WO2018169451A1 - Средство для лечения на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования - Google Patents

Средство для лечения на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования Download PDF

Info

Publication number
WO2018169451A1
WO2018169451A1 PCT/RU2018/000161 RU2018000161W WO2018169451A1 WO 2018169451 A1 WO2018169451 A1 WO 2018169451A1 RU 2018000161 W RU2018000161 W RU 2018000161W WO 2018169451 A1 WO2018169451 A1 WO 2018169451A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
ang
cdna
seq
cells
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000161
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Игорь Семенович КРОК
Наталиа САВЕЛИЕВА
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Медсервис"
Дармина Десигн Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Медсервис", Дармина Десигн Лтд filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Медсервис"
Publication of WO2018169451A1 publication Critical patent/WO2018169451A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Definitions

  • the invention relates to molecular biology, biotechnology, genetic engineering and medicine and can be used to correct the pathological conditions of cells of various organs and tissues, as well as human organs and tissues proper, associated with a decrease in the level of ANG gene expression and / or a decrease in the quantity and / or activity angiogenin protein, in particular for therapeutic purposes.
  • Angiogenesis is the process of the formation of new blood vessels in an existing vascular system. It plays an important role in the development and normal growth of tissues, wound healing, the reproductive cycle in women (development of the placenta and corpus luteum, ovulation), and is involved in the pathogenesis of various diseases.
  • neoangiogenesis is necessary for the long-term adaptation of tissues in conditions of damage. In this case, a partial influx of growth factors into the blood occurs, which is of diagnostic value. Growth factors, as a rule, are produced by non-specialized cells located in all tissues and have endocrine, paracrine and autocrine effects.
  • angiogenin protein belongs to the Ribonuclease A superfamily. It has a specific biological effect and enzymatic RNase activity, in contrast to other angiogenesis factors.
  • Angiogenin is a homologue of bovine pancreatic ribonuclease A (RNase A). The biological activity of angiogenin depends on RNase activity, which is 10 4 -10 6 lower than that of RNase A (Biochemistry 2002, 41, p. 1343). Mutations of amino acids critical for the enzymatic activity of angiogenin result in a loss of angiogenic activity.
  • angiogenin is necessary for cell proliferation induced by other proteins, such as vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • angiogenin expression can be induced by a state of hypoxia.
  • the protein encoded by the ANG gene is a powerful mediator of the formation of new blood vessels.
  • the mature peptide has antimicrobial activity against certain bacteria and fungi, including S. pneumoniae, and C. Albicans.
  • Angiogenin is one of the key proteins involved in the process of angiogenesis in normal and tumor tissues. Angiogenin interacts with actin on the surface of endothelial cells, and by endocytosis It is transported to the cell nucleus, which further leads to stimulation of the processes of cell migration, invasion and proliferation.
  • Angiogenin is also able to bind follistatin. Its in vivo activity is regulated by interaction with RNH1
  • Angiogenin is produced by various types of cells and is present in normal human plasma, promotes migration of endothelial cells, binds to them, mediates cell adhesion, promotes the formation of tubular structures and can affect vascular maturation, inducing proliferation of smooth muscle cells and fibroblasts. It is mainly expressed in the liver, and is also detected in neurons of the spinal cord. A high level of ANG expression was found in the extracellular matrix and interstitial tissue, and angiogenin was also localized in the spinal cord, endothelial cells, for example, in vascular endothelium, which indicates its role in angiogenesis. It is also known that ANGs express cells such as vascular endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, colon colon epithelium, lymphocytes and primary adenocarcinoma cells, as well as selective human tumor cell lines.
  • Angiogenin revealed neurotrophic function (Greenway MJ et al., AN mutations segregate with familial and 'sporadic' amyotrophic lateral sclerosis, Nat. Genet., 2006; N ° 38, p. 41 1 - 413 - Mutations in the angiogenin gene are isolated in familial and "sporadic" forms of amyotrophic lateral sclerosis-ALS), as well as in vascular endothelial growth factor (Lambrechts D. et al., Nat. Genet., 2003, Ns 34, p.
  • the vascular endothelial growth factor is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in mice and humans and protects motor neurons from ischemic death.), which allows us to consider neurotrophic factors among the most promising compounds for the treatment of ALS.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • the importance of angiogenin in the pathogenesis of ALS has been confirmed in experiments on mice of the B6SJL-Tg (SOD1 * G93A) dl1 Gur / J line with the G93A mutation in the SOD1 gene (Gurney M.E. et al., Science, 1994, N ° 264, C. 1772). An increase in life expectancy was shown with the introduction of recombinant angiogenin.
  • U.S. Patent Application No. 2008/0045456 shows pharmaceutical compositions based on human angiogenin, including recombinant origin (obtained from E. coli), and methods of their use for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular ALS, to reduce the manifestations of neurodegenerative processes in experimental mice and lengthen their lifespan. With such therapy, recombinant angiogenin must be administered daily.
  • drugs are known (Angiopharm, Cosmo-Genium, Angiosib, Pharmagen gels), containing recombinant human angiogenin, for which patents RU 2512527, RU 2221043 have been obtained.
  • drugs According to research data, drugs have high reparative properties due to the accelerated reconstruction of the local capillary network and the formation of granulation tissue, reduce edema and inflammation, increase local immunity in the lesion zone, and reduce the likelihood the formation of keloid scars.
  • therapy due to local application may not be effective enough and does not take into account the individual characteristics of the patient.
  • WO2009146178 A1 describes a method for the therapeutic treatment of a neurodegenerative disorder in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition comprising an isolated angiogenin polypeptide; the method allows isolated angiogenin to pass through one or both barriers - the blood-brain barrier and the blood barrier of the spinal cord; while reducing one or more symptoms of a neurodegenerative disorder in a subject.
  • the composition contains non-replicating nanoparticles, including the human angiogenin gene and the human vascular endothelial growth factor gene, cloned into two expression cassettes of the same non-replicating nanoparticle based on the human genotype 5 adenovirus genotype, the composition further comprising a formulation buffer.
  • a method of treating amyotrophic lateral sclerosis is to administer to a person a therapeutically effective dose of a pharmaceutical composition containing non-replicating nanoparticles, including the human angiogenin gene and human vascular endothelial growth factor gene, cloned into two expression cassettes of one non-replicating nanoparticle based on the human adenovirus genome 5 serotype this composition further comprises a formulation buffer.
  • the disadvantage of this approach is that when creating a gene-therapeutic agent in this invention, an adeno-associated virus is used that can integrate into the chromosome of the host cell, and also individual patient characteristics, in connection with which a group of variations for this agent may be needed.
  • the objective of the invention is to provide a highly effective means for treating the conditions of the human body associated with a decrease in the level of expression of the ANG gene and / or a decrease in the amount and / or activity of the angiogenin protein, based on gene therapeutic substances with the ANG gene, which are a group of gene therapeutic substances, when used, taking into account the individual characteristics of the patient, there is an increase in the level of expression of the ANG gene and / or an increase in the amount and / or activity of the angiogenin protein, cells of organs and tissues and / or organs and tissues of the body
  • a tool for treating the conditions of the human body associated with a decrease in the level of expression of the ANG gene and / or a decrease in the amount and / or activity of the angiogenin protein, based on gene-therapeutic substances with the ANG gene, which is at least at least one gene therapeutic substance selected from the group of gene therapeutic substances, each of which represents a genetic construct based on a vector plasmid comprising the cDNA of the ANG gene with the coding sequence the angiogenin protein, with deletions of 5 'and 3'-untranslated regions, namely, obtained on the basis of a portion of a native unmodified cDNA of the ANG gene SEQ ID No: 1, or a modified cDNA of the ANG gene, while SEQ ID No: 2, or SEQ ID No: 3, or SEQ ID No: 4, are used as a modified cDNA of the ANG gene or SEQ ID No: 5, or SEQ ID No: 6, or SEQ ID No: 7, or a
  • Each genetic construct with a modified cDNA of the ANG gene contains a nucleotide sequence that includes a protein coding region of the cDNA of the ANG gene that carries modifications that do not affect the structure of the angiogenin protein, namely, nucleotide substitutions that do not lead to amino acid substitutions or termination of the amino acid chain, or combinations of the above modifications and that do not affect the amino acid sequence encoded by this sequence.
  • a transport molecule liposomes, or dendrimers of the 5th and higher generations, or amphiphilic block copolymers are used.
  • a method of obtaining a means for treating conditions of the human body associated with a decrease in the level of expression of the ANG gene and / or a decrease in the amount and / or activity of the angiogenin protein is to obtain each gene therapeutic substance from the group of gene therapeutic substances, whereby the cDNA of the ANG gene is obtained, then cDNA and regulatory elements are placed in a vector plasmid capable of providing a high level of expression of this cDNA in cells of various human organs and tissues, and the necessary amount of substance, then the substance is combined with a transport molecule to transfect organ and tissue cells with the obtained agent and / or introduce the obtained agent into human organs and tissues, using the cDNA of the ANG gene with the coding sequence of angiogenin protein, with 5 'and 3'-untranslated deletions areas, namely, obtained on the basis of a portion of a native unmodified cDNA of the ANG gene SEQ ID No: 1, or a modified cDNA of the ANG gene, while either SEQ ID No
  • a method of using the agent for treating human body conditions associated with a decrease in the level of expression of the ANG gene and / or a decrease in the amount and / or activity of the angiogenin protein is to transfect the agent for treatment on the basis of a gene-therapeutic substance or substances selected or selected from the group of created gene-therapeutic substances, cells of organs and tissues of a patient and / or the introduction into the organs and tissues of a patient of autologous cells of a patient transfected with a created agent for treatment based on a gene-therapeutic substance or substances selected or selected from the group of created gene therapeutic substances, and / or in the introduction into the organs and tissues of a patient of a means for treatment based on a gene therapeutic substance or substances selected or selected from the group of created gene therapeutic substances, or a combination of the indicated methods.
  • the figure shows the graphs of the accumulation of products of polymerase chain reaction (PCR), corresponding to:
  • the B2M gene (Beta-2-microglobulin) shown in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as the reference gene.
  • an analysis of the change in the amount of angiogenin protein in the skin of patients is presented.
  • three variants of autologous fibroblast culture were injected into the patients - non-transfected (A), transfected with the pCMV6-XL5 vector (B) and transfected with the gene therapeutic substance with the pCMV6-ANG genetic construct SEQ ID No: 7 (C) - into the skin of the forearm.
  • the amount of angiogenin protein in intact skin was also analyzed.
  • An increase in the amount of angiogenin protein in the patient’s skin in the area of the introduction of fibroblasts transfected with the gene therapeutic substance cDNA of the ANG gene (C) was shown.
  • Fibroblast cultures of 26 patients were divided into 8 parts each from (A) to (H); the first parts (A) of patient cell cultures were transfected with the gene therapeutic substance pCMV6-v4 / VG SEQ ID No: 1, parts (B) were transfected with the gene therapeutic substance pCMV6- / WG SEQ ID No: 2, parts (C) were transfected with gene with the therapeutic substance pCMV6- / A / VG SEQ ID No: 3, part (D) was transfected with the gene-therapeutic substance pCMV6- / A / VG SEQ ID No: 4, parts (E) were transfected with the gene-therapeutic substance pCMV6- / 4 / VG SEQ ID No: 5, part (F) was transfected with the gene therapeutic substance pCMV6- / A / VG SEQ ID No: 5, part (G) was transfected with the gene therapeutic substance pCMV6- / A / VG V6-WG SEQ ID No
  • Figure 5 shows, for each group of cell cultures, indicator charts (averaged within the group if more than one cell culture is included in the group) for all genetically therapeutic substances participating in the experiment after transfection of these cell cultures with gene-therapeutic substances containing modified and native cDNA of the ANG gene.
  • Each gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances is effective in some significant group of patients. Therefore, in order to select the most effective gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances for therapeutic purposes, a preliminary personalized study of the patient is necessary,
  • the B2M gene was used as a reference.
  • the B2M gene was used as a reference. From the figure it follows that as a result of transfection, the level of specific cDNA of the ANG gene increased many times.
  • the analysis of changes in the amount of angiogenin protein in the skin is presented in the skin of a person with the introduction of a gene therapeutic substance into the skin.
  • the patient was injected with a gene-therapeutic substance containing a vector plasmid with cDNA of the ANG gene pCMV6-ANG SEQ ID No: 4 (B) and a placebo, which is a combination of the vector plasmid pCMV-XL5 not containing the cDNA of the ANG gene with the transport molecule (A, was introduced ) - in the skin of the forearm.
  • An increase in the amount of angiogenin protein was shown in the skin biopsy of patient 1B, to whom a gene therapeutic substance was introduced containing a genetic construct with cDNA of the ANG gene, which indicates the effectiveness of the gene therapeutic substance.
  • an analysis is presented changes in the amount of angiogenin protein in the oral mucosa.
  • the patient was injected with a gene therapeutic substance containing a vector plasmid with cDNA of the ANG pCDNA 3.1 gene ANG SEQ ID No: 5 (B) and a placebo pCDNA 3.1 (+) was introduced in parallel, which is a combination of a vector plasmid containing no ANG cDNA gene with a transport molecule (A) - into the oral mucosa.
  • angiogenin protein was shown in the lysate of a biopsy sample of the oral mucosa of patient 1 B, who was injected with a gene therapeutic substance containing a genetic construct with cDNA of the ANG gene, which indicates the effectiveness of the gene therapeutic substance.
  • an analysis of the change in the amount of angiogenin protein in the muscle tissue is presented.
  • the patient was injected with a gene therapeutic substance containing a vector plasmid with the ANG gene cDNA pCMV6-Kan / Neo ANG SEQ ID No: 6 (B) and a placebo pCMV6-Kan / Neo, which was a combination vector plasmid not containing cDNA of the ANG gene with the transport molecule (A) - into the muscle tissue in the area of the forearm.
  • An increase in the amount of angiogenin protein was shown in a biopsy of muscle tissue of patient 1 B, who was injected with a gene therapeutic substance containing a genetic construct with cDNA of the ANG gene, which indicates the effectiveness of the gene therapeutic substance.
  • angiogenin protein in human skin was analyzed depending on the presence and type of modifications in the cDNA gene ANG.
  • the biopsy samples selected indicators for each biopsy from each patient, which showed the maximum levels of angiogenin protein, and combined them into seven groups based on the following criteria:
  • the figure 1 1 for each group of biopsy samples shows charts of indicators (averaged within the group, if the group includes more than one biopsy) in relation to all involved in the experiment of gene-therapeutic substances, after the introduction of patients with these gene-therapeutic substances, containing modified cDNA of the ANG gene and a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene.
  • Each gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances is effective in some significant group of patients. Therefore, in order to select the most effective gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances for therapeutic purposes, a preliminary personalized study of the patient is necessary.
  • angiogenin protein was analyzed in cell lysates of this patient’s fibroblasts transfected with different genetic constructs containing a portion of the native unmodified ANG cDNA or modified ANG cDNAs.
  • angiogenin protein a variant of the gene-therapeutic substance was isolated in the patient’s fibroblast culture, the transfection of which reveals the maximum concentration of angiogenin protein.
  • the maximum concentration of angiogenin protein in the lysate is observed upon transfection with a gene therapeutic substance based on pCMV6 ANG SEQ ID No: 1 containing a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene, as shown in Figure 12.
  • the most effective gene-therapeutic substance has been selected for this patient for subsequent transfection of the patient's cells as part of a therapeutic procedure.
  • the amount of angiogenin protein in the lysates of biopsy samples of the skin of the patient was analyzed after the introduction of gene-therapeutic substances containing a portion of native unmodified ANG cDNA or sections of modified ANG cDNA.
  • angiogenin protein a variant of the gene therapeutic substance was isolated in the lysate of biopsy samples of the patient’s skin, during transfection of which the maximum protein concentration angiogenin.
  • the maximum concentration of angiogenin protein was noted with the introduction of a gene therapeutic substance based on pCMV6 ANG SEQ ID No: 7 containing a modified gene cDNA, as shown in figure 13.
  • angiogenesis proteins for example, the ANG gene
  • the ANG gene was chosen, and not the angiogenin protein encoded by this gene.
  • RNA from a cell culture for example, human skin fibroblasts, or oral mucosal epithelial cells, or corneal epithelial cells, and analysis of ANG gene expression from the genome of these cells.
  • a cell culture for example, human skin fibroblasts, or oral mucosal epithelial cells, or corneal epithelial cells
  • gene-therapeutic substances containing a portion of native unmodified ANG cDNA or modified ANG cDNA and parallel transfection of the same cell culture with a vector plasmid containing no cDNA of the ANG gene in various combinations.
  • H A comparative analysis of the amount of angiogenin protein in human organs and tissues, in particular in the mucous membrane of the oral cavity, or human muscle tissue, after the introduction of gene-therapeutic substances containing a portion of native unmodified ANG cDNA or modified ANG cDNA and placebo.
  • Unmodified cDNA of the ANG gene is a nucleotide sequence that has high homology with the nucleotide sequence of the gene and ANG mRNA shown in the GenBank database under the number NM_00 45; nucleotides 601 to 1044 are translated into the amino acid sequence of the angiogenin protein corresponding to that given in GenBank under the number NP_ NP_001136.1.
  • Total RNA is obtained from human blood cells using the PAXGeneBlood RNA Kit (Qiagen, Germany) and used to obtain total cDNA by reverse transcription using RevertAid reverse transcriptase (ThermoScientific, USA) and random 9-nucleotide primers according to the method of the manufacturer of reverse transcriptase.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • Phusion DNA polymerase ThermoScientific, USA
  • a Master CyclerGradient amplifier Eppendorf, USA
  • a reaction mixture containing 0.5 ⁇ l of total cDNA of the first chain, 0.1 ⁇ M each of the ANG F1 and ANG R1 primers, 250 ⁇ M of each deoxynucleoside triphosphate (dATP, dTCP, dTTP and dGTP), 100 mM Tris-HCI (pH 8.85 at 20 ° ⁇ ), 50 mM ammonium sulfate, 250 mM potassium chloride, 0.01% Tween-20 and 5 units.
  • Phusion DNA polymerase ThermoScientific, USA
  • a Master CyclerGradient amplifier Eppendorf, USA
  • a reaction mixture containing 0.5 ⁇ l of total cDNA of the first chain, 0.1 ⁇ M each of the ANG F1 and ANG R1 primers, 250 ⁇ M of
  • Pfu DNA polymerase (PhusionThermo Scientific, USA) under the following conditions: initial denaturation at +98 ° ⁇ for 30 sec., 35 cycles, including denaturation at +98 ° ⁇ for 10 sec., Annealing of primers at +65 ° ⁇ within 30 sec. and elongation at +68 ° C for 2 minutes.
  • the amplification product was isolated from agarose gel using the QIAquickGelExtractionKit kit (Qiagen,
  • An amplified 998 bp cDNA fragment carrying a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene is cloned in pUC19 plasmid vector (NEB, USA, cat. No. N3041 S).
  • the DNA of the vector plasmid pUC19 (NEB, USA, KaT.HOMepN3041S) is digested with restriction enzyme giving blunt ends, for example, Smal (NEB, USA) and is treated with alkaline phosphatase.
  • the amplified cDNA fragment and the linearized plasmid pUC19 are ligated with 400,000 U / ml phage T4 DNA ligase. (NEB, USA, Cat.No.
  • M0202S based on 1 ⁇ l of enzyme per 1 ⁇ g DNA Ligation is carried out in a volume of 20 ⁇ l in the presence of 2 mm ATP, 50 mm Tris-HCl, pH 7.6, 10 mm MgCI 2 , 10 mm DTT for 10 hours at + 16 ° C ⁇
  • the resulting mixture was transformed into E.coPToryu competent cells (http://molbiol.ru/protocol/03_04.html), which were plated on Petri dishes with L-agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and 40 ⁇ l per cup of solutions of 100 mM IPTG and 2% X-gal. Separate colonies are analyzed for the presence of an insert using PCR with ANG-F1 and ANG-R1 primers and confirmed by Sanger sequencing.
  • the variant cDNA of the ANG gene according to Example 1 is placed in a vector plasmid, the selection of which uses the following selection criteria:
  • the plasmid must have a bacterial selection factor (for example, an antibiotic resistance gene, or another selection factor that does not contain antibiotic resistance genes);
  • the plasmid must have the presence of eukaryotic regulatory elements - the obligatory promoter and a terminator (polyadenylation signal), for example, an enhancer and intron (s) element (s);
  • the plasmid must have a convenient polylinker for cloning.
  • An example of such a plasmid can be pCMV6-XL5, pCMV6-Kan / Neo (OriGene, USA) or pCDNA 3.1 (+) (ThermoFisher Scientific, USA), or plasmid vectors of viral origin - for example, human adenovirus of the 5th serotype.
  • the plasmid may contain nucleotide sequences with regulatory elements for replication in mammalian cells, for example, such as SV40 ori from the monkey virus SV40 or ori P / EBNA-1 from the human Epstein-Barr virus.
  • the plasmid may also contain additional regulatory elements that enhance the translation of the protein, for example, binding sites with the transcription factor NFkB, which ensures the active transport of plasmid DNA into the cell nucleus for more efficient transcription of the target gene.
  • additional regulatory elements that enhance the translation of the protein, for example, binding sites with the transcription factor NFkB, which ensures the active transport of plasmid DNA into the cell nucleus for more efficient transcription of the target gene.
  • the coding nucleotide sequence is placed under the control of the human CMV promoter CMV, effective in eukaryotic cells, and the bovine growth hormone gene polyadenylation signal.
  • This plasmid also has a bacterial selection factor, the ampicillin resistance gene, and a eukaryotic selection factor, the neomycin resistance gene.
  • the coding nucleotide sequence is placed under the control of the human cytomegalovirus CMV promoter effective in eukaryotic cells and the polyadenylation signal of the human growth hormone gene.
  • This plasmid also has a bacterial selection factor, the ampicillin resistance gene.
  • the vector plasmid pUC19- / 4 / VG with a native unmodified cDNA sequence of the ANG gene is used as a template for amplification with the following primer pairs:
  • ANG F3 GGGAATTCGCCACCATGGTGATGGGCCTGGG ANG R3 GGAAGCTTTTACGGACGACGGAAAA
  • Amplification is carried out under the conditions described in Example 1. Next, the amplification products are reprecipitated with ethanol, the precipitates are washed with 70% ethanol and dissolved in 1x TE buffer, and then subjected to restriction with endonucleases EcoRI and Hindi i I.
  • restriction products are separated by 1% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide solution and DNA fragments corresponding to the Hindlll-5'NTR-cDNA insert gene ANG-3'NTR-EcoRI or EcoRI-5'NTR-KflHK ANG-3 'NTR-Hindi II and the linearized plasmid pCMV6-XL5 and pCMV6-Kan / Neo and pCDNA 3.1 (+) are excised, isolated from the gel using a QIAquickGelExtractionKit gel isolation kit (Qiagen, Germany) and mixed. The resulting mixture of restriction fragments is ligated using T4 phage DNA ligase.
  • Ligation is carried out for 10-15 minutes at room temperature, and then at 12 ° C for 10 hours.
  • Ligation DNA is used to transform E. coli cells according to the standard method using calcium chloride. Transformed cells were selected on agar medium LB with ampicillin (100 ⁇ g / ml). Plasmid DNA was isolated from ampicillin-resistant colonies using the QiagenSpinMiniprepKit plasmid isolation kit (Qiagen, Germany), analyzed by restriction enzyme digestion with EcoRI and Hind 111, and the genetic construct (s) were selected by DNA sequencing using the Sanger method.
  • Bacteria containing the obtained genetic constructs based on the vectors pCMV6-XL5, pCMV6-Kan / Neo and pCDNA 3.1 (+) are grown on LB liquid medium with ampicillin, lysed, and plasmid DNA is isolated for transfection with a special QiagenMaxiKit plasmid isolation kit (Qiagen, Germany ) to obtain the appropriate gene-therapeutic substances.
  • a special QiagenMaxiKit plasmid isolation kit Qiagen, Germany
  • expression genetic constructs are obtained based on the vectors pCMV6-XL5, pCMV6-Kan / Neo and pCDNA 3.1 (+) containing a 444 bp nucleotide sequence obtained by deletion of 5'-untranslated and_3'-untranslated regions, with the primary structure shown in the sequence listing Seq ID No1.
  • Modifications are carried out in such a way as not to affect the primary structure of the angiogenin protein, namely, nucleotide substitutions that do not lead to amino acid substitutions or termination of the amino acid chain, and, accordingly, do not affect the amino acid sequence encoded by this sequence.
  • modified cDNA of the ANG gene in order to increase the efficiency of transcription and translation of angiogenin protein, in cells of human tissues and organs, modifications are made to the region of the native cDNA sequence of the ANG gene using the codon optimization principle by replacing minor codons with synonymous major ones so that substitutions did not lead to changes in the amino acid sequence of the protein or a break amino acid chain during translation, did not worsen the processes of transcription and translation.
  • modified cDNA ANG SEQ ID No. 2 conduct sequential PCR mutagenesis on plasmids pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1, pCMV6-Kan / Neo-ANG Seq ID No1 and pCDNA 3.1 (+) - ANG Seq ID No1 with primers complementary to the regions of the native ANG cDNA shown in GenBank under NM_001145:
  • nucleotide sequence of the ANG cDNA thus modified SEQ ID No: 2 contains 1 GC substitution at position 663, which does not lead to changes in the amino acid sequence of the protein encoded by the ANG gene sequence and has the primary structure listed in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence of the ANG SEQ ID No: 3 cDNA thus modified contains 1 nucleotide substitution G-> C at position 663, and one nucleotide substitution A-> G at position 921; not leading to changes in the amino acid sequence of angiogenin protein, and has a primary structure listed in the sequence listing.
  • sequential PCR mutagenesis is carried out on plasmids pCMV6-XL5-ANG Seq ID No. 1, pCMV6-Kan / Neo-ANG Seq ID No. 1 and pCDNA 3.1 (+) - ANG Seq ID No. 1 with primers complementary sections of native ANG cDNA shown in GenBank under the number NM_001 145:
  • the nucleotide sequence of the ANG cDNA thus modified SEQ ID No: 4 contains 1 nucleotide substitution G-> C at position 663, 2 nucleotide substitutions A-G at positions 879, 921; 1 nucleotide substitution AC at position 885, which does not lead to changes in the amino acid 15 sequence of the angiogenin protein, and has the primary structure listed in the sequence listing.
  • nucleotide sequence of the ANG cDNA thus modified contains 2 nucleotide substitutions G-> C at position 663, 966; 3 nucleotide substitutions A-> G at positions 879, 921, 957; 1 nucleotide substitution A-> C at position 885, which does not lead to changes in the amino acid sequence of the angiogenin protein, and has the primary structure shown in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence of the ANG cDNA thus modified SEQ ID No: 6 contains 2 nucleotide substitutions G-> C at positions 663, 966; 4 nucleotide substitutions of A-G at positions 879, 921, 957, 1005; 1 nucleotide substitution A-> C at position 885, 1 nucleotide substitution T-> C at position 1003; not leading to changes in the amino acid sequence of angiogenin protein, and has a primary structure listed in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence of the ANG cDNA thus modified, SEQ ID No: 7, contains 2 nucleotide substitutions G-> C at position 663, 966; 4 nucleotide substitutions of A-G at positions 879, 921, 957, 1005; 1 nucleotide substitution A-> C at position 885, 1 nucleotide substitution T-> C at position 1003; and 2 nucleotide substitutions T-> G at positions 1035 and 1038; not leading to changes in the amino acid sequence of angiogenin protein, and has a primary structure listed in the sequence listing.
  • expression vectors based on plasmids pCMV6-XL5, pCMV6-Kan / Neo and pCDNA 3.1 (+) are obtained in which a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 1) and the modified nucleotide sequences of the cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 2, 3, 4, 5, 6, 7) encoding an angiogenin protein.
  • Bacteria containing the obtained genetic constructs based on the vectors pCMV6-XL5, pCMV6-Kan / Neo and pCDNA 3.1 (+) are grown on LB liquid medium with ampicillin, lysed, and plasmid DNA is isolated for transfection with a special QiagenMaxiKit plasmid isolation kit to obtain the corresponding genes -therapeutic substances.
  • the resulting expression vectors are used to obtain gene-therapeutic substances based on them, which are subsequently used for transfection of eukaryotic cells of organs and tissues and / or introduction into human organs and tissues.
  • control plasmids the original vector pCMV6-XL5, (pCMV6-Kan / Neo) or pCDNA 3.1 (+) without insertion of the ANG gene cDNA is used.
  • Example 3 transform bacterial E. coli cells (T. Maniatis et al. Molecular Cloning. M., Mir, 1984) and the obtained bacterial clones are grown, containing the construct, in the presence of a bacterial factor for selection of ampicillin resistance.
  • the ligase mixture of Example 3 is used to transform competent E. coli cells of strain XLblue. Preliminary selection of clones containing the ANG gene cDNA insert in the correct orientation and a single copy is carried out by hydrolysis of plasmid DNA with restriction enzymes EcoRI and Hind 111 and analysis of restriction products by electrophoresis in 1.2% agarose gel. The selected clones are used for preparative growth of plasmid DNA with the aim of further transfection into fibroblast cultures (epithelial cells of the oral mucosa, or epithelial cells of the cornea of the eye, etc.).
  • Epitheasy 3.5 takes a skin biopsy sample from a zone protected from ultraviolet radiation, for example, behind the auricle or from the side inner surface in the area of the elbow joint, about 3 mm in size, weighing up to 20 mg.
  • the patient’s skin was pre-washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the primary cell culture was grown on Petri dishes at 37 ° C in an atmosphere containing 5% C0 2 in DMEM medium with 10% fetal calf serum and ampicillin 100 U / ml.
  • Trypsinization and reseeding is performed every 5 days; for trypsinization, the cells were washed with PBS and incubated for 30 minutes at 37 ° C in a solution containing 0.05% trypsin and 1 mM EDTA. To neutralize trypsin 5 ml of culture medium was added to the cells and the suspension was centrifuged at 600 rpm for 5 minutes. Fibroblast culture growth after 4-5 passages was carried out in 75 ml culture bottles in a medium containing 10 g / l DMEM, 3.7 g / l Na 2 C0 3 , 2.4 g / l HEPES, 10% fetal serum and 100 U / ml ampicillin . The culture medium was changed every 2 days. The total duration of culture growth did not exceed 25-30 days. An aliquot containing 10 6 cells was selected from the cell culture.
  • the part of the fibroblast culture intended for RNA isolation followed by analysis of the ANG gene transcription was centrifuged at 1000 rpm for 20 minutes and washed twice in PBS buffer by centrifugation at 600 rpm for 5 minutes. Then the cells were resuspended in 1.5 ml of the stabilizing reagent RNAIater and stored at 4 ° C for 10 days for subsequent RNA isolation.
  • RNA isolation was performed using the RNeasyMiniKit kit. (Qiagen, Germany). The isolated RNA was analyzed spectrophotometrically, measuring the ratio of optical density at 260 and 280 nm, as well as by capillary electrophoresis on a QIAxcel instrument (Qiagen, Germany) using an RNA Qiality Control cartridge. For further work, we used only those samples for which the total amount of isolated RNA was not less than 50 ⁇ g RNA, the ratio of D260: D280 was not less than 1, 8, and the ratio of the 28S: 18S bands on capillary electrophoresis was not less than 1: 1.
  • Analysis of the expression of the ANG gene from the fibroblast genome is carried out in order to subsequently correctly determine the gene therapeutic effect after transfection of these cells with genetic constructs with cDNA of the ANG gene.
  • Isolated RNA is analyzed by real-time PCR (SYBR GreenRealTimePCR).
  • SYBR GreenRealTimePCR For amplification of cDNA (265-338 n.p.) specific for the ANG gene, the direct primer ANG FA1 5 'CACAGAGAAAACCTAAGAATAAGCAA 3' is used
  • the length of the amplification product is -74 nucleotide.
  • the beta-2-microglobulin B2M gene is used as the reference gene, the expression level of which in fibroblasts is comparable to that normal for the ANG gene.
  • PCR amplification is performed using the SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, USA) or another real-time PCR kit in 20 ⁇ l amplification mixture containing: 25 ⁇ l QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2.5 mM magnesium chloride, 0.5 ⁇ m of each primer, 5 ⁇ l of total RNA.
  • the reaction is carried out on a CFX96 amplifier (Bio-Rad, USA) under the following conditions: 1 reverse transcription cycle at 50 ° C for 30 minutes, denaturation 98 ° C for 15 minutes, then 40 cycles including denaturation 94 ° C for 15 seconds, primer annealing at 59 ° ⁇ - 30 sec. and elongation of 72 ° C for 30 sec.
  • a positive control the concentration of amplicons obtained by PCR on matrices representing plasmids at known concentrations containing cDNA sequences of the ANG and B2M genes is used.
  • a negative control deionized water is used (PCR accumulation curves of the products of negative and positive controls are not shown in FIG. 1 to simplify visualization).
  • the number of PCR products - cDNA of the ANG and B2M genes obtained as a result of amplification, is estimated in real time using the software of the Bio-RadCFXManager 2.1 amplifier.
  • Example 6 To evaluate the effectiveness of the gene therapeutic substance containing the unmodified cDNA of the ANG gene according to Example 3, the primary human fibroblast culture with reduced ANG expression selected in Example 6 is transfected with this gene therapeutic substance.
  • This fibroblast culture is grown in culture bottles (25 cm 2 ) until the cells cover 50-70% of the surface of the bottle.
  • the resulting cells are transfected with a gene therapeutic substance based on pCMV6-ANG SEQ ID No: 1 in the presence of a transport molecule (eg, dendrimer) and pCMV6-XL5 vector as a control.
  • a transport molecule eg, dendrimer
  • a 6-well plate with DMEM medium with 10% fetal calf serum (1.6 ml per well) was seeded fibroblasts at the rate of 1-4 x 10 5 cells per well. Cells were incubated for 18 hours at 37 ° C and in an atmosphere containing 5% CO 2 . Then, 2 ⁇ g of plasmid DNA was dissolved in serum-free DMEM with Tris-HCI buffer 20 mM with 1 mM EDTA, pH 7-8 (minimum DNA concentration - 0.1 ⁇ g / ⁇ l). The final volume of the mixture was 100 ⁇ l.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent dendrimer solution (Qiagen, Germany) was used as a transport molecule.
  • the culture medium was added and incubated for 24-48 hours at 37 ° ⁇ and in an atmosphere containing 5% ⁇ 0 2 , after which they were evaluated the cDNA level of the ANG gene and the control cDNA of the B2M gene using real-time amplification as described in example 6. The results of the analysis are shown in figure 2.
  • Protein angiogenin has enzymatic and biological activity, which are interconnected. Since its RNA activity is rather low, its study is intermittent (Biochemistry 2002, 41, 1343), and the lack of commercial standardized methods makes it difficult to conduct studies of angiogenin activity in patients with pathological conditions associated with hypofunction of this protein, providing a stable reproducible result.
  • angiogenin protein The biological activity of the angiogenin protein is known to be associated with the mechanism of angiogenesis induction by the interaction of receptor proteins (for example, a-actin) of endothelial target cells with a certain dose of angiogenin. Also, at certain concentrations, angiogenin stimulates fibrinolysis mediated by endothelial cells and cell-associated proteolytic activity, which are components of angiogenesis (http://rnedbiol.ru/medbiol/angiogenin/00009e6f.htm).
  • a human skin fibroblast culture according to Example 5 as the transport molecule of the 6th generation SuperFect Transfection Reagent dendrimers (Qiagen, Germany), and as an control, an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (A), vector plasmid pCDNA 3.1 (+), which does not contain the cDNA of the ANG gene (B), as transfected agents - gene therapeutic substance based on the vector plasmid pCDNA 3.1 (+) containing the cDNA of the ANG gene - pCDNA 3.1 ANG EQ ID No: 1 (C).
  • Preparation of the DNA dendrimer complex and transfection of fibroblasts was performed according to Example 7.
  • ANG cDNA product was used to quantify the target protein. Quantification of the ANG cDNA product was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA) according to the manufacturer's methodology http://www.abcam.com/ps/products/99/ab99970/documents/ab9 9970 Anqioqenin% 20 (ANG)% 20 Human% 20 ELISA Kit% 20v3% 2Q (website) .pdf The optical density of the samples was measured at a wavelength of 450 nm using a ChemWell automatic biochemical and enzyme immunoassay (Awareness TechNology Inc., USA) and is proportional to the protein concentration ANG in the sample.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration is determined using a calibration curve constructed using calibrators with a known concentration of ANG protein, which is part of the kit. The difference between the optical density (OD) values of the calibrators supplied in triplicate did not exceed 10%.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and visualization of data R, version 3.0.2 (https://www.r-proiect.org/).
  • the preparation of a suspension of liposomes was carried out according to the method of the manufacturer (Promega, TransFast Transfection Reagent, Instruction for Use of Product, E2431) with some changes: 0.4 ml of Nuclease-Free grade sterile water was added to 0.4 mg of liposome powder. The suspension was mixed well by shaking. The resulting intermediate product of the suspension of liposomes was kept for 18 hours at a temperature of -20 ° C, then thawed at room temperature, resuspended by shaking or on a table mixer type "VORTEX".
  • DNA liposome complex 400 ⁇ l of plasmid DNA solution (with a concentration of 150 ⁇ g / ml) was added to 400 ⁇ l of liposome solution (with a concentration of 1 mg / ml) and mixed thoroughly. Then, the DNA – liposome mixture was incubated for 5–10 minutes at a temperature of 15–25 ° ⁇ and was further used as a gene-therapeutic substance.
  • the medium was carefully selected from the wells of a cell culture plate (without disturbing the cell layer) and the cells were washed with 3 ml of PBS buffer.
  • a solution containing DNA liposime complexes 600 ⁇ l of fetal serum DMEM medium was added and this mixture was transferred to the wells of a cell plate.
  • Cells were incubated with complexes for 2-3 hours at 37 ° C and in an atmosphere containing 5% C0 2 . Then the medium was carefully removed and the cell layer was washed with 3 ml of PBS buffer. Then added the culture medium and incubated 24-48 hours at 37 ° C in an atmosphere containing 5% C0 2 .
  • Part of the cell culture was centrifuged at 700 rpm, the cells were washed twice with physiological saline, resuspended in physiological saline at the rate of 1 million cells in 200 ⁇ l and used for administration to the patient.
  • the introduction was carried out by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm. Foci of introducing fibroblast cultures were located at a distance of 3-5 cm from each other.
  • angiogenin protein was performed in lysates of biopsy samples of the patient’s skin by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Biopsy samples were taken 3 days after the introduction of a suspension of fibroblasts.
  • a biopsy was performed from the injection sites of the fibroblast suspension, as well as from the intact skin, using an Epitheasy 3.5 skin biopsy device (MedaxSRL).
  • the patient’s skin was pre-washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the size of the biopsy sample was about 3 mm, and the mass was up to 20 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCI pH 7.6, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized to obtain a uniform suspension.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 minutes at 14,000 rpm. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • the effectiveness of the gene therapeutic substance was shown to introduce fibroblasts into the human skin transfected with the obtained gene therapeutic substance carrying the modified cDNA of the ANG gene, which leads to an increase in the level of expression of the ANG gene in the skin in the injection zone.
  • sequences of the native unmodified ANG gene cDNA region are shown in the sequence list, SEQ ID No: 1.
  • the modified ANG gene cDNA sequences are listed in the sequence list (SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No : 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7).
  • Fibroblast cultures were grown from the same skin biopsy samples taken from the inner lateral surface area in the elbow joint area of 26 patients randomly selected in Example 5, aliquots were selected and the level of angiogenin protein was evaluated in cell lysates.
  • a cell pellet corresponding to 2 x 10 6 cells was washed with phosphate buffer and resuspended in ice in a lysis buffer containing 25 mM HEPES pH 7.9, 100 MMNaCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-00, 10% glycerol and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. The lysate was centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm, protein concentration in the supernatant was determined by the Bradford method ([Bradford M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.]).
  • each of the 18 fibroblast cultures was divided into 8 parts.
  • One part, designated (A) was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 1 vector containing unmodified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 1.) according to Example 2 in combination with a transport molecule - dendrimer as in example 7.
  • the second part, designated (B), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 2 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 2.) According to Example 3 in combination with a transport molecule - dendrimer as in example 7.
  • the third part, designated (C), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 3 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 3.) According to Example 3 in combination with a transport molecule - dendrimer according to example 7.
  • the 4th part, designated (D), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 4 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 4.) According to Example 3 in combination with a transport molecule - dendrimer according to example 7.
  • the 5th part, designated (E), was transfected according to example 7 with a gene-therapeutic substance based on vector pCMV6-SEQ ID No: 5, containing the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 5.) of Example 3 in combination with the transport molecule dendrimer of Example 7.
  • the 6th part, designated (F), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 6 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 6.) According to Example 3 in combination with a transport molecule - dendrimer according to example 7.
  • the 7th part, designated (G), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 7 vector containing the modified version of the ANG gene cDNA variant (SEQ ID No: 7.) According to Example 3 in combination with a transport molecule dendrimer according to example 7.
  • the 8th part, designated (H), was transfected according to Example 7 with the vector plasmid pCMV6-XL5 that did not contain the ANG cDNA of Example 3 in combination with the transport molecule dendrimer of Example 7.
  • angiogenin protein was performed in lysates of biopsy samples of the patient’s skin by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • indicators were selected for each part of the cell culture from each patient, which demonstrated maximum expression levels and combined them into seven groups, based on the following criteria:
  • the figure 5 for each group of cell cultures shows diagrams of indicators of concentrations of angiogenin protein (averaged within the group, if the group includes more than one cell culture) for all involved in the experiment of gene-therapeutic substances, after transfection of these cell cultures gene-therapeutic substances containing modified and a portion of the native cDNA of the ANG gene.
  • Each gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances is effective in some significant group of patients. Therefore, in order to select the most effective gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances for therapeutic purposes, a preliminary personalized study of the patient’s biopsy specimens, or cells grown from these biopsy specimens is required maximum effectiveness of therapeutic effects created by gene-therapeutic substances within the group of gene-therapeutic substances.
  • Example 1 1.
  • Biopsy material from the limb region in the form of a circle with a diameter of 1-1.5 mm was placed in a Petri dish in a balanced Hanks saline solution, dispase (20 ⁇ l 25 u / ml) and gentamicin were added and incubated for 24 hours at +4. Then the epithelial layer was separated from the stroma and both tissues were cut into pieces of 1 -2 mm 3 .
  • a suspension of epithelial cells was obtained by incubating pieces of tissue in a solution of Trypsin-EDTA for 15 minutes at + 37 ° C. Trypsinization was stopped by the addition of a soybean trypsin inhibitor in PBS. Cell suspensions were washed by centrifugation at 700 rpm and resuspended in serum-free DMEM with gentamicin. Cells were grown in 25 cm 2 vials with 5 ml of medium at 37 ° C and in an atmosphere containing 5% CO2. After 24 hours, non-adherent cells were removed and 5 ml of fresh medium was added. Reseeding was performed every 7 days in a ratio of 1: 2 - 1: 3.
  • Transfection of this cell culture was performed with a plasmid-based gene therapeutic substance pCMV6-Kan / Neo ANG SEQ ID No: 2, using PAMAM dendrimers (Weihai CY Dendrimer Technology) as a transport molecule.
  • PAMAM dendrimers Weightihai CY Dendrimer Technology
  • the plasmid pCMV6-Kan / Neo without ANG gene cDNA was used as a control.
  • RNA isolation was performed using the RNeasyMiniKit kit (Qiagen, Germany). RNA samples were grouped into 3 groups of 8 samples with a similar concentration and combined.
  • the analysis of the level of specific cDNA of the ANG gene was carried out using real-time amplification according to the method and with the primers of Example 6 using the iTaqUniversalSYBRGreenSupermix reagent kit (Bio-Rad, USA), CFX96 amplifier (Bio-RadUSA) and Bio-RadCFXManager 2.1 software. The maximum increase in the expression (transcription) of the ANG gene was observed on day 3.
  • Figure 6 shows the accumulation curves of a specific amplification product corresponding to the cDNA of the ANG gene in corneal epithelial cells.
  • Example 12 Transfection of the cell culture of the epithelium of the oral mucosa with a gene-therapeutic substance in order to confirm the increase in the expression of the ANG gene in this cell culture.
  • the epithelium of the human oral mucosa was transfected using amphiphilic block copolymers as a transport molecule .
  • Biopsies of the mucous membrane of the oral cavity weighing 40 mg were crushed into fragments up to 10 mm 3 .
  • the primary cell culture was grown on Petri dishes at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO2 in DMEM medium with 10% fetal calf serum and ampicillin 100 U / ml. Trypsinization and reseeding is performed every 5 days; for trypsinization, the cells were washed with PBS and incubated for 30 minutes at 37 ° C in a solution containing 0.05% trypsin and 1 mM EDTA. To neutralize trypsin, 5 ml of culture medium was added to the cells and the suspension was centrifuged at 600 rpm for 5 minutes.
  • the growth of the epithelial cell culture after 4-5 passages was carried out in 75 ml culture bottles in a medium containing 10 g / L DMEM, 3.7 g / L Na2C03, 2.4 g / L HEPES, 10% fetal serum and 100 U / ml ampicillin.
  • the culture medium was changed every 2 days. The total duration of culture growth did not exceed 25-30 days. An aliquot containing 105 cells was selected from the cell culture.
  • Amphiphilic block copolymers were used to transfect cells with a gene therapeutic substance containing the cDNA of the ANG gene.
  • the methodology was applied according to (IntJPharm, 2012, 427, 80-87) or in (Macromol. Biosci.201 1, 11, 652-661), with some changes.
  • the block copolymer was synthesized from a mixture of linear polyethyleneimine (PEI) (Polyscience Inc., USA) and bifunctional polyethylene glycol (PEG) 1 ⁇ 1-hydroxysuccinimidyl-75-Y- (3-maleimidopropionyl) -amido-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73 - tetracosoxapenta-heptacontanoate (MAL-dPEG TM -NHS ester, Quanta BioDesign, Ltd., USA) in borate buffer.
  • PEI linear polyethyleneimine
  • PEG bifunctional polyethylene glycol
  • a polyplex was prepared 1 hour before the introduction into the cells by mixing the solution of the block copolymer with DNA of the genetic construct pCMV6-Kan / Neo ANG SEQ ID No: 3 with the modified cDNA of the ANG gene SEQ ID No: 3.
  • the transfection mixture was added to the cell suspension in 1 ml of DMEM culture medium with 10% fetal serum and ampicillin.
  • RNA isolation was performed using a kit RNeasyMiniKit (Qiagen, Germany). RNA samples were grouped into 3 groups of 8 samples with a similar concentration and combined.
  • the patients were injected with a gene therapeutic substance containing a genetic construct with cDNA of the ANG gene (B) and were simultaneously administered a placebo, which is a combination of a vector plasmid not containing cDNA of the ANG gene with the transport molecule (A) into the skin of the forearm.
  • TRANSFAST TM Transfection Reagent liposome powder (PROMEGA, USA) was used according to Example 9.
  • the genetic construct pCMV6 ANG SEQ ID No: 4 which contains the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 4) and plasmid pCMV6-XL5, used as a placebo - which does not contain cDNA of the ANG gene, each of which was dissolved in sterile water with a Nuclease-Free purification grade.
  • DNA liposome complexes were prepared according to Example 9.
  • the resulting gene therapeutic substance and placebo were used for administration to a patient.
  • the introduction was carried out by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene-therapeutic substance and placebo is about 0.3 ml for each.
  • the foci of the introduction of the gene-therapeutic substance and placebo were located at a distance of 3-5 cm from each other.
  • angiogenin protein was performed in lysates of biopsy samples of the patient’s skin by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Biopsy samples were taken 3 days after the introduction of the gene-therapeutic substance. A biopsy was performed from skin areas in the area of the introduction of the gene-therapeutic substance and placebo, as well as from intact skin using an Epitheasy 3.5 biopsy grader (Medax SRL) further as described in Example 9.
  • Medax SRL Epitheasy 3.5 biopsy grader
  • TRANSFAST TM Transfection Reagent liposome powder (PROMEGA, USA) according to Example 9 was used.
  • DNA liposome complexes were prepared according to Example 9.
  • the resulting gene therapeutic substance and placebo were used for administration to a patient.
  • the introduction was carried out by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 1 - 2.
  • the volume of the injected solution of the gene-therapeutic substance and placebo was about 0.3 ml for each.
  • the foci of the introduction of the gene-therapeutic substance and placebo were located at a distance of 2 - 4 cm from each other.
  • Angiogenin protein was quantified in lysates of biopsy samples of the patient's oral mucosa by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Biopsy samples were taken 3 days after the introduction of the gene-therapeutic substance. A biopsy was performed from areas of the oral mucosa in the area of the introduction of the gene-therapeutic substance, as well as from the intact areas and in the area of the placebo, using the Epitheasy 3.5 biopsy device (Medax SRL), further according to Example 9.
  • TRANSFAST TM Transfection Reagent liposome powder (PROMEGA, USA) was used as in Example 9.
  • DNA liposome complexes were prepared according to Example 9.
  • the resulting gene therapeutic substance and placebo were used for administration to a patient.
  • the introduction was carried out by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 15–20 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene-therapeutic substance and placebo is about 0.5 ml for each.
  • the foci of the introduction of the gene-therapeutic substance and placebo were located at a distance of 5 -7 cm from each other
  • angiogenin protein was carried out in lysates of biopsy specimens of the patient’s muscle tissue by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Biopsy samples were taken 3 days after the introduction of the gene-therapeutic substance. A biopsy was performed from muscle tissue in the area of the introduction of the gene-therapeutic substance, as well as from intact areas of the muscle and in the placebo, using the MAGNUM automatic biopsy device (company BARD, USA), hereinafter in Example 9.
  • sequence of the portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene is shown in the sequence list, SEQ ANG ID No: 1, the sequences of the modified cDNA of the ANG gene are shown in the sequence list (SEQ ANG ID No: 2, SEQ ANG ID No: 3, SEQ ANG ID No: 4, SEQ ANG ID No: 5, SEQ ANG ID No: 6, SEQ ANG ID No: 7).
  • genetic constructs one of which contains a portion of the native unmodified ANG cDNA of the gene (SEQ ID No: 1), the second genetic construct contains a portion of the modified ANG cDNA of the gene (SEQ ID No: 2), the third genetic construct contains the modified ANG cDNA of the gene (SEQ ID No: 3), the fourth genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 4), the fifth genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 5), the sixth genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 6), the seventh genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 7), the eighth genetic construct (placebo), is a vector pCMV6 XL5 dissolved in sterile water with a Nuclease-Free purification grade.
  • DNA complexes were prepared in combination with transport molecules - liposomes according to Example 9.
  • the resulting seven variants of gene therapeutic substances and a placebo were used for administration to the skin of patients.
  • the introduction was carried out by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm.
  • the volume of the injected solution of each gene therapeutic substance was about 0.3 ml.
  • the foci of the introduction of gene-therapeutic substances and placebo were located at a distance of 3-5 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken 72 hours after the introduction of gene-therapeutic substances.
  • the biopsy was performed from the sites of the introduction of gene therapeutic substances, placebo, as well as from intact skin, using the Epitheasy 3.5 skin biopsy device (Medax SRL).
  • the patient’s skin was pre-washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution. Each size the biopsy sample was about 3 mm, weight up to 20 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCI pH 7.6, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and homogenized to obtain a uniform suspension.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 minutes at 14,000 rpm. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • Example 3 D - biopsy obtained after the introduction of a gene therapeutic substance based on pCMV6-SEQ ID No: 4, containing the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 4.) According to Example 3 in combination with the transport molecules - liposomes according to Example 9.
  • E is a biopsy obtained after the introduction of a gene therapeutic substance based on pCMV6-SEQ ID No: 5, containing a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 5) according to example 3 in combination with transport molecules - liposomes according to example 9.
  • F - biopsy obtained after the introduction of a gene therapeutic substance based on pCMV6-SEQ ID No: 6, containing the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 6) according to Example 3 in combination with the transport molecules - liposomes according to Example 9.
  • G is a biopsy obtained after the introduction of a gene therapeutic substance based on pCMV6-SEQ ID No: 7, containing the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 7.) According to Example 3 in combination with the transport molecules - liposomes according to Example 9.
  • H is a biopsy obtained after the introduction of the vector plasmid pCMV6-XL5 that does not contain the cDNA of the ANG gene according to example 3 in combination with transport molecules - liposomes according to example 9.
  • Angiogenin protein was quantified in nine skin biopsies from each patient (A to H and in intact skin biopsy) 72 hours after the administration of gene therapeutic substances by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, United States), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • indicators were selected for each biopsy from each patient, which showed the maximum levels of angiogenin protein and combined them into seven groups, based on the following criterion: In group 1, the maximum amount of angiogenin protein was observed with the introduction of unmodified cDNA of the ANG gene SEQ ID No: 1. This group included 7 biopsies out of 31.
  • Each gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances is effective in some significant group of patients. Therefore, in order to select the most effective gene-therapeutic substance from the group of gene-therapeutic substances for therapeutic purposes, a preliminary personalized study of the patient’s biopsy samples, or cells grown from these biopsy samples for the maximum effectiveness of the therapeutic effect created by the gene-therapeutic substances within the group of gene-therapeutic substances is necessary. therapeutic substances.
  • Example 17 Transfection of the patient’s fibroblast cell line with various therapeutic genes containing modified ANG cDNA and a portion of the native unmodified ANG cDNA to personalize the most effective gene therapeutic substance from the group of gene therapeutic substances for this patient to subsequently transfect this patient cell substance as part of a therapeutic procedure.
  • angiogenin protein was analyzed in cell lysates of the patient’s fibroblasts transfected with different gene therapeutic substances containing a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene and / or modified cDNA of the ANG gene.
  • sequence of the portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene is shown in the sequence list, SEQ ANG ID No: 1, the sequences of the modified cDNA of the ANG gene are shown in the sequence list (SEQ ANG ID No: 2, SEQ ANG ID No: 3, SEQ ANG ID No: 4, SEQ ANG ID No: 5, SEQ ANG ID No: 6, SEQ ANG ID No: 7).
  • Fibroblast cultures from the patient’s biopsy were grown according to Example 5, aliquots were taken and cell lysis was performed: a cell pellet corresponding to 2 x 10 6 cells was washed with phosphate buffer and resuspended in ice in a lysis buffer, containing 25 mm HEPES pH 7.9, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol and 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride. The lysate was centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm.
  • the patient’s fibroblast culture was divided into 8 parts.
  • the first part, designated (A) was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 1 vector containing a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 1.) according to Example 3 in combination with transport molecules - liposomes according to example 9.
  • the second part, indicated by (B), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 2 vector containing a portion of the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 2.) According to Example 3 in combination with transport molecules - liposomes of example 9.
  • the third part, labeled (C) was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on pCMV6-SEQ ID No: 3 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 3.) According to Example 3 in combination with liposome transport molecules as in example 9.
  • the fourth part, designated (D), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 4 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 4.) According to Example 3 in combination with liposome transport molecules as in example 9.
  • the fifth part, designated (E), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 5 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 5.) According to Example 3 in combination with liposome transport molecules as in example 9.
  • the sixth part, designated (F), was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 6 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 6.) according to Example 3 in combination with liposome transport molecules as in example 9.
  • the seventh part was transfected according to Example 7 with a gene therapeutic substance based on the pCMV6-SEQ ID No: 7 vector containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 7.) According to Example 3 in combination with liposome transport molecules as in example 9.
  • the eighth part, designated (H), was transfected according to Example 7 with the vector plasmid pCMV6-XL5 that did not contain the ANG gene cDNA according to Example 3 in combination with the liposome transport molecules of Example 9.
  • Determination of the amount of angiogenin protein in the cell lysates of the patient’s fibroblasts was performed 72 hours after transfection by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8. According to the results of determining the angiogenin protein, a variant of the gene therapeutic substance was isolated in the patient’s fibroblast culture, during transfection of which the maximum amount of angiogenin protein is observed in the cell culture lysate and, accordingly, the maximum expression of the ANG gene is observed.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the most effective gene-therapeutic substance has been selected for this patient for subsequent transfection of the patient's cells as part of a therapeutic procedure.
  • the amount was analyzed W angiogenin protein, in lysates of the biopsy samples of the skin of this patient, after introducing into the skin gene-therapeutic substances containing modified cDNA of the ANG gene and / or a portion of the native 5 cDNA of the ANG gene.
  • sequence of the portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene is shown in the sequence list, SEQ ANG ID No: 1, the sequences of the modified cDNA of the ANG gene are shown in the sequence list (SEQ ANG ID No: 2, SEQ ANG ID No: 3, SEQ ANG ID No: 4 , SEQ ANG ID No: 5, SEQ ANG ID No: 6, SEQ ANG ID No: 7).
  • the patient was administered 7 gene therapeutic substances and a placebo into the skin of the forearm.
  • the second gene therapeutic substance (B) based on pCMV6-SEQ ID No: 2, containing the modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 2.) According to Example 3 in combination with the transport molecule dendrimer according to Example 7.
  • Example 3 in combination with the transport molecule dendrimer of Example 7.
  • the fourth gene therapeutic substance (D) based on pCMV6-SEQ ID No: 4, containing modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 4.) according to example 3 in combination with a transport molecule - dendrimer according to example 7.
  • the fifth gene therapeutic substance (E) based on pCMV6-SEQ ID No: 5, containing the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 5.) According to Example 3 in combination with the transport molecule dendrimer according to Example 7.
  • the eighth vector plasmid pCMV6-XL5 that does not contain the cDNA of the ANG gene according to example 3 in combination with the transport molecule dendrimer of example 7.
  • the genetic constructs one of which contains a portion of the native unmodified ANG cDNA of the gene (SEQ ID No: 1), the second genetic construct contains the modified ANG cDNA of the gene (SEQ ID No: 2), the third genetic construct contains the modified ANG cDNA of the gene (SEQ ID No: 3), the fourth genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 4), the fifth genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 5), the sixth genetic construct contains a modified cDNA of the ANG gene (SEQ ID No: 6), the seventh genetic i design contains the modified ANG gene cDNA (SEQ ID No: 7), the eighth plasmid (placebo), is the pCMV6 XL5 vector, dissolved in sterile water of the Nuclease-Free purification grade.
  • DNA-dendrimer complexes were prepared according to Example 7.
  • the resulting seven variants of gene-therapeutic substances and placebo were used for administration to the patient.
  • the introduction was carried out by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm into the skin of the forearm of patients.
  • the volume of the injected solution of each gene therapeutic substance was about 0.3 ml.
  • the foci of the introduction of gene-therapeutic substances and placebo were located at a distance of 3-5 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken 72 hours after the introduction of gene-therapeutic substances.
  • the biopsy was performed from the sites of the introduction of gene-therapeutic substances, placebo, as well as from intact skin using the device for taking a skin biopsy Epitheasy 3.5 (Medax SRL).
  • the patient’s skin was pre-washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the size of each biopsy sample was about 3 mm, and the weight was up to 20 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCI pH 7.6, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and homogenized to obtain a uniform suspension.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 minutes at 14,000 rpm. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • angiogenin protein was carried out in nine biopsy samples of the patient’s skin 72 hours after the introduction of gene-therapeutic substances by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ANG Human ELISA Kit (Abeam, USA), as described in Example 8.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the most effective gene-therapeutic substance has been selected for this patient for its subsequent administration to the patient as part of a therapeutic procedure.
  • An agent has been developed for treating conditions of the human body associated with a decrease in the expression of the ANG gene and / or a decrease in the amount of angiogenin protein, consisting of one or more gene therapeutic substances from the group of gene therapeutic substances for correcting pathological conditions of organ cells and human tissues and / or organs and tissues resulting from insufficient expression of the ANG gene, method for its preparation and use.
  • An invented tool for treating conditions of the human body associated with a decrease in the expression of the ANG gene and / or a decrease in the amount of angiogenin protein, consisting of one or more gene therapeutic substances from the group of gene therapeutic substances using one of the modified cDNA of the ANG gene or a portion of the native unmodified cDNA of the ANG gene allows in practice to use the gene therapeutic substances included in the group to increase angiogenin protein to the required level in various cells ah organs and tissues and / or organs and human tissues by enhancing the expression of ANG gene.
  • the group of gene therapeutic substances provides a high level of ANG gene expression by increasing the amount of angiogenin protein in the cells of organs and tissues and / or human organs and tissues, in particular in hepatocytes, neurons, vascular endothelial cells, muscle cells, fibroblasts, epithelial cells, lymphocytes , in combination with or without a transport molecule during transfection with these gene therapeutic substances of cells of human organs and tissues and / or in human organs and tissues, in particular, in the spinal cord, blood vessels, the heart, intestines, stomach, liver, gall bladder, lungs, organs of the excretory and reproductive systems (bladder, ureters, uterus, ovaries), smooth and skeletal muscles, interstitial, endothelial, epithelial, nervous, muscle tissues, placental tissue, in the dermis (skin) in combination with or without a transport molecule when these gene-therapeutic substances are introduced into human organs and tissues.
  • the above examples confirm the fulfillment of the task, namely, the creation of a highly effective tool for the treatment of human body conditions associated with a decrease in the level of ANG gene expression and / or a decrease the amount of angiogenin protein, based on gene therapeutic substances with the ANG gene, which is a group of gene therapeutic substances, using which, taking into account the individual characteristics of the patient, there is an increase in the level of expression of the ANG gene and / or an increase in the amount of angiogenin protein in the cells of organs and tissues and / or organs and tissues of the body.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Средство для лечения состояний человека, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, на основе генно-терапевтических субстанций с геном ANG, представляющее собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена ANG, с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делениями 5' и З'-нетранслируемых областей, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1, или модифицированной кДНК гена ANG, в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7 или их сочетание и регуляторные элементы для повышения экспрессии гена ANG в эукариотических клетках, в клетках органов и тканей человека в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении средства в органы и ткани. Изобретение также относится к способу получения и использования средства.

Description

СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ С ГЕНОМ ANG, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, в частности, в терапевтических целях.
Предшествующий уровень.
Ангиогенез - это процесс образования новых кровеносных сосудов в уже существующей сосудистой системе. Он играет важную роль в развитии и нормальном росте тканей, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (развитие плаценты и желтого тела, овуляции), и вовлечен в патогенез различных заболеваний.
Процесс неоангиогенеза является необходимым для длительной адаптации тканей в условиях повреждения. При этом происходит частичное поступление факторов роста в кровь, что имеет диагностическое значение. Факторы роста, как правило, продуцируются неспециализированными клетками, находящимися во всех тканях, и обладают эндокринным, паракринным и аутокринным действием.
Одним из факторов ангиогенеза является белок ангиогенин, который принадлежит к суперсемейству Рибонуклеаз А. Он обладает и специфическим биологическим действием, и ферментативной РНКазной активностью, в отличие от других факторов ангиогенеза. Ангиогенин является гомологом бычьей панкреатической рибонуклеазы А (РНКазы А). Биологическая активность ангиогенина зависит от РНКазной активности, которая при этом у него в 104-106 ниже, чем у РНКазы A (Biochemistry 2002, 41 , р. 1343). Мутации критических для ферментативной активности ангиогенина аминокислот приводят к потере ангиогенной активности.
Эндогенный ангиогенин необходим для пролиферации клеток, индуцируемой другими белками, как например фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Как и в случае с VEGF, экспрессия ангиогенина может индуцироваться состоянием гипоксии. Белок, кодируемый геном ANG, является мощным медиатором образования новых кровеносных сосудов. Зрелый пептид обладает противомикробной активностью против некоторых бактерий и грибов, в том числе S. pneumoniae, и С. Albicans. Ангиогенин - один из ключевых белков, вовлеченных в процесс ангиогенеза в нормальных и опухолевых тканях. Ангиогенин взаимодействует с актином на поверхности эндотелиальных клеток, и путем эндоцитоза транспортируется в клеточное ядро, что в дальнейшем приводит к стимуляции процессов клеточной миграции, инвазии и пролиферации. Ангиогенин также способен связывать фоллистатин. Его активность in vivo регулируется взаимодействием с RNH1
(ribonuclease/angiogenin inhibitor 1 ).
Ангиогенин продуцируется различными типами клеток и присутствует в нормальной человеческой плазме, способствует миграции эндотелиальных клеток, связывается с ними, опосредует клеточное сцепление, способствует формированию трубчатых структур и может влиять на созревание сосудов, индуцируя пролиферацию гладкомышечных клеток и фибробластов. Преимущественно он экспрессируется в печени, а также детектируется в нейронах спинного мозга. Высокий уровень экспрессии ANG был обнаружен во внеклеточном матриксе и интерстициальной ткани, также ангиогенин был локализован в спинном мозге, эндотелиальных клетках, например, в сосудистом эндотелии, что свидетельствует о его роли в ангиогенезе. Известно также, что ANG экспрессируют такие клетки, как клетки сосудистого эндотелия, гладкомышечные клетки, фибробласты, цилиндрический эпителий толстой кишки, лимфоциты и клетки первичной аденокарциномы, а также селективные линии клеток опухоли человека.
У ангиогенина была открыта нейротрофическая функция (Greenway M.J. et al., ANG mutations segregate with familial and 'sporadic' amyotrophic lateral sclerosis, Nat. Genet., 2006; N° 38, с. 41 1 - 413 - Мутации в гене ангиогенина выделяют при семейной и "спорадической" формах бокового амиотрофического склероза -БАС), а также - у фактора роста эндотелия сосудов (Lambrechts D. et al., Nat. Genet., 2003, Ns 34, c. 383-394 - Фактор роста эндотелия сосудов является модификатором бокового амиотрофического склероза (БАС) у мыши и человека и защищает мотонейроны от ишемической смерти.), что позволяет рассматривать нейротрофические факторы в числе наиболее перспективных соединений для лечения БАС. Важность ангиогенина при патогенезе БАС подтверждена в экспериментах на мышах линии B6SJL- з Tg(SOD1*G93A)dl1 Gur/J с мутацией G93A в гене СОД1 (Gurney М.Е. et al., Science, 1994, N°264, С. 1772). Было показано увеличение продолжительности жизни при введении им рекомбинантного ангиогенина.
В заявке на патент США N 2008/0045456 показаны фармацевтические композиции на основе ангиогенина человека, в том числе рекомбинантного происхождения (полученного в E.coli), и методы их использования для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности БАС, позволяющие снизить проявления нейродегенеративных процессов у подопытных мышей и удлинить продолжительность их жизни. При такой терапии необходимо ежедневно вводить рекомбинантный ангиогенин.
Известны ряд лекарственных препаратов (гели «Ангиофарм», «Cosmo-Genium», «Ангиосиб», «Фармаген»), содержащие рекомбинантный человеческий ангиогенин, на который получен патенты RU 2512527, RU 2221043. Согласно данным исследований препараты обладают высокими репаративными свойствами за счет ускоренной реконструкции локальной капиллярной сети и образования грануляционной ткани, снижают отечные и воспалительные явления, повышают местный иммунитет в зоне повреждения, снижают вероятность образования келоидных рубцов. Однако подобная терапия за счет местного применения может быть недостаточно эффективной и не учитывает индивидуальных характеристик пациента.
В заявке WO 2009146178 А1 описан способ терапевтического лечения нейродегенеративного расстройства у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенный полипептид ангиогенина; способ позволяет изолированному ангиогенину проходить через один или оба барьера - гематоэнцефалического барьера и барьера крови спинного мозга; при этом уменьшая один или более симптомов нейродегенеративного нарушения у субъекта.
Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, частое его введение (что увеличивает стоимость терапии и повышает риск побочных явлений) и сложность внутриклеточной доставки препарата. Кроме того, внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами.
За прототип авторами было принято техническое решение по заявке WO 2013122502 А1 , в которой описана фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза (БАС). Композиция содержит нереплицирующиеся наночастицы, включающие ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека, клонированных в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, при этом композиция дополнительно содержит формулирующий буфер. Способ терапии бокового амиотрофического склероза заключается во введении человеку терапевтически эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей нереплицирующиеся наночастицы, включающие ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека, клонированных в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, при этом композиция дополнительно содержит формулирующий буфер.
Недостатком данного подхода является то, что при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении использован аденоассоциированный вирус, который может интегрироваться в хромосому клетки- хозяина, а также - не учитываются индивидуальные характеристики пациента, в связи с которыми может понадобиться группа вариаций для данного средства.
Раскрытие изобретения
Задачей данного изобретения является создание высокоэффективного средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, на основе генно-терапевтических субстанций с геном ANG, представляющих собой группу генно-терапевтических субстанций, при использовании которых с учетом индивидуальных особенностей пациента, происходит повышение уровня экспрессии гена ANG и/или повышение количества и/или активности белка ангиогенина, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма
Указанная задача решается за счёт того, что создано средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, на основе генно-терапевтических субстанций с геном ANG, представляющее собой, по крайней мере, одну генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена ANG, с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и З'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:1 , или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют SEQ ID No:2, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие повышение экспрессии гена ANG в эукариотических клетках, в клетках органов и тканей человека, где клетки органов и тканей выбраны из фибробластов, эпителиальных клеток роговицы глаза, органы и ткани выбраны из кожи, слизистой оболочки полости рта или мышечной ткани, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этого средства в органы и ткани человека. Каждая генетическая конструкция с модифицированной кДНК гена ANG содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена ANG, которая несёт модификации, не затрагивающие структуру белка ангиогенина, а именно: нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры. Способ получения средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина заключается в получении каждой генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций, при этом получают кДНК гена ANG, затем помещают кДНК и регуляторные элементы в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество субстанции, затем комбинируют субстанцию с транспортной молекулой для трансфекции полученным средством клеток органов и тканей и/или введения полученного средства в органы и ткани человека, при этом используют кДНК гена ANG с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и З'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1 , или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют, или SEQ ID No:2, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или используют сочетание этих субстанций.
Способ использования средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, заключается в трансфекции средством для лечения на основе генно-терапевтической субстанции или субстанций, выбранной или выбранных из группы созданных генно- терапевтических субстанций, клеток органов и тканей пациента и/или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток пациента, трансфицированных созданным средством для лечения на основе генно- терапевтической субстанции или субстанций, выбранной или выбранных из группы созданных генно- терапевтических субстанций, и/или во введении в органы и ткани пациента средства для лечения на основе генно- терапевтической субстанции или субстанций, выбранной или выбранных из группы созданных генно- терапевтических субстанций, или сочетанием обозначенных способов.
Перечень фигур
На фиг. 1
С целью последующего корректного определения генно- терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG проводили анализ эндогенной экспрессии гена ANG в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:
1 - кДНК гена ANG, фибробласты со сниженной экспрессией гена ANG,
2 - кДНК гена ANG, фибробласты с нормальной экспрессией гена ANG, 3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена ANG,
4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена ANG.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 2
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена ANG при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG с генетической конструкцией pCMV6- ANG SEQ ID No:1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:
1 - кДНК гена ANG в фибробластах с нормальной экспрессией гена ANG,
2 - кДНК гена ANG в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG до трансфекции ГТС с кДНК гена
ANG,
3 - кДНК гена ANG в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции ГТС с кДНК гена
ANG,
4 - кДНК гена ANG в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции вектором без кДНК гена ANG,
5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена ANG,
п 6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG до трансфекции ГТС с кДНК гена ANG,
7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции ГТС с кДНК гена
ANG,
8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции вектором без кДНК гена ANG.
Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена ANG уровень кДНК гена ANG в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК гена ANG - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена ANG многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена ANG в нормальных фибробластах).
На фиг. 3
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена ANG при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена ANG представлен график изменения количества белка ангиогенина, нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК гена ANG (культура В) и трансфицированных генно-терапевтической субстанцией с генетической конструкцией pCDNA ЪЛ-ANG SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG происходит увеличение количества белка ангиогенина, в клеточном лизате.
На фиг.4
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной генно-терапевтической субстанцией, представлен анализ изменения количества белка ангиогенина, в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные генно- терапевтической субстанцией с генетической конструкцией pCMV6- ANG SEQ ID No:7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количество белка ангиогенина, в интактной коже. Показано повышение количества белка ангиогенина, в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией кДНК гена ANG (С).
На фиг. 5
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток генно-терапевтическими субстанциями с участком нативной немодифицированной кДНК гена ANG и модифицированных кДНК гена ANG, представлен анализ изменения количества белка ангиогенина в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, используемой для трансфекции фибробластов.
Культуры фибробластов 26 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали генно- терапевтической субстанцией pCMV6-v4/VG SEQ ID No: 1 , части (В) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-/WG SEQ ID No:2, части (С) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-/A/VG SEQ ID No:3, части (D) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-/A/VG SEQ ID No:4, части (E) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-/4/VG SEQ ID No:5, части (F) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-/A/VG SEQ ID No:6, части (G) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6- WG SEQ ID No:7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена ANG.
По итогам анализа уровня количества белка ангиогенина, выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка ангиогенина, и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-/A/VG SEQ ID No: 1 , в группе 2 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-/A/VG SEQ ID No:2, в группе 3 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции рСМ б-ANG SEQ ID No:3, в группе 4 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-y4A/G SEQ ID No:4, в группе 5 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции рСМУб-ANG SEQ ID No:5, в группе 6 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции рСМ в-ANG SEQ ID No:6, в группе 7 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-/4/VG SEQ ID No:7.
Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка ангиогенина присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена ANG.
На фигуре 5 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур генно- терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена ANG.
Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка ангиогенина, в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции генно- терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, входящих в генно-терапевтические субстанции.
Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента,
Обозначения:
0 части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)
Ш части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No:2 (В)
части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No:3 (С)
Ώ части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No:4 (D)
части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No:5 (Е)
□ части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No:6 (F)
□ части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No:7 (G)
И части клеточных культур, трансфицированных
плацебо (Н)
На фиг.6 С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клеточной культуре эпителиальных клеток глаза человека при трансфекции данных клеток генно- терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG в генетической конструкции pCMV6-Kan/Neo ANG SEQ ID No:2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:
1 - кДНК гена ANG, эпителий роговицы до трансфекции
2 - кДНК гена ANG, эпителий роговицы после трансфекции
3- кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции
4- кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции
Ген В2М использовали в качестве референтного.
Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена ANG в культуре клеток эпителия роговицы человека многократно вырос.
На фиг.7
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клеточной культуре эпителия слизистой оболочки полости рта при трансфекции данных клеток генно- терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:
1 - кДНК гена ANG, до трансфекции
2 - кДНК гена ANG, после трансфекции
3 - кДНК гена В2М, до трансфекции
4 - кДНК гена В2М, после трансфекции
Ген В2М использовали в качестве референтного. Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена ANG вырос многократно.
На фиг. 8
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в коже человека при введении в кожу генно- терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка ангиогенина в коже. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG pCMV6- ANG SEQ ID No:4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка ангиогенина, в биоптате кожи пациента 1 В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.
Обозначения:
I пациент 1А
D пациент 1В
1 пациент 1 В до введения ГТС
На фиг. 9
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина в слизистой оболочке полости рта человека при введении в слизистую оболочку полости рта генно- терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка ангиогенина, в слизистой оболочке полости рта. При этом пациенту вводили генно- терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG pCDNA 3.1 ANG SEQ ID No:5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1 (+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку полости рта.
Показано увеличение количества белка ангиогенина, в лизате биоптата слизистой оболочки полости рта пациента 1 В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.
Обозначения:
I пациент 1А
П пациент 1 В
1 пациент 1 В до введения ГТС
На фиг. 10
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка ангиогенина в мышечной ткани. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG - pCMV6-Kan/Neo ANG SEQ ID No:6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка ангиогенина, в биоптате мышечной ткани пациента 1 В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.
Обозначения:
I пациент 1А
П пациент 1 В
й пациент 1 В до введения ( С
На фиг.11
С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов генно-терапевтических субстанций с модифицированными кДНК гена ANG и участком нативной немодифицированной кДНК гена ANG анализировали уровень количества белка ангиогенина в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG.
Каждому из 31-го пациента, которые были отобраны в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 генно- терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No: 1 , pCMV6- SEQ ID No:2, pCMV6- SEQ ID No:3, pCMV6- SEQ ID No:4, pCMV6- SEQ ID No:5, pCMV6- SEQ ID No:6, pCMV6- SEQ ID No:7, и плацебо pCMV6- XL5. По итогам анализа уровня количества белка ангиогенина, в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни количества белка ангиогенина, и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении рСМУб-ANG SEQ ID No: 1 ,
в группе 2 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-v4/VG SEQ ID No:2,
в группе 3 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6->4A/G SEQ ID No:3,
в группе 4 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6->AM3 SEQ ID No:4,
в группе 5 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-/A/VG SEQ ID No:5,
в группе 6 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-v4/VG SEQ ID No:6,
в группе 7 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6- WG SEQ ID No:7.
Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка ангиогенина, присутствует в случае введения плацебо.
На фигуре 1 1 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG.
Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка ангиогенина, в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу генно- терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, входящих в генно- терапевтические субстанции.
Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.
Обозначения:
биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)
Ш биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No:2 (В)
Н биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No:3 (C)
Q биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No:4 (D)
Ш биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No:5 (Е)
П биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No:6 (F) ЕЗ биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No:7 (G)
И биоптаты пациентов после введения плацебо (Н) На фиг. 12
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно- терапевтической субстанции анализировали количество белка ангиогенина, в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG.
По итогам анализа количества белка ангиогенина, в культуре фибробластов пациента выделили вариант генно- терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка ангиогенина. В данном эксперименте максимальная концентрация белка ангиогенина в лизате наблюдается при трансфекции генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 ANG SEQ ID No:1 , содержащей участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG, что показано на фигуре 12.
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.
Обозначения: 1 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)
2 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No:2 (В)
3 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No:3 (С)
4 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No:4 (D)
5 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No:5 (E)
6 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No:6 (F)
7 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No:7 (G)
8 - клеточный лизат после трансфекции плацебо (Н) На фиг. 13
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно- терапевтической субстанции анализировали количество белка ангиогенина в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или участки модифицированных кДНК гена ANG.
По итогам анализа количества белка ангиогенина, в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант генно- терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка ангиогенина. В данном эксперименте максимальная концентрация белка ангиогенина отмечена при введении генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6 ANG SEQ ID No:7, содержащей модифицированную кДНК гена, что показано на фигуре 13.
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры,
Обозначения:
1 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)
2 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No:2 (В)
3 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No:3 (С)
4 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No:4 (D)
5 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No:5 (Е)
6 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No:6 (F)
7 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No:7 (G)
8 - лизат биоптата после введения плацебо (Н)
Реализация изобретения. При снижении экспрессии генов, кодирующих белки ангиогенеза, например, гена ANG, происходит снижение количества белка ангиогенина или снижение его активности в организме, что приводит к патологическим состояниям.
Так у гомозиготных мышей, нокаутных по гену ANG, наблюдали аномальную реакцию на испуг (http://www. mouse phenotvpe.orq/data/qenes/MGI:88022).
Преимущества использования генетической конструкции с геном ANG для коррекции экспрессии гена ANG и количества и/или активности белка ангиогенина в клетках органов и тканей человека, по сравнению с использованием фармацевтической композиции на основе нереплицирующихся наночастиц, одна из которых включает ген ангиогенина человека, решение по заявке WO 2013122502 А1 (прототип) следующие:
1 ) легче обеспечить более высокий и стабильный количественный уровень и активность целевого белка в клетках при одновременной минимизации вероятности встраивания элементов генетической конструкции в геном пациента,
2) обеспечивается транспортировка генно- терапевтической субстанции в больший спектр клеток органов и тканей человека, а также более эффективная внутриклеточная транспортировка генно-терапевтической субстанции при одновременной минимизации вероятности встраивания элементов генетической конструкции в геном пациента,
3) учитываются индивидуальные характеристики пациента. Таким образом, для создания группы генно- терапевтических субстанций по данному изобретению был выбран ген ANG, а не белок ангиогенин, кодируемый этим геном.
Для получения группы генно-терапевтических субстанций осуществляют следующие действия:
1. Получение участка нативной кДНК гена ANG, содержащей белок-кодирующую область гена ANG, клонирование его в промежуточную плазмиду,
2. Переклонирование участка нативной кДНК гена ANG в экспрессионные векторные плазмиды под контроль эукариотических регуляторных элементов для эффективной экспрессии этой кДНК в клетках органов и тканей человека таким образом, что полученные генетические конструкции содержат кодирующую нуклеотидную последовательность кДНК белка ангиогенина с делециями 5'- нетранслируемых З'-нетранслируемых областей, которая является участком нативной немодифицированной кДНК гена ANG и которая используются для дальнейших модификаций.
3. Внесение модификаций в последовательность нуклеотидов участка нативной кДНК гена ANG, клонированной в векторных плазмидах, с целью создания группы кДНК гена ANG, обеспечивающих достаточный для борьбы с патологическими проявлениями уровень трансляции белка ангиогенина.
4. Трансформация каждой из полученных генетических конструкций бактериальных клеток E.coli, анализ трансформированных клонов на предмет наличия, ориентации и копийности вставки кДНК и наращивание отобранных клонов для получения необходимого для дальнейшей работы количества вариантов плазмидной ДНК.
5. Выделение группы генетических конструкций, содержащих модифицированные кДНК гена ANG или участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG для создания на их базе группы генно-терапевтических субстанций.
6. Создание группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена ANG, с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и З'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1 , или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют SEQ ID No:2, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии гена ANG в эукариотических клетках, или комбинацию такой конструкции с транспортной молекулой для эффективной трансфекции различных типов клеток органов и тканей и/или введения в органы и ткани человека. Для доказательства эффективности созданных генно- терапевтических субстанций, приводящих к увеличению экспрессии гена ANG, проводят следующие исследования:
A) Выращивание культур различных типов клеток из биоптатов различных органов и тканей человека, например, фибробластов кожи человека, или клеток эпителия слизистой оболочки полости рта, или клеток эпителия роговицы глаза.
B) Выделение РНК из культуры клеток, например, фибробластов кожи человека, или клеток эпителия слизистой оболочки полости рта, или клеток эпителия роговицы глаза и анализ экспрессии гена ANG из генома этих клеток.
C) Трансфекция культуры клеток, например, фибробластов кожи человека, или клеток эпителия слизистой оболочки полости рта, или клеток эпителия роговицы глаза генно-терапевтическими субстанциями содержащими участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG и параллельная трансфекция культуры этих же клеток векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена ANG в различных комбинациях.
D) Сравнительный анализ изменения уровня мРНК гена ANG и/или изменения количества белка ангиогенина, после трансфекции в различных комбинациях клеток, например, фибробластов кожи человека, или клеток эпителия слизистой оболочки полости рта, или клеток эпителия роговицы глаза генно-терапевтическими субстанциями содержащими участок нативной ^модифицированной кДНК гена ANG и/или модифицированные «ДНК гена ANG и параллельной трансфекции культуры этих же клеток векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена ANG. Данный анализ проводят, в частности, перед предполагаемой терапией с целью определения наиболее эффективной для пациента генно-терапевтической субстанции.
E) Введение пациентам в органы и ткани культуры клеток трансфицированных генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG, например, введение, в кожу человека, аутологичных фибробластов, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG и параллельное введение пациентам в органы и ткани, например, в кожу, культур этих же клеток нетрансфицированных и трансфицированных вектором без вставки кДНК гена ANG и/или введение пациентам в органы и ткани генно-терапевтических субстанций, например, введение в кожу человека генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК ANG, а также плацебо в различных комбинация.
F) Сравнительный анализ количества белка ангиогенина, в органах и тканях человека, в частности в коже человека, после введения клеток нетрансфицированных и трансфицированных генно- терапевтическими субстанциями, содержащими кДНК гена ANG и векторными плазмидами, не содержащими кДНК гена ANG или генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG, а также плацебо.
G) Введение пациентам в органы и ткани, например, в слизистую оболочку полости рта или мышечную ткань, генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG, а также плацебо.
H) Сравнительный анализ количества белка ангиогенина, в органах и тканях человека, в частности в слизистой оболочке полости рта, или мышечной ткани человека, после введения генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG а также плацебо.
I) Введение пациентам в органы и ткани, например, введение в кожу пациента генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG.
J) Сравнительный анализ количества белка ангиогенина, в органах и тканях пациента, в частности в коже, после введения генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG. Данный анализ проводят, в частности, перед предполагаемой терапией с целью выбора наиболее эффективной для пациента генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций. Пример 1.
Получение и клонирование нативной немодифицированной кДНК гена ANG.
Немодифицированная кДНК гена ANG представляет собой последовательность нуклеотидов, которая имеет высокую гомологию с нуклеотидной последовательностью гена и мРНК ANG, приведенной в базе данных GenBank под номером NM_00 45; нуклеотиды с 601 по 1044 транслируются в аминокислотную последовательность белка ангиогенина, соответствующую приведённой в GenBank под номером NP_ NP_001136.1.
Суммарную РНК получают из клеток человеческой крови с помощью набора PAXGeneBlood RNA Kit (Qiagen, Germany) и используют для получения суммарной кДНК путём обратной транскрипции с помощью обратной транскриптазы RevertAid (ThermoScientific, USA) и случайных 9-нуклеотидных праймеров по методике производителя обратной транскриптазы. Затем, используя суммарную кДНК в качестве матрицы и специфичные, предварительно кинированные праймеры, комплементарные нуклеотидам 84-103 5' TGGACGCTCAGCCAGGGGTA 3' (ANG-F1 ) и 1081-1060 5' GGACAGCAGAGCCAGCACTTGA 3' (ANG-R1 ) из последовательности мРНК ANG (NM_001 145), получают участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG, содержащий кодирующую последовательность белка ангиогенина, и частичные делеции 5' и 3'- нетранслируемых областей. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят с помощью ДНК-полимеразы Phusion (ThermoScientific, USA), дающей продукты с тупыми концами, на амплификаторе Master CyclerGradient (Eppendorf, USA) в 50 мкл. реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл суммарной кДНК первой цепи, по 0, 1 мкМ каждого праймера ANG F1 и ANG R1 , 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 100 мМ трис-HCI (рН 8,85 при 20°С), 50 мМ сульфата аммония, 250 мМ хлористого калия, 0,01 % Твин-20 и 5 ед. Pfu ДНК-полимеразы (PhusionThermoScientific,USA) при следующих условиях: первоначальная денатурация при +98 °С в течение 30 сек., 35 циклов, включающих денатурацию при +98 °С в течение 10 сек., отжиг праймеров при +65 °С в течение 30 сек. и элонгацию при +68 °С течение 2 минут.
Продукт амплификации выделяют из агарозного геля с помощью набора QIAquickGelExtractionKit (Qiagen,
Germany)
Амплифицированный фрагмент кДНК длиной 998 н.п, несущий участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG, клонируют в плазмидном векторе pUC19 (NEB, USA, кат номер N3041 S). ДНК векторной плазмиды pUC19 (NEB, USA, KaT.HOMepN3041S) гидролизуют рестриктазой, дающей тупые концы, например, Smal (NEB, USA) и обрабатывают щелочной фосфатазой. Амплифицированный фрагмент кДНК и линеаризованную плазмиду pUC19 лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 400 000 ед./ мл. (NEB, USA, кат номер M0202S) из расчета 1 мкл фермента на 1 мкг ДНК. Лигирование проводят в объеме 20 мкл в присутствии 2 мМ АТФ, 50 мМ трис -HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCI2, 10 мМ DTT в течение 10 ч при +16°С^
Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.соПТорЮ (http://molbiol.ru/protocol/03_04.html), которые высевают на чашки Петри с L- агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и по 40 мкл на чашку растворов 100 мМ ИПТГ и 2 % X-gal. Отдельные колонии анализируют на наличие вставки с помощью ПЦР с праймерами ANG--F1 и ANG--R1 и подтверждают секвенированием по методу Сэнгера.
Пример 2.
Получение генетических конструкций с участком немодифицированной кДНК гена ANG
Для экспрессии участка немодифицированной кДНК гена ANG в клетках органов и тканей человека вариант кДНК гена ANG по Примеру 1 помещают в векторную плазмиду, при выборе которой используют следующие критерии выбора:
1 ) плазмида должна обязательно реплицироваться в E.coli, желательно с высокой копийностью;
2) в плазмиде должен быть бактериальный фактор селекции (например, ген устойчивости к антибиотику, либо другой фактор селекции не содержащий генов резистентности к антибиотикам);
3) в плазмиде должно быть наличие эукариотических регуляторных элементов - обязательных промотора и терминатора (сигнала полиаденилирования), например, энхансер и интронный(е) элемент(ы);
4) в плазмиде должно быть наличие удобного полилинкера для клонирования. Примером такой плазмиды может быть pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo (OriGene, USA) или pCDNA 3.1 (+) (ThermoFisherScientific, USA), либо плазмидные векторы вирусного происхождения - например, аденовирус человека 5-го серотипа.
5) Плазмида может содержать нуклеотидные последовательности с регуляторными элементами для репликации в клетках млекопитающих, например, такие как SV40 ori из вируса обезьян SV40 или ori P/EBNA-1 из вируса Эпштейн-Барра человека.
6) Плазмида также может содержать дополнительные регуляторные элементы, усиливающие трансляцию белка, например, участки связывания с транскрипционным фактором NFkB, обеспечивающим активный транспорт плазмидной ДНК в клеточное ядро для более эффективной транскрипции целевого гена.
При клонировании кДНК гена ANG в pCDNA 3.1 (+) кодирующая нуклеотидная последовательность помещается под контроль промотора цитомегаловируса человека CMV, эффективного в эукариотических клетках, и сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Также данная плазмида обладает бактериальным фактором селекции - геном устойчивости к ампициллину, и эукариотическим фактором селекции - геном устойчивости к неомицину. При клонировании кДНК гена ANG в pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo кодирующая нуклеотидная последовательность помещается под контроль промотора цитомегаловируса человека CMV, эффективного в эукариотических клетках, и сигнала полиаденилирования гена гормона роста человека. Также данная плазмида обладает бактериальным фактором селекции - геном устойчивости к ампициллину.
Векторную плазмиду pUC19-/4/VG с нативной немодифицированной последовательностью кДНК гена ANG используют в качестве матрицы для амплификации со следующими парами праймеров:
1 пара для ориентации Hind III - ANG - Eco Rl
ANG F2 GGAAGCTTGCCACCATGGTGATGGGCCTGGG ANG R2 GGGAATTCTTACGGACGACGGAAAA
2 пара для ориентации Rl - ANG - Hind III
ANG F3 GGGAATTCGCCACCATGGTGATGGGCCTGGG ANG R3 GGAAGCTTTTACGGACGACGGAAAA
Амплификацию проводят при условиях, приведенных в Примере 1. Далее продукты амплификации переосаждают этиловым спиртом, осадки промывают 70% этанолом и растворяют в 1х ТЕ буфере, после чего подвергают рестрикции с эндонуклеазами EcoRI и Hindi i I. Продукты рестрикции разделяют с помощью электрофореза в геле 1 % агарозы, окрашивают раствором бромистого этидия и фрагменты ДНК, соответствующие гену-вставке Hindlll-5'NTR- кДНК ANG-3'NTR- EcoRI, либо EcoRI -5'NTR-KflHK ANG-3'NTR- Hindi II и линеаризованной плазмиде pCMV6-XL5 и pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1 (+), вырезают, выделяют из геля с помощью набора для выделения из геля QIAquickGelExtractionKit (Qiagen, Germany) и смешивают. Полученную смесь рестрикционных фрагментов лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят в течение 10-15 мин при комнатной температуре, а затем - при 12°С в течение 10 ч. Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е. coli по стандартной методике с использованием хлористого кальция. Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с ампициллином (100 мкг/мл). Плазмидную ДНК из ампициллин-устойчивых колоний выделяют с помощью набора для выделения плазмид QiagenSpinMiniprepKit (Qiagen, Germany), анализируют с помощью гидролиза рестриктазами EcoRI и Hind 111 и отбирают генетическую (ие) конструкцию (ии) с помощью секвенирования ДНК по методу Сэнгера.
Бактерии, содержащие полученные генетические конструкции на базе векторов pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1 (+), выращивают на жидкой среде LB с ампициллином, лизируют и выделяют плазмидную ДНК для трансфекции специальным набором для выделения плазмид QiagenMaxiKit (Qiagen, Germany) для получения соответствующих генно-терапевтических субстанций. Таким образом, получают экспрессионые генетические конструкции на базе векторов pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1 (+), содержащие нуклеотидную последовательность длиной 444 н.п., полученную за счет делеции 5'- нетранслируемых и_3'- нетранслируемых областей, с первичной структурой, приведенной в перечне последовательностей Seq ID No1.
Пример 3.
Модификации кДНК гена ANG в генетических конструкциях для получения на их основе генно- терапевтических субстанций.
Модификации проводят таким образом, чтобы не затрагивать первичную структуру белка ангиогенина, а именно, нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность.
В частности для получения модифицированных кДНК гена ANG с целью повышения эффективности транскрипции и трансляции белка ангиогенина, в клетках тканей и органов человека в участок нативной последовательности кДНК гена ANG, используя принцип оптимизации кодонов, вносят модификации путем замены минорных кодонов на синонимичные мажорные таким образом, чтобы замены не привели к изменениям в аминокислотной последовательности белка или обрыву аминокислотной цепи при трансляции, не ухудшили процессы транскрипции и трансляции.
Все модификации осуществляют в несколько этапов методом ПЦР мутагенеза набором QuikChANGe II XL kit или QuikChANGe Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (AgilentTechnologies, USA,) согласно рекомендациям производителя.
http://www.agilent.com/cs/library/userrnanuals/Public/200513.
К плазмидной ДНК, полученной по Примеру 2, в количестве 10— 50 нг добавляют 50-100 нг праймера, содержащего необходимую замену, инсерцию или делецию длиной 19-45 н.п. и проводят ПЦР в буфере QuikChANGe Multi reaction buffer (AgilentTechnologies, USA) со смесью ферментов QuikChANGe Multi mix (AgilentTechnologies, USA) при следующих условиях: 95°C, 1 мин; далее от 30 до 35 циклов: 95°С 1 минута, 55°С 1 минута, 65°С 2 минуты/1000 н.п. После проведения ПЦР к амплификационной смеси добавляют 1-2 мкл рестриктазы Dpn I и инкубируют 1-2 часа при 37°С. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli ТорЮ
(http://molbiol.ru/protocol/03 04.html), которые высевают на чашки с L-агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Трансформированнные колонии анализируют на содержание мутаций секвенированием плазмидной ДНК по методу Сэнгера.
Для получения модифицированной кДНК ANG SEQ ID No 2 проводят последовательный ПЦР-мутагенез на плазмидах pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1 , pCMV6-Kan/Neo- ANG Seq ID No1 и pCDNA 3.1 (+)- ANG Seq ID No1 с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК ANG , приведенной в GenBank под номером NM_001145:
1. ANG 651 -680 F:
5' TCTGACCCCACCCACCCTGGCTCAGGATAA 3',
Комплементарный нуклеотидам 651-680, с заменой G->C в позиции 663; Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК ANG SEQ ID No:2 содержит 1 нуклеотидную замену G- C в позиции 663, не приводящую к изменениям в аминокислотной последовательности белка, кодируемого последовательностью гена ANG и имеет первичную структуру, приведенную в перечне последовательностей.
Для получения модифицированной кДНК ANG SEQ ID No 3 проводят последовательный ПЦР-мутагенез на плазмидах pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1 , pCMV6-Kan/Neo- ANG Seq ID No1 и pCDNA 3.1 (+)- ANG Seq ID No1 с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК ANG , приведенной в GenBank под номером NM_001 145:
1. ANG 651-680 F:
5' TCTGACCCCACCCACCCTGGCTCAGGATAA 3' , Комплементарный нуклеотидам 600-633, с заменой G- C в позиции 615;
2. ANG 910-929F:
5' ACTTG С AAG CTG С ATG G AG G 3', Комплементарный нуклеотидам 910-929, с заменой A->G в позиции 921 ;
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК ANG SEQ ID No:3 содержит 1 нуклеотидную замену G->C в позиции 663, и одну нуклеотидную замену A->G в позиции 921 ; не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина, и имеет первичную структуру, приведенную в перечне последовательностей. Для получения модифицированной кДНК ANG SEQ ID No 4 проводят последовательный ПЦР-мутагенез на плазмидах pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1 , pCMV6-Kan/Neo- ANG Seq ID No1 и pCDNA 3.1 (+)- ANG Seq ID No1 с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК ANG , приведенной в GenBank под номером NM_001 145:
1. ANG 651-680 F:
5' TCTGACCCCACCCACCCTGGCTCAGGATAA 3',
Комплементарный нуклеотидам 600-633, с заменой G->C в позиции 615; W
2. ANG 910-929F:
5' ACTTGCAAGCTGCATGGAGG 3',
Комплементарный нуклеотидам 910-929, с заменой A->G в позиции 921 ;
5 3. ANG 866-891 F:
5' ACAGAGAAAACCTGAGAATCAGCAAG 3',
Комплементарный нуклеотидам 866-891 , с заменой A- G в позиции 879 и заменой А- С в позиции 885;
Модифицированная таким образом нуклеотидная ю последовательность кДНК ANG SEQ ID No:4 содержит 1 нуклеотидную замену G->C в позиции 663, 2 нуклеотидных замены A- G в позициях 879, 921 ; 1 нуклеотидную замену А- С в позиции 885, не приводящие к изменениям в аминокислотной 15 последовательности белка ангиогенина, и имеет первичную структуру, приведенную в перечне последовательностей.
Для получения модифицированной кДНК ANG SEQ ID No 5 проводят последовательный ПЦР-мутагенез на 20 плазмидах pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1 , pCMV6-Kan/Neo- ANG Seq ID No1 и pCDNA 3.1 (+)- ANG Seq ID No1 с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК ANG , приведенной в GenBank под номером NM_001 145:
25 1. ANG 651 -680 F:
5' TCTGACCCCACCCACCCTGGCTCAGGATAA 3', Комплементарный нуклеотидам 600-633, с заменой G- C в позиции 615;
2. ANG 910-929F:
5' ACTTGCAAGCTGCATGGAGG 3', Комплементарный нуклеотидам 910-929, с заменой A->G в позиции 921 ;
3. ANG 866-891 F:
5' ACAGAGAAAACCTGAGAATCAGCAAG 3',
Комплементарный нуклеотидам 866-891 , с заменой A- G в позиции 879 и заменой А- С в позиции 885;
4. ANG 938-977F:
5' GGCCTCCATGCCAGTACCGGGCCACAGCCGG- GTTCAGAAA 3',
Комплементарный нуклеотидам 938-977, с заменой A->G в позиции 957 и заменой G->C в позиции 966;
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК ANG SEQ ID No:5 содержит 2 нуклеотидных замены G->C в позиции 663, 966; 3 нуклеотидных замены A->G в позициях 879, 921 , 957; 1 нуклеотидную замену А->С в позиции 885, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина, и имеет первичную структуру, приведенную в перечне последовательностей. Для получения модифицированной кДНК ANG SEQ ID No 6 проводят последовательный ПЦР-мутагенез на плазмидах pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1 , pCMV6-Kan/Neo- ANG Seq ID No1 и pCDNA 3.1 (+)- ANG Seq ID No1 с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК ANG , приведенной в GenBank под номером NM_001 145:
1. ANG 651-680 F:
5' TCTGACCCCACCCACCCTGGCTCAGGATAA 3', Комплементарный нуклеотидам 600-633, с заменой G- C в позиции 615;
2. ANG 910-929F:
5' ACTTGCAAGCTGCATGGAGG 3',
Комплементарный нуклеотидам 910-929, с заменой A- G в позиции 921 ;
3. ANG 866-891 F:
5' ACAGAGAAAACCTGAGAATCAGCAAG 3',
Комплементарный нуклеотидам 866-891 , с заменой A->G в позиции 879 и заменой А->С в позиции 885; 4. ANG 938-977F:
5' GGCCTCCATGCCAGTACCGGGCCACAGCCGGG- TTCAGAAA 3',
Комплементарный нуклеотидам 938-977, с заменой A->G в позиции 957 и заменой G- C в позиции 966; 5. ANG 994-1023F:
5' GAAAATGGCCTGCCTGTCCACTTGGATCAG
3',
Комплементарный нуклеотидам 994-1023, с заменой A->G в позиции 1005 и заменой Т->С в позиции 1003;
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК ANG SEQ ID No:6 содержит 2 нуклеотидных замены G->C в позицииях 663, 966; 4 нуклеотидные замены A- G в позициях 879, 921 , 957, 1005; 1 нуклеотидную замену А->С в позиции 885, 1 нуклеотидную замену Т->С в позиции 1003; не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина, и имеет первичную структуру, приведенную в перечне последовательностей.
Для получения модифицированной кДНК ANG SEQ ID No 7 проводят последовательный ПЦР-мутагенез на плазмидах pCMV6-XL5-ANG Seq ID No1 , pCMV6-Kan/Neo- ANG Seq ID No1 и pCDNA 3.1 (+)- ANG Seq ID No1 с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК ANG , приведенной в GenBank под номером NM_001 145:
1. ANG 651-680 F:
5' TCTGACCCCACCCACCCTGGCTCAGGATAA 3', Комплементарный нуклеотидам 600-633, с заменой G->C в позиции 615; 2. ANG 910-929F:
5' ACTTGCAAGCTGCATGGAGG 3',
Комплементарный нуклеотидам 910-929, с заменой A->G в позиции 921 ;
3. ANG 866-891 F:
5' ACAGAGAAAACCTGAGAATCAGCAAG 3\
Комплементарный нуклеотидам 866-891 , с заменой A->G в позиции 879 и заменой А->С в позиции 885;
4. ANG 938-977F:
5' GGCCTCCATGCCAGTACCGGGCCACAGCCGG- GTTCAGAAA 3',
Комплементарный нуклеотидам 938-977, с заменой A->G в позиции 957 и заменой G->C в позиции 966;
5. ANG 994-1023F:
5' GAAAATGGCCTGCCTGTCCACTTGGATCAG 3',
Комплементарный нуклеотидам 994-1023, с заменой A- G в позиции 1005 и заменой Т->С в позиции 1003;
6. ANG 1024-1044F:
5' TCAATTTTCCGGCGGCCGTAA 3'.
Комплементарный нуклеотидам 1024-1044, с заменами T- G в позициях 1035, 1038;
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК ANG SEQ ID No:7 содержит 2 нуклеотидных замены G->C в позиции 663, 966; 4 нуклеотидных замены A- G в позициях 879, 921 , 957, 1005; 1 нуклеотидную замену А->С в позиции 885, 1 нуклеотидную замену Т->С в позиции 1003; и 2 нуклеотидные замены T->G в позициях 1035 и 1038; не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина, и имеет первичную структуру, приведенную в перечне последовательностей.
Таким образом, получают экспрессионные векторы на базе плазмид pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1 (+), в которых клонированы участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No: 1 ) и модифицированные нуклеотидные последовательности кДНК гена ANG (SEQ ID No:2, 3, 4, 5, 6, 7), кодирующие белок ангиогенина. Бактерии, содержащие полученные генетические конструкции на базе векторов pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1 (+), выращивают на жидкой среде LB с ампициллином, лизируют и выделяют плазмидную ДНК для трансфекции специальным набором для выделения плазмид QiagenMaxiKit для получения соответствующих генно-терапевтических субстанций.
Полученные экспрессионные векторы используют для получения на их основе генно-терапевтических субстанций, которые в дальнейшем применяют для трансфекции эукариотических клеток органов и тканей и/или введения в органы и ткани человека. В качестве контрольных плазмид используют исходный вектор pCMV6 - XL5, (pCMV6- Kan/Neo) или pCDNA 3.1 (+) без вставки кДНК гена ANG. Пример 4.
Наращивание генетической конструкции в бактериальной культуре.
Для получения препаративных количеств векторной плазмиды, содержащей один из вариантов кДНК гена ANG, полученными конструкциями по примеру 3 трансформируют бактериальные клетки E.coli (Маниатис Т., и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984) и выращивают полученные клоны бактерий, содержащие конструкцию, в присутствии бактериального фактора селекции устойчивости к ампициллину.
Лигазную смесь по примеру 3 используют для трансформации компетентных клеток E.coli штамма XLblue. Предварительный отбор клонов, содержащих вставку кДНК гена ANG в правильной ориентации и единичной копии, осуществляют путём гидролиза плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и Hind 111 и анализа продуктов рестрикции путём электрофореза в 1.2% агарозном геле. Отобранные клоны используют для препаративного наращивания плазмидной ДНК с целью дальнейшей трансфекции в культуры фибробластов (клеток эпителия слизистой оболочки полости рта, или клеток эпителия роговицы глаза и др.).
Для получения препаративных количеств генетических экспрессионных конструкций по Примеру 3 выращивали 20 мл ночной культуры E.coli в LB-среде с 150 мкг/мл ампициллина. Этой культурой инокулировали 500 мл LB- среды с 100 мкг/мл ампициллина, рост осуществляли в шейкере-инкубаторе в течение 16 часов при 37°С и 200 об/мин. Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора EndoFreePlasmidMaxiKit (Qiagen, Germany). Выход составил 350 мкг ДНК.
Пример 5.
Культивирование эукариотических клеток, например, фибробластов для последующих трансфекции генно- терапевтической субстанцией и анализа экспрессии гена ANG.
Для последующей трансфекции генно-терапевтической субстанцией содержащей один из вариантов кДНК гена ANG по примеру 3, выращивают первичные культуры фибробластов человека из биоптатов кожи пациентов.
Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL) берут образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, например, за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 3 мм, массой - до 20 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Выращивание первичной культуры клеток осуществляют на чашках Петри при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % С02 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Трипсинизацию и пересев производят каждые 5 дней, для трипсинизации клетки промывали раствором PBS и инкубировали 30 минут при 37°С в растворе, содержащем 0.05% трипсина и 1 мМ ЭДТА. Для нейтрализации трипсина к клеткам добавляли 5 мл культуральной среды и центрифугировали суспензию при 600 об/мин 5 минут. Рост культуры фибробластов после 4-5 пассажей осуществляли в культуральных флаконах ёмкостью 75 мл в среде, содержащей 10 г/л DMEM, 3.7 г/л Na2C03, 2.4 г/л HEPES, 10% фетальной сыворотки и 100 Ед/мл ампициллина. Смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 106 клеток.
Часть культуры фибробластов, предназначенную для выделения РНК с последующим анализом транскрипции гена ANG, центрифугировали при 1000 об/мин 20 минут и дважды отмывали в буферном растворе PBS центрифугированием при 600 об/мин в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в 1.5 мл стабилизирующего реагента RNAIater и хранили при 4°С в течение 10 дней для последующего выделения РНК.
Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasyMiniKit. (Qiagen, Germany). Выделенную РНК анализировали спектрофотометрически, измеряя соотношение оптической плотности при 260 и 280 нм, а также с помощью капиллярного электрофореза на приборе QIAxcel (Qiagen, Germany), используя картридж RNA Qiality Control. Для дальнейшей работы использовали только те образцы, для которых общее количество выделенной РНК было не менее 50 мкг РНК, соотношение D260: D280 - не менее 1 ,8, а соотношение полос 28S: 18S на капиллярном электрофорезе - не ниже 1 :1. Синтез суммарной кДНК первой цепи проводили, используя обратную транскриптазу RevertAid (Thermo Scientific, USA), согласно рекомендациям изготовителя. 1-2 мкг суммарной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК. В реакционную смесь для проведения обратной транскрипции вносили 100-200 ед. обратной транскриптазы и 10 пМ случайного 9- нуклеотидного праймера. Пример 6.
Анализ эндогенной экспрессии гена ANG в культуре первичных фибробластов.
Анализ экспрессии гена ANG из генома фибробластов проводят с целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции этих клеток генетическими конструкциями с кДНК гена ANG.
Для анализа используют клеточные линии фибробластов кожи, фибробласты с низкой экспрессией гена ANG и фибробласты с нормальной экспрессией гена ANG, из которых выделяют РНК по стандартной методике (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984).
Выделенную РНК анализируют методом ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК (265-338 н.п.), специфичной для гена ANG, используют прямой праймер ANG FA1 5' CACAGAGAAAACCTAAGAATAAGCAA 3'
и обратный праймер ANG -RA1 5' CAGGGGGAACCTCCATGT 3' Длина продукта амплификации -74 нуклеотид. В качестве референтного гена используют ген бета-2- микроглобулина В2М, уровень экспрессии которого в фибробластах сопоставим с таковым в норме для гена ANG.
ПЦР-амплификацию проводят с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, USA) или другого набора для ПЦР в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого прймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляют на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 50°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин., затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек., отжиг праймеров 59 °С - 30 сек. и элонгацию 72°С - 30 сек.
В качестве положительного контроля используют концентрацию ампликонов, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ANG и В2М. В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду (кривые накопления ПЦР продуктов отрицательного и положительных контролей для упрощения визуализации на фигуре 1 не показаны). Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ANG и В2М, полученных в результате амплификации, оценивают в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. По итогам анализа экспрессии гена ANG в разных культурах фибробластов (с низкой экспрессией гена ANG и с нормальной экспрессией гена ANG) были отобраны клоны от пациентов одного возраста и одного типа старения, в которых количество ПЦР-продукта, соответствующего кДНК гена ANG, была в 10-20 раз ниже таковой кДНК гена В2М. Кривые накопления специфических ПЦР-продуктов приведены на фигуре 1. Пример 7.
Трансфекция клеточной культуры фибробластов со сниженной экспрессией гена ANG генно-терапевтической субстанцией с целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в культуре данных клеток.
Для оценки эффективности генно-терапевтической субстанции, содержащей немодифицированную кДНК гена ANG по примеру 3, этой генно-терапевтической субстанцией трансфицируют первичную культуру фибробластов человека со сниженной экспрессией гена ANG, отобранную по примеру 6.
Данную культуру фибробластов выращивают в культуральных флаконах (25 см2) до момента, когда клетки покрывают 50-70% поверхности флакона. Полученные клетки трансфицируют генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- ANG SEQ ID No: 1 в присутствии транспортной молекулы (например, дендримера) и вектором pCMV6-XL5 в качестве контроля.
6-луночный планшет с DMEM-средой с 10% фетальной телячьей сывороткой (1.6 мл в лунке) засевали фибробластами из расчёта 1-4 х 105 клеток на лунку. Инкубировали клетки в течение 18 часов при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% С02. Затем 2 мкг плазмидной ДНК растворяли в среде DMEM без сыворотки с буфером Трис-HCI 20 мМ с 1 мМ ЭДТА, рН 7-8 (минимальная концентрация ДНК - 0.1 мкг/мкл). Конечный объём смеси составлял 100 мкл.
В качестве транспортной молекулы использовали раствор дендримера SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Г ермания).
Приготовление комплекса ДНК-дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями: к 15 мкл раствора дендримера (с концентрацией 3 мкг/мкл) добавляли 5 мкл (с концентрацией 0,5 мкг/мкл) раствора плазмидной ДНК и тщательно перемешивали. Затем инкубировали смесь ДНК с дендримером в течение 5-10 минут при температуре 15 - 25°С.
Из лунок планшета с клеточной культурой осторожно отбирали среду (не нарушая клеточного слоя) и промывали клетки 3 мл буфера PBS. К раствору, содержащему комплексы ДНК-дендример, добавляли 600 мкл среды DMEM с фетальной сывороткой и переносили эту смесь в лунки планшета с клетками. Клетки инкубировали с комплексами 2-3 часа при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% С02. Затем осторожно удаляли среду и промывали клеточный слой 3 мл буфера PBS. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали 24-48 часов при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% С02, после чего оценивали уровень кДНК гена ANG и контрольной кДНК гена В2М с помощью амплификации в режиме реального времени как описано в примере 6. Результаты анализа приведены на фигуре 2.
Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена ANG уровень кДНК гена ANG в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК гена ANG - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена ANG многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена ANG в нормальных фибробластах).
Показано, что в клетках трансфицированных генно- терапевтической субстанцией на основе pCMV6- ANG SEQ ID No: 1 наблюдается усиление экспрессии целевого гена ANG.
Пример 8.
Трансфекция клеточной культуры фибробластов с нормальной экспрессией гена ANG генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG с целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в культуре данных клеток.
Белок ангиогенин обладает ферментной и биологической активностью, которые взаимосвязаны между собой. Поскольку РНК-азная его активность достаточно низкая, ее изучение имеет прерывистый характер (Biochemistry 2002, 41 , 1343), а отсутствие коммерческих стандартизованных методик затрудняет проведение исследований активности ангиогенина у пациентов с патологическими состояниями, связанными с гипофункцией этого белка, обеспечивающих стабильный воспроизводимый результат.
Известно, что биологическая активность белка ангиогенина связана с механизмом индукции ангиогенеза путем взаимодействия белков-рецепторов (например, а- актина) клеток-мишеней эндотелия с определенной дозой ангиогенина. Также в определенных концентрациях ангиогенином осуществляется стимуляция фибринолиза, опосредованного эндотелиальными клетками, и клеточноассоциированной протеолитической активности, которые являются составными частями ангиогенеза (http://rnedbiol.ru/medbiol/angiogenin/00009e6f.htm).
На основе вышесказанного, при проведении экспериментов приняли степень корреляции между эффективностью экспрессии и количеством белка ангиогенина как достаточно-высокую, а использование стандартизованной чувствительной методики количественного определения ангиогенина в клетках и биологических жидкостях - приемлемым для получения достоверно-значимых данных об эффективности исследуемых генно-терапевтических субстанций.
Для оценки изменения уровня экспрессии гена ANG, использовали культуру фибробластов кожи человека по Примеру 5, в качестве транспортной молекулы дендримеры SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия), в качестве контроля - водный раствор дендримеров без плазмидной ДНК (А), векторную плазмиду pCDNA 3.1 (+), не содержащую кДНК гена ANG (В), в качестве трансфицируемых агентов - генно- терапевтическую субстанцию на основе векторной плаз иды pCDNA 3.1 (+), содержащую кДНК гена ANG - pCDNA 3.1 ANG EQ ID No: 1 (C), Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию фибробластов проводили согласно Примеру 7.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости приливали 0, 1 мл 1 N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовывали смесь, добавляя 0, 1 мл 1.2N NaOH/0.5M HEPES (рН 7-7,6) и тщательно перемешивали.
Данную смесь использовали для количественного определения целевого белка. Количественное определение продукта кДНК гена ANG проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США) согласно методике производителя http://www.abcam.com/ps/products/99/ab99970/documents/ab9 9970 Anqioqenin%20(ANG)%20Human%20ELISA Kit%20v3 %2Q(website).pdf Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка ANG в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка ANG, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%. Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-proiect.org/).
Таким образом, показано, что транфекция фибробластов полученной генно-терапевтической субстанцией, несущей кДНК гена ANG, приводит к увеличению экспрессии гена ANG в клетках фибробластов. Результаты показаны на фигуре 3.
Пример 9.
Введение в кожу человека клеточной культуры фибробластов, трансфицированной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG с целью подтверждения увеличения после этого уровня экспрессии гена ANG в биоптате кожи человека.
С целью анализа изменения уровня экспрессии гена ANG в тканях человека, пациентам в кожу предплечья вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированных (А), трансфицированных вектором без вставки, например, pCMV6-XL5 (В) и трансфицированных генно- терапевтической субстанцией на основе pCMV6- ANG SEQ ID No:7(C) в комбинации с транспортными молекулами - липосомами TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA),
Приготовление суспензии липосом проводили по методике производителя (Promega, TransFast Transfection Reagent, Instruction for Use of Product, E2431 ) с некоторыми изменениями: к 0,4 мг порошка липосом добавляли 0,4 мл стерильной воды степени очистки Nuclease-Free. Суспензию хорошо перемешивали взбалтыванием. Полученный полупродукт суспензии липосом выдерживали в течение 18 часов при температуре - 20 °С, затем оттаивали при комнатной температуре, ресуспендировали встряхиванием или на настольном миксере типа «ВОРТЕКС».
Для приготовления комплекса ДНК-липосомы к 400 мкл раствора липосом (с концентрацией 1 мг/мл) добавляли 400 мкл раствора плазмидной ДНК (с концентрацией 150 мкг/мл) и тщательно перемешивали. Затем инкубировали смесь ДНК с липосомами в течение 5-10 минут при температуре 15 - 25°С и использовали далее в качестве генно-терапевтической субстанции.
Для последующей трансфекции клеток генно- терапевтической субстанцией выращивали первичные культуры фибробластов человека из биоптатов кожи пациентов по примеру 5.
Для трансфекции из лунок планшета с клеточной культурой осторожно отбирали среду (не нарушая клеточного слоя) и промывали клетки 3 мл буфера PBS. К раствору, содержащему комплексы ДНК-липосимы, добавляли 600 мкл среды DMEM с фетальной сывороткой и переносили эту смесь в лунки планшета с клетками. Клетки инкубировали с комплексами 2-3 часа при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% С02. Затем осторожно удаляли среду и промывали клеточный слой 3 мл буфера PBS. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02.
Часть клеточной культуры центрифугировали при 700 об/мин, дважды отмывали клетки физиологическим раствором, ресуспендировали в физиологическом растворе из расчёта 1 млн клеток в 200 мкл и использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Очаги введения культур фибробластов располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Оценку белка ангиогенина проводили в лизатах биоптатов кожи пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения суспензии фибробластов. Взятие биопсии осуществляли из участков введения суспензии фибробластов, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI рН 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Как видно из фигуры 4, в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных генно- терапевтической субстанцией на основе pCMV6- ANG SEQ ID No:7 (зона С), произошло увеличение количества белка ангиогенина, что может свидетельствовать об усилении экспрессии гена ANG. Тогда как при введении контрольных культур фибробластов (нетрансфицированных (зона А) и трансфицированных вектором без вставки кДНК гена ANG pCMV6-XL5 (зона В)) количество белка ангиогенина, в коже не изменялась.
Таким образом, показана эффективность генно- терапевтической субстанции при введении в кожу человека клеточной культуры фибробластов, трансфицированных полученной генно-терапевтической субстанцией, несущей модифицированную кДНК гена ANG, что приводит к повышению уровня экспрессии гена ANG в коже в зоне введения.
Пример 10.
Трансфекция культур фибробластов из биоптатов группы различных пациентов генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG.
С целью подтверждения индивидуального характера увеличения экспрессии гена ANG до различного уровня при трансфекции клеточных культур фибробластов пациентов генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными кДНК гена ANG и участком нативной кДНК гена ANG анализировали количественный уровень белка ангиогенина в клеточных лизатах фибробластов, трансфицированных разными генно-терапевтическими субстанциями по примеру 3, содержащими модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG в группе пациентов в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG.
Последовательности участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG приведена в перечне последовательностей, SEQ ID No: 1., последовательности модифицированных кДНК гена ANG приведены в перечне последовательностей (SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6, SEQ ID No: 7).
Вырастили культуры фибробластов из однотипных биоптатов кожи, отобранных из зоны внутренней боковой поверхности в зоне локтевого сустава 26 пациентов, выбранных случайным образом по примеру 5, отобрали аликвоты и оценили уровень белка ангиогенина, в клеточных лизатах. Клеточный осадок, соответствующий 2 х 106 клеток, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 MMNaCI, 1 мМ ЭДТА, 1 % Тритон Х- 00, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин, концентрацию белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда ([Bradford М.М. (1976) Anal.Biochem. 72: 248-254.]).
Затем каждую из 18-ти культур фибробластов разделили на 8 частей. Одну часть, обозначенную (А), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:1 , содержащей немодифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No: 1.) по примеру 2 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Вторую часть, обозначенную (В), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:2, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:2.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
3- ю часть, обозначенную (С), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:3, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:3.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
4- ю часть, обозначенную (D), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:4, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
5- ю часть, обозначенную (Е), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 5, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5.) no примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
6-ю часть, обозначенную (F), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:6, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
7- ю часть, обозначенную (G), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:7, содержащей вариант модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:7.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
8- ю часть, обозначенную (Н), трансфицировали по примеру 7 векторной плазмидой pCMV6-XL5, не содержащей кДНК гена ANG по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Оценку белка ангиогенина проводили в лизатах биоптатов кожи пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
По итогам определения количества белка ангиогенина выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни экспрессии и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1 . В эту группу вошло 5 культур из 26.
В группе 2 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:2. В эту группу вошло 2 культуры из 26.
В группе 3 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:3. В эту группу вошло 5 культур из 26.
В группе 4 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:4. В эту группу вошло 3 культуры из 26.
В группе 5 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 5. В эту группу вошло 2 культуры из 26.
В группе 6 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:6. В эту группу вошло 4 культуры из 26.
В группе 7 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при трансфекции модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:7 . В эту группу вошло 5 культур из 26.
Ни в одной из клеточных культур, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией с векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена ANG не было обнаружено максимальное количество белка ангиогенина, в отличие от клеточных культур, трансфицированных генно- терапевтическими субстанциями с генетическими конструкциями, содержащими кДНК гена ANG .
На фигуре 5 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентраций белка ангиогенина, (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и участок нативной кДНК гена ANG.
Из данного примера следует, что достижение максимального уровня экспрессии гена ANG в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, входящих в генно-терапевтические субстанции.
Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование биоптатов пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов на предмет максимальной эффективности терапевтического воздействия, созданных генно-терапевтических субстанций в рамках группы генно-терапевтических субстанций. Пример 1 1.
Введение в клеточную культуру эпителиальных клеток глаза человека генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG с целью подтверждения при этом увеличения экспрессии гена ANG.
Биопсийный материал из области лимба в виде круга диаметром 1 -1.5 мм помещали в чашку Петри в сбалансированный солевой раствор Хэнкса, добавляли диспазу (20 мкл 25 ед/мл) и гентамицин и инкубировали 24 часа при +4. Затем отделяли эпителиальный слой от стромы и нарезали обе ткани кусочками 1 -2 мм3.
Суспензию эпителиальных клеток получали путем инкубирования кусочков тканей в растворе Трипсин-ЭДТА в течение 15 минут при +37°С. Трипсинизацию останавливали добавлением соевого ингибитора трипсина в PBS. Клеточные суспензии отмывали центрифугированием при 700 об/мин и ресуспендировали в бессывороточной среде DMEM с гентамицином. Клетки растили в 25 см2 флаконах с 5 мл среды при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% С02. Через 24 часа среду с не прикрепившимися клетками удаляли и добавляли 5 мл свежей среды. Пересев производили каждые 7 дней в соотношении 1 :2 - 1 :3.
Трансфекцию этой клеточной культуры проводили генно-терапевтической субстанцией на основе плазмиды pCMV6-Kan/Neo ANG SEQ ID No:2, используя в качестве транспортной молекулы РАМАМ-дендримеры (Weihai CY Dendrimer Technology). В качестве контроля использовали плазмиду pCMV6- Kan/Neo без кДНК гена ANG.
Каждые 24 часа из каждой культуры отбирали аликвоту по 500 мкл суспензии с целью выделения РНК и анализа уровня специфической кДНК. Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasyMiniKit (Qiagen, Germany). Образцы РНК были сгруппированы в 3 группы по 8 образцов с близкой концентрацией и объединены. Анализ уровня специфической кДНК гена ANG проводили с помощью амплификации в режиме реального времени по методике и с праймерами по примеру 6, используя набор реагентов iTaqUniversalSYBRGreenSupermix (Bio-Rad, USA), амплификатор CFX96 (Bio-RadUSA) и программное обеспечение Bio-RadCFXManager 2.1. Максимальное увеличение экспрессии (транскрипции) гена ANG наблюдали на 3 сутки.
На фигуре 6 приведены кривые накопления специфического продукта амплификации, соответствующего кДНК гена ANG в эпителиальных клетках роговицы.
Показано, что, в клеточной культуре эпителиальных клеток глаза человека, трансфицированной генно- терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG, произошло увеличение экспрессии гена ANG при использовании генно- терапевтической субстанции с кДНК гена ANG.
Пример 12. Трансфекция клеточной культуры эпителия слизистой оболочки полости рта генно-терапевтической субстанцией с целью подтверждения при этом увеличения экспрессии гена ANG в данной культуре клеток.
С целью выяснения эффективности генно- терапевтической субстанции, содержащей кДНК гена ANG, в различных типах клеток, а также с целью оценки влияния транспортной молекулы на успешность трансфекции этой субстанцией - трансфицировали эпителий слизистой оболочки полости рта человека, используя в качестве транспортной молекулы амфифильные блок-сополимеры.
Биоптаты слизистой оболочки полости рта массой 40 мг измельчали на фрагменты до 10 мм3. Выращивание первичной культуры клеток осуществляют на чашках Петри при 37 оС в атмосфере, содержащей 5 % С02 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Трипсинизацию и пересев производят каждые 5 дней, для трипсинизации клетки промывали раствором PBS и инкубировали 30 минут при 37оС в растворе, содержащем 0.05% трипсина и 1 мМ ЭДТА. Для нейтрализации трипсина к клеткам добавляли 5 мл культуральной среды и центрифугировали суспензию при 600 об/мин 5 минут. Рост культуры клеток эпителия после 4-5 пассажей осуществляли в культуральных флаконах ёмкостью 75 мл в среде, содержащей 10 г/л DMEM, 3.7 г/л Na2C03, 2.4 г/л HEPES, 10% фетальной сыворотки и 100 Ед/мл ампициллина. Смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 105 клеток.
Для трансфекции клеток генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена ANG использовали амфифильные блок-сополимеры. Применяли методику по (IntJPharm, 2012, 427, 80-87) или в (Macromol. Biosci.201 1 , 11 , 652-661 ), с некоторыми изменениями. Блок-сополимер синтезировали из смеси линейного полиэтиленимина (ПЭИ) (Polyscience Inc., США) и бифункционального полиэтиленгликоля (ПЭГ) 1\1-гидроксисукцинимидил-75-Ы-(3- малеимидопропионил)-амидо-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31 , 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61 , 64, 67, 70, 73 - тетракосаоксапента-гептаконтаноата (MAL-dPEG™-NHS ester, Quanta BioDesign, Ltd., США) в боратном буфере. Полиплекс готовили за 1 час до введения в клетки, смешивая раствор блок-сополимера с ДНК генетической конструкции pCMV6- Kan/Neo ANG SEQ ID No:3 с модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:3. Смесь для трансфекции добавляли к суспензии клеток в 1 мл культуральной среды DMEM с 10 % фетальной сывороткой и ампициллином.
Так как для трансфекции использовали конструкцию, содержащую фактор селекции (устойчивость к генетицину), то клетки после трансфекции выращивали в 25 см3 флаконах с 5 мл среды с генетицином в течение 12 дней, меняя среду каждые 4 дня. Каждые 24 часа из каждой культуры отбирали аликвоту по 500 мкл суспензии с целью выделения РНК и анализа уровня специфической кДНК. Выделение РНК производили с помощью набора RNeasyMiniKit (Qiagen, Germany). Образцы РНК были сгруппированы в 3 группы по 8 образцов с близкой концентрацией и объединены. Анализ уровня специфической кДНК гена ANG проводили с помощью амплификации в режиме реального времени по методике и с праймерами по примеру 6, используя набор реагентов iTaqUniversalSYBRGreenSupermix (Bio-Rad, USA), амплификатор CFX96 (Bio-Rad, USA) и программное обеспечение Bio-RadCFXManager 2.1. Максимальное увеличение транскрипции ANG наблюдали на 4 сутки. На фигуре 7 приведены кривые накопления специфического продукта амплификации, соответствующего кДНК гена ANG.
Показано, что в клетках эпителия слизистой оболочки полости рта, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- Kan/Neo ANG SEQ ID No:3, используя в качестве транспортной молекулы амфифильные блок-сополимеры, наблюдается увеличение экспрессии целевого гена ANG.
Пример 13.
Введение в кожу человека генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG с целью подтверждения при этом увеличения уровня экспрессии целевого гена ANG в коже человека.
С целью анализа увеличения уровня экспрессии целевого гена ANG пациентам вводили генно- терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию с кДНК гена ANG (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья.
В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCMV6 ANG SEQ ID No:4, которая содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4) и плазмиду pCMV6-XL5, используемую в качестве плацебо - которая не содержит кДНК гена ANG, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease- Free. Для получения генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.
Полученные генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,3 мл для каждого. Очаги введения генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Количественную оценку белка ангиогенина проводили в лизатах биоптатов кожи пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи в зоне введения генно- терапевтической субстанции и плацебо, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL) далее, как описано в примере 9.
Показано, что в коже пациента в области введения генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG, произошло увеличение количества белка ангиогенина, тогда как при введении плацебо, количество белка ангиогенина в коже не изменялась, что говорит об увеличении экспрессии гена ANG при использовании генно- терапевтической субстанции с кДНК гена ANG. Результаты отражены на фигуре 8.
Пример 14.
Введение в слизистую оболочку полости рта человека генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG с целью подтверждения при этом увеличения уровня экспрессии целевого гена ANG в слизистой оболочке рта человека человека.
С целью анализа уровня экспрессии целевого гена ANG пациентам вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию с кДНК гена ANG (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку полости рта.
В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCDNA 3.1 ANG SEQ ID No:5, которая содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5), и плазмиду pCDNA 3.1 (+), используемую в качестве плацебо, которая не содержит кДНК гена ANG, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.
Полученные генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 1 - 2. Объем вводимого раствора генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,3 мл для каждого. Очаги введения генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 2 - 4 см друг от друга.
Количественную оценку белка ангиогенина проводили в лизатах биоптатов слизистой оболочки полости рта пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков слизистой оболочки полости рта в зоне введения генно-терапевтической субстанции, а также из интактных участков и в зоне введения плацебо, используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL), далее по примеру 9.
Показано, что слизистой оболочке полости рта пациента в области введения генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG, произошло увеличение белка ангиогенина, тогда как при введении плацебо количество белка ангиогенина в слизистой оболочке рта не изменялось, что подтверждает увеличение экспрессии гена ANG при использовании генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG. Результаты отражены на фигуре 9.
Пример 15.
Введение в мышечную ткань человека генно- терапевтической субстанции с кДНК гена ANG с целью подтверждения при этом увеличения уровня экспрессии целевого гена ANG в мышечной ткани человека.
С целью анализа уровня экспрессии целевого гена ANG пациентам вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья.
В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCMV6-Kan/Neo ANG SEQ ID No:6, которая содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6), и плазмиду pCMV6-Kan/Neo, используемую в качестве плацебо, которая не содержит кДНК гена ANG, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free.
Для получения генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9. Полученные генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 15 - 20 мм. Объем вводимого раствора генно- терапевтической субстанции и плацебо - около 0,5 мл для каждого. Очаги введения генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 5 -7 см друг от друга
Количественную оценку белка ангиогенина проводили в лизатах биоптатов мышечной ткани пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани в зоне введения генно-терапевтической субстанции, а также из интактных участков мышцы и в зоне введения плацебо, используя автоматическое устройство для взятия биопсии MAGNUM (компания BARD, USA), далее по примеру 9.
Показано, что, в мышечной ткани пациента в области введения генно-терапевтической субстанции с кДНК гена ANG, произошло увеличение белка ангиогенина, тогда как при введении плацебо количество белка ангиогенина в мышечной ткани не изменялась, что подтверждает увеличение экспрессии гена ANG при использовании генно- терапевтической субстанции с кДНК гена ANG. Результаты отражены на фигуре 10 Пример 16.
Введение группе различных пациентов генно- терапевтических субстанций содержащих модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG.
С целью подтверждения индивидуального характера увеличения уровня экспрессии целевого гена ANG до различного уровня при введении в кожу пациентов генно- терапевтических субстанций с модифицированными и немодифицированной кДНК гена ANG анализировали количественный уровень белка ангиогенина, в лизате биоптатов кожи группы пациентов в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG.
Последовательность участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG приведена в перечне последовательностей, SEQ ANG ID No: 1 , последовательности модифицированных кДНК гена ANG приведены в перечне последовательностей (SEQ ANG ID No:2, SEQ ANG ID No:3, SEQ ANG ID No:4, SEQ ANG ID No:5, SEQ ANG ID No:6, SEQ ANG ID No:7).
При этом генетические конструкции, одна из которых содержит участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No:1 ), вторая генетическая конструкция содержит участок модифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No:2), третья генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:3), четвертая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4), пятая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5), шестая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6), седьмая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:7), восьмая генетическая конструкция (плацебо), представляет собой вектор pCMV6 XL5, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генно- терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Полученные семь вариантов генно-терапевтических субстанций и плацебо использовали для введения в кожу пациентам. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора каждой генно-терапевтической субстанции составлял около 0,3 мл. Очаги введения генно-терапевтических субстанций и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Каждому из 31-го пациента, которые были отобраны в случайном порядке, вводили 7 генно-терапевтических субстанций и плацебо в кожу предплечья.
Биопсийные образцы брали через 72 часа после введения генно-терапевтических субстанций. Взятие биопсии осуществляли из участков введения генно- терапевтических субстанций, плацебо, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI рН 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
А - биоптат, полученный после введения генно- терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:1 , содержащий немодифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No: 1.) по примеру 2 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. В - биоптат, полученный после введения генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:2, содержащий модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:2.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. С - биоптат, полученный после введения генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:3, содержащий модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:3.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
D - биоптат, полученный после введения генно- терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:4, содержащий модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Е - биоптат, полученный после введения генно- терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:5, содержащий модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
F - биоптат, полученный после введения генно- терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:6, содержащий модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
G - биоптат, полученный после введения генно- терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No:7, содержащий модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:7.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Н - биоптат, полученный после введения векторной плазмиды pCMV6-XL5, не содержащей кДНК гена ANG по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Количественную оценку белка ангиогенина проводили в девяти биоптатах кожи от каждого пациента (от А до Н и в биоптате интактной кожи) через 72 часа после введения генно-терапевтических субстанций методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
По итогам анализа количественного уровня белка ангиогенина, выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни белка ангиогенина и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия: В группе 1 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1 . В эту группу вошло 7 биоптатов из 31.
В группе 2 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:2. В эту группу вошло 2 биоптата из 31.
В группе 3 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:3. В эту группу вошло 5 биоптатов из 31.
В группе 4 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:4. В эту группу вошло 4 биоптата из 31.
В группе 5 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:5. В эту группу вошло 3 биоптата из 31.
В группе 6 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:6. В эту группу вошло 4 биоптата из 31.
В группе 7 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалось при введении модифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:7. В эту группу вошло 6 биоптатов из 31.
Ни в одном из биоптатов, в которые были введены генно-терапевтические субстанции плацебо - векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена ANG, не было обнаружено максимальное количество белка ангиогенина, в отличие от биоптатов, в которые были введены генно- терапевтические субстанции с генетическими конструкциями, содержащими кДНК гена ANG. На фигуре 1 1 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и участок нативной кДНК гена ANG.
Из данного примера следует, что достижение максимального уровня белка ангиогенина в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу генно- терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, входящих в генно- терапевтические субстанции.
Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование биоптатов пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов на предмет максимальной эффективности терапевтического воздействия, созданных генно-терапевтических субстанций в рамках группы генно-терапевтических субстанций.
Пример 17. Трансфекция клеточной линии фибробластов пациента разными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG с целью персонализированного выбора из группы генно- терапевтических субстанций наиболее эффективной генно- терапевтической субстанции применительно к данному пациенту для последующей трансфекции этой субстанцией клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно- терапевтической субстанции анализировали количество белка ангиогенина, в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генно- терапевтическими субстанциями, содержащими участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG и/или модифицированные кДНК гена ANG.
Последовательность участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG приведена в перечне последовательностей, SEQ ANG ID No: 1 , последовательности модифицированных кДНК гена ANG приведены в перечне последовательностей (SEQ ANG ID No:2, SEQ ANG ID No:3, SEQ ANG ID No:4, SEQ ANG ID No:5, SEQ ANG ID No:6, SEQ ANG ID No:7).
Культуры фибробластов из биоптата пациента вырастили по примеру 5, отобрали аликвоты и провели клеточный лизис: клеточный осадок, соответствующий 2 х 106 клеток, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА, 1 % Тритон Х-100, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин.
Затем культуру фибробластов пациента разделили на 8 частей. Первую часть, обозначенную (А), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 1 , содержащей участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No: 1.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Вторую часть, обозначенную (В), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:2, содержащей участок модифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No:2.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Третью часть, обозначенную (С), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:3, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:3.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Четвертую часть, обозначенную (D), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:4, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. Пятую часть, обозначенную (Е), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:5, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Шестую часть, обозначенную (F), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:6, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Седьмую часть, обозначенную (G), трансфицировали по примеру 7 генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No:7, содержащей модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:7.) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Восьмую часть, обозначенную (Н), трансфицировали по примеру 7 векторной плазмидой pCMV6-XL5, не содержащей кДНК гена ANG по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Определение количества белка ангиогенина, в клеточных лизатах фибробластов пациента проводили через 72 часа после трансфекции методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8. По итогам определения белка ангиогенина, в культуре фибробластов пациента выделили вариант генно- терапевтической субстанции, при трансфекции которой наблюдается максимальное количество белка ангиогенина, в лизате клеточной культуры и соответственно наблюдается максимальная экспрессия гена ANG. В данном эксперименте максимальное количество белка ангиогенина, в лизате отмечено при трансфекции генно- терапевтической субстанцией на базе pCMV6 ANG SEQ ID No:1 , содержащей немодифицированную кДНК гена ANG, что показано на фигуре 12.
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.
Пример 18.
Введение в кожу пациента различных генно- терапевтических субстанций, содержащих модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG с целью выбора из группы генно-терапевтических субстанций наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции применительно к данному пациенту для последующего введения этой субстанции пациенту в рамках терапевтической процедуры.
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно- терапевтической субстанции анализировали количество W белка ангиогенина, в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему в кожу генно- терапевтических субстанций, содержащих модифицированные кДНК гена ANG и/или участок нативной 5 кДНК гена ANG.
Последовательность участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG приведена в перечне последовательностей, SEQ ANG ID No:1 , последовательности модифицированных кДНК гена ANG ю приведены в перечне последовательностей (SEQ ANG ID No:2, SEQ ANG ID No:3, SEQ ANG ID No:4, SEQ ANG ID No:5, SEQ ANG ID No:6, SEQ ANG ID No:7).
Пациенту вводили 7 генно-терапевтических субстанций и плацебо в кожу предплечья.
15 Первая генно-терапевтическая субстанция (А) на базе pCMV6- SEQ ID No:1 , содержащая участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No:1.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
20 Вторая генно-терапевтическая субстанция(В) на базе pCMV6- SEQ ID No:2, содержащая модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:2.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Третья генно-терапевтическая субстанция (С) на базе
25 pCMV6- SEQ ID No:3, содержащая модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:3.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Четвертая генно-терапевтическая субстанция (D) на базе pCMV6- SEQ ID No:4, содержащая модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Пятая генно-терапевтическая субстанция (Е) на базе pCMV6- SEQ ID No:5, содержащая модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Шестая генно-терапевтическая субстанция (F) на базе pCMV6- SEQ ID No:6, содержащая модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Седьмая генно-терапевтическая субстанция (G) на базе pCMV6- SEQ ID No:7, содержащая модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:7.) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Восьмая векторная плазмида pCMV6-XL5, не содержащая кДНК гена ANG по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
При этом генетические конструкции, одна из которых содержит участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG (SEQ ID No: 1 ), вторая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:2), третья генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:3), четвертая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:4), пятая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:5), шестая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:6), седьмая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена ANG (SEQ ID No:7), восьмая плазмида (плацебо), представляет собой вектор pCMV6 XL5, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-дендример по примеру 7.
Полученные семь вариантов генно-терапевтических субстанций и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм в кожу предплечья пациентов. Объем вводимого раствора каждой генно-терапевтической субстанции составлял около 0,3 мл. Очаги введения генно- терапевтических субстанций и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Биопсийные образцы брали через 72 часа после введения генно-терапевтических субстанций. Взятие биопсии осуществляли из участков введения генно- терапевтических субстанций, плацебо, а также из интактной кожи используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI рН 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Определение количества белка ангиогенина проводили в девяти биоптатах кожи пациента через 72 часа после введения генно-терапевтических субстанций методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 8.
По итогам определения количества белка ангиогенина, в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант генно- терапевтической субстанции, при введении которой в кожу наблюдается максимальное количество белка ангиогенина, в лизате биоптата кожи и соответственно наблюдается максимальная экспрессия гена ANG. В данном эксперименте максимальное количество целевого белка в лизате биоптата кожи отмечено при введении генно- терапевтической субстанции на базе pCMV6 ANG SEQ ID No:7, содержащей модифицированную кДНК гена ANG, что показано на фигуре 13
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры.
Создано средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества белка ангиогенина, состоящее из одной или нескольких генно-терапевтических субстанций из группы генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, возникших вследствие недостаточной экспрессии гена ANG, способ его получения и использования.
Созданное средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества белка ангиогенина, состоящее из одной или нескольких генно- терапевтических субстанций из группы генно- терапевтических субстанций с использованием одной из модифицированных кДНК гена ANG или участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG позволяет на практике использовать входящие в группу генно- терапевтические субстанции для повышения до необходимого уровня белка ангиогенина, в различных клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем увеличения экспрессии гена ANG.
В результате проведения предварительных исследований биоптата пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов, определяют, какой вариант генно-терапевтической субстанции из созданной группы генно-терапевтических субстанций необходимо выбрать для данного пациента для того, чтобы повысить количество белка ангиогенина, в клетках этих органов и тканей и/или органах и тканях до необходимого уровня применительно к конкретному пациенту. В тех случаях, когда использование генно-терапевтической субстанции с участком нативной немодифицированной кДНК гена ANG не приводит к желаемому изменению уровня белка ангиогенина, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях, необходимо применять субстанцию на основе модифицированной кДНК гена ANG, приводящей к более эффективной экспрессии гена ANG.
При использовании заявленной генно-терапевтической субстанции не происходит встраивания экзогенного генетического материала в геном клетки.
Группа генно-терапевтических субстанций обеспечивает высокий уровень экспрессии гена ANG, повышая количество белка ангиогенина, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека в частности, в гепатоцитах, нейронах, клетках сосудистого эндотелия, мышечных клетках, фибробластах, клетках эпителия, лимфоцитах, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в спинном мозге, кровеносных сосудах, сердце, кишечнике, желудке, печени, желчном пузыре, легких, органах выделительной и половой систем (мочевом пузыре, мочеточниках, матке, яичниках), гладких и скелетных мышцах, интерстициальной, эндотелиальной, эпителиальной, нервной, мышечной тканях, плацентарной ткани, в дерме (коже) в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих генно- терапевтических субстанций в органы и ткани человека.
Таким образом, приведённые примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно, создание высокоэффективного средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества белка ангиогенина, на основе генно- терапевтических субстанций с геном ANG, представляющего собой группу генно-терапевтических субстанций, при использовании которых с учетом индивидуальных особенностей пациента, происходит повышение уровня экспрессии гена ANG и/или повышение количества белка ангиогенина, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма.
Кроме этого при введении генетических конструкций в отличие от введения непосредственно белка, снижается требуемая частота их введения в связи с пролонгированным действием, а также облегчается внутриклеточная доставка.
Повышение эффективности коррекции количественного уровня белка ангиогенина, в клетках органов и тканей человека достигают за счет того, что при недостаточном количестве этого белка вследствие дефекта гена ANG используют не белок, а генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, кодирующую этот белок.
Промышленная применимость.
Все приведенные примеры по созданию и использованию созданной группы генно-терапевтических субстанций подтверждают её промышленную применимость. Перечень сокращений
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
мл - миллилитр, мкл - микролитр
л - литр
мкг - микрограмм
мг - миллиграмм
г - грамм
мкМ - микромоль
мМ - миллимоль
об/мин - обороты в минуту
нм - нанометр
см - сантиметр
мВт - милливатт
о. е. ф-относительная единица флуоресценции
ГТС - генно-терапевтическая субстанция

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности 5 белка ангиогенина, на основе генно-терапевтических субстанций с геном ANG, представляющее собой, по крайней мере, одну генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет генетическую конструкцию ю на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена ANG, с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и З'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID
15 No:1 , или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют SEQ ID No:2, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых 0 содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие повышение экспрессии гена ANG в эукариотических клетках, в клетках органов и тканей человека, где клетки органов и тканей выбраны из фибробластов, эпителиальных клеток роговицы глаза, органы и ткани 5 выбраны из кожи, слизистой оболочки полости рта или мышечной ткани, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этого средства в органы и ткани человека.
2. Средство по п. 1., отличающееся тем, что каждая генетическая конструкция с модифицированной кДНК гена ANG содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена
5 ANG, которая несёт модификации, не затрагивающие структуру белка ангиогенина, а именно: нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, не влияющие на ю кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность.
3. Средство по п. 1 , отличающееся тем, что в качестве транспортной молекулы используют.липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные
15 блоксополимеры.
4. Способ получения средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, по п.1., 0 заключающийся в получении каждой генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций, при этом получают кДНК гена ANG, затем помещают кДНК и регуляторные элементы в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой 5 кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество субстанции, затем комбинируют субстанцию с транспортной молекулой для трансфекции полученным средством клеток органов и тканей и/или введения полученного средства в органы и ткани человека, при этом используют кДНК гена ANG с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и З'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No:1 , или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют, или SEQ ID No:2, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или используют сочетание этих субстанций .
5. Способ использования средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина по п.1 , заключается в трансфекции средством для лечения на основе генно-терапевтической субстанции или субстанций, выбранной или выбранных из группы созданных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей пациента и/или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток пациента, трансфицированных созданным средством для лечения на основе генно-терапевтической субстанции или субстанций, выбранной или выбранных из группы созданных генно- терапевтических субстанций, и/или во введении в органы и ткани пациента средства для лечения на основе генно- терапевтической субстанции или субстанций, выбранной или выбранных из группы созданных генно-терапевтических субстанций, или сочетанием обозначенных способов.
PCT/RU2018/000161 2017-03-17 2018-03-16 Средство для лечения на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования WO2018169451A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017108957A RU2665771C1 (ru) 2017-03-17 2017-03-17 Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ang и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования
RU2017108957 2017-03-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018169451A1 true WO2018169451A1 (ru) 2018-09-20

Family

ID=63459881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000161 WO2018169451A1 (ru) 2017-03-17 2018-03-16 Средство для лечения на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2665771C1 (ru)
WO (1) WO2018169451A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022025783A1 (ru) * 2020-07-28 2022-02-03 Общество с ограниченной ответственностью "Ангиолайф" Применения комбинации генов ангиогенных и нейротрофических факторов

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491097C1 (ru) * 2012-02-16 2013-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" Фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза
RU2519645C2 (ru) * 2008-05-14 2014-06-20 Эгрикалчер Виктория Сервисиз Пти Лтд Применение ангиогенина или агонистов ангиогенина для лечения заболеваний и нарушений
US20170071972A1 (en) * 2014-04-18 2017-03-16 Genethon Method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2519645C2 (ru) * 2008-05-14 2014-06-20 Эгрикалчер Виктория Сервисиз Пти Лтд Применение ангиогенина или агонистов ангиогенина для лечения заболеваний и нарушений
RU2491097C1 (ru) * 2012-02-16 2013-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" Фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза
US20170071972A1 (en) * 2014-04-18 2017-03-16 Genethon Method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Nucleotide [O] 6 June 2016 (2016-06-06), XP055549108, Database accession no. NC_000014.9 *
KURACHI K. ET AL.: "Expression of Human Angiogenin in Cultured Baby Hamster Kidney Cells", BIOCHEMISTRY, vol. 27, no. 17, 1988, pages 6557 - 6562, XP055549110 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2665771C1 (ru) 2018-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2886480T3 (es) Métodos y composiciones para el tratamiento guiado por ARN de una infección por VIH
RU2658428C1 (ru) Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена Р4НА1 и/или уменьшением количества белка пролил 4- гидрокислазы альфа 1 на основе генно-терапевтических субстанций с геном Р4НА1, способ получения и использования
CN115851665A (zh) 工程化的Cas12i核酸酶及其效应蛋白以及用途
US10940215B2 (en) Adipocyte-targeting non-viral gene delivery complex comprising dual plasmid vector
CA2360878A1 (en) Gene repair involving excision of targeting dna
CN112662674A (zh) 靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用
KR20230003511A (ko) 안면견갑상완 근이영양증에 대한 crispr-억제
TW201023898A (en) Use of a truncated eIF-5A1 polynucleotide to induce apoptosis in cancer cells
CN117337326A (zh) 工程化的Cas12i核酸酶、效应蛋白及其用途
ES2295037T3 (es) Procedimientos que utilizan el sistema toxina/antitoxina bacteriana pard kis/pard kid para destruir celulas eucariotas.
RU2665771C1 (ru) Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ang и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования
KR20180102025A (ko) C2c1 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 이를 이용한 유전체 교정 방법
RU2649814C1 (ru) Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена сат и/или уменьшением активности белка каталазы на основе генно-терапевтических субстанций с геном сат, способ получения и использования
RU2651048C1 (ru) Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена il-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном il-11, способ получения и использования
US11352639B2 (en) Gene therapy based on vector VTVAF17
RU2662944C1 (ru) Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена prok 1 и/или уменьшением количества белка прокинетицина 1 на основе генно-терапевтических субстанций с геном prok 1, способ получения и использования
RU2677695C2 (ru) Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена prok 2 и/или уменьшением количества белка прокинетицина 2, на основе генно-терапевтических субстанций с геном prok 2, способ получения и использования
RU2651757C2 (ru) Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена sod2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования
RU2652353C2 (ru) Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена sod1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования
Misic et al. Effect of endonuclease G depletion on plasmid DNA uptake and levels of homologous recombination in hela cells
RU2652318C2 (ru) Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена clca2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования
RU2700649C2 (ru) Генетическая конструкция на основе невирусной векторной плазмиды, включающей кДНК гена Р4НА2, для купирования проявлений состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена Р4НА2 и/или уменьшением количества белка пролил 4-гидрокислаза альфа 2, способ получения и использования
WO2020139151A1 (en) Gene therapy dna vector based on gene therapy dna vector vtvaf17
JP2001512690A (ja) 細胞のゲノムに組み込まれる付加的核酸物質を細胞に導入するためのベクターおよび方法
RU2705252C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген CFTR, или NOS1, или AQ1, или AQ3, или AQ5, для лечения заболеваний, связанных с необходимостью повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и использования, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CFTR, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NOS1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-AQ1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-AQ3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-AQ5, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18767986

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18767986

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1