WO2018159632A1 - 子宮内膜症改善用素材およびその製造方法 - Google Patents

子宮内膜症改善用素材およびその製造方法 Download PDF

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aglycone
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智博 天海
重廣　宗一郎
城 北脇
宰 ▲高▼岡
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ニチモウ株式会社
京都府公立大学法人
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Definitions

  • the present invention relates to an endometriosis ameliorating material, and more particularly to an endometriosis ameliorating material using aglycone isoflavone (also referred to as “isoflavone aglycone”) and a method for producing the same.
  • aglycone isoflavone also referred to as “isoflavone aglycone”
  • Patent Document 1 a therapeutic agent for endometriosis-related diseases (see Patent Document 1) has been proposed.
  • the therapeutic agent described in Patent Document 1 is not intended to treat in response to estrogen that many women have in the body.
  • endometriosis is a disease in which an endometrial-like tissue engrafts outside the uterine cavity and affects 5 to 10% of women of reproductive age (Non-patent Document 1).
  • the main symptoms of endometriosis are pelvic pain and infertility (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 It is well known that estrogen is involved in the development and maintenance of lesions because symptoms improve when menopause (Non-patent Document 3). In the endometriotic lesion, estrogen is directly involved in inflammation by inducing cytokines (Non-patent Document 4).
  • Non-patent Document 5 Inflammatory cytokines promote estrogen synthesis locally in the endometriotic lesion, and as a result, positive feedback promotes the progression and maintenance of the lesion.
  • endometriosis is considered as an estrogen-dependent inflammatory disease, and both hormones and inflammatory cytokines are involved in lesion progression, maintenance, and clinical symptoms (Non-Patent Document 6).
  • Endocrine treatments for endometriosis such as low-dose estrogen / progestin, GnRH agonists, and progestins are effective for lesion progression and pelvic pain. However, since they suppress ovulation, they cannot be used by women who wish to become pregnant immediately. A new endometriosis drug that has few side effects and can be used for all endometriosis patients is desired.
  • Isoflavones are non-steroidal natural products derived from plants with weak estrogenic activity. Since isoflavone is similar in structure to estrogen, it can bind to estrogen receptor (ER) and exert estrogenic action. Since isoflavones have a very low activity of 1/1000 to 1 / 10,000 of estrogen, isoflavones may have antiestrogenic effects on women of reproductive age with high estrogen blood levels. Soybeans mainly contain genistin and daidzin as glycoside isoflavones, and are valuable functional ingredients that are only 0.2 to 0.3% of the weight of soybeans. Soybean germ isoflavone content is about Ten times higher.
  • composition of isoflavones contained in the germ is different from the composition of isoflavones contained in whole soybeans, and contains a large amount of daidzin isoflavones.
  • glycoside type isoflavones are not absorbed into the body as they are, but are absorbed after the sugar chains of glycoside type isoflavones are broken down by intestinal bacterial enzymes to become aglycone type isoflavones.
  • Aglycone type isoflavones are absorbed quickly in the stomach and intestines regardless of the action of intestinal bacteria because the sugar chains have already been degraded (Non-Patent Documents 7 to 9).
  • Non-patent Document 10 oral intake of isoflavones in patients undergoing in vitro fertilization has improved the effect of progesterone in the luteal phase, suggesting the possibility of an increase in embryo transfer success rate and clinical pregnancy rate.
  • Non-patent Document 11 plant-derived isoflavones regulate prostaglandin secretion from the endometrium in the early stage of pregnancy.
  • Non-patent Document 12 In a randomized trial of 190 postmenopausal women, 12 weeks of oral intake of agrimax alleviated hot flash symptoms (Non-patent Document 12). Aglycone type isoflavones are absorbed faster in the body than glycosides and have a higher absorption rate (Non-patent Document 13).
  • Genistein promotes cell growth of estrogen-dependent breast cancer cells (MCF-7) (Non-Patent Document 14) and attenuates the inhibitory effect of Tamoxifen (Non-Patent Document 15).
  • daidzein suppressed the growth of MCF-7 (Non-Patent Document 16) and improved the therapeutic effect of Tamoxifen (Non-Patent Document 17).
  • Gwprotein-coupled estrogen receptor 1 agonist G-1 induces cell cycle arrest in the mitotic tosis Fertil Steril 2015; 103: 1228-36.
  • Reis FM Petraglia F, Taylor RN. Endometriosis: hormone regulation and clinical consequences of chemotaxis and apoptosis.
  • Monsivais D Dyson MT, Yin P, Coon JS, Navarro A, Feng G, Malpani SS, Ono M, Ercan CM, Wei JJ, Pavone ME, Su E, Bulun SE.
  • ER ⁇ - and prosregland pro via Ras-like and estrogen-regulated growth inhibitor in endometriosis.
  • Woclawek-Potocka I Bah MM, Korzekwa A, Piskula MK, Wiczkowski W, Depta A, Skarzynski DJ. Soybean-derived phytoestrogens regulate prostaglandin secretion .
  • Daidzein-rich isoflavone aglycones are potentially effective in reducing hot flashes in menopausal women. Menopause 32.
  • Izumi T Piskula MK, Osawa S, Obata A, Tobe K, Saito M, Kataoka S, Kubota Y, Kikuchi M.
  • Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and in higher amounts than in 130 -9.
  • Physiological concentrations of dietary genistein dose-dependently stimulate growth of estrogen-dependent human breast cancer athim ; 131: 2957-62.
  • Dietary genistein negates the inhibitory effect of tamoxifen on growth of estrogen-dependent human breast cancer (MCF-7) cells implant -7.
  • TGF- ⁇ 1 induces proteinase-activated receptorometriotic and stimulates PAR2 activation-induced secretion of IL-6.
  • Takai E Taniguchi F, Negamura K, Uegaki T, Iwabe T, Harada T. Parthenolide reduces cell proliferation and prostaglandin estradiol synthesis in human endometriotic stromal cells and inhibits .
  • Vercellini P Cortesi I, Crosignani PG.
  • the present invention has been made in view of the above points, and provides a material for improving endometriosis, which is a material using aglycone-type isoflavones and can improve endometriosis, and a method for producing the same. It is intended to provide.
  • the present inventors have intensively studied and used endometriotic stromal cells isolated from endometriotic cysts and a mouse model of endometriosis, and aglycone for endometriosis.
  • the following material for improving endometriosis according to the present invention was completed by comparing the type isoflavone effect with the effect of glycoside type isoflavone.
  • Agrimax registered trademark which is a material produced by the production method based on Patent Document 2 and Patent Document 3 was used.
  • the first embodiment of the material for improving endometriosis according to the present invention is characterized by having an aglycone type isoflavone having an action of improving endometriosis.
  • endometriosis is improved by administering and applying the aglycone type isoflavone by some method.
  • the material for improving endometriosis of the second form according to the present invention is, in the first form,
  • the effect of improving the endometriosis is ⁇ Inhibiting the growth of endometriotic stromal cells ⁇ Reducing the gene expression of IL-6, IL-8, aromatase and COX-2 in endometriotic cells ⁇ PGE2 in endometriotic cells Decrease in protein level ⁇ Increase aromatase enzyme activity in endometriosis cells ⁇ Inhibit TNF- ⁇ -induced phosphorylation of I ⁇ B in endometriosis cells ⁇ In endometriosis cells Inhibiting p65 nuclear uptake by fluorescent immunostaining ⁇ PHTPP, an ER ⁇ antagonist, suppresses the growth inhibitory effect of aglycone isoflavones on endometriotic cells ⁇ ER ⁇ knockdown cells aglycone on endometriotic cells -Cannot cancel the effect of ER ⁇ antagonist MPP to improve endometrios
  • the method for producing an endometriosis-improving material according to the present invention is a method of hydrolyzing proteins in the product by inoculating a koji mold with beans and making a koji, and then adding the product to the product obtained by the koji making process.
  • the glycosides of the isoflavone compound in the beans are decomposed to produce an isoflavone compound containing a large amount of aglycone, and a material for improving endometriosis containing the aglycone-type isoflavone using the beans as a raw material is produced. It is characterized by doing.
  • endometriosis can be improved by a material using aglycone type isoflavones.
  • the method for producing a material for improving endometriosis it is possible to reliably produce a material for improving endometriosis using an aglycone type isoflavone that can improve endometriosis.
  • A is a characteristic diagram for proliferation of endometriotic stromal cells and normal endometrium by Agrimax
  • B is a characteristic chart for proliferation of endometriotic stromal cells and normal endometrium by isoflavone 40 (described later).
  • A is a characteristic diagram showing the state of gene expression for IL-6, IL-8, aromatase and COX-2 based on real-time PCR, agrimax, isoflavone 40, B is a control for PGE 2 protein level, agrimax , C is a control for aromatase enzyme activity, a characteristic diagram for agrimax A is a characteristic diagram regarding agrimax related to suppression of phosphorylation of I ⁇ B promoted by TNF- ⁇ , and B is a characteristic diagram regarding agrimax regarding inhibition of p65 uptake.
  • A is a characteristic diagram relating to cell growth inhibition between Agrimax and PHTPP
  • B is a characteristic diagram relating to cell growth inhibition between Agrimax and MPP
  • C is a characteristic diagram relating to cell growth inhibition of Agrimax against SiER ⁇ and control
  • D is a characteristic diagram of SGK1 gene expression between agrimax and control
  • E is an explanatory diagram showing the pharmacological mechanism of agrimax
  • A is a photograph showing an endometriosis-like lesion
  • B is a photograph showing the size of the lesion of A
  • C is a characteristic diagram showing the number of cysts in a mouse administered with control
  • D is a photograph of C Characteristic diagram showing cyst weight in case
  • E is a characteristic diagram showing Ki67 staining ratio of cyst part in mice administered with control and agrimax
  • the agrimax (manufactured by Nichimo Biotics Co., Ltd.) was used as an aglycone type isoflavone which is a material for improving endometriosis of the present invention. A method for producing a material for improving endometriosis will be described later.
  • the agrimax is an aglycone-type isoflavone produced by fermenting soybean germ with Aspergillus oryzae using the production method based on Patent Document 2 and Patent Document 3, followed by extraction and concentration processes. : 2 component composition.
  • an agrimax precursor, isoflavone 40 (manufactured by Tama Seikagaku Co., Ltd.), which is a glycoside isoflavone, was used.
  • endometriotic stromal cells were obtained from 24 patients who underwent ovarian endometriotic cystectomy (mean age 36.8 years; 24-44 years). Normal endometrial cells were obtained from 12 patients who underwent benign ovarian tumor removal (mean age 34.9 years; 22-41 years). Samples from patients who had not received hormonal treatment at least 6 months before surgery were used. The study was started after complying with the Declaration of Helsinki and obtaining approval from the Ethics Review Committee of Kyoto Prefectural University of Medicine (ERE-E-306). Informed consent was obtained from all patients.
  • RNA extraction from endometriotic stromal cells was performed using RNeasy Mini kit (QIAGEN) and following the protocol. RNA concentration was measured with NanoDrop (Thermo Scientific).
  • RNA concentration was measured with NanoDrop (Thermo Scientific).
  • ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo) and GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems) were used.
  • Real-time PCR used Power SYBR Green and Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
  • the target genes for the primers were IL-6, IL-8, aromatase, COX-2, SGK1 and GAPDH.
  • Agrimax suppressed the gene expression of IL-6, IL-8, aromatase and COX-2. Isoflavones 40 did not suppress their gene expression. In addition, Agrimax inhibited PGE2 protein expression and aromatase enzyme activity. More specifically, real-time PCR was used to examine the gene expression of IL-6, IL-8, aromatase and COX-2 in endometriosis cells. Compared to the control, Agrimax decreased the expression of four genes (P ⁇ 0.05), but isoflavone 40 did not suppress the gene expression (see FIG. 2A). Agrimax reduced protein levels of PGE 2 (P ⁇ 0.05) (see Figure 2B). Similar to mRNA levels, Agrimax decreased aromatase enzyme activity in endometriotic cells (P ⁇ 0.05) (see FIG. 2C).
  • ER ⁇ knockdown cells counteracted the effects of Agrimax (FIG. 4B).
  • the ER ⁇ antagonist MPP was added and measured similarly in the WST-8 assay, but the effect of Agrimax was not counteracted (see FIG. 4C).
  • Agrimax decreased SGK1 gene expression (P ⁇ 0.05) (see FIG. 4D).
  • Endometriosis is a local pelvic inflammatory disease (Non-patent Document 21).
  • endometriosis tissues active macrophages secrete inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-8. These cytokines contribute to the maintenance of lesion progression.
  • Agrimax suppressed IL-6 and IL-8 mRNA expression. This result is involved in cell growth suppression.
  • suppression of aromatase, COX-2, and PGE 2 suggests that it is effective in suppressing local estrogen production and pelvic pain.
  • Agrimax suppressed endometriosis exacerbation-related factors.
  • NF- ⁇ B is an important regulator in endometriosis.
  • Agrimax inhibited TNF- ⁇ -induced phosphorylation of I ⁇ B and nuclear uptake of p65, and exhibited anti-inflammatory effects.
  • SGK1 is regulated by ER ⁇ in endometriosis (Non-patent Document 24).
  • SGK1 promotes phosphorylation of I ⁇ B and promotes NF- ⁇ B activity (Non-patent Document 25).
  • Agrimax also suppressed the gene expression of SGK1.
  • Agrimax exerts an anti-inflammatory effect by suppressing this pathway (see FIG. 5E).
  • Agrimax was evaluated in endometriosis model mice. From 1 week after uterine tissue transplantation, a diet containing 6% and 6.5% agrimax and 40% isoflavone was given. Agrimax reduced cyst count and cyst weight compared to control and isoflavone 40. These results demonstrate that Agrimax is similar to in ⁇ ⁇ ⁇ vitro when absorbed into the mouse body.
  • Agrimax suppressed cell growth of endometriosis via ER ⁇ and -NF- ⁇ B pathway, and suppressed lesion formation in endometriosis model mice. These pharmacological actions are expected to be effective in the development of endometriotic lesions and pelvic pain.
  • Manufacturing method of endometriosis-improving material 5-1 Manufacturing process The manufacturing method of the endometriosis-improving material may be performed by the methods described in Patent Document 2 and Patent Document 3.
  • Patent Document 2 a bean is inoculated with koji mold and koji-molded, and hydrolyzed into a product obtained by this koji-making process to hydrolyze proteins in the product and distribute isoflavone compounds in the beans.
  • the sugar body is decomposed to produce an isoflavone compound containing a large amount of aglycone, and a material for improving endometriosis using the beans as a raw material is produced.
  • phytic acid in the beans is also removed at the same time.
  • Patent Document 3 (1) degreasing soybean hydrolyzed by fermentation using microorganisms with a nonpolar solvent, and drying the obtained degreased product; (2) extracting the dried defatted product obtained in step (1) with a polar solvent, concentrating and drying the extract containing the obtained isoflavone compound; (3) a step of dissolving the concentrated dry-solid extract obtained in step (2) with a polar solvent, further diluting with water, and separating to obtain an insoluble substance;
  • the polar solvent is methanol, ethanol, propanol, acetone, or a mixture thereof with water; (4)
  • the insoluble material obtained in step (3) is washed as necessary and dried to remove the solvent, thereby producing a material for improving endometriosis.
  • soybean meal in beans is used as a raw material.
  • soybean hypocotyl in soybean is used as a raw material.
  • the material for improving endometriosis produced by the production methods described in Patent Document 2 and Patent Document 3 using soybean germ as a raw material is a large amount of aglycone isoflavones contains.
  • aglycone type isoflavones daidzein, genistein and glycitein are contained. Any one of these can be used as a material for improving endometriosis.
  • daidzein, genistein and glycitein are 7: 1: 2 by weight.
  • a material for improving endometriosis can be reliably produced, and a material for improving endometriosis that can improve endometriosis is provided reliably. It is possible to exhibit an excellent effect of being able to.

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Abstract

【課題】アグリコン型イソフラボンを利用した素材であって子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材およびその製造方法を提供すること。 【解決手段】子宮内膜症を改善する作用を備えたアグリコン型イソフラボンを有すること、並びに、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料としたアグリコン型イソフラボンを含有する子宮内膜症改善用素材を製造すること。

Description

子宮内膜症改善用素材およびその製造方法
　本発明は、子宮内膜症改善用素材に係り、特に、アグリコン型イソフラボン（「イソフラボンアグリコン」とも称する）を利用した子宮内膜症改善用素材およびその製造方法に関する。
　一般に、子宮内膜症を改善することは望まれており、例えば、子宮内膜症関連疾患の治療薬（特許文献１参照）等も提案されている。しかしながら、特許文献１に記載の治療薬は女性が多く体内に保有するエストロゲンに対応して治療するものではない。
　一方、子宮内膜症は、子宮内膜類似組織が子宮腔外に生着し進展する疾患で、生殖可能年齢の5％から10％の女性が罹患する（非特許文献１）。子宮内膜症の主な症状は骨盤痛および不妊である（非特許文献２）。閉経すると症状が改善することから、エストロゲンが病巣の進展および維持に関わっていることはよく知られている（非特許文献３）。子宮内膜症病巣局所ではエストロゲンは直接サイトカインを誘発することで炎症に関わっている（非特許文献４）。炎症性サイトカインは子宮内膜症病巣局所でエストロゲン合成を促進し結果として正のフィードバックが病巣の進展・維持を助長している（非特許文献５）。このように子宮内膜症はエストロゲン依存性炎症疾患として考えられており、ホルモンと炎症性サイトカイン双方が病巣の進展、維持および臨床症状に関与している（非特許文献６）。
　低用量エストロゲン・プロゲスチンやGnRHアゴニスト、プロゲスチンなどの子宮内膜症に対する内分泌治療は病巣進展や骨盤痛に効果がある。しかし、これらは排卵を抑制することから直ちに妊娠を希望する女性には使用できない。副作用が少なく、すべての子宮内膜症患者に使用できる新しい子宮内膜症治療薬が望まれる。
　イソフラボンは弱いエストロゲン作用を持つ植物由来の非ステロイド天然物である。イソフラボンはエストロゲンと構造が類似しているのでエストロゲンレセプター(ER)と結合しエストロゲン様作用が発揮可能である。イソフラボンの活性はエストロゲンの1000分の1から10000分の1と非常に弱いので、エストロゲン血中濃度の高い生殖可能年齢の女性に対してイソフラボンは抗エストロゲン作用を持つこともある。大豆にはグリコシド型イソフラボンとして主にゲニスチンおよびダイジンが含まれ、大豆の重量にわずか0.2～0.3％ほどしかない貴重な機能性成分であり、大豆胚芽のイソフラボン含有量は、大豆全体に比べて約10倍も高い。しかも、胚芽に含まれているイソフラボンの組成は、丸大豆に含まれるイソフラボンの組成と異なり、ダイジンイソフラボンが多く含まれている。しかし、グリコシド型イソフラボンはそのまま体内に吸収されず、腸内細菌の酵素でグリコシド型イソフラボンの糖鎖を分解しアグリコン型イソフラボンになってから吸収される。アグリコン型イソフラボンは、すでに糖鎖が分解されているので、腸内細菌の働きに関係なく、胃や腸ですみやかに吸収される（非特許文献７～９）。
　過去の研究によると、体外受精経験患者のイソフラボンの経口摂取は黄体期のプロゲステロンの効果を改善させ、胚移植成功率や臨床妊娠率の上昇の可能性が示唆された（非特許文献１０）。妊娠初期において植物由来イソフラボンは子宮内膜からのプロスタグランジン分泌を制御するとの報告もある（非特許文献１１）。また、190人の閉経後女性のランダム化試験で12週間のアグリマックス経口摂取はホットフラッシュ症状を軽減させた（非特許文献１２）。アグリコン型イソフラボンはグリコシド型より体内吸収が速く、吸収率も高い（非特許文献１３）。ゲニステインはエストロゲン依存性乳癌細胞（MCF-7）の細胞増殖を促進させ（非特許文献１４）、タモキシフェンの抑制効果を減弱させる（非特許文献１５）。一方で、ダイゼインはMCF-7の増殖を抑制し（非特許文献１６）、タモキシフェンの治療効果を改善させた（非特許文献１７）。これらの報告は、イソフラボンの種類により標的細胞への効果が異なることを示している。
特開２００９－２０９１５８号公報 特許第３０１４１４５号掲載公報 特許第４３９７５２５号掲載公報
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　女性のヘルスケアに対してイソフラボンは注目を集めているが、子宮内膜症に対しての効果はわかっておらず、臨床効果や薬理作用を理解するために詳細な分析が必要である。
　そこで、本発明は、このような点に鑑みなされたものであり、アグリコン型イソフラボンを利用した素材であって子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材およびその製造方法を提供することを目的とするものである。
　前述した目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究し、子宮内膜症性嚢胞から分離した子宮内膜症間質細胞および子宮内膜症マウスモデルを使用し、子宮内膜症に対するアグリコン型イソフラボン効果をグリコシド型イソフラボンの効果と比較して以下の本発明である子宮内膜症改善用素材を完成させた。アグリコン型イソフラボンとしては特許文献２並びに特許文献３に基づく製造方法によって製造された素材であるアグリマックス（登録商標）を用いた。
　本発明に係る第１の形態の子宮内膜症改善用素材は、子宮内膜症を改善する作用を備えたアグリコン型イソフラボンを有することを特徴とする。
　そして、このような構成によれば、アグリコン型イソフラボンを何らかの方法によって投与・適用することによって子宮内膜症が改善される。
　また、本発明に係る第２の形態の子宮内膜症改善用素材は、第１の形態において、
　前記子宮内膜症を改善する作用が、
　・子宮内膜症間質細胞の増殖を抑制すること
　・子宮内膜症細胞のIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を減少させること
　・子宮内膜症細胞のPGE2のタンパクレベルを減少させること
　・子宮内膜症細胞のアロマターゼ酵素活性を減少させること
　・子宮内膜症細胞において、TNF-αによって促進されるIκBのリン酸化を抑制すること
　・子宮内膜症細胞の蛍光免疫染色でp65の核内取り込みを阻害すること
　・ERβアンタゴニストであるPHTPPが子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンによる増殖抑制効果を抑制すること
　・ERβノックダウン細胞が子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンの効果を打ち消すこと
　・ERαアンタゴニストのMPPが子宮内膜症細胞に対するアグリマックスの子宮内膜症を改善する作用を打ち消さないこと
　・子宮内膜症細胞におけるSGK1の遺伝子発現を減少させること
　・子宮内膜症モデルマウスの嚢胞形成を阻害すること
　・子宮内膜症細胞におけるKi67染色割合を減少させること
  の少なくとも１つを含むことを特徴とする。
　そして、このような構成によれば、アグリコン型イソフラボンを例えば経口投与することによって子宮内膜症に関連する多くの項目が改善される。
　また、本発明に係る子宮内膜症改善用素材の製造方法は、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料としたアグリコン型イソフラボンを含有する子宮内膜症改善用素材を製造することを特徴とする。
　そして、このような構成によれば、子宮内膜症改善用素材を確実に製造することができ、子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材を確実に提供することができるという優れた作用効果を発揮することができる。
　本発明に係る子宮内膜症改善用素材によれば、アグリコン型イソフラボンを利用した素材によって子宮内膜症を改善することができる。
　本発明に係る子宮内膜症改善用素材の製造方法によれば、子宮内膜症を改善することができるアグリコン型イソフラボンを利用した子宮内膜症改善用素材を確実に製造することができる。
Ａはアグリマックスによる子宮内膜症間質細胞と正常子宮内膜の増殖についての特性図、Ｂはイソフラボン40（後述）による子宮内膜症間質細胞と正常子宮内膜の増殖についての特性図 ＡはリアルタイムＰＣＲに基づくＩＬ－６、ＩＬ－８、アロマターゼおよびＣＯＸ－２に関するコントロール、アグリマックス、イソフラボン40についての遺伝子発現の状態を示す特性図、ＢはＰＧＥ２タンパク質レベルに関するコントロール、アグリマックスについての特性図、Ｃはアロマターゼ酵素活性に関するコントロール、アグリマックスについての特性図 ＡはＴＮＦ－αにより促進されるＩκＢのリン酸化抑制に関するアグリマックスについての特性図、Ｂはｐ６５の取り込み阻害に関するアグリマックスについての特性図 ＡはアグリマックスとＰＨＴＰＰとの細胞増殖抑制に関する特性図、ＢはアグリマックスとＭＰＰとの細胞増殖抑制に関する特性図、ＣはＳｉＥＲβおよびコントロールに対してのアグリマックスの細胞増殖抑制に関する特性図、ＤはアグリマックスとコントロールとのＳＧＫ１遺伝子発現に関する特性図、Ｅはアグリマックスの薬理機序を示す説明図 Ａは子宮内膜症様病変を示す写真、ＢはＡの病変の大きさを示す写真、Ｃはコントロール、アグリマックスとイソフラボン40とを投与したマウスにおける嚢胞個数を示す特性図、ＤはＣの場合の嚢胞重量を示す特性図、Ｅはコントロール、アグリマックスとを投与したマウスにおける嚢胞部分のＫｉ６７の染色割合を示す特性図
　以下、本発明に係る子宮内膜症改善用素材の実施形態について、図１から図５を参照して説明する。
　本発明に基づいて、以下の実験等によって子宮内膜症改善用素材であるアグリコン型イソフラボンを検体に投与・適用することによって子宮内膜症が改善されることを確認した。
　１　イソフラボンについて
　　本発明の子宮内膜症改善用素材であるアグリコン型イソフラボンとして前記アグリマックス（ニチモウバイオティックス株式会社製）を用いた。子宮内膜症改善用素材の製造方法を後述する。当該アグリマックスは、特許文献２並びに特許文献３に基づく製造方法によって大豆胚芽を麹菌で発酵させ、抽出・濃縮の過程を経て製造されたアグリコン型イソフラボンであり、ダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインが7:1:2の成分構成となっている。
　比較素材としてアグリマックスの前駆物質でグリコシド型イソフラボンであるイソフラボン40（タマ生化学株式会社製）を用いた。
　２　検体について
　　患者については、24人の卵巣子宮内膜症性嚢胞摘出術を受けた患者（平均年齢36.8歳；24-44歳）から子宮内膜症間質細胞を得た。12人の卵巣良性腫瘍摘出術を受けた患者（平均年齢34.9歳；22-41歳）から正常子宮内膜細胞を得た。少なくとも手術6ヶ月前以降はホルモン治療を受けていない患者の検体を使用した。ヘルシンキ宣言を遵守し、京都府立医科大学倫理審査委員会の承認を得たのちに研究を開始した（ERE-E-306）。全ての患者からインフォームドコンセントによる承諾を得た。
　３　実験項目
　３－１　子宮内膜症間質細胞の増殖について
　　（実験方法）
　　　細胞処理および細胞増殖アッセイを次のようにして実行した。
　　　子宮内膜症間質細胞は既報どおりに処置し単離した（非特許文献１８）。96ウェルプレートに１ウェルあたり5000細胞となるように播種した。24時間アグリマックスとDMSOで処理し72時間後にWST-8アッセイで細胞増殖を測定した。マルチウェルmultiplex 9120 (Bio-Rad)により450 nmの波長で測定した。
　　（実験結果）
　　　アグリマックスは子宮内膜症間質細胞に対して増殖抑制効果を示したが、イソフラボン40ではその効果は認めなかった。
　更に説明すると、子宮内膜症間質細胞および正常子宮内膜に対するアグリマックスおよびイソフラボン40の効果をWST-8アッセイで測定した。アグリマックスは濃度依存性に子宮内膜症間質細胞の増殖を抑制した（P<0.01）が、正常子宮内膜では増殖抑制効果は示さなかった（図1A参照）。一方でイソフラボン40は子宮内膜症細胞および正常子宮内膜ともに増殖抑制効果は示さなかった（図1B参照）。これらの結果により以降の研究はアグリマックス濃度を20μMで施行した。
　３－２　mRNAおよびcDNA合成、リアルタイムPCRについて
　　（実験方法）
　　　子宮内膜症間質細胞からのRNA抽出はRNeasy Mini kit (QIAGEN)を使用し、プロトコールに従った。RNA濃度はNanoDrop (Thermo Scientific)で測定した。cDNA合成はReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo) および GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems)を使用した。リアルタイムPCRはPower SYBR Green and Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems).を使用した。プライマーのターゲット遺伝子はIL-6、IL-8、アロマターゼ、COX-2、SGK1およびGAPDHとした。
　　（実験結果）
　　　アグリマックスはIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を抑制した。イソフラボン40はそれらの遺伝子発現を抑制しなかった。さらにアグリマックスはPGE2のタンパク発現およびアロマターゼ酵素活性を抑制した。
　更に説明すると、リアルタイムPCRで子宮内膜症細胞のIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を調べた。コントロールと比較しアグリマックスは4つの遺伝子発現を減少させた（P<0.05）が、イソフラボン40では遺伝子発現は抑制されなかった（図2A参照）。アグリマックスはPGE2のタンパクレベルを減少させた（P<0.05）（図2B参照）。mRNAレベルと同様に、アグリマックスは子宮内膜症細胞のアロマターゼ酵素活性を減少させた（P<0.05）（図2C参照）。
　３－３　ウエスタンブロットおよび蛍光免疫染色について
　　（実験方法）
　　　細胞タンパク抽出はRIPA buffer (Nacalai Tesque) とpolyacrylamide gels (ATTO)を使用した。1次抗体はphosphorylated inhibitor κB (p-IκB)、total-inhibitor κB (t-IκB)、 ERb (Abcam)、GAPDH (Cell Signaling Technology) 、2次抗体はagainst rabbit IgG (Cell Signaling Technology)を使用した。蛍光免疫染色はカバーガラスに細胞播種後、1次抗体はphosphor-histone H3 (Ser10)、2次抗体はAlexa-conjugated secondary antibodies (Cell Signaling Technology)を使用した。PI (Vector Laboratories)で蛍光し、FV1000 confocal laser scanning microscope と FLUOVIEW software (Olympus)で分析した。
　　（実験結果）
　　　NF-κB経路の解析とウエスタンブロットおよび蛍光免疫染色の結果が得られた。
　更に説明すると、細胞内シグナル伝達経路におけるアグリマックスの効果を調べた。アグリマックスは子宮内膜症細胞において、TNF-αによって促進されるIκBのリン酸化を抑制した(図3A参照)。さらにアグリマックスは蛍光免疫染色でp65の取り込みを阻害することを確認した（図3B参照）。
　３－４　ELISAおよびアロマターゼ酵素活性測定について
　　（実験方法）
　　　PGE2のタンパク濃度はPGE2 highsensitivity enzyme immunoassay (EIA) kit (Enzo Life Science)で測定した。アロマターゼ酵素活性を既報の[3H]-water法により測定した（非特許文献１９）。
　　（実験結果）
　　　アグリマックスはERβを介して子宮内膜症の細胞増殖を抑制する。さらにSGK１の発現を抑制した。
　更に説明すると、ERβアンタゴニストであるPHTPPを加えた培養液で細胞増殖をWST-8アッセイで測定した。PHTPPはアグリマックスの増殖抑制効果を抑制した（図4A）。さらにトランスフェリングsiRNAによりERβをノックダウンし、WST-８アッセイで増殖抑制効果を調べた。ERβノックダウン細胞はアグリマックスの効果を打ち消した（図4B）。ERαアンタゴニストのMPPを加え、同様にWST-8アッセイで測定したが、アグリマックスの効果は打ち消さなかった（図4C参照）。さらにアグリマックスはSGK1の遺伝子発現を減少させた（P<0.05）（図4D参照）。
　３－５　子宮内膜症モデルマウスによる検討について
　　（実験方法）
　　　BALB/cマウス（7週齢）の卵巣摘出後にエストラジオール（E2:0.5 mg/マウス/週）を投与してホルモン動態を一定化させた。同型マウスから摘出した子宮組織を細断し腹腔内に投与した（非特許文献２０）。子宮組織移植1週間後からアグリマックスおよびイソフラボン40 をそれぞれ0.6%、0.65％含む餌を与えた。餌投与４週間後に、腹腔内に形成された嚢胞を摘出した。嚢胞個数、嚢胞重量を計測した。Ki67染色により細胞増殖能を評価した。
　　（実験結果）
　　　アグリマックスは子宮内膜症モデルマウスの嚢胞形成を抑制したが、イソフラボン40は抑制効果を示さなかった。
　更に説明すると、子宮内膜症様病変はマウスの腹腔内に生着した（図5A参照）。病変の大きさは２から10 mmであった（図5B参照）。アグリマックスを含む餌を与えたマウスの嚢胞個数(図5C参照)、嚢胞重量（図5D参照）はコントロールおよびイソフラボン40と比較し減少した（P<0.05）。アグリマックスはコントロールと比較しKi67染色割合を減少させた（P<0.05）（図5E参照）。
　３－６　統計分析について
　　統計分析はMann-Whitney U-testを使用し、データは平均±標準誤差で示した。P値は0.05以下を有意差ありとした。
　４　作用効果の纏め
　　この実験は、子宮内膜症間質細胞および正常子宮内膜細胞、子宮内膜症モデルマウスに対するアグリマックスおよびイソフラボン40の薬剤効果を調査した最初の研究である。アグリマックスは子宮内膜症細胞でのみ増殖抑制効果を認めたので、子宮内膜症患者に使用可能であることが示唆される。さらにERβ、-NF-κB経路を介して薬理作用を示すことを確認した。モデルマウスではアグリマックスは嚢胞形成抑制を示したが、イソフラボン40では示さなかった。アグリマックスの濃度は20μMで研究したが、さらに詳細な濃度設定は必要である。
　子宮内膜症は局所の骨盤炎症性疾患である（非特許文献２１）。子宮内膜症組織では活動性マクロファージがIL-6、IL-8などの炎症性サイトカインを分泌する。これらのサイトカインは病巣の進展維持に貢献している。アグリマックスはIL-6、IL-8のmRNA発現を抑制した。この結果は細胞増殖抑制に関与している。さらにアロマターゼ、COX-2、PGE2を抑制することから病巣局所のエストロゲン産生抑制や骨盤痛に効果があることが示唆される。まとめると、アグリマックスは子宮内膜症増悪関連因子を抑制した。
　ここで、アグリマックスは子宮内膜細胞に対してどのような機序で抗炎症作用や細胞増殖抑制を示すのかを分析する。子宮内膜症細胞は正常子宮内膜と比較しERβの発現が高い（非特許文献２２）。アグリマックスの主な構成イソフラボンであるダイゼインは、ERβに弱く結合する（非特許文献２３）。成績で示したとおり、ERβをブロックすることでアグリマックスの効果は減少した。ERαではアグリマックスの効果は抑制されなかったので、薬理効果はERβを介していることを示した。
　NF-κBは子宮内膜症において重要な制御因子である。アグリマックスはTNF-αによって促進されるIκBのリン酸化およびp65の核内取り込みを抑制し、抗炎症作用を示した。子宮内膜症においてSGK1がERβにより制御される（非特許文献２４）。SGK1はIκBのリン酸化を促進し、NF-κB活性を促進する（非特許文献２５）。アグリマックスはSGK1の遺伝子発現も抑制した。アグリマックスはこの経路を抑制することで抗炎症作用を発揮する(図5E参照)。
　アグリマックスとイソフラボン40の効果判定を子宮内膜症モデルマウスで評価した。子宮組織移植1週間後からアグリマックスおよびイソフラボン40 をそれぞれ6%、6.5％含む餌を与えた。アグリマックスはコントロールとイソフラボン40と比較し嚢胞個数と嚢胞重量を減少させた。これらの結果はアグリマックスがマウス体内に吸収された時も、in vitroと同様の効果があることを証明している。
　結論として、アグリマックスはERβ、-NF-κB経路を介して子宮内膜症の細胞増殖を抑制し、子宮内膜症モデルマウスの病変形成を抑制した。これらの薬理作用は子宮内膜症の病巣進展と骨盤痛の抑制効果が期待される。
　５　子宮内膜症改善用素材の製造方法
　　５－１　製造工程
　　　子宮内膜症改善用素材の製造方法は特許文献２並びに特許文献３に記載の方法によって行うとよい。
　具体的には次のようにして行われる。
　即ち、特許文献２においては、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料とした子宮内膜症改善用素材を製造する。
　この場合、同時に前記豆類中のフィチン酸を除去することも行われる。
　また、特許文献３においては、
　（１）微生物を用いた発酵により加水分解された大豆を非極性溶媒により脱脂し、得られた脱脂生成物を乾燥させる工程と、
　（２）工程（１）で得られた乾燥脱脂生成物を極性溶媒で抽出し、得られたイソフラボン化合物を含有する抽出物を濃縮乾固する工程と、
　（３）工程（２）で得られた濃縮乾固抽出物を極性溶媒で溶解し、さらに加水希釈した後に、分離して不溶性物質を得る工程と、
  前記極性溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、又はこれらと水との混合物であり、
　（４）工程（３）で得られた不溶性物質を、必要に応じて洗浄し、乾燥させて溶媒を除去する工程を実行することによって子宮内膜症改善用素材を製造する。
　　５－２　原料
　　　特許文献２の実施例においては、原料として豆類中の大豆粕を用いている。
　　　特許文献３の実施例においては、原料として大豆中の大豆胚軸を用いている。
　子宮内膜症改善用素材の原料としては、アグリコン型イソフラボンが多量に含有されている大豆胚軸を用いることが好ましい。
　　５－３　製造結果物としての子宮内膜症改善用素材
　　　大豆胚芽を原料として特許文献２並びに特許文献３に記載の製造方法によって製造された子宮内膜症改善用素材はアグリコン型イソフラボンを多量に含有する。
　アグリコン型イソフラボンとしては、ダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインが含有されている。これらの１種でも子宮内膜症改善用素材として利用することができる。
　特に、アグリマックスにおいてはダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインが重量比で７：１：２である。
　このように本発明の製造方法によれば、子宮内膜症改善用素材を確実に製造することができ、子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材を確実に提供することができるという優れた作用効果を発揮することができる。

Claims (3)

  1. 　子宮内膜症を改善する作用を備えたアグリコン型イソフラボンを有することを特徴とする子宮内膜症改善用素材。
  2. 　前記子宮内膜症を改善する作用は、
    　・子宮内膜症間質細胞の増殖を抑制すること
    　・子宮内膜症細胞のIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を減少させること
    　・子宮内膜症細胞のPGE2のタンパクレベルを減少させること
    　・子宮内膜症細胞のアロマターゼ酵素活性を減少させること
    　・子宮内膜症細胞において、TNF-αによって促進されるIκBのリン酸化を抑制すること
    　・子宮内膜症細胞の蛍光免疫染色でp65の核内取り込みを阻害すること
    　・ERβアンタゴニストであるPHTPPが子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンによる増殖抑制効果を抑制すること
    　・ERβノックダウン細胞が子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンの効果を打ち消すこと
    　・ERαアンタゴニストのMPPが子宮内膜症細胞に対するアグリマックスの子宮内膜症を改善する作用を打ち消さないこと
    　・子宮内膜症細胞におけるSGK1の遺伝子発現を減少させること
    　・子宮内膜症モデルマウスの嚢胞形成を阻害すること
    　・子宮内膜症細胞におけるKi67染色割合を減少させること
      の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の子宮内膜症改善用素材。
  3. 　豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料としたアグリコン型イソフラボンを含有する子宮内膜症改善用素材を製造することを特徴とする子宮内膜症改善用素材の製造方法。
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