WO2018174005A1 - 医薬 - Google Patents

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WO2018174005A1
WO2018174005A1 PCT/JP2018/010791 JP2018010791W WO2018174005A1 WO 2018174005 A1 WO2018174005 A1 WO 2018174005A1 JP 2018010791 W JP2018010791 W JP 2018010791W WO 2018174005 A1 WO2018174005 A1 WO 2018174005A1
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WO
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antibody
bnc
protein
lipid bilayer
molecule
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PCT/JP2018/010791
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English (en)
French (fr)
Inventor
黒田　俊一
益巳 飯嶋
健司 立松
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • the present invention relates to medicine.
  • the present invention relates to antibody drugs.
  • a screening technique necessary for obtaining a monoclonal antibody molecule as an active ingredient of an antibody drug has advanced, and an antibody molecule having high affinity for a specific antigen has been obtained.
  • a technique for applying a specific mutation to the Fc region present in the constant region of immunoglobulin has also been developed. .
  • the S298A-E333A-K334A mutant has a weaker binding force to Fc ⁇ RIIB (inhibitory Fc ⁇ ) and stronger binding force to Fc ⁇ RIII than before the introduction of these mutations. It is disclosed in Document 1.
  • both the S239D-I332E mutant and the S239D-I332E-A330L mutant have a very strong binding force to Fc ⁇ RIII compared to those before the introduction of the mutation, resulting in ADCC activity as a result.
  • the fact that abilities increase is shown.
  • the S239D-I332E-A330L mutant tends to lose its CDC activation ability as compared to those before the introduction of the mutation.
  • the CDC activation ability of the S267E-H268F-S324T mutant is increased by about 6.9 times compared to those before the introduction of the mutation, the ADCC activation ability is drastically reduced to about 0.045 times, and S267E- Non-patent document 5 discloses that the CDC activation ability of the H268F-S324T-G236A-I332E mutant is about 23 times higher than before the introduction of these mutations, and ADCC is about 1.2 times slightly increased. Has been.
  • Patent Document 1 discloses an invention in which a complex obtained by modifying a hepatitis B virus surface antigen and carrying an antibody molecule thereon can be used as a DDS preparation.
  • a DDS formulation is one of the dosage forms of a pharmaceutical composition developed for the purpose of reaching a necessary amount in a body for a necessary amount of time.
  • Patent Document 2 discloses an invention in which a complex in which a hepatitis B virus surface antigen is modified and an antibody molecule is supported thereon functions as a sensitive immunosensor.
  • Patent Document 3 discloses the invention of a vaccine using the DDS application described in Patent Document 1 described above.
  • the above-mentioned specific mutation is applied to enhance the function exhibited by the antibody molecule.
  • the function that the antibody molecule itself that is an active ingredient of a medicine should exhibit is not preferable because it may be changed or attenuated unintentionally.
  • the present invention aims to obtain an excellent antibody drug while using the antibody molecule itself contained in the existing antibody drug as an active ingredient without any change.
  • the inventors of the present application have made extensive studies, and as a result, the antibody molecule contained as an active ingredient of an existing antibody drug can be used as it is as a component of a predetermined complex. We have found that the functions of antibody molecules are enhanced.
  • the inventors of the present application exert an antibody molecule that binds to such an antibody binding domain by using a liposome containing a lipid bilayer in which a transmembrane protein provided with an antibody binding domain is disposed. It was clarified that the function is enhanced more than the function exhibited by the antibody molecule alone.
  • An antibody drug containing an antibody-carrying liposome wherein the antibody-carrying liposome comprises (1) one lipid bilayer, (2) one or more transmembrane proteins, and (3) two or more Contains antibody molecules, The transmembrane protein penetrates the lipid bilayer, wherein one or more antibody binding domains are provided outside the lipid bilayer, and the antibody molecules each bind to the antibody binding domain; An antibody drug wherein the function exhibited by the antibody molecule is enhanced compared to the function exhibited by an equimolar amount of the antibody molecule.
  • the viral coat protein is hepatitis B virus coat protein, hepatitis C virus coat protein, Sendai virus coat protein, human immunodeficiency virus coat protein, herpes simplex virus coat protein, varicella-zoster virus coat protein, Item 5.
  • the antibody drug according to Item 4 which is at least one virus coat protein selected from the group consisting of influenza virus coat proteins.
  • the sugar chain is a sugar chain in which at least one kind of carbon sugar selected from the group consisting of galactose, N-acetylglucosamine, mannose, fucose and sialic acid is glycosidically bonded.
  • the reconstructed immunoglobulin or fragment thereof is at least one selected from scFv, diabody, triabody, tetrabody, minibody, scFv-Fc, VHH, and a multivalent antibody.
  • [Section 13] (1) one lipid bilayer, (2) one or more transmembrane proteins, and (3) two or more antibody molecules, The antibody-carrying liposome, wherein the transmembrane protein penetrates the lipid bilayer membrane, one or more antibody binding domains are provided outside the lipid bilayer membrane, and the antibody molecule binds to the antibody binding domain, respectively Including the step of using A method for enhancing the function exhibited by the antibody molecule as compared with the function exhibited by an equimolar amount of the antibody molecule.
  • [Section 14] A method for producing an antibody drug comprising an antibody molecule with enhanced function as an active ingredient, A step of binding a liposome containing one lipid bilayer arranging a transmembrane protein provided with one or more antibody-binding domains, and two or more antibody molecules; Part or all of the antibody binding domain is disposed on the outer surface of the lipid bilayer; Production method.
  • the antibody drug of the present invention containing an antibody molecule has an effect that the function exhibited by the antibody molecule as an active ingredient is increased compared to the function exhibited when the antibody drug is used in a state where the antibody drug is not contained in the antibody drug of the present invention.
  • the function exhibited by the antibody molecule contained in the antibody drug according to the present invention exerts an effect of enhancing compared to the function exhibited by an equimolar amount of the antibody molecule contained in the antibody drug. .
  • Such an antibody drug according to the present invention can be expected to exert a desired therapeutic effect with a small dose.
  • Example 2 is a graph showing the results of in vitro experiments confirming the effects of the antibody drug of the present invention shown in Example 1.
  • the rhombus marks in the graph indicate the results when Herceptin is used, the triangle marks indicate ZZ-BNC-Herceptin, the cross marks indicate cadsila, and the circle marks indicate results when ZZ-BNC-cadsila is used.
  • the vertical axis in the graph represents the cell viability (%).
  • the horizontal axis in the graph indicates the concentration (nM) calculated for the antibody portion of the sample used.
  • 5 is a graph showing the results of in vivo experiments confirming the effects of the antibody drug of the present invention shown in Example 2.
  • the square marks in the graph indicate the results when ZZ-BNC is used, the diamond marks indicate Herceptin, the triangle marks indicate ZZ-BNC-Herceptin, the cross marks indicate cadsila, and the circle marks indicate results when ZZ-BNC-cadsila is used.
  • the schematic diagram for demonstrating the antibody pharmaceutical of this invention. (A) in a figure is a figure explaining the antibody pharmaceutical of this invention based on ZZ-BNC (equivalent to the antibody carrying
  • FIG. 1 (B) in the figure is a diagram for explaining an antibody drug of the present invention based on LL-BNC (corresponding to an antibody-supported liposome before binding of two or more antibody molecules of the present invention).
  • (C) in the figure is a diagram for explaining the antibody drug of the present invention based on GL-BNC or LG-BNC (corresponding to an antibody-loaded liposome before binding of two or more antibody molecules of the present invention).
  • FIG. 1 shows the in-vitro experiment result (cytotoxic activity by VEGF depletion in a VEGF receptor 2-dependent cell) which confirms the effect by the antibody pharmaceutical of this invention shown in Example 3.
  • the diamond marks in the graph indicate the results when Avastin is used, and the triangle marks in the graph indicate the results when ZZ-BNC-Avastin is used.
  • FIG. The triangle mark in the graph shows the result when ZZ-BNC is used, the square mark in the graph shows Avastin, and the diamond mark in the graph shows the result when ZZ-BNC-Avastin is used.
  • the graph which shows the in-vitro experiment result cytotoxic activity by the VEGF receptor 2 antagonist in a VEGF receptor 2 dependent cell which confirms the effect by the antibody pharmaceutical of this invention shown in Example 5.
  • the rhombus marks in the graph indicate the results when using a syllamza
  • the triangle marks in the graph indicate the results when using a ZZ-BNC-Sylamza.
  • FIG. The triangle mark in the graph indicates the result when ZZ-BNC is used
  • the square mark indicates the result of using SYRAMA
  • the diamond mark in the graph indicates the result when ZZ-BNC-SYRAMAZ is used.
  • the graph which shows the invitro experiment result (ADCC activity by activation of Fc (gamma) receptor IIIa) which confirms the effect by the antibody pharmaceutical of this invention shown in Example 7.
  • the diamond marks in the graph indicate the results when Rituxan is used, and the triangle marks in the graph indicate the results when ZZ-BNC-Rituxan is used.
  • the graph which shows the in-vitro experiment result cytotoxic activity by TCR activation induced by PD-1 / PD-L1 binding suppression) which confirms the effect by the antibody pharmaceutical of this invention shown in Example 8.
  • FIG. The diamond marks in the graph indicate the results when using Opdivo
  • the triangle marks in the graph indicate the results when using ZZ-BNC-Opivo.
  • the antibody drug of the present invention contains an antibody-loaded liposome, which comprises (1) one lipid bilayer, (2) one or more transmembrane proteins, and (3) two or more Contains antibody molecules,
  • the transmembrane protein penetrates the lipid bilayer, wherein one or more antibody binding domains are provided outside the lipid bilayer, and the antibody molecules each bind to the antibody binding domain;
  • it is an antibody drug in which the function exhibited by the antibody molecule is enhanced compared to the function exhibited by an equimolar amount of the antibody molecule.
  • the antibody-supported liposome which is a component of the antibody drug of the present invention, contains (1) one lipid bilayer membrane, (2) one or more transmembrane proteins, and (3) two or more antibody molecules.
  • the lipid bilayer is a main component constituting the shape of the antibody-supporting liposome, and the shape is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited. For example, a spherical shape, an elliptical shape, a semicircular shape, and the like can be given.
  • the above-mentioned transmembrane protein penetrates the lipid bilayer contained in the above antibody-supporting liposome. That is, in the antibody drug of the present invention, it can be said that the transmembrane protein is arranged in a lipid bilayer membrane contained in the antibody-supported liposome.
  • the term “penetration” is not necessarily limited to the mode in which the transmembrane protein penetrates the lipid bilayer membrane, but the mode in which the transmembrane protein projects outside the lipid bilayer membrane may be used. Good.
  • the liposome formed by the lipid bilayer membrane contained in the antibody-supporting liposome that is a component of the present invention has a shape including a closed space
  • the above-mentioned transmembrane protein is located outside the lipid bilayer membrane.
  • the protruding aspect can be said to be an aspect in which the transmembrane protein protrudes outside the antibody-supporting liposome.
  • the function exerted by the antibody molecule enhanced by being contained in the antibody drug of the present invention is a function that the antibody molecule originally has and is a function within a range that exhibits a desired pharmacological effect.
  • a desired pharmacological effect There is no particular limitation. Specific examples include antigen binding activity, cytotoxic activity (for example, ADCC activity or CDC activity), ADCP activity, and the like.
  • the above-described antigen-binding activity is understood by those skilled in the art as the binding force (also referred to as affinity) between an antibody molecule and an antigen molecule.
  • the degree of enhancement of the binding force can be confirmed using the binding constant between the antibody molecule and the antigen molecule as an index.
  • a known method can be adopted as a method for measuring the coupling constant.
  • the above-mentioned antigen-binding activity of the antibody drug according to the present invention is measured as an affinity showing a one-to-one binding ability between the antigen molecule and the antibody molecule because the antibody drug of the present invention has a plurality of antibody molecules. It is not preferable to do this, and it is preferable to measure as avidity.
  • the cytotoxic activity described above may be any activity that has toxicity to the target cell, and specifically includes the effect of causing the cell to die.
  • Such cytotoxic activity measurement methods are described in Wang C et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep; 2 (9): 846-56., Lewis Phillips GD et al., Cancer Res. 2008 Nov 15; 68 (22): 9280 -90., Reff ME et al. Blood. 1994 Jan 15; 83 (2): 435-45., Zhang N et al. Exp Ther Med. 2014 Dec; 8 (6): 1723-1726., Pietras RJ et al. Oncogene Methods described in known literatures such as “1998 1998 Oct 29”, 17 (17): 2235-49.
  • ADCC activity which is one of the above cytotoxic activities, is also called antibody-dependent cytotoxic activity.
  • This activity is caused by the fact that antibody molecules recruit effector cells such as macrophages, NK cells, neutrophils, or eosinophils in the vicinity, and recruit the cells or in vivo molecules that are in the vicinity of the antibody molecule. It will be understood by those skilled in the art that it is an activity that causes damage through a modified effector cell.
  • a known method can be adopted. Specifically, it can be measured by appropriately modifying a method described in a known literature such as Cancer Sci
  • ADCC® Reporter® Bioassay® Promega.
  • cell damage caused by mixing leukocyte fraction of blood with target cells is quantified into measurement of LDH leakage, cell survival activity using WST-8, etc. Can also be measured.
  • CDC activity which is one of the cytotoxic activities described above, is also called complement-dependent cytotoxic activity.
  • This activity is considered to be an activity in which an antibody molecule recruits complement in the vicinity thereof and damages cells or in vivo molecules existing in the vicinity of the antibody molecule through the recruited complement. It is understood by the contractor.
  • As a method for measuring the degree of CDC activity a known method can be employed. Specifically, it can be measured by appropriately modifying a known method described in the above-mentioned literature or the like in the measurement of ADCC activity. Specifically, it can be measured by adding serum to cells and measuring the degree of cell damage due to complement in the serum.
  • ADCP activity which is one of the above cytotoxic activities, is also called antibody-dependent cell phagocytic activity.
  • ADCP activity is also called antibody-dependent cell phagocytic activity.
  • this activity is an activity in which an antibody molecule recruits macrophages or the like in the vicinity thereof, and exerts a phagocytosis effect of the recruited macrophages or the like on cells or in vivo molecules present in the vicinity of the antibody molecules.
  • a known method can be employed as Specifically, it can be measured by appropriately modifying a method described in known literature such as Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol. 111, No. 4, 391-396, and 2011 by Nagashima H et al.
  • phagocytic target cells are labeled with PE by phagocytic cells labeled with fluorescent dye PE (THP-1) and target cells labeled with fluorescent dye calcein (Ramos) after FACS analysis. It discloses that ACDP activity is evaluated by the ratio of the number of target cells phagocytosed by using as an index the double positive of calcein.
  • Fc ⁇ RIIa-H ADCP Reporter Bioassay Promega. More specifically, a polymorphism having a binding sequence of a transcription factor NFAT that stably expresses Fc ⁇ RIIa-H as an effector cell and is activated by Fc-binding Fc ⁇ RIIa, and a base sequence to which a luciferase reporter gene is bound downstream. Cells in which nucleotides are integrated into the genome are used. When Fc ⁇ RIIa of the effector cell recognizes an antibody molecule bound to the target cell, luciferase is expressed. ADCP activity can be quantified by measuring the activity of this luciferase.
  • a preferable function exhibited by an antibody molecule that is enhanced by being contained in the antibody drug of the present invention described above is cytotoxic activity.
  • Specific methods for confirming that various functions exhibited by the antibody molecule contained in the antibody drug of the present invention described above are enhanced include, for example, the antibody drug of the present invention and the antibody drug of the present invention.
  • the same antibody molecule as the above-mentioned antibody molecule can be subjected to the above-described various measurement methods and the like in the same molar amount, and the functions of both antibody molecules can be compared.
  • the above-mentioned various functions originally possessed by an antibody molecule include, for example, the degree of decrease in the survival activity against cells expressing antigen molecules that specifically bind to a certain antibody molecule, or such cells It can also be confirmed based on the degree of decrease in the volume of tissue to be performed. Specifically, in the examples described later, typical examples of various functions of the antibody molecule contained in the antibody drug of the present invention are increased (decreased cell survival activity and tissue volume described above). ing.
  • the transmembrane protein contained in the antibody drug of the present invention is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • Specific examples include envelope virus envelope proteins.
  • the envelope-type viral coat protein means a protein constituting an envelope among the viral coat proteins. These enveloped virus coat proteins can be used as envelope virus coat proteins of the above-described antibody drug of the present invention in combination of one or more.
  • the envelope-type virus coat protein described above is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • hepatitis B virus coat protein, hepatitis C virus coat protein, Sendai virus coat protein, human immunodeficiency virus coat protein, herpes simplex virus coat protein, chickenpox / zoster virus coat protein, or influenza virus coat protein be able to.
  • enveloped viral coat protein derived from hepatitis B virus (HBV) coat protein examples include hepatitis B virus surface antigen (HBsAg).
  • HBV hepatitis B virus
  • HBsAg hepatitis B virus surface antigen
  • these proteins can be employed as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • envelope-type virus coat protein derived from hepatitis C virus (HCV) coat protein examples include glycoprotein E1 protein and E2 protein. These proteins can be used as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • envelope-type virus coat protein derived from Sendai virus (SeV) coat protein include F protein and HN protein which are glycoproteins. These proteins can be used as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • envelope-type virus coat protein derived from human immunodeficiency virus (HIV) coat protein examples include glycoprotein GP160 protein, GP120 protein, or GP41 protein. These proteins can be used as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • envelope-type virus coat protein derived from herpes simplex virus (HSV) coat protein examples include gB protein, gC protein, gD protein, gH protein, and gL protein, which are glycoproteins. These proteins can be used as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • HSV herpes simplex virus
  • envelope-type virus coat protein derived from varicella-zoster virus (VZV) coat protein specifically, glycoprotein gB protein, gC protein, gE protein, gH protein, gI protein, gK protein, or Examples include gL protein. These proteins can be used as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • VZV varicella-zoster virus
  • envelope-type virus coat proteins derived from influenza virus coat proteins include glycoproteins such as M1 protein, M2 protein, hemagglutinin, and neuraminidase. These proteins can be used as a transmembrane protein contained in the above-described antibody drug of the present invention by combining one or a plurality thereof.
  • hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) is preferable.
  • transmembrane protein may be subjected to various mutations typified by substitution, insertion, and / or deletion within a range that does not attenuate the effect of enhancing the function of the antibody molecule in the antibody drug of the present invention. it can. Further, mutations that do not exhibit transmembrane ability are not preferred.
  • Such a mutation preferably has an amino acid sequence homology of 80% or more before and after the mutation, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98. % Or more, more preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • the antibody binding domain provided in the transmembrane protein in the lipid bilayer membrane contained in the antibody drug of the present invention described above is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • a domain that binds to Fc, Fab, sugar chain, J chain, or the like of an immunoglobulin can be exemplified.
  • the binding of antibody molecules described below to these antibody binding domains is preferably specific binding.
  • the antibody binding domain described above is provided in a transmembrane protein arranged in the lipid bilayer of the antibody drug of the present invention.
  • the number of antibody binding domains provided in the above-mentioned transmembrane protein is one or more.
  • the embodiment of the antibody binding domain thus provided can be an embodiment in which part or all of the antibody binding domain is disposed outside the liposome described above. Since an antibody binding domain is composed of a plurality of amino acid residues as described later, the above-mentioned part does not mean the whole of one antibody binding domain, but a single antibody binding domain. Is a part of For example, when the antibody binding domain is composed of 8 amino acid residues, an embodiment in which only 4 amino acid residues are provided outside the lipid bilayer membrane can be exemplified.
  • Immunoglobulin Fc is a site contained in a constant region with relatively little change in an antibody molecule.
  • a site called a CH2-CH3 region excluding the F (ab) ′ region from its structure. Will be understood by those skilled in the art to correspond to Fc.
  • Protein A is a protein that has a tendency not to bind to human-derived IgD (hereinafter sometimes referred to as “h”) but is found to bind to isotype IgG derived from various animals. Will be understood by those skilled in the art.
  • IgG in the case of IgG, it binds with high specificity to hIgG 1 , hIgG 2 , hIgG 4 , mouse-derived (hereinafter sometimes referred to as “m”) IgG 2a , mIgG 2b , or mIgG 3.
  • m mouse-derived
  • Z domain including E, D, A, B, and C domains possessed by such protein A can be mentioned as an antibody binding domain that binds to Fc described above.
  • the specific amino acid sequence of the Z domain is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • the antibody drug of the present invention adopting a Z domain as the above-mentioned antibody binding domain includes, for example, a lipid bilayer membrane (liposome) in which a transmembrane protein provided with a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is arranged. And can be obtained by binding two or more desired antibody molecules thereto.
  • a transmembrane protein is provided in such a manner that two Z domains described above are arranged in tandem.
  • the above-mentioned antibody drug having a Z domain can be easily obtained by biosynthesis in which a host cell is transformed with a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and cultured. .
  • the liposome having the antibody-supporting liposome, which is a component of the antibody drug of the present invention obtained by this, before supporting the antibody molecule may be referred to as “ZZ-BNC” in the present specification.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is a mutation typified by substitution, insertion, and / or deletion within a range that does not attenuate the effect of enhancing the function of the antibody molecule contained in the antibody drug of the present invention. Can be applied. Moreover, neither a mutation that attenuates transmembrane ability nor a mutation that attenuates antibody binding ability is preferred. Such a mutation preferably has an amino acid sequence homology of 80% or more before and after the mutation, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98. % Or more, more preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • protein G derived from streptococci and the like.
  • This protein G is a protein that is found to bind to isotype IgG derived from various animals, although it tends to not bind to IgD, as with protein A described above.
  • IgG binds to hIgG 1 , hIgG 2 , hIgG 3 , hIgG 4 , mIgG 2a , mIgG 2b , or mIgG 3 with high specificity.
  • Such C1, D1, C2, D2, or C3 domain of such protein G can be mentioned as an antibody binding domain that binds to Fc described above.
  • the C2 domain is preferable.
  • the specific amino acid sequence of the C2 domain is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • An example is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Immunoglobulin Fab includes the variable region (Fv) of an antibody molecule and corresponds to a part that plays an important role in determining the antigen of an antibody molecule.
  • protein L derived from Peptostreptococcus magnus can be mentioned. It is understood by those skilled in the art that this protein L binds to Fab of an antibody molecule, and more specifically, binds to kappa light chain, and thus binds to almost all isotype immunoglobulins.
  • the B1, B2, B3, B4, or B5 domain of such protein L can be cited as an antibody binding domain that binds to the Fab of the antibody molecule described above.
  • the B1 domain is preferred.
  • the specific amino acid sequence of the B1 domain is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 can be mentioned.
  • the antibody drug of the present invention adopting the L domain as the antibody binding domain described above, for example, produces a lipid bilayer membrane (liposome) in which a penetrating protein provided with a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is arranged. This can be obtained by binding two or more desired antibody molecules thereto.
  • a transmembrane protein is provided in such a manner that two L domains described above are arranged in tandem.
  • the above-mentioned antibody drug having the L domain can be easily obtained by biosynthesis in which a host cell is transformed with a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and cultured. .
  • Such a production method can be specifically performed according to the description in Patent Documents 1 to 3, and the antibody-supported liposome, which is a component of the obtained antibody drug of the present invention, before the antibody molecule is supported. Liposomes are sometimes referred to herein as “LL-BNC”.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is also substituted, inserted, and / or inserted within the range in which the effect of enhancing the function of the antibody molecule in the antibody drug of the present invention is not attenuated, similar to ZZ-BNC described above. Or various mutations represented by deletion etc. can be given.
  • Such a mutation preferably has an amino acid sequence homology of 80% or more before and after the mutation, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98. % Or more, more preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • a C2 domain (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) contained in protein G, which is a typical example of an antibody binding domain that binds to Fc of the above antibody molecule, and an antibody binding domain that binds to the Fab of the above antibody molecule
  • LG-BNC (SEQ ID NO: 6) and GL-BNC having an amino acid sequence in a form arranged in tandem with the B1 domain (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3) contained in protein L, which is a typical example of (SEQ ID NO: 7) can also be mentioned as a typical example of the liposome of the aspect before carrying the antibody molecule of the antibody-carrying liposome which is a component of the antibody drug of the present invention.
  • Both the above-mentioned LG-BNC and GL-BNC can be obtained in the same manner as the above-described ZZ-BNC or LL-BNC.
  • amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6 and 7 are also represented by substitution, insertion, and / or deletion, etc. within a range that does not attenuate the effect of enhancing the function of the antibody molecule in the antibody drug of the present invention. Various mutations can be made.
  • Such a mutation preferably has an amino acid sequence homology of 80% or more before and after the mutation, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98. % Or more, more preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • the sugar chain described above is not particularly limited as long as it is a sugar chain contained in an antibody molecule that binds to an antibody binding domain described later.
  • Such a sugar chain is preferably an N-type sugar chain that binds to aspartic acid (Asn) in the antibody molecule.
  • sugar chains include N-type sugar chains in which monosaccharides represented by galactose, N-acetylglucosamine, mannose, fucose, sialic acid and the like are glycosidically bonded to each other.
  • the number of monosaccharides linked to glycosides in the sugar chain is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited. Specifically, it can be 5 or more.
  • the upper limit value of the number is not limited, and may be 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15.
  • glycoside bond described above is not particularly limited as long as it is within the range in which the effect of the present invention is exhibited. Specific examples include a 1-2 bond, a 1-3 bond, a 1-4 bond, a 1-5 bond, and a 1-6 bond. Further, it may be an ⁇ bond or a ⁇ bond.
  • sugar chains include N-type sugar chains as shown in the following table.
  • sugar chains shown in the schematic diagram of Table 1 sugar chains shown in any of 16 types that do not contain two sialic acids (() are preferably exemplified as sugar chains present in human IgG.
  • the above-mentioned J chain is not particularly limited as long as it is a protein that binds to an antibody molecule within the range in which the effects of the present invention are exhibited.
  • strand which IgA or IgM has can be illustrated.
  • the amino acid sequence of such a J chain is not particularly limited as long as it is within the range where the effects of the present invention are exhibited.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • NIH National Institutes of Health
  • the antibody molecule contained in the antibody-supporting liposome which is a component of the antibody drug of the present invention described above, is particularly an antibody molecule that is used as an active ingredient of an antibody drug within the range that exhibits the effects of the present invention. It is not limited. Specific examples of such antibody molecules include immunoglobulins, fragments thereof, and reconstructs thereof.
  • the isotype of the above immunoglobulin is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • Specific examples include isotypes such as IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, IgW, IgX, IgY, or IgNAR.
  • IgM, IgD, IgG, IgA, or IgE which are immunoglobulins originally possessed by mammals, are preferred, and IgG is particularly preferred as the immunoglobulin isotype described above.
  • the IgG subclass described above is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention. Specific examples include IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgG 2a , IgG 2b , and IgG 2c .
  • the IgA subclass described above is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited. Specific examples include IgA1 and IgA2.
  • the immunoglobulin fragment described above is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • Specific examples include F (ab ′) 2 , Fab, Fc, Fv, sugar chain, J chain derived from IgA, J chain derived from IgM, and the like.
  • the Fab described above is a molecule in which a VH-CH1 region derived from the heavy chain of IgG and a VL-CL derived from the light chain are disulfide bonded, and can be obtained by digesting IgG with papain. Those skilled in the art will understand that this is a possible molecule.
  • the above-mentioned F (ab ′) 2 is specifically a molecule in which the above-mentioned two molecules of Fab are disulfide-bonded by a hinge region and a cysteine residue contained therein, and are obtained by digesting IgG with pepsin. Those skilled in the art will understand that this is a molecule that can.
  • the Fc, Fab, sugar chain, and J chain exemplified as typical examples of the antibody molecule contained in the antibody-supporting liposome, which is a component of the antibody drug of the present invention described above, are the components of the antibody drug of the present invention described above. It can be made to be the same as that explained as the binding target of the antibody binding domain arranged in the transmembrane protein present in the lipid bilayer membrane contained in the antibody-supported liposome.
  • the reconstructed immunoglobulin or immunoglobulin fragment described above is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention. Specifically, scFv, diabody, triabody, tetrabody, minibody, scFv-Fc, VHH, or multivalent antibody can be exemplified.
  • the scFv described above is specifically understood by those skilled in the art as a molecule having a structure in which the heavy chain variable region (VH) and the light chain variable region (VL) of IgG are bound via a linker.
  • Such scFv can include the following four embodiments as the bond between the VH and VL via the linker described above, but it goes without saying that the embodiment is not limited to any of these embodiments.
  • the above-mentioned diabody refers to a person skilled in the art that the above-mentioned two molecules of scFv are molecules having a structure in which they are non-covalently associated with each other via VH and VL contained therein. Understood.
  • triabody specifically refers to a person skilled in the art that the above-described three molecules of scFv have a structure in which they are non-covalently associated with each other via VH and VL contained therein. Understood.
  • the tetrabodies described above are molecules having a structure in which the above-mentioned four molecules of scFv are non-covalently and planarly associated with each other via VH and VL contained therein. It will be understood by those skilled in the art.
  • the above-mentioned minibody refers to two molecules formed by binding the CH3 domain contained in the Fc domain of IgG to the end of the above scFv in a non-covalent manner via the CH3 domains.
  • the molecule has an associated structure.
  • the scFv-Fc described above specifically refers to the structure of the minibody described above, in which two molecules having the hinge part at the end of the scFv and the CH2 domain and CH3 domain contained in the Fc domain of IgG bound to each other. It is understood by those skilled in the art that the molecule has a structure obtained by non-covalent association via the CH3 domains described in 1) and a disulfide bond via the hinge portion.
  • the VHH described above is specifically a molecule that has the ability to bind to a target antigen with a low dissociation constant present in the blood of camelids, and has a structure consisting of only a heavy chain as compared with IgG. It will be understood by those skilled in the art as a protein of about 13 kDa.
  • the multivalent antibody described above is not particularly limited as long as it is an antibody molecule that has the effect of the present invention and has one or more antigen-binding sites.
  • tetrabodies, minibodies, scFv-Fc, or immunoglobulins such as IgG, IgA and IgM, tetravalent IgG and the like can be mentioned.
  • bispecific antibodies are also encompassed by the multivalent antibodies listed as typical examples of immunoglobulins or immunoglobulin fragment reconstructs of the present invention.
  • antibody molecules contained in the antibody drug of the present invention include immunotoxin, Affibody (registered trademark), Nanobody (registered trademark), Unibody, and the like.
  • Immunotoxin is also called an antibody-drug conjugate (ADC) and is understood by those skilled in the art as a molecule in which a molecule that exerts a cytotoxic effect is supported on the antibody molecule described above.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the molecule exhibiting the cytotoxic action is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • emtansine DM1
  • ozogamicin calicheamicins
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • MMAF monomethyl auristatin F
  • PPD pyrrolobenzodiazepine
  • duocarmycins amanitin (AAMT)
  • AAMT adzelsin
  • bizelsin carzelsin (U-80244)
  • PNU159682 nemorubicins
  • Affibody is a registered trademark.
  • An Affibody is a protein molecule that has a structure in which three helix domains are bound using a specific domain of Protein A as a scaffold, and has a function of binding to a target protein (antigen) with a low dissociation constant. To be understood. Reference may also be made to US Pat. No. 5,831,012, which is described in more detail.
  • Nanobody is a trademark of Ablynx. Nanobodies are structures mimicking VHH described above as typical examples of antibody molecules that bind to antibody binding domains provided in transmembrane proteins arranged in lipid bilayer membranes contained in the antibody drug of the present invention. Those skilled in the art will understand that the molecule has an antigen-binding function. Reference can also be made to WO2004 / 041867, which is described in more detail.
  • Unibody is a registered trademark. Unibody is well known in the art and refers to an antibody fragment that lacks the hinge region of an IgG4 antibody. Such a deletion of the hinge region can be explained as a molecule that is essentially half the size of a conventional IgG4 antibody and has a monovalent binding region instead of the bivalent binding region of IgG4 antibody. For more details, the description of WO2007 / 059782 can also be referred to.
  • antibody molecules contained in the antibody drug of the present invention can be used singly or in combination.
  • the antibody drug of the present invention comprises a liposome having a lipid bilayer membrane having a transmembrane protein in which the above-described antibody binding domain is arranged (typically, the above-mentioned ZZ-BNC, LL-BNC, LG- BNC, GL-BNC, etc.) and the above antibody molecule can be brought into contact.
  • the mode of binding of the antibody molecules described above in the antibody-supported liposome, which is a component of the antibody drug of the present invention thus obtained, is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the above antibody molecules are aligned and arranged on the outer surface of a lipid bilayer membrane (liposome) contained in the above antibody-supporting liposome via an antibody binding domain provided on a transmembrane protein of the membrane. It is preferable that they are combined in the same manner.
  • the aligned arrangement can include a state in which the orientation of antibody molecules is uniform.
  • the antibody molecule that binds to the antibody binding domain disposed outside the lipid bilayer membrane (liposome) contained in the antibody drug of the present invention is an antibody molecule having Fc and Fv
  • the Fc is the lipid A state in which Fv is uniformly oriented on the outside of the lipid bilayer membrane (liposome) is bound to an antibody binding domain arranged in a transmembrane protein in the bilayer membrane.
  • ZZ-BNC which is a liposome of the embodiment of the antibody-supporting liposome that is a component of the antibody drug of the present invention, before the antibody is loaded, is shown in the schematic diagram of FIG. It can be exemplified that the structure shows a state in which Fv of antibody molecules are uniformly oriented on the outside.
  • LL-BNC which is a liposome in the form before antibody loading of the antibody-loaded liposome, which is a constituent of the antibody drug of the present invention, has an antibody molecule outside the liposome as shown in the schematic diagram of FIG. It can be exemplified that the structure shows a state in which Fc is uniformly oriented.
  • LG-BNC and GL-BNC which are the liposomes of the embodiment prior to antibody loading of the antibody-supporting liposome that is a component of the antibody drug of the present invention, are shown in the schematic diagram of FIG.
  • the structure that shows the state in which the Fv of the antibody molecule is uniformly oriented outside the liposome, which is the feature of the LL-BNC, and the structure that shows the state in which the Fc of the antibody molecule is uniformly oriented outside the liposome, which is the feature of the LL-BNC Have both
  • the binding between the antibody binding domain provided in the transmembrane protein arranged in the lipid bilayer membrane contained in the antibody drug of the present invention described above and the antibody molecule described above is strengthened by a crosslinking treatment using a crosslinking agent. Can also be done.
  • Such a crosslinking agent will not be specifically limited if it is a range which exhibits the effect of this invention.
  • DABCO 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane
  • 3- (diphenylphosphino) propionic acid N-succinimidyl and the like used as Staudinger ligation
  • 4-azido- used as a photoreactive crosslinker 2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid
  • BASED bis [2- (4-azidosalicylamido) ethyl] disulfide
  • 4- [3- (trifluoromethyl) -3H-diazilin-3-yl] Benzoic acid 4- [3- (trifluoromethyl) -3H-diazilin-3-yl] benzyl alcohol, 4- [3- (trifluoromethyl) -3H-diazilin-3-yl] benzylamine hydrochloride, 4 -
  • BS3 is preferably used.
  • cross-linking treatment described above can be carried out by employing known conditions according to the cross-linking agent used.
  • the antibody drug of the present invention can be used in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be a known one, and is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the antibody drug of the present invention can be in a suitable dosage form.
  • the active ingredient of the present invention is an antibody molecule, oral administration is not preferred. Therefore, the dosage form of the antibody drug of the present invention is preferably a dosage form that enables parenteral administration such as intravenous administration.
  • the antibody drug of the present invention contains two or more antibody molecules. Therefore, the degree of enhancement of the function originally possessed by an antibody molecule, typically exemplified by antigen binding activity, cytotoxic activity (ADCC activity or CDC activity) or ADCP activity exhibited by the antibody drug of the present invention, is as follows.
  • the synergistic enhancement is expected in addition to the additive enhancement corresponding to the number of antibody molecules contained in the antibody drug of the present invention.
  • the function of the antibody molecule contained therein can be enhanced.
  • the liposome of the embodiment before producing the antibody-supporting liposome which is a constituent of the antibody pharmaceutical of the present invention described above typically, ZZ-BNC mentioned above, LL-BNC, LG-BNC, GL-BNC, etc .; hereinafter, this may be referred to as “pre-supported liposome”
  • pre-supported liposome a predetermined antibody molecule bound to the pre-supported liposome.
  • the former is expected to exhibit a higher effect.
  • ZZ-BNC-Herceptin A complex of ZZ-BNC and Herceptin (registered trademark), which is a typical example of the antibody drug of the present invention, used in Examples 1 and 2 shown below (referred to herein as “ZZ-BNC-Herceptin”)
  • ZZ-BNC-Herceptin a complex of ZZ-BNC and Cadosila (registered trademark) (sometimes referred to herein as “ZZ-BNC-Cadosila”) (1) to (3 ).
  • the above-mentioned ZZ-BNC was produced according to the method described in any of the above-mentioned Patent Documents 1 to 3.
  • Tris-HCl buffer was added to the mixture after the incubation in (2) described above so that the final concentration was 100 ⁇ M, and this was incubated at room temperature for 10 minutes.
  • Example 1 In vitro assay (cytotoxicity: Herceptin cadsira) An in vitro cytotoxicity assay was performed using the antibody drug of the present invention. It can be determined that killing a specific cell with an antibody drug has enhanced the function of the antibody molecule. In this example, an experiment was conducted to confirm the degree of such death based on the IC 50 value based on the amount of a specific sample used as an antibody molecule.
  • SK-BR-3 cells sensitivity to trastuzumab (HER2 positive (3+))
  • MDA-MB-468 cells trastuzumab insensitive (HER2 negative; negative control)
  • the various cells used in the assay described above were conditioned using the medium shown below in an environment containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • MDA-MB-468 cells were acclimated in an environment containing no 5% CO 2 .
  • Each conditioned cell was seeded in a 96-well plate at 1.0 ⁇ 10 4 cells / well.
  • SK-BR-3 cells McCoy's 5a medium + 10% non-immobilized FBS
  • MDA-MB-468 cells Leibovitz's L-15 medium + 10% non-immobilized FBS
  • antibody portion means various antibodies contained in the antibody drug of the present invention, and “antibody portion concentration” refers to a certain solvent (for example, a medium). It means the amount (for example, mass or substance amount) of various antibody molecules contained in the above-mentioned antibody drug of the present invention contained in a unit volume, or the amount of the antibody molecule itself (single).
  • the IC 50 value of Herceptin as an antibody moiety concentration was estimated to or higher than about 10 nM.
  • the IC 50 value of ZZ-BNC-Herceptin was estimated to be about 1 to 2 nM in terms of antibody partial concentration.
  • ZZ-BNC-Herceptin which is a typical example of the antibody drug of the present invention, further enhances the function of the antibody molecule than Herceptin, which is a conventional product.
  • the IC 50 value of cadilla for SK-BR-3 cells was estimated to be about 1 nM as the antibody partial concentration.
  • the IC 50 value of ZZ-BNC-cadsira was estimated to be about 0.1 nM in antibody partial concentration.
  • ZZ-BNC-cadilla which is a typical example of the antibody drug of the present invention, enhances the function of the antibody molecule more than conventional cadilla.
  • Example 2 In vivo assay (antitumor: Herceptin cadsira) An in vivo cytotoxicity assay was performed using the antibody drug of the present invention. As in Example 1 described above, killing a tissue containing specific cells with an antibody drug can be judged to have enhanced the function of the antibody molecule. In this example, the degree of such tissue death was evaluated in an experiment in which the tumor size of a tumor-bearing mouse was confirmed to suppress the effect of administration of the antibody drug of the present invention.
  • KPL-4 cells insensitive to trastuzumab / HER2-positive (3+)
  • DMEM + 5% non-immobilized FBS Six-week-old male nude mice (Japan SLC) were inoculated with 1.0 ⁇ 10 7 cells (100 ⁇ l, containing 50% Matrigel (BD)) of KPL-4 cells after the above culture subcutaneously on the back.
  • BD Matrigel
  • ZZ-BNC-Herceptin and ZZ-BNC-Cadsila which are the antibody drugs of the present invention used in Example 1 described above, and ZZ-BNC, Herceptin, and CadSila as negative controls were used.
  • Tumor size was calculated by (major axis x (minor axis) 2 ) / 2) 150 ⁇ l of the above sample (suspended in 10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 3.4% (w / w) Sucrose) was administered.
  • ZZ-BNC-Herceptin and Herceptin were intraperitoneally administered at an antibody amount of 30 mg / kg once a week for a total of 4 times. Except for the first time, the dose was 15 mg / kg.
  • CADSILLA and ZZ-BNC-CADSILLA were intravenously injected once at an antibody amount of 15 mg / kg. Thereafter, mouse breeding was continued for 126 days, and the tumor size was measured. The results are shown in FIG.
  • Herceptin monotherapy showed a limited growth suppression effect up to about 140 mm 3 tumor size during the administration period (days 0, 7, 14, and 21), but suppression of tumor growth beyond the administration period The effect disappeared quickly. This is thought to be because Herceptin originally only acts on KPL-4 cells.
  • ZZ-BNC-Herceptin and ZZ-BNC-Cadsila which are typical examples of the antibody drug of the present invention, exhibit a stronger tumor growth inhibitory effect than Herceptin and CadSila, respectively.
  • Example 3 In vitro assay (cytotoxic activity: Avastin) A complex of ZZ-BNC and human anti-VEGF monoclonal antibody Avastin prepared in the same manner as ZZ-BNC-Herceptin, which is a typical example of the antibody drug of the present invention (this is referred to as “ZZ -BNC-Avastin (sometimes called "BNC-Avastin”) was conducted to confirm the ADCC activity. Specifically, the above-described assay was performed using GloResponse TM NFAT-RE-luc2P / KDR HEK293 cells (Promega) basically according to the protocol provided by the manufacturer. Details of this experiment are shown below.
  • a 100 ⁇ L solution of ZZ-BNC-Avastin in a serial dilution series with a concentration of 0.001 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml was prepared.
  • 100 ⁇ L of a solution of syramza and a solution of ZZ-BNC in a serial dilution series from 0.001 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml were prepared.
  • Example 4 In vivo assay (antitumor activity: Avastin) An experiment was conducted using ZZ-BNC-Avastin prepared in Example 3 in place of ZZ-BNC-Herceptin and ZZ-BNC-cadilla used in the in vivo assay of Example 2.
  • the nude mice used are 6-week-old female BALB / c (Claire Japan), and the cancer cells carried on this are A549 (about 1.0 ⁇ 10 6 cells).
  • Example 5 In vitro assay (cytotoxic activity: thyramza) A complex of ZZ-BNC and thyramza, a human anti-VEGF monoclonal antibody, prepared in the same manner as ZZ-BNC-Herceptin, which is a typical example of the antibody drug of the present invention (hereinafter referred to as “ZZ -BNC-Syramza "(sometimes called ADCC activity). Specifically, the above-described assay was performed using GloResponse TM NFAT-RE-luc2P / KDR HEK293 cells (Promega) basically according to the protocol provided by the manufacturer. Details of this experiment are shown below.
  • the GloResponse TM NFAT-RE-luc2P HEK293 cells which are the target cells included in the above kit, are seeded in a 96-well plate at 2x10 4 cells / well, and 1% (v / v) Was incubated for 16-20 hours at 37 ° C. in a CO 2 environment using a DMEM culture medium containing inactivated FBS.
  • a 100 ⁇ L solution of ZZ-BNC-Siramza in a serial dilution series with a concentration of 0.001 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml was prepared.
  • 100 ⁇ L of a solution of syramza and a solution of ZZ-BNC in a serial dilution series from 0.001 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml were prepared.
  • shaft in a figure shows the relative value (%) of the RLU value obtained at the time of the addition of thyramza or ZZ-BNC-silamza with respect to the RLU value obtained when VEGF attached to a kit is added.
  • Example 6 In vivo assay (antitumor activity: thyramza) An experiment was conducted using ZZ-BNC-Avastin prepared in Example 5 in place of ZZ-BNC-Herceptin and ZZ-BNC-cadilla used in the in vivo assay of Example 2.
  • the nude mice used are 6-week-old female BALB / c (Claire Japan), and the cancer cells carried on this are BxPC-3 (about 1.0 ⁇ 10 6 cells).
  • Example 7 In vitro assay (ADCC activity: Rituxan) A complex of ZZ-BNC and Rituxan, a chimeric (human / mouse) anti-CD20 monoclonal antibody, produced in the same manner as ZZ-BNC-Herceptin, which is a typical example of the antibody drug of the present invention (in this specification, An experiment was conducted to confirm the ADCC activity of “ZZ-BNC-Rituxan”. Specifically, using the ADCC Reporter Bioassay kit (Promega), the above-described assay was performed basically according to the protocol provided by the manufacturer. Details of this experiment are shown below.
  • ADCC target cells WIL2-S cells, ADCC target cells included in the kit described above, are seeded in a 96-well plate at about 5.0x10 3 cells / well, and 10% (v / v) Incubated with RPMI-1640 containing inactivated FBS at 37 ° C. in a CO 2 environment for 16-20 hours.
  • ZZ-BNC-Rituxan 50 ⁇ g of ZZ-BNC and 10 ⁇ g of Rituxan (Rituximab; purchased from Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) were mixed in 1 mL of PBS ( ⁇ ) and incubated at room temperature for 30 minutes. .
  • the ZZ-BNC-Rituxan thus obtained was diluted 3-fold with Assay buffer [RPMI 1640 containing 1% (v / v) inactivated FBS], and the final concentration converted to the amount of IgG in the antibody portion was A 100 ⁇ L ZZ-BNC-Rituxan solution in a serial dilution series from 0.0001 ⁇ g / ml to 1 ⁇ g / ml was prepared.
  • As negative controls 100 ⁇ L of a Rituxan solution and a ZZ-BNC solution in a serial dilution series from 0.0001 ⁇ g / ml to 1 ⁇ g / ml were prepared.
  • Example 8 In vitro assay (cytotoxic activity: Opdivo) A complex of ZZ-BNC and Opdivo, which is a human anti-human PD1 monoclonal antibody, produced in the same manner as ZZ-BNC-Herceptin, which is a typical example of the antibody drug of the present invention (this is referred to as “ An experiment was conducted to confirm the cytotoxic activity of ZZ-BNC-Opivo. Specifically, the above-described assay was performed using a PD-1 / PD-L1 Blockade Bioassay kit (Promega) basically according to the protocol provided by the manufacturer. Details of this experiment are shown below.
  • PD-L1-expressing cells PD-L1 aAPC / CHO-K1 cells, which are PD-L1-expressing cells attached to the kits described above, are recovered from Ham's containing 10% (v / v) inactivated FBS. Replace the medium with F-12), and place these cells in 96-well plates with 4.0x10 4 cells / 100 ⁇ L / well [Ham's F-12 containing 10% (v / v) inactivated FBS]. Sowing. In addition, 80 ⁇ L of medium was added to Blank wells. The 96-well plate thus prepared was cultured at 37 ° C. in a CO 2 environment for 16-20 hours.
  • ZZ-BNC-Opivo 50 ⁇ g of ZZ-BNC and 10 ⁇ g of Opdivo (nivolumab; purchased from Ono Pharmaceutical) were mixed in 1 mL of PBS ( ⁇ ) and incubated at room temperature for 30 minutes. .
  • the ZZ-BNC-Opivo obtained in this way was diluted 3-fold with Assay buffer [RPMI 1640 containing 1% (v / v) inactivated FBS], and the final concentration calculated by the amount of IgG in the antibody portion was A 100 ⁇ L ZZ-BNC-opdivo solution in a serial dilution series from 0.001 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml was prepared.
  • As negative controls 100 ⁇ L of an Opdivo solution and a ZZ-BNC solution in a serial dilution series from 0.001 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml were prepared.
  • the antibody drug of the present invention enhances the function of the antibody molecule contained therein.

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Abstract

本発明は、　抗体担持リポソームを含有する抗体医薬であって、該抗体担持リポソームは （１）1個の脂質二重膜 （２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び （３）2個以上の抗体分子 を含有し、 該膜貫通タンパク質は該脂質二重膜を貫通し、該脂質二重膜の外側に1個以上の抗体結合ドメインが設けられ、及び該抗体分子はそれぞれ該抗体結合ドメインに結合し、 且つ、該抗体分子が発揮する機能が、これと等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強されている、抗体医薬を提供する。

Description

医薬
　本発明は医薬に関する。特に、本発明は抗体医薬に関する。
　近年の抗体医薬に関する競争の激化に伴い、高品質な抗体医薬を開発する目的で、様々な手段を講じた研究開発がされている。
　例えば、抗体医薬の有効成分となるモノクローナル抗体分子を入手するために必要なスクリーニング技術が進歩し、特定の抗原に対する親和性の高い抗体分子が得られるようになっている。また、抗体医薬による薬理効果を発揮する上で重要なADCC活性及びCDC活性を増強させるために、イムノグロブリンの定常領域に存在するFc領域に対して、特定の変異を施す技術も開発されている。
　具体的に、S298A-E333A-K334A変異体は、それらの変異導入前と比較してFcγRIIB（抑制型Fcγ）への結合力が弱く、且つ、FcγRIIIへの結合力が強くなることが、非特許文献1に開示されている。
　また、非特許文献2には、S239D-I332E変異体及びS239D-I332E-A330L変異体は、共にそれらの変異導入前と比較してFcγRIIIへの結合力が非常に強くなるため、結果としてADCC活性化能が、上昇する事実が示されている。また、S239D-I332E-A330L変異体は、それら変異導入前と比べて、CDC活性化能が消失する傾向となる事実も示されている。
　そして、F243L-R292P-Y300L-V305I-P396L変異体が、それら変異導入前と比較してFcγRIIIへの結合力が非常に強くなるため、結果としてADCC活性化能が上昇する事実が非特許文献3に示されている。
　他方、K326W及びK326W-E333S変異体は、それら変異導入前と比較して補体C1qの結合量が増大し、その結果としてCDC活性化能が増強されることも知られている（非特許文献４）。
　また、S267E-H268F-S324T変異体のCDC活性化能は、それら変異導入前と比較して約6.9倍程度上昇し、ADCC活性化能は約0.045倍程度にまで激減すること、及び、S267E-H268F-S324T-G236A-I332E変異体のCDC活性化能は、それら変異導入前と比較して約23倍程度に上昇し、ADCCは約1.2倍程度の微増であることが非特許文献5に開示されている。
　特許文献1には、B型肝炎ウイルス表面抗原を改変して、これに抗体分子を担持させた複合体をDDS製剤として用いることができる旨の発明が開示されている。DDS製剤とは、体内の必要な部位に、必要な量を、必要な時間だけ到達させることを目的に開発された医薬組成物の剤形の一つである。また、特許文献2には、B型肝炎ウイルス表面抗原を改変し、これに抗体分子を担持させた複合体が感度の良いイムノセンサーとして働くとの旨の発明が開示されている。
そして、特許文献3には上記する特許文献1に記載するDDS用途を利用したワクチンの発明が開示されている。
特開2004-002323 特開2015-184269 国際公開番号2013/147232
Robert L.Shieldsら，J.B.C., Vol. 276, No. 9, March 2 (2001), pp 6591-6604. Greg A. Lazarら，PNAS March 14 (2006) vol. 103, no. 11, pp 4005-4010. Jeffrey B. Stavenhagenら、Cancer Res, 2007; 67 (18). pp 8882-8890. Esohe E.Idusogieら、The Journal of Immunology, (2001); 166, pp 2571-2575． Gregory L. Mooreら、mAbs2: 2, pp 181-189.
　既に抗体医薬の有効成分とするために開発された抗体分子よりも高い親和性を有する抗体分子を取得することは、まったく新しい抗体分子を得ることと大差は無く、それまでの開発にかかった時間的及び金銭的な事情を考慮すると、たとえ優れた抗体医薬を得るためといえども、現実的な対応とはいえない。
　また、既に抗体医薬の有効成分とするために開発がなされた抗体分子に対して、上記の様な特定の変異を施して抗体分子が発揮する機能を増強させることは、斯かる変異導入によって抗体医薬の有効成分となる抗体分子そのものが発揮すべき機能が、意図しないように変更又は減衰してしまう可能性があるために好ましくない。
　したがって、抗体分子の入手手段の改良又は抗体分子自体に変異に施すことを、優れた抗体医薬を開発する手段として採用することは難しい。
　上記する事情を考慮したうえで、本発明では、既存の抗体医薬に有効成分として含有される抗体分子そのものに変更を加えることなく、これをそのまま利用しながら、優れた抗体医薬を得ることを目的とする。
　上記課題を解決すべく、本願の発明者らが鋭意検討を重ねた結果、既存の抗体医薬の有効成分として含有される抗体分子を、所定の複合体の一成分としてそのまま利用することにより、該抗体分子が発揮する機能が増強されることを見いだした。
　具体的に、本願の発明者らは、抗体結合ドメインを設けた膜貫通タンパク質を配置する脂質二重膜を含有するリポソームを使用することによって、斯かる抗体結合ドメインに結合する抗体分子が発揮する機能を、該抗体分子が単独で発揮する機能よりも増強されることを明らかにした。
　本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、後記する態様の発明を広く包含する。
　［項1］　抗体担持リポソームを含有する抗体医薬であって、該抗体担持リポソームは
（１）1個の脂質二重膜
（２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）2個以上の抗体分子
を含有し、
該膜貫通タンパク質は該脂質二重膜を貫通し、該脂質二重膜の外側に1個以上の抗体結合ドメインが設けられ、及び該抗体分子はそれぞれ該抗体結合ドメインに結合し、
且つ、該抗体分子が発揮する機能が、これと等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強されている、抗体医薬。
　［項2］　前記2個以上の抗体分子が、前記脂質二重膜の外側表面に整列配置されることを特徴とする、項1に記載する抗体医薬。
　［項3］　前記抗体分子が発揮する増強される機能が、抗原結合活性、細胞障害活性及びADCP活性からなる群より選択される少なくとも一種である、項1又は2に記載する抗体医薬。
　［項4］　前記膜貫通タンパク質が、エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質である、項1～3の何れか一項に記載する抗体医薬。
　［項5］　前記ウイルス外皮タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス外皮タンパク質、単純ヘルペスウイルス外皮タンパク質、水痘・帯状疱疹ウイルス外皮タンパク質、及びインフルエンザウイルス外皮タンパク質からなる群より選択される少なくとも一種のウイルス外皮タンパク質である、項4に記載の抗体医薬。
　［項6］　前記膜貫通タンパク質がB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)である、項5に記載の抗体医薬。
　［項7］　前記抗体結合ドメインが、イムノグロブリンのFc、Fab、糖鎖、及びJ鎖からなる群より選択される少なくとも一種に選択的に結合する、項1～6の何れか一項に記載の抗体医薬。
　［項8］　前記糖鎖が、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、マンノース、フコース及びシアル酸からなる群より選択される少なくとも一種の炭糖が、少なくとも5個以上グリコシド結合した糖鎖である、項7に記載する抗体医薬。
　［項9］　前記抗体分子が、イムノグロブリン、その断片、及びこれらの再構築物からなる群より選択される少なくとも一種である、項1～8の何れか一項に記載する抗体医薬。
　［項10］　前記イムノグロブリンの断片が、F(ab')2、Fab、Fc、Fv、糖鎖、及びJ鎖から選択される少なくとも一種である、項9に記載する抗体医薬。
　［項11］　前記イムノグロリン又はその断片の再構築物が、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、scFv-Fc、VHH、及び多価化抗体より選択される少なくとも一種である、項9に記載する抗体医薬。
　［項12］　前記抗体分子が、イムノトキシン、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びユニボディ（登録商標）からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～１１の何れか一項に記載する抗体医薬。
   [項13]
（１）1個の脂質二重膜
（２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）2個以上の抗体分子
を含有し、
該膜貫通タンパク質は該脂質二重膜を貫通し、該脂質二重膜の外側に1個以上の抗体結合ドメインが設けられ、及び該抗体分子はそれぞれ該抗体結合ドメインに結合する、抗体担持リポソームを使用する工程を含む、
該抗体分子が発揮する機能を、これと等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強させる方法。
   [項14］
　その機能が増強された抗体分子を有効成分とする抗体医薬の製造方法であって、
1個以上の抗体結合ドメインを設けた膜貫通タンパク質を配置する1個の脂質二重膜を含有するリポソームと、2個以上の該抗体分子とを結合させる工程を含み、
該抗体結合ドメインの一部又は全部が該脂質二重膜の外側表面に配置される、
製造方法。
　抗体分子を含有する本発明の抗体医薬は、有効成分である抗体分子が発揮する機能が、該抗体医薬が本発明の抗体医薬に含有されない状態で使用した時に発揮する機能に比べて上昇する効果を発揮する。また、本発明に係る抗体医薬に含有される抗体分子が発揮する機能は、該抗体医薬に含有される抗体分子と等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強させる効果を発揮する。
　このような本発明に係る抗体医薬は、少ない投与量にて所望する治療効果を発揮することが期待できる。
実施例1に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vitro実験結果を示すグラフ。グラフ中の菱形マークはハーセプチンを、三角マークはZZ-BNC-ハーセプチンを、クロスマークはカドサイラを、そしてサークルマークはZZ-BNC-カドサイラを使用した時の結果を示している。グラフ中の縦軸は細胞生存率（%）を示す。また、グラフ中の横軸は、使用したサンプルの抗体部分で算出した濃度（nM）を示す。 実施例2に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vivo実験結果を示すグラフ。グラフ中の四角マークはZZ-BNCを、菱形マークはハーセプチンを、三角マークはZZ-BNC-ハーセプチンを、クロスマークはカドサイラを、そしてサークルマークはZZ-BNC-カドサイラを使用した時の結果を示している。 本発明の抗体医薬を説明するための模式図。図中の（A）は、ZZ-BNC（本発明の2個以上の抗体分子の結合前の抗体担持リポソームに相当する）に基づく本発明の抗体医薬を説明する図である。図中の（B）は、LL-BNC（本発明の2個以上の抗体分子の結合前の抗体担持リポソームに相当する）に基づく本発明の抗体医薬を説明する図である。図中の（C）は、GL-BNC又はLG-BNC（本発明の2個以上の抗体分子の結合前の抗体担持リポソームに相当する）に基づく本発明の抗体医薬を説明する図である。 実施例３に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vitro実験結果（VEGF受容体2依存的細胞におけるVEGF枯渇による細胞障害活性）を示すグラフ。グラフ中の菱形マークはアバスチンを、そしてグラフ中の三角マークはZZ-BNC-アバスチンを使用した時の結果を示している。 実施例４に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vivo実験結果（抗腫瘍効果）を示すグラフ。グラフ中の三角マークはZZ-BNCを、グラフ中の四角マークはアバスチンを、そしてグラフ中の菱形マークはZZ-BNC-アバスチンを使用した時の結果を示している。 実施例５に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vitro実験結果（VEGF受容体2依存的細胞におけるVEGF受容体2アンタゴニストによる細胞障害活性）を示すグラフ。グラフ中の菱形マークはサイラムザを、そしてグラフ中の三角マークはZZ-BNC-サイラムザを使用した時の結果を示している。 実施例６に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vivo実験結果（抗腫瘍効果）を示すグラフ。グラフ中の三角マークはZZ-BNCを、四角マークはサイラムザを、そしてグラフ中の菱形マークはZZ-BNC-サイラムザを使用した時の結果を示している。 実施例７に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vitro実験結果（Fcγ受容体IIIaの活性化によるADCC活性）を示すグラフ。グラフ中の菱形マークはリツキサンを、そしてグラフ中の三角マークはZZ-BNC-リツキサンを使用した時の結果を示している。 実施例８に示す本発明の抗体医薬による効果を確認するin vitro実験結果（PD-1/PD-L1結合抑制で誘導されるTCR活性化による細胞障害活性）を示すグラフ。グラフ中の菱形マークはオプジーボを、そしてグラフ中の三角マークはZZ-BNC-オプジーボを使用した時の結果を示している。
抗体医薬
　本発明の抗体医薬は、抗体担持リポソームを含有し、該抗体担持リポソームは
（１）1個の脂質二重膜
（２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）2個以上の抗体分子
を含有し、
該膜貫通タンパク質は該脂質二重膜を貫通し、該脂質二重膜の外側に1個以上の抗体結合ドメインが設けられ、及び該抗体分子はそれぞれ該抗体結合ドメインに結合し、
且つ、該抗体分子が発揮する機能が、これと等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強されている抗体医薬である。
　本発明の抗体医薬の構成要素である抗体担持リポソームとは、（１）1個の脂質二重膜
（２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び（３）2個以上の抗体分子を含有する。ここで脂質二重膜とは、前記抗体担持リポソームの形状を構成する主成分であり、該形状は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、球形、楕円形、半円形等の形状を挙げることができる。
　上記する膜貫通タンパク質は、上記する抗体担持リポソームに含有される脂質二重膜を貫通する。すなわち、本発明の抗体医薬において、該膜貫通タンパク質は該抗体担持リポソームに含有される脂質二重膜中に配置されるとも言える。ここで、「貫通」とは必ずしも該膜貫通タンパク質が該脂質二重膜を突き抜ける態様には限定されず、該膜貫通タンパク質が該脂質二重膜の外側に突出されている態様であってもよい。上記するように本発明の構成要素である抗体担持リポソームに含有される脂質二重膜によって形成されるリポソームは閉鎖空間を含む形状であるため、前記する膜貫通タンパク質が脂質二重膜の外側に突出されている態様とは、膜貫通タンパク質が抗体担持リポソームの外側に突出されている態様であるともいえる。
　本発明の抗体医薬に含有されることによって増強される抗体分子が発揮する機能とは、抗体分子が原始的に有する機能であって、所望の薬理効果を発揮する範囲内の機能であれば、特に限定されない。具体的には、抗原結合活性、細胞障害活性（例えば、ADCC活性またはCDC活性）、ADCP活性等を挙げることができる。
　上記する抗原結合活性とは、抗体分子と抗原分子との結合力（親和性ともいう）であると当業者に理解される。このような結合力の増強の度合いは、抗体分子と抗原分子との結合定数等を指標として確認することができる。結合定数の測定方法は、公知の方法を採用することができる。本発明に係る抗体医薬が有する上記の抗原結合活性は、本発明の抗体医薬が複数の抗体分子を有しているため、抗原分子と抗体分子との一対一対応の結合能を示すアフィニティとして測定することは好ましくなく、アビディティとして測定することが好ましい。
　具体的には、Iijima MらのBiomaterials, 32 (2011); 1455-1464、Gregory P． AdamsらのClin. Cancer Res 2006; 12: 1599-1605等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して求めることができる。また、通常用いられる公知のイライザキット等を用いて測定することも可能である。
　上記する細胞障害活性とは、目的とする細胞に対して毒性を及ぼす活性であればよく、具体的に該細胞を死に至らしめる効果もこれに包含され得る。このような細胞障害活性の測定方法は、Wang CらのCancer Immunol Res. 2014 Sep;2(9):846-56.、Lewis Phillips GDらのCancer Res. 2008 Nov 15;68(22):9280-90.、Reff MEらのBlood. 1994 Jan 15;83(2):435-45.、Zhang NらのExp Ther Med. 2014 Dec;8(6):1723-1726.、Pietras RJらのOncogene. 1998 Oct 29;17(17):2235-49.等の公知の文献に記載される方法を採用することができる。
　その他の方法として、後記する実施例にて使用するハーセプチン、カドサイラ、アバスチン、サイラムザ、リツキサン、オブジーボ等のインタビューフォームに記載された薬理効果を確認する実験手段を適宜採用することもできるし、後記する実施例にて使用するGloResponseTM NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293 cells（プロメガ）、PD-1/PD-L1 Blockade Bioassayキット（プロメガ）などのキットを用いることによって、測定することもできる。
　上記する細胞障害活性の一種であるADCC活性とは、抗体依存性細胞傷害活性とも呼ばれる。この活性は、抗体分子がマクロファージ、NK細胞、好中球、又は好酸球等のエフェクター細胞を、その近傍にリクルートし、その抗体分子の近傍に存在する細胞又は生体内分子等に対し、リクルートされたエフェクター細胞を介して障害を与える活性であると当業者に理解される。このようなADCC活性の程度を測定する方法は、公知の方法を採用することができる。具体的には、Kimura MらのCancer Sci|August 2007 vol.98 no.8 1275-1280.等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して測定することができる。また、ADCC Reporter Bioassay (Promega)を用いてこれを測定することも可能である。その他の測定方法として、例えば、血液の白血球画分等を標的細胞と混合させることによって生じる細胞障害を、LDH漏れ出し量の測定、WST-8等を用いた細胞の生存活性等に数値化することによっても測定することができる。
　上記する細胞障害活性の一種であるCDC活性とは、補体依存性細胞傷害活性とも呼ばれる。この活性は、抗体分子が補体を、その近傍にリクルートし、その抗体分子の近傍に存在する細胞又は生体内分子等に対し、リクルートされた補体を介して障害を与える活性であると当業者に理解される。このようなCDC活性の程度を測定する方法は、公知の方法を採用することができる。具体的には、ADCC活性の測定にて上記した文献等に記載する公知の方法を適宜改変して測定することができる。具体的には、血清を細胞に添加し、血清中の補体による細胞障害の程度を測定することにより測定可能である。
　上記する細胞障害活性の一種であるADCP活性とは、抗体依存性細胞貪食活性とも呼ばれる。この活性は、抗体分子がマクロファージ等を、その近傍にリクルートし、その抗体分子の近傍に存在する細胞又は生体内分子等に対し、リクルートされたマクロファージ等の貪食作用発揮させる活性であると当業者に理解される。このようなADCP活性の程度を測定する方法は、公知の方法を採用することができる。具体的には、Nagashima HらのJournal of Bioscience and Bioengineering. VOL. 111 No. 4, 391-396, 2011等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して測定することができる。この文献には、蛍光色素PEで標識された貪食細胞(THP-1)と蛍光色素カルセインで標識された標的細胞(Ramos)を混合培養後にFACS解析することによって、貪食された標的細胞がPEとカルセインのダブル・ポジティブになることを指標として、貪食された標的細胞数の割合によりACDP活性を評価することを開示している。
　また、FcγRIIa-H ADCP Reporter Bioassay（Promega）等のFcγRIIaを発現する細胞を用いて、ADCP活性を定量することも可能である。より詳細に説明すると、エフェクター細胞としてFcγRIIa-Hを安定発現し、なおかつFc結合型FcγRIIaにより活性化を受ける転写因子NFATの結合配列、及びその下流にルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を結合した塩基配列を有するポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれている細胞を用いる。標的細胞に結合した抗体分子を上記のエフェクター細胞のFcγRIIaが認識するとルシフェラーゼが発現する。このルシフェラーゼの活性を測定することにより、ADCP活性を定量化することができる。
　上記する本発明の抗体医薬に含有されることによって増強される抗体分子が発揮する好ましい機能は細胞障害活性である。
　上記する本発明の抗体医薬に含有される抗体分子が発揮する各種機能が増強していることを確認する具体的な方法は、例えば、本発明の抗体医薬と、本発明の抗体医薬に含有される抗体分子と同一の抗体分子とを、それぞれ同モル量の使用量で上記する各種の測定方法等に供して、両者の抗体分子が発揮する機能の比較をする方法を挙げることができる。
　なお、上記する抗体分子が原始的に有する各種機能は、例えば、ある抗体分子に特異的に結合する抗原分子をその表面に発現する細胞に対する生存活性の低下の程度、又はこのような細胞を含有する組織の体積の減少の程度等を基に確認することもできる。具体的に後記する実施例では、本発明の抗体医薬に含有される抗体分子が有する各種機能が増大（上記する細胞の生存活性の低下及び上記する組織体積の減少）することの典型例を示している。
　本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質とは、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。具体的には、エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質等を挙げることができる。エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質とは、ウイルス外皮タンパク質の中でも、エンベロープを構成するタンパク質であることを意味する。これらのエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質は、一種又は複数を組み合わせて、上記する本発明の抗体医薬のエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質として採用することもできる。
　上記するエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質とは、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。例えば、B型肝炎ウイルス外皮タンパク質、C型肝炎ウイルス外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス外皮タンパク質、単純ヘルペスウイルス外皮タンパク質、水痘・帯状疱疹ウイルス外皮タンパク質、又はインフルエンザウイルス外皮タンパク質等を挙げることができる。
　B型肝炎ウイルス(HBV)外皮タンパク質に由来するエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬のに含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　C型肝炎ウイルス(HCV)外皮タンパク質に由来するエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるE1タンパク質又はE2タンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　センダイウイルス(SeV)外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるFタンパク質又はHNタンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　ヒト免疫不全ウイルス(HIV)外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるGP160タンパク質、GP120タンパク質、又はGP41タンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　単純ヘルペスウイルス(HSV)外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるgBタンパク質、gCタンパク質、gDタンパク質、gHタンパク質、又はgLタンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)外皮タンパク質外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるgBタンパク質、ｇＣタンパク質、gEタンパク質、gHタンパク質、gIタンパク質、gKタンパク質、又はgLタンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　インフルエンザウイルス外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるM1タンパク質、M2タンパク質、ヘマグルチニン、又はノイラミニダーゼ等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の抗体医薬に含有される膜貫通タンパク質として採用することができる。
　上記する膜貫通タンパク質の中でも、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)が好ましい。
　なお、上記する膜貫通タンパク質は、本発明の抗体医薬における抗体分子の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される各種の変異を施すことができる。また、膜貫通能を発揮しないような変異が好ましくない。
　このような変異は、その変異前後のアミノ酸配列の相同性が80%以上であることが好ましく、より好ましくは85%以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上、最も好ましくは99.5％以上である。
　上記する本発明の抗体医薬に含有される脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に設けられる抗体結合ドメインは、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。例えば、イムノグロブリンのFc、Fab、糖鎖、又はJ鎖等に結合するドメインを挙げることができる。これらの抗体結合ドメインに対する後記する抗体分子の結合は、特異的な結合であることが好ましい。
　上記する抗体結合ドメインは、本発明の抗体医薬の脂質二重膜中に配置される膜貫通タンパク質中に設けられる。前記する膜貫通タンパク質に設けられる抗体結合ドメインの個数は1個以上である。このように設けられる抗体結合ドメインの態様は、それらの一部又は全部が上記するリポソームの外側に配置される態様とすることもできる。なお、抗体結合ドメインとは後記するように複数のアミノ酸残基からなるものであるため、上記する一部とは一個の抗体結合ドメインの全体を意味するのではなく、一個の抗体結合ドメインの中の一部であることを意味する。例えば、8アミノ酸残基からなる抗体結合ドメインである時、その4アミノ酸残基のみが脂質二重膜の外側に設けられる態様を例示することができる。
　イムノグロブリンのFcとは、抗体分子の中でも比較的変化の少ない定常領域に含まれる部位であり、例えばIgGであれば、その構造からＦ(ab)'領域を除いたCH2-CH3領域と呼ばれる部位がFcに相当すると当業者に理解される。
　このようなFcに結合するタンパク質の典型例として、黄色ブドウ球菌等に由来するプロテインＡを挙げることができる。プロテインＡとは、ヒト由来（以後、これを「h」と称することがある）のIgDには結合しない傾向であるものの、各種動物に由来するアイソタイプのIgGに結合することが認められるタンパク質であると当業者に理解される。
　例えば、IgGであれば、hIgG1、hIgG2、hIgG4、マウス由来（以後、これを「m」と称することがある）IgG2a、mIgG2b、又はmIgG3等に高い特異性で結合することが当業者に理解される。
　このようなプロテインAが有するE、D、A、B、及びCドメインを含むZドメインを、上記するFcに結合する抗体結合ドメインとして挙げることができる。具体的なZドメインのアミノ酸配列は、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。例えば、配列番号1に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
　上記する抗体結合ドメインとして、Zドメインを採用した本発明の抗体医薬は、例えば、配列番号4に記載するアミノ酸配列を含むペプチドが設けられた膜貫通タンパク質を配置する脂質二重膜（リポソーム）を作製し、これに所望の２個以上の抗体分子を結合させることによって得ることができる。このような膜貫通タンパク質には、上記するZドメインがタンデムに2個並べられた態様にて設けられている。具体的に、上記するZドメインを有する抗体医薬は、配列番号4に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換し、これを培養する生合成によって容易に得ることができる。このような製造方法は、具体的には特許文献1～3の記載に準じて行うことができる。これによって得られる本発明の抗体医薬の構成要素である抗体担持リポソームの、抗体分子を担持する前のリポソームのことを、本明細書において「ZZ-BNC」と呼ぶことがある。
　上記の配列番号４に記載のアミノ酸配列は、本発明の抗体医薬に含有される抗体分子の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される変異を施すことができる。また、膜貫通能を減衰するような変異も、抗体結合能を減衰するような変異も好ましくない。このような変異は、その変異前後のアミノ酸配列の相同性が80％以上であることが好ましく、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上、最も好ましくは99.5％以上である。
　上記する抗体分子のFcに結合するタンパク質のもう一つの典型例として、連鎖球菌等に由来するプロテインGを挙げることができる。このプロテインGとは、上記したプロテインAと同様に、IgDには結合しない傾向であるものの、各種動物に由来するアイソタイプのIgGに結合することが認められるタンパク質である。例えば、IgGであれば、hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4、mIgG2a、mIgG2b、又はmIgG3等に高い特異性で結合すること当業者に理解される。
　このこのようなプロテインGが有するC1、D1，C2、D2、又はC3ドメインを、上記するFcに結合する抗体結合ドメインとして挙げることができる。プロテインGに由来するドメインの中でもC2ドメインが好ましい。具体的なC2ドメインのアミノ酸配列は、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
　イムノグロブリンのFabとは抗体分子の可変領域（Fv）を包含し、抗体分子の抗原決定に際して重要な働きを担う部分に相当する。
　このようなFabに結合するタンパク質として、ペプトストレプトコッカス属マグナスに由来するプロテインLを挙げることができる。このプロテインLとは、抗体分子のFabに結合する、より詳細には、κ軽鎖に結合することから、ほぼすべてのアイソタイプのイムノグロブリンに結合すること当業者に理解される。
　このようなプロテインLが有するB1、B2，B3、B4、又はB5ドメインを、上記する抗体分子のFabに結合する抗体結合ドメインとして挙げることができる。プロテインLに由来するドメインの中でもB1ドメインが好ましい。具体的なB1ドメインのアミノ酸配列は、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。例えば、配列番号3に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
　上記する抗体結合ドメインとしてLドメインを採用した本発明の抗体医薬は、例えば、配列番号5に記載するアミノ酸配列を含むペプチドが設けられた貫通タンパク質を配置する脂質二重膜（リポソーム）を作製し、これに所望する2個以上の抗体分子を結合させることによって得ることができる。このような膜貫通タンパク質には、上記するLドメインがタンデムに2個並べられた態様にて設けられている。
　具体的に、上記するLドメインを有する抗体医薬は、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換し、これを培養する生合成によって容易に得ることができる。このような製造方法は、具体的には特許文献1～3の記載に準じて行うことができ、得られる本発明の抗体医薬の構成要素である抗体担持リポソームの、抗体分子を担持する前のリポソームを、本明細書において「LL-BNC」と呼ぶことがある。
　なお、上記の配列番号５に記載のアミノ酸配列も、上記するZZ-BNCと同様に、本発明の抗体医薬における、抗体分子の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される各種の変異を施すことができる。
　このような変異は、その変異前後のアミノ酸配列の相同性が80％以上であることが好ましく、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上、最も好ましくは99.5％以上である。
　また、上記する抗体分子のFcに結合する抗体結合ドメインの典型例であるプロテインGに含まれるC2ドメイン（例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列）と上記する抗体分子のFabに結合する抗体結合ドメインの典型例であるプロテインLに含まれるB1ドメイン（例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列）とが、タンデムにて配置された態様のアミノ酸配列を有するLG-BNC（配列番号6）及びGL-BNC（配列番号7）も、本発明の抗体医薬の構成要素である抗体担持リポソームの、抗体分子を担持する前の態様のリポソームの典型例として挙げることができる。上記するLG-BNCもGL-BNCも、共に上記するZZ-BNC又はLL-BNCと同様にして得ることができる。
　なお、上記する配列番号６及び７に記載のアミノ酸配列も、本発明の抗体医薬における、抗体分子の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される各種の変異を施すことができる。
　このような変異は、その変異前後のアミノ酸配列の相同性が80％以上であることが好ましく、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上、最も好ましくは99.5％以上である。
　上記する糖鎖とは、後記する抗体結合ドメインに結合する抗体分子に含有される糖鎖であれば、特に限定はされない。このような糖鎖は抗体分子中のアスパラギン酸(Asn)に結合するN型糖鎖であることが好ましい。
　このような糖鎖として、具体的には、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、及びシアル酸等に代表される単糖が、互いにグリコシド結合したN型糖鎖を挙げることができる。
　上記する糖鎖にて単糖がグリコシド結合する個数は、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定はされない。具体的には、5個以上とすることができる。斯かる個数の上限値も限定的ではなく、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個を例示することができる。
　また、上記するグリコシド結合の態様も、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。具体的には、1-2結合、1-3結合、1-4結合、1-5結合、又は1-6結合等を挙げることができる。また、α結合であってもβ結合であってもよい。
　このような糖鎖の具体例として、下記の表にて示すようなN型糖鎖を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の模式図にて示す糖鎖の中でも、２つのシアル酸（◇）を含まない、16種類の何れかに示す糖鎖が、ヒトIgGに存在する糖鎖として好ましく例示される。
　この様な好ましい糖鎖の典型例（G0、G1、及びG2）を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記するJ鎖とは、本発明の効果を発揮する範囲内で、且つ抗体分子に結合するタンパク質であれば、特に限定はされない。具体的には、IgA又はIgMが有するJ鎖を例示することができる。このようなJ鎖のアミノ酸配列は、本発明の効果を発揮する範囲内であれば、特に限定されない。例えば、アメリカ合衆国の国立衛生研究所（NIH）の国立医学図書館に付属する国立生物工学情報センター（NCBI）のウェブサイト(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)にて、NP_653247.1で検索されるアミノ酸配列を挙げることができる。
　上記する本発明の抗体医薬の構成成分である抗体担持リポソームに含有される抗体分子は、本発明の効果を発揮する範囲内で、且つ抗体医薬の有効成分として用いられる抗体分子であれば、特に限定されない。このような抗体分子として、具体的には、イムノグロブリン、その断片、又はこれらの再構築物を挙げることができる。
　上記するイムノグロブリンのアイソタイプは、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。具体的には、IgM、IgD、IgG、IgA、IgE、IgW，IgX、IgY、又はIgNAR等のアイソタイプを挙げることができる。これらのイムノグロブリンのアイソタイプ中でも、哺乳類動物が原始的に有するイムノグロブリンであるIgM、IgD、IgG、IgA、又はIgEが好ましく、中でもIgGが、上記するイムノグロブリンのアイソタイプとして好ましい。
　なお、上記するIgGのサブクラスは、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。具体的には、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgG2b、又はIgG2c等を挙げることができる。また、上記するIgAのサブクラスも、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。具体的にはIgA1又はIgA2等を挙げることができる。
　上記するイムノグロブリンの断片とは、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。具体的には、F(ab')2、Fab、Fc、Fv、糖鎖、IgAに由来するJ鎖、又はIgMに由来するJ鎖等を挙げることができる。
　上記するFabとは、具体的には、IgGの重鎖に由来するVH-CH1領域と軽鎖に由来するVL-CLがジスルフィド結合した分子であり、IgGをパパインで消化することによって得ることができる分子であると当業者に理解される。
　上記するF(ab')2とは、具体的には、上記する2分子のFabが、ヒンジ領域とそれに含まれるシステイン残基によってジスルフィド結合した分子であり、IgGをペプシンで消化することによって得ることができる分子であると当業者に理解される。
　上記する本発明の抗体医薬の構成成分である抗体担持リポソームに含有される抗体分子の典型例として例示したFc、Fab、糖鎖、及びJ鎖とは、上記する本発明の抗体医薬の構成成分である抗体担持リポソームに含有される脂質二重膜中に存在する膜貫通タンパク質に配置された抗体結合ドメインの結合対象として説明したものと同様にすることができる。
　上記するイムノグロブリン又はイムノグロブリンの断片の再構築物とは、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。具体的には、scFv、ディアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、ミニボディ(Minibody)、scFv-Fc、VHH、又は多価化抗体等を挙げることができる。
　上記するscFvとは、具体的には、IgGの重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)とがリンカーを介して結合した構造を有する分子であると当業者に理解される。このようなscFvは、上記のVHとVLとのリンカーを介する結合として、後記する4つの態様を挙げることができるが、これらの何れかの態様に限定されないのはいうまでも無い。
・（N末端）VH（C末端）－（リンカー）－（N末端）VL（C末端）
・（N末端）VL（C末端）－（リンカー）－（N末端）VH（C末端）
・（N末端）VH（C末端）－（リンカー）－（C末端）VL（N末端）
・（N末端）VL（C末端）－（リンカー）－（C末端）VH（N末端）
　上記するディアボディとは、具体的には、上記の2分子のscFvが、これらに含まれるVHとVLとを介して、互いに非共有結合的に会合した構造を有する分子であると当業者に理解される。
　上記するトリアボディとは、具体的には、上記の3分子のscFvが、これらに含まれるVHとVLとを介して、互いに非共有結合的に会合した構造を有する分子であると当業者に理解される。
　上記するテトラボディとは、具体的には、上記の4分子のscFvが、これらに含まれるVHとVLとを介して、互いに非共有結合的に、且つ、平面的に会合した構造を有する分子であると当業者に理解される。
　上記するミニボディとは、具体的には、上記のscFvの末端にIgGのFcドメインに含まれるCH3ドメインが結合してなる2つの分子が、互いにそのCH3ドメイン同士を介した非共有結合的に会合した構造を有する分子であると当業者に理解される。
　上記するscFv-Fcとは、具体的には、上記のscFvの末端にヒンジ部、及びIgGのFcドメインに含まれるCH2ドメイン並びにCH3ドメインが結合した2つの分子が、互いに上記のミニボディの構造にて説明したCH3ドメイン同士を介した非共有結合的な会合及び該ヒンジ部を介したジスルフィド結合によって得られる構造を有する分子であると当業者に理解される。
　上記するVHHとは、具体的には、ラクダ科動物の血中に存在する低解離定数で標的抗原に結合する能力を有する分子であり、IgGと比較すると重鎖のみからなる構造を有する、分子量約13kDa程度のタンパク質として当業者に理解される。
　上記する多価化抗体とは、本発明の効果を発揮する範囲であり、且つ一個以上の抗原結合部位を有する抗体分子である限り、特に限定されない。例えば、上記するトリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、scFv-Fc、又はIgG、IgA並びにIgM等のイムノグロブリンのほかに、四価IgG等を挙げることができる。また、二重特異性抗体も本発明のイムノグロブリン又はイムノグロブリンの断片の再構築物の典型例として挙げる多価化抗体に包含されると当業者に理解される。
　本発明の抗体医薬に含有される抗体分子の他の典型例として、イムノトキシン、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、又はユニボディ等を挙げることもできる。
　イムノトキシンとは、抗体－薬物複合体(Antibody-Drug Conjugate:ADC)とも呼ばれ、上記する抗体分子に細胞毒性作用を発揮する分子が担持された分子であると当業者に理解される。
　細胞毒性作用を発揮する分子とは、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。例えば、エムタンシン(DM1)、オゾガマイシン(カリケアミシン類)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、デュオカルマイシン類、アマニチン(AAMT)、アドゼルシン、ビゼルシン、カルゼルシン(U-80244)、PNU159682(ネモルビシン類)等を挙げることができる。これらの分子の中でも、かなり細胞に対する毒性が高いものが好ましい。このような好ましい分子として、例えば、エムタンシンを挙げることができる。
　アフィボディ(Affibody)とは登録商標である。アフィボディとはプロテインAの特定のドメインを足場にして、3つのへリックスドメインが結束した構造を有し、低解離定数で標的タンパク質（抗原）に結合する機能を有するタンパク質分子であると当業者に理解される。より詳細に記載される米国特許第5,831,012号を参照することもできる。
　ナノボディ(Nanobody)とはAblynx社の商標である。ナノボディとは、本発明の抗体医薬に含有される脂質二重膜に配置される膜貫通タンパク質に設けられた抗体結合ドメインに結合する抗体分子の典型例として、上記に説明したVHHを模倣した構造を有する抗原結合機能を有する分子であると当業者に理解される。より詳細に記載されるWO2004/041867を参照することもできる。
　ユニボディ(Unibody)とは登録商標である。ユニボディとは、当技術分野で周知であり、これは、IgG4抗体のヒンジ領域を欠く抗体断片をいう。このようなヒンジ領域の欠失によって、従来のIgG4抗体の大きさの本質的に半分であり、且つIgG4抗体の二価の結合領域ではなく一価の結合領域を有する分子であると説明できる。より詳細には、WO2007/059782の記載を参照することもできる。
　上記する本発明の抗体医薬に含有される抗体分子は、一種又は複数を組み合わせて用いることができる。
　本発明の抗体医薬は、上記する抗体結合ドメインが配置された膜貫通タンパク質を有する脂質二重膜を有するリポソーム（典型例として上記にて挙げた、上記のZZ‐BNC、LL‐BNC、LG‐BNC、又はGL‐BNC等）と、上記する抗体分子とを接触させることによって容できる。
　このようにして得られる本発明の抗体医薬の構成要素である抗体担持リポソームにおける上記する抗体分子の結合の態様は、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定はされない。具体的には、上記する抗体担持リポソームに含まれる脂質二重膜（リポソーム）の外側表面に、これが有する膜貫通タンパク質上に設けられた抗体結合ドメインを介して、上記する抗体分子が整列配置された態様で結合されることが好ましい。整列配置とは、抗体分子の配向性が一様である状態を挙げることができる。
　例えば、本発明の抗体医薬に含有される脂質二重膜（リポソーム）の外側に配置された抗体結合ドメインに結合する抗体分子が、Fc及びFvを有する抗体分子であるとき、該Fcが該脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に配置された抗体結合ドメインに結合され、Fvが該脂質二重膜（リポソーム）の外側に一様に配向した状態を挙げることができる。このような状態は、Iijima Mら、Scientific Reports 2（2012）790（5pages）に記載の方法を採用することによって確認することができる。
　より具体的には、本発明の抗体医薬の構成成分である抗体担持リポソームの抗体担持前の態様のリポソームであるZZ‐BNCは、図3(A)の模式図に示すように、該リポソームの外側に抗体分子のFvが一様に配向した状態を示す構造であると例示することができる。
　また、本発明の抗体医薬の構成成分である抗体担持リポソームの抗体担持前の態様のリポソームであるLL‐BNCは、図3(B)の模式図に示すように、リポソームの外側に抗体分子のFcが一様に配向した状態を示す構造であると例示することができる。
　そして、本発明の抗体医薬の構成成分である抗体担持リポソームの抗体担持前の態様のリポソームであるLG‐BNC及びGL-BNCは、図3(C)の模式図に示すように、ZZ-BNCの特徴であるリポソームの外側に抗体分子のFvが一様に配向した状態を示す構造と、LL-BNCの特徴であるリポソームの外側に抗体分子のFcが一様に配向した状態を示す構造とを併せ持つ
　上記する本発明の抗体医薬に含まれる脂質二重膜に配置される膜貫通タンパク質に設けられた抗体結合ドメインと、上記する抗体分子との結合は、架橋剤を用いた架橋処理によってより強固にされることもできる。
　このような架橋剤は、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。例えば、Staudingerライゲーションとして用いられる、DABCO(1,4－ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン)、3-(ジフェニルホスフィノ)プロピオン酸N-スクシンイミジル等；光反応性クロスリンカーとして用いられる、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、BASED(ビス[２-(４-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド)、4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル]安息香酸、4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル]ベンジルアルコール、4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル]ベンジルアミン塩酸塩、4‐[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル]ベンジルブロミド等；ヘテロ二官能性クロスリンカーとして用いられる、2‐メルカプトエチルアミン、N‐(2－アミノエチル)マレイミド塩酸塩、カルボキシ-PEG6‐アミン、ＮＨＳ‐PEG4‐アジド、3‐アジドプロピルアミン、4‐アジド－2,3,5,6‐テトラフルオロ安息香酸、PEG5‐アジド、アミノ-PEG3‐アジド、アジド‐PEG3‐カルボン酸、PEG4‐アジド、5‐アジド吉草酸、N‐(tert‐ブトキシカルボニル）プロパルギルアミン、3‐ブチン酸、N‐カルボベンゾキシ‐6‐アミノヘキサン酸、ジベンゾシクロオクチン－マレイミド（米国では使用不可）、ジエチレングリコールモノ(2－プロピン‐1－イル)エーテル、8‐(Fmoc‐アミノ)‐3，6‐ジオキサ-n‐オクタン酸、3‐(Fmoc‐アミノ)‐１‐プロパノール、ゲニピン((１S,２R,６S)-2-ヒドロキシ-9-(ヒドロキシメチル)-3-オキサビシクロ[4.3.0]ノナ-4,8‐ジエン‐5‐カルボン酸メチル）、グリシジル2‐プロピニルエーテル、5‐ヘキシン酸、DL‐α‐リポ酸、(R)‐α‐リポ酸、4‐マレイミド酪酸、6‐マレイミドヘキサン酸、19‐マレイミド‐17‐オキソ‐4,7,10,13－テトラオキサ-16‐アザノナデカン酸、3-マレイミドプロピオン酸、6-メルカプト-1-ヘキサノール、プロパルギル酢酸、プロパルギルアミン、N-プロパルギルマレイミド、プロパルギル-PEG5-NHS、2-[2-(プロパルギルオキシ)エトキシ]エチルアミン、2-(2-プロパルギルオキシ)エチルアミン、BCN-アミン(N-(1R,8S,9s)-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチルオキシカルボニル-1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタン)、SATP(3-(アセチルチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル)、N-アクリルオキシスクシンイミド、ANB-NOS(N-(5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシ)スクシンイミド)、4-(アジドスルホニル)安息香酸Ｎ－スクシンイミジル、ATFB-SE(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸Ｎ－スクシンイミジル)、4-ベンゾイル安息香酸N-スクシンイミジル、ブロモ酢酸N-スクシンイミジル、4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジル、ヨード酢酸N-スクシンイミジル、AMAS(N-(α-マレイミドアセトキシ)スクシンイミド)、GMBS(N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド)N-(3-マレイミドベンゾイルオキシ)スクシンイミド、N-(6‐マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド、SMCC(4‐(N‐マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸N‐スクシンイミジル)、LC‐SMCC(6‐[[4‐(Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキシル]カルボキサミド]ヘキサン酸N‐スクシンイミジル）、SMPB(4‐(4‐マレイミドフェニル)酪酸N‐スクシンイミジル)、BMPS(3‐マレイミドプロピオン酸N‐スクシンイミジル)、KMUS(11‐マレイミドウンデカン酸N‐スクシンイミジル)、メタクリル酸Ｎ－スクシンイミジル、SPDP(3‐(2‐ピリジルジチオ)プロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル)、4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン‐1‐カルボン酸3‐スルホ‐N‐スクシンイミジルナトリウム、メルカプト酢酸、トリエチレングリコールモノプロパルギルエーテル、4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル)安息香酸、4‐[3‐(トリフルオロメチル)‐3H‐ジアジリン‐3‐イル]ベンジルアルコール、４‐[3‐(トリフルオロメチル)‐3H‐ジアジリン‐3‐イル]ベンジルアミン塩酸塩、4-[3-(トリフルオロメチル）‐3H‐ジアジリン‐3‐イル)ベンジルアミン塩酸塩、10-ウンデシン酸；ヘテロ二官能性クロスリンカーとして用いられる、アジポジヒドラジド、1,2‐ビス(２‐アミノエトキシ)エタン、DFDNPS(ビス(4-フルオロ-3‐ニトロフェニル)スルホン)、BMB(1,4-ビス[マレイミド]ブタン)、1,2‐ビス(マレイミド)エタン、1,6‐ビス(マレイミド)ヘキサン、ビス(NHS)PEG5、(NHS)PEG9、1,4‐ブタンジオールジグリシジルエーテル、N-(tert-ブトキシカルボニル)-2,2'-(エチレンジオキシ）ジエチルアミン、トリエチレングリコールビス(２－アミノエチル)エーテル、ビス[2-(2-アミノエトキシ)エチル]エーテル、ビス[2-(3-アミノプロポキシ)エチルエーテル、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩、DSC(炭酸N,N'-ジスクシンイミジル)、DTSP(3,3'-ジチオジプロピオン酸ジ(Ｎ－スクシンイミジル))、スベリン酸ジ(N-スクシンイミジル)、DSS(セバシン酸ジ(Ｎ－スクシンイミジル))、3,3'-ジチオジプロピオン酸、1,2-ビス(2-プロピニルオキシ)エタン、1,2-ジグリシジルオキシエタン、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールビス(3－アミノプロピル)エーテル、ジプロパルギルエーテル、ジベンゾ[a,e]シクロオクタジエン-5,11-ジイン、BS3(ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート)等を挙げることができる。
　これらの架橋剤の中でも、BS3を用いることが好ましい。
　上記する架橋処理は、使用する架橋剤に応じた公知の条件を採用することによって実施することができる。
　本発明の抗体医薬は、薬学的に許容される担体等と組み合わせて用いることができる。このような担体等は公知のものを使用すればよく、本発明の効果を発揮する範囲であれば、特に限定されない。
　また、本発明の抗体医薬は適当な剤形とすることもできる。なお、本発明の有効成分は抗体分子であるため経口投与は好ましくない。そこで、本発明の抗体医薬の剤形は、例えば、経静脈投与などの非経口投与が可能となる剤形とすることが好ましい。
　本発明の抗体医薬は２個以上の抗体分子を含有する。よって、本発明の抗体医薬が発揮する抗原結合活性、細胞障害活性（ADCC活性又はCDC活性等）又はADCP活性等を典型例とする、抗体分子が原始的に有する機能の上記する増強の程度は、本発明の抗体医薬に含有される抗体分子数に相当する相加的な増強には止まらず、相乗的な増強となることが期待される。
　本発明の抗体医薬を使用することによって、これに含有される抗体分子の機能を増強させることができる。このような本発明が発揮する効果に基づくと、上記する本発明の抗体医薬の構成要素である抗体担持リポソームを作成する前の態様のリポソーム（典型例として上記にて挙げた、ZZ-BNC、LL-BNC、LG-BNC、及びGL-BNC等；以後、これを「担持前リポソーム」と呼ぶことがある。）に対して所定の抗体分子を結合した複合体と、担持前リポソームに結合させた該抗体分子の等モル量が発揮する効果とを比較すると、前者のほうがより高い効果を発揮することが期待される。
　以下に、本発明をより詳細に説明する実施例を示す。本発明が以下に示す実施例に限定されないのはいうまでも無い。
　以下に示す実施例1及び2にて使用する、本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNCとハーセプチン（登録商標）の複合体（本明細書にて「ZZ-BNC-ハーセプチン」と呼ぶことがある。）、及びZZ-BNCとカドサイラ（登録商標）との複合体（本明細書にて「ZZ-BNC-カドサイラ」と呼ぶことがある。）を、後記する（１）～（３）に示す手順にて作製した。
　（１）50μlのPBSバッファー中で、タンパク質量として5μgのZZ-BNCに、それぞれ抗体量（タンパク質量）として1μgのハーセプチン（トラスツズマブ、中外製薬株式会社から購入）、又はカドサイラ（トラスツズマブ-エムタンシン、中外製薬株式会社から購入）を加えて混合した。
　上記するZZ-BNCとは、上記する特許文献1～3の何れかに記載する方法に準じて作製した。
　なお、上記する条件はZZ-BNC:ハーセプチン又はカドサイラ=5:1(重量比)、モル比では1:8程度であり、結合可能と見つもられる条件は、ZZ-BNC:ハーセプチン又はカドサイラ=1:1(重量比)、モル比では1:40程度である。
　（２）上記する（１）にて得られた混合物に対し、BS3(bis（sulfosuccinimidyl）suberate)を、その最終濃度が50μMになるように追加し、これを室温にて30分間インキュベートした。
　（３）上記する（２）のインキュベート後の混合物に対し、Tris-HClバッファーを、その最終濃度が100μMになるように追加し、これを室温で10分間インキュベートした。
　最後に、上記する（３）にて得られるインキュベート後の混合物を、Sephadex G-25カラムを用いてPBSにバッファー交換し、これを後記する実験で使用するために4℃にて保存した。
＜実施例１＞in　vitroアッセイ（細胞毒性：ハーセプチン・カドサイラ）
　本発明の抗体医薬を用いた、in　vitroでの細胞毒性アッセイを行った。抗体医薬によって特定の細胞を死滅させることは、抗体分子が有する機能が増強したと判断できる。本実施例では、この様な死滅の程度を、特定のサンプルの抗体分子としての使用量を基にIC50値にて確認する実験を行った。
実験材料
　本アッセイでは、以下に示す性質を有するヒト乳がん由来細胞を使用した。
［細胞］
・SK-BR-3細胞:トラスツズマブ感受性（HER２陽性(3+)）
・MDA-MB-468細胞:トラスツズマブ非感受性（HER2陰性；ネガティブコントロール）
　上記する本アッセイで使用する各種の細胞は、37℃で5％のCO2を含む環境下で、以下に示す培地を用いて馴化した。なお、MDA-MB-468細胞は5%のCO2含まない環境下にて馴化した。馴化した各細胞を96ウェルプレートに、それぞれ1.0x104細胞／ウェルで播種した。
［培地］
・SK-BR-3細胞：McCoy's　5a培地+10％の非動化FBS
・MDA-MB-468細胞：Leibovitz's　L-15培地+10％の非動化FBS
実験手段
　上記する細胞等を用い、後記する（１）～（３）に示す手順にて細胞毒性アッセイを行った。
（１）上記する本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチン及びZZ-BNC-カドサイラをサンプルとした実験を行った。抗体部分の最終濃度がそれぞれ10nM、5nM、2.5nM、1nM、0.5nM、0.25nM、0.1nM、及び0nMとなるZZ-BNC-ハーセプチン及びZZ-BNC-カドサイラを含む100μlの培地を用意した。ここで、培地は上記する適当な培地を選択して用いた。また、ネガティブコントロールとして、ZZ-BNC、ハーセプチン、及びカドサイラをそれぞれ単独で10nM、5nM、2.5nM、1nM、0.5nM、0.25nM、0.1nM、及び0nMとなる終濃度で含む100μlの培地も同様に用意した。
　なお、本明細書にて使用する「抗体部分」との用語は、本発明の抗体医薬が含有する各種の抗体を意味し、「抗体部分濃度」とは、ある溶媒（例えば、培地等）の単位体積中に含有される、上記する本発明の抗体医薬が含有する各種の抗体分子の量（例えば、質量又は物質量等）又は、抗体分子そのもの（単独）の量であることを意味する。
（２）上記する（１）にて作製した100μlの培地を各細胞が播種された上記の96穴プレートの各ウェルに加え、72時間の37℃で5％のCO2を含む環境下での培養に供した。なお、MDA-MB-468細胞は5％のCO2含まない環境下にて72時間の培養を行った。
（３）上記する培養の終了の後、Cell Count Reagent SF（ナカライテスク）を、各ウェルに10μlで添加し、その後室温で20－100分間程度インキュベート（発色度合いに従い反応時間を決定）し、プレートリーダー（Varioskan: Thermo Scientific）で450nmの吸光度を測定した。この結果を図1に示す。
結果と考察
　図１に示す結果から、ZZ-BNC単独では、ハーセプチン（トラスツズマブ）感受性細胞であるSK-BR-3細胞に対して、何らの細胞毒性を与える結果は確認されなかった。
　また、SK-BR-3細胞に対する、ハーセプチンのIC50値は抗体部分濃度として、約10nM以上程度と見積もられた。これに対して、ZZ-BNC-ハーセプチンのIC50値は、抗体部分濃度で約1～2nM程度と見積もられた。
　これらの結果から、本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチンは従来品であるハーセプチンよりも、抗体分子の機能をより増強させることが明らかとなった。
　また、SK-BR-3細胞に対する、カドサイラのIC50値は抗体部分濃度として、約1nM程度と見積もられた。これに対して、ZZ-BNC-カドサイラのIC50値は抗体部分濃度で約0.1nMと見積もられた。
　これらの結果から、本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-カドサイラは従来品であるカドサイラよりも、抗体分子の機能をより増強させることが明らかとなった。
　なお、ネガティブコントロールであるMDA-MB-468細胞に対しては、約10nM程度の抗体部分濃度まで、何れのサンプルも何ら細胞毒性を示す結果は得られなかった。
＜実施例２＞in　vivoアッセイ（抗腫瘍：ハーセプチン・カドサイラ）
　本発明の抗体医薬を用いた、in　vivoでの細胞毒性アッセイを行った。上記する実施例１と同様に、抗体医薬によって特定の細胞を含む組織を死滅させることは、抗体分子が有する機能が増強したと判断できる。本実施例では、このような組織の死滅の程度を、担癌マウスの腫瘍サイズが本発明の抗体医薬の投与による抑制効果を確認する実験にて評価した。
実験材料
　ヒト乳がん細胞（KPL-4細胞：トラスツズマブに非感受性・HER2陽性(3+)）をDMEM+5%非動化FBSで培養した。6週令オスヌードマウス（日本SLC）の背部皮下に上記する培養後のKPL-4細胞を1.0×107細胞（100μl，50%Matrigel含有(BD)）を接種した。
　サンプルとしては、上記する実施例1にて用いた本発明の抗体医薬であるZZ-BNC-ハーセプチン並びにZZ-BNC-カドサイラ、及びネガティブコントロールとしてZZ-BNC、ハーセプチン、並びにカドサイラを用いた。
実験手段
　上記するヌードマウスにKPL-4細胞を接種してから約10日後、その腫瘍サイズが300mm3に達した時（腫瘍サイズは、（長径x(短径)2）/2で算出した）、150μlの上記サンプル（10mMのHEPES(pH7.4)、100ｍＭのNaCl、3.4%(w／w)のSucroseで懸濁した状態にする）を投与した。
　ここで、ZZ-BNC-ハーセプチンとハーセプチンは、抗体量30mg/kgを週1回で、計4回腹腔内投与した。初回以外は、15mg/kgの投与量で行った。
　また、カドサイラとZZ-BNC-カドサイラは抗体量15mg/kgで単回静注した。その後、126日間マウスの育種を続け、腫瘍サイズを測定した。この結果を図2に示す。
結果と考察
　図2に示すように、ZZ-BNC単独投与群（当該抗体量の5倍量）については、全く腫瘍増殖に対して何ら抑制効果を示さなかった。
　ハーセプチン単独投与については投与期間中（0、7、14、及び21日目）で約140mm3程度の腫瘍サイズにまで限定的に増殖抑制効果を示したが、投与期間を超えると腫瘍増殖に対する抑制効果は速やかに消失した。これは、ハーセプチンがKPL-4細胞に対して元来限定的にしか作用しないためと考えられる。
　これに対して、ZZ-BNC-ハーセプチンは投与期間（0、7、14、及び21日目）後も126日目までで約100mm3程度の腫瘍サイズにまで腫瘍増殖を抑制したものの、この腫瘍増殖抑制の程度は、後記するカドサイラ及びZZ-BNC-カドサイラを投与した時ほどの増殖抑制は観察されなかった。
　カドサイラ単独投与は強力な腫瘍増殖抑制を示し、これの投与後126日目でも約15mm3程度の腫瘍サイズを示した。しかしながら、ZZ-BNC-カドサイラを投与すると、カドサイラ単独投与を超える最も強力な腫瘍増殖抑制効果を発揮し、21日目において腫瘍は視認できなくなり、この投与後126日目でも腫瘍の再増殖は認められなかった。
　以上より、本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチン及びZZ-BNC-カドサイラは、それぞれハーセプチン及びカドサイラよりも強い腫瘍増殖抑制効果を発揮することが確認された。
＜実施例３＞in　vitroアッセイ（細胞障害活性：アバスチン）
　本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチンと同様にして作製した、ZZ-BNCとヒト型抗VEGFモノクローナル抗体であるアバスチンとの複合体（本明細書にて、これを「ZZ-BNC-アバスチン」と呼ぶことがある）のADCC活性を確認する実験を行った。具体的にはGloResponseTM NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293 cells（プロメガ）を使用し、基本的にメーカー提供のプロトコルに従い、上記するアッセイを行った。以下に、本実験の詳細を示す。
（1）ターゲット細胞の調製
　上記するキットに付属するターゲット細胞であるThe GloResponseTM NFAT-RE-luc2P HEK293 Cellを96 wellプレートに2.0x104cells/wellとなるように播種し、1% (v/v)の非働化FBSを含むDMEM培養液で馴化した。このようにして調製した96 wellプレートを37℃、CO2環境下にて16-20時間インキュベートした。
（2）ZZ-BNC-アバスチンの調製
　50μgのZZ-BNCと10μgのリツキサン（ベバシズマブ；中外製薬株式会社から購入）とを1mLのPBS(-)中で混合し、これを室温で30分間インキュベートした。このようにして得られたZZ-BNC-アバスチンをAssay buffer [1 % (v/v)の非働化FBSを含むRPMI 1640]で3倍ずつ希釈し、抗体部分の最終濃度（12ng/ｍLのアバスチンに含まれるIgG濃度に換算）が0.001μg/mlから10μg/mlとなる段階希釈系列の100μLのZZ-BNC-アバスチンの溶液を準備した。また、ネガティブコントロールとして、100μLの0.001μg/mlから10μg/mlとなる段階希釈系列となるサイラムザの溶液及びZZ-BNCの溶液を準備した。
（3）活性測定
　上記する（1）にて調製したターゲット細胞が格納されたwellに、VEGFを1ngずつ加えて室温で30分インキュベートした後、上記する（2）にて準備したZZ-BNC-アバスチンの溶液、アバスチンの溶液及びZZ-BNCの溶液を、それぞれ20μl/wellとなるように添加し、37℃、CO2環境下にて6時間インキュベートした。その後、上記キットに含有されるBio-Glo reagentを50μl/well各ｗellに添加し、これを37℃、CO2環境下にて3-5minインキュベートした。その後、上記キット含有されるAssay Reagentを75μL/wellで添加し、37℃、CO2環境下にて室温で5分間インキュベートし、これをプレートリーダー(Synergy2, BioTek)を用いて各ウェルのルシフェラーゼ活性（RLU値）を測定した。この結果を図4に示す。なお、図中の縦軸は、キットに付属するVEGFを添加した際に得られるRLU値に対するアバスチン、又はZZ-BNC-アバスチン添加時に得られるRLU値の相対値（％）を示す。
結果と考察
　図4に示すように、50%にて判断するとZZ-BNC-アバスチンはアバスチン単独よりも、約10倍程度も高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。
＜実施例４＞in　vivoアッセイ（抗腫瘍活性：アバスチン）
　実施例２のin vivoアッセイにおいて用いたZZ-BNC-ハーセプチン及びZZ-BNC-カドサイラに代えて、実施例３にて作製したZZ-BNC-アバスチンを用いた実験を行った。また、使用したヌードマウスは６週齢メスのBALB/c（日本クレア）であり、これに担持させた癌細胞はA549（約1.0×106細胞）である。
　癌細胞のサイズが150mm3となるまで癌細胞を担持するマウスを飼育した後、それぞれの抗体量が3mg/kg（等モル量）となるように、上記するZZ-BNC、アバスチン及びZZ-BNC-アバスチンを該マウスに腹腔内に９日間毎日投与を行った。また、ZZ-BNCは3mg/kgとなるように添加した。その後、実施例２と同様に癌細胞サイズを計測し、ZZ-BNC、アバスチン及びZZ-BNC-アバスチンによる効果を確認した。結果を図５に示す。
結果と考察
図５から、ZZ-BNCにアバスチンを担持させると（ZZ-BNC-アバスチン）、これと当モル量のアバスチンと比較して、明らかに腫瘍サイズを減少させる効果を発揮することが明らかとなった。実施例３では、ZZ-BNC-アバスチンによる細胞障害活性が、これと等モル量のアバスチンよりも高い効果を発揮することを実証したことから、本実施例にて実証した癌細胞のサイズが減少する効果は、細胞障害活性に基づいた効果であるといえる。
＜実施例５＞in　vitroアッセイ（細胞障害活性：サイラムザ）
　本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチンと同様にして作製した、ZZ-BNCとヒト型抗VEGFモノクローナル抗体であるサイラムザとの複合体（本明細書にて、これを「ZZ-BNC-サイラムザ」と呼ぶことがある）のADCC活性を確認する実験を行った。具体的にはGloResponseTM NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293 cells（プロメガ）を使用し、基本的にメーカー提供のプロトコルに従い、上記するアッセイを行った。以下に、本実験の詳細を示す。
（1）ターゲット細胞の調製
　上記するキットに付属するターゲット細胞であるThe GloResponseTM NFAT-RE-luc2P HEK293細胞を96wellプレートに2x104cells/wellとなるように播種し、1%(v/v)の非働化FBSを含むDMEM培養液を用いて37℃、CO2環境下にて16-20時間インキュベートした。
（2）ZZ-BNC-サイラムザの調製
　50μgのZZ-BNCと10μgのサイラムザ（ラムシルマブ；イーライ・リリー株式会社から購入）とを1mLのPBS(-)中で混合し、これを室温で30分間インキュベートした。このようにして得られたZZ-BNC-サイラムザをAssay buffer[1%(v/v)の非働化FBSを含むRPMI 1640]で3倍ずつ希釈し、抗体部分の最終濃度（12ng/ｍLのサイラムザに含まれるIgG濃度に換算）が0.001μg/mlから10μg/mlとなる段階希釈系列の100μLのZZ-BNC-サイラムザの溶液を準備した。また、ネガティブコントロールとして、100μLの0.001μg/mlから10μg/mlとなる段階希釈系列となるサイラムザの溶液及びZZ-BNCの溶液を準備した。
（3）活性測定
　上記する（1）にて調製したターゲット細胞が格納されたwellに、VEGFを1ngずつ加えて室温で30分インキュベートした後、上記する（2）にて準備したZZ-BNC-サイラムザの溶液、サイラムザの溶液及びZZ-BNCの溶液を、それぞれ20μl/wellとなるように添加し、37℃、CO2環境下にて6時間インキュベートした。その後、上記キットに含有されるBio-Glo reagentを50μl/wellで各ｗellに添加し、これを37℃、CO2環境下にて3-5minインキュベートした。その後、上記キット含有されるAssay Reagentを75μL/wellで添加し、37℃、CO2環境下にて室温で5分間インキュベートし、これをプレートリーダー(Synergy2, BioTek)を用いて各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を図6に示す。なお、図中の縦軸は、キットに付属するVEGFを添加した際に得られるRLU値に対するサイラムザ、又はZZ-BNC-サイラムザ添加時に得られるRLU値の相対値（％）を示す。
結果と考察
　図6に示すように、50%にて判断するとZZ-BNC-サイラムザはサイラムザ単独よりも、約10倍程度も高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。
＜実施例６＞in　vivoアッセイ（抗腫瘍活性：サイラムザ）
　実施例２のin vivoアッセイにおいて用いたZZ-BNC-ハーセプチン及びZZ-BNC-カドサイラに代えて、実施例５にて作製したZZ-BNC-アバスチンを用いた実験を行った。また、使用したヌードマウスは６週齢メスのBALB/c（日本クレア）であり、これに担持させた癌細胞はBxPC-3（約1.0×106細胞）である。
　癌細胞のサイズが300mm3となるまで癌細胞を担持するマウスを飼育した後、それぞれの抗体量が4mg/kg（等モル量）となるように、上記するZZ-BNC、サイラムザ及びZZ-BNC-サイラムザを該マウスに腹腔内投与した。投与回数は１週間に３回とし、計17回の投与を行った。また、ZZ-BNCは4mg/kgとなるように添加した。その後、実施例２と同様に癌細胞サイズを計測し、ZZ-BNC、サイラムザ及びZZ-BNC-サイラムザによる効果を確認した。結果を図7に示す。
結果と考察
　ZZ-BNCにサイラムザを担持させると（ZZ-BNC-サイラムザ）、これと当モル量のサイラムザと比較して、明らかに腫瘍サイズを減少させる効果を発揮することが明らかとなった。実施例５では、ZZ-BNC-サイラムザによる細胞障害活性が、これと等モル量のサイラムザよりも高い効果を発揮することを実証したことから、本実施例にて実証した癌細胞のサイズが減少する効果は、細胞障害活性に基づいた効果であるといえる。
＜実施例７＞in　vitroアッセイ（ADCC活性：リツキサン）
　本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチンと同様にして作製した、ZZ-BNCとキメラ（ヒト/マウス）抗CD20モノクローナル抗体であるリツキサンとの複合体（本明細書にて、これを「ZZ-BNC-リツキサン」と呼ぶことがある）のADCC活性を確認する実験を行った。具体的にはADCC Reporter Bioassayキット（プロメガ）を使用し、基本的にメーカー提供のプロトコルに従い、上記するアッセイを行った。以下に、本実験の詳細を示す。
（1）ADCCターゲット細胞の調製
　上記するキットに付属するADCCターゲット細胞であるWIL2-S細胞を96 wellプレートに約5.0x103 cells/wellとなるように播種し、10%(v/v)の非働化FBSを含むRPMI-1640で37℃、CO2環境下にて16-20時間インキュベートした。
（2）ZZ-BNC-リツキサンの調製
　50μgのZZ-BNCと10μgのリツキサン（リツキシマブ；中外製薬株式会社から購入）とを1mLのPBS(-)中で混合し、これを室温で30分間インキュベートした。このようにして得られたZZ-BNC-リツキサンをAssay buffer[1%(v/v)の非働化FBSを含むRPMI 1640]で3倍ずつ希釈し、抗体部分のIgG量で換算した最終濃度が0.0001μg/mlから1μg/mlとなる段階希釈系列の100μLのZZ-BNC-リツキサンの溶液を準備した。また、ネガティブコントロールとして、100μLの0.0001μg/mlから1μg/mlとなる段階希釈系列となるリツキサンの溶液及びZZ-BNCの溶液を準備した。
（3）活性測定
　上記する（1）にて調製したADCCターゲット細胞が格納されたwellに、上記するキットに含有される25μLのassay bufferを添加し、その後、上記する（2）にて準備したZZ-BNC-リツキサンの溶液、リツキサンの溶液及びZZ-BNCの溶液を、それぞれ25μl/wellとなるように添加し、ここに上記キットに含有されるAssay Bufferにて3×106cells/mlの濃度となるように懸濁したEffector細胞（Jurkat T cells）を25μl/wellで添加した。これを37℃、CO2環境下にて6時間インキュベートした。その後、上記キット含有されるAssay Reagentを75μL/wellで添加し、37℃、CO2環境下にて室温で5分間インキュベートし、これをプレートリーダー(Synergy2, BioTek)を用いて各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を図8に示す。
結果と考察
　図8に示すように、4000RLUにて判断するとZZ-BNC-リツキサンはリツキサン単独よりも、約10倍程度も高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。
＜実施例８＞in　vitroアッセイ（細胞障害活性：オプジーボ）
　本発明の抗体医薬の典型例であるZZ-BNC-ハーセプチンと同様にして作製した、ZZ-BNCとヒト型抗ヒトPD1モノクローナル抗体であるオプジーボとの複合体（本明細書にて、これを「ZZ-BNC-オプジーボ」と呼ぶことがある）の細胞障害活性を確認する実験を行った。具体的には、PD-1/PD-L1 Blockade Bioassayキット（プロメガ）を使用し、基本的にメーカー提供のプロトコルに従い、上記するアッセイを行った。以下に、本実験の詳細を示す。
（1）PD-L1発現細胞の調製
　上記するキットに付属するPD-L1発現細胞であるPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞をRecovery medium(10%(v/v)の非働化FBSを含むHam's F-12)に培地を交換し、これらの細胞を96 wellプレートに4.0x104 cells/100μL/well[10%(v/v)の非働化FBSを含むHam's F-12]を入れて細胞を播種した。またBlank wellsに80μLの培地を入れた。このように準備した96wellプレートを37℃、CO2環境下にて16-20時間培養した。
（2）ZZ-BNC-オプジーボの調製
　50μgのZZ-BNCと10μgのオプジーボ（ニボルマブ；小野薬品株式会社から購入）とを1mLのPBS(-)中で混合し、これを室温で30分間インキュベートした。このようにして得られたZZ-BNC-オプジーボをAssay buffer[1%(v/v)の非働化FBSを含むRPMI 1640]で3倍ずつ希釈し、抗体部分のIgG量で換算した最終濃度が0.001μg/mlから10μg/mlとなる段階希釈系列の100μLのZZ-BNC-オプジーボの溶液を準備した。また、ネガティブコントロールとして、100μLの0.001μg/mlから10μg/mlとなる段階希釈系列となるオプジーボの溶液及びZZ-BNCの溶液を準備した。
（3）活性測定
　上記する（1）にて調製したPD-L1発現細胞が格納されたwellに、上記する（2）にて準備したZZ-BNC-オプジーボの溶液、オプジーボの溶液及びZZ-BNCの溶液を、それぞれ40μl/wellとなるように添加し、ここに上記キットに含有される1%(v/v)の非働化FBSを含むRPMI 1640にて馴化されたPD-1 Effector細胞（Jurkat T cells）を40μl/wellで添加した。これを37℃、CO2環境下にて6時間インキュベートした。その後、上記キット含有されるBio-Glo reagent (Promega)を 40 μL/wellで添加し、37℃、CO2環境下にて3-5 minインキュベートし、これをプレートリーダー(Synergy2, BioTek)を用いて各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を図９に示す。
結果と考察
　図９に示すように、2500RLUにて判断するとZZ-BNC-オプジーボはオプジーボ単独よりも、約10倍程度も高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。
以上の本発明の抗体医薬の典型例が示す実験結果から明らかなように、本発明の抗体医薬は、これに含有される抗体分子の機能を増強させることが示唆される。
　上記する本発明は様々な態様に修飾し得ることが明らかであるといえる。このような修飾とは、本発明の趣旨から導き出される範囲から逸脱するものではなく、当業者にとって自明であろう全ての範囲の修飾を包含する。
１　Fc
２　Fv
３　脂質二重膜
４　膜貫通タンパク質
５　抗体結合ドメイン
　以下に、本明細書にて表示するアミノ酸配列を示す。

Claims (14)

  1. 　　抗体担持リポソームを含有する抗体医薬であって、該抗体担持リポソームは
    （１）1個の脂質二重膜
    （２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び
    （３）2個以上の抗体分子
    を含有し、
    該膜貫通タンパク質は該脂質二重膜を貫通し、該脂質二重膜の外側に1個以上の抗体結合ドメインが設けられ、及び該抗体分子はそれぞれ該抗体結合ドメインに結合し、
    且つ、該抗体分子が発揮する機能が、これと等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強されている、抗体医薬。
  2. 　　前記2個以上の抗体分子が、前記脂質二重膜の外側表面に整列配置されることを特徴とする、請求項1に記載する抗体医薬。
  3. 　　前記抗体分子が発揮する増強される機能が、抗原結合活性、細胞障害活性及びADCP活性からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項1又は2に記載する抗体医薬。
  4. 　　前記膜貫通タンパク質が、エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質である、請求項1～3の何れか一項に記載する抗体医薬。
  5. 　　前記ウイルス外皮タンパク質が、B型肝炎ウイルス外皮タンパク質、C型肝炎ウイルス外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス外皮タンパク質、単純ヘルペスウイルス外皮タンパク質、水痘・帯状疱疹ウイルス外皮タンパク質、及びインフルエンザウイルス外皮タンパク質からなる群より選択される少なくとも一種のウイルス外皮タンパク質である、請求項4に記載の抗体医薬。
  6. 　　前記膜貫通タンパク質がB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)である、請求項5に記載の抗体医薬。
  7. 　　前記抗体結合ドメインが、イムノグロブリンのFc、Fab、糖鎖、及びJ鎖からなる群より選択される少なくとも一種に選択的に結合する、請求項1～6の何れか一項に記載の抗体医薬。
  8. 　　前記糖鎖が、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、マンノース、フコース及びシアル酸からなる群より選択される少なくとも一種の炭糖が、少なくとも５個以上グリコシド結合した糖鎖である、請求項7に記載する抗体医薬。
  9. 　　前記抗体分子が、イムノグロブリン、その断片、及びこれらの再構築物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～８の何れか一項に記載する抗体医薬。
  10. 　　前記イムノグロブリンの断片が、F(ab')2、Fab、Fc、Fv、糖鎖、及びJ鎖から選択される少なくとも一種である、請求項9に記載する抗体医薬。
  11. 　　前記イムノグロリン又はその断片の再構築物が、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、scFv-Fc、VHH、及び多価化抗体より選択される少なくとも一種である、請求項9に記載する抗体医薬。
  12. 　　前記抗体分子が、イムノトキシン、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びユニボディからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項1～11の何れか一項に記載する抗体医薬。
  13. （１）1個の脂質二重膜
    （２）1個以上の膜貫通タンパク質、及び
    （３）2個以上の抗体分子
    を含有し、
    該膜貫通タンパク質は該脂質二重膜を貫通し、該脂質二重膜の外側に1個以上の抗体結合ドメインが設けられ、及び該抗体分子はそれぞれ該抗体結合ドメインに結合する、抗体担持リポソームを使用する工程を含む、
    該抗体分子が発揮する機能を、これと等モル量の該抗体分子が発揮する機能に比べて増強させる方法。
  14. 　　その機能が増強された抗体分子を有効成分とする抗体医薬の製造方法であって、
    1個以上の抗体結合ドメインを設けた膜貫通タンパク質を配置する1個の脂質二重膜を含有するリポソームと、2個以上の該抗体分子とを結合させる工程を含み、
    該抗体結合ドメインが該脂質二重膜の外側表面に配置される、
    製造方法。
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