WO2018147710A1 - 이미다조퀴놀린계열 물질을 포함하는 나노에멀젼 및 이의 용도 - Google Patents

이미다조퀴놀린계열 물질을 포함하는 나노에멀젼 및 이의 용도 Download PDF

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WO2018147710A1
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acid
oil
nanoemulsion
agonist
imidazoquinoline
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임용택
김선영
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단디바이오사이언스 주식회사
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Definitions

  • the present invention is directed to nanoemulsions comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and oil, and their use as adjuvants and vaccines.
  • Vaccine adjuvant is an adjuvant adjuvant and activates immune cells and plays an important role in the prevention and treatment of infectious diseases vaccines and chemotherapy.
  • Aluminum salts aluminum salt, alum
  • squalene nanoemulsions MF59, AS03, AF03, etc.
  • MF59, AS03, AF03, etc. humoral immune responses that contribute to antibody responses.
  • nanoemulsion-based adjuvants are limited to influenza vaccines.
  • an adjuvant composition comprising a complex of a negatively charged polymer and a toll-like receptor agonist, and a collagen-based or gelatin-based material. These adjuvant compositions are disclosed to have multi-stage phase transition properties with temperature changes.
  • imidazoquinoline-based drugs e.g., Imiquimod, Resiquimod, Dactolisib, Dactolisib, Gardiquimod) Quimod
  • Sumanirole sumanirol
  • imidazoquinoline-based materials have many difficulties in dispersing in aqueous solution due to their molecular structure.
  • imiquimod R837
  • DMSO dimethyl methoxysulfoxide
  • imiquimod has been commercialized in a cream formulation (product name: Aldara® from 3M) with various surfactants.
  • imidazoquinoline-based drugs in salt form eg, HCl
  • HCl salt form
  • the present inventors dissolve the imidazoquinoline toll-like receptor 7 or 8 agonist, which is difficult to solubilize in aqueous solution, into oil using a dispersion medium material and prepare the oil mixture in the form of nanoemulsion, thereby making it difficult to solubilize the imidazoquinoline series.
  • the present invention was developed by developing an immunoactivating substance having both the immunological properties and the immunological properties of oil-based nanoemulsions, and finding that it can be used not only for humoral immunity but also for adjuvant and vaccine for improving cellular immunity. Completed.
  • the present invention provides a nanoemulsion comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and an oil.
  • imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist may be dispersed in a nano-sized oil layer.
  • At least one selected from the group consisting of the surfactant and the immunoactivating material may be coated on the outside of the oil layer.
  • imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist may be immimod (Imiquimod), Resiquimod (Resiquimod), Dactolisib, Cardiquimod (Gardiquimod), Sumanirole (Sumanirole) ), Motolimod, 3M-052, S-34240, 852, 854-A from 3M, and their derivatives.
  • the oil may be selected from the group consisting of fish derived oil, animal derived oil, vegetable derived oil, tocopherol, mineral oil, and castor oil,
  • imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonists and oil may be included in a weight ratio of 0.1: 100 to 1:50.
  • the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist may further include a mediator to help the lipophilic interaction between the oil.
  • the mediator is myristic oleic acid, palmitoleic acid, sapienic acid (Sapienic acid), oleic acid, Elaidic acid (Elaidic acid), Vaccenic acid, linoleic acid, linoleicidic acid (Linoelaidic acid) , Alpha-linoleic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, erucic acid, docosahexaenonic acid, caprylic acid, capric acid, capric acid acid), Lauric acid, Myristic acid, Palmitic acid, Stearic acid, Arachidic acid, Behenic acid, Lignoceric acid, and It may be selected from the group consisting of cerotic acid.
  • the mediator material may be included in a weight ratio of 0.1: 10 to 10: 0.1 with the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist.
  • the surfactant is a polyoxyethylene sorbitan ester surfactant (Tween), including polysorbate 20 and polysorbate 80; Copolymers comprising at least one of ethylene oxide (EO), propylene oxide (PO) and butylene oxide (BO); Octosinol including Triton X-100 and t-octylphenoxypolyethoxyethanol; (Octylphenoxy) polyethoxyethanol; Phosphatidylcholine (lecithin) phospholipids including phosphatidylethanolaniline, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, sphingomyelin and cardiolipin; Nonylphenol ethoxylate; Polyoxyethylene patty ethers derived from lauryl, cetyl and oleyl alcohols including triethyleneglycol monolauryl ethers; And sorbitan esters
  • the immunoactivator may be a toll-like receptor agonist (TLR), a saponin, an antiviral peptide, an inflammasome inducer, a NOD ligand, a CDS ligand ( cytosolic DNA sensor ligands), stimulator of interferon genes (STING) ligands, and cationic lipids.
  • TLR toll-like receptor agonist
  • saponin a saponin
  • an antiviral peptide an antiviral peptide
  • an inflammasome inducer a NOD ligand
  • CDS ligand cytosolic DNA sensor ligands
  • STING stimulator of interferon genes
  • an adjuvant composition comprising the nanoemulsion is provided.
  • an adjuvant composition for enhancing cellular immunity as well as humoral immunity and a vaccine composition comprising an antigen.
  • a method for producing a nanoemulsion comprising a.
  • Nanoemulsions comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and an oil according to the present invention are useful for the prevention of infectious diseases, therapeutic vaccines and immune chemotherapy. It is possible to provide the vaccine adjuvant in the form of emulsion used for activation, and also to disperse imidazoquinoline-based materials stably in an oil such as squalene using a dispersion medium material, and finally to prepare the oil layer thus prepared in emulsion form. By the preparation, it is possible to provide a vaccine adjuvant using imidazoquinoline series material that is poorly soluble in most organic solvents and aqueous solutions.
  • the adjuvant in the form of a nanoemulsion of the present invention when used as a vaccine in combination with an antigen, has the effect of simultaneously improving humoral and cellular immunity.
  • the nanoemulsion comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and an oil according to the present invention is a lipophilic imidazoquinoline-based toll-like receptor agonist. Because of the controlled release behavior characteristics from the inner oil layer to the aqueous solution layer, it is released slowly in the body, thereby improving the cellular immune effect, while solving the systemic toxicity problem.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a nanoemulsion adjuvant composition composed of an imidazoquinoline-based toll-like receptor agonist, a dispersion mediator material, an oil, a surfactant, and an immunoactivating agent component according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2A illustrates data obtained by measuring the size and size distribution of a nanoemulsion (NE-IQ) including a nanoemulsion (NE) and an imidazoquinoline-based toll-like receptor agonist according to an embodiment of the present invention.
  • Light Scattering Measurement data.
  • Figure 2b is a data measuring the size and size distribution of the nanoemulsion (NE-IQ) comprising a nanoemulsion (NE) and imidazoquinoline-based toll-like receptor agonist according to an embodiment of the present invention, TEM (Transmission) Electron Microscopy) image (NE-IQ).
  • Figure 3 shows the delivery and distribution in immune cells (BMDC: bone-marrow derived dendritic cell, BMMC: bone-marrow derived macrophage cell) of NE-IQ according to an embodiment of the present invention (NE-IQ (DID) , Lysotracker (FITC), where a is for BMDC and b is for BMMC.
  • BMDC bone-marrow derived dendritic cell
  • BMMC bone-marrow derived macrophage cell
  • Figure 4 shows the concentration dependence of imiquimod (R837) of the expression level of cytokines associated with the maturation of immune cells after the treatment of NE-IQ according to an embodiment of the invention
  • a is BMDC
  • b is BMMC
  • a is BMDC
  • b is BMMC
  • Figure 5 shows the concentration dependence of R837 of the surface marker expression rate survival rate associated with the maturation of immune cells after the treatment of NE-IQ according to an embodiment of the invention
  • a is a BMDC
  • b is a graph for BMMC.
  • Figure 6 shows the effect on immune cell survival after 24, 48 hours after treatment with NE-IQ according to an embodiment of the invention
  • a is a BMDC
  • b is a graph for BMMC.
  • Figure 7 shows the expression level of IFN-alpha, a type of Type I inteferon expressed after NE-IQ intramuscular injection.
  • Figure 8 shows the enzyme immunoassay-IgG titer (3, 6, 9 weeks) of NE and NE-IQ against OVA (Ovalbumin) antigen in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the enzyme immunoassay-IgG1 titer (3, 6, 9 weeks) of NE and NE-IQ against OVA (Ovalbumin) antigen according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 shows the enzyme immunoassay of NE and NE-IQ-IgG2a titer (3, 6, 9 weeks) against OVA (Ovalbumin) antigen in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows the enzyme immunoassay of NE and NE-IQ-IgG2a / IgG1 ratio (3, 6, 9 weeks) to the OVA (Ovalbumin) antigen according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the Immunization schedule for measuring the CTL immune response that is activated after intramuscular injection of NE-IQ.
  • Figure 13 shows the cellular immune-induced effects of NE and NE-IQ (IFN-gamma secretion by T cell activation) to the OVA (Ovalbumin) antigen according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 16 shows the results of measuring activation of CD3 (+) CD8 (+) T cells after immunization of NE-IQ in mice transplanted with B16F10 cancer cells.
  • Fig. 17 shows the results of measuring activation of CD4 (+) IFN-gamma (+) cells after immunization of NE-IQ in mice transplanted with B16F10 cancer cells.
  • Fig. 19 shows the results of confirming that antigens specific to cancer cell growth are inhibited after administration of a vaccine consisting of NE-IQ and ovalbumin antigen to mice transplanted with B16F10-OVA cancer cells.
  • Figure 21 illustrates the cellular immune-induced effect (IFN-gamma secretion by T cell activation) of the NE-IQ series of vaccine adjuvant compositions for OVA (Ovalbumin) antigen in accordance with an embodiment of the present invention.
  • the term "combination of these" included in the expression of the mark of the form of the word means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the mark of the form of the mark, It means to include one or more selected from the group consisting of components.
  • the present invention provides a nanoemulsion comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and an oil.
  • the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist may be dispersed in a nanosized oil layer and coated with a surfactant, an immunoactivating material, or a combination thereof on the exterior of the emulsion. (FIG. 1).
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nanoemulsion of the present invention, wherein an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist is dispersed in an oil layer, and a spherical surface having a surfactant and / or an immunoactivating material coated thereon Form.
  • the size of the nanoemulsion may be about 50 to 500 nm, for example about 50 to 300 nm, about 50 to 100 nm, about 70 to 500 nm, about 100 to 500 nm or about 100 to 200 nm.
  • the nanoemulsion is a) dissolving an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist in oil to prepare an oil solution; b) mixing at least one selected from the group consisting of a surfactant and an immunoactivating substance with the oil solution; And c) dispersing the mixed solution obtained in step b in an aqueous solution.
  • the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist may be dissolved in oil together with a mediator material to assist lipophilic interaction.
  • the immunoactivating material may be used in admixture with a surfactant in the nanoemulsion preparation process, or after the nanoemulsion is prepared, may be additionally attached to the surface.
  • the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and oil may be included in a weight ratio of 0.1: 100 to 1:50, for example, 1:20.
  • the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist is an immunoactivating substance and includes imiquimod, Resiquimod, Dactolisib, Gardiquimod, and Sumani. It may be selected from the group consisting of Sumanirole, motolimod, 3M-052, S-34240, 852, 854-A, and analogs thereof of 3M, for example, imiqui May be a mode.
  • the oil may be selected from the group consisting of fish derived oils, animal derived oils, vegetable derived oils, tocopherols, mineral oils, castor oils and combinations thereof.
  • the fish oil may be used without limitation as long as it is a metabolizable oil, and includes, for example, cod liver oil, shark liver oil, whale oil and the like.
  • the shark liver oil contains squalene, a molecule known as 2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaene, unsaturated terpene, squalene, Saturated analogs to squalane may also be included.
  • the animal derived oil may include lard, tallow oil, tallow, and the like.
  • the vegetable derived oil may be an oil derived from nuts, seeds, grains, and the like, and may include, for example, peanut oil, soybean oil, coconut oil, olive oil, and the like.
  • the tocopherol may be tocopherol containing vitamin E.
  • Various tocopherols are present ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ or ⁇ ), but ⁇ -tocopherol is generally used, for example DL- ⁇ -tocopherol can be used.
  • the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonists may be solubilized and dispersed in oil by a mediator that is poorly soluble and aids in lipophilic interaction with the oil.
  • the mediator may be, for example, myristic oleic acid, palmitoleic acid, sapienic acid, oleic acid, laidic acid, vacecic acid, linoleic acid, linoleicidic acid.
  • the mediator material may be used in a weight ratio of 0.1: 10 to 10: 0.1 with the imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and oil, for example 1: 5 to 5: 1.
  • the surfactant is coated on the outside of the nanoemulsion so that the nanoemulsion can be dispersed in an aqueous solution, for example, polyoxyethylene sorbitan ester surfactant (Tween), in particular polysorbate 20 and polysorbate 80; Copolymers of ethylene oxide (EO), propylene oxide (PO), and / or butylene oxide (BO); Octosinol (eg, Triton X-100, or t-octylphenoxypolyethoxyethanol); (Octylphenoxy) polyethoxyethanol (IGEPAL CA-630 / NP-40); As phospholipid (phospholipid component), phosphatidylcholine (lecithin) phosphatidylethanolaniline, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, sphingomyelin and cardiolipin; Nonylphenol ethoxylates
  • the surfactant may be a mixture of these surfactants, such as a Tween 80 / Span 85 mixture, and a combination of polyoxyethylene sorbitan ester and octosinol. Other useful combinations may include laureth 9, polyoxyethylene sorbitan esters and / or octosinol.
  • the surfactant may be used in an amount of 0.001 to 20% by weight based on the total weight of the total nanoemulsion, for example, 0.01 to 1%, 0.001 to 0.1%, 0.005 to 0.02%; It may be used at a weight of 0.1 to 20%, 0.1 to 10%, 0.1 to 1% or about 0.5%.
  • the additional immunoactivating material coated on the outside of the nanoemulsion serves to stimulate the proliferation, differentiation and activity of dendritic cells, T cells and B cells, and thus activated T cells promote differentiation into cytotoxic T cells and And cytokines, such as interferon-gamma, are involved in cellular immune responses.
  • Such additional immunoactivating agents include, for example, toll-like receptor agonists (TLRs), saponins, antiviral peptides, inflammasome inducers, NOD ligands, CDS ligand (cytosolic DNA sensor ligand), stimulator of interferon genes (STING) ligand, cationic lipids (cationic lipids), and combinations thereof may include a material selected from the group consisting of, but is not limited thereto. have.
  • TLRs toll-like receptor agonists
  • saponins saponins
  • antiviral peptides antiviral peptides
  • inflammasome inducers NOD ligands
  • CDS ligand cytosolic DNA sensor ligand
  • STING stimulator of interferon genes
  • cationic lipids cationic lipids
  • combinations thereof may include a material selected from the group consisting of, but is not limited thereto. have.
  • the toll-like receptor agonist may be a natural toll-like receptor agonist or a synthetic toll-like receptor agonist.
  • the immunoactivating agent may comprise a combination of one or more toll-like receptor agonists, for example CL401 (dual TLR2 and TLR7 agonists) or CL429 (dual TLR2 and NOD2 agonists) alone or a combination thereof. It may include a combination, but is not limited thereto.
  • the toll-like receptor agonist may be one that can cause a signaling response through TLR-1, for example tri-acylated lipopeptide (LP); Phenol-soluble modulins; Cobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) lipopeptide; S- (2,3-bis (palmitoyloxy)-(2-RS) -propyl) -N-palmitoyl- (R) -Cys- (S) -Ser- (S) -Lys (4) -OH ; Bacterial lipopeptides from Borrelia burgdorfei; Trihydrochloride (Pam3Cys) lipopeptides that mimic the acetylated amino termini of OspA lipopeptides; And one or more materials selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • LP tri-acylated lipopeptide
  • Phenol-soluble modulins Cobacterium tubercul
  • the toll-like receptor agonist may include a TLR-2 agonist, and may include, for example, Pam3Cys-Lip, but is not limited thereto.
  • the toll-like agonist may include a TLR-3 agonist, and may include, for example, Poly (I: C), Poly (ICLC), Poly (IC12U), Ampligen, or the like as a polyish family.
  • TLR-3 agonist may include, for example, Poly (I: C), Poly (ICLC), Poly (IC12U), Ampligen, or the like as a polyish family.
  • ICLC Poly
  • IC12U Poly (IC12U)
  • Ampligen or the like as a polyish family.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the toll-like agonist may be one comprising a TLR-4 agonist, for example, Shigella flexineri outer membrane protein preparation, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA, And one or more materials selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • TLR-4 agonist for example, Shigella flexineri outer membrane protein preparation, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA, And one or more materials selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the toll-like agonist may include a TLR-5 agonist, and may include, for example, flagellin or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the toll-like agonist may be one comprising a TLR-7 agonist or a TLR-8 agonist, for example, an imidazoquinoline molecule such as imiquimod, R837, resquimod, or R848; VTX-2337; CRX642; Imidazoquinoline covalently bound to a phospholipid group or a phosphonolipid group; And one or more materials selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the toll-like agonist may be one containing a TLR-9 agonist, for example, may include an immunostimulatory oligonucleotide, but is not limited thereto.
  • the immunostimulatory oligonucleotides may include one or more CpG motifs, but are not limited thereto.
  • the saponin may be selected from the group consisting of QS21, Quil A, QS7, QS17, ⁇ -eskin, Digitonin, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the antiviral peptide may include KLK, but is not limited thereto.
  • the influxome inducer may be trehalose-6,6-dibehenate (TDB), but is not limited thereto.
  • the NOD ligand may be M-TriLYS (NOD2 agonist-synthetic Muramil tripeptide) or NOD2 agonist (N-glycolylated muramyldipeptid), but is not limited thereto.
  • M-TriLYS NOD2 agonist-synthetic Muramil tripeptide
  • NOD2 agonist N-glycolylated muramyldipeptid
  • the CDS ligand may be Poly (dA: dT), but is not limited thereto.
  • the STING ligand may be cGAMP, di-AMP, or di-GMP, but is not limited thereto.
  • the immuno-activator is Pam3Cys-Lip, Poly (I: C), CRX-527, MPLA (monophosphoryl lipid A), flagellin (flagellin), imiquimod, resquimod, CpG, QS21, M
  • the cationic lipids are DC-cholesterol (3ß- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol hydrochloride), DDA (dimethyldioctadecylammonium), DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane), EPC (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), MVL5 (N1- [2-((1S) -1- [ (3-aminopropyl) amino] -4- [di (3-amino-propyl) amino] butylcarboxamido) ethyl] -3,4-di [oleyloxy] -benzamide), DODAP (lipids1,2-dioleoyl-3
  • the present invention also provides an adjuvant composition comprising the nanoemulsion according to the present invention and a vaccine composition comprising the adjuvant composition and the antigen according to the present invention.
  • the antigen may be selected from the group consisting of proteins, recombinant proteins, glycoproteins, genes, peptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, polynucleotides, cells, viruses and combinations thereof.
  • the protein may include, for example, overalbumin, peptide, recombinant protein, subunit, split protein antigen.
  • the gene may comprise DNA or mRNA antigens, and the peptide may comprise peptide antigens specific for cancer cells or viruses.
  • the cells may include, for example, dendritic cells, cancer cells and cancer cell derived lysates, and the virus may include, for example, influenza, highly pathogenic influenza.
  • the adjuvant composition or vaccine composition may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents in addition to pharmaceutically effective amounts of nanoemulsions and / or antigens.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to allow the physiologically active ingredient to be administered to an animal or human to exhibit the desired physiological or pharmacological activity. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the severity of symptoms, age, weight, health condition, sex, route of administration, and duration of treatment.
  • pharmaceutically acceptable refers to a physiologically acceptable and, when administered to a human, usually does not cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal, and can be formulated for various oral or parenteral administration. It may be formulated in a form.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • composition according to the invention can be administered via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, the dosage of the active ingredient being determined by several factors such as the route of administration, the age, sex, weight and severity of the patient. It may be appropriately selected depending on.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with known compounds that can enhance the desired effect.
  • Squalene comprising imiquimod prepared as in Example 1 (5% v / v, Sigma Aldrich, USA), Tween 80 (0.5% v / v, Sigma Aldrich, USA) and Span 85 (0.5% v / v, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in 2 mL of phosphate buffer solution (PBS, 0.0067M PO4) and released to disperse completely in phosphate buffer solution (PBS) for 1 minute using an ultrasonic tip sonicator. Thereafter, the mixture was stirred for about 2 hours using a tube revolve and then stored in a 4 ° C. refrigerator until use.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the size of the emulsion was analyzed by DLS (Dynamic Light Scattering, Otsuga, Japan). As a result of measuring DLS (Dynamic Light Scattering, Otsuga, Japan), the diameters were 106.16 ⁇ 5.4 and 148.54 ⁇ 18.5m (Fig. 2, Table 1).
  • BMDCs Bone marrow-derived dendritic cells
  • BMMCs bone marrow-derived macrophage cells
  • NE-IQ squalene nanoemulsion
  • BMDCs bone marrow-derived dendritic cells
  • BMMCs bone marrow-derived macrophage
  • NE-IQ in Figure 4 When treated, it was confirmed that the secretion of IL-6 and IL-12, which induce Th1 response, was increased, and the secretion of TNF- ⁇ and inflammatory cytokine IL-1 ⁇ , which induce apoptosis and tumor suppression, was also increased. It can be seen that the increase is more significant than the case without including the mode (Imiquimod) (R837).
  • NE-IQ was applied to bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) and bone marrow-derived macrophage (BMMCs). After treatment, the cell proliferation rate was evaluated. In the proliferation rate of FIG. 6, an MTS assay kit (Cell Proliferation) assay for measuring mitochondrial activity was used. NE-IQ When treated, it was confirmed that both 24-hour and 48-hour increase in both types of immune cells was more than 10-fold higher than without imiquimod.
  • mice C57BL / 6 (female 5-6 weeks old, orient) mice were used, and 10 ⁇ g of ovalbumin (OVA) and 25 ⁇ g of imiquimod (R837) were dissolved in 50 ⁇ L in a single dose. 24 hours after the vaccine was injected into the mice, the secretion amount of IFN- ⁇ at the muscle and lymph node areas was analyzed by ELISA test method. NE-IQ The treated experimental group was confirmed to increase the cytokine secretion than other controls (control using NE and Alum adjuvant) (Fig. 7). Imiquimod (R837) is known to increase the secretion of interferon (IFN) cytokines through stimulation of toll like receptor 7.
  • IFN interferon
  • mice C57BL / 6 (female 5-6 weeks old, orient) mice were used, and 100 ⁇ g of ovalbumin (OVA) and 45.5 ⁇ g of imiquimod (R837) were used in one dose, as in Example 2 above.
  • OVA ovalbumin
  • R837 imiquimod
  • the prepared NE-IQ was dissolved in 100 ⁇ L and used.
  • Enzyme immunoassay was analyzed to increase the humoral immune response as mice were injected with the vaccine.
  • Humoral immune response was performed three times in total, and the orbital blood collection in the mice three weeks after the vaccination was completed to compare the production of immunoglobulin IgG and IgG subtypes IgG1 and IgG2a with the control (Fig. 8: IgG 9: IgG1, FIG. 10: IgG2a production amount).
  • the amount of antibody production was increased in all cases when the vaccine was inoculated, in particular, the highest effect was observed in the vaccine using NE-IQ containing imiquimod as an adjuvant.
  • the IgG2a / IgG1 value indicating the degree of cellular immune enhancement was found to be the highest value in the experimental group using NE-IQ as an adjuvant (FIG. 11). The reason seems to be due to the role of imiquimod loaded inside NE.
  • Example 8 Evaluate the effect of NE-IQ on cancer cell proliferation
  • Tumor healing ability was confirmed after administration of NE-IQ to intratumor injection using a C57BL / 6 mouse melanoma model.
  • 1x105 melanoma cells (B16F10) were injected subcutaneously into the right thigh of five female 6-week-old mice, and 100 ⁇ l of five injections were performed five days later, and the control group was injected with PBS. Then, tumor volume was measured 2-3 times a week for 19 days after cancer cell administration.
  • NE-IQ was administered after cancer cell injection, it was observed that tumor cell proliferation was significantly suppressed compared to the control group (FIG. 14).
  • T cell activated IFN-gamma-secreting CD8 + T cells in NE-IQ group compared with the control group. It was confirmed to promote (Fig. 17, Fig. 18).
  • a melanoma model (B16F10-OVA) expressing the peptide of obvalmin (Ovalbumin, OVA)
  • a vaccine consisting of NE-IQ and obalbumin antigen in the same manner as in Figure 12, the antigen-specific This confirmed that the cancer cell suppression (Fig. 19).
  • Another tumor model was used to confirm the cancer cell proliferation inhibitory effect of NE-IQ. Tumor healing ability was confirmed after administration of NE-IQ to intratumor injection using a lymphoma model (EG7-OVA) expressing C57BL / 6 mouse OVA antigen.
  • 1x105 lymphoma cells (EG7-OVA) were injected subcutaneously into the right thigh of five 6-week-old female females, and 100 ⁇ l were injected five times at three-day intervals after 5 days, and the control group was injected with PBS. Then, tumor volume was measured 2-3 times a week for 19 days after cancer cell administration. As a result, when NE-IQ was administered after cancer cell injection, it was observed that tumor cell proliferation was significantly suppressed compared to the control group (FIG. 20).
  • Example 9 Including one or more additional immunoactivating substances in NE-IQ Nano Emulsion Produce
  • Nanoemulsions comprising one or more additional immunoactivating substances, such as MPLA, DDA, QS21, etc. in the NE-IQ nanoemulsion were prepared in the composition shown in Table 2.
  • Example 9-1 NE-IQ-1 Adjuvant Manufacture: NE-IQ + DDA + MPLA
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), cholesterol (Cholesterol 0.25 mg / mL , Sigma-Aldrich, USA), MPLA [monophosphoryl lipid a, 0.2 mg / mL and yorki polar lipids (USA)] were dissolved in 1 mL of ethanol. After transferring the solution to a round flask, the ethanol was completely evaporated using a rotary evaporator to form a thin-film form.
  • the dispersion solution was transferred to a 4 mL vial and released using a sonicator for 1 minute to disperse the lipid membrane completely in phosphate buffer (PBS) for 1 minute. Then, the mixture was stirred for about 2 hours using a tube revolve and then stored in a 4 ° C. refrigerator until use.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 9-2 NE-IQ-2 Adjuvant Manufacture: NE-IQ + MPLA + QS21
  • DOPC 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma-Aldrich, USA
  • MPLA 0.2 mg / mL, yorki polar lipids (United States)
  • saponin QS21 , 0.2 mg / mL
  • cholesterol Choesterol 0.25 mg / mL, Sigma Aldrich, USA
  • Example 9-3 NE-IQ-3 Adjuvant Manufacture: NE-IQ + Pam3Cys -Lip + QS21
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma-Aldrich, USA), Pam3Cys-Lip (0.2 mg / mL, Invivo Gen, USA), QS21 (QS21, 0.2 mg / mL ) was dissolved in 1 mL of ethanol. The solution was transferred to a round flask and ethanol was completely evaporated using a rotary concentrator to form a thin lipid membrane. NE-IQ (Pam3Cys-Lip + QS21) adjuvant was then prepared using the same method as in Example 3.
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), c-di-AMP (2 mg, Invivo Gen, San Diego, USA), cholesterol (0.25 mg / mL, Sigma Aldrich, USA) were dissolved in 1 mL of ethanol. The solution was transferred to a round flask and ethanol was completely evaporated using a rotary concentrator to form a thin lipid membrane. NE-IQ (DDA + STING (cyclic DNA)) was then prepared using the same method as in Example 3.
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), cholesterol (0.25 mg / mL, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in 1 mL of ethanol. The solution was transferred to a round flask and ethanol was completely evaporated using a rotary concentrator to form a thin lipid membrane.
  • soybean oil (2.5% v / v, Sigma-Aldrich, USA) and Tween (1% v /) containing R837 prepared using the same preparation method as Example 1, except that soybean oil was used instead of squalene.
  • phosphate buffer solution PBS, 0.0067M PO4
  • the lipid membrane was dispersed in the solution at 600 rpm for 30 minutes at 60 ° C. using a stirrer.
  • the dispersed solution was transferred to a 4 mL vial and released using a sonicator for 1 minute to completely disperse the lipid membrane in phosphate buffer (PBS).
  • Poly (I: C) (2 mg / mL. Invivogen, USA) was dissolved in phosphate buffer solution (0.0067 M PO4), mixed with the nanoemulsion in a 1: 1 volume ratio, and then stirred for 2 hours. It was stored in a 4 °C refrigerator until.
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), cholesterol (0.25 mg / mL, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in 1 mL of ethanol. The solution was transferred to a round flask and ethanol was completely evaporated using a rotary concentrator to form a thin lipid membrane.
  • a phosphate buffer solution containing squalene (2.5% v / v, Sigma Aldrich, USA) and Tween (1% v / v) containing R837 prepared as in Example 1 (PBS, 0.0067M PO4)
  • PBS phosphate buffer
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), cholesterol (0.25 mg / mL, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in 1 mL of ethanol. The solution was transferred to a round flask and ethanol was completely evaporated using a rotary concentrator to form a thin lipid membrane.
  • phosphate buffer solution PBS, 0.0067M PO4 containing squalene (2.5% v / v, Sigma Aldrich, USA) and Tween (1% v / v) comprising R837 prepared in Example 1
  • the lipid membrane was dispersed in the solution at 600 rpm for 30 minutes at 60 ° C. using a stirrer.
  • the dispersed solution was transferred to a 4 mL vial, and then released using a sonicator for 1 minute to completely disperse the lipid membrane in phosphate buffer (PBS).
  • DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg / mL, Sigma Aldrich, USA), cholesterol (0.25 mg / mL, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in 1 mL of ethanol. The solution was transferred to a round flask and ethanol was completely evaporated using a rotary concentrator to form a thin lipid membrane.
  • the lipid membrane was dispersed in the solution at 600 rpm for 30 minutes at 60 ° C. using a stirrer.
  • the dispersed solution was transferred to a 4 mL vial and released using a sonicator for 1 minute to completely disperse lipids in phosphate buffer (PBS).
  • CpG (2 mg / mL. Invivogen, USA) is dissolved in phosphate buffer solution (0.0067 M PO4), mixed with the nanoemulsion in a 1: 1 volume ratio, stirred for about 2 hours, and then placed in a 4 ° C refrigerator until use. Stored.
  • the cellular immune response of T cells against the NE-IQ series vaccine adjuvant compositions prepared according to Examples 9-1 to 9-8 as described in Table 2 was measured using the same method as in Example 7. The results are shown in FIG. 21. As the additional immunoactivator was introduced, it was confirmed that the interferon-gamma (IFN- ⁇ ) secretion was rapidly improved.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • Nanoemulsions comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and an oil according to the present invention are useful for the prevention of infectious diseases, therapeutic vaccines and immune chemotherapy. It is possible to provide the vaccine adjuvant in the form of emulsion used for activation, and also to disperse imidazoquinoline-based materials stably in an oil such as squalene using a dispersion medium material, and finally to prepare the oil layer thus prepared in emulsion form. By the preparation, it is possible to provide a vaccine adjuvant using imidazoquinoline series material that is poorly soluble in most organic solvents and aqueous solutions.
  • the adjuvant in the form of a nanoemulsion of the present invention when used as a vaccine in combination with an antigen, has the effect of simultaneously improving humoral and cellular immunity.
  • the nanoemulsion comprising an oil layer comprising an imidazoquinoline-based toll-like receptor 7 or 8 agonist and an oil according to the present invention is an lipophilic imidazoquinoline-based toll-like receptor agonist. Because of the controlled release behavior from the inner oil layer to the aqueous solution layer, it is released slowly in the body, thereby improving cellular immune effects, while solving the systemic toxicity problem.

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Abstract

본 발명은 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼, 및 이의 아주번트 및 백신으로의 용도에 대한 것으로, 본 발명에 따르면 난용성인 이미다조퀴놀린계열 물질을 분산 매개체 물질을 이용하여 오일에 용해시키고, 이 오일 용액을 용이하고 재현성 있게 수용성에 분산시킬 수 있는 나노에멀젼 형태의 백신 아주번트를 제공할 수 있다.

Description

이미다조퀴놀린계열 물질을 포함하는 나노에멀젼 및 이의 용도
본 발명은 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼, 및 이의 아주번트 및 백신으로의 용도에 대한 것이다.
백신 아주번트는 면역증강 보조제로서, 면역세포를 활성화시켜 감염성 질환의 예방/치료 백신 및 항암치료에서 중요한 역할을 한다. 종래의 백신에서 아주번트로 사용되는 면역보조제인 알루미늄염(aluminum salt, alum)이나 스쿠알렌 나노에멀젼(squalene-based nanoemulsion, MF59, AS03, AF03 등)은 항체 반응에 기여하는 체액성 면역반응(humoral immunity)의 향상을 유도하는데 효과적이지만, 바이러스 및 암 항원에 대한 세포성 면역 반응(cellular immunity)을 유도하는 효능에는 한계가 있다는 치명적인 단점이 있다. 이 때문에, 나노에멀젼기반 아주번트는 인플루엔자 예방백신으로만 그 이용이 제한적이다.
최근에는 Tuberculosis, HIV, Malaria, Zoster 및 암 백신 등에서는 체액성 면역과 세포성 면역효과를 동시에 효과적으로 유도할 수 있는 백신 아주번트 개발이 요구되고 있다. 세포성 면역을 유도하기 위해서 다양한 톨 유사 수용체 리간드 등이 사용되고 있다. 한 예로, GSK에서는 alum과 톨-유사 수용체 4(Toll-like receptor 4)의 리간드인 MPLA을 혼합한 ASO4 아주번트를 제조하여 자궁경부암 백신으로 상용화한 예가 있다. 또한, 스쿠알렌 나노에멀젼 외부에 MPLA와 사포닌계열인 QS21을 코팅한 AS02를 개발하여 임상시험 중에 있다. 한편, 한국등록특허 제10-1577955호는, 음전하성 고분자 및 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist)의 복합체, 및 콜라겐계 물질 또는 젤라틴계 물질을 포함하는 아주번트 조성물을 개시하고, 이러한 아주번트 조성물은 온도 변화에 따라 다단계 상전이 특성을 가짐을 개시하고 있다. 한편, 세포성 면역반응을 유도하는 면역보조제로 알려진 이미다조퀴놀린 (Imidazoquinoline) 계열 약물(예를 들어, Imiquimod(이미퀴모드), Resiquimod (레시퀴모드), Dactolisib (닥토리십), Gardiquimod(가디퀴모드), Sumanirole (수마니롤) 등)은 톨-유사 수용체 7 또는 8 리간드로서, 백신 아주번트로서 유용한 특성을 갖고 있다.
하지만, 이미다조퀴놀린계열 물질은 그 분자구조로 인해 수용액에 분산하는데 많은 어려움이 있다. 특히, 이미퀴모드(Imiquimod, R837)는 DMSO를 제외한 대부분의 유기 용제에도 용해되지 않아, 다양한 제형으로의 제조에 많은 한계가 있다. 이러한 이유로 인해, 이미퀴모드는 다양한 계면활성화제를 혼합한 크림형태의 제형 (제품명: 3M사의 Aldara®)으로 상용화되어 있는 실정이었다. 그리고, 염 형태(예를 들어, HCl)의 이미다조퀴놀린 계열 약물은 수용액에 가용화 될 수 있으나, 약물이 전신으로 흡수되어 많은 독성효과 및 부작용을 초래하기 때문에, 백신 아주번트 형태로는 적합하지 않다는 문제점이 있었다.
본 발명자는 수용액에 가용화되기 힘든 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트를 분산 매개체 물질을 사용하여 오일에 용해시키고, 이 오일 혼합물을 나노에멀젼 형태로 제조함으로써, 난용성인 이미다조퀴놀린계열의 면역학적 특성과 오일기반 나노에멀젼의 면역학적 특성을 동시에 갖는 면역활성화 물질을 개발하고, 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역을 향상시키는 아주번트 및 백신 용도로 사용할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼을 제공한다.
그리고, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 나노크기의 오일층 내부에 분산되어 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 계면활성제, 및 면역활성화 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 상기 오일층 외부에 코팅되어 있을 수 있다.
또한, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 닥토리십(Dactolisib), 가디퀴모드(Gardiquimod), 수마니롤(Sumanirole), 모토리모드(motolimod), 3M사의 3M-052, S-34240, 852, 854-A, 및 이들의 유사체(derivatives)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
그리고, 상기 오일은 어류 유래 오일, 동물성 유래 오일, 식물성 유래 오일, 토코페롤, 미네랄 오일, 및 케스터 오일로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다,
또한, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일은 0.1:100 내지 1:50의 중량비로 포함될 수 있다.
한편, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일 간에 친유성 상호작용을 도와주는 매개체 물질을 더 포함할 수 있다.
그리고, 상기 매개체 물질은 미리스트올레산, 팔미톨레산, 사피에닉산(Sapienic acid), 올레산, 엘라이딘산(Elaidic acid), 박센산(Vaccenic acid), 리놀레산, 리놀레에시딕산(Linoelaidic acid), 알파-리놀레산, 아라키돈산, 에티코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid), 에루크산(Erucic acid), 도코사헥사에노산(Docosahexaenonic acid), 카프릴산(Caprylic acid), 카프르산(Capric acid), 라우르산(Lauric acid), 미리스트산(Myristic acid), 팔미트산, 스테아르산, 아라크산(Arachidic acid), 베헨산(Behenic acid), 리그노세르산(Lignoceric acid), 및 세로트산(Cerotic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 매개체 물질은 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 0.1:10 내지 10:0.1의 중량비로 포함될 수 있다.
그리고, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(Tween); 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO) 및 부틸렌 옥사이드(BO) 중 하나 이상을 포함하는 코폴리머; 트리톤 X-100 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 포함하는 옥토시놀; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올; 포스파티딜콜린(레시틴) 포스파티딜에탄올아닐린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 스핑고미엘린 및 카디올리핀을 포함하는 포스포리피드; 노닐페놀 에톡실레이트; 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르를 포함하는 라우릴, 세틸 및 오레일 알코올로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 패티 에테르; 및 소르비탄 트리올레이트(Span85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함하는 소르비탄 에스테르(SPAN) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
그리고, 상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist, TLR), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 및 양이온성 지질(cationic lipids) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 나노에멀젼을 포함하는 아주번트 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역을 높이는 아주번트 조성물, 및 항원을 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, a) 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트를 오일에 용해시켜 오일용액을 제조하는 단계; b) 계면활성화제 및 면역활성화 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을, 상기 오일용액과 혼합하는 단계; 및 c) 상기 b 단계에서 수득한 혼합 용액을 수용액에 분산하는 단계 를 포함하는 나노에멀젼의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼은, 감염성 질환의 예방, 치료 백신 및 면역항암치료에서 중요한 역할을 하는 면역세포의 활성화에 사용되는 에멀젼 형태의 백신 아주번트를 제공할 수 있고, 또한 분산 매개체 물질을 이용하여 이미다조퀴놀린 계열 물질을 스쿠알렌과 같은 오일에 안정하게 분산시키고, 이렇게 제조된 오일층을 최종적으로 에멀젼 형태로 제조함으로써, 대부분의 유기 용매와 수용액에 난용성인 이미다조퀴놀린 계열 물질을 이용한 백신 아주번트를 제공할 수 있다.
한편, 본 발명의 나노에멀젼 형태의 아주번트는 항원과 결합되어 백신으로 사용될 때, 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 탁월하게 향상시킬 수 있다는 효과를 가진다.
또한, 본 발명에 따른 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼은, 친유성인 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 아고니스트가 나노에멀젼의 내부인 오일층에서 수용액층으로 서방성 방출(controlled release) 거동 특성을 보이므로, 체내에서 느리게 방출됨으로써, 세포성 면역효과를 높이면서도, 전신독성 문제를 해결할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 아고니스트, 분산 매개체 물질, 오일, 계면활성제 및 면역활성화 물질 성분으로 구성된 나노에멀젼 아주번트 조성물의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노에멀젼(NE)과 이미다조퀴놀린계열 톨유사 수용체 아고니스트를 포함하는 나노에멀젼(NE-IQ)의 크기 및 크기 분포를 측정한 데이터로, DLS(Dynamic Light Scattering) 측정 데이터이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노에멀젼(NE)과 이미다조퀴놀린계열 톨유사 수용체 아고니스트를 포함하는 나노에멀젼(NE-IQ)의 크기 및 크기 분포를 측정한 데이터로, TEM(Transmission Electron Microscopy) 이미지(NE-IQ)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 NE-IQ의 면역세포(BMDC:bone-marrow derived dendritic cell, BMMC:bone-marrow derived macrophage cell)내 전달 및 분포를 나타낸 것(NE-IQ(DID), Lysotracker (FITC))으로, a는 BMDC, b는 BMMC에 대한 것이다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 NE-IQ의 처리 후에, 면역세포의 성숙도와 관련된 사이토카인의 발현량의 이미퀴모드(R837)의 농도 의존도를 나타낸 것으로, a는 BMDC, b는 BMMC에 대한 그래프이다.
도 5는 발명의 일 실시예에 따른 NE-IQ의 처리 후에, 면역세포의 성숙도와 관련된 표면마커 발현률 생존률의 R837의 농도 의존도를 나타낸 것으로, a는 BMDC, b는 BMMC에 대한 그래프이다.
도 6은 발명의 일 실시예에 따른 NE-IQ의 처리 후에, 24, 48시간 후에 면역세포 생존률에 미치는 영향을 나타낸 것으로, a는 BMDC, b는 BMMC에 대한 그래프이다.
도 7은 NE-IQ를 근육주사 후에, 발현되는 Type I inteferon의 한 종류인 IFN-alpha의 발현량을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 OVA(Ovalbumin) 항원에 대한 NE 및 NE-IQ의 효소 면역 측정-IgG titer(3, 6, 9 주)를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 OVA (Ovalbumin) 항원에 대한 NE 및 NE-IQ의 효소 면역 측정-IgG1 titer(3, 6, 9 주)를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 OVA(Ovalbumin) 항원에 대한 NE 및 NE-IQ의 효소 면역 측정-IgG2a titer (3, 6, 9 주)를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 OVA (Ovalbumin) 항원에 대한 NE및 NE-IQ의 효소 면역 측정-IgG2a/IgG1 ratio (3, 6, 9 주)를 나타낸 것이다.
도 12는 NE-IQ를 근육주사 후에, 활성화되는 CTL 면역반응을 측정하기 위한 Immunization schedule을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 OVA(Ovalbumin) 항원에 대한 NE 및 NE-IQ의 세포성 면역유도 효과(T 세포 활성화에 의한 IFN-gamma 분비)를 나타낸 것이다.
도 14는 B16F10 암세포 이식한 마우스에 NE-IQ를 immunization한 후에 암세포의 성장을 측정한 결과이다.
도 15는 B16F10 암세포 이식한 마우스에 NE-IQ를 immunization한 후에, CD3(+)CD4(+)T 세포의 활성화를 측정한 결과이다.
도 16은 B16F10 암세포 이식한 마우스에 NE-IQ를 immunization한 후에, CD3(+)CD8(+)T 세포의 활성화를 측정한 결과이다.
도 17은 B16F10 암세포 이식한 마우스에 NE-IQ를 immunization한 후에, CD4(+)IFN-gamma(+) 세포의 활성화를 측정한 결과이다.
도 18은 B16F10 암세포 이식한 마우스에 NE-IQ를 immunization한 후에, CD8(+)IFN-gamma(+) 세포의 활성화를 측정한 결과이다.
도 19는 B16F10-OVA 암세포 이식한 마우스에, NE-IQ와 오브알부민 항원으로 이루어진 백신을 투여한 후에, 항원 특이적으로 암세포 성장이 억제되는 것을 확인한 결과이다.
도 20은 EG7-OVA 암세포 이식 한 마우스에 NE-IQ를 immunization한 후에 암세포의 성장에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 OVA (Ovalbumin) 항원에 대한 NE-IQ 계열의 백신 아주번트 조성물들의 세포성 면역유도 효과(T 세포 활성화에 의한 IFN-gamma 분비)를 나타낸 것이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현 예 및 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼을 제공한다.
상기 나노에멀젼에서 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 나노크기의 오일층 내부에 분산되어 있고, 에멀젼 외부에 계면활성제, 면역활성화 물질 또는 이들의 조합이 코팅된 형태일 수 있다(도 1).
도 1은 본 발명의 나노에멀젼의 개략도로서, 오일층 내부에 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트가 분산되어 있고, 표면에 계면활성제 및/또는 면역활성화 물질이 코팅되어 있는 구형의 형태이다. 나노에멀젼의 크기는 약 50 내지 500 nm, 예를 들어, 약 50 내지 300 nm, 약 50 내지 100 nm, 약 70 내지 500 nm, 약 100 내지 500 nm 또는 약 100 내지 200 nm일 수 있다.
상기 나노에멀젼은 a) 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트를 오일에 용해시켜 오일용액을 제조하는 단계; b) 계면활성화제 및 면역활성화 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을, 상기 오일용액과 혼합하는 단계; 및 c) 상기 b 단계에서 수득한 혼합 용액을 수용액에 분산하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
상기에서 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 친유성 상호작용을 도와주는 매개체 물질과 함께 오일에 용해되는 것일 수 있다.
상기 면역활성화 물질은 상기 나노에멀젼 제조과정에서 계면활성화제와 혼합하여 사용되거나, 나노에멀젼을 제조한 후에, 표면에 추가적으로 부착될 수 있다.
상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일은 0.1:100 내지 1:50의 중량비, 예를 들어, 1:20의 중량비로 포함될 수 있다.
상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 면역활성화 물질로서, 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 닥토리십(Dactolisib), 가디퀴모드(Gardiquimod), 수마니롤(Sumanirole), 모토리모드(motolimod), 3M사의 3M-052, S-34240, 852, 854-A, 및 이들의 유사체(derivatives)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 예를 들어, 이미퀴모드일 수 있다.
상기 오일은 어류 유래 오일, 동물성 유래 오일, 식물성 유래 오일, 토코페롤, 미네랄 오일, 케스터 오일 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 어류 오일은 대사 가능한 오일이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 대구간 오일, 상어간 오일, 고래 오일 등을 포함한다. 상기 상어간 오일은 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로서 알려진 분자, 불포화 테르펜을 함유하며, 스쿠알렌, 스쿠알란에 대한 포화 유사체도 포함할 수 있다. 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함하는 어류 오일은 시중의 공급원으로부터 용이하게 이용 가능하거나 또는 당업계에 공지된 방법으로 획득될 수 있다. 상기 동물성 유래 오일은 라드, 수지(tallow) 오일, 우지 등을 포함할 수 있다. 상기 식물성 유래 오일은 견과, 종자, 곡물 등으로부터 유래된 오일일 수 있으며, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일 등을 포함할 수 있다. 상기 토코페롤은 비타민 E가 함유된 토코페롤일 수 있다. 다양한 토코페롤이 존재하지만(α, β, γ, δ, ε 또는 ξ), 일반적으로 α-토코페롤이 사용되며, 예를 들어, DL-α-토코페롤이 사용될 수 있다.
상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 난용성으로서 오일과의 친유성 상호작용을 도와주는 매개체 물질에 의해 오일 내에 가용화되어 분산될 수 있다. 상기 매개체 물질은 예를 들어, 미리스트올레산, 팔미톨레산, 사피에닉산(Sapienic acid), 올레산, 엘라이딘산(Elaidic acid), 박센산(Vaccenic acid), 리놀레산, 리놀레에시딕산(Linoelaidic acid), 알파-리놀레산, 아라키돈산, 에티코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid), 에루크산(Erucic acid), 도코사헥사에노산(Docosahexaenonic acid), 카프릴산(Caprylic acid), 카프르산(Capric acid), 라우르산(Lauric acid), 미리스트산(Myristic acid), 팔미트산, 스테아르산, 아라크산(Arachidic acid), 베헨산(Behenic acid), 리그노세르산(Lignoceric acid), 세로트산(Cerotic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 매개체 물질은 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일과 0.1:10 내지 10:0.1의 중량비, 예를 들어, 1:5 내지 5:1의 중량비로 사용될 수 있다.
상기 계면활성제는 나노에멀젼의 외부에 코팅되어 나노에멀젼이 수용액 내에 분산될 수 있도록 하는 것으로, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(Tween), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 코폴리머; 옥토시놀(예를 들면, 트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스포리피드 (인지질 성분)로서, 포스파티딜콜린(레시틴) 포스파티딜에탄올아닐린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 스핑고미엘린 및 카디올리핀; Tergitol™ NP 시리즈와 같은 노닐페놀 에톡실레이트; 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30)과 같은 라우릴, 세틸 및 오레일 알코올(Brij 계면활성제로 알려진)로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 패티 에테르; 및 소르비탄 트리올레이트 (Span85) 및 소르비탄 모노라우레이트와 같은 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPAN로 알려짐)를 단독으로 사용하거나, 2종 이상의 계면활성제를 조합하여 함께 사용할 수 있다.
예를 들어, 상기 계면활성제는 이들 계면활성제의 혼합물, 예를 들면 Tween 80/Span 85 혼합물이 이용될 수 있고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 옥토시놀의 조합이 사용될 수 있다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥토시놀을 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 전체 나노에멀젼 총 중량에 대하여 0.001 내지 20%의 중량으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 0.01 내지 1%, 0.001 내지 0.1%, 0.005 내지 0.02%; 0.1 내지 20%, 0.1 내지 10%, 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%의 중량으로 사용될 수 있다.
상기 나노에멀젼의 외부에 코팅되는 추가 면역활성화 물질은 수지상세포, T 세포 및 B 세포의 증식과 분화, 활성을 자극하는 역할을 하며, 이에 따라 활성화된 T 세포는 세포독성 T 세포로 분화를 촉진시키고, 인터페론-감마와 같은 사이토카인의 분비로 인해 세포성 면역반응에 관여한다. 상기 추가 면역활성화 물질은 예를 들어, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist, TLR), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 양이온성 지질 (cationic lipids), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 천연 톨-유사 수용체 아고니스트 또는 합성 톨-유사 수용체 아고니스트일 수 있다.
상기 면역활성화 물질은 하나 또는 둘 이상의 톨-유사 수용체 아고니스트의 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어, CL401(듀얼 TLR2 및 TLR7 아고니스트)또는 CL429(듀얼 TLR2 및 NOD2 아고니스트) 단독 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 TLR-1을 통해 신호전달 반응을 야기시킬 수 있는 것일 수 있으며, 예를 들어, 트리-아실화된 지질펩티드(LP); 페놀-가용성 모듈린(modulin); 코박테리움튜베르쿨로시스(Mycobacteriumtuberculosis) 지질펩티드; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH; 보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei)로부터의 박테리아 지질펩티드; OspA 지질펩티드의 아세틸화된 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드(Pam3Cys) 지질펩티드; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 TLR-2 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, Pam3Cys-Lip을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-3 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 폴리아이시 계열로서 Poly(I:C), Poly(ICLC), Poly(IC12U), Ampligen 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-4 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 시겔라 플렉시네리(Shigella flexineri) 외막 단백질 제조물, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-5 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 플라젤린(flagellin) 또는 이의 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-7 아고니스트 또는 TLR-8 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 이미퀴모드, R837, 레스퀴모드, 또는 R848와 같은 이미다조퀴놀린 분자; VTX-2337; CRX642; 인지질 기 또는 포스포노지질기에 공유적으로 결합된 이미다조퀴놀린; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-9 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 CpG 모티프를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, β-에스킨, 디지토닌 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항바이러스성 펩티드는 케이엘케이(KLK)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인플러머좀 인듀서는 TDB(trehalose-6,6-dibehenate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 NOD 리간드는 M-TriLYS(NOD2 아고니스트-합성 무라밀 트리펩티드) 또는 NOD2 아고니스트(N-glycolylated muramyldipeptid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CDS 리간드는 Poly(dA:dT)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 STING 리간드는 cGAMP, di-AMP, 또는 di-GMP 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역활성화 물질은 Pam3Cys-Lip, 폴리아이시(Poly(I:C), CRX-527, MPLA(monophosphoryl lipid A), 플라젤린(flagellin), 이미퀴모드, 레스퀴모드, CpG, QS21, M-TriLys(MurNAc-Ala-D-isoGln-Lys), TDB(trehalose-6,6-dibehenate), 8837, Poly(dA:dT), cGAMP, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤(3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride), DDA(dimethyldioctadecylammonium), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DOTMA(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane), EPC(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), MVL5(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide), DODAP(lipids1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 나노에멀젼을 포함하는 아주번트 조성물 및 상기 본 발명에 따른 아주번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 항원은 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 유전자, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포, 바이러스 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 단백질은, 예를 들어, 오버알부민, 펩타이드, 재조합 단백질, 서브유닛(subunit), 스플릿(split) 단백질 항원을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 DNA 또는 mRNA 항원을 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드는 암세포 또는 바이러스에 특이적 펩타이드 항원을 포함할 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어, 수지상세포, 암세포 및 암세포 유래 라이세이트를 포함할 수 있고, 상기 바이러스는, 예를 들어, 인플루엔자, 고병원성 인플루엔자를 포함할 수 있다.
상기 아주번트 조성물 또는 백신 조성물은 약학적으로 유효한 양의 나노에멀젼 및/또는 항원 이외에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 이미퀴모드(Imiquimod)(R837)를 포함한 스쿠알렌용액의 제조
이미퀴모드 (TCI, 도쿄, 일본) 20 mg을 올레산 (시그마알드리치, 미국) 100mg에 초음파 분산기 (bath sonicator) (Branson Bransonic® MH Mechanical Bath 5800, Emerson, St. Louis MO)를 이용하여 용액이 투명해질 때까지 실온에서 용해시켰다. 그 후, 스쿠알렌 (Squalene) (5% v/v, 시그마알드리치, 미국) 1 mL을 넣은 뒤에 균일한 스쿠알렌(Squalene) 용액을 얻기 위해서 믹서기 (Vortex-Genie 2, Scientific Industries, USA)를 이용하여 교반시켰다.
실시예 2. 이미퀴모드를 포함한 스쿠알렌 나노에멀젼 (NE-IQ) 제조 및 특성화
실시예 1에서와 같이 제조된 이미퀴모드를 포함하는 스쿠알렌 (5% v/v, 시그마알드리치, 미국), Tween 80 (0.5% v/v, 시그마알드리치, 미국) 및 Span 85 (0.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)을 인산완충용액 (PBS, 0.0067M PO4) 2 mL에 용해시킨 후 초음파 분산기 (Tip sonicator)를 이용하여서 1분 동안 인산완충용액 (PBS)에 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 그 후, 회전기(tube revolve)를 사용하여 2시간 정도 교반한 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 에멀젼(emulsion)의 크기는 DLS (Dynamic Light Scattering, 오츠가, 일본)를 통해 분석하였다. DLS (Dynamic Light Scattering, 오츠가, 일본) 측정 결과, 지름이 106.16±5.4 와 148.54±18.5m 임을 확인하였다(도 2, 표 1).
Figure PCTKR2018001891-appb-T000001
실시예 3. NE-IQ의 면역세포 내 유입 및 세포 내 위치 확인
골수유래수지상세포 (Bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)와 골수유래대식세포 (Bone marrow-derived macrophage cells, BMMCs)에 24시간 동안 이미퀴모드(Imiquimod)(R837)를 포함한 스쿠알렌(Squalene)을 처리 후 형광현미경을 이용하여 평가하였다. 도 3의 형광이미지에서 보이듯이 lysotracker (녹색)과 DID (빨간색)는 세포내 같은 위치에 존재하며 겹쳐지는 것 (Co-localization)이 되는 것을 확인하였다. 이를 통해 이미퀴모드를 포함한 스쿠알렌 나노에멀젼 (NE-IQ)이 세포내 유입 후에 엔도좀(endosome) 및 리소좀 (lysosome)에 위치하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. NE-IQ의 BMDCs와 BMMCs로의 세포 활성효과 평가
NE-IQ가 골수유래수지상세포 (Bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)와 골수유래대식세포 (Bone marrow-derived macrophage, BMMCs) 활성화에 미치는 영향은 전구염증 싸이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-12, IL-2)의 분비량을 이엘아이에스에이(ELISA) 실험방법을 이용하여 분석하었다.
도 4에서 NE-IQ를 처리 하였을 경우, Th1 반응을 유도하는 IL-6와 IL-12의 분비가 증가되는 것으로 확인하였고, 또한 세포사멸과 종양생성억제를 유도하는 TNF-α와 염증성 사이토카인 IL-1β의 분비량도 이미퀴모드 (Imiquimod)(R837)를 포함하지 않은 경우보다 확연히 증가됨을 확인 할 수가 있었다.
또한, 시료를 BMDCs와 BMMCs에 처리하여 성숙됨에 따라 발현되는 CD40,80,86을 표지한 결과, NE-IQ를 처리한 경우 모두 발현 양이 증가되었음이 확인되었다(도 5). 이를 통하여, 이미퀴모드의 자극을 통해 수지상세포와 대식세포의 성숙도를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. NE-IQ의 BMDCs와 BMMCs로의 세포 증식효과 평가
골수유래수지상세포 (Bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)와 골수유래대식세포 (Bone marrow-derived macrophage, BMMCs)에 NE-IQ를 처리 한 후, 세포증식률을 평가하였다. 도 6의 증식률 평가에는 미토콘드리아의 활성을 측정하는 MTS Assay kit (Cell Proliferation) 분석이 사용되었다. NE-IQ를 처리 하였을 경우, 24시간 48시간 모두 두 종류의 면역세포에서 이미퀴모드를 포함하지 않은 경우보다 10배 이상 확연히 증가됨을 확인 할 수가 있었다.
실시예 6. NE-IQ의 IFN -α 생성 능력 평가
마우스 실험에서는 C57BL/6 (female 5-6 주령, 오리엔트) 마우스를 사용하였으며, 오브알부민 (OVA) 10μg, 그리고 이미퀴모드(R837) 25μg이 한 마리 분량으로 50μL에 용해되어 사용되었다. 마우스에게 백신을 주입함에 따라 24시간 후에 근육(Muscle) 부위와 림프노드(Lymph node) 부위에서의 IFN-α의 분비량을 이엘아이에스에이(ELISA) 실험방법을 통하여 분석하였다. NE-IQ를 처리한 실험군이 다른 대조군 (NE 및 Alum 아주번트 사용 대조군)보다 사이토카인 분비량이 증가하는 것을 확인하였다(도 7). 이미퀴모드(Imiquimod)(R837)는 톨 유사 수용체 7의 자극을 통해 인터페론 (IFN) 사이토카인의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다.
실시예 7. NE-IQ 아주번트가 포함된 백신의 항체형성 능력 및 세포매개 T 세포 활성화 효과 확인
마우스 실험에서는 C57BL/6 (female 5-6 주령, 오리엔트) 마우스를 사용하였으며, 오브알부민 (OVA) 100 μg, 그리고 이미퀴모드(R837) 45.5 μg이 한 마리 분량으로, 상기 실시예 2에서와 같이 제조된 NE-IQ를 100 μL에 용해하여 사용하였다. 마우스에게 백신을 주입함에 따라 체액성 면역 반응이 증가함을 효소 면역 측정법으로 각각 분석하였다. 체액성 면역 반응은 총 3번의 접종을 진행하였으며 백신 접종이 끝난 후 3주 간격으로 마우스에서 안와채혈을 실시하여 면역 글로불린 IgG와 IgG 아형인 IgG1 및 IgG2a의 생성량을 대조군과 비교하였다(도 8: IgG, 도 9: IgG1, 도 10: IgG2a 생성량).
그 결과, 항체 생성량은 백신을 접종한 경우 모두에서 증가한 것을 확인하였고, 특히 이미퀴모드가 포함된 NE-IQ를 아주번트로 사용한 백신에서의 효과가 가장 높게 나타나는 것을 관찰하였다. 특히 세포성 면역 향상 정도를 나타내는 IgG2a/IgG1 값이 NE-IQ를 아주번트로 사용한 실험군에서 가장 높은 값을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 11). 그 이유는 NE 내부에 로딩된 이미퀴모드의 역할 때문으로 보여진다.
세포성 면역 유도효과를 검증하기 위하여, 도 12와 같은 일정으로 immunization 하였으며, 마지막 주입 후 7일 후에 쥐에서 비장을 적출하여, 단일 세포를 얻은 뒤 PBS를 사용하여 세척하고 원심분리 (1500rpm, 5분)을 시행하였다. OVA peptide 를 이용하여 reactivation 시킨 후 T 세포의 표면 분자인 CD8에서 세포 내부의 IFN-gamma들 확인한 결과 대조군에 비하여 NE-IQ가 immunization 된 그룹에서 IFN-gamma를 분비하는 CD8+ T 세포의 활성화를 촉진하는 것을 확인 하였다 (도 13).
실시예 8. NE-IQ의 암세포 증식 억제 효과 평가
C57BL/6 마우스 흑색종 모델을 이용하여 NE-IQ를 암세포(intratumor injection)에 투여한 후 종양 치유 능력을 확인하였다. 6주령 생쥐 암컷 5마리의 오른쪽 대퇴부에 1x105 흑색종 세포 (B16F10)를 피하주사로 주입하고 5일 후에 3일 간격으로 5번 100μl씩 주입하였으며, 대조군에는 PBS를 주입하였다. 그 다음 암세포 투여 후 19일 동안 1주일에 2-3회씩 종양 크기(Tumor volume)를 측정하였다. 그 결과 암 세포 주입 후 NE-IQ를 투여한 경우에, 대조군에 비해 종양세포의 증식이 현저히 억제됨을 관찰 할 수 있었다(도 14).
마지막 주입 후에 3일후에 암세포 부위에서의 T 세포의 침투율을 확인한 결과, NE-IQ를 투여한 경우에 대조군에 비해서 CD4 T cell 과 CD8 T cell의 침투율이 증가하는 것을 확인 할 수가 있었다(도 15, 도 16).
이는 암세포를 죽일 수 있는 T 세포들을 증가시켜 암을 억제하는 역할을 한다. 마지막 주입 후 7일 후에 쥐에서 비장을 적출하여, 단일 세포를 얻은 뒤 PBS를 사용하여 세척하고 원심분리 (1500rpm, 5분)을 시행하였다. B16F10 의 lysate를 이용하여 reactivation 시킨 후 T 세포이 표면 분자인 CD8와 CD4에서 세포 내부의 IFN-gamma를 확인한 결과 대조군에 비해, NE-IQ를 투여한 그룹에서 IFN-gamma를 분비하는 CD8+ T 세포의 활성화를 촉진하는 것을 확인하였다(도 17, 도 18). 또한, 오브알부민(Ovalbumin, OVA)의 펩타이드를 발현하는 흑색종 모델(B16F10-OVA)을 이용하여, NE-IQ와 오브알부민 항원으로 이루어진 백신을 도 12와 같은 방법으로 투여한 후에, 항원 특이적이게 암세포 억제를 하는 것을 확인 할 수가 있었다(도 19). 또 다른 종양 모델을 이용하여서도 NE-IQ의 암세포 증식 억제효과를 확인하였다. C57BL/6 마우스 OVA 항원을 발현하는 림포마 모델(EG7-OVA)을 이용하여 NE-IQ를 암세포(intratumor injection)에 투여한 후 종양 치유 능력을 확인하였다. 6주령 생쥐 암컷 5마리의 오른쪽 대퇴부에 1x105 림포마 세포(EG7-OVA)를 피하주사로 주입하고 5일 후에 3일 간격으로 5번 100μl씩 주입하였으며, 대조군에는 PBS를 주입하였다. 그 다음 암세포 투여 후 19일 동안 1주일에 2-3회씩 종양 크기(Tumor volume)를 측정하였다. 그 결과 암 세포 주입 후, NE-IQ를 투여한 경우에, 대조군에 비해 종양세포의 증식이 현저히 억제됨을 관찰 할 수 있었다(도 20).
실시예 9. NE-IQ에 하나 이상의 추가 면역활성화 물질을 포함하는 나노에멀젼 제조
NE-IQ 나노에멀젼에 MPLA, DDA, QS21 등 하나 이상의 추가 면역활성화 물질을 포함하는 나노에멀젼을 하기 표 2와 같은 조성으로 제조하였다.
Figure PCTKR2018001891-appb-T000002
실시예 9-1. NE-IQ-1 아주번트 제조 : NE-IQ + DDA + MPLA
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (Cholesterol 0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA [monophosphoryl lipid a, 0.2 mg/mL 및 아반띠 폴라 리피드(avanti polar lipids, 미국)]을 에탄올 (ethanol) 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기 (rotary evaporator)를 이용하여 상기 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 (thin-film) 형태를 형성하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1과 2에서 사용된 방법과 동일한 제조방법을 이용하여 이미퀴모드(R837)이 포함된 나노에멀젼을 제조하되, 스쿠알렌 대신 미네랄오일 (2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)을 사용하였다. 이 미네랄오일이 포함된 용액과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산완충용액 (PBS, 0.0067M PO4) 2 mL을 첨가한 후에 교반기(stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30분 동안 600 rpm 속도로 지질(lipid) 막을 용액에 분산시켰다. 상기 분산용액을 4 mL 유리병(vial)에 옮긴 뒤에 초음파 분산기 (Tip sonicator)를 이용하여서 1분 동안 인산완충용액 (PBS)에 지질(lipid) 막이 완전하게 분산되도록 풀어줬다. 그런 다음, 회전기 (tube revolve)를 사용하여 2시간 정도 교반한 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
실시예 9-2. NE-IQ-2 아주번트 제조 : NE-IQ + MPLA + QS21
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA [0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 리피드(avanti polar lipids, 미국)], 사포닌 (QS21, 0.2 mg/mL), 콜레스테롤 (Cholesterol 0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 (ethanol) 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기 (rotary evaporator)를 이용하여 상기 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 (thin-film) 형태를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 1에서 사용된 이미퀴모드(R837)와 올레산 대신 레스퀴모드(R848)와 리놀레산 (시그마알드리치, 미국)을 사용하여 레스퀴모드가 분산된 스쿠알렌 오일용액을 제조하고, 상기 실시예 2에서 사용된 방법과 동일한 방법을 이용하여, NE-IQ (MPLA + QS21) 아주번트를 제조하였다.
실시예 9-3. NE-IQ-3 아주번트 제조 : NE-IQ + Pam3Cys -Lip + QS21
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), Pam3Cys-Lip (0.2 mg/mL, Invivo Gen, 미국), QS21 (QS21, 0.2 mg/mL)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기를 이용하여서 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 3에서와 같은 방법을 사용하여 NE-IQ (Pam3Cys-Lip + QS21) 아주번트를 제조하였다.
실시예 9-4. NE-IQ-4 아주번트 제조 : NE-IQ + DDA + STING (cyclic DNA))
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), c-di-AMP(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 3에서와 같은 방법을 사용하여 NE-IQ (DDA + STING (cyclic DNA))를 제조하였다.
실시예 9-5. NE-IQ-5 아주번트 제조 : NE-IQ + DDA + Poly ( I:C )
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 스쿠알렌 대신 대두 오일을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 제조방법을 이용하여 제조된 R837을 포함하는 대두 오일(2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산완충용액 (PBS, 0.0067M PO4) 2 mL을 첨가한 후에 교반기(stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30분 동안 600 rpm 속도로 지질(lipid) 막을 용액에 분산시켰다. 분산된 용액을 4 mL 유리병(vial)에 옮긴 뒤에 초음파 분산기 (Tip sonicator)를 이용하여서 1분 동안 인산완충용액 (PBS)에 지질(lipid) 막이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국)를 인산완충용액 (0.0067 M PO4)에 녹인 후에 나노에멀젼과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
실시예 9-6. NE-IQ-6 아주번트 제조 : NE-IQ + DDA + CL401
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 1에서와 같이 제조된 R837을 포함하는 스쿠알렌 (2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산완충용액 (PBS, 0.0067M PO4) 2 mL을 첨가한 후에 교반기(stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30분 동안 600rpm 속도로 지질(lipid) 막을 용액에 분산시켰다. 분산된 용액을 4 mL 유리병(vial)에 옮긴 뒤에 초음파 분산기 (Tip sonicator)를 이용하여서 1분 동안 인산완충용액 (PBS)에 지질(lipid) 막이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 마지막으로, CL401 (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산완충용액 (0.0067 M PO4)에 녹인 후에 나노리포좀과 1:1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
실시예 9-7. NE-IQ-7 아주번트 제조 : NE-IQ + DDA 7+ CL429
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 1에서 제조된 R837을 포함하는 스쿠알렌 (2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산완충용액 (PBS, 0.0067M PO4) 2 mL을 첨가한 후에 교반기(stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30분 동안 600rpm 속도로 지질(lipid) 막을 용액에 분산시켰다. 분산된 용액을 4 mL 유리병(vial)에 옮긴 뒤에 초음파 분산기 (Tip sonicator)를 이용하여 1분 동안 인산완충용액 (PBS)에 지질(lipid) 막이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 마지막으로, CL429 (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산완충용액 (0.0067 M PO4)에 녹인 후에 나노리포좀과 1:1부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
실시예 9-8. NE-IQ-8 아주번트 제조 : NE-IQ + DDA + CpG
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 제조된 R837을 포함하는 스쿠알렌 (2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산완충용액 (PBS, 0.0067M PO4)2 mL을 넣은 뒤에 교반기(stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30분 동안 600rpm 속도로 지질(lipid) 막을 용액에 분산시켰다. 분산된 용액을 4 mL 유리병(vial)에 옮긴 뒤에 초음파 분산기 (Tip sonicator)를 이용하여서 1분 동안 인산완충용액 (PBS)에 지질(lipid)가 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 마지막으로, CpG (2 mg/mL. 인비보젠, 미국)를 인산완충용액 (0.0067 M PO4)에 녹인 후에 나노에멀젼과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
실시예 10: NE-IQ 계열 나노에멀젼들의 세포매개 T세포 반응 확인
상기 표 2에 기재된 바와 같은 실시예 9-1 내지 9-8에 따라 제조된 NE-IQ 계열의 백신 아주번트 조성물에 대한 T 세포의 세포성 면역반응을 실시예 7에서와 같은 방법을 이용하여 측정하고, 그 결과를 도 21에 나타내었다. 추가적인 면역활성화 물질이 도입됨에 따라 인터페론-감마(IFN-γ) 분비량이 급격하게 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명에 따른 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼은, 감염성 질환의 예방, 치료 백신 및 면역항암치료에서 중요한 역할을 하는 면역세포의 활성화에 사용되는 에멀젼 형태의 백신 아주번트를 제공할 수 있고, 또한 분산 매개체 물질을 이용하여 이미다조퀴놀린 계열 물질을 스쿠알렌과 같은 오일에 안정하게 분산시키고, 이렇게 제조된 오일층을 최종적으로 에멀젼 형태로 제조함으로써, 대부분의 유기 용매와 수용액에 난용성인 이미다조퀴놀린 계열 물질을 이용한 백신 아주번트를 제공할 수 있다. 한편, 본 발명의 나노에멀젼 형태의 아주번트는 항원과 결합되어 백신으로 사용될 때, 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 탁월하게 향상시킬 수 있다는 효과를 가진다. 그리고, 본 발명에 따른 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼은, 친유성인 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 아고니스트가 나노에멀젼의 내부인 오일층에서 수용액층으로 서방성 방출(controlled release) 거동 특성을 보이므로, 체내에서 느리게 방출됨으로써, 세포성 면역효과를 높히면서도, 전신독성 문제를 해결할 수 있다.

Claims (17)

  1. 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트 및 오일을 포함하는 오일층을 포함하는 나노에멀젼.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 나노 크기의 오일층 내부에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  3. 제2항에 있어서, 상기 계면활성제, 및 면역활성화 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 상기 오일층 외부에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트는 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 닥토리십(Dactolisib), 가디퀴모드(Gardiquimod), 수마니롤(Sumanirole), 모토리모드(motolimod), 및 이들의 유사체(derivatives)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  5. 제1항에 있어서, 상기 오일은 어류 유래 오일, 동물성 유래 오일, 식물성 유래 오일, 토코페롤, 미네랄 오일, 및 케스터 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동물성 유래 오일은 스쿠알렌이고, 식물성 유래 오일은 올레산 인 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일은 0.1:100 내지 1:50의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  8. 제1항에 있어서, 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일 간에 친유성 상호작용을 도와주는 매개체 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  9. 제8항에 있어서, 상기 매개체 물질은 미리스트올레산, 팔미톨레산, 사피에닉산(Sapienic acid), 올레산, 엘라이딘산(Elaidic acid), 박센산(Vaccenic acid), 리놀레산, 리놀레에시딕산(Linoelaidic acid), 알파-리놀레산, 아라키돈산, 에티코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid), 에루크산(Erucic acid), 도코사헥사에노산(Docosahexaenonic acid), 카프릴산(Caprylic acid), 카프르산(Capric acid), 라우르산(Lauric acid), 미리스트산(Myristic acid), 팔미트산, 스테아르산, 아라크산(Arachidic acid), 베헨산(Behenic acid), 리그노세르산(Lignoceric acid), 및 세로트산(Cerotic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  10. 제8항에 있어서, 상기 매개체 물질은 상기 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 0.1:10 내지 10:0.1의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  11. 제3항에 있어서, 상기 계면활성제는
    폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(Tween);
    에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO) 및 부틸렌 옥사이드(BO) 중 하나 이상을 포함하는 코폴리머;
    트리톤 X-100 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 포함하는 옥토시놀;
    (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올;
    포스파티딜콜린(레시틴) 포스파티딜에탄올아닐린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 스핑고미엘린 및 카디올리핀을 포함하는 포스포리피드;
    노닐페놀 에톡실레이트;
    트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르를 포함하는 라우릴, 세틸 및 오레일 알코올로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 패티 에테르; 및
    소르비탄 트리올레이트(Span85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함하는 소르비탄 에스테르(SPAN)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  12. 제3항에 있어서, 상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist, TLR), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 및 양이온성 지질(cationic lipids) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 나노에멀젼을 포함하는 아주번트 조성물.
  14. 제13항에 따른 아주번트 조성물, 및 항원을 포함하는 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항원은 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 유전자, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. a) 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트를 오일에 용해시켜 오일용액을 제조하는 단계;
    b) 계면활성화제 및 면역활성화 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을, 상기 오일용액과 혼합하는 단계; 및
    c) 상기 b 단계에서 수득한 혼합 용액을 수용액에 분산하는 단계;
    를 포함하는 나노에멀젼의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 오일용액 제조단계에서 이미다조퀴놀린계열 톨-유사 수용체 7 또는 8 아고니스트와 오일 간에 친유성 상호작용을 도와주는 매개체 물질을 오일에 더 용해 시키는 것을 특징으로 하는 나노에멀젼의 제조방법.
PCT/KR2018/001891 2017-02-13 2018-02-13 이미다조퀴놀린계열 물질을 포함하는 나노에멀젼 및 이의 용도 WO2018147710A1 (ko)

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