt) * 1997-07-03 2007-07-11 Osiris Therapeutics Inc Células estaminais mesenquimatosas humanas de sangue periférico
GB0600972D0 (en) 2006-01-18 2006-03-01 Univ Leeds Enrichment of cells
JP2014506453A (ja) 2011-01-19 2014-03-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生得的多能性体細胞
EP2773746A4 (en) 2011-11-01 2015-08-05 Neostem Inc COMPOSITIONS OF ADULT MESENCHYMAL STEM CELLS (MSC) AND PREPARATION METHODS THEREOF
US10479977B2 (en) * 2014-11-07 2019-11-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteochondroreticular stem cells for bone and cartilage regeneration

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009060840A (ja) 2007-09-06 2009-03-26 Keio Gijuku ヒト間葉系幹細胞濃縮方法
JP2015500810A (ja) * 2011-11-30 2015-01-08 アドバンスド セル テクノロジー、インコーポレイテッド 間葉系間質細胞及びその関連用途
JP2016513962A (ja) * 2013-03-13 2016-05-19 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド 療法および予防のための細胞を単離する方法
JP2016519938A (ja) * 2013-05-20 2016-07-11 セル セラピー リミテッドＣｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ 特定の間葉系幹細胞において、細胞の集団を同定するための、マルチカラーフローサイトメトリー方法

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARRANCIO, S. ET AL.: "Effects of MSC Coadministration and Route of Delivery on Cord Blood Hematopoietic Stem Cell Engraftment", CELL TRANSPLANTATION, vol. 22, no. 7, 2013, pages 1171 - 1183, XP055561203 *
COLTER, D. C.SEKIYA, I.PROCKOP, D. J.: "Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells", PROC NATL ACAD SCI., vol. 98, 2001, pages 7841 - 7845, XP055398556, DOI: 10.1073/pnas.141221698
DE BARI, C.DELL'ACCIO, F.TYLZANOWSKI, P.LUYTEN, F. P.: "Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane", ARTHRITIS RHEUM., vol. 44, 2001, pages 1928 - 1942, XP002266867, DOI: 10.1002/1529-0131(200108)44:8<1928::AID-ART331>3.0.CO;2-P
DOMINICI ET AL.: "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells., The International Society for Cellular Therapy position statement", CYTOTHERAPY, vol. 8, no. 4, 2006, pages 315 - 7, XP055570596, DOI: 10.1080/14653240600855905
GUANERIO J.COLTELLA N.ALA U.TONON G.PANDOLFI PP.BERNARDI R.: "Bone Marrow Endosteal Mesenchymal Progenitors Depend on HIF Factors for Maintenance and Regulation of Hematopoiesis", STEM CELL REPORTS, vol. 2, 2014, pages 794 - 809
HARTING, M.JIMENEZ, F.PATI, S.BAUMGARTNER, J.COX, C., JR.: "Immunophenotype characterization of rat mesenchymal stromal cells", CYTOTHERAPY, vol. 10, 2008, pages 243 - 253, XP008094085, DOI: 10.1080/14653240801950000
LI, T. S. ET AL.: "Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells on Satellite Cell Proliferation and Apoptosis in Immobilization- Induced Muscle Atrophy in Rats", MEDICAL SCIENCE MONITOR, vol. 22, 2016, pages 4651 - 4660, XP055561208 *
MABUCHI, Y. ET AL.: "LNGFR(+)THY-1(+)VCAM-1(hi+) cells reveal functionally distinct subpopulations in mesenchymal stem cells", STEM CELL REPORTS, vol. 1, 2013, pages 152 - 165, XP055391281, DOI: 10.1016/j.stemcr.2013.06.001
MORIKAWA, S. ET AL.: "Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow", J EXP MED., vol. 206, 2009, pages 2483 - 2496, XP055044128, DOI: 10.1084/jem.20091046
NEWMAN, R. E. ET AL.: "Treatment of Inflammatory Diseases with Mesenchymal Stem Cells", INFLAMMATION & ALLERGY-DRUG TARGETS, vol. 8, no. 2, 2009, pages 110 - 123, XP002571220 *
OGATA ET AL., PLOS ONE, vol. 10, no. 6, 8 June 2015 (2015-06-08), pages e0129096
SALEM, H. K.THIEMERMANN, C., MESENCHYMAL STROMAL CELLS: CURRENT UNDERSTANDING AND CLINICAL STATUS, vol. 28, 2010, pages 585 - 596
See also references of EP3739038A4
SEKIYA I.MUNETA T.HORIE M.KOGA H.: "Arthroscopic Transplantation of Synovial Stem Cells Improves Clinical Outcomes in Knees With Cartilage Defects", CLIN ORTHOP RELAT RES., vol. 473, 2015, pages 2316 - 26

Also Published As

Publication number Publication date
US11613733B2 (en) 2023-03-28
EP3739038A1 (en) 2020-11-18
EP3739038A4 (en) 2021-03-31
JPWO2018207918A1 (ja) 2020-03-26
US20200239849A1 (en) 2020-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Paduano et al. CD146 expression influences periapical cyst mesenchymal stem cell properties
US8440440B2 (en) Ultrasonic cavitation derived stromal or mesenchymal vascular extracts and cells derived therefrom obtained from adipose tissue and use thereof
Quirici et al. Anti-L-NGFR and-CD34 monoclonal antibodies identify multipotent mesenchymal stem cells in human adipose tissue
Rozemuller et al. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from multiple mammalian species using cross-reacting anti-human monoclonal antibodies
Mareddy et al. Clonal isolation and characterization of bone marrow stromal cells from patients with osteoarthritis
Flemming et al. Immunomodulative efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in human platelet lysate
US7863043B2 (en) Stem cell populations and methods of use
US20100260721A1 (en) Enrichment of Cells
US20140341863A1 (en) Adult mesenchymal stem cell (msc) compositions and methods for preparing the same
US20210032599A1 (en) Enhanced differentiation of mesenchymal stem cells
BRPI0613190A2 (pt) imunofenótipo e imunogeniticidade de células humanas derivadas de adipose
JP2009060840A (ja) ヒト間葉系幹細胞濃縮方法
WO2014036094A1 (en) Isolation of stromal vascular fraction from adipose tissue obtained using homogenization with beads
Montelatici et al. Defining the identity of human adipose-derived mesenchymal stem cells
WO2018207918A1 (ja) 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法
DE102009041885B4 (de) Separation von Mesenchymalen Stammzellen
Kode et al. Mesenchymal stromal cells and their clinical applications
Gregory Mesenchymal stem cells: from culture to clinic
WO2020117647A1 (en) Indirect ultrasonic cavitation-derived perivascular cells and methods of use thereof
Götherström Characterisation of human fetal mesenchymal stem cells
Larson Characterization of Stromal Cells Derived from Bone Marrow, Dermis, and Myocardium

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18798420

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019517719

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018798420

Country of ref document: EP

Effective date: 20191212