JP2009023919A - 不妊症改善用素材 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト子宮内膜上皮細胞における白血病阻害因子(LIF)の分泌、ヒト子宮内膜上皮細胞におけるトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌およびグリコデリンの発現の少なくとも1つを調整することのできるイソフラボンを有することを特徴とする。
【選択図】図1
Description
初めに、本発明に利用するイソフラボンおよび本発明の不妊症改善用素材を子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて検査する場合に用いる各種の材料や機器を説明する。
次に、本発明の不妊症改善用素材を子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて検査する場合に用いる各種の方法を説明する。
正常なヒト子宮内膜上皮細胞を既存の方法で(Zhang他 1995年)分離した。組織をハンクス緩衝液の中で細かく切り、DMEM/ F-12ハムズ培養液(DMEM/F-12; 1:1, 容積/容積)にコラゲナーゼ0.5%で、37度で60分、温浸した。分散した細胞を目合い70-μmのフィルター、続いて、ポアサイズ38-μmのフィルターにかけた。上皮腺および細胞を第2フィルターで回収し、100mm皿に入れ、DMEM/F-12ハムズ培養液にペニシリン 100 IU/mL、ストレプトマイシン 50 mg/mL、10% FBS (容量/容量)を加えたもので、空気中の二酸化炭素5%で、37度で培養した。本実施形態においては、第1フィルターを通過した上皮細胞を培養に使用した。
培養上澄み液内のヒトLIFおよびTGF-β1を調べるために、サンプルを酸活性化し、ヒトLIFおよびTGF-β1判断用のELISAキット(R & D Systems、米国ミネアポリス)を使用して、メーカーの指示書に従って、量の測定を行った。簡単に説明すると、サンプル50 μL、および、ビオチニル化抗LIFもしくはTGF-β1抗体試薬50 μLを、マイクロプレートで3時間培養した。特殊な洗剤で洗浄後、 ストレプトアブジンHRP液 100 μLを加え、0.5時間培養した。洗浄後、TMB 基質を加え、30分培養し、HClで培養を止めた。プレートの読み取りは、自動ELISA読取り器を使って、450 nmにて行った。
100mm培養皿に入った、コンフルエント70-80%の、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)を、16〜24時間、血清枯渇状態にし、氷点冷却したPBSバッファーで二度洗浄し、KRHバーファーに、AglyMax 0.5 μg/mLもしくはゲニスタイン0.1 μmol/Lを入れた場合と入れない場合で、37°Cで10分培養した。環状AMPホスフォジエステラーゼ阻害物質であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX)を、ポジティブコントロールとして、0.5 mmol/Lで使用した。培養の最後に、細胞をHCl 0.1 mol/Lで溶解した。細胞内環状AMP濃度を、環状AMP EIAキット(Cayman Chemical、米国ミシガン州)を使用し、メーカーの指示書に従って測定した。結果を細胞タンパク質含有に修正し、溶解タンパク質1マイクログラムに対する、ピコグラム単位での環状AMP(pg/μg)で表した。
タンパク質を、沸騰させたTris/HCl 0.5 mmol/L、pH 6.8、グリセロール、10% SDS、0.1%先導色素、2-メルカプトエタノールで抽出した。このタンパク質を、スタッキングゲルの入ったゲルを使って、電気泳動させた。電気泳動後、タンパク質を2時間、ニトロセルロース膜へと転写した。この膜を、洗浄バッファー(TBS-Tween)に5%スキムミルクの入った中に入れ、一夜、ブロックした。ブロック後、ブロットを第一抗体(1:1000)で二時間培養した。その後、洗浄し、洗浄バッファーに第二抗体(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州Piscataway)を1:1000で希釈したもので、一時間、最終培養した。NIHイメージソフト(v. 1.62)を使って、 吸光度を測定した。
ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)(細胞4x105 /mL)を、F-12ハムズ培養液に10%FBSを加えたものに入れ、Lab-Tek IIチェンバースライドに載せ、湿度95%、二酸化炭素5%の空気中で、37℃で24時間、培養した。次に、この培養液を、F-12ハムズ培養液に0.3% FBSを加え、ゲニスタインもしくはアグリコン型イソフラボンAglyMaxを含んだものに変え、9日間培養した。その後、細胞を10%バッファー ホルマリンで、90分固定し、リン酸緩衝液 (PBS)を3回換えて濯ぎ、内分泌性ペロキシターゼを阻害すべく H2O2で10分培養し、10%正常牛血清で、一夜、4°Cでブロックし、抗グリコデリン抗体(1:1000, Santa Cruz Biotechnology Inc. 米国サンタクルス)で、一夜、4°Cで培養した。細胞は、溶解抗ヤギ免疫グロブリン(ベクター)で、室温で1時間培養し、続いて、DABをクロマジェンとして使い、アビジン+ビオチン+ペロキシターゼ混合物(ABC Elite、ベクター)で、室温で1時間培養した。細胞はハリス ヘマトキシリンで30秒、軽く染色し、酸性アルコールで浄化し、炭酸リチウムで青色に染色した。スライドは、エタノール濃縮液で脱水し、キシレンでクリアにした。
実験は各々、3回以上実施した。値は、中間値+/-標準誤差(SEM)で出している。データはすべて、SPSSソフトウェアを使用して分析した(SPSSソフトウェアInc. 米国マサチューセッツ州ノーサンプトン)。中間値間の差異の統計的優位性は、一元配置分散分析を使用して判断した。両側測定P値が0.05未満の場合に、差異が統計的優位性を持つと判断した。NIH画像Jソフトウェアを使用して、band densityの数量分析を行った。ウェスタンブロット検知は二重ないし三重に実施した。
次に、本発明の不妊症改善用素材の子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおける不妊症改善の機能を説明する。
本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンは、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)におけるLIFおよびTGF-βの分泌を誘発する。
ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)でのイソフラボン誘引型サイトカイン分泌における、エストロゲン受容体、ERK1/2およびp38 MAPキナーゼ経路の役割
図2は、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)の白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)のイソフラボン誘引型分泌に対する、ICI 182,780、PD98059、SB203580の、阻害効果を示している。同図AおよびBは、ERK1/2およびp38のイソフラボン誘引型リン酸化を示している。Ishikawa Cellは、AglyMax0.5 μg/mL、もしくは、ゲニスタイン0.1 μmol/Lで、所定の期間、処理をした場合を示す。同図CおよびDは、細胞を、ゲニスタインのみ0.1 μmol/L 、あるいは、エストロゲン受容体拮抗剤ICI 182 780を10 μmol/L、もしくは、MEK 阻害物質PD98059を20 μmol/L、もしくは、p38 MAPキナーゼ阻害物質SB203580を20 μmol/L加えて、24時間処理をした場合を示す。データは中間値± SEM、それぞれ n=6、 *p<0.001、コントロールもしくはゲニスタインとの比較を示している。
本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンは、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)のグリコデリン発現を上昇させる。
ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)での、イソフラボン誘引型グリコデリン発現における、環状AMPの役割。
本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンは、分離ヒト初代子宮内膜上皮細胞におけるLIFおよびTGF-β1の分泌、ならびに、グリコデリンの発現を誘引した。
本実施形態においては、白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)およびグリコデリンをターゲットとして選び、子宮の上皮部分および組織の再模型化に対するイソフラボンの効果を観測して、本発明の不妊症改善用素材の作用効果を確認した。
Claims (5)
- ヒト子宮内膜上皮細胞における白血病阻害因子(LIF)の分泌、ヒト子宮内膜上皮細胞におけるトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌およびグリコデリンの発現の少なくとも1つを調整することのできるイソフラボンを有することを特徴とする不妊症改善用素材。
- 前記イソフラボンは、血漿中濃度範囲内において用いられることを特徴とする請求項1に記載の不妊症改善用素材。
- 前記イソフラボンは、アグリコン型イソフラボン(腸内細菌によってアグリコン型イソフラボンに分解される配糖体イソフラボンを含む)、ゲニスタイン、ダイゼイン、エコールの1種若しくは複数種からなることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の不妊症改善用素材。
- 前記アグリコン型イソフラボンは、豆類を麹菌によって発酵させた生成物からエタノール/水抽出によって生成された生成物であることを特徴とする請求項3に記載の不妊症改善用素材。
- 前記アグリコン型イソフラボンは、抽出物の重量の70%がイソフラボンで、ダイゼイン:ゲニスタイン:グリシタインが7:1:2の重量割合とされていることを特徴とする請求項4に記載の不妊症改善用素材。
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