WO2018131659A1 - 免疫療法剤 - Google Patents

免疫療法剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2018131659A1
WO2018131659A1 PCT/JP2018/000519 JP2018000519W WO2018131659A1 WO 2018131659 A1 WO2018131659 A1 WO 2018131659A1 JP 2018000519 W JP2018000519 W JP 2018000519W WO 2018131659 A1 WO2018131659 A1 WO 2018131659A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
group
compound
cells
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/000519
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博嘉 西川
重之 森
翔 礒山
Original Assignee
国立研究開発法人国立がん研究センター
全薬工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人国立がん研究センター, 全薬工業株式会社 filed Critical 国立研究開発法人国立がん研究センター
Priority to JP2018561418A priority Critical patent/JPWO2018131659A1/ja
Priority to CN201880006193.8A priority patent/CN110198717A/zh
Publication of WO2018131659A1 publication Critical patent/WO2018131659A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an immunotherapeutic agent.
  • the immune system is one of the systems for maintaining the homeostasis of life, and is a mechanism that distinguishes between self and non-self and attacks and eliminates non-self.
  • the immune reaction basically begins with “discrimination between self and nonself”, and proceeds in the order of “specific reaction to nonself” and “exclusion and memory of nonself”.
  • the lymphocytes constituting the immune system proliferate once the non-self is recognized and activated, and differentiate into a population toward the elimination of the non-self (effector mechanism) and a population that memorizes the non-self (memory response). Cells involved in the latter memory response will quickly reactivate and eliminate non-self upon encountering a stored non-self in the future.
  • exclusion of non-self can be said to be the primary principle of the immune system, but at the same time, if homeostatic responses to cells and antigens are not properly suppressed, life homeostasis is impaired.
  • the immune system has a mechanism called autoimmune tolerance that suppresses responses to self.
  • the immune system maintains homeostasis by an appropriate balance between the response as an accelerator and the autoimmune tolerance as a brake, and if the activity of the immune system against non-self decreases, the defense against microbial infection, etc.
  • the function of the autoimmune tolerance system declines, the autoimmune disease will develop.
  • Abnormal cells such as cancer cells and virus-infected cells are originally self cells, but at the same time they express cancer antigens and virus antigens that are abnormal antigens (non-self antigens) and are subject to exclusion by immunity. Become. However, it has been found that these cells simultaneously use the function of the autoimmune tolerance system to suppress the immune response that attacks the cells themselves.
  • an approach that enhances the immune response to non-self antigens or cancels the suppression of the immune response may be effective in treatment.
  • One example of such an approach is autoimmune tolerance.
  • a method via regulatory T cells regulatory T cells (Regulatory T cells) which are one of the cells involved in the above mechanism.
  • Autoimmune tolerance has a mechanism (negative selection) in which autoreactive T cells are excluded from T cells differentiated and matured in the thymus, but at this time, all autoreactive T cells are eliminated. Rather, some T cells escape apoptosis and survive in the peripheral immune system. Treg suppresses the activation and proliferation of cells that escape these negative selections.
  • Treg has been identified as a CD4-positive CD25-positive Foxp3-positive cell, and it has become clear that it suppresses various immune responses including tumor immunity.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 below show that Treg plays an important role in the treatment of asthma and autoimmune diseases, and also treats graft-versus-host disease (GVHD) to induce transplant tolerance. It has been reported that it can.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • Treg is considered to have a function of actively maintaining autoimmune tolerance by suppressing activation and proliferation of autoreactive T cells and tumor reactive T cells.
  • abnormal cells such as virus-infected cells and cancer cells are recognized and attacked by non-self antigen-specific cytotoxic T cells (CytotoxictoT Lymphocyte; CTL). It is suppressed by accumulating around the cell (an example of suppression of the immune response by the abnormal cell itself described above). Therefore, in virus-infected patients and cancer patients, by suppressing the function of Treg, the suppression of CTL attacking target cells (abnormal cells such as virus-infected cells and cancer cells) is released, and the immune response is increased. It is possible to enhance.
  • CTL non-self antigen-specific cytotoxic T cells
  • immunotherapy the method of indirectly treating the disease by assisting the immune function and enhancing the attack on the target cell, rather than directly attacking abnormal cells, is called immunotherapy.
  • Tregs Numerous Tregs are accumulated in human tumor tissue, and these Tregs were activated by naive regulatory T cells (Naive Treg) before being activated by antigen stimulation, or by antigen stimulation. It has been reported that various Tregs exist such as cells called later effector Treg (eTreg). These Tregs can be classified into three subtypes (fractions I, II, and III) according to the double staining pattern of CD45RA and Foxp3 (see Non-Patent Document 3 below). eTreg (CD45RA - Foxp3 high Treg) corresponds to Fraction II and has a particularly strong immunosuppressive action (this eTreg is because of this strong activity). In eTreg, immune checkpoint molecules such as CTLA-4 and PD-1 are highly expressed, and the antitumor immune response is suppressed through signal transduction by these molecules.
  • eTreg immune checkpoint molecules such as CTLA-4 and PD-1 are highly expressed, and the antitumor immune response is
  • Non-Patent Document 4 In recent studies, there is a report that eTreg highly expresses CCR4 (see Non-Patent Document 4 below). If anti-CCR4 antibody is used to selectively remove CCR4-positive eTreg, anti-tumor immune response is reported. It is theoretically thought that the suppression can be released and the tumor cells can be eliminated. In addition, at this time, CCR4-negative Tregs present in blood and lymphoid tissues are maintained, and it can be expected that autoimmune reactions can be prevented.
  • Treg can also be suppressed by inhibiting the action of PI3 kinase (Phosphoinositide 3-kinase; PI3K), a molecule responsible for signal transduction that controls cell proliferation and differentiation.
  • PI3 kinase Phosphoinositide 3-kinase
  • Non-patent document 5 discloses that an inhibitor of PI3K ⁇ , which is a kind of catalytic subunit constituting PI3K, is promising as a Treg inhibitor.
  • Non-Patent Document 5 the data shown in Non-Patent Document 5 are only experiments using mice, and the inhibitory effect of PI3K ⁇ inhibitor on human eTreg has not been clarified. No PI3K ⁇ inhibitor has been found. In fact, not all drugs that exhibit PI3K ⁇ inhibitory action are necessarily effective as Treg inhibitors.
  • the present invention is intended to provide an immunotherapeutic agent having an effect on various diseases.
  • the present invention relates to an immunotherapeutic agent comprising a heterocyclic compound represented by the following general formula (I) or a metabolite thereof as an active ingredient.
  • X represents a nitrogen atom or CH.
  • R 1 and R 2 may be either or either a hydrogen atom, hydroxyl group, halogen, amino group, C 1 -C 6 alkylamino group, C 1 -C 6 alkoxy group, C 1 -C 6 alkyl group, cyano group Represents a tert-butyldimethylsilyloxy group or a nitro group.
  • R 3 represents a hydrogen atom, a difluoromethyl group, an amino group, a C 1 -C 6 alkylamino group, a methyl group, or a hydroxymethyl group.
  • R 4 and R 5 each represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, or a C 1 -C 6 alkyl group.
  • R 6 is morpholino (optionally substituted with 1 to 2 C 1 -C 6 alkyl groups or hydroxyl groups), pyrrolidinyl (optionally substituted with hydroxy C 1 -C 6 alkyl groups), piperidino (1 Up to 2 oxygen atoms, hydroxyl group, formyl, or C 1 -C 6 alkyl group), piperazinyl (ring may be substituted with 1 to 2 oxygen atoms, 4-position Is substituted with a substituent selected from the group consisting of formyl, hydroxy C 1 -C 6 alkyl, C 1 -C 6 alkoxycarbonyl, oxo C 1 -C 6 alkyl, aromatic carbonyl, benzylcarbonyl, substituted carbamoyl and may be), 1,4 Jiazepano (ring may be substituted with 1 to 2 oxygen atoms, 4-position nitrogen, formyl, hydroxy C 1 C 6 alkyl, C 1 -C 6 alkoxycarbonyl, oxo
  • C 1 -C 6 means a group having 1 to 6 carbon atoms unless otherwise specified.
  • C 1 -C 6 alkyl includes linear or branched alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl and the like. Can be mentioned.
  • Hydrox C 1 -C 6 alkyl means a group in which a hydroxy group is bonded to any carbon atom of the group defined in the above “C 1 -C 6 alkyl”.
  • C 1 -C 6 alkoxy includes linear or branched alkoxy such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy, tert-butoxy, n-pentyloxy, n-hexyloxy, etc. Groups.
  • Oxo C 1 -C 6 alkyl means a group in which an oxo group is bonded to any carbon atom of the group defined above as “C 1 -C 6 alkyl”.
  • C 1 -C 6 alkylamino means a group in which any of the groups defined above as “C 1 -C 6 alkyl” is bonded to an amino group.
  • C 1 -C 6 alkoxycarbonyl means a group in which any of the groups defined above as “C 1 -C 6 alkoxy” is bonded to a carbonyl group.
  • Aromaatic carbonyl means a group in which any aromatic (eg, phenyl, thienyl, furyl, etc.) group is bonded to the carbonyl group.
  • Substituted carbamoyl means a carbamoyl group substituted with an alkyl (eg, C 1 -C 6 alkyl as described above) or an aromatic group, such as methylcarbamoyl, phenylcarbamoyl and the like.
  • Carboxy C 1 -C 6 alkyl means a group in which a carboxy group is bonded to any carbon atom of the group defined in the above “C 1 -C 6 alkyl”.
  • Suitable acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, hydrobromides, nitrates, phosphates, etc., and organic acid salts such as acetates, oxalates, propionates and glycolic acids.
  • Salt lactate, pyruvate, malonate, succinate, maleate, fumarate, malate, tartrate, citrate, benzoate, cinnamate, methanesulfonate, benzene Sulfonates, p-toluenesulfonates, salicylates and the like are used.
  • the heterocyclic compound of the present invention can be produced by the same method as the compounds described in Patent Documents 1 to 3.
  • the present invention also provides a compound represented by the above formula (I) or a metabolite thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more immunomodulating agents, immune cell therapeutic agents or vaccine therapeutic agents at the same time. Or an immunotherapeutic agent combined to be administered separately or over time.
  • immunotherapy refers to a therapy that assists immune function and indirectly treats by enhancing attack on target cells, more specifically, cancels suppression of CTL function, It refers to therapies that enhance immune functions by enhancing CTLs and treat diseases such as infections or cancer caused by various viruses.
  • immunotherapy agent is a drug that enhances the function of CTL, suppression of CTL function (suppression by abnormal cells such as virus-infected cells and cancer cells that are the target of CTL, suppression by Treg, etc.) refers to a drug that releases, and a drug that has both effects.
  • Immunomodulators are co-suppressive molecules (PD-1, PD-L1, LAG-3, etc., molecules that induce immune responses in a suppressive direction) and costimulatory molecules (OX40, etc., activate immune responses) It refers to drugs that affect immune function by inhibiting or stimulating molecules that induce direction.
  • Immunocytotherapeutic agent refers to lymphocytes and dendritic cells that have been collected from a patient in immune cell therapy and proliferated and activated for transfer to the patient.
  • Vaccine therapy agents are drugs that use antigens such as cancer and viruses as vaccines, and these antigens are administered to patients with cancer and virus infections through processing and antigen presentation by the immune system. , Refers to an agent that promotes antigen-specific activity and proliferation of T cells.
  • Ereg refers to three subtypes of Foxp3 positive cell populations, which are classified based on the double staining pattern of CD45RA and Foxp3 (fraction I: CD45RA + Foxp3 low , fraction II: CD45RA - Foxp3 high , fraction III: CD45RA - Foxp3 low ), Treg corresponding to fraction II.
  • + indicates positive and ⁇ indicates negative. High and low both indicate positive, but high indicates a state in which the protein is expressed more strongly than low.
  • Suitable immunomodulators include anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-LAG-3 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-OX-40 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-4 -1BB antibody, anti-KIR antibody, anti-GITR antibody, anti-CD27 antibody, anti-TIM3 antibody, anti-ICOS antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-B7-H4 antibody, anti-VISTA antibody, anti-BTLA antibody, anti-HVEM antibody, anti-CD28 Examples include antibodies and anti-CD30 antibodies, but the present invention is not limited to these, and various immunomodulators can be used depending on the target disease. [Manufacturing process]
  • the heterocyclic compound represented by the general formula (I) is a benzimidazole compound (compound V) starting from cyanuric chloride or 2,4,6-trichloropyrimidine (compound II) as shown in the following reaction formula: , A morpholine compound (compound VI) and R 6 H (compound VII) can be produced in this order.
  • reaction formula (Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , X are the same as defined above)
  • Examples of the hydrogen chloride scavenger used in this reaction include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, triethylamine or pyridine, and examples of the solvent include acetone, toluene, hexane, xylene, dioxane, tetrahydrofuran or Examples include dichloroethane, N, N-dimethylformamide (DMF), and the like.
  • Examples of the hydrogen chloride scavenger used in this reaction include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, triethylamine or pyridine
  • examples of the solvent include acetone, toluene, hexane, xylene, dioxane, tetrahydrofuran or Examples include dichloroethane, N, N-dimethylformamide (DMF), and the like.
  • Compound V can also be used as a hydrogen chloride scavenger.
  • intermediate IV obtained in the production step (i) is reacted with a morpholine compound (compound VI) to obtain intermediate IV.
  • a hydrogen chloride scavenger used in this reaction include the same hydrogen chloride scavenger as in the production step (i), and examples of the solvent include DMF, acetone, toluene, xylene, dichloroethane, dichloromethane and the like.
  • Compound VI can also be used as a hydrogen chloride scavenger.
  • Compound (I) of the present invention is obtained by reacting R 6 H (Compound VII) with Intermediate IV obtained in the production step (ii) in the presence of a hydrogen chloride scavenger in a solvent.
  • Examples of the hydrogen chloride scavenger used in this reaction include the same hydrogen chloride scavenger as in the production step (i), and examples of the solvent include DMF, dimethyl sulfoxide (DMSO), xylene, dichloroethane, and the like.
  • Compound (I) can be obtained by carrying out production steps (ii) and (iii) in one step. In that case, 2-10 mol of compound VI or VII is used with 1-10 mol of compound III and reacted at -10 ° C-5 ° C for 0.1-5 hours and further at room temperature-120 ° C for 3-50 hours. The reaction conditions in the production step (ii) are followed.
  • R 1 , R 2 , and R 3 when any of R 1 , R 2 , and R 3 is tert-butyldimethylsilyloxy, it can be further deprotected with an acid and converted to a hydroxyl group according to a conventional method. Further, when either R 1 or R 2 is a nitro group, it can be converted to an amino group by reduction.
  • the product obtained in each of the above steps can be separated and purified by an ordinary method such as extraction, concentration, neutralization, filtration, recrystallization, column chromatography and the like, if necessary.
  • the acid addition salt of the compound of general formula (I) as the active ingredient of the present invention can be produced by various methods well known in the art.
  • Suitable acids to be used include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, nitric acid and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid, oxalic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid and succinic acid.
  • Examples include acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid and the like.
  • the immunotherapeutic agent of the present invention can be used for a wide range of diseases that can be the target of immunotherapy such as cancer and infections caused by various viruses.
  • cancer examples include lung cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, colon cancer, cecal cancer, colon cancer, rectal cancer, anal cancer, head and neck cancer, brain tumor, glue, and the like.
  • Leukemia Leukemia, adult T-cell leukemia, etc.
  • malignant lymphoma Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, etc.
  • small lymphocytic lymphoma myelodysplastic syndrome, myeloproliferative tumors, blood tumors such as multiple myeloma, etc.
  • blood tumors such as multiple myeloma, etc.
  • Infectious diseases that can be targeted by the immunotherapeutic agent of the present invention include, for example, influenza, cytomegalovirus infection, Epstein-Barr virus infection, HIV infection, rickettsia infection, chlamydia infection, phytoplasma infection, coccella Examples include, but are not limited to, infectious diseases, toxoplasma infections, leishmania infections, and the like.
  • the immunotherapeutic agent of the present invention can be used for a wide range of antigens that can be the target of immunotherapy.
  • Representative examples include antigens derived from pathogenic organisms and tumor cells.
  • pathogenic organisms include cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, hepatitis virus, varicella-zoster virus, poliovirus, human papillomavirus.
  • Measles virus Measles virus, mumps virus, rubella virus, influenza virus, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae b type, HIV, herpes simplex virus type 2, diphtheria, tetanus, H.pylori, Streptococcus pneumoniae, hepatitis B virus, Examples include hepatitis C virus and meningococcus. However, it is not limited to these
  • the effect of the immunotherapeutic agent containing the heterocyclic compound represented by the general formula (I) as an active ingredient will be described.
  • influenza, cytomegalovirus infection, Epstein Barr virus infection, and cancer are mainly handled as an example of the subject of the present invention, but the treatment subject of the present invention is limited to this. Rather, it can be used for various diseases that can be the subject of immunotherapy.
  • the description of the concentration when a reagent or the like is added indicates the final concentration. [Test 1]
  • PI3-Kinase human HTRF Assay Kit purchased from Millipore was used to determine the inhibitory activity of Compound 1 on each PI3K isoform.
  • Detection solution (included in PI3-Kinase human HTRF Assay Kit) was added to each well by 5 [ ⁇ L], and after about 18 hours, fluorescence of each well was measured (excitation wavelength: 330 [nm], measurement wavelength: 620). [Nm] and 665 [nm]). The value obtained by dividing the measurement value obtained at the measurement wavelength 665 [nm] by the measurement value obtained at the measurement wavelength 620 [nm] was defined as the HTRF ratio. The enzyme activity rate was calculated assuming that the HTRF ratio in the absence of the compound was 100% activity and the HTRF ratio in the absence of each PI3K isoform was 0% activity, and the 50% enzyme inhibitory concentration (IC50 value) was determined.
  • IC50 value 50% enzyme inhibitory concentration
  • the IC50 value of human PI3K subunit PI3K ⁇ of compound 1 is 6.71 [nM], and compound 1 has high inhibitory activity against human PI3K subunit PI3K ⁇ . confirmed. [Test 2]
  • CD4-positive CD25-positive cells CD4-positive CD25-negative cells
  • CD8-positive T cells among T cell subsets selected from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CD25 is generally known as a marker for Treg.
  • CD4 positive CD25 positive cells are treated as Treg.
  • Compound 1 was added to the sorted cells together with CD3 / CD28 stimulating beads and IL-2 and cultured, and then the proportion of proliferating cells in each T cell subset was measured using flow cytometry. Moreover, regarding the experimental group in which CD4 positive CD25 positive cells were cultured, the ratio of eTreg to CD4 positive Foxp3 positive Treg was measured (see FIGS. 1A and 1B). As described above, eTreg has a strong inhibitory activity against the immune response, and the number and ratio of eTreg can be used as an index when evaluating the function of the immune system.
  • Anti-Fc ⁇ R antibody (purchased from eBioscience) was added to a suspension of human PBMC (purchased from Cellular Technology Limited) at a 5-fold dilution, reacted at 4 ° C. for 10 minutes, and then further CD3, CD4, CD8, Each antibody against CD45RA and CD25 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes. Washing and suspending with PBS (containing 2 mM EDTA, 0.5% (W / V) BSA), using a cell sorter (BD FACSAria TM Fusion, manufactured by BD Bioscience), CD4 positive CD25 positive cells in T cell subset, CD4 positive CD25 negative cells and CD8 positive T cells were selected.
  • PBS containing 2 mM EDTA, 0.5% (W / V) BSA
  • BD FACSAria TM Fusion manufactured by BD Bioscience
  • CFSE CellTrace TM CFSE Cell Proliferation Kit, purchased from Lifetechnologies
  • RPMI1640 medium purchased from the Cell Science Laboratory, 10% human AB serum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamine
  • a 96-well plate was seeded with 5 ⁇ 10 4 cells per well.
  • IL-2 in a final concentration of 10 [IU / mL] and 2 [ ⁇ L / well] CD3 / CD28 antibody-coated magnetic beads (Dynabeads® Human T-Activator CD3 / CD28, Lifetechnologies) Purchased 1), Compound 1 (final concentration 1 or 4 [ ⁇ M]) is added, the amount of liquid per well is 0.2 [mL], carbon dioxide 5% (concentration in the atmosphere), temperature 37 ° C. For 4 days.
  • the cultured cells were detached from each well by pipetting, and the plate was centrifuged and suspended in 2% FBS-containing PBS.
  • Anti-Fc ⁇ R antibody (purchased from eBioscience) was added at a 5-fold dilution, allowed to react at 4 ° C for 10 minutes, and then each antibody against CD3, CD4, CD8, CD45RA was added at a 50-fold dilution, and 4 ° C. For 15 minutes.
  • the cells were washed with 2% FBS-containing PBS, then suspended in a cell fixative (purchased from eBioscience) and reacted at 4 ° C. for 60 minutes.
  • the cells were washed with a washing solution for fixed cells (purchased from eBioscience), an antibody against Foxp3 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed and suspended in 2% FBS-containing PBS and measured with a flow cytometer.
  • Compound 1 strongly suppressed the growth of CD4-positive CD25-positive cells.
  • a stronger suppression of proliferation was seen compared to the group to which 1 [ ⁇ M] was added.
  • no suppression of proliferation was observed for CD4 positive CD25 negative cells and CD8 positive T cells.
  • Compound 1 was confirmed to selectively suppress the proliferation of Treg among T cell subsets.
  • Anti-Fc ⁇ R antibody (purchased from eBioscience) was added to a suspension of human PBMC (purchased from Cellular Technology Limited) at a 5-fold dilution, reacted at 4 ° C. for 10 minutes, and then further CD3, CD4, CD8, Each antibody against CD45RA and CD25 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed and suspended in PBS (containing 2 mM EDTA, 0.5% (W / V) BSA), and CD4-positive CD25-positive T cells were selected using a cell sorter (BD FACSAria TM Fusion, manufactured by BD Bioscience).
  • RPMI1640 medium purchased from Cell Science Laboratories, containing 10% human AB serum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamine
  • RPMI1640 medium purchased from Cell Science Laboratories, containing 10% human AB serum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamine
  • Each well has a final concentration of 10 [IU / mL] of IL-2, 2 [ ⁇ L / well] CD3 / CD28 antibody-coated magnetic beads (Dynabeads® Human T-Activator CD3 / CD28, from Lifetechnologies) Purchase), each test substance in a final concentration of 4 [ ⁇ M] was added, the liquid volume per well was 0.2 [mL], carbon dioxide 5% (concentration in the atmosphere), temperature 37 ° C. For 4 days.
  • the cultured cells were detached from each well by pipetting, and the plate was centrifuged and suspended in 2% FBS-containing PBS.
  • Anti-Fc ⁇ R antibody (purchased from eBioscience) was added at a 5-fold dilution, allowed to react at 4 ° C for 10 minutes, and then each antibody against CD3, CD4, CD8, CD45RA was added at a 50-fold dilution, and 4 ° C. For 15 minutes.
  • the cells were washed with 2% FBS-containing PBS, then suspended in a cell fixative (purchased from eBioscience) and reacted at 4 ° C. for 60 minutes.
  • the cells were washed with a washing solution for fixed cells (purchased from eBioscience), an antibody against Foxp3 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed and suspended in 2% FBS-containing PBS and measured with a flow cytometer.
  • Non-Patent Document 6 among the PI3K ⁇ inhibitors to be compared with Compound 1 in Test 2, IC50 of PI3K ⁇ of CAL101 is 2.5 [nM], whereas the above test According to 1, the IC50 for PI3K ⁇ of compound 1 is 6.71 [nM]. That is, although the activity as a PI3K ⁇ inhibitor was lower in Compound 1 than in CAL101, Compound 1 showed a significantly stronger eTreg inhibitory effect than CAL101. The strength of the eTreg inhibitory effect indicates that it does not necessarily depend on the strength of the PI3K ⁇ inhibitory activity, which can be said to be an unexpected result in view of the findings disclosed in Non-Patent Document 5 above. [Test 4]
  • Test 4 after adding CD2 / CD28-stimulated beads and IL-2 together with compounds 2 to 7 to CD4 + CD25 + cells in a T cell subset selected from human PBMC, the cells were cultured, and then flow cytometry was used. The ratio of eTreg to Treg was measured (see FIGS. 3A and 3B).
  • Human PBMC prepared from healthy human blood collected at National Cancer Center or purchased from Cellular Technology Limited
  • RPMI1640 medium purchased from Cell Science Laboratory, 10% human AB serum, 25 mM HEPES, 4 mM L -Containing glutamine
  • antigenic peptides As antigenic peptides, it is known that there are T cell clones that are expressed on the cell surface of cancer cells or virus-infected cells and that react with the antigens at a certain frequency in PBMCs of healthy individuals. The following antigens were selected on the condition that Each antigenic peptide was obtained from Eurofin Genomics Inc. In addition, for each antigen peptide obtained, the reactivity of 3 or more lots of human PBMC was tested in advance, and the most reactive lot was used for this test.
  • ⁇ Modified Melan-A Cancer antigen expressed by malignant melanoma cells (genetically modified)
  • CMV Virus antigen expressed by cytomegalovirus (CMV) -infected cells
  • EBNA Virus antigen expressed by Epstein-Barr virus (EBV) -infected cells
  • Flu Virus antigen expressed by influenza-infected cells
  • the cells in each well after culturing were removed by pipetting, and the plate was centrifuged and suspended in 2% FBS-containing PBS.
  • An anti-Fc ⁇ R antibody (purchased from eBioscience) was added at a 100-fold dilution and reacted at 4 ° C. for 15 minutes, and then the cell suspension was divided into two equal parts for eTreg measurement and CTL measurement.
  • each antibody against CD3, CD4, CD8, and CD45RA was added to the cell suspension at a 50-fold dilution, and allowed to react at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed with PBS containing 2% FBS, suspended in a cell fixing solution (purchased from eBioscience), reacted at 4 ° C. for 60 minutes, and then washed with a washing solution for fixed cells (purchased from eBioscience).
  • An antibody against Foxp3 was added at a 50-fold dilution and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed and suspended in 2% FBS-containing PBS and measured with a flow cytometer.
  • MHC-Tetramer for antigen peptide-specific TCR detection (purchased from TC-Metrix) was added to the cell suspension at a 50-fold dilution and allowed to react at 37 ° C. for 15 minutes. Subsequently, each antibody against CD3, CD4, and CD8 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed with PBS containing 2% FBS, suspended in a cell fixing solution (purchased from BD), reacted at room temperature for 20 minutes, and then washed with a washing solution for fixed cells (purchased from BD). The sample was suspended in PBS containing% FBS and measured with a flow cytometer.
  • the ratio of the number of eTreg and CTL measured by the above procedure is shown in FIG. Although the reactivity and optimum concentration differ depending on the antigen peptide and PBMC donor used, the CTL / eTreg ratio tends to increase depending on the treatment concentration with Compound 1, regardless of the type of antigen peptide. In both cases, the final concentration increased more than 2-fold compared to the control group. From the above, it was shown that the compound 1 may enhance the antigen-specific immune response against infectious diseases and cancer. [Test 6]
  • Test 6 is a test for verifying the increase in CTL by Compound 1.
  • CD3 negative cells and CD8 positive T cells are selected from human PBMC, and after culturing by adding Compound 1 together with IL-2, IL-7 and antigen peptide to a co-culture system of these cells. The number of antigen-specific CTLs was counted using flow cytometry (see FIG. 5).
  • Compound 1 If the enhancement of antigen-specific CTL is confirmed by administration of Compound 1 in a co-culture system of only antigen-presenting cells CD3 negative cells and CD8 positive T cells (ie, in the absence of Treg), Compound 1 Can be presumed to not only suppress Treg but also directly enhance the stages of antigen presentation and CTL activation.
  • Anti-Fc ⁇ R antibody (purchased from eBioscience) was added at a 5-fold dilution to a suspension of human PBMC (prepared from healthy human blood obtained at the National Cancer Center) and allowed to react at 4 ° C. for 10 minutes. Thereafter, cocktails of antibodies against CD3, CD4, and CD8 were added at 50-fold dilutions, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes. It was washed and suspended in PBS (containing 2 mM EDTA, 0.5% (W / V) BSA), and CD3 negative cells and CD8 positive T cells were selected using a cell sorter (BD FACSAria TM Fusion, manufactured by BD Bioscience). .
  • Both cells are suspended in RPM11640 medium (purchased from Cell Science Laboratories, containing 10% human AB serum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamine), and 1 well of CD3 negative cells is added to the same well of a 96-well plate. 1 ⁇ 10 6 cells per well and 2 ⁇ 10 5 CD8 positive T cells were seeded per well.
  • Compound 1 (final concentration of 0.03 to 2 ⁇ M), IL-2 (final concentration of 10 [U / mL]), IL-7 (final concentration of 20 [ng / mL]) and antigen peptide diluted stepwise in each well (Final concentration 10 [ ⁇ M]) was added, and the liquid volume per well was 0.2 [mL], and the cells were cultured for 8 days under conditions of 5% carbon dioxide (concentration in the atmosphere) and a temperature of 37 ° C. During the culture period, 100 ⁇ L of the culture supernatant is removed every 2-3 days, and 100 ⁇ L of a new RPMI1640 medium (same as above) containing Compound 1, IL-2 and IL-7 at the same final concentrations as above is removed. ] Was added.
  • the cells were washed with PBS containing 2% FBS, suspended in a cell fixing solution (purchased from BD), reacted at room temperature for 20 minutes, and then washed with a washing solution for fixed cells (purchased from BD).
  • the sample was suspended in PBS containing% FBS and measured with a flow cytometer.
  • the number of EBNA-specific CTLs measured by the above procedure is shown in FIG.
  • the number of EBNA-specific CTLs increased depending on the treatment concentration of Compound 1, and the EBNA-specific CTLs were compared with the control group in the group treated with 2 [ ⁇ M] Compound 1, which is the highest concentration in this study. Increased more than three times. That is, Compound 1 shows that not only the immune response is enhanced through Treg suppression but also an antigen-specific immune response is enhanced by another mechanism not via Treg. [Test 7]
  • PBMCs were prepared from the peripheral blood of gastric cancer patients acquired at the National Cancer Center, and CD8 positive T cells were isolated using magnetic beads (purchased from Miltenyi) bound with anti-CD8 antibodies. From the negative fraction (CD8 - PBMC), anti-CD4 antibody-bound magnetic beads (purchased from Miltenyi) were used to remove CD4-positive T cells, and the remaining cells (CD8 - CD4 - PBMC) were antigen-presenting cells. (APC). APC was suspended in X-VIVO medium (purchased from LONZA), and seeded at 2 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 in a 2 mL tube.
  • X-VIVO medium purchased from LONZA
  • Various antigen peptides (MAGE-A3, MAGE-A4, NYESO-1, WT-1) were added at a final concentration of 10 [ ⁇ M] so that the liquid volume per tube was 0.25 [mL]
  • the cells were cultured for 1 day under conditions of 5% carbon (concentration in the atmosphere) and a temperature of 37 ° C., and the antigenic peptide was pulsed into APC.
  • isolated CD8-positive T cells are suspended in RPMI1640 medium (purchased from Cell Science Laboratories, containing 10% human AB serum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamine), and 1 per well in a 96-well plate.
  • the seeds were inoculated to ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 5 cells and cultured for 1 day under conditions of 5% carbon dioxide (concentration in the atmosphere) and a temperature of 37 ° C.
  • the APC pulsed with the antigen peptide was inactivated by irradiation with 35 Gy radiation, and seeded at 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 per well in a 96-well plate seeded with CD8 positive T cells. Mixed with positive T cells. Stepwise diluted Compound 1 (final concentration 0.25 to 1 ⁇ M), IL-2 (final concentration 10 [U / mL]) and IL-7 (final concentration 20 [ng / mL]) are added.
  • the liquid volume per well was 0.2 [mL], and the cells were cultured for 8 days under conditions of 5% carbon dioxide (concentration in the atmosphere) and a temperature of 37 ° C. During the culture period, 100 [ ⁇ L] of the culture supernatant was removed every 2-3 days, and 100 ⁇ L of fresh RPMI1640 medium containing Compound 1, IL-2, and IL-7 at the same final concentration was added.
  • the cell group treated with each antigen peptide was measured with a flow cytometer according to the same procedure as in Test 6 above.
  • the cultured cells were suspended in 2% FBS-containing PBS, reacted with anti-Fc ⁇ R antibody, and then reacted with MHC-Tetramer for TCR detection specific to each antigen peptide.
  • each antibody against CD3, CD4, and CD8 was added and reacted, fixed with a cell fixative, suspended in PBS containing 2% FBS, and subjected to flow cytometry.
  • the ratio of cancer antigen-specific CTL in CD8-positive T cells measured by the above procedure is shown in FIGS. 6A to 6D.
  • the ratio of the antigen-specific CTL increased depending on the treatment concentration of Compound 1, so that Compound 1 was not only in healthy human blood but also in peripheral blood of cancer patients. It was also suggested to enhance the cancer antigen-specific immune response. [Test 8]
  • Compound 1 was administered to tumor-bearing mice, and each of peripheral lymph nodes (PLN), spleen (Spleen), and tumor infiltrating lymphocytes (TIL) was subjected to CD8 positive T cells and Treg using flow cytometry. The ratio was measured (see FIGS. 7A to 7E).
  • PPN peripheral lymph nodes
  • Spleen spleen
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • a 7-week-old BALB / c female mouse (purchased from CLEA Japan) was shaved and the mouse fibrosarcoma cell line CMS5a was subcutaneously transplanted. When the tumor diameter reached 4 to 6 mm, grouping was performed and administration of Compound 1 suspended in 2.5% hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) was started. As a control, 7-week-old BALB / c mice transplanted subcutaneously with only the medium were used (indicated as cont in FIGS. 7A to 7E).
  • Compound 1 was administered daily by oral administration.
  • the dose per administration was 0, 10, 30, 100 [mg / kg], and only the solvent was administered to the group not administered with Compound 1 (dosage 0 [mg / kg]).
  • the administration was once a day, and the administration period was 8 days, 15 days, and 22 days.
  • Each tissue was collected before the first administration (Day 0) and the next day after the final administration in each administration period (Day 8, Day 15, Day 22), and the peripheral lymph nodes and spleen were in ice-cold PBS containing 2% FBS.
  • the cancer tissue was homogenized with ice-cold PBS (containing 2 mM EDTA and 0.5% (W / V) BSA), and the cell suspension was filtered and the cells were washed to prepare a cell suspension. did.
  • a 96-well plate was seeded with about 1 ⁇ 10 6 cells per well.
  • Anti-CD16 / 32 antibody (purchased from BD) was added at a 100-fold dilution, reacted at 4 ° C for 15 minutes, and then each antibody against CD3, CD4, and CD8 was added at a 50-fold dilution, and at 4 ° C. The reaction was allowed for 15 minutes.
  • the cells were washed with 2% FBS-containing PBS, then suspended in a cell fixative (purchased from eBioscience) and reacted at 4 ° C. for 60 minutes. The cells were washed with a washing solution for fixed cells (purchased from eBioscience), an antibody against Foxp3 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed, suspended in PBS containing 2% FBS, and measured with a cell count bead (purchased from eBioscience) on a flow cytometer. The number of CD8 positive T cells and Treg cells was measured for each tissue, and the CD8 positive T cell / Treg ratio was calculated.
  • the CD8 positive T cell / Treg ratio in peripheral lymph nodes and spleen of cancer-bearing mice was not different from the control group on Day 0, but as shown in FIGS. 7B to 7D, After Day 8, the CD8 positive T cell / Treg ratio decreased with the proliferation of tumor cells (see PLN (cont), Spleen (cont) and PLN (tumor + vehicle), Spleen (tumor + vehicle)).
  • FIGS. 7B to 7D the CD8 positive T cell / Treg ratio in peripheral lymph nodes and spleen tended to increase in a dose-dependent manner with Compound 1 (PLN).
  • a 7-week-old BALB / c female mouse (purchased from CLEA Japan) was shaved and the mouse fibrosarcoma cell line CMS5a introduced with the human cancer antigen NY-ESO-1 gene was subcutaneously transplanted.
  • grouping was performed, and 500 ⁇ g of anti-CD8 antibody or anti-CD4 antibody was intraperitoneally administered to some mice, and the next day (Day 0)
  • administration of Compound 1 suspended in 2.5% hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) was started.
  • the dose of Compound 1 per administration was 100 [mg / kg], and it was orally administered every day until the end of the experiment (Day 17), and 250 ⁇ g of anti-CD8 antibody or anti-CD4 antibody was intraperitoneally administered again on Day 6.
  • FIG. 8A and 8B show the average tumor volume of each group on Day 17.
  • the tumor volumes in the antibody non-administered group (vehicle) and the anti-CD4 antibody administered group (CD4 depletion) average about 3000 [mm 3 ].
  • the tumor volume in the anti-CD8 antibody administration group (CD8 depletion) reached an average of about 6000 [mm 3 ]. It can be seen that the presence of CD8 positive T cells is greatly involved in tumor growth.
  • Compound 1 shows that the immune response is enhanced through enhancement of the functions of CD8-positive T cells and CD4-positive T cells and exhibits an antitumor effect, and Compound 1 can be used as a new immunotherapeutic agent. It is expected. [Test 10]
  • an anti-PD-1 antibody was used as an immunomodulator.
  • Compound 1 and anti-PD-1 antibody were administered in combination to tumor-bearing mice, cancer tissues were collected from 5 mice in each group, the number of CD8-positive T cells and Treg was measured by flow cytometry, and CD8 The positive T cell / Treg ratio was calculated (see FIG. 9A).
  • CTL NY-ESO-1 antigen-specific CD8-positive T cells
  • a 7-week-old BALB / c female mouse (purchased from Claire Japan) was shaved and the mouse fibrosarcoma cell line CMS5a introduced with the human cancer antigen NY-ESO-1 gene was subcutaneously transplanted.
  • grouping is performed, and compound 1 or anti-PD-1 antibody (In VivoMab anti-mouse PD-1 (CD279) suspended in 2.5% hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) Clone: RMP1-14, purchased from Bio X Cell), or both.
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • the timing of administration of each agent in each group of cancer-bearing mice is as follows. -Administer vehicle only once a day for 10 days. -Compound 1 was administered 100 [mg / kg] once a day for 10 days (compound (1)). ⁇ Anti-PD-1 antibody was administered at 250 [ ⁇ g / head] on days 1, 4 and 8 (anti-PD-1 Ab). Compound 1 was administered 100 [mg / kg] once a day for 10 days, and anti-PD-1 antibody was administered 250 [ ⁇ g / head] on days 1, 4 and 8 (anti- PD-1 Ab + compound (1)).
  • each antibody against CD3, CD4, and CD8 was added to the cell suspension at a 50-fold dilution, and allowed to react at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed with PBS containing 2% FBS, suspended in a cell fixing solution (purchased from eBioscience), reacted at 4 ° C. for 60 minutes, and then washed with a washing solution for fixed cells (purchased from eBioscience).
  • An antibody against Foxp3 was added at a 50-fold dilution and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed and suspended in 2% FBS-containing PBS and measured with a flow cytometer.
  • MHC-Tetramer for NY-ESO-1-specific TCR detection (purchased from TC-Metrix) was added to the cell suspension (diluted 50 times) and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. . Subsequently, each antibody against CD3, CD4, and CD8 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed with PBS containing 2% FBS, suspended in a cell fixing solution (purchased from BD), reacted at room temperature for 20 minutes, and then washed with a washing solution for fixed cells (purchased from BD). The suspension was suspended in PBS containing% FBS, and measurement was performed with a cell count bead (purchased from eBioscience) using a flow cytometer.
  • the administration of Compound 1 alone increased the CD8 positive T cell / Treg ratio
  • the combined use of Compound 1 and anti-PD-1 antibody further increased the CD8 positive T cell / Treg ratio.
  • Compound 1 and anti-LAG-3 antibody are administered to tumor-bearing mice, the number of CD8-positive T cells and Tregs in the spleen and cancer tissue is measured by flow cytometry, and the ratio of CD8-positive T cells / Treg is calculated. (See FIGS. 10A and 10B).
  • the lumbar region of a 7-week-old C57BL / 6 female mouse (purchased from Claire Japan) was shaved, and the mouse melanoma cell line B16-F0 was subcutaneously transplanted.
  • grouping was performed, and Compound 1 or anti-LAG-3 antibody (In VivoMab anti-mouse LAG-3, clone: suspended in 2.5% hydroxypropylmethylcellulose (HPMC): C9B7W, purchased from Bio X Cell), or both.
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • Compound 1 was administered daily by oral administration
  • anti-LAG-3 antibody was administered intraperitoneally twice in total.
  • the timing of administration of each agent in each group of cancer-bearing mice is as follows. -Solvent only (vehicle) once a day for 7 days. -Compound 1 was administered at a dose of 60 mg / kg once a day for 7 days (compound (1)). ⁇ Anti-LAG-3 antibody was administered at 250 [ ⁇ g / head] on day 1 and day 5 (anti-LAG-3 Ab). Compound 1 was administered once a day for 60 days at 60 [mg / kg], and anti-LAG-3 antibody was administered at 250 [ ⁇ g / head] on the first and fifth days (anti-LAG-3 Ab + Compound (1)).
  • the spleen and cancer tissue were collected, ice-cooled PBS containing 2% FBS, or ice-cooled PBS (containing 2 mM EDTA, 0.5% (W / V) BSA)
  • the cells were homogenized and filtered through tissue pieces and washed cells to prepare a cell suspension.
  • a 96-well plate was seeded with about 1 ⁇ 10 6 cells per well.
  • Anti-CD16 / 32 antibody purchased from BD was added at a 100-fold dilution and allowed to react at 4 ° C. for 15 minutes.
  • each antibody against CD3, CD4, and CD8 was added at a 50-fold dilution, and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed with 2% FBS-containing PBS, then suspended in a cell fixative (purchased from eBioscience) and reacted at 4 ° C. for 60 minutes.
  • the cells were washed with a washing solution for fixed cells (purchased from eBioscience), an antibody against Foxp3 was added (diluted 50 times), and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed, suspended in PBS containing 2% FBS, and measured with a cell count bead (purchased from eBioscience) on a flow cytometer.
  • the CD8 positive T cell / Treg ratio increased by administration of Compound 1 alone. Furthermore, when an anti-LAG-3 antibody was used in combination with administration of Compound 1, the CD8 positive T cell / Treg ratio further increased.
  • the CD8 positive T cell / Treg ratio in the group in which anti-LAG-3 antibody is used in combination with compound 1 is larger than that in the case where compound 1 is administered alone. Rose. [Test 12]
  • mice Three mice were transplanted with each mouse melanoma cell line as a tumor-bearing mouse, each compound-bearing mouse was administered Compound 1 and an anti-GITR antibody, and CD8-positive T cells and Treg in the spleen and cancer tissue were administered. Were counted by flow cytometry, and the ratio of CD8 positive T cells / Treg was calculated (see FIGS. 11A and 11B).
  • the lumbar region of a 7-week-old C57BL / 6 female mouse (purchased from Claire Japan) was shaved, and the mouse melanoma cell line B16-F0 was subcutaneously transplanted.
  • the grouping was performed, and the compound 1 or anti-GITR antibody (In VivoMab anti-mouse GITR, clone: DTA-1, suspended in 2.5% hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), (Purchased from BioX Cell), or both.
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • Compound 1 was administered daily by oral administration, and anti-GITR antibody was administered intraperitoneally three times in total.
  • the timing of administration of each agent in each group of cancer-bearing mice is as follows. -Solvent only (vehicle) once a day for 7 days. Compound 50 was administered at a dose of 50 mg / kg once a day for 7 days (Compound (1)). -Anti-GITR antibody was administered at 10 [mg / kg] on days 1, 4 and 7 (anti-GITR Ab). Compound 1 was administered 50 mg / kg once a day for 7 days and anti-GITR antibody was administered 10 mg / kg on days 1, 4 and 7 (anti-GITR Ab + Compound (1)).
  • spleen and cancer tissue were collected, ice-cooled PBS containing 2% FBS, or ice-cooled PBS (containing 2 mM EDTA, 0.5% (W / V) BSA)
  • the cells were homogenized and filtered through tissue pieces and washed cells to prepare a cell suspension.
  • a 96-well plate was seeded with about 1 ⁇ 10 6 cells per well.
  • Anti-CD16 / 32 antibody purchased from BD was added at a 100-fold dilution and allowed to react at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the CD8 positive T cell / Treg ratio increased by administration of Compound 1 alone, but when anti-GITR antibody was used in combination with Compound 1, the CD8 positive T cell / Treg ratio was further increased. Rose. Also in the cancer tissue, as shown in FIG. 11B, in the group in which the anti-GITR antibody was used in combination with Compound 1, the CD8 positive T cell / Treg ratio was further increased as compared with the case where Compound 1 was administered alone.
  • the present inventors have found that the effect of administration of Compound 1 is maintained for a long time via immune memory.
  • the function of cancer immune response activated by single administration of Compound 1 and combined administration of Compound 1 and an immunomodulator is maintained in vivo by immune memory. confirmed.
  • Anti-PD-1 antibody was used as an immunomodulator.
  • the tumor was re-implanted in a mouse in which the tumor disappeared by administration of Compound 1 alone, administration of anti-PD-1 antibody alone or combination administration of Compound 1 and anti-PD-1 antibody, and the tumor grew. I investigated whether it was done or rejected. If the re-implanted tumor is rejected, it can be considered that the immune function against the tumor is maintained by immune memory in the mouse.
  • CMS5a-NYESO1 cells As shown by the alternate long and short dash line in FIGS. 12A to 12C, the disappearance of the tumor (CMS5a-NYESO1 cells) was confirmed in some of the mice in each group transplanted with the tumor in Test 10 as a result of drug administration. It was. The number of individuals in which the tumor disappeared was 1 in the single agent administration group of Compound 1, 3 in the single agent administration group of anti-PD-1 antibody, and 5 in the combination treatment group of both agents. On day 69 after the start of administration, in each group of mice in which tumor disappearance was observed, CMS5a cells (CMS5a-NYESO1) into which NY-ESO-1 gene was introduced to enhance antigenicity were placed on the right hip.
  • CMS5a cells (CMS5a) not transfected with the -1 gene were implanted subcutaneously on the left hip.
  • the number of transplants was 2 ⁇ 10 7 cells per CMS5a-NYESO1 cell and 2 ⁇ 10 6 cells per CMS5a cell. After transplantation, the tumor diameter was measured daily.
  • FIGS. 12A to 12C show the results in the compound 1 single agent administration group, the anti-PD-1 antibody single agent administration group, and the dual agent combination group, respectively, and the broken lines after day 69 indicate tumors of CMS5a-NYESO1 cells.
  • Volume and solid line represent the tumor volume of CMS5a cells, respectively.
  • CMS5a-NYESO1 cells with high antigenicity were rejected in all individuals who had undergone retransplantation (see FIGS. 12A to 12C, broken lines).
  • FIGS. 12B solid line
  • Tumors were rejected in 1 of 1 mice in the compound 1 single-dose group and in 4 of 5 in the compound 1 and anti-PD-1 antibody combination group (see solid lines in FIGS. 12A and 12C).
  • Frozen human PBMC (Cellular Technology Limited) was thawed and suspended in PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% BSA, and anti-CD8 antibody-bound magnetic beads (purchased from Miltenyi) were used to detect CD8 positive T cells. Isolated. From the negative fraction (CD8 negative PBMC), anti-CD4 antibody-bound magnetic beads (purchased from Miltenyi) were used to remove CD4 positive T cells, and the remaining cells (CD8 negative CD4 negative PBMC) were antigen-presenting cells (APC). ). APC was suspended in X-VIVO medium (purchased from LONZA) and seeded in a 2 mL tube at 1 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 6 per tube.
  • X-VIVO medium purchased from LONZA
  • isolated CD8-positive T cells are suspended in RPMI1640 medium (purchased from Cell Science Laboratory, containing 10% human AB type serum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamine), and 1 ⁇ per well in a 96-well plate.
  • the seeds were inoculated so as to be 10 5 to 2 ⁇ 10 5 , and cultured for 1 day under conditions of 5% carbon dioxide (concentration in the atmosphere) and a temperature of 37 ° C.
  • the APC pulsed with the antigen peptide was inactivated by irradiation with 35 Gy radiation.
  • a 96-well plate seeded with CD8-positive T cells was seeded at about 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 APCs per well and mixed with CD8-positive T cells.
  • Total volume of IL-2 (final concentration 10 [IU / mL]), IL-7 (final concentration 20 ng / mL) and serially diluted Compound 1 (final concentration 0.25 to 1 ⁇ M) in each well was added at 0.2 mL per well and cultured for 8 days under conditions of 5% carbon dioxide (concentration in the atmosphere) and a temperature of 37 ° C.
  • 100 ⁇ L of the culture supernatant was removed every 2-3 days, and 100 ⁇ L of fresh RPMI1640 medium containing Compound 1, IL-2, and IL-7 at the same final concentrations as above was added.
  • the cells were washed with PBS containing 2% FBS, suspended in a cell fixing solution (purchased from BD), reacted at room temperature for 20 minutes, and then washed with a washing solution for fixed cells (purchased from BD).
  • the suspension was suspended in PBS containing% FBS, and the ratio of MPEC in each cancer antigen-specific CD8-positive T cell was measured with a flow cytometer.
  • MPEC can be detected as KLRG1-negative CD127 (IL-7R) positive cells in T cells in the early activation stage.
  • FIGS. 13A to 13C show the ratio of MPEC in CD8-positive T cells specific for each antigen in cell groups treated with CMV IV, Melan-A, and modified Melan-A, respectively.
  • the ratio of MPEC in CD8 positive T cells specific for each antigen tended to increase as the treatment concentration of Compound 1 increased. From the above, it was shown that administration of Compound 1 can increase memory T cells responsible for immune memory.
  • Compound 1 has the action of increasing memory CD8 positive T cells against a wide range of antigens and enhancing immune memory.
  • Compound 1 can induce an immune response by T cells against the tumor as well as a subsequent memory response.
  • the compound as the active ingredient of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the dosage form for oral administration tablets, coated tablets, powders, granules, capsules, microcapsules, syrups,
  • an injection including an injectable lyophilized agent used after dissolution), a suppository and the like can be used.
  • these dosage forms is pharmaceutically acceptable excipients, binders, lubricants, disintegrants, suspending agents, emulsifiers, preservatives, stabilizers and dispersants such as lactose, sucrose, starch , Dextrin, crystalline cellulose, kaolin, calcium carbonate, talc, magnesium stearate, distilled water or physiological saline.
  • excipients such as lactose, sucrose, starch , Dextrin, crystalline cellulose, kaolin, calcium carbonate, talc, magnesium stearate, distilled water or physiological saline.
  • the dosage varies depending on the patient's symptoms, age, weight, etc., 1 to 1,000 [mg] for an adult can be administered in 2 to 3 divided doses.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a test analyzing the effect on immunological memory of single administration of the immunotherapeutic agent (compound 1) of the present invention and combined administration with an immunomodulator (anti-PD-1 antibody). The result regarding the agent administration group is shown. It is a graph which shows the result of the test which analyzed the effect with respect to the immune memory of single-agent administration of the immunotherapy agent (compound 1) of this invention, and combined administration with an immunomodulator (anti-PD-1 antibody), and anti-PD-1 The result regarding the single agent administration group of the antibody is shown.
  • the reaction solution was poured into 20 L of ice water, and the precipitated crystals were suction filtered.
  • the obtained crystals were subjected to reslurry washing with 1.0 L of methanol for 0.5 hours, suction filtered, and washed with 200 mL of methanol. It was dried in a desiccator under reduced pressure to obtain 238.1 g (1.01 mol, yield: 90%, mp 145-147 ° C.) of 2,4-dichloro-6-morpholino-1,3,5 triazine as colorless crystals.
  • the filtrate was poured into 6 L of water, and the crystallized crystals were suction filtered.
  • the crystals were reslurry washed with 1.0 L of ethanol for 0.5 hours and suction filtered.
  • the obtained crystals were dissolved by heating (internal temperature 63 ° C.) in 8.0 L of acetone-ethanol (1: 1 (v / v)), and the solution was naturally filtered using a filter paper.
  • the filtrate was concentrated to about 1/2 volume under reduced pressure, and the precipitated crystals were suction filtered and washed with 0.5 L of ethanol.
  • the immunotherapeutic agent of the present invention can be used for immunotherapy targeting various diseases such as cancer and infectious diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

下記一般式（Ｉ）で示される複素環式化合物もしくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする免疫療法剤。

Description

免疫療法剤
　本発明は、免疫療法剤に関する。
　免疫系は生命の恒常性を維持するためのシステムの一つであり、自己と非自己を区別して非自己を攻撃し、排除する仕組みである。免疫反応は基本的に「自己と非自己の識別」に始まり、「非自己への特異的反応」、「非自己の排除と記憶」の順に進む。免疫系を構成するリンパ球は、一旦非自己を認識して活性化すると増殖し、非自己の排除に向かう集団（エフェクター機構）と、非自己を記憶する集団（記憶応答）へと分化する。後者の記憶応答に関わる細胞は、将来、記憶した非自己に遭遇すると迅速に再活性化し非自己を排除する。このように、非自己の排除は免疫系の第一義と言えるが、同時に、自己の細胞や抗原に対する応答が適正に抑制されていないと、却って生命の恒常性を損うことになる。そこで免疫系には、自己に対する応答を抑制する自己免疫寛容と呼ばれる機構が備わっている。すなわち、免疫系は、アクセルとしての応答と、ブレーキとしての自己免疫寛容との適正なバランスにより恒常性を維持しており、非自己に対する免疫系の活性が低下すれば微生物の感染等に対する防御が弱体化する一方、自己免疫寛容システムの機能が低下すれば、自己免疫疾患を発症してしまうことになる。
　がん細胞やウイルス感染細胞といった異常な細胞は、元々は自己の細胞であるが、同時に異常抗原（非自己抗原）であるがん抗原やウイルス抗原を発現しており、免疫による排除の対象となる。しかし、これらの細胞は同時に、自己免疫寛容システムの機能を利用して、細胞自身を攻撃する免疫応答を抑制していることが判明している。
　こういった異常な細胞に対しては、非自己抗原に対する免疫応答を増強し、あるいは免疫応答の抑制を解除するアプローチが治療に有効な場合があり、そのようなアプローチの一例として、自己免疫寛容の機構に関与する細胞の一つである制御性Ｔ細胞（Regulatory T Cell；Treg）を介した方法が挙げられる。
　自己免疫寛容には、胸腺にて分化・成熟したＴ細胞のうち自己反応性のＴ細胞が排除される機構（負の選択）があるが、この際、自己反応性のＴ細胞が全て排除されるわけではなく、一部のＴ細胞はアポトーシスを逃れて末梢免疫系に生存する。Tregは、こうした負の選択を逃れた細胞の活性化や増殖を抑制している。
　種々の動物実験やヒトでの試験から、TregはCD4陽性CD25陽性Foxp3陽性細胞として同定されており、腫瘍免疫を含む様々な免疫応答を抑制していることが明らかになってきている。例えば、下記非特許文献１、２には、Tregが喘息や自己免疫疾患の治療の過程で重要な役割を果たすこと、また、移植片対宿主病（GVHD）を治療し、移植免疫寛容を誘導し得ること等が報告されている。
　Tregは、自己反応性Ｔ細胞や腫瘍反応性Ｔ細胞の活性化や増殖を抑制することで、自己免疫寛容を能動的に維持する機能を担っていると考えられている。例えば、ウイルス感染細胞やがん細胞といった異常な細胞は、非自己抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T Lymphocyte；CTL）によって認識・攻撃されるが、このCTLの働きは、Tregが標的細胞の周辺に集積することで抑制されてしまう（上述した異常な細胞自身による免疫応答の抑制の一例である）。したがって、ウイルス感染患者やがん患者等においては、Tregの機能を抑制することにより、標的細胞（ウイルス感染細胞やがん細胞といった異常な細胞）を攻撃するCTLの抑制を解除し、免疫応答を増強することが可能である。
　このように、異常な細胞を直接攻撃するのではなく、免疫機能を補助し、標的細胞への攻撃を増強することで間接的に治療を行う方法は免疫療法と呼ばれている。
　ヒトの腫瘍組織中には、多数のTregが集積しており、これらのTregとしては、抗原刺激により活性化される前のナイーブ制御性Ｔ細胞（Naive Treg）や、抗原刺激により活性化された後のエフェクターTreg（eTreg）と呼ばれる細胞等、種々のTregが存在することが報告されている。これらのTregは、CD45RAとFoxp3の二重染色パターンによって３つのサブタイプ（フラクションI、II、III）に分類することができる（下記非特許文献３参照）。eTreg（CD45RA-Foxp3highTreg）はこのうちフラクションIIに該当し、特に強い免疫抑制作用を有している（eTregと呼ばれるのは、この強力な活性のためである）。eTregでは、CTLA-4やPD-1といった免疫チェックポイント分子が高発現しており、これらの分子によるシグナル伝達を介して抗腫瘍免疫応答を抑制している。
　最近の研究では、eTregがCCR4を高発現しているとの報告もあり（下記非特許文献４参照）、抗CCR4抗体を用いてCCR4陽性eTregを選択的に除去すれば、抗腫瘍免疫応答の抑制が解除されて腫瘍細胞を排除できると理論上は考えられる。しかも、この際、血中やリンパ組織内に存在するCCR4陰性Tregは維持されるので、自己免疫反応は阻止し得るとも期待できる。
　また、細胞の増殖や分化を制御するシグナル伝達を担う分子であるPI3キナーゼ（Phosphoinositide 3-kinase；PI3K）の働きを阻害することによっても、Tregの機能を抑制できる可能性が示されている。下記非特許文献５には、PI3Kを構成する触媒サブユニットの一種であるPI3Kδの阻害剤が、Tregの抑制剤として有望であることが開示されている。
　ただし、非特許文献５に示されているデータは、あくまでマウスを用いた実験であり、PI3Kδ阻害剤のヒトeTregに対する抑制効果までは明らかになっておらず、ヒトeTregに対し特異的な効果を有するPI3Kδ阻害剤等の発見には至っていない。また、実際には、PI3Kδ阻害作用を示す薬剤の全てが必ずしもTregの抑制剤として有効であるわけでもない。
　その他、がん免疫療法の可能性は多くの機関で研究されており、抗腫瘍免疫応答の活性化剤として使用し得る薬剤も種々開発されている。
　しかしながら、こうした抗腫瘍免疫応答の活性化剤は、多くが限定的な臨床効果を有するに留まっている。また、免疫療法剤としての使用にあたっては、例えばCD8陽性Ｔ細胞やCTLの機能などを増強する対象を患部に限定したり、あるいはCTLとTregの機能的なバランスを考慮する必要があるなど、解決すべき問題点は多い。
　さらに、長期的な効果を得るためには、広範な抗原に対してＴ細胞の免疫記憶を司るメモリーＴ細胞を誘導することが有効と考えられるが、そのような療法ないし療法剤についての研究も未だ発展の途上にある。このように、自己免疫疾患を伴うことなく、標的細胞に対する免疫応答を効果的に誘導し得る免疫療法剤の開発は依然として強く望まれており、それと共に、記憶応答をも誘導し得る療法や療法剤の開発も求められている。
特許第３８３６４３６号公報 特許第４７３３０２１号公報 特許第５０８９３７７号公報
がんと免疫　2015(株)南山堂 Transplantation. 2005 May 27; 79(10):1310-16 PLoS One. 2012;7(4):e34662. doi: 10.1371/journal.pone.0034662. PNAS 110, no. 44, 17945-17950 Nature 510, 407-411 BLOOD 117, no.2, 591-594
　本発明は、種々の疾患に対し効果を有する免疫療法剤を提供しようとするものである。
　本発明は、以下の一般式（Ｉ）にて示される複素環式化合物若しくはその代謝物を有効成分とする免疫療法剤にかかるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　この一般式（Ｉ）中の各記号の定義に使用する語句の意味と例を以下に説明する。
　Ｘは窒素原子又はＣＨを表す。
　Ｒ１、Ｒ２は共に、或いはいずれかが水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アミノ基、Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、シアノ基、tert-ブチルジメチルシリルオキシ基、ニトロ基 を表す。
　Ｒ３は水素原子、ジフルオロメチル基、アミノ基、Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ基、メチル基、又はヒドロキシメチル基を表す。
　Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、又はＣ１－Ｃ６アルキル基を表す。
　Ｒ６はモルホリノ（１～２個のＣ１－Ｃ６アルキル基又はヒドロキシル基で置換されてもよい）、ピロリジニル（ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペリジノ（１～２個の酸素原子、ヒドロキシル基、ホルミル、又はＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペラジニル（環が１～２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１－Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）、１，４－ジアゼパノ（環が１～２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１－Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）、式－ＮＲ７Ｒ８（Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、又はカルボキシＣ１－Ｃ６アルキル基を表す）を表す。
　「Ｃ１－Ｃ６」とは限定がなければ炭素数１～６個を有する基を意味する。
　「Ｃ１－Ｃ６アルキル」としてはメチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基が挙げられる。
　「ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル」とは、上記「Ｃ１－Ｃ６アルキル」で定義される基のいずれかの炭素原子にヒドロキシ基が結合した基を意味する。
　「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ」としてはメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ等の直鎖又は分枝鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
　「オキソＣ１－Ｃ６アルキル」とは、上記「Ｃ１－Ｃ６アルキル」で定義される基の何れかの炭素原子にオキソ基が結合した基を意味する。
　「Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ」とは、アミノ基に上記「Ｃ１－Ｃ６アルキル」で定義される基の何れかが結合した基を意味する。
　「Ｃ１－Ｃ６アルコキシカルボニル」とは、カルボニル基に上記「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ」で定義される基の何れかが結合した基を意味する。
　「芳香族カルボニル」とは、カルボニル基に任意の芳香族（例えば、フェニル、チエニル、フリル等）基が結合した基を意味する。
　「置換カルバモイル」とは、メチルカルバモイル、フェニルカルバモイル等の、アルキル（例えば、上述のＣ１－Ｃ６アルキルなど）又は芳香族基で置換されたカルバ
モイル基を意味する。
　「カルボキシＣ１－Ｃ６アルキル」とは、上記「Ｃ１－Ｃ６アルキル」で定義される基の何れかの炭素原子にカルボキシ基が結合した基を意味する。
　尚、上述の化合物は、その構造中に不斉炭素原子を有する場合、不斉炭素原子由来の異性体及びそれらの混合物（ラセミ体）が存在するが、それらはいずれも本発明の有効成分とする化合物に含むものとする。
　また、上述の化合物若しくはその代謝物は、薬学的に許容される塩として酸付加塩の形態をとってもよい。適当な酸付加塩としては、無機酸塩では例えば塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等、有機酸塩では例えば酢酸塩、シュウ酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩等が用いられる。
　尚、本発明の複素環式化合物は、上記特許文献１～３に記載の化合物と同様の方法により製造することができる。
　また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物若しくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩と、１又は２以上の免疫調節剤、免疫細胞療法剤又はワクチン療法剤を同時に、別々に、又は経時的に投与するよう組み合わされた免疫療法剤にかかるものである。
　尚、ここでいう「免疫療法」とは、免疫機能を補助し、標的細胞への攻撃を増強することで間接的に治療する療法を指し、より詳しくは、CTLの機能に対する抑制を解除し、CTLを増強することで免疫機能を増強し、各種ウイルスによる感染症或いはがんといった疾患を治療する療法を指す。また、「免疫療法剤」とは、CTLの機能を増強する薬剤、CTLの機能の抑制（CTLの標的であるウイルス感染細胞やがん細胞等の異常な細胞による抑制や、Treg等による抑制）を解除する薬剤、及びその両方の作用を有する薬剤を指す。また、「免疫調節剤」とは、共抑制分子（PD-1、PD-L1、LAG-3等、免疫応答を抑制方向に誘導する分子）や共刺激分子（OX40等、免疫応答を活性化方向に誘導する分子）を阻害或いは刺激することで、免疫機能に対し影響を与える薬剤を指す。
　「免疫細胞療法」とは、患者から採取したリンパ球や樹状細胞を体外で増殖、活性化させ、再び患者に移入することでウイルスによる感染症やがんなどの疾患を治療する治療法を指し、「免疫細胞療法剤」とは、免疫細胞療法において患者から採取され、患者に移入するために増殖、活性化されたリンパ球や樹状細胞を指す。
　「ワクチン療法剤」とは、がんやウイルスなどの抗原をワクチンとして用いた薬剤であり、これらの抗原をがんやウイルス感染症患者に投与することで、免疫系によるプロセッシングと抗原提示を経て、Ｔ細胞の抗原特異的な活性と増殖を促す薬剤を指す。
　「eTreg」 とは、ヒトのTregをCD45RAとFoxp3の二重染色パターンに基づいて分類したFoxp3陽性細胞集団の３つのサブタイプ（フラクションI：CD45RA+Foxp3low、フラクションII：CD45RA-Foxp3high、フラクションIII：CD45RA-Foxp3low）のうち、フラクションIIに相当するTregを指す。尚、＋は陽性、－は陰性を指す。highとlowはいずれも陽性を指すが、highはlowと比較してより強くタンパク質が発現している状態を指す。
　適当な免疫調節剤としては、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX-40抗体、抗TIGIT抗体、抗4-1BB抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗TIM3抗体、抗ICOS抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗CD28抗体、抗CD30抗体が例として挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではなく、対象となる疾患等に応じて種々の免疫調節剤を使用し得る。
［製造工程］
　上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物は、下記反応式に示されるように塩化シアヌル又は2,4,6-トリクロロピリミジン(化合物II)を出発原料としてベンズイミダゾール化合物(化合物Ｖ)、モルホリン化合物(化合物VI)及びＲ６Ｈ(化合物VII)を順次反応させることにより製造することができる。
［反応式］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘは前記定義に同じ）
　以下に各々の製造工程を説明する。
　１）中間体IIIの製造工程（ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘは前記定義に同じ）
　溶媒中、塩化水素捕捉剤の存在下で、塩化シアヌル又は2,4,6-トリクロロピリミジン(化合物II)とベンズイミダゾール化合物(化合物Ｖ)を反応させることにより中間体IIIが得られる。
　この反応で用いる塩化水素捕捉剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン又はピリジン等が挙げられ、溶媒としてはアセトン、トルエン、ヘキサン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン又はジクロロエタン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)等が挙げられる。
　この反応においては、化合物II１モルに対して0.5～1.2モルの化合物Ｖを0.5～2モルの塩化水素捕捉剤の存在下で-15℃～-5℃の温度で0.5～2時間、更に室温で5～50時間反応させる。
　尚、化合物Ｖを塩化水素捕捉剤として用いることもできる。
　２）中間体IVの製造工程（ｉｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ1、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘは前記定義に同じ）
　溶媒中、塩化水素捕捉剤の存在下で、前記製造工程(i)で得られた中間体IIIとモルホリン化合物(化合物VI)を反応させることにより中間体IVが得られる。この反応で用いる塩化水素捕捉剤としては、前記製造工程(i)の塩化水素捕捉剤と同じものが挙げられ、溶媒としてはDMF、アセトン、トルエン、キシレン、ジクロロエタン、ジクロロメタン等が挙げられる。
　この反応においては、中間体III１モルに対して0.5～1.2モルの化合物VIを0.5～3モルの塩化水素捕捉剤の存在下で-5℃～0℃の温度で0.5～3時間、更に室温で5～50時間反応させる。
　尚、化合物VIを塩化水素捕捉剤として用いることもできる。
　３）化合物(I)の製造工程（ｉｉｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘは前記定義に同じ）
　溶媒中、前記製造工程(ii)で得られた中間体IVに塩化水素捕捉剤の存在下、Ｒ６Ｈ(化合物VII)を反応させることにより、本発明の化合物(I)が得られる。
　この反応で用いる塩化水素捕捉剤としては、前記製造工程(i)の塩化水素捕捉剤と同じものが挙げられ、溶媒としてはDMF、ジメチルスルホキシド(DMSO)、キシレン、ジクロロエタン等が挙げられる。
　この反応においては、中間体IV１モルに対して1～5モルのＲ６Ｈ(化合物VII)を室温～140℃で0.1～16時間反応させる。尚、塩化水素捕捉剤の存在下で反応させる場合は、中間体IV１モルに対して1～5モルの塩化水素捕捉剤を用いる。尚、化合物VIIを塩化水素捕捉剤として用いることもできる。
　ただし、化合物(I)の製造に当たって化合物VIと化合物VIIが同一の場合は、製造工程(ii)、(iii)を一段階で行い化合物(I)を得ることができる。その場合は、化合物III１モルに対して2～10モルの化合物VI又はVIIを用いて-10℃～5℃で0.1～5時間反応させ、さらに室温～120℃で3～50時間反応させる以外は前記製造工程(ii)の反応条件に従う。
　また、製造工程(i)、(ii)、(iii)において用いられる化合物Ｖ、VI又はVIIの反応性が低い場合は、水素化ナトリウムで処理した後に各工程の反応を進めることが好ましい。水素化ナトリウムを使用する場合は、各工程の出発物質（化合物II、III又はIV）１モルに対して1.0～1.2モルの水素化ナトリウムを用いる。
　尚、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のいずれかがtert-ブチルジメチルシリルオキシである場合は、更に常法に従い酸により脱保護し水酸基に変換することができる。また、Ｒ１、Ｒ２のいずれかがニトロ基の場合は、還元することによりアミノ基に変換することができる。
　また、前記製造工程(i)、(ii)、(iii)は、順序が入れ替わることも可能であり、その際の反応条件の変更は当業者にとって自明な範囲で行うことができる。
　尚、上記各工程で得られる生成物は必要に応じて通常の方法、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、再結晶、カラムクロマトグラフィー等で分離精製することができる。
　本発明の有効成分とする一般式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、当該技術分野で周知の各種の方法によって製造することができる。用いる適当な酸としては、無機酸では例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等、有機酸では例えば酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。
　本発明の免疫療法剤は、例えばがんや各種ウイルスによる感染症等、免疫療法の対象となり得る広範な疾患に対して使用することができる。
　本発明の免疫療法剤が対象とし得るがんとしては、例えば肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌等、大腸癌、盲腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、頭頚部癌、脳腫瘍、膠芽腫、神経膠腫、神経鞘腫、下垂体腺種、ぶどう膜悪性黒色腫、髄膜腫、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、甲状腺癌、胃癌、胸腺腫、胸腺癌、中皮腫、肝臓癌、GIST（消化管間質腫瘍）、胆管癌、胆嚢癌、膵内分泌腫瘍、膵臓癌、膵臓腺癌、腎癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌（子宮内膜癌）、乳癌、卵巣癌、精巣（睾丸）腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、絨毛性疾患、陰茎癌、膣癌、外陰癌、皮膚癌、悪性黒色腫、乳房外パジェット病、中皮腫、メルケル細胞癌、有棘細胞癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、子宮肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、悪性骨腫瘍、口腔癌など、肉腫および癌腫を含む固形腫瘍もしくは線維症、さらに、白血病（急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病等）、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等）、小リンパ球性リンパ腫、骨髄異型性症候群、骨髄増殖性腫瘍、多発性骨髄腫などの血液腫瘍等が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。
　また、本発明の免疫療法剤が対象とし得る感染症としては、例えばインフルエンザ、サイトメガロウイルス感染症、エプスタインバーウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、リケッチア感染症、クラミジア感染症、ファイトプラズマ感染症、コクシエラ感染症、トキソプラズマ感染症、リーシュマニア感染症等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本発明の免疫療法剤は、免疫療法の対象となり得る広範な抗原に対して使用することができる。代表的な例として、病原性生物由来、腫瘍細胞由来の抗原が挙げられ、病原性生物としては、例えばサイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス、肝炎ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、Neisseria meningitidis、百日咳菌、Haemophilus influenzae b型、HIV、単純ヘルペスウイルス2型、ジフテリア菌、破傷風菌、H.pylori、Streptococcus pneumoniae、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、髄膜炎菌等が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない
　以下、上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物を有効成分とする免疫療法剤の効果について説明する。尚、以下の各試験では本発明の対象の一例として主にインフルエンザ、サイトメガロウイルス感染症、エプスタインバーウイルス感染症、がんを取り扱っているが、本発明の治療対象はこれに限定されるものではなく、免疫療法の対象となり得る種々の疾患に使用し得る。また、各試験例中、試薬等添加した際の濃度の記載は全て終濃度を示す。
［試験１］
　上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物のうち、以下の化合物１のPI3Kδに対する阻害活性を測定した。
・化合物１：２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン
　PI3-KinaseヒトHTRF Assay Kit（Millipore社より購入）を使用し、化合物１のPI3K各アイソフォームに対する阻害活性を決定した。３８４ウェルプレート（Perkin Elmer社より購入）の各ウェルに、ＤＭＳＯ、又は化合物１を０．１～３０００［ｎＭ］含むＤＭＳＯを０．５［μＬ］と、酵素と基質の混合溶液（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、１３．８μＭ　ＰＩＰ２、及びそれぞれ最適濃度として定めた濃度のPI3Kα（最終濃度４０［ｎｇ／ｍＬ］）、β（最終濃度７０［ｎｇ／ｍＬ］）、γ（最終濃度６００［ｎｇ／ｍＬ］）又はδ（最終濃度３０［ｎｇ／ｍＬ］））を１４．５［μＬ］ずつ分注し、室温で１０分間インキュベートした。さらに、５［μＬ］のＡＴＰ溶液（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、８０μＭ　ＡＴＰ）を加えて室温で３０分間インキュベートし、反応停止溶液（PI3-KinaseヒトHTRF Assay Kit内に含まれる）を５［μＬ］添加して反応を終了させた。検出溶液（PI3-KinaseヒトHTRF Assay Kit内に含まれる）を各ウェルに５［μＬ］ずつ添加し、約１８時間後、各ウェルの蛍光を測定した（励起波長３３０［ｎｍ］、測定波長６２０［ｎｍ］及び６６５［ｎｍ］）。測定波長６６５［ｎｍ］で得た測定値を、測定波長６２０［ｎｍ］で得た測定値で除した値をＨＴＲＦ比とした。化合物非存在下におけるＨＴＲＦ比を１００％活性、PI3K各アイソフォーム非存在下におけるＨＴＲＦ比を０％活性として酵素活性率を算出し、５０％酵素阻害濃度（IC50値）を決定した。
　その結果、化合物１のヒトのPI3KのサブユニットPI3Kδに関するIC50値は６．７１［ｎＭ］であり、化合物１は、ヒトのPI3KのサブユニットPI3Kδに対して高い阻害活性を有していることが確認された。
［試験２］
　次に、上記化合物１の投与が免疫系細胞に与える影響を検討した。この試験２では、ヒトの末梢血単核細胞（PBMC）から選別したＴ細胞サブセットのうち、CD4陽性CD25陽性細胞、CD4陽性CD25陰性細胞、及びCD8陽性T細胞に関して化合物１の影響を分析した。CD25はTregのマーカーとして一般に知られており、この試験２では、CD4陽性CD25陽性細胞をTregとして扱っている。
　選別した細胞に、CD3/CD28刺激ビーズ及びIL-2と共に化合物１を添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いて各Ｔ細胞サブセットにおける増殖性細胞の割合を測定した。また、CD4陽性CD25陽性細胞を培養した実験群に関しては、CD4陽性Foxp3陽性Tregに対するeTregの割合を測定した（図１Ａ、図１Ｂ参照）。上述の通り、eTregは免疫反応に対して強い抑制活性を有しており、免疫系の働きを評価する際には、eTregの数や割合を指標として用いることができる。
　ヒトPBMC（Cellular Technology Limited社より購入）の懸濁液に抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、さらにCD3、CD4、CD8、CD45RA、CD25に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）で洗浄、懸濁し、セルソーター（BD FACSAriaTM Fusion、BD Bioscience社製）を用いてＴ細胞サブセット中のCD4陽性CD25陽性細胞、CD4陽性CD25陰性細胞及びCD8陽性T細胞を選別した。これに細胞増殖の指標としてCFSE（CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit、Lifetechnologies社より購入）を取り込ませ、RPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトＡＢ型血清、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ　L-グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０４個の細胞を播種した。各ウェルに、最終濃度１０［ＩＵ／ｍＬ］となる量のIL-2、及び２［μＬ／ウェル］のCD3/CD28抗体コート磁気ビーズ（Dynabeads (R) Human T-Activator CD3/CD28、Lifetechnologies社より購入）、化合物１（最終濃度１又は４［μＭ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で４日間培養した。
　培養した細胞をピペッティングにより各ウェルから剥がし、プレートを遠心して２％　ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、CD3、CD4、CD8、CD45RAに対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。
　図１Ａに示す如く、化合物１の添加により、CD4陽性CD25陽性細胞の増殖が強く抑制された。化合物１を４［μＭ］添加した群では、１［μＭ］添加した群と比較してより強い増殖の抑制が見られた。一方、CD4陽性CD25陰性細胞とCD8陽性T細胞については、増殖の抑制は観察されなかった。化合物１は、Ｔ細胞サブセットのうち、Tregの増殖を選択的に抑制することが確認された。
　さらに、増殖抑制が観察されたCD4陽性CD25陽性細胞においては、図１Ｂに示す如く、TregにおけるeTregの割合も減少していたが、このeTregの減少についても化合物１の濃度への依存が見られ、化合物１を４［μＭ］添加した群においては、１［μＭ］添加した群と比較してeTregの割合が大きく減少していた。以上より、化合物１は、Tregの中でも特にeTregの活性化と増殖を抑制することが示された。
［試験３］
　上記試験２と同じ実験系を用いて、化合物１と他のPI3Kδ阻害剤のTregに対する増殖抑制効果を比較した。この試験３では、ヒトPBMCから選別したＴ細胞サブセット中のCD4陽性CD25陽性細胞に、CD3/CD28刺激ビーズ及びIL-2と共に化合物１をはじめとする各種のPI3Kδ阻害剤（被験物質）をそれぞれ添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いてTregに対するeTregの割合を測定した（図２参照）。
　ヒトPBMC（Cellular Technology Limited社より購入）の懸濁液に抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、さらにCD3、CD4、CD8、CD45RA、CD25に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）で洗浄、懸濁し、セルソーター（BD FACSAriaTM Fusion、BD Bioscience社製）を用いてCD4陽性CD25陽性Ｔ細胞を選別した。これをRPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトＡＢ型血清、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ　L-グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０４個の細胞を播種した。各ウェルに、最終濃度１０［ＩＵ／ｍＬ］となる量のIL-2、２［μＬ／ウェル］のCD3/CD28抗体コート磁気ビーズ（Dynabeads (R) Human T-Activator CD3/CD28、Lifetechnologies社より購入）、最終濃度４［μＭ］となる量の各被験物質を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で４日間培養した。
　培養した細胞をピペッティングにより各ウェルから剥がし、プレートを遠心して２％　ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、CD3、CD4、CD8、CD45RAに対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。
　図２に示す如く、PI3Kδ阻害剤として公知の物質であるCAL101、PIK293、PIK294、AMG319、PI3065、IC87114と比較して、化合物１がeTregに対し有意に強い抑制効果を示すことが確認された。このように、化合物１のもつeTreg抑制効果は、PI3Kδ阻害剤一般の中でも特に強いことが確認された。
　ここで、非特許文献６によれば、本試験２にて化合物１との比較対象としたPI3Kδ阻害剤のうち、CAL101のPI3Kδに関するIC50は２．５［ｎＭ］であり、一方、上述の試験１によれば、化合物１のPI3Kδに関するIC50は６．７１［ｎＭ］である。つまり、PI3Kδ阻害剤としての活性はCAL101と比較して化合物１のほうが低いにもかかわらず、化合物１にCAL101よりも有意に強いeTreg抑制効果が認められた。eTreg抑制効果の強さは、PI3Kδ阻害活性の強さに必ずしも依存しないことを示すものであり、これは上記非特許文献５に開示されている知見等を鑑みて予想外の結果と言える。
［試験４］
　次に、上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物の類縁体である以下の化合物２～７に関し、eTregに対する増殖抑制効果を検討した。この試験４で用いた実験系は、用いる化合物の種類のほかは、上記試験３と同じとした。
・化合物２：２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－Ｎ，Ｎ－ジ（２－ヒドロキシエチル）アミノ－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン
・化合物３：２－（２－ジフルオロメチル－５－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン
・化合物４：２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－（２－ヒドロキシモルホリノ）－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン・化合物５：２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－モルホリノ－６－（４－オキソピペリジノ）－１，３，５－トリアジン
・化合物６：２－（２－ジフルオロメチル－４－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４－（２－ヒドロキシメチルピロリジン－１－イル）－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン
・化合物７：２－（２－ジフルオロメチル－４－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４－（３，３－ジメチルモルホリノ）－６－モルホリノピリミジン
　試験４では、ヒトPBMCから選別したＴ細胞サブセット中のCD4陽性CD25陽性細胞に、CD3/CD28刺激ビーズ及びIL-2と共に化合物２～７をそれぞれ添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いてTregに対するeTregの割合を測定した（図３Ａ、図３Ｂ参照）。
　図３Ａ、図３Ｂに示す如く、化合物２～７の添加により、TregにおけるeTregの割合が顕著に減少した。このことから、化合物２～７は、化合物１と同様、eTregの増殖を抑制する効果を有することが確認された。
［試験５］
　次に、化合物１の投与による抗原特異的免疫応答の増強効果を検討した。がんや感染症の発症に際しては、がん細胞やウイルス感染細胞が発現する抗原に特異的なCTL（抗原特異的CTL）が誘導されるが、このときにTregが共存していると、CTLの増殖が阻害されたり、機能が抑制されたりすることが知られている。したがって、上記試験３にて確認されたように、化合物１によりeTregが抑制されるとすれば、化合物１の投与によって抗原特異的CTLの数や機能が増大することが期待できる。この試験５では、ヒトPBMCにIL-2、IL-7及び抗原ペプチドと共に化合物１を添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いてCTLとeTregの数を計測し、CTL/eTreg比を算出した（図４参照）。CTL/Treg比はCTLによる抗原特異的免疫応答とTregによる免疫抑制反応のバランスを評価する指標として一般的に用いられているものである。したがって、この試験５において、化合物１の投与によりCTL/eTreg比が上昇すれば、化合物１の作用により抗原特異的免疫応答が増強されていると解釈することができる。
　ヒトPBMC（国立がん研究センター内で採取された健常人血液より調製、或いはCellular Technology Limited社より購入）をRPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ　HEPES、４ｍＭ　Ｌ－グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０６個の細胞を播種した。各ウェルに段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．００８～２μＭ）、IL-2（最終濃度１０［Ｕ／ｍＬ］）、IL-7（最終濃度２０［ｎｇ／ｍＬ］）及び下記各種抗原ペプチド（最終濃度１０［μＭ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２～３日毎に１００［μＬ］の培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同上の最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地（同上）を１００［μＬ］添加した。
　抗原ペプチドとしては、がん細胞又はウイルス感染細胞の細胞表面上に発現しており、且つ健常人のPBMC中に、当該抗原に対し一定の頻度で反応するＴ細胞クローンが存在することが知られていることを条件に、以下の各抗原を選択した。各抗原ペプチドは、ユーロフィンジェノミクス株式会社等より入手した。また、入手した各抗原ペプチドに関し、３ロット以上のヒトPBMCの反応性を事前に試験し、最も反応性の高いロットを本試験に使用した。
・改変Melan-A：悪性黒色腫細胞が発現するがん抗原（遺伝子改変型）
・CMV：サイトメガロウイルス（CMV）感染細胞が発現するウイルス抗原
・EBNA：エプスタイン・バールウイルス（EBV）感染細胞が発現するウイルス抗原
・Flu：インフルエンザ感染細胞が発現するウイルス抗原
　培養後の各ウェル内の細胞をピペッティングして剥がし、プレートを遠心して２％　ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、細胞懸濁液をeTreg測定用とCTL測定用に２等分した。
　eTreg測定用のサンプルについては、細胞懸濁液にCD3、CD4、CD8、CD45RAに対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。
　CTL測定用のサンプルについては、細胞懸濁液に抗原ペプチド特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を５０倍希釈にて添加し、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。
　上記手順により測定したeTregとCTLの数の比を図４に示す。使用した抗原ペプチドやPBMCドナーの違いにより、反応性や至適濃度は異なるものの、抗原ペプチドの種類にかかわらず、化合物１による処理濃度に依存してCTL/eTreg比が増加する傾向が認められ、いずれも最終濃度では対照区と比較して２倍以上増加した。以上から、化合物１により、感染症やがん等に対する抗原特異的免疫応答が増強される可能性が示された。
［試験６］
　続いて、上記試験５と同じ実験系を用い、化合物１によるCTLの活性化について検討した。この試験６は、化合物１によるCTLの増加を検証するための試験である。具体的な手順としては、ヒトPBMCからCD3陰性細胞とCD8陽性T細胞を選別し、これらの細胞の共培養系にIL-2、IL-7及び抗原ペプチドと共に化合物１を添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いて抗原特異的なCTLの数を計測した（図５参照）。抗原提示細胞であるCD3陰性細胞とCD8陽性T細胞のみの共培養系（すなわち、Tregの存在しない条件下）において、化合物１の投与により抗原特異的なCTLの増強が確認されれば、化合物１はTregを抑制するのみならず、抗原提示とCTL活性化の段階をも直接的に増強していると推定することができる。
　ヒトPBMC（国立がん研究センター内で取得された健常人血液より調製）の懸濁液に抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、さらにCD3、CD4、CD8に対する各抗体のカクテルをそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）で洗浄、懸濁し、セルソーター（BD FACSAriaTM Fusion、BD Bioscience社製）を用いてCD3陰性細胞及びCD8陽性T細胞を選別した。両細胞をRPM11640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ　HEPES、４ｍＭ　Ｌ－グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートの同一ウェルに対して、CD3陰性細胞を１ウェルあたり１×１０6個、CD8陽性T細胞を１ウェルあたり２×１０５個を播種した。各ウェルに段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．０３～２μＭ）、IL-2（最終濃度１０［Ｕ／ｍＬ］）、IL-7（最終濃度２０［ｎｇ／ｍＬ］）及び抗原ペプチド（最終濃度１０［μＭ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２～３日毎に１００［μＬ］の培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同上の最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地（同上）を１００［μＬ］添加した。
　培養後の各ウェル内の細胞をピペッティングして剥がし、プレートを遠心して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、EBNA特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を添加し（５０倍希釈）、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。
　上記手順により測定したEBNA特異的CTLの数を図５に示す。化合物１の処理濃度に依存してEBNA特異的CTLの数が増加し、本試験中の最高濃度である２［μＭ］の化合物１で処理した群では、対照区と比較してEBNA特異的CTLは３倍以上に増加した。すなわち、化合物１は、Treg抑制を通じて免疫応答を増強するのみならず、Tregを介さない別の機構によっても、抗原特異的免疫応答を増強していることを示すものである。
［試験７］
　さらに、がん患者における抗原特異的免疫応答に対し、化合物１が与える影響を検討した。がん患者の体内では、がん抗原に対する免疫寛容が成立しているため、がん患者のがん抗原に対する免疫反応と、健常人の外来抗原に対する免疫反応は異なるものと考えられる。したがって、がん抗原への免疫反応に対する作用を検討するにあたっては、健常人由来のサンプルの他に、がん患者由来のサンプルを用いた解析をも行う必要がある。そこで、この試験７では、がん抗原に対する免疫応答が認められた胃がん患者末梢血からPBMCを採取し、これを上記試験６における健常人血液由来のPBMCの代わりに用いて化合物１の影響を検討した（図６Ａ～図６Ｄ参照）。
　国立がん研究センター内で取得した胃がん患者の末梢血よりPBMCを調製し、抗CD8抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD8陽性T細胞を単離した。そのネガティブフラクション（CD8-PBMC）から、さらに抗CD4抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD4陽性T細胞を除去し、残った細胞（CD8-CD4-PBMC）を抗原提示細胞（APC）とした。APCをX-VIVO培地（LONZA社より購入）に懸濁し、２ｍＬチューブに１本あたり３×１０５～１×１０６個となるよう播種した。各種抗原ペプチド（MAGE-A3、MAGE-A4、NYESO-1、WT-1）を１チューブあたりの液量が０．２５［ｍＬ］となるよう、最終濃度１０［μＭ］にて添加し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養し、APCに抗原ペプチドをパルスした。一方、単離したCD8陽性T細胞は、RPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ　HEPES、４ｍＭ　Ｌ－グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5～２×１０5個となるよう播種し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養した。抗原ペプチドをパルスしたAPCに３５Gyの放射線を照射して不活化し、CD8陽性T細胞を播種済みの９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０５～５×１０５個となるよう播種し、CD8陽性T細胞と混合した。各ウェルに段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．２５～１μＭ）、IL-2（最終濃度１０［Ｕ／ｍＬ］）及びIL-7（最終濃度２０［ｎｇ／ｍＬ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２～３日毎に１００［μＬ］の培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同じ最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地を１００［μＬ］添加した。
　続いて、各抗原ペプチドで処理した細胞群に関し、上記試験６と同様の手順によりフローサイトメーターによる測定を行った。培養後の細胞を２％　ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、抗FcγR抗体を添加して反応させた後、各抗原ペプチドに特異的なTCR検出用MHC-Tetramerを添加して反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体を添加して反応させ、細胞固定液にて固定して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。
　上記手順により測定したCD8陽性T細胞におけるがん抗原特異的CTLの割合を図６Ａ～図６Ｄに示す。いずれの抗原を添加した細胞群においても、化合物１の処理濃度に依存して抗原特異的CTLの割合が増加したことから、化合物１は健常人の血液のみならず、がん患者の末梢血においてもがん抗原特異的免疫応答を増強することが示唆された。
［試験８］
　次に、この化合物１がin vivoにてCD8陽性Ｔ細胞とTregの細胞数比に対して与える影響を検討した。この試験８では、担がんマウスに化合物１を投与し、末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）及び腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の各々についてフローサイトメトリーを用いてCD8陽性T細胞とTregの比を計測した（図７Ａ～図７Ｅ参照）。
　７週齢のBALB/c系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、マウス線維肉腫細胞株CMS5aを皮下移植した。腫瘍径が４～６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のBALB/cマウスを使用した（図７Ａ～図７Ｅ中ではcontと表示）。
　化合物１は、経口投与により連日投与した。１回あたりの投与量は０，１０，３０，１００［ｍｇ／ｋｇ］とし、化合物１を投与しない群（投与量０［ｍｇ／ｋｇ］）には溶媒のみを投与した。投与は１日１回とし、投与期間は８日間、１５日間、２２日間の三通りとした。
　初回投与前（Day 0）、及び各投与期間における最終投与の翌日（Day 8，Day 15，Day 22）に各組織を回収し、末梢リンパ節および脾臓については氷冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中で、がん組織については氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）でそれぞれホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、CD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、セルカウント用ビーズ（eBioscience社より購入）と共にフローサイトメーターにて測定を行った。各組織についてCD8陽性Ｔ細胞及びTregの細胞数を測定し、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比を算出した。
　図７Ａに示す如く、担がんマウスの末梢リンパ節や脾臓におけるCD8陽性Ｔ細胞/Treg比は、Day 0においては対照群と差が認められなかったが、図７Ｂ～図７Ｄに示す如く、Day 8以降、腫瘍細胞の増殖と共にCD8陽性Ｔ細胞/Treg比は低下した（PLN（cont）、Spleen（cont）及びPLN（tumor + vehicle）、Spleen（tumor + vehicle）参照）。そして、化合物１を連続投与すると、図７Ｂ～図７Ｄに示す如く、末梢リンパ節や脾臓におけるCD8陽性Ｔ細胞/Treg比に関し、化合物１の投与量依存的に上昇する傾向が見られた（PLN（tumor + 10 mg）、PLN（tumor + 30 mg）、PLN（tumor + 100 mg）、Spleen（tumor + 10 mg）、Spleen（tumor + 30 mg）、Spleen（tumor + 100 mg）参照）。以上より、化合物１を投与することで、in vivoにおいて免疫応答を増強し得ることが確認された。
　また、図７Ｅに示す如く、がん組織内のTILに関しても、Day 8において化合物１の投与量依存的にCD8陽性Ｔ細胞/Treg比の上昇が認められ、化合物１が免疫応答を増強し得ることが示された。
［試験９］
　次に、化合物１が異常な細胞を排除する免疫応答の機能を増強することをin vivoにて確認する試験を行った。この試験９では、抗CD8抗体又は抗CD4抗体を担がんマウスに投与してCD8陽性Ｔ細胞又はCD4陽性Ｔ細胞を除去した場合の化合物１投与による抗腫瘍効果を検討した。
　７週齢のBALB／c系雌マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、ヒトがん抗原NY-ESO-1の遺伝子を導入したマウス線維肉腫細胞株CMS5aを皮下移植した。腫瘍径が４～６ｍｍに達した時点（Day -1）で群分けを行い、一部のマウスに対して５００μｇの抗CD8抗体又は抗CD4抗体を腹腔内投与し、翌日（Day 0）から溶媒又は２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１の投与を開始した。化合物１の１回あたりの投与量は１００［ｍｇ／ｋｇ］とし、実験終了日（Day 17）まで連日経口投与し、Day 6に２５０μｇの抗CD8抗体又は抗CD4抗体を再び腹腔内投与した。
　図８Ａ、図８ＢはDay 17における各群の平均腫瘍体積を示している。図８Ａに示す如く、化合物１を含まない溶媒を投与したマウスにおいては、抗体非投与群（vehicle）及び抗CD4抗体投与群（CD4 depletion）における腫瘍体積が平均約３０００［ｍｍ３］であるのに対し、抗CD8抗体投与群（CD8 depletion）における腫瘍体積は平均約６０００［ｍｍ３］に達した。CD8陽性Ｔ細胞の存在が腫瘍増殖に大きく関与していることがわかる。
　一方、図８Ｂに示す如く、化合物１を投与したマウスにおいては、抗体非投与群（化合物（１））における腫瘍体積が平均１０００［ｍｍ３］程度に抑えられたのに対して、抗CD8抗体（化合物（１）CD8 depletion）及び抗CD4抗体投与群（化合物（１）CD4 depletion）における腫瘍体積は平均２０００［ｍｍ３］以上に達した。このように、化合物１による抗腫瘍効果は、CD8陽性Ｔ細胞やCD4陽性Ｔ細胞の除去により半減した。化合物１が、CD8陽性Ｔ細胞やCD4陽性Ｔ細胞の機能の増強を介して免疫応答を高め、抗腫瘍効果を発揮することを示すものであり、化合物１を新たな免疫療法剤として利用し得ることが期待される。
［試験１０］
　次に、化合物１と免疫調節剤の併用による免疫増強の効果について検討した。この試験１０では、免疫調節剤として抗PD-1抗体を使用した。担がんマウスに化合物１と抗PD-1抗体を併用投与し、各群５匹ずつのマウスからがん組織を回収し、CD8陽性T細胞とTregの数をフローサイトメトリーにより計測し、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比を算出した（図９Ａ参照）。また同様に、NY-ESO-1抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞（CTL）の数を計測し、CTL/Treg比を算出した（図９Ｂ参照）。
　７週齢のBALB/c系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、ヒトがん抗原NY-ESO-1の遺伝子を導入したマウス線維肉腫細胞株CMS5aを皮下移植した。腫瘍径が４～６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１又は抗PD-1抗体（In VivoMab anti-mouse PD-1 (CD279)clone: RMP1-14、Bio X Cell社より購入）、もしくはその両方の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のBALB/cマウスを使用した。化合物１は経口投与により連日投与し、抗PD-1抗体は合計３回、腹腔内に投与した。
　担がんマウスの各群における各剤の投与のタイミングは以下の通りである。
・溶媒のみを１０日間、１日１回投与（vehicle）。
・化合物１を１０日間、１日１回、１００［ｍｇ／ｋｇ］投与（化合物（１））。
・抗PD-1抗体を、１日目、４日目及び８日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-PD-1 Ab）。
・化合物１を１０日間、１日１回、１００［ｍｇ／ｋｇ］投与し、且つ抗PD-1抗体を１日目、４日目及び８日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-PD-1 Ab + 化合物（１））。
　投与開始より１０日後（Day 10）にがん組織を回収し、氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）中でホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、細胞懸濁液をTreg測定用とCTL測定用に２等分した。
　Treg測定用のサンプルについては、細胞懸濁液にCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。
　CTL測定用のサンプルについては、細胞懸濁液にNY-ESO-1特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を添加し（５０倍希釈）、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、セルカウント用ビーズ（eBioscience社より購入）と共にフローサイトメーターにて測定を行った。
　図９Ａに示す如く、化合物１の単剤投与によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比が上昇し、化合物１と抗PD-1抗体との併用によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比はさらに上昇した。
　NY-ESO-1抗原特異的CTLのTregに対する比についても、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比と同様の傾向が見られた。図９Ｂに示す如く、がん組織において化合物１の投与によりCTL/Treg比が上昇した。この効果は、抗体との併用によって更に増強された。
　以上より、化合物１を免疫調節剤と併用することで、効果的に免疫応答を誘導する免疫療法となり得ることが示された。
［試験１１］
　上記試験１０にて用いた抗PD-1抗体とは別の免疫調節剤に関しても、化合物１との併用による効果を検討した。この試験１１では、免疫調節剤として抗LAG-3抗体を用いた。担がんマウスとしては、マウス黒色腫細胞株を移植したマウスを各群３匹ずつ用いた。
　担がんマウスに化合物１と抗LAG-3抗体を投与し、脾臓及びがん組織におけるCD8陽性T細胞及びTregの数をフローサイトメトリーにて計測し、CD8陽性Ｔ細胞/Tregの比を算出した（図１０Ａ、図１０Ｂ参照）。
　７週齢のC57BL/6系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、マウス黒色腫細胞株B16-F0を皮下移植した。腫瘍径が４～６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１又は抗LAG-3抗体（In VivoMab anti-mouse LAG-3、clone: C9B7W、Bio X Cell社より購入）、もしくはその両方の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のC57BL/6マウスを使用した。化合物１は経口投与により連日投与し、抗LAG-3抗体は合計２回、腹腔内に投与した。
　担がんマウスの各群における各剤の投与のタイミングは以下の通りである。
・溶媒のみを７日間、１日１回投与（vehicle）。
・化合物１を７日間、１日１回、６０［ｍｇ／ｋｇ］投与（化合物（１））。
・抗LAG-3抗体を、１日目及び５日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-LAG-3 Ab）。
・化合物１を７日間、１日１回、６０［ｍｇ／ｋｇ］投与し、且つ抗LAG-3抗体を１日目及び５日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-LAG-3 Ab + 化合物（１））。
　投与開始より７日後（Day 7）に脾臓とがん組織を回収し、氷冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ、又は氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）中でホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。
　続いて、CD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を添加し（５０倍希釈）、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、セルカウント用ビーズ（eBioscience社より購入）と共にフローサイトメーターにて測定を行った。
　図１０Ａに示す如く、脾臓においては、化合物１の単剤投与によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比が上昇した。さらに、化合物１の投与に抗LAG-3抗体を併用すると、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比は一層上昇した。一方、がん組織においても、図１０Ｂに示す如く、化合物１に抗LAG-3抗体を併用した群において、化合物１を単剤投与した場合と比較してCD8陽性Ｔ細胞/Treg比がさらに大きく上昇した。
［試験１２］
　さらに別の免疫調節剤に関し、化合物１との併用による効果を検討した。この試験１２では、T細胞の活性化分子であるGITRを刺激する抗GITR抗体を免疫調節剤として用いた。免疫調節剤以外の条件は上記試験１１と同じとした。
　担がんマウスとしてマウス黒色腫細胞株を移植したマウスを各群３匹ずつ用い、各担がんマウスに化合物１と抗GITR抗体を投与し、脾臓及びがん組織におけるCD8陽性T細胞及びTregの数をフローサイトメトリーにて計測し、CD8陽性Ｔ細胞/Tregの比を算出した（図１１Ａ、図１１Ｂ参照）。
　７週齢のC57BL/6系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、マウス黒色腫細胞株B16-F0を皮下移植した。腫瘍径が４～６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１又は抗GITR抗体（In VivoMab anti-mouse GITR、clone: DTA-1、Bio X Cell社より購入）、もしくはその両方の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のC57BL/6マウスを使用した。化合物１は経口投与により連日投与し、抗GITR抗体は合計３回、腹腔内に投与した。
　担がんマウスの各群における各剤の投与のタイミングは以下の通りである。
・溶媒のみを７日間、１日１回投与（vehicle）。
・化合物１を７日間、１日１回、５０［ｍｇ／ｋｇ］投与（化合物（１））。
・抗GITR抗体を、１日目、４日目および７日目に１０［ｍｇ／ｋｇ］投与（anti-GITR Ab）。
・化合物１を７日間、１日１回、５０［ｍｇ／ｋｇ］投与し、且つ抗GITR抗体を１日目、４日目および７日目に１０［ｍｇ／ｋｇ］投与（anti-GITR Ab + 化合物（１））。
　投与開始より８日後（Day 8）に脾臓とがん組織を回収し、氷冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ、又は氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）中でホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。
　続いて、上記試験１１と同様の手順により、フローサイトメーターを用いて測定を行った。細胞にCD3、CD4、CD8に対する各抗体を添加して反応させ、洗浄した後、細胞固定液に懸濁して固定した。固定細胞用洗浄液で細胞を洗浄し、Foxp3に対する抗体を添加して反応させた後、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁してセルカウント用ビーズと共にフローサイトメトリーに供した。
　図１１Ａに示す如く、脾臓においては、化合物１の単剤投与によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比が上昇したが、化合物１の投与に抗GITR抗体を併用すると、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比はさらに上昇した。がん組織においても、図１１Ｂに示す如く、化合物１に抗GITR抗体を併用した群において、化合物１を単剤投与した場合と比較してCD8陽性Ｔ細胞/Treg比がさらに大きく上昇した。
　以上の試験１０～１２より、化合物１と種々の免疫調節剤を組み合わせることで、それぞれを単剤投与する場合と比較して効果的に免疫反応を増強し得ることが確認された。
［試験１３］
　さらに本発明者らは、化合物１の投与による効果が免疫記憶を介して長期的に維持されることを見出した。本試験１３では、化合物１の単剤投与、および化合物１と免疫調節剤との併用投与により活性化されたがん免疫応答の機能が、免疫記憶により長期に維持されることをin vivoにて確認した。免疫調節剤としては抗PD-1抗体を用いた。
　上記試験１０において、化合物１単剤投与、抗PD-1抗体単剤投与または化合物１と抗PD-1抗体の併用投与により腫瘍が消失したマウスを対象に腫瘍を再度移植し、該腫瘍が増殖するか拒絶されるかを調べた。再移植された腫瘍が拒絶されれば、そのマウスでは腫瘍に対する免疫機能が免疫記憶により維持されていると考えることができる。
　図１２Ａ～１２Ｃに一点鎖線にて示す如く、試験１０において腫瘍を移植された各群のマウスのうち一部の個体で、薬剤の投与の結果、腫瘍（CMS5a-NYESO1細胞）の消失が確認された。腫瘍が消失した個体は、化合物１の単剤投与群において１匹、抗PD-1抗体の単剤投与群において３匹、両剤併用群において５匹であった。投与開始から６９日目、腫瘍の消失が見られた各群のマウスに対し、抗原性を高めるためNY-ESO-1遺伝子を導入したCMS5a細胞（CMS5a-NYESO1）を右腰に、NY-ESO-1遺伝子を導入していないCMS5a細胞（CMS5a）を左腰に、それぞれ皮下移植した。移植個数は、CMS5a-NYESO1細胞については一匹あたり２×１０7個、CMS5a細胞については一匹あたり２×１０6個とした。移植後、経日的に腫瘍径を計測した。
　図１２Ａ～図１２Ｃはそれぞれ、化合物１の単剤投与群、抗PD-1抗体の単剤投与群、両剤併用群における結果を示しており、６９日目以降の破線はCMS5a-NYESO1細胞の腫瘍体積、実線はCMS5a細胞の腫瘍体積をそれぞれ表している。再移植を行った全ての個体において、抗原性の高いCMS5a-NYESO1細胞は拒絶された（図１２Ａ～図１２Ｃ、破線参照）。これに対し、NY-ESO-1遺伝子を導入していないCMS5a細胞については、抗PD-1抗体の単剤投与群では全個体で顕著な増殖が認められたが（図１２Ｂ、実線参照）、化合物１の単剤投与群では1匹中1匹、化合物１と抗PD-1抗体の両剤併用群では5匹中4匹で腫瘍が拒絶された（図１２Ａ及び図１２Ｃ、実線参照）。
　このように、CMS5a-NYESO1細胞に対する免疫応答については、化合物１の単剤、抗PD-1抗体単剤および両剤併用の全ての場合において長期に記憶され得ることが確認された。一方、CMS5a細胞に対する反応は投与群によって異なり、抗PD-1抗体の単剤投与群では、CMS5a-NYESO1細胞は拒絶されたものの、CMS5a細胞は拒絶されなかった。抗PD-1抗体を単剤投与したマウスでは、CMS5a-NYESO1細胞が過剰発現しているNY-ESO-1への免疫のみが記憶されていると考えられる。これに対し、化合物１の単剤投与群および抗PD-1抗体との両剤併用群では、CMS5a-NYESO1細胞だけでなく、相対的に抗原性の低いCMS5a細胞も拒絶された。化合物１を単剤投与あるいは抗PD-1抗体と併用投与されたマウスでは、NY-ESO-1だけでなく、CMS5a細胞がもともと発現している抗原性の低い抗原に対する免疫も広範に記憶されていると考えられる。
［試験１４］
　試験１３において化合物１の免疫記憶に対する増強作用が示唆されたことから、次に化合物１によるメモリーＴ細胞の誘導作用について検討した。Ｔ細胞の免疫記憶を司るメモリーＴ細胞は、活性化したＴ細胞の一部から前駆細胞であるMPEC（memory precursor effector cell）を経て分化誘導されることが知られている。この試験１４では、ヒトCD8陽性Ｔ細胞を化合物１存在下でCMV、Melan-A、改変Melan-Aペプチドで刺激し、抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞におけるMPEC（memory precursor effector cell）の割合をフローサイトメトリーにて測定した。
　凍結ヒトPBMC（Cellular Technology Limited）を融解して２ ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に懸濁し、抗CD8抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD8陽性Ｔ細胞を単離した。そのネガティブフラクション（CD8陰性PBMC）から抗CD4抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD4陽性Ｔ細胞を除去し、残りの細胞（CD8陰性CD4陰性PBMC）を抗原提示細胞（APC）とした。APCをX-VIVO培地（LONZA社より購入）に懸濁し、２ｍＬチューブに1本あたり１×１０６～３×１０６個となるよう播種した。各種抗原ペプチド（CMV 、Melan-A、改変Melan-A）を１チューブあたりの液量が０．２５［ｍＬ］、最終濃度が１０μＭとなるよう添加し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養することでAPCに抗原ペプチドをパルスした。
　一方、単離したCD8陽性Ｔ細胞はRPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ　HEPES、４ｍＭ　Ｌ－グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5～２×１０5個となるよう播種し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養した。
　抗原ペプチドをパルスしたAPCを、３５Gyの放射線を照射して不活化した。CD8陽性Ｔ細胞を播種済みの９６ウェルプレートに、APCを１ウェルあたり約１×１０５～５ ×１０５個となるよう播種し、CD8陽性Ｔ細胞と混合した。各ウェルにIL-2（最終濃度１０[ＩＵ／ｍＬ]）、IL-7（最終濃度２０ ｎｇ／ｍＬ）および段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．２５～１ μＭ）を総液量が１ウェルあたり０．２ ｍＬとなるよう添加して二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２～３日毎に１００ μＬの培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同上の最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地を１００ μＬ添加した。
　培養後、各ウェル内の細胞をピペッティングにより剥がし、プレートを遠心して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに縣濁した。抗Fc?R抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、抗原ペプチド特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を添加し（５０倍希釈）、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8、KLRG1、CD127（IL-7R）に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて各がん抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞におけるMPECの割合を測定した。MPECは、活性化初期のＴ細胞中において、KLRG1陰性CD127（IL-7R）陽性細胞として検出することが出来る。
　図１３Ａ～１３Ｃは、それぞれCMV 、Melan-Aおよび改変Melan-Aにて処理した細胞群における各抗原に特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。各抗原に特異的なCD8陽性Ｔ細胞におけるMPECの割合は、化合物１の処理濃度が高いほど上がる傾向が見られた。以上より、化合物１の投与は免疫記憶を司るメモリーＴ細胞を増加させ得ることが示された。
　以上の試験１３、試験１４より、化合物１は広範な抗原に対してメモリーCD8陽性Ｔ細胞を増加させ、免疫記憶を増強させる作用を有するものと考えられる。このように、化合物１は腫瘍に対してＴ細胞による免疫応答を誘導すると共に、それに続く記憶応答をも誘導し得る。こうした結果は、免疫療法剤としての化合物１の長期的な臨床効果を示唆するものであり、ひいてはがん患者の長期生存を可能にすることが期待される。
　次に、本発明の免疫療法剤を哺乳類、とりわけヒトに適用する場合の投与方法、剤型、投与量について説明する。
　本発明の有効成分とする化合物は経口的又は非経口的に投与可能であり、経口投与の剤型としては錠剤、コーティング錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、シロップ剤が、又非経口投与の剤型としては注射剤（用時溶解して用いる注射用凍結乾燥剤を含む）、坐剤等が使用できる。これらの剤型の調製は薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、懸濁化剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤及び分散剤、例えば乳糖、白糖、澱粉、デキストリン、結晶セルロース、カオリン、炭酸カルシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、蒸溜水又は生理食塩水を用いて行われる。
　投与量は患者の症状、年齢、体重等に応じて異なるが、成人に対する一日量として１～１，０００［ｍｇ］を２～３回に分けて投与することができる。
本発明の免疫療法剤（化合物１）による免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞、CD4陽性CD25陰性細胞及びCD8陽性Ｔ細胞を培養した後の各Ｔ細胞サブセットにおける増殖性細胞の割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）による免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）によるPI3Kδ阻害の効果を他のPI3Kδ阻害剤と比較した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を各PI3Kδ阻害剤存在下で培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物２～４）によるeTregの増殖抑制効果を検討した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を各化合物存在下で培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物５～７）によるeTregの増殖抑制効果を検討した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を各化合物存在下で培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、各種の抗原ペプチドの存在下にて培養したPBMCにおける抗原特異的CTL/eTreg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、健常人由来のCD3陰性細胞とCD8陽性T細胞を抗原ペプチドの存在下にて共培養した系における抗原特異的CTLの細胞数を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（MAGE-A3）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（MAGE-A4）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（NYESO-1）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（WT-1）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、初回投与前の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、８日目の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、１５日目の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、２２日目の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、８日目のがん組織（TIL）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoでの腫瘍増殖への影響、及びこれに対する免疫系細胞の関与を解析した試験の結果を示すグラフであり、本発明の免疫療法剤を投与しない群における実験終了時の腫瘍体積を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoでの腫瘍増殖への影響、及びこれに対する免疫系細胞の関与を解析した試験の結果を示すグラフであり、本発明の免疫療法剤を投与した群における実験終了時の腫瘍体積を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗PD-1抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗PD-1抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中の抗原特異的CTL/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗LAG-3抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、脾臓（Spleen）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗LAG-3抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗GITR抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、脾臓（Spleen）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗GITR抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）の単剤投与および免疫調節剤（抗PD-1抗体）との併用投与の免疫記憶に対する効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、化合物１の単剤投与群に関する結果を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）の単剤投与および免疫調節剤（抗PD-1抗体）との併用投与の免疫記憶に対する効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、抗PD-1抗体の単剤投与群に関する結果を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）の単剤投与および免疫調節剤（抗PD-1抗体）との併用投与の免疫記憶に対する効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、化合物１と抗PD-1抗体の両剤併用群に関する結果を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のメモリーＴ細胞（MPEC）誘導作用を検討した試験の結果を示すグラフであり、抗原としてCMVを加えた細胞群における抗原特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のメモリーＴ細胞（MPEC）誘導作用を検討した試験の結果を示すグラフであり、抗原としてMelan-Aを加えた細胞群における抗原特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。 本発明の免疫療法剤（化合物１）のメモリーＴ細胞（MPEC）誘導作用を検討した試験の結果を示すグラフであり、抗原として改変Melan-Aを加えた細胞群における抗原特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。
　次に、特許文献１～３に記載の方法を用いて製造した、一般式(Ｉ)で示される複素環式化合物の一例を以下に示すが、本発明の有効成分はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
・２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン （化合物１）
(１)o-フェニレンジアミン（216.3ｇ, 2.00mol）とジフルオロ酢酸(201.7g, 2.10mol)を、2規定塩酸2.0L中で4時間加熱還流した。冷後、20Lの容器に移し、無水炭酸ナトリウムで中和すると、2-ジフルオロメチル-1H-ベンズイミダゾールが結晶として析出した。得た結晶を吸引ろ過し、水2Lで水洗し、風乾し、２－ジフルオロメチル-1H-ベンズイミダゾールを無色結晶として296.5g(1.76mol, 収率：88％, mp 127-130℃)得た。
MSｍ/ｚ：168（M+）
1H-MNR(CDCl3)δ:6.91(1H,t,J=54Hz),7.36-7.53(2H,m),7.56(1H,d,J=7Hz),7.86(1H,d, J=7Hz)
(２) 塩化シアヌル(230.5g, 1.25mol)をアセトン2.25Lに溶解した溶液に、モルホリン(98.0g, 1.13mol)とトリエチルアミン(113.0g, 1.13mol)をアセトン2.25Lに溶解させた混液を、内温5-10℃の反応温度を保つように滴下した。滴下終了後、反応溶液を氷水20Lに注ぎ込み、析出した結晶を吸引ロ過した。得た結晶をメタノール1.0Lでリスラリー洗浄を0.5時間行い吸引ろ過し、200mLのメタノールで洗浄した。減圧下デシケータ内で乾燥して２,4-ジクロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジンを無色結晶として238.1ｇ(1.01mol, 収率：90％, mp 145-147℃)得た。
 MSｍ/ｚ： 234（M+）
1H-MNR(CDCl3)δ:3.75(4H,t,J=4Hz),3.87(4H,t,J=4Hz )
(３) 2-ジフルオロメチル-1H-ベンズイミダゾール(168.1g, 1.00mol)と、２,4-ジクロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジン(235.1g, 1.00mol)をDMF（4.0 L）中、無水炭酸カリウム(138.2 g, 1.00mol)存在下、室温で4時間撹拌した。反応溶液を水6Lに注ぎ込み、析出した結晶を吸引ロ過した。得た結晶をDMF1.0Lに分散させ、リスラリー洗浄を0.5時間行い、吸引ロ過し、DMF0.5L、続いてアセトン1.0Lで結晶を洗浄した。減圧下デシケータ内で乾燥して1-(4-クロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジン-2-イル)-2-ジフルオロメチル)-1H-ベンズイミダゾールを無色結晶として300.2ｇ(0.82mol, 収率：82％, mp 245-246℃)得た。
MSｍ/ｚ：366（M+）
1H-MNR(CDCl3)δ:3.80-3.87(4H,m),3.94-4.01(4H,m),7.38-7.53(2H,m), 7.58(1H,t,J=54Hz), 7.90(1H,d, J=7Hz), 8.42(1H,d, J=7Hz)
(４) 1-(4-クロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジン-2-イル)-2-ジフルオロメチル)-1H-ベンズイミダゾール(293.4g,  0.80mol)を、モルホリン1742gに溶解し、80℃で3時間撹拌した。ロ液を水6Lに注ぎ込み、晶析した結晶を吸引ろ過した。結晶をエタノール1.0L用いてリスラリー洗浄を0.5時間行い、吸引ろ過した。
得た結晶をアセトン-エタノール（1：1(v/v)）8.0L中に加熱（内温63度）溶解し、溶液をろ紙を用いて自然ろ過した。ろ液を約1/2量まで減圧濃縮し、析出した結晶を吸引ろ過し、さらにエタノール0.5Lで洗浄した。減圧下デシケータ内で乾燥し、２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジンを無色結晶として290.0ｇ (0.69mol,  収率：86％,  mp 209-210℃)得た。
NMR(CD Cl3)δ：3.79(8H, t, J=4Hz), 3.88(8H, t, J=4Hz), 7.3-7.4(2H, m), 7.56(1H, t, J=53Hz), 7.88(1H, d, J=7Hz), 8.32(1H, d, J=7Hz)
MS m/z: 417(M+)
［実施例２］
　上記実施例の記載及び特許文献１～３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－Ｎ，Ｎ－ジ（２－ヒドロキシエチル）アミノ－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン（化合物２）
NMR(DMSO-d6)δ：3.67-3.82(16H,m), 4.78-4.87(2H,m), 7.42-7.48(2H,m), 7.83(1H, t, J=7Hz), 7.84(1H, d, J=7Hz), 8.37(1H,d, J=7Hz) 
MS m/z：436[M+H]+ 
［実施例３］
　上記実施例の記載及び特許文献１～３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２－（２－ジフルオロメチル－５－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン（化合物３）
NMR(CDC13)δ：3.7-3.9(16H, m), 7.26-7.29(2H, m), 7.54(1H, t, J=54Hz), 8.20(1H, d, 8Hz)
MS m/z：433(M+)
　[実施例４]
　上記実施例の記載及び特許文献１～３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－（２－ヒドロキシモルホリノ）－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン（化合物４）
NMR(CDCl3 )δ ：3.05(1H,brs), 3.72-4.10(13H,m), 4.13-4.19(1H,m), 5.10(1H,brd), 7.36-7.44(2H,m), 7.54(1H,t,J=54Hz), 7.87(1H,d、J=7Hz), 8.31(1H,d、J=7Hz) 
MS m/z：434[M+H]+ 
　[実施例５]
　上記実施例の記載及び特許文献１～３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－モルホリノ－６－（４－オキソピペリジノ）－１，３，５－トリアジン（化合物５）
NMR(CDCl3 )δ ：2.5-2.65(4H, m), 3.80-3.90(8H, m), 4.10-4.20(4H,m),7.27-7.45(2H,m), 7.56(1H, t, J=54Hz), 7.89(1H, d, J=7Hz),8.34(1H, d, J=7Hz) 
MS m/z：430[M+H]+
　[実施例６]
　上記実施例の記載及び特許文献１～３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２－（２－ジフルオロメチル－４－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４－（２－ヒドロキシメチルピロリジン－１－イル）－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン（化合物６）
NMR(CDCl3 )δ ： 1.9-2.1(4H,m), 3.5-4.0(12H, m), 4.7-4.8(1H,m), 5.1-5.3(1H,m), 6.89(1H, d, J=9Hz), 7.30(1H, t, J=9Hz), 7.50(1H,brs), 7.55(1H, t, J=54Hz), 7.83(1H, d, J=9Hz) 
MS m/z：447
　[実施例７]
　上記実施例の記載及び特許文献１～３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２－（２－ジフルオロメチル－４－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４－（３，３－ジメチルモルホリノ）－６－モルホリノピリミジン（化合物７）
融点：204-206℃
NMR(CDCl3 )δ ：1.48(6H,s),3.05(1H, s), 3.6-3.8(6H,m), 3.8-4.0(6H,m), 5.76(1H,s), 6.68(1H,d,J=7Hz),7.29(1H,t,J=7Hz), 7.49(1H,t,J=54Hz), 7.66(1H,dJ=7Hz), 
MS m/z:460(M+)
　本発明の免疫療法剤は、がんや感染症といった種々の疾患を対象とした免疫療法に利用することができる。

Claims (9)

  1. 　一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｘは窒素原子又はＣＨ；Ｒ１、Ｒ２は共に、或いはいずれかが水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アミノ基、Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、シアノ基、tert-ブチルジメチルシリルオキシ基、ニトロ基；Ｒ３は水素原子、ジフルオロメチル基、アミノ基、Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ基、メチル基、又はヒドロキシメチル基；Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基；Ｒ６はモルホリノ（１～２個のＣ１－Ｃ６アルキル基又はヒドロキシル基で置換されてもよい）、ピロリジニル（ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペリジノ（１～２個の酸素原子、ヒドロキシル基、ホルミル、Ｃ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペラジニル（環が１～２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１－Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）、１，４－ジアゼパノ（環が１～２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１－Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていても良い）、式－ＮＲ７Ｒ８（Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、又はカルボキシＣ１－Ｃ６アルキル基を表す）を表す］で示される複素環式化合物もしくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする免疫療法剤。
  2. 　Ｒ１及びＲ２は共に、或いはいずれかが水素原子又はヒドロキシル基であり、Ｒ３がジフルオロメチル基であり、Ｒ６はモルホリノ（１～２個のＣ１－Ｃ６アルキル基又はヒドロキシル基で置換されてもよい）、又は式－ＮＲ７Ｒ８（Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、又はカルボキシＣ１－Ｃ６アルキル基を表す）である、請求項１に記載の免疫療法剤。
  3. 　２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル)－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン、２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－Ｎ，Ｎ－ジ（２－ヒドロキシエチル）アミノ－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン、２－（２－ジフルオロメチル－５－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン、２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－（２－ヒドロキシモルホリノ）－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン、２－（２－ジフルオロメチルベンズイミダゾール－１－イル）－４－モルホリノ－６－（４－オキソピペリジノ）－１，３，５－トリアジン、２－（２－ジフルオロメチル－４－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４－（２－ヒドロキシメチルピロリジン－１－イル）－６－モルホリノ－１，３，５－トリアジン、２－（２－ジフルオロメチル－４－ヒドロキシベンズイミダゾール－１－イル）－４－（３，３－ジメチルモルホリノ）－６－モルホリノピリミジンの少なくともいずれかを有効成分とする免疫療法剤。
  4. 　免疫調節剤、免疫細胞療法剤又はワクチン療法剤と組み合わせて使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む免疫療法剤。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物もしくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩と、免疫調節剤とを、同時に又は別々に、もしくは経時的に投与するよう組み合わされた免疫療法剤。
  6. 　前記免疫調節剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-３抗体、抗OX-40抗体、抗TIGIT抗体、抗4-1BB抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗TIM3抗体、抗ICOS抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗CD28抗体、抗CD30抗体のいずれかから選択される、請求項４に記載の免疫療法剤。
  7. 　前記免疫調節剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-３抗体、抗OX-40抗体、抗TIGIT抗体、抗4-1BB抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗TIM3抗体、抗ICOS抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗CD28抗体、抗CD30抗体のいずれかから選択される、請求項５に記載の免疫療法剤。
  8. 　前記免疫調節剤が抗PD-1抗体、抗LAG-３抗体又は抗GITR抗体である、請求項５に記載の免疫療法剤。
  9. 　前記免疫調節剤が抗PD-1抗体、抗LAG-３抗体又は抗GITR抗体である、請求項５に記載の免疫療法剤。
PCT/JP2018/000519 2017-01-11 2018-01-11 免疫療法剤 WO2018131659A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018561418A JPWO2018131659A1 (ja) 2017-01-11 2018-01-11 免疫療法剤
CN201880006193.8A CN110198717A (zh) 2017-01-11 2018-01-11 免疫治疗药

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017002752 2017-01-11
JP2017-002752 2017-01-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018131659A1 true WO2018131659A1 (ja) 2018-07-19

Family

ID=62839592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/000519 WO2018131659A1 (ja) 2017-01-11 2018-01-11 免疫療法剤

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2018131659A1 (ja)
CN (1) CN110198717A (ja)
WO (1) WO2018131659A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002088112A1 (fr) * 2001-04-27 2002-11-07 Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha Compose heterocyclique et agent antitumoral contenant ce dernier en tant qu'ingredient actif
WO2006095906A1 (ja) * 2005-03-11 2006-09-14 Zenyaku Kogyo Kabushikikaisha 複素環式化合物を有効成分とする免疫抑制剤及び抗腫瘍剤
JP2015506698A (ja) * 2012-02-02 2015-03-05 カリフォルニア ステム セル インコーポレイテッド 多能性胚葉起源抗原を提示する癌ワクチン

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4493503B2 (ja) * 2002-10-25 2010-06-30 全薬工業株式会社 複素環式化合物及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤
US10426753B2 (en) * 2014-04-03 2019-10-01 Invictus Oncology Pvt. Ltd. Supramolecular combinatorial therapeutics

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002088112A1 (fr) * 2001-04-27 2002-11-07 Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha Compose heterocyclique et agent antitumoral contenant ce dernier en tant qu'ingredient actif
WO2006095906A1 (ja) * 2005-03-11 2006-09-14 Zenyaku Kogyo Kabushikikaisha 複素環式化合物を有効成分とする免疫抑制剤及び抗腫瘍剤
JP2015506698A (ja) * 2012-02-02 2015-03-05 カリフォルニア ステム セル インコーポレイテッド 多能性胚葉起源抗原を提示する癌ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
CN110198717A (zh) 2019-09-03
JPWO2018131659A1 (ja) 2019-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11401267B2 (en) Substituted benzyl-triazole compounds for Cbl-b inhibition, and further uses thereof
US11951133B2 (en) 3-substituted piperidine compounds for Cbl-b inhibition, and use thereof
US11530229B2 (en) Cyano cyclobutyl compounds for CBL-B inhibition and uses thereof
ES2915849T3 (es) Combinación de agente bloqueante de factor inmunosupresor y fármaco antidiabético de biguanida para su uso en un método de prevención de la progresión, del tratamiento y/o de la prevención del cáncer
US20230002730A1 (en) Improved targeted t-cell therapy
US20230089255A1 (en) Combinations of dgk inhibitors and checkpoint antagonists
TW202024053A (zh) 異喹啉化合物及其用途
US20210213066A1 (en) Improved cell therapy compositions for hematopoietic stem cell transplant patients
WO2018131659A1 (ja) 免疫療法剤
JP7074760B2 (ja) 抗腫瘍剤及び抗腫瘍効果増強剤
JP7482118B2 (ja) 癌の治療用のイソキノリン化合物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18739003

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018561418

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18739003

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1