WO2018199186A1 - 造血前駆細胞マーカー - Google Patents

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義明 葛西
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寿来留 有馬
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Kyoto University NUC
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Kyoto University NUC
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    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing CD8 positive cells using one or more hematopoietic progenitor cell markers (HPC markers), a cell population expressing one or more HPC markers, and the like.
  • HPC markers hematopoietic progenitor cell markers
  • T cells play a central role in the immune system against foreign pathogens such as bacteria and viruses and abnormal cells such as cancer cells.
  • CTL cytotoxic T cells
  • TCR T cell receptors
  • CD8 single positive (SP) cells are CD8 single positive (SP) cells.
  • the CD8SP cell is an immature cell that does not express TCR and has neither CD4 nor CD8 in the thymus (CD4 / CD8 double negative (in this specification, double negative may be referred to as DN).
  • DN double negative
  • DP double positives
  • T cells play a central role in the immune system, so if T cells can be replenished and regenerated, they are extremely useful for the prevention or treatment of diseases such as tumors, infections, and autoimmune disorders. It becomes an effective means.
  • hematopoietic progenitor cells and T cells can be obtained by a method of inducing hematopoietic progenitor cells (HematopoieticgenProgenitor Cell; sometimes referred to as HPC in this specification) from iPS cells or a method of inducing CD4 / CD8DP cells. Attempts have been made to obtain lineage cells.
  • Non-Patent Document 1 describes that CD34 / CD43DP cells can be induced by co-culturing iPS cells with feeder cells (specifically, OP9 cells).
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 describe a method for separating HPC from a cell population containing HPC derived from human pluripotent stem cells using CD43 and CD34, CD31 or CD144 as indicators, and the separated cells. It is described that the properties of induced hematopoietic cells differ depending on the method of differentiation into cells of the T cell lineage and whether or not Activin / Nodal is activated in the early stage of induction when differentiating from pluripotent stem cells to HPC. Has been.
  • Patent Document 2 describes a method for producing CD4 / CD8DP under feeder-free conditions.
  • Non-patent document 3 describes various methods for inducing blood cells including hematopoietic progenitor cells from human pluripotent stem cells and the reason why clinical use of blood cells induced in vitro has not progressed. Low induction efficiency is mentioned.
  • the present invention provides cells of T cell lineage (eg, CD8 positive cells (eg, CD4 / CD8DP cells, CD8SP cells)) at higher and / or higher concentrations in order to stably provide cell therapy ( That is, an object is to provide a method for producing the cells. Moreover, this invention makes it a subject to provide the cell population containing the hematopoietic progenitor cell for solving the said subject.
  • CD8 positive cells eg, CD4 / CD8DP cells, CD8SP cells
  • the present inventors have identified a marker (HPC marker) that is expressed on the surface of HPC in order to develop a method for producing CD4 / CD8DP cells that solve the above problems. Furthermore, HPC isolated from a cell population containing HPC using one or more of the markers has high efficiency of differentiating into CD8 positive cells (eg, CD4 / CD8DP cells) and has a high proliferation ability, ie, 1 It has been found that by using more than one HPC marker, more CD8 positive cells (eg, CD4 / CD8DP cells) can be obtained and / or at higher concentrations within the cell population. Furthermore, it has been found that the production method of the present invention can provide stable CD8 positive cells (eg, CD4 / CD8DP cells) with little variation in yield, and the present invention has been completed.
  • HPC marker a marker that is expressed on the surface of HPC in order to develop a method for producing CD4 / CD8DP cells that solve the above problems.
  • Step 1 From a cell population containing hematopoietic progenitor cells, from CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, and CD325
  • a step 2 a step of differentiating the cells separated in step 1 into CD4 / CD8 double positive cells
  • the cells selected in step 1 are CD235a And the method according to [1], wherein the cell does not express CD14 and
  • step 1 from the cell population containing hematopoietic progenitor cells, CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226
  • the first group shown in the step 1 is a group consisting of CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD7 and CD144.
  • step 1 one or more molecules selected from the second group consisting of CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 and CD156c are selected from a cell population containing hematopoietic progenitor cells.
  • the method according to [5] wherein the second group shown in Step 1 is a group consisting of CD49f, CD51 and CD102.
  • step 7 The method according to any one of [1] to [6], wherein the cell population containing the hematopoietic progenitor cells in Step 1 is a cell population obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the method of inducing includes, for example, a method comprising culturing CD4 / CD8 double positive cells in the presence of an adrenocortical hormone agent, an antibody and / or a cytokine, preferably the adrenal cortex
  • the pluripotent stem cells are human induced pluripotent stem cells.
  • [15] Selected from the first group consisting of CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 and CD325 Hematopoietic progenitor cells that express one or more molecules and / or one or more molecules selected from the second group consisting of CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 and CD156c A cell population in which the ratio of hematopoietic progenitor cells (the number of hematopoietic progenitor cells / the total number of cells contained in the cell population) is 40% or more.
  • the cell population according to [15], wherein [17] The cell population according to [15], wherein the ratio is a ratio of hematopoietic progenitor cells that do not further express one or more molecules selected from the second group consisting of CD49f, CD51, and CD102.
  • a reagent for separating hematopoietic progenitor cells comprising an antibody against each of one or more molecules selected from the group consisting of CD62P, CD69, CD102 and CD156c. [19] The reagent according to [18], further comprising one or more antibodies against CD235a, CD14, CD45, CD34 and / or CD43.
  • a method for detecting a surface protein of a hematopoietic progenitor cell comprising the hematopoietic progenitor cell, CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7 , CD144, CD56, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102, CD109 or CD156c.
  • the substance comprises an antibody or a fragment thereof.
  • the substance further contains a fluorophore.
  • a method for selecting hematopoietic progenitor cells from a cell population containing hematopoietic progenitor cells, the presence or absence of one or more proteins on the surface of cells by any of the methods [20] to [24] And (i) CD45, CD34 and / or CD43 and the following proteins: CD24, CD62L, C90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 and CD325: any one or any combination of these are detected on the surface of the cells and / or (ii) When CD14 and / or CD235a is not detected on the surface of the cell, and the following proteins: CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102, CD109 and CD156c: are not detected And selecting the cells.
  • CD8 positive cells for example, CD4 / CD8DP cells, CD8SP cells
  • CD8 positive cells for example, CD4 / CD8DP cells, CD8SP cells
  • the production method of the present invention can provide CD8 positive cells (for example, CD4 / CD8DP cells, CD8SP cells) stably with little variation in yield. Accordingly, the production method of the present invention provides an improved method for separating hematopoietic progenitor cells from a cell population. This provides an improved cell source for generating CD8 positive cells.
  • This novel production method is surprising to the inventors that certain HPC positive markers and HPC negative markers can be used to greatly improve the quality and / or quantity of a CD8 positive cell population derived from HPC. And based on unexpected findings.
  • This beneficial source of CD8 positive cells of the present invention provides an improved CD8 positive cell population for clinical applications (eg, cell therapy, diagnostic purposes, and in vitro applications).
  • the present invention is (step 1) a cell expressing one or more hematopoietic progenitor cell markers (sometimes abbreviated as “HPC marker” in the present specification) from a cell population containing hematopoietic progenitor cells, and / or Alternatively, a step of separating cells that do not express one or more HPC markers, and (step 2) a cell separated by step 1 is a CD8 positive cell (for example, CD4 / CD8 double positive cell (hereinafter referred to as “CD4 A method of producing CD8 positive cells (for example, CD4 / CD8DP cells) (hereinafter abbreviated as “production method of the present invention”), which includes a step of differentiation into “/ CD8DP cells”. To do.
  • CD8 positive cell for example, CD4 / CD8 double positive cell
  • production method of the present invention production method of the present invention
  • CD8 positive cell means a T cell expressing CD8.
  • the cell include CD4 / CD8DP cell and CD8 single positive cell (herein, “CD8SP cell”). May be abbreviated as ")".
  • CD4 / CD8DP cell means a T cell that expresses both CD4 and CD8, and “CD8SP cell” means a T cell that does not express CD4 but expresses CD8. means.
  • Examples of CD8SP cells include cytotoxic T cells and their progenitor cells.
  • T cell means, for example, a cell expressing an antigen receptor called T cell receptor (TCR) on its surface and its precursor cell (eg, TCR). (Pro T cells not expressing (TCR ⁇ ), pre-T cells in which TCR ⁇ and pre-TCR ⁇ are associated).
  • TCR T cell receptor
  • hematopoietic progenitor cell means a CD34 positive cell, preferably a CD34 / CD43DP cell.
  • the origin of hematopoietic progenitor cells used in the present invention is not limited.
  • hematopoietic progenitor cells induced in vitro by known methods for example, the methods described in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Documents 1 to 3.
  • hematopoietic progenitor cells obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells or hematopoietic progenitor cells isolated from living tissue by a known technique may be used.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells), induced pluripotent stem cells (induced PS cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells (EG cells) are mentioned, and iPS cells (more preferably human iPS cells) are preferred.
  • ES cells embryonic stem cells
  • induced PS cells induced pluripotent stem cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • iPS cells more preferably human iPS cells
  • the pluripotent stem cell is any cell derived from an ES cell or a human embryo, the cell is a cell prepared without destroying the embryo, even if the cell is prepared by destroying the embryo. However, it is preferably a cell produced without destroying the embryo.
  • the iPS cell can be produced by introducing a specific reprogramming factor into a somatic cell in the form of DNA or protein, and has almost the same characteristics as an ES cell, such as pluripotency and proliferation ability by self-replication.
  • a specific reprogramming factor such as pluripotency and proliferation ability by self-replication.
  • the iPS cells may be prepared from somatic cells by a method known per se, or iPS cells that have already been established and stocked may be used.
  • the somatic cells from which iPS cells used in the present invention are derived are not limited, but are preferably cells derived from peripheral blood or cells derived from umbilical cord blood.
  • a pluripotent stem cell is derived,
  • mammals such as a mouse
  • Hematopoietic progenitor cells can be produced by subjecting the pluripotent stem cells to a method known per se.
  • the pluripotent stem cell is an iPS cell
  • hematopoietic progenitor cells can be produced by, for example, the method described in International Publication No. 2017/221975.
  • the biological tissue is not limited as long as it contains hematopoietic progenitor cells, and examples thereof include peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, spleen, and umbilical cord blood.
  • peripheral blood and umbilical cord blood are preferable from the viewpoint of low invasiveness to animals and easy preparation.
  • the hematopoietic progenitor cells and pluripotent stem cells used in the present invention are preferably GMP (Good Manufacturing Practice) standard cells from the viewpoint of application to therapy.
  • ⁇ HPC marker '' is a molecule that can be expressed on the surface of hematopoietic progenitor cells, CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, Any molecule of CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, and CD325 (in the specification, these markers may be referred to as “HPC positive marker”, “positive HPC selection marker”, or “positive HPC marker”)
  • HPC positive marker any molecule of CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 and CD156c, which is a molecule that is not normally expressed on the surface of hematopoietic progenitor cells
  • these markers are referred to as “HPC negative Marker ",” negative HPC selectable marker ", or” negative HPC marker ” (in the specification, HPC positive marker and HPC negative marker are
  • HPC positive markers of the present invention CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD200, CD7 or CD144 are preferred, and CD90, CD143, CD218a or CD200 is more preferred.
  • CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200 or CD218a are preferred, and CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200 or CD218a are preferred. More preferred.
  • the cell expressing the HPC positive marker may be referred to as an HPC marker positive cell (or HPC marker positive cell).
  • the cell in the case of a cell expressing a CD24 molecule, the cell is referred to as a CD24 positive cell.
  • the HPC negative markers of the present invention CD49f, CD51 or CD102 is preferable.
  • the cells that do not express the HPC negative marker may be referred to as HPC marker negative cells (or HPC marker negative cells).
  • CD8 positive cells preferably CD4 / CD8 double positive cells, express (a) CD34 and CD43 and (b) CD62L, CD24, CD90, CD143 from a cell population comprising hematopoietic progenitor cells. , CD218a, CD263 or Notch3, and (c) by isolating cells that do not express CD235a and CD14.
  • the CD8 positive cells preferably CD4 / CD8 double positive cells, express (a) CD34 and CD43 and (b) CD90, CD143, CD200, CD218a from a cell population comprising hematopoietic progenitor cells. Or (c) by isolating cells that do not express CD235a and CD14.
  • the CD8 positive cells preferably CD4 / CD8 double positive cells, express (a) CD34 and CD43 and (b) CD7, CD144, CD56, CD226 from a cell population comprising hematopoietic progenitor cells. , And expressing either CD262 or CD325 and (c) isolating cells that do not express CD235a and CD14.
  • the CD8 positive cells preferably CD4 / CD8 double positive cells, express (a) CD34 and CD43 and (b) CD49f, CD51, CD426, CD61 from a cell population comprising hematopoietic progenitor cells. , CD62P, CD69 or CD156c, and (c) is produced by isolating cells that do not express CD235a and CD14.
  • “express” means that expression can be detected by a method used for separating cells
  • “not expressed” means detection by the detection sensitivity of the method used for separating cells. It means you can't.
  • Examples of the method used when separating cells include the following method using flow cytometry and mass cytometry, and magnetic cell separation.
  • the cells separated by the above step 1 are cells that express one or more HPC positive markers and cells that do not express one or more HPC negative markers.
  • the cells separated by the above step 1 are cells expressing CD34 and / or CD43 in addition to one or more HPC positive markers of the present invention, and / or one or more books. It is a cell that does not express the HPC negative marker of the invention and expresses CD34 and / or CD43.
  • the cells to be separated are preferably CD235a negative, CD14 negative and / or CD45 positive.
  • the step 1 comprises, from a cell population containing hematopoietic progenitor cells, CD235a negative, CD14 negative, CD45 positive, CD34 positive and CD43 positive, and one or more HPCs of the present invention. This is done by isolating positive marker positive and / or one or more HPC negative marker negative cells of the present invention.
  • “separate cells” selects a cell that expresses one or more HPC positive markers and / or does not express one or more HPC negative markers, and isolates the selected cells.
  • An embodiment and an embodiment in which the selected cell is subjected to the next differentiation step are included.
  • each term such as “comprising” or “comprises” optionally includes “consistingconsistof” or “consists of”. May be replaced.
  • Flow cytometry or mass cytometry is used as a method for separating cells expressing one or more HPC positive markers and / or not expressing one or more HPC negative markers from a cell population containing hematopoietic progenitor cells.
  • Methods, magnetic cell separation methods, etc., and these methods can be carried out using known methods.
  • a cell that expresses one or more HPC positive markers and / or a cell that does not express one or more HPC negative markers includes a cell (for example, an antibody) that specifically binds to each HPC marker. It can isolate
  • Such substances include those to which a detectable label (eg, GFP) has been added, and those to which no label has been added.
  • a detectable label eg, GFP
  • the separation can be performed by further using a substance with a detectable label that directly or indirectly recognizes the substance.
  • a substance with a detectable label that directly or indirectly recognizes the substance.
  • the substance is an antibody
  • a fluorescent dye, a metal isotope or a bead is directly or indirectly supported on the antibody, thereby labeling an HPC marker on the cell surface. It is possible to separate cells based on the label. Only one type of antibody or two or more types of antibodies may be used.
  • Examples of a method for differentiating cells isolated from cells that contain hematopoietic progenitor cells as cells expressing one or more HPC positive markers of the present invention and / or not expressing HPC negative markers into CD8 positive cells include: Known methods (for example, methods described in International Publication No. 2016/076415, JournalJof Leukocyte Biology 96 (2016) 1165-1175, Cell Reports (2 (2012) 1722-1735, International Publication No. 2017/221975)) Can be mentioned.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ MEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium Ham's F12 medium
  • RPMI 1640 medium Fischer's medium
  • Neurobasal Medium Neurobasal Medium (Life Technologies), and mixed media thereof.
  • the medium may or may not contain serum.
  • the medium contains, for example, vitamin Cs (eg ascorbic acid, vitamin C phosphate), albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids
  • vitamin Cs eg ascorbic acid, vitamin C phosphate
  • albumin e.g ascorbic acid, vitamin C phosphate
  • insulin transferrin
  • selenium fatty acids
  • trace elements 2-mercaptoethanol
  • thiolglycerol lipids
  • amino acids amino acids
  • substances such as L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and cytokines may be included.
  • the medium preferably contains a cytokine.
  • cytokines include IL-7, FLT-3L, SCF, TPO, and combinations thereof, and FLT-3L and IL-7 are preferred.
  • the concentration of IL-7 in the medium ranges from 1 ng / ml to 50 ng / ml (eg, 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml).
  • the concentration of FLT-3L in the medium ranges from 1 ng / ml to 100 ng / ml (eg, 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml).
  • the medium preferably contains Notch ligand (eg, Dll1, Dll4, Dll1, or a fusion protein of Dll4 and Fc). When using a Notch ligand, it may be added to the medium or coated on the culture vessel. Alternatively, feeder cells that express a Notch ligand may be used.
  • Notch ligand eg, Dll1, Dll4, Dll1, or a fusion protein of Dll4 and Fc.
  • the hematopoietic progenitor cells obtained in step 1 may be subjected to adhesion culture or suspension culture.
  • the culture vessel may be coated and used, or co-cultured with feeder cells or the like. From the viewpoint of application to treatment, it is preferably feeder-free.
  • the substrate for coating a culture vessel include fibronectin fragments (eg, retronectin), pronectin, vitronectin, matrigel (BD), type I collagen, type IV collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin, and These combinations are mentioned.
  • feeder cells to be co-cultured examples include bone marrow stromal cell line OP9 cells, mouse mesenchymal cell line 10T1 / 2 cells, and Tst-4 cells.
  • the exchange of the feeder cells can be performed by transferring the target cells in culture onto the feeder cells previously seeded. The exchange is preferably performed every 2 to 5 days.
  • the culture temperature condition for inducing CD4 / CD8 DP cells by culturing hematopoietic progenitor cells is not particularly limited, but is preferably about 37 ° C to 42 ° C, more preferably about 37 to 39 ° C.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD4 / CD8DP cells.
  • the number of culture days for inducing CD4 / CD8 DP cells from hematopoietic progenitor cells is not particularly limited, but it is 10 days or longer (eg, 12, 14, 16, 18, 20, or More than that), and preferably 60 days or less.
  • CD4 / CD8DP cells can be efficiently obtained in large quantities by culturing for 21 to 28 days.
  • the obtained CD4 / CD8DP cells may be isolated and used as a cell population containing other cell types (for example, CD8SP cells).
  • CD4, CD8, CD3, CD45 molecules and the like can be used as an index.
  • the isolation method a method well known to those skilled in the art can be used. For example, the method is performed by labeling with an antibody against a molecule as an index, and using the above-described flow cytometry or mass cytometry, magnetic cell separation method, Or the method of refine
  • CD8SP cells can be produced by subjecting the CD4 / CD8DP cells obtained by the production method of the present invention to the step of inducing differentiation into CD8SP cells (a method for producing CD8SP cells in this way). May be abbreviated as “the method for producing the CD8SP cell of the present invention”). For the method of producing CD4 / CD8DP cells, see 1. As described in.
  • basal medium and medium used in the method for producing CD8SP cells of the present invention the same basal medium and medium as described in 1. can be mentioned.
  • the medium may contain a corticosteroid.
  • corticosteroids include glucocorticoids and derivatives thereof, and the glucocorticoids include, for example, cortisone acetate, hydrocortisone, fludrocortisone acetate, prednisolone, triamcinolone, methylprednisolone, dexamethasone, betamethasone, Beclomethasone propionate is mentioned. Of these, dexamethasone is preferable.
  • a method for producing CD8 single positive cells comprises culturing CD4 / CD8 double positive cells in the presence of an adrenocortical hormone agent, preferably dexamethasone, to obtain said CD4 / CD8 double positive cells. Inducing CD8 single positive cells.
  • an adrenocortical hormone agent preferably dexamethasone
  • dexamethasone When dexamethasone is used as a corticosteroid, its concentration in the culture solution is preferably 1 nM to 100 nM (eg, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM) Of these, 10 nM is preferable.
  • the medium may contain antibodies (eg, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD2 antibody), cytokines (eg, IL-7, IL-2, IL-15) and the like.
  • antibodies eg, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD2 antibody
  • cytokines eg, IL-7, IL-2, IL-15
  • the anti-CD3 antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes CD3, and examples thereof include an antibody produced from an OKT3 clone.
  • the anti-CD3 antibody may be one to which magnetic beads or the like are bound, and instead of adding the anti-CD3 antibody to the medium, the TCD is cultured on a culture container in which the anti-CD3 antibody is bound to the surface. Stimulation may be performed by culturing lymphocytes for a certain period of time.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody in the medium is 10 ng / ml to 1000 ng / ml (eg, 10 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml, 200 ng / ml, 300 ng / ml, 400 ng / ml, 500 ng / ml, 600 ng / ml, 700 ng / ml, 800 ng / ml, 900 ng / ml, 1000 ng / ml) are preferable, and 500 ng / ml is particularly preferable.
  • the concentration of other antibodies can also be appropriately determined by those skilled in the art based on culture conditions and the like.
  • a method for producing CD8 single positive cells comprises culturing CD4 / CD8 double positive cells in the presence of an antibody, preferably an anti-CD3 antibody, to cultivate said CD4 / CD8 double positive cells to CD8. Inducing to single positive cells.
  • the concentration of IL-2 used in the present invention in the medium is 10 U / ml to 1000 U / ml (example: 10 U / ml, 20 U / ml, 30 U / ml, 40 U / ml, 50 U / ml). 60 U / ml, 70 U / ml, 80 U / ml, 90 U / ml, 100 U / ml, 500 U / ml, 1000 U / ml), with 100 U / ml being preferred.
  • the concentration of IL-7 or IL15 used in the present invention in the medium is 1 ng / ml to 100 ng / ml (eg, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 30 ng).
  • a method for producing CD8 single positive cells comprises culturing CD4 / CD8 double positive cells in the presence of a cytokine, preferably IL-2, to convert said CD4 / CD8 double positive cells to CD8. Inducing to single positive cells.
  • a cytokine preferably IL-2
  • the temperature condition for culturing CD4 / CD8DP cells is not particularly limited, but is preferably about 37 ° C to 42 ° C, more preferably about 37 to 39 ° C.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD8-positive T cells.
  • the number of days is not particularly limited as long as CD8SP cells can be obtained, but it is preferably 1 day or more, 3 days or more, 7 days or more, and preferably 60 days or less.
  • the CD8SP cells produced by the production method of the present invention are not limited to cells obtained by differentiating from CD4 / CD8DP cells (for example, cells obtained by the above 2.).
  • a CD4 / CD8DP cell from a cell isolated from a cell population containing hematopoietic progenitor cells that expresses one or more HPC positive markers of the present invention and / or does not express one or more HPC negative markers.
  • CD8SP cells induced without passing through are also included in the CD8SP cells produced by the production method of the present invention.
  • Cell population containing hematopoietic progenitor cells expressing one or more types of HPC markers The present invention expresses one or more types of HPC positive markers and / or does not express one or more types of HPC negative markers. Is a high-frequency cell population (hereinafter abbreviated as “cell population of the present invention”).
  • the cell population is, for example, a cell population containing hematopoietic progenitor cells, wherein cells that express one or more HPC positive markers and / or do not express one or more HPC negative markers are used according to the separation method described above. Can be obtained by separating them.
  • the definition of HPC markers, specific molecules, and the definition of hematopoietic progenitor cells are as described above.
  • the cell population of the present invention is a ratio of hematopoietic progenitor cells expressing one or more HPC positive markers and / or not expressing one or more HPC negative markers (the number of hematopoietic progenitor cells / total cells contained in the cell population). Number) is higher than the proportion contained in the hematopoietic progenitor cell population obtained by conventional methods (eg, CD34 positive, CD34 positive and CD43 positive, or CD43 positive and CD34, CD31 or CD144 positive) However, it is preferably 40% or more (eg, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100%).
  • the cell population of the present invention can be obtained by the method described in Step 1 of the production method of the present invention.
  • the percentage of hematopoietic progenitor cells that express one or more HPC positive markers and / or do not express one or more HPC negative markers can be measured by flow cytometry.
  • the cell population of the present invention is compared to a cell population that expresses one or more HPC positive markers and / or does not isolate cells that do not express one or more HPC negative markers.
  • the efficiency of differentiation into CD4 / CD8DP cells and CD8SP cells is high, and the proliferation ability is also excellent.
  • Reagent for separation of "cell population of the present invention” The present invention also provides an HPC marker of the present invention, i.e., CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 and CD156c, preferably CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200CD218a, CD7, CD144
  • a reagent for separating a cell population of the present invention comprising an antibody against each of one or more markers selected from the group consisting of CD49f, CD51 and CD102 provide.
  • the reagent of the present invention contains antibodies against two or more HPC markers
  • the reagent can be provided as a reagent kit containing each antibody in a separate reagent.
  • the antibody contained in the reagent of the present invention can be provided in a form bound to, for example, a fluorescent dye, a metal isotope, or a bead (eg, magnetic bead) according to the separation means used in Step 1 of the production method of the present invention. .
  • the reagent of the present invention may be an anti-CD4 antibody and / or an anti-CD8 antibody and optionally other cell surface markers known to be expressed or not expressed in CD4 / CD8DP cells and / or CD8SP cells (for example, , CD3, CD45, CD235a, CD14, CD45, CD34, CD43) as a reagent for separating CD4 / CD8DP cells and CD8SP cells induced to differentiate from the cell population of the present invention. Can be used.
  • the reagent of the present invention may further contain reagents (eg, basal medium, medium additive, etc.) for inducing differentiation of hematopoietic progenitor cells into CD4 / CD8DP cells and further into CD8SP cells. As described above, 1. And 2. The substances exemplified in (1) are similarly mentioned.
  • Example 1 (Examination using TKT3V1-7 strain) As a cell population containing hematopoietic progenitor cells (hereinafter sometimes referred to as HPC), iPS cells (TKT3V1-7 strain) are prepared by known methods (for example, Cell Reports 2 (2012) 1722-1735 and International Publication No. 2017/221975). The floating cell population differentiated according to the method described in No. 1) was used.
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • TKT3V1-7 strain was seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / well on a 6-well plate treated with ultra-low adhesion (Day 0), and EB medium (10 ⁇ g / ml human insulin, 5.5 ⁇ g / well in StemPro34) ml human transferrin, 5 ng / ml sodium selenite, 2 mM L-glutamine, 45 mM ⁇ -monothioglycerol, and 50 ⁇ g / ml ascorbic acid), 10 ng / ml BMP4, 5 ng / ml bFGF, 15 ng / ml VEGF, 2 [mu] M SB431542, added were 5-day culture at a low oxygen conditions (5% 0 2) (Day5 ).
  • EB medium 10 ⁇ g / ml human insulin, 5.5 ⁇ g / well in StemPro34
  • ml human transferrin 5 ng / ml sodium selenite, 2
  • the cell population subjected to the above staining was subjected to sorting by FACSAria.
  • the cell fraction obtained from each sample group is shown below.
  • fractions A to G each indicate the following.
  • Fraction A CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive
  • Fraction B CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD62L positive
  • Fraction C CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD62L Negative Fraction D: CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD24 positive
  • Fraction E CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD24 negative
  • Fraction E CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD24 negative
  • Fraction F CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD90 positive
  • Fraction G CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD90 negative
  • Fraction H CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD143 positive
  • Fraction I CD235a negative, CD14 negative CD34 positive, CD43 positive,
  • the cells contained in the fractions A to O can be obtained from lymphocytes according to known methods (for example, the method described in Journal of Leukocyte Biology 96 (2016) 1165-1175 and International Publication No. 2017/221975). Differentiated into cells. Specifically, each cell population of fractions A to O was seeded at 48 cells / well in a 48-well-plate coated with Recombinat h-DLL4 / Fc chimera (Sino Biological) and Retrotrontin (Takara Bio). The cells were cultured under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. During the culture period, the medium was changed every 2 or 3 days.
  • OP9 medium (15% FBS, 2 mM L) supplemented with 50 ng / ml SCF, 50 ng / ml IL-7, 50 ng / ml Flt3L, 100 ng / ml TPO, 15 ⁇ M SB203580, 30 ng / ml SDF-1 ⁇ (Includes glutamine, 100 Uml penicillin, 100 ng / ml streptomycin, 55 ⁇ 2-mercaptoethanol, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid, 10 ⁇ g / ml human insulin, 5.5 ⁇ g / ml human transferrin, 5 ng / ml sodium selenite) was used.
  • the cells were subcultured to 48-well-plates with the same coating. On the 21st day from the start of the culture, all cells were collected, counted using a hemocytometer, and then stained using the following antibody set.
  • the stained cell population was subjected to FACSAria sorting.
  • the cell fraction obtained by the sorting is shown below.
  • the lymphocyte fraction is the same as the method described in Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 18 (1994) 199-208, using FSC (forward scatter) and SSC (side scatter) as indices.
  • the separated fraction Fraction P: Lymphocyte fraction
  • Fraction Q Lymphocyte fraction, CD3 positive, CD45 positive, CD5 positive, CD7 positive
  • Fraction R Lymphocyte fraction, CD3 positive, CD45 positive, CD7 positive, CD8a positive, CD4 Positive fraction
  • S Lymphocyte fraction, CD3 positive, CD45 positive, CD7 positive, CD8a positive, CD4 negative
  • Table 4 shows the number of cells on the 21st day of culture in each sample derived from fractions A to O (ratio with the number of cells in the sample derived from fraction A).
  • Table 4 shows that fraction B (CD62L positive), fraction D (CD24 positive), fraction F (CD90 positive), and fraction H (CD143 positive) compared to the cell population contained in the sample derived from fraction A
  • fraction J CD218a positive
  • fraction L CD263 positive
  • fraction N Notch3 positive
  • Table 5 shows the number of cells in cell fraction P to S obtained by sorting with FACS Aria on the 21st day of culture (ratio with the number of cells in cell fraction P to S in the sample derived from fraction A).
  • CD4 / CD8 double positive cells or CD8 positive cells
  • CD90, CD143 or CD218a a high proportion of CD4 / CD8 double positive cells (or CD8 positive cells) by isolating cells that express CD90, CD143 or CD218a as a cell population containing hematopoietic progenitor cells and differentiating the isolated cells It has been shown that cell populations comprising can be produced.
  • Example 2 (Study using Ff-I01s04 strain) As a cell population containing hematopoietic progenitor cells (hereinafter sometimes referred to as HPC), a floating cell population obtained by subjecting iPS cells (Ff-I01s04 strain) to the method described in Example 1 was used.
  • the cell population containing HPC is the antibody set 3, 4, 5, 6 shown in Example 1 for each sample group (in this example, expressed as 3b, 4b, 5b, 6b, respectively) or the antibodies shown below Stained with set 8b.
  • the cell population subjected to the above staining was subjected to sorting by FACSAria.
  • the cell fraction obtained from each sample group is shown below.
  • fractions f to m, t and u each indicate the following.
  • Fraction f CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD90 positive
  • Fraction g CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD90 negative
  • Fraction h CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 Positive, CD143 positive
  • Fraction i CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD143 negative
  • Fraction j CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD218a positive
  • Fraction k CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD218a negative
  • Fraction l CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD263 positive
  • Fraction m CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD263 negative
  • Fraction t CD235a negative , CD14 negative, CD34 positive, CD43
  • the cells contained in the above fractions f to m, t and u were subjected to the method described in Example 1 to be differentiated into lymphocyte cells. On day 28 of the start of culture, all cells were collected and stained using the following antibody set.
  • the stained cell population was subjected to FACSAria sorting.
  • the cell fraction obtained by the sorting is shown below.
  • Fraction p Lymphocyte fraction fraction q: Lymphocyte fraction, CD45 positive, CD5 positive, CD7 positive fraction r: Lymphocyte fraction, CD45 positive, CD7 positive, CD8a positive, CD4 positive fraction s: Lymph Spherical fraction, CD45 positive, CD7 positive, CD8a positive, CD4 negative
  • Table 9 shows the number of cells on the 28th day from the start of culture in each sample derived from fractions f to m, t and u (ratio with the number of cells at the start of culture).
  • fraction f is fractioned with respect to fraction g, fraction h with respect to fraction i, fraction j with respect to fraction k, and fraction l with respect to fraction m. It was found that t was excellent in proliferation ability for fraction u. That is, it was found that all cell populations contained in samples derived from CD90 positive, CD143 positive, CD218a positive, CD263 positive or CD200 positive were excellent in proliferating ability.
  • Table 10 shows the number of cells in cell fraction p-s obtained by sorting by FACS Aria on the 28th day of culture when cells contained in fractions fm, t, and u were seeded at 1000 cells / well. Show.
  • CD45 positive and CD5 positive when cells derived from each marker positive cell were used compared to when cells derived from each marker negative cell were used.
  • CD7-positive, CD8a-positive, and CD4-positive cells or
  • CD45-positive, CD5-positive, CD7-positive, CD8a-positive, and CD4-negative cells can be prepared with high yield.
  • Example 3 (Examination using Ff-I01s04 strain) As a cell population containing hematopoietic progenitor cells (hereinafter sometimes referred to as HPC), a floating cell population obtained by subjecting iPS cells (Ff-I01s04 strain) to the method described in Example 1 was used. The floating cell population containing HPC was stained using the following antibody set for each sample group.
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • the cell population subjected to the above staining was subjected to sorting by FACSAria.
  • the cell fraction obtained from each sample group is shown below.
  • fractions Ac to Pc indicate the following.
  • Fraction Ac CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive
  • Fraction Bc CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD7 positive
  • Fraction Cc CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD144 Positive
  • Fraction Dc CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD56 positive
  • Fraction Ec CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD226 positive
  • Fc CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD262 positive
  • Fraction Gc CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD325 positive
  • Fraction Hc CD235a negative, CD14 negative, CD34 positive, CD43 positive, CD49f positive
  • Fraction Ic CD235a negative, CD14 negative CD34 positive, CD43 positive, CD51 positive
  • Fraction Jc CD235a negative, CD14 negative,
  • the cells contained in the fractions Ac to Pc were subjected to the method described in Example 1 to differentiate into lymphocyte cells. On the 21st day from the start of the culture, all cells were collected, counted using a hemocytometer, and then stained using the following antibody set.
  • the stained cell population was subjected to FACSAria sorting.
  • the cell fraction obtained by the sorting is shown below.
  • Fraction Qc Lymphocyte fraction
  • Fraction Rc Lymphocyte fraction, CD3 positive, CD45 positive, CD5 positive, CD7 positive
  • Fraction Sc Lymphocyte fraction, CD3 positive, CD45 positive, CD7 positive, CD8a positive
  • Tc Lymphocyte fraction, CD3 positive, CD45 positive, CD7 positive, CD8a positive, CD4 negative
  • Table 14 shows the number of cells on the 21st day from the start of culture in each sample derived from fractions Ac to Pc (ratio with the number of cells in the sample derived from fraction Ac).
  • fraction Bc (CD7 positive), fraction Cc (CD144 positive), fraction Dc (CD56 positive), fraction Ec (CD226 positive) It was found that the cell populations contained in the samples derived from fraction Fc (CD262 positive) and fraction Gc ⁇ (CD325 positive) all have excellent proliferation ability. Also, fraction Hc (CD49f positive), fraction Ic (CD51 positive), fraction Kc (CD42b positive), fraction Lc (CD61 positive), fraction Mc (CD62P positive), fraction Nc (CD69 positive) and It was found that all the cell populations contained in the sample derived from the fraction Pc (CD156c positive) were inferior in proliferation ability.
  • Table 15 shows the number of cells in the cell fraction Qc to Tc obtained by sorting by FACS Aria on the 21st day of culture (ratio with the number of cells in the cell fraction Qc to Tc in the sample derived from the fraction Ac).
  • fraction Ac derived from fraction Hc, fraction Ic, fraction Jc, fraction Kc, fraction Lc, fraction Mc, fraction Nc, fraction Oc, or fraction Pc. It is shown that a cell population containing CD3 positive CD45 positive CD7 positive CD8 positive CD4 positive cell or CD3 positive CD45 positive CD7 positive CD8a positive CD4 negative cell can be prepared compared to It was done.
  • a cell population containing hematopoietic progenitor cells cells expressing any one or more of CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, and CD325, or CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102
  • more and / or higher concentration of immature T cells and mature T cells can be obtained, and the cells thus obtained can prevent diseases such as tumors, infectious diseases, autoimmune disorders, etc. Or it is useful for treatment.

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Abstract

本発明は、次の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法を提供する。工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、 CD317、CD200 及びCD218a からなる群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程、及び工程２：工程１により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化する工程

Description

造血前駆細胞マーカー
　本発明は、１種以上の造血前駆細胞マーカー（HPCマーカー）を用いたCD8ポジティブ細胞を製造する方法及び１種以上のHPCマーカーを発現する細胞集団などに関する。
（発明の背景）
　T細胞は、細菌やウイルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしている。なかでも、細胞傷害性T細胞（CTL）は、その細胞表面上に存在するT細胞受容体（TCR）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原と共に提示された、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮する。
　ここで、大部分のCTLは、CD8シングルポジティブ（SP）細胞である。上記CD8SP細胞は、胸腺内において、TCRを発現しておらず、CD4もCD8も有さない未成熟な細胞（CD4/CD8ダブルネガティブ（本明細書では、ダブルネガティブをDNと表記することがある。）細胞）から、CD8及びCD4を発現する細胞（CD4/CD8ダブルポジティブ（本明細書では、ダブルポジティブをDPと表記することがある。）細胞）を経て、分化してくることが知られている。
　上述のように、T細胞は免疫システムにおいて中心的な役割を果たしているため、T細胞の補充や再生をすることができれば、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の予防又は治療などに極めて有効な手段となる。そのため、iPS細胞から造血前駆細胞(Hematopoietic Progenitor Cell；本明細書中、HPCと称することがある。)を誘導する方法や、さらにCD4/CD8DP細胞を誘導する方法などにより、造血前駆細胞やT細胞系列の細胞を得る試みが行われている。例えば、非特許文献１には、iPS細胞をフィーダー細胞（具体的には、OP9細胞）と共培養することで、CD34/CD43DP細胞を誘導できることが記載されている。特許文献１や非特許文献２には、ヒト多能性幹細胞から誘導したHPCを含む細胞集団から、CD43と、CD34、CD31又はCD144との発現を指標としてHPCを分離する方法、分離した細胞をT細胞系列の細胞へ分化させる方法や、多能性幹細胞からHPCへ分化させる際に、誘導初期にActivin/Nodalを作用させるか否かにより、誘導される造血系細胞の性質が異なることが記載されている。特許文献２には、フィーダーフリー条件下でCD4/CD8DPを製造する方法が記載されている。また、非特許文献３には、ヒト多能性幹細胞から造血前駆細胞を含む血液系細胞を誘導する様々な方法や、in vitroで誘導した血液系細胞の臨床での使用が進まない理由として、誘導効率の低さが挙げられている。
国際公開第２０１３／０７５２２２号 国際公開第２０１７／２２１９７５号
Choi K.D. et al., Stem Cells, 27 (2009);559-567 Kennedy M. et al., Cell Reports, 2 (2012);1722-1735 Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358
　本発明は、安定的に細胞治療を提供するため、T細胞系列の細胞（例えば、CD8ポジティブ細胞(例えば、CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞)）をより多く及び/又はより高い濃度で得ること（すなわち、該細胞の製造方法を提供すること）を課題とする。また、本発明は、上記課題を解決するための造血前駆細胞を含む細胞集団を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するCD4/CD8DP細胞を製造方法の開発を行うため、HPCの表面に発現するマーカー（HPCマーカー）を同定した。さらに、HPCを含む細胞集団から、１種以上の該マーカーを用いて分離したHPCは、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）に分化する効率が高く、増殖能力も高いこと、即ち、１種以上のHPCマーカーを用いることで、CD8ポジティブ細胞(例えば、CD4/CD8DP細胞)をより多く得ることができ、及び/又は細胞集団内により高い濃度で得ることができることを見出した。さらに、本発明の製法により、収率のバラツキが少なく、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）を安定して提供することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］　以下の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法。
工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程、並びに
工程２：工程1により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化させる工程
［２］　前記工程１において選択される細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、［１］に記載の方法。
［３］　前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　前記工程１に示される第１の群が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる群である、［３］に記載の方法。
［５］　前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程である、［１］又は［２］に記載の方法。
［６］　前記工程１に示される第２の群が、CD49f、CD51及びCD102からなる群である、［５］に記載の方法。
［７］　前記工程１の造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］　前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９－１］　［１］～［８］のいずれかの方法により得られたCD4/CD8 ダブルポジティブ細胞をCD8 シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む、CD8 シングルポジティブ細胞の製造方法。
[９－２]　前記誘導する工程が、例えば、副腎皮質ホルモン剤、抗体及び/又はサイトカインの存在下でCD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養する工程を含む方法であって、好ましくは、該副腎皮質ホルモン剤がデキサメタゾンであり、及び/又は該抗体が抗CD3抗体であり、及び/又はサイトカインはIL-2である、[９－１]に記載の方法。
［１０］　前記CD8 シングルポジティブ細胞が細胞傷害性T細胞である、［９－１］又は［９－２］に記載の方法。
［１１］　造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離して得られる細胞集団。
［１２］　分離された細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、［１１］に記載の細胞集団。
［１３］　前記造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、［１１］又は［１２］に記載の細胞集団。
［１４］　前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１３］に記載の細胞集団。
［１５］　CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が40％以上である細胞集団。
［１６］　前記割合が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる第１の群より選択される１種以上の分子をさらに発現する造血前駆細胞の割合である、［１５］に記載の細胞集団。
［１７］　前記割合が、CD49f、CD51及びCD102 からなる第２の群より選択される１種以上の分子をさらに発現しない造血前駆細胞の割合である、［１５］に記載の細胞集団。
［１８］　CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる群より選択される１種以上の分子の各々に対する抗体を含んでなる、造血前駆細胞の分離用試薬。
［１９］　さらにCD235a、CD14、CD45、CD34及び/又はCD43に対する抗体を１種以上含んでなる、［１８］に記載の試薬。
[２０]　造血前駆細胞の表面タンパク質を検出する方法であって、該造血前駆細胞と、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109又はCD156cに特異的に結合する物質とを接触させる工程を含む、方法。
[２１]　前記物質が抗体又はその断片を含む、［２０］に記載の方法。
[２２]　前記物質がさらにフルオロフォアを含む、[２０]又は[２１]に記載の方法。
[２３]　前記造血前駆細胞に、CD34、CD43、CD14又はCD235aに特異的に結合する物質を接触させる工程をさらに含む、[２０]～[２２]のいずれかに記載の方法。
［２４］　造血前駆細胞の表面上の複数のタンパク質を検出する方法であって、該方法は、造血前駆細胞を、複数のタンパク質の各々に特異的に結合する物質と接触させる工程を含み、該複数のタンパク質が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156cの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７若しくは２８つの、又は全２９つの任意の組み合わせを含む、方法。
[２５]　造血前駆細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を選択する方法であって、［２０］～[２４]のいずれかの方法により細胞の表面上の１種以上のタンパク質の存在又は非存在を検出する工程、並びに該１種以上のタンパク質の存在又は非存在に基づき該細胞を選択する工程であって、(i)次のタンパク質：CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325：の任意の１つ又は任意の組み合わせが該細胞の表面で検出される場合、及び／又は(ii)次のタンパク質：CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156c：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせが該細胞の表面で検出されない場合に、該細胞を選択する工程、を含む方法。
［２６］　次のタンパク質：CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144：の任意の１つ又は任意の組み合わせが細胞の表面上で検出される場合に、該細胞を選択する、[２５]に記載の方法。
[２７]　次のタンパク質：CD49f、CD51及びCD102：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせが細胞の表面上で検出されない場合に、該細胞を選択する、[２５]又は［２６］に記載の方法。
［２８］　造血前駆細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を選択する方法であって、［２０］～[２４]のいずれかの方法により細胞の表面上の１種以上のタンパク質の存在又は非存在を検出する工程、並びに該１種以上のタンパク質の存在又は非存在に基づき、(i)CD45、CD34及び／又はCD43と、次のタンパク質：CD24、CD62L、C90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせとが、該細胞の表面上で検出された場合、並びに／又は(ii)CD14及び／若しくはCD235aが該細胞の表面上で検出されず、かつ次のタンパク質：CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156c：も検出されなかった場合に、該細胞を選択する工程を含む、方法。
　本発明の１種のHPCマーカーを用いた製法により、より多くのCD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を提供することができ、及び/又はCD8ポジティブ細胞をより高い濃度で作製することができる。さらに、本発明の製法により、収率のバラツキが少なく、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を安定して提供することができる。従って、本発明の製造方法は、細胞集団から造血前駆細胞を分離するための改良された方法を提供する。これは、CD8ポジティブ細胞を作製するための改良された細胞供給源を提供する。この新規な製造方法は、HPC由来のCD8ポジティブ細胞集団の質及び/又は量を大きく改善するために、特定のHPCポジティブマーカー及びHPCネガティブマーカーを用いることができるという本発明者らの驚くべき、そして予期できない知見に基づいている。本発明のCD8ポジティブ細胞のこの有益な供給源は、臨床応用（例えば、細胞療法、診断目的、及びインビトロでの用途）のための改良されたCD8ポジティブ細胞集団を提供する。
（発明の詳細な説明）
　本発明は、（工程１）造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上の造血前駆細胞マーカー（本明細書中、「HPCマーカー」と略記することがある。）を発現する細胞、及び／又は１種以上のHPCマーカーを発現しない細胞を分離する工程、及び（工程２）工程１により分離された細胞を、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（本明細書中、「CD4/CD8DP細胞」と略記することがある。）に分化させる工程を含む、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）を製造する方法（以下「本発明の製法」と略記する。）などを提供する。
　本発明において、「CD8ポジティブ細胞」とは、CD8を発現しているT細胞を意味し、該細胞としては、例えば、CD4/CD8DP細胞及びCD8シングルポジティブ細胞（本明細書中、「CD8SP細胞」と略記することがある。）が挙げられる。本発明において、「CD4/CD8DP細胞」とは、CD4及びCD8が共に発現しているT細胞を意味し、「CD8SP細胞」とは、CD4を発現せず、CD8を発現しているT細胞を意味する。CD8SP細胞としては、例えば、細胞傷害性T細胞及びその前駆細胞が挙げられる。また、本発明において、「T細胞」とは、例えば、表面にT細胞受容体（T cell receptor、TCR）と称される抗原受容体を発現している細胞、及びその前駆細胞（例：TCR（TCRαβ）を発現していないプロT細胞、TCRβとプレTCRαとが会合しているプレT細胞）を意味する。
　本発明において、「造血前駆細胞」とは、CD34陽性細胞を意味し、好ましくは、CD34/CD43DP細胞である。本発明に用いる造血前駆細胞の由来は制限されず、例えば、公知の手法（例えば、特許文献１、２、非特許文献１～３に記載の手法）により、in vitroで誘導された造血前駆細胞（例えば、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる造血前駆細胞）であってもよく、また、生体組織から、公知の手法により単離した造血前駆細胞であってもよい。
　前記多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）が挙げられるが、好ましくはiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)である。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　前記iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（例えば、Takahashi K.及びYamanaka S. (2006） Cell，126；663-676：Takahashi K. et al． (2007) Cell，131;861-872：Yu J. et al． (2007） Science，318;1917-1920：Nakagawa M．et al．(2008) Nat．Biotechnol．26;101-106）。iPS細胞を用いる場合、該iPS細胞は、自体公知の方法により体細胞から作製してもよいし、既に樹立され、ストックされているiPS細胞を用いてもよい。本発明に用いるiPS細胞の由来となる体細胞に制限はないが、好ましくは末梢血由来の細胞または臍帯血由来の細胞である。多能性幹細胞の由来となる動物に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
　前記多能性幹細胞を自体公知の方法に供することにより、造血前駆細胞を製造することができる。前記多能性幹細胞がiPS細胞である場合、例えば、国際公開第2017/221975号に記載された方法により、造血前駆細胞を製造することができる。
　また、前記生体組織としては、造血前駆細胞を含有する限り制限されないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血が挙げられる。これらの中では、動物に対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。
　本発明で用いる造血前駆細胞や多能性幹細胞は、治療への適用の観点からは、GMP（Good Manufacturing Practice）規格の細胞であることが好ましい。
　本発明において、「HPCマーカー」とは、造血前駆細胞の表面に発現し得る分子である、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325のいずれかの分子（明細書中、これらのマーカーを「HPCポジティブマーカー」、「ポジティブHPC選択マーカー」、又は「ポジティブHPCマーカー」と称することがある）、あるいは、造血前駆細胞の表面に通常発現しない分子である、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cのいずれかの分子（明細書中、これらのマーカーを「HPCネガティブマーカー」、「ネガティブHPC選択マーカー」、又は「ネガティブHPCマーカー」と称することがある）を意味する（明細書中、HPCポジティブマーカーとHPCネガティブマーカーをまとめて「本発明のHPCマーカー」と称することがある）。本発明のHPCポジティブマーカーのなかでも、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD200、CD７又はCD144が好ましく、CD90、CD143、CD218a又はCD200がより好ましい。また別の態様では、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200又はCD218aが好ましく、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200 又はCD218aがより好ましい。また、本発明において、前記HPCポジティブマーカーを発現する細胞を、HPCマーカー陽性細胞（又はHPCマーカーポジティブ細胞）と呼ぶことがあり、例えば、CD24分子を発現する細胞の場合、CD24陽性細胞と呼ぶことがある。本発明のHPCネガティブマーカーのなかでも、CD49f、CD51又はCD102が好ましい。本発明において、前記HPCネガティブマーカーを発現しない細胞を、HPCマーカー陰性細胞（又はHPCマーカーネガティブ細胞）と呼ぶことがある。
　典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD62L、CD24、CD90、CD143、CD218a、CD263又はNotch3のいずれかを発現し、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
　典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD90、CD143、CD200、CD218a又はCD263のいずれかを発現し、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
　典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD7、CD144、CD56、CD226、CD262又はCD325のいずれかを発現し、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
　典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD49f、CD51、CD426、CD61、CD62P、CD69又はCD156cのいずれも発現せず、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
　本発明において、「発現する」とは、細胞を分離する際に使用する方法で発現が検出できることを意味し、「発現しない」とは、細胞を分離する際に使用する方法の検出感度では検出できないことを意味する。細胞を分離する際に使用する方法としては、下述のフローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などが挙げられる。
　前記工程１により分離される細胞としては、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する細胞、１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞。本発明の一実施態様において、前記工程１により分離される細胞は、１種以上の本発明のHPCポジティブマーカーに加えて、CD34及び／又はCD43を発現する細胞、及び／又は１種以上の本発明のHPCネガティブマーカーを発現せず、かつCD34及び／又はCD43を発現する細胞である。さらに、該分離される細胞は、CD235a陰性、CD14陰性及び／又はCD45陽性であることが好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様において、前記工程１は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD235a陰性、CD14陰性、CD45陽性、CD34陽性及びCD43陽性であり、かつ１種以上の本発明のHPCポジティブマーカー陽性及び／又は１種以上の本発明のHPCネガティブマーカー陰性の細胞を分離することにより行われる。
　本発明において、「細胞を分離する」には、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を選択し、該選択した細胞を単離する態様、及び該選択した細胞を次の分化工程へ供する態様が包含される。
　本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」のような各用語は、任意選択でに、「からなる（consisting of）」又は「からなる(consists of)」で置き換えられてもよい。
　造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を分離する方法としては、フローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などが挙げられ、これらの方法は、公知の方法を用いて実施することができる。例えば、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する細胞、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞は、当該細胞と各HPCマーカーに特異的に結合する物質（例えば、抗体）とを接触させる工程を含む方法により分離することができる。上記物質には、それ自体に検出可能な標識（例：GFP）が付加されているもの、およびそれ自体には標識が付加されていないものも含まれる。上記物質が、それ自体に標識が付加されていないものである場合、当該物質を直接または間接的に認識する検出可能な標識が付加された物質をさらに使用することで前記分離が可能となる。例えば、前記物質が抗体である場合には、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）を当該抗体に直接的又は間接的に担持させ、それにより細胞表面のHPCマーカーを標識することが可能であり、当該標識に基づいて細胞を分離することが可能である。この際用いる抗体は、１種類のみ、又は２種類以上の抗体であってもよい。
　造血前駆細胞を含む細胞集団から本発明の１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又はHPCネガティブマーカーを発現しない細胞として分離された細胞を、CD8ポジティブ細胞に分化させる方法としては、例えば公知の方法（例えば、国際公開第2016/076415号、Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175、Cell Reports 2(2012)1722-1735、国際公開第2017/221975号に記載された方法）が挙げられる。
１．CD4/CD8DP細胞の製造方法
　本発明の製法の工程２で用いる細胞培養用の基礎培地としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地が挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、含有されていなくてもよい。必要に応じて、培地には、例えば、ビタミンC類(例：アスコルビン酸、リン酸ビタミンC)、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質を含有させてもよい。
　前記培地は、サイトカインを含んでいることが好ましい。サイトカインとしては、IL-7、FLT-3L、SCF、TPO及びこれらの組合せなどが挙げられ、FLT-3L及びIL-7が好ましい。IL-7の培地中における濃度は、1 ng/ml～50 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml）が好ましく、なかでも、5 ng/mlが好ましい。FLT-3Lの培地中における濃度は、1 ng/ml～100 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。その他のサイトカインの濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。また、培地は、Notchリガンド（例：Dll1、Dll4、Dll1又はDll4とFcの融合タンパク質）を含んでいることが好ましい。Notchリガンドを用いる場合は、培地に添加してもよく、培養容器にコーティングしてもよい。また、Notchリガンドを発現するフィーダー細胞を用いてもよい。
　本発明の製法においては、工程１により得られた造血前駆細胞を接着培養又は浮遊培養してもよい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。治療への適用の観点からは、フィーダーフリーであることが好ましい。培養容器をコーティングする場合の基材としては、例えば、フィブロネクチン断片（例：レトロネクチン）、プロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、共培養するフィーダー細胞として、例えば、骨髄間質細胞株のOP9細胞、マウス間葉系細胞株の10T1/2細胞、Tst-4細胞が挙げられる。フィーダー細胞を用いる場合には、該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。当該交換は、2日～5日毎に行うことが好ましい。
　本発明において、造血前駆細胞を培養してCD4/CD8 DP細胞を誘導する際の培養温度条件は、特に制限されないが、37℃～42℃程度が好ましく、37～39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD4/CD8DP細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。CD4/CD8DP細胞が得られる限り、造血前駆細胞からCD4/CD8 DP細胞を誘導する培養日数は特に限定されないが、10日間以上（例：12日、14日、16日、18日、20日又はそれ以上）が好ましく、また、60日以下が好ましい。後述の実施例で示す通り、特定の実施態様において、21日間～28日間の培養により、CD4/CD8DP細胞を大量に効率よく得ることができる。
　本発明において、得られたCD4/CD8DP細胞は、単離して用いてもよく、他の細胞種（例えば、CD8SP細胞）が含有される細胞集団として用いてもよい。単離する場合、CD4、CD8、CD3、CD45分子などを指標として、単離することができる。当該単離の方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、指標とする分子に対する抗体により標識し、上述のフローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法、又は所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
２．CD8シングルポジティブ細胞の製造方法
　本発明の製法により得られたCD4/CD8DP細胞をCD8SP細胞に分化誘導する工程に付すことにより、CD8SP細胞を製造することができる（このようにCD8SP細胞を製造する方法を、「本発明のCD8SP細胞の製法」と略記することがある。）。CD4/CD8DP細胞を製造する方法については、１．に記載の通りである。
　本発明のCD8SP細胞の製法に用いる基礎培地および培地としては、1.に記載された基礎培地および培地と同様のものが挙げられる。
　前記培地は、副腎皮質ホルモン剤を含んでいてもよい。副腎皮質ホルモン剤としては、例えば、糖質コルチコイド及びその誘導体などが挙げられ、該糖質コルチコイドとしては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。なかでも、デキサメタゾンが好ましい。従って、一実施態様において、CD8シングルポジティブ細胞を製造する方法は、副腎皮質ホルモン剤、好ましくはデキサメタゾンの存在下で、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養することにより、前記CD4/CD8ダブルポジティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む。
　副腎皮質ホルモン剤としてデキサメタゾンを用いる場合、培養液中におけるその濃度は、1nM～100nM（例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM）が好ましく、なかでも、10nMが好ましい。
　前記培地は、抗体（例：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体）、サイトカイン（例：IL-7、IL-2、IL-15）などを含有していてもよい。
　本発明に用いる抗CD3抗体としては、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体は、磁気ビーズ等が結合されているものであってもよく、また、前記抗CD3抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体を表面に結合させた培養容器上で該Tリンパ球を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。抗CD3抗体の培地中における濃度は、10ng/ml～1000ng/ml（例：10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml、1000 ng/ml）が好ましく、なかでも、500 ng/mlが好ましい。その他の抗体の濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。従って、一実施態様において、CD8シングルポジティブ細胞を製造する方法は、抗体、好ましくは抗CD3抗体の存在下で、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養することにより、前記CD4/CD8ダブルポジティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む。
　本発明に用いるIL-2の培地中における濃度は、10 U/ml～1000 U/ml（例：10 U/ml、20 U/ml、30 U/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/ml、100 U/ml、500 U/ml、1000 U/ml）が好ましく、なかでも、100 U/mlが好ましい。本発明に用いるIL-7又はIL15の培地中における濃度は、1 ng/ml～100 ng/ml（例：1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。従って、一実施態様において、CD8シングルポジティブ細胞を製造する方法は、サイトカイン、好ましくはIL-2の存在下で、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養することにより、前記CD4/CD8ダブルポジティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む。
　本発明のCD8SP細胞の製法において、CD4/CD8DP細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、37℃～42℃程度が好ましく、37～39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。CD8SP細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、1日以上、3日以上、7日以上が好ましく、60日以下が好ましい。
　本発明の製法により製造されるCD8SP細胞は、CD4/CD8DP細胞から分化させて得られる細胞（例えば、上記２．により得られる細胞）に限定されない。したがって、例えば、造血前駆細胞を含む細胞集団から本発明の１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞として分離された細胞からCD4/CD8DP細胞を経ずに誘導されるCD8SP細胞も本発明の製法により製造されるCD8SP細胞に含まれる。
３．１種以上のHPCマーカーを発現する造血前駆細胞を含有する細胞集団
　本発明は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞を高頻度で含む細胞集団（以下「本発明の細胞集団」と略記する。）を提供する。前記細胞集団は、例えば、造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を上記に記載の分離方法を用いて分離することで得ることができる。HPCマーカーの定義、具体的な分子、及び造血前駆細胞の定義については、上記に記載の通りである。
　本発明の細胞集団は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が、従来法（例えば、CD34陽性、CD34陽性及びCD43陽性、あるいはCD43陽性及びCD34、CD31もしくはCD144陽性を指標に分離する方法）により得られる造血前駆細胞集団に含まれる割合よりも高い割合であれば特に制限はないが、40%以上（例：50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%）であることが好ましい。本発明の細胞集団は、本発明の製法の工程１で記載した方法により得ることができる。１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞の割合は、フローサイトメトリーにより測定することができる。
　後述の実施例で示す通り、本発明の細胞集団は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を分離しなかった細胞集団と比較して、CD4/CD8DP細胞及びCD8SP細胞へ分化する効率が高く、増殖能にも優れている。
４．「本発明の細胞集団」の分離用試薬
　本発明はまた、本発明のHPCマーカー、即ち、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156c、好ましくは、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200CD218a、CD7、CD144、CD49f、CD51及びCD102からなる群より選択される１種以上のマーカーの各々に対する抗体を含んでなる、本発明の細胞集団の分離用試薬（以下、「本発明の試薬」と略記する）を提供する。本発明の試薬が２種以上のHPCマーカーに対する抗体を含む場合、該試薬は、各抗体を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明の試薬に含まれる抗体は、本発明の製法の工程１に用いられる分離手段に応じて、例えば、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）に結合した形態で提供され得る。
　また、本発明の試薬は、抗CD4抗体及び／又は抗CD8抗体、並びに、必要に応じてCD4/CD8DP細胞及び／又はCD8SP細胞で発現する又は発現しないことが既知の他の細胞表面マーカー（例えば、CD3、CD45、CD235a、CD14、CD45、CD34、CD43）に対する１種以上の抗体をさらに含むことができ、本発明の細胞集団から分化誘導されたCD4/CD8DP細胞やCD8SP細胞の分離用試薬として使用することができる。
　また、本発明の試薬は、造血前駆細胞をCD4/CD8DP細胞に、さらにはCD8SP細胞に分化誘導するための試薬類（例えば、基礎培地、培地添加物など）をさらに含んでもよく、当該試薬類としては、上記１．及び上記２．で例示された物質が同様に挙げられる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明はこれらに限定されない。
実施例１（TKT3V1-7株を用いた検討）
　造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（TKT3V1-7株）を公知の方法（例えば、Cell Reports 2(2012)1722-1735や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて分化させた浮遊細胞集団を用いた。具体的には、超低接着処理された6weｌｌ plateにTKT3V1-7株を3 ｘ 105個/ウェルで播種し（Day0)、EB培地(StemPro34に10 μg/mlヒトインスリン、5. 5 μg/mlヒトトランスフェリン、5 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、45mM α-モノチオグリセロー ル、および50 μg/mlアスコルビン酸を添加）に10 ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF 、15ng/ml VEGF、2μM SB431542、を加えて、低酸素条件下（5% 02)にて5日間 培養を行った(Day5)。 続いて、50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5～9 日間培養を行い（～Day14)、浮遊細胞集団を得た。なお、培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、サンプル群ごとに以下の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記各サンプル群から取得した細胞分画を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上表において、分画A～Gは各々以下を示す。
　分画A：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性
　分画B：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62L陽性
　分画C：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62L陰性
　分画D：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD24陽性
　分画E：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD24陰性
　分画F：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陽性
　分画G：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陰性
　分画H：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陽性
　分画I：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陰性
　分画J：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陽性
　分画K：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陰性
　分画L：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陽性
　分画M：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陰性
　分画N：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、Notch3陽性
　分画O：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、Notch3陰性
　上記分画A～Oに含まれる細胞を、公知の方法（例えば、Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて、リンパ球系細胞へ分化させた。具体的には、分画A～Oの各細胞集団を、2000 cells/wellで、Recombinat h-DLL4/Fc chimera（Sino Biological）とRetronectin（タカラバイオ）をコートした48-well-plateに播種し、5%CO2、37℃条件下に培養した。培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。なお、培地としては、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30 ng/ml SDF-1α を添加したOP9培地（15% FBS、2mM L-グルタミン、100Umlペニシリン、100ng /mlストレプトマイシン、55μΜ 2-メルカプトエタノール、50μg/mlアスコ ルビン酸、10 μg/mlヒトインスリン、5. 5 μg/mlヒトトランスフェリン、 5ng/ml亜セレン酸ナトリウムを含む）を用いた。培養開始から7日目および14日目に同様のコートをした48-well-plateに継代した。培養開始21日目にすべての細胞を回収し、血球板を用いて細胞数を数えた後、以下の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記ソーティングにより取得した細胞分画を以下に示す。なお、本明細書においてリンパ球分画とは、Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 18(1994)199-208に記載された方法と同様に、FSC（forward scatter）およびSSC(side scatter)を指標として分離した分画をいう。
　分画P：リンパ球分画
　分画Q：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
　分画R：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
　分画S：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
　分画A～O由来の各サンプルにおける培養開始21日目の細胞数（分画A由来のサンプルにおける細胞数との比率）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、分画A由来のサンプルに含まれる細胞集団に比べて、分画B（CD62L陽性）、分画D(CD24陽性)、分画F（CD90陽性）、分画H（CD143陽性）、分画J（CD218a陽性）、分画L(CD263陽性)または分画N(Notch3陽性)由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に優れていることがわかった。
　培養21日目のFACS Ariaによるソーティングにより得られた細胞分画P～Sの細胞数（分画A由来のサンプルにおける細胞分画P～Sの細胞数との比率）を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　この結果、分画F由来の細胞を用いることにより、分画Gまたは分画A由来の細胞を用いた場合に比して、(a) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞、あるいは(b) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陰性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。同様に、分画H由来の細胞を用いることにより、分画Iまたは分画A由来の細胞を用いた場合に比して、(a) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞、あるいは(b) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陰性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。また分画J由来の細胞を用いることにより、分画Kまたは分画A由来の細胞を用いた場合に比して、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。すなわち、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD90、CD143またはCD218aを発現する細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（またはCD8ポジティブ細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
実施例２（Ff-I01s04株を用いた検討）
　造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（Ff-I01s04株）を実施例１に記載された方法に供して得られた浮遊細胞集団を用いた。
　HPCを含む細胞集団は、サンプル群ごとに実施例１に示した抗体セット3、4、5、6（本実施例では、それぞれ3b、4b、5b、6bと表記する）、または以下に示す抗体セット8bを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記各サンプル群から取得した細胞分画を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上表において、分画f～m、ｔおよびuは各々以下を示す。
　分画f：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陽性
　分画g：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陰性
　分画h：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陽性
　分画i：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陰性
　分画j：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陽性
　分画k：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陰性
　分画l：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陽性
　分画m：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陰性
　分画t：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD200陽性
　分画u：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD200陰性
　上記分画f～m、tおよびuに含まれる細胞を、実施例１に記載された方法に供してリンパ球系細胞へ分化させた。培養開始28日目にすべての細胞を回収し、以下の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記ソーティングにより取得した細胞分画を以下に示す。
分画p：リンパ球分画
分画q：リンパ球分画、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画r：リンパ球分画、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画s：リンパ球分画、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
　分画f～m、tおよびu由来の各サンプルにおける培養開始28日目の細胞数（培養開始時の細胞数との比率）を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９より、分画fは分画gに対して、分画hは分画iに対して、分画jは分画kに対して、分画lは分画mに対して、分画tは分画uに対していずれも増殖能に優れていることがわかった。すなわち、CD90陽性、CD143陽性、CD218a陽性、CD263陽性またはCD200陽性由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に優れていることがわかった。
　分画f～m、tおよびuに含まれる細胞を1000 cells/wellで播種した場合における、培養28日目のFACS Ariaによるソーティングにより得られた細胞分画p～sの細胞数を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示す培養28日目のFACSによる解析により、各マーカー陽性細胞由来の細胞を用いた場合、各マーカー陰性細胞由来の細胞を用いた場合に比して、(a) CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞、あるいは(b) CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陰性細胞を高い収率で調製可能であることが示された。
　これらの結果から、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD90、CD143、CD200、CD218aまたはCD263を発現する細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD8ポジティブ細胞（例：CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
実施例３（Ff-I01s04株を用いた検討）
　造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（Ff-I01s04株）を実施例１に記載された方法に供して得られた浮遊細胞集団を用いた。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、サンプル群ごとに以下の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記各サンプル群から取得した細胞分画を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　上表において、分画Aｃ～Pｃは各々以下を示す。
　分画Aｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性
　分画Bｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD7陽性
　分画Cｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD144陽性
　分画Dｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD56陽性
　分画Eｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD226陽性
　分画Fｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD262陽性
　分画Gｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD325陽性
　分画Hｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD49f陽性
　分画Iｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD51陽性
　分画Jｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD102陽性
　分画Kｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD42b陽性
　分画Lｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD61陽性
　分画Mｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62P陽性
　分画Nｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD69陽性
　分画Oｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD102陽性
　分画Pｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD156c陽性
　上記分画Aｃ～Pcに含まれる細胞を、実施例１に記載された方法に供してリンパ球系細胞へ分化させた。培養開始21日目にすべての細胞を回収し、血球板を用いて細胞数を数えた後、以下の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記ソーティングにより取得した細胞分画を以下に示す。
　分画Qｃ：リンパ球分画
　分画Rｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
　分画Sｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
　分画Tｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
　分画Aｃ～Pc由来の各サンプルにおける培養開始21日目の細胞数（分画Aｃ由来のサンプルにおける細胞数との比率）を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１４より、分画Aｃ由来のサンプルに含まれる細胞集団に比べて、分画Bｃ（CD7陽性）、分画Cｃ(CD144陽性)、分画Dｃ（CD56陽性）、分画Eｃ（CD226陽性）、分画Fｃ（CD262陽性）および分画Gｃ (CD325陽性) 由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に優れていることがわかった。また、分画Hｃ（CD49f陽性）、分画Iｃ (CD51陽性)、分画Kｃ（CD42b陽性）、分画Lｃ（CD61陽性）、分画Mｃ (CD62P陽性)、分画Nｃ (CD69陽性) および分画Pc (CD156c陽性) 由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に劣っていることがわかった。
　培養21日目のFACS Ariaによるソーティングにより得られた細胞分画Qc～Tcの細胞数（分画Aｃ由来のサンプルにおける細胞分画Qc～Tcの細胞数との比率）を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　この結果、分画Bｃ、分画Cｃ、分画Dｃ、分画Eｃ、分画Fｃ、または分画Gｃ由来の細胞を用いることにより、分画Aｃ由来の細胞を用いた場合に比して、CD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陽性細胞、あるいはCD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陰性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。また、分画Hｃ、分画Iｃ、分画Jｃ、分画Kｃ、分画Lｃ、分画Mｃ、分画Nｃ、分画Oｃ、または分画Pｃ由来の細胞を用いることにより、分画Aｃ由来の細胞を用いた場合に比して、CD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陽性細胞、あるいはCD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陰性細胞を低い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。すなわち、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、及びCD325のいずれか１種以上を発現する細胞、あるいはCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cのいずれか１種以上を発現しない細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（またはCD8シングルポジティブ細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
　本出願は、日本国で出願された特願２０１７－０８７７２３（出願日：２０１７年４月２６日）を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は本明細書に全て包含される。
　本発明により、未成熟T細胞や成熟T細胞をより多く及び／又はより高い濃度で得ることができ、このようにして得られた細胞は、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の予防又は治療に有用である。

Claims (19)

  1. 　以下の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法。
    工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程、並びに
    工程２：工程1により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化させる工程
  2. 　前記工程１において選択される細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記工程１に示される第１の群が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる群である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記工程１に示される第２の群が、CD49f、CD51及びCD102からなる群である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記工程１の造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれかの方法により得られたCD4/CD8 ダブルポジティブ細胞をCD8 シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む、CD8 シングルポジティブ細胞の製造方法。
  10. 　前記CD8 シングルポジティブ細胞が細胞傷害性T細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 　造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離して得られる細胞集団。
  12. 　分離された細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、請求項１１に記載の細胞集団。
  13. 　前記造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、請求項１１又は１２に記載の細胞集団。
  14. 　前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１３に記載の細胞集団。
  15. 　CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が40％以上である細胞集団。
  16. 　前記割合が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞の割合である、請求項１５に記載の細胞集団。
  17. 　前記割合が、CD49f、CD51及びCD102からなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合である、請求項１５に記載の細胞集団。
  18. 　CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる群より選択される１種以上の分子の各々に対する抗体を含んでなる、造血前駆細胞の分離用試薬。
  19. 　さらにCD235a、CD14、CD45、CD34及び/又はCD43に対する抗体を１種以上含んでなる、請求項１８に記載の試薬。
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