WO2018114798A1 - Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen - Google Patents

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Anne-Sophie Rebstock
Leo MARX
Sarah WAGNER
Beatrix Stelte-Ludwig
Lisa Dietz
Hannah Joerissen
Christoph Mahlert
Simone Greven
Anette Sommer
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Bayer Aktiengesellschaft
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    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Definitions

  • the invention relates to novel prodrugs in which cytotoxic agents such as e.g. Kinesin spindle protein inhibitors are conjugated to groups selected selectively by
  • prodrugs or conjugates for the treatment and / or prevention of diseases as well as the use of these prodrugs for the production of medicaments for the treatment and / or prevention of diseases, in particular of hyperhidrosis.
  • proliferative and / or angiogenic diseases such as cancer.
  • Such treatments may be monotherapy or in combination with other medicines or other therapeutic measures.
  • Cancer cells often express certain proteases more than normal cells. This has led to attempts to increase the selectivity of cytotoxic drugs for cancer cells, in which the drugs are linked to groups that are cleaved from such proteases, thereby releasing the drug.
  • Legumain is an asparaginyl endopeptidase (S. Ishii, Methods Enzymol., 1994, 244, 604; JM Chen et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) and has been used to process prodrugs of small cytotoxic molecules such as Wox et al., Cancer Res., 2006, 66, 970; L. Stern et al; Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; KM Bajjuri et al., ChemMed Chem 201 1, 6; 54).
  • US 2015-0343083 A1 describes legumain-cleavable peptide-active substance conjugates of the formula RYZ-Asn-linker-D in which linker is p-aminobenzylcarbamoyl or p-aminobenzyl carbonate, R is a radical selected from different chemical groups D is a cytotoxic agent, Asn is the amino acid asparagine, Y is an amino acid selected from Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr and Phe and Z is an amino acid selected from Ala, Thr, Asn and Pro is, these being
  • the object of the present invention is to further improve the tumor selectivity of cytotoxic drugs.
  • the invention provides prodrugs of cytotoxic drug molecules.
  • a group cleavable by the enzyme leguminin is conjugated to the drug molecule, the drug and the legumable cleavable group being linked either directly via a covalent bond or via a self-immolative linker.
  • These prodrugs preferably contain a binder which, after binding to a receptor of a tumor cell, is internalized by the tumor cell and processed intracellularly (preferably lysosomally). This binder can either be modified with the legume-cleavable group
  • Active compound molecule may be connected via a linker, so that both groups (Legumain cleavable group and binder) must be processed independently of each other to form an active metabolite, or the binder may be connected to the cleavable by the Enyzm Legumain group optionally via a linker (see that after cleavage of the legume-cleavable group, the active ingredient is separate from the binder or a derivative thereof).
  • a kinesin spindle protein inhibitor (CSF inhibitor) is preferred.
  • CSF inhibitor kinesin spindle protein inhibitor
  • an antibody is preferred.
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • APDCs conjugates of prodrugs with antibodies
  • the legume-cleavable group used in the present invention, which is linked to the active ingredient, has a structural motif reduced to the amino acid asparagine.
  • the ADCs and APDCs of the invention exhibit only one amino acid (Asparagine) as an enzymatic cleavage site in the linker a high anti-tumor effect, the analogues with classical tripeptide substrates (three amino acids) in the linker
  • Amino acid building block (one amino acid) can be reduced. Even for closely related conjugates with amino acids such as glutamine or leucine instead of asparagine (see
  • the ADCs of the invention show a high preference for cleavage by a tumor-associated asparagine-cleaving protease such as legume.
  • the prodrugs of the invention have the following general formula
  • La is a self-immolative linker, n is 0 or 1;
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is preferably internalized by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally,
  • Lb is a linker, o and p are each independently 0 or 1, R is LIG- (L c ) e-,
  • LIG stands for a binder which, after binding to a receptor on a tumor cell, is preferably internalized by the tumor cell and processed intracellularly, preferably lysosomally,
  • Lc is a linker and e is 0 or 1 or
  • x is 0 or 1 v is an integer from 1 to 20; and for -H, -alkyl, -CH 2 -COOH, -CH 2 -CH 2 -COOH or
  • R 1 in the meaning of alkyl is preferably C 1 -C 12 -alkyl.
  • the binder (LIG) is an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, in particular an anti-TWEAKR antibody, an anti-EGFR antibody, an anti-B7H3 antibody or an anti-HER2 antibody or a Antigen-binding fragment of these.
  • anti-TWEAKR antibodies TPP-7006, TPP-7007 and TPP-10337, the anti-B7H3 antibodies TPP-8382 and TPP-8567, the anti-EGFR antibody cetuximab (TPP-981) and the anti HER2 antibodies trastuzumab and TPP-1015 or an antigen-binding fragment thereof.
  • the prodrugs according to the invention preferably contain a binder which can bind to a receptor of a tumor cell and is usually internalized after binding to the receptor by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally.
  • the binder may either be linked to the group cleavable by the enzyme legumain, if appropriate via a linker, so that after cleavage of the legume-cleavable group the active substance is present separately from the binder or a derivative thereof.
  • the compounds of embodiment A thus preferably have the following general formula III ':
  • n, e, LIG, La, Lc, and Di are those given in the general formula (Ia)
  • -D in the general formula (la) represents -D-
  • R in the general formula (Ia) represents LIG- (L c ) e - (Embodiment A).
  • the present invention preferably relates to compounds of the general formula (Ia) in which
  • La is a self-immolative linker, n is 0 or 1;
  • D - (Lb) 0 - (LIG) p, o and p are 0, represents a cytotoxic agent
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is preferably internalized by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally,
  • Lb stands for a linker
  • R stands for LIG (Lc) e -
  • LIG stands for a binder which, after binding to a receptor on a tumor cell, is preferably internalized by the tumor cell and processed intracellularly, preferably lysosomally,
  • Lc is a linker and e is 0 or 1.
  • the binder may optionally be linked to the drug molecule via a linker, so that after cleavage of the legumain-cleavable group of the drug is present together with the binder or a derivative thereof.
  • D represents in the general formula (la) -di- (L
  • 3) 0 -LIG represents and R in the general formula (la) represents Zi- (C ( 0)) q is (Embodiment B).
  • n, o, LIG, La, Lb and Di are those given in the general formula (Ia)
  • the present invention preferably relates to compounds of the general formula (Ia) in which
  • La is a self-immolative linker, n is 0 or 1;
  • D is di- (Lb) 0 - (LIG) p , o is 0 or 1 p is 1, Di is a cytotoxic agent,
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is preferably internalized by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally,
  • Lb is a linker
  • Zi is a Ci-10-alkyl, C 5 -io-aryl, C 6 -io-aryl-Ci- 6 -alkyl-, C3-10-
  • 0 or 1 is a number from 1 to 20 and for -H, -alkyl, -CH 2 -COOH, -CH 2 -CH 2 -COOH, or
  • Fig. 1 shows the strategy of transglutaminase-catalyzed
  • Fig. 2 shows annotated sequences of preferred antibodies for binder drug
  • Conjugates Shown are the protein sequences of the heavy and light chains of the IgGs, as well as the VH and VL regions of these antibodies. Below the sequences, important regions are annotated (VH and VL regions in IgGs, and the CDR regions (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).
  • Figure 3 shows the sequence listing of sequences of the preferred antibodies for binder-drug conjugates and sequences of the target proteins.
  • legume cleavable groups which can be used according to the invention and the cytotoxic active compounds D, which may optionally have a soap immolative links are described.
  • the preferred binder according to the invention LIG which is internalized after binding to a receptor of a tumor cell of the tumor cell and intracellularly (preferably lysosomally) is processed, described.
  • the various elements of the compounds of the invention can be used without limitation in any combination.
  • the active compounds D which are in each case described as being preferred or particularly preferred, may be used in combination with the binders LIG, each of which is illustrated as being preferred or particularly preferred, if appropriate in combination with the respective preferred or
  • the compounds of the general formula (Ia) according to the invention have a legume-cleavable group of the formula (Ia ')
  • n 0 or 1
  • # 1 represents binding to the cytotoxic agent (cytotoxic agent)
  • R stands for LIG- (L c ) e-
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is preferably internalized by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally,
  • Lc is a linker and e is 0 or 1, or
  • Zi is a Ci-10-alkyl, C 5 -io-aryl, Ce-io-aryl-Ci-e-alkyl, C3-10-
  • Heteroalkyl Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, C5-io-heteroaryl-Ci-6-alkyl, Cs-io-heteroaryl-alkoxy,
  • R 1 is -H, -alkyl, -CH 2 -COOH, -CH 2 -CH 2 -COOH, or -CH 2 -CH 2 -NH 2 .
  • R 1 in the meaning of alkyl is preferably C 1 -C 12 -alkyl.
  • leguminin-cleavable group of formula Ia ' is also referred to as a legume-cleavable protecting group (embodiment B).
  • q is preferably 1.
  • Zi particularly preferably represents a Ci-3-alkyl, C6-7-aryl-Ci-6-alkyl, C5-6-heteroaryl-Ci-3-alkyl, or C6-7-aryl-Ci-6-alkoxy Group which may be monosubstituted or polysubstituted, identically or differently, by -COOH, -C ( O) - or -OH.
  • the release of the active substance can take place according to various mechanisms, for example after initial enzymatic release of a nucleophilic group by subsequent elimination via an electronic cascade (Bioorg.Med.Chem., 1999, 7, 1597, J.Med.Chem., 2002, 45 . 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71) or by cyclization of the corresponding linker element (Bioorg.Med.Chem., 2003, 11, 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem Lett, 2007, 17, 2241) or by a combination of both (Angew Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Examples of such linker elements are shown in the figure:
  • # 1 is the bond to the carbonyl group and # 2 is the bond to the hydroxyl or
  • LIG represents a binder that binds to a receptor
  • Tumor cell is preferably internalized by the tumor cell and processed intracellularly and preferably lysosomally,
  • Lb is a linker and o and p are independently 0 or 1.
  • Mitomycin, doxorubicin, aminopterin, actinomycin, bleomycin, 9-amino-camptothecin, n8-acetyl-spermidine, 1- (2-chloroethyl) -1,2-dimethanesulfonyl-hydrazide, tallysomycin, cytarabine, etoposide, camptothecin are preferably used as the cytotoxic agent , Taxol, esperamicin, podophyllotoxin, anguidine, vincristine, vinblastine, morpholine-doxorubicin, n- (5,5-diacetoxy-pentyl) -doxorubicin, duocarmycin, auristatin, monomethylauristatin, dolastatin, tubulysin, maytansinoid, cryptophycin, amanitine, pyrrolobenzodiazepine derivatives , Indolinobenzodiazep
  • a corresponding derivatization of these active ingredients can be carried out on the basis of known methods (see, for example, Synthesis, 1999, 1505 with respect to duocarmycin, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 337, Journal of Med. Chem., 2010, 53 (3), 1043 with regard to camptothecin, ChemMedChem, 201 1, 6 (1), 54 with respect to auristatin, Mol. Cancer, Thier., 2005, 4, 751 with respect to doxorubicin and J. Biol. Chem., 2008, 283, 9318. Pyrrolobenzodiazepine derivatives (PBD derivatives), see J. Med. Chem 2013, 56, 7564 and further references in the introduction, J. Med. Chem. 2001, 44, 1341, Oncology Reports 201 1, 26, 629)).
  • This group of drugs includes e.g. Doxorubicin which has the following formula:
  • Active ingredients cytotoxic agents
  • cytotoxic agents as e.g. in International Patent Application WO2015 / 096982.
  • kinesin spindle protein inhibitors of the following formula (II) are cytotoxic agents:
  • X 3 is C
  • X 3 is N
  • X 3 is N
  • X 3 is C
  • X 3 stands for C.
  • R 1 is -H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) o- 3 Z,
  • Halogen atoms one to three mono-, di- or tri-halogenated
  • Alkyl groups one to three -O-alkyl groups, one to three -SH-
  • Y 1 and Y 2 independently of one another represent -H, -IMH 2, or - (CH 2) o-3Z ',
  • R 5 is -H, -IMH 2, -NO 2, halogen, -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, -SH or - (CH 2 ) o-3Z,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another represent -H, -IMH 2, or - (CH 2) o-3Z ',
  • Y 3 is -H or - (CH 2 ) o- 3 Z '
  • R 6 and R 7 are each independently -H, -CN, C 1-10 -alkyl, fluoro-C 1-10 -alkyl .
  • R 8 represents straight-chain or branched C 1-10 -alkyl, fluoro-C 1-10 -alkyl,
  • Heteroatoms selected from N, O and S which may be substituted by -OH, -COOH, -NH2 or -L- # 1,
  • R 9 is -H, -F, -CH 3 , -CF 3 , -CH 2 F or -CHF 2 ,
  • -L- # 1 stands for - (Lb) 0 - (LIG) P ,
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is internalized by the tumor cell and is processed intracellularly and preferably lysosomally,
  • Lb stands for a linker
  • o and p are independently 0 or 1
  • -MOD is - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3
  • R 10 is -H or C 1 -C 3 -alkyl-
  • o 0 or 1
  • Sulfonic acid may be substituted
  • R y is -H, phenyl, C-
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • Rx for -H, C-
  • G3 is -H or -COOH
  • -MOD has at least one, preferably two -COOH groups, and an amino group in -MOD with the legumain-cleavable group of the formula (la ') may be acylated, and their salts, solvates and salts of the solvates.
  • Preferred compounds are those in which
  • R 3 is L- # 1 or a C 1-10 alkyl, C 6-10 aryl or C 6-10 aralkyl, C 5-10
  • Heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group having one to three OH groups, one to three halogen atoms, one to three mono-, di- or tri-halogenated alkyl groups, one to three -O-alkyl groups, one to three -SH- Groups, one to three -S-alkyl groups, one to three -O-C ( O) -alkyl
  • n 0, 1 or 2
  • X 3 stands for N.
  • kinesin spindle protein inhibitors used according to the invention have an amino group which is essential for the action.
  • this amino group By modifying this amino group with peptide derivatives or asparagine derivatives, the action against the kinesin spindle protein is blocked and thus also the unfolding of a cytotoxic effect is inhibited.
  • this peptide residue can be released by tumor-associated enzymes such as legume, the effect can be selectively restored in the tumor tissue. definitions
  • substituted means that one or more hydrogens on the designated atom or group are replaced by a selection from the group indicated, provided that the normal valence of the designated atom has not been exceeded under the present circumstances becomes.
  • optionally substituted means that the number of substituents may be the same or different from 0. Unless otherwise indicated, optionally substituted groups may be substituted by as many optional substituents as may be substituted by replacement of a hydrogen by a non-hydrogen substituent. Typically, the number of optional substituents (if present) may be 1, 2, 3, 4, or 5, especially 1, 2, or 3. As used herein, in the definition of the substituents of the compounds of the general formulas of the present invention, the term “one or more times” means "1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1, 2, 3 or 4, more preferably 1 , 2 or 3, most preferably 1 or 2 ".
  • radicals are substituted in the compounds according to the invention, the radicals can, unless stated otherwise, be monosubstituted or polysubstituted.
  • the meanings of all residues that occur multiple times are independent of each other. Substitution by one, two or three identical or different substituents is preferred. Substitution by a substituent is particularly preferred.
  • Alkyl is a linear or branched, saturated, monovalent
  • Hydrocarbon radical having 1 to 10 carbon atoms (C 1 -C 10 -alkyl), generally 1 to 6 (C 1 -C 6 -alkyl), preferably 1 to 4 (C 1 -C 4 -alkyl), and particularly preferably 1 to 3
  • Carbon atoms (Ci-C 3 alkyl).
  • Particularly preferred is a methyl, ethyl, propyl, isopropyl and tert-butyl radical.
  • Heteroalkyl is a straight-chain and / or branched hydrocarbon chain having 1 to 10 carbon atoms, which is mono- or polysubstituted by one or more of
  • R x is -H, C 1 -C 6 -alkyl or phenyl.
  • Alkenyl is a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one or two double bonds and 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -Cio-alkenyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (C 2 -C3 alkenyl), it being understood that when the alkenyl group contains more than one double bond, the
  • Double bonds can be isolated from each other or conjugated with each other.
  • the alkenyl group is, for example, an ethenyl (or vinyl),
  • Prop-2-en-1-yl (or “allyl”), prop-1 -en-1-yl, but-3-enyl, but-2-enyl, but-1-ynyl , Pent-4-enyl, pent-3-enyl, pent-2-enyl, pent-1-enyl, hex-5-enyl, hex-4-enyl,
  • Penta-1, 4-dienyl or hexa-1 -5-dienyl group is vinyl or allyl.
  • Alkynyl represents a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one triple bond and having 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -C 10 -alkynyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (C 2 -C 3) alkynyl).
  • C2-C6-alkynyl group is, for example, an ethynyl, prop-1-vinyl,
  • Prop-2-ynyl (or propargyl), but-1-ynyl, but-2-ynyl, but-3-ynyl, pent-1-ynyl, pent-2-ynyl, pentyl 3-inyl, pent-4-ynyl, hex-1-ynyl, hex-2-ynyl, hex-3-ynyl, hex-4-ynyl, hex-5-ynyl, 1-methylprop 2-inyl, 2-methylbut-3-ynyl, 1-methylbut-3-ynyl, 1-methylbut-2-ynyl,
  • alkynyl group is ethynyl, prop-1-ynyl or prop-2-ynyl.
  • Cycloalkyl is a saturated monohydric mono- or bicyclic
  • Hydrocarbon radical having 3-12 carbon atoms (C3-Ci2-cycloalkyl).
  • a monocyclic hydrocarbon radical is a monovalent
  • Hydrocarbon radical having generally 3 to 10 (C 3 -C 10 -cycloalkyl), preferably 3 to 8 (C 5 -C 8 -cycloalkyl), and more preferably 3 to 7 (C 3 -C 7 -cycloalkyl)
  • cyclopropyl cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and cyclooctyl
  • Particular preference is given to a cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl.
  • bicyclic hydrocarbon radical for a hydrocarbon radical having usually 3 to 12 carbon atoms (C3-Ci2-cycloalkyl), which in this case is a fusion of two saturated ring systems to understand that share two directly adjacent atoms.
  • Hydrocarbon radicals may be mentioned: bicyclo [2.2.0] hexyl, bicyclo [3.3.0] octyl,
  • Heterocycloalkyl is a non-aromatic mono- or bicyclic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different. As heteroatoms nitrogen atoms, oxygen atoms or sulfur atoms can occur.
  • a monocyclic ring system according to the present invention may have 3 to 8, preferably 4 to 7, particularly preferably 5 or 6 ring atoms.
  • heterocycloalkyl having 3 ring atoms are: Aziridinyl
  • heterocycloalkyl having 4 ring atoms examples and preferred are: Acetidinyl, Oxetanyk
  • heterocycloalkyl having 5 ring atoms examples include: pyrrolidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, pyrrolinyl, dioxolanyl and tetrahydrofuranyl
  • heterocycloalkyl having 6 ring atoms examples and preferred are: piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, dioxanyl, tetrahydropyranyl and
  • heterocycloalkyl having 7 ring atoms are: azepanyl, oxepanyl, 1, 3-diazepanyl, 1, 4-diazepanyk
  • heterocycloalkyl having 8 ring atoms Exemplary and preferred for a heterocycloalkyl having 8 ring atoms are: oxocanyl, Azocanyk
  • monocyclic heterocycloalkyl are 4 to 7-membered saturated
  • Heterocyclyl radicals having up to two heteroatoms from the series O, N and S are preferred. Particularly preferred are morpholinyl, piperidinyl, pyrrolidinyl and Tetrahydrofuranyk
  • a bicyclic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different, may according to the present invention have from 6 to 12, preferably 6 to 10 ring atoms, with one, two, three or four carbon atoms against the same or different heteroatoms from the series O, N and S can be exchanged.
  • Examples include: azabicyclo [3.3.0] octyl, azabicyclo [4.3.0] nonyl,
  • perhydrocyclopenta [c] pyrrolyl perhydrofuro [3,2-c] pyridinyl, perhydropyrrolo [1,2-a] pyrazinyl, perhydropyrrolo [3,4-c] pyrrolyl and 3,4-methylenedioxyphenyl.
  • heterocycloalkoxy is particularly preferred.
  • Heterocycloalkoxy is heterocycloalkyl which is connected via an -O- group to the remainder of the molecule.
  • Alkoxy represents a linear or branched, saturated alkyl ether radical of the formula -O-alkyl having generally 1 to 6 (C 1 -C 6 -alkoxy), preferably 1 to 4 (C 1 -C 4 -alkoxy), and particularly preferably 1 to 3 ( C 1 -C 3 -alkoxy) carbon atoms.
  • Aryl is a monovalent, mono- or bicyclic, aromatic carbon ring system consisting of carbon atoms. Examples are naphthyl and phenyl; preferred is phenyl or a phenyl radical.
  • Heteroaryl means a monovalent monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic ring system having 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14 ring atoms (a "5- to 14-membered heteroaryl" group), in particular 5, 6, 9 or 10 ring atoms, which contains at least one ring heteroatom and optionally one, two or three further ring heteroatoms from the group N, O and S and which is bonded via a ring carbon atom or optionally (if it allows the valency) via a ring nitrogen atom.
  • the heteroaryl group may be a 5-membered heteroaryl group such as thienyl, furyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl or tetrazolyl; or a 6-membered heteroaryl group such as pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl or triazinyl; or a tricyclic heteroaryl group such as carbazolyl, acridinyl or phenazinyl; or a 9-membered heteroaryl group such as, for example, benzofuranyl, benzothienyl, benzoxazolyl, benzisoxazolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl,
  • heteroaryl radicals include all possible isomeric forms thereof, e.g. Tautomers and positional isomers with respect to the point of attachment to the remainder of the molecule.
  • pyridinyl includes pyridin-2-yl, pyridin-3-yl and pyridin-4-yl; or the term thienyl includes thien-2-yl and thien-3-yl.
  • the binding valency may be on any aromatic compound
  • Carbon atom or on a nitrogen atom Carbon atom or on a nitrogen atom.
  • a monocyclic heteroaryl group according to the present invention has 5 or 6 ring atoms.
  • heteroaryl radicals having one or two heteroatoms Preference is given to those heteroaryl radicals having one or two heteroatoms. Particularly preferred are one or two nitrogen atoms.
  • heteroaryl radicals having 5 ring atoms include the rings:
  • Oxadiazolyl triazolyl, tetrazolyl and thiadiazolyl.
  • Heteroaryl radicals having 6 ring atoms include, for example, the rings: Pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl and triazinyl.
  • a bicyclic heteroaryl group according to the present invention has 9 or 10
  • heteroaryl radicals having 9 ring atoms include the rings:
  • Heteroaryl radicals with 10 ring atoms include, for example, the rings:
  • Heteroaryl-alkyl is a linear or branched, saturated, monovalent hydrocarbon radical having 1 to 10 carbon atoms (C 1 -C 10 -alkyl), to which a heteroaryl radical is bound as defined above.
  • a heteroaryl radical is bound as defined above.
  • this is meant e.g. a group C5-io-heteroaryl-Ci-6-alkyl
  • aralkoxy or arylalkoxy is meant a linear or branched, saturated, monovalent hydrocarbon radical having 1 to 10 carbon atoms (C 1 -C 10 -alkyl), to which an aryl radical as defined above is bonded.
  • aryl radical as defined above is bonded.
  • this is meant e.g. a group C6-io-aryl-Ci-6-alkoxy-.
  • Aryloxy represents an aryl radical, the formula aryl-O-.
  • the hydrocarbon chain including the
  • R y is in each case -H, phenyl, C-
  • R x is -H, C 1 -C 6 -alkyl or phenyl.
  • Halogen or halogen atom in the context of the invention is fluorine (-F), chlorine (-CI), bromine (-Br), or iodine (-1).
  • the kinesin spindle protein inhibitors (cytotoxic agent) of the present invention preferably have the following formula (IIa):
  • X 3 is N
  • Xs stands for C.
  • R 1 is -H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Y 1 and Y 2 are independently -H, -NH 2 , - ( ⁇ 2 ⁇ 2 0) ⁇ -3- ( ⁇ 2 ) ⁇ -3 ⁇ '
  • w is -H or -OH
  • ⁇ 4 is linear or branched Ci-6 alkyl, optionally with
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 independently of one another represent -H, -NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ',
  • ⁇ 3 is -H or - (CH 2 ) o- 3 Z '
  • ⁇ 4 is linear or branched C1-6 alkyl, optionally with
  • ⁇ 6 is linear or branched C 1-6 alkyl, -MOD, -L- # 1, or an optionally substituted alkyl,
  • Ci-10-alkyl fluoro-Ci-10 alkyl, C 2- io-alkenyl -, fluoro- C 2- io-alkenyl, C 2- io-alkynyl, fluoro-C 2-io-alkynyl, hydroxy, -N0 2, -NH 2, -COOH, or halogen, represent straight-chain or branched Ci-10-alkyl, fluoro-Ci-10 alkyl, C 2- io alkenyl, C 2- fluoro-io alkenyl, C 2- io-alkynyl or fluoro-C 2-io-alkynyl , or is C4-io-cycloalkyl, fluoro-C4-io-cycloalkyl or - (CH 2 ) o- 2 - (HZ 2 ),
  • R 9 is -H, -F, -CH 3 , -CF 3 , -CH 2 F or -CHF 2 ,
  • -L- # 1 stands for - (Lb) 0 - (LIG) P ,
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is internalized by the tumor cell and is processed intracellularly and preferably lysosomally,
  • Lb stands for a linker, o and p are independently 0 or 1,
  • -MOD is - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3
  • R 10 is -H or Ci-C 3 alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • R y is -H, phenyl, C-
  • 0 "alkynyl, each containing -NH-C ( O) -NH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , sulfonamide, sulfone,
  • Rx for -H, C-
  • G3 is -H or -COOH
  • -MOD has at least one, preferably two -COOH groups and
  • an amino group in -MOD may be acylated with the legume-cleavable group of formula (Ia '),
  • R 3 is L- # 1 or a C 1-10 alkyl, C 6-10 aryl or C 6-10 aralkyl, C 5-10
  • Xi is CH or CF
  • Xi is NH
  • Xi stands for CH
  • Xi stands for CH
  • R 1 is preferably - MOD.
  • R 4 is -L- # 1 and R 1 is -MOD if R 3 is not -MOD.
  • R 2 is preferably -H.
  • R 3 is preferably
  • Alkyl here is preferably C 1 -C 3 -alkyl
  • R 5 is preferably -H or -F.
  • R 6 and R 7 are each independently -H, Ci-io-alkyl, fluoro-Ci-io-alkyl, C 2 -io-alkenyl, fluoro-C 2 -io-alkenyl -, C 2 -io-alkynyl, fluoro-C 2-io-alkynyl, hydroxy or halogen.
  • R 8 is the group-C (CHs) 2- (CH 2) -R y , wherein R y is -H.
  • R 9 is preferably -H or -F.
  • -MOD is preferably the group
  • x is a number from 2 to 6
  • -MOD is particularly preferably the group
  • a binder which is bound to a receptor of a tumor cell internalized by the tumor cell and processed intracellularly and preferably lysosomally, is a linker independently of one another representing 0 or 1 which represents - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3 , is -H or C 1 -C 3 -alkyl, is 0 or 1,
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • R 5 is -H
  • R 6 and R 7 are fluorine
  • R 8 is t-butyl
  • R 9 is -H
  • -L- # 1 stands for - (Lb) 0 - (LIG) P ,
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is internalized by the tumor cell and is processed intracellularly and preferably lysosomally,
  • Lb stands for a linker
  • o and p independently of one another are 0 or 1, and their salts, solvates and salts of the solvates.
  • Ci-3-alkyl is particularly preferred.
  • X 3 is N
  • R 1 is -L- # 1, -H, or -MO D
  • LIG stands for a binder which, after binding to a receptor of a tumor cell, is internalized by the tumor cell and processed intracellularly and preferably lysosomally.
  • Lb is a linker, o and p independently of one another are 0 or 1, -MOD is the group - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3,
  • R 10 is -H or C 1 -C 3 -alkyl, n is 0,
  • R y is -H or C-
  • C 0 alkyl which is substituted by -NH-C ( O) -NH 2 , -COOH,
  • R 2 is -H, for -L- # 1, R 4 for the legume-cleavable group of formulas (la ')
  • R 5 is -H
  • R 6 and R 7 are fluorine
  • R 8 is t-butyl
  • R 9 is -H
  • -L- # 1 stands for - (Lb) 0 - (LIG) P ,
  • LIG stands for a binder that binds to a receptor after binding
  • Tumor cell is internalized by the tumor cell and is processed intracellularly and preferably lysosomally,
  • Lb stands for a linker
  • o and p are independently 0 or 1
  • X 3 is N
  • X 3 is N
  • X 3 is C
  • X 3 stands for C.
  • R 1 is -MOD
  • -MOD is the group - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3
  • R y is -H, phenyl, C-
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • Rx for -H, C-
  • G3 stands for -H or -COOH
  • R 2 is -H
  • R 4 is -H
  • R 5 is -H, -NH 2 , -NO 2 , halogen, -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, -SH or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are -H, -NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ',
  • Y 3 is -H or - (CH 2 ) o- 3 Z '
  • R 6 and R 7 independently of one another are -H, -CN, C 1 -10-alkyl, fluoro-C 1 -10-alkyl,
  • C 2- io-alkenyl, C 2- fluoro-io alkenyl, C 2- io-alkynyl, fluoro-C 2-io alkynyl, hydroxy, -N0 2, -NH 2, -COOH or Halogen stand, for straight-chain or branched C 1-10 -alkyl, fluoro-C 1-10 -alkyl, C 2-10 -alkenyl, fluoro-C 2-10 -alkenyl, C 2-10 -alkynyl or fluorinated C 2-1 -alkynyl-, or is C4-io-cycloalkyl- or fluoro-C4-io-cycloalkyl-,
  • X 3 is N
  • R 1 is -MOD
  • -MOD is the group - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3
  • R 10 is -H or C 1 -C 3 -alkyl, n is 0,
  • Sulfonic acid may be substituted
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • X 3 is C
  • X 3 is N
  • X 3 is N
  • X 3 is C
  • X 3 stands for C.
  • Sulfonic acid may be substituted
  • R y is -H, phenyl, C-
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • Rx for -H, C-
  • R 2 is -H
  • R 3 represents an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl,
  • R 4 is -H
  • R 5 is -H, -IMH 2, -NO 2, halo, -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, -SH or - (CH 2 ) o -3Z stands,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are -H, -IMH 2, or - (CH 2 ) o-3Z ', Y 3 is -H or - (CH 2 ) o- 3 Z',
  • R 6 and R 7 independently of one another are -H, -CN, C 1 -10-alkyl, fluoro-C 1 -10-alkyl,
  • R 8 represents straight-chain or branched C 1-10 -alkyl, fluoro-C 1-10 -alkyl,
  • R 9 is -H, -F, -CH 3 , -CF 3 , -CH 2 F or -CHF 2 , and their salts, solvates and salts of the solvates.
  • R 9 is -H, -F, -CH 3 , -CF 3 , -CH 2 F or -CHF 2 , and their salts, solvates and salts of the solvates.
  • X 3 is N
  • R 1 is the group * - (G 1 ) 0 -G 2 -NH- ** ,
  • R y is -H, phenyl, C-
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • R 4 is -H
  • R 5 is -H
  • R 6 and R 7 are fluorine
  • R 8 is t-butyl
  • R 9 is -H
  • R 1 is -H, -L- # 1, -COOH
  • R 2 is -H
  • -CH (CH 3) OCH 3 a phenyl group which may be substituted by one to three halogen atoms, one to three amino groups, one to three alkyl groups or one to three haloalkyl groups,
  • x is 0 or 1
  • Y 5 is -H or -NHY 6 ,
  • R 6 and R 7 independently of one another are -H, C 1-3 -alkyl or halogen
  • R 8 is Ci-4-alkyl-
  • R 9 stands for -H.
  • R 6 and R 7 independently of one another represent hydrogen or fluorine
  • R 8 is tert-butyl
  • R 1 is -H, -COOH
  • R 2 is -H
  • Y 5 is -H or -NHY 6 ,
  • R 6 and R 7 independently of one another are -H, C 1-3 -alkyl or halogen
  • R 8 is C 1-4 -alkyl
  • R 9 is -H
  • R 6 and R 7 are -F and
  • R 8 is tert-butyl
  • R 7 , R 8 and R 9 have the meanings given in the general formula (IIa) and
  • B represents a single bond, -O-CH 2 - or -CH 2 -O-,
  • R 20 is -NH 2 , -F, -CF 3 , or -CH 3 and
  • n 0, 1, or 2.
  • Preferred compounds of this type are those of the general formula (IIb) in which X.sup.1 is CH,
  • X 3 stands for N.
  • X 1 , X 2 , X 3 A, R 1 , R 3 , R 4 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 are as defined in general formula (IIa)
  • Preferred compounds of this type are those of the general formula (IIc) in which X.sup.1 is CH,
  • X 2 is C, X 3 is N,
  • R 3 is -CH 2 OH, -CH 2 OCH 3 , -CH (CH 3 ) OH or -CH (CH 3 ) OCH 3 .
  • Xi stands for CH
  • X 2 is C
  • X 3 is N
  • R 3 is -CH 2 -S x - (CH 2 ) o-4-CHY 5 -COOH
  • x is 0 or 1
  • Y 5 stands for -H or -NHY 6
  • R 1 is - (CH 2 ) o- 3 Z
  • Y 1 is -H, -NH 2 , or - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3 Z ';
  • Y 2 is - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) 0 -3Z 'and
  • Y 2 is - (CH 2 CH 2 O) 3 -CH 2 CH 2 Z 'and
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z '
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z '
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z '
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z '
  • Y 4 is aryl or benzyl optionally substituted with -NH 2 ; Y 4 is aminobenzyl;
  • R 2 is - (CH 2 ) o- 3 Z
  • Y 3 has the meaning given above;
  • Y 5 is -H
  • Y 4 and Y 6 have the meanings given above; Y 4 is linear or branched C 1-6 alkyl, optionally with
  • -MOD is - (NR 10) n - (G) o- G2 - G3 is,
  • R 10 is -H or C 1 -C 3 -alkyl
  • o 0 or 1
  • R y is -H, phenyl, C-
  • o-alkynyl, each containing -NH-C ( O) -NH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , sulfonamide,
  • Sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted, Rx for -H, C-
  • G3 is -H or -COOH
  • group -MOD preferably has at least one or preferably two -COOH groups, and an amino group in -MOD can be acylated with the legumain-cleavable group of the formula (Ia ').
  • the group -MOD has at least one -COOH group, e.g. in a beta group.
  • this -COOH group is terminal all the time.
  • the group -MOD is the group
  • x is 0 or 1
  • Y 5 stands for -H or -NHY 6
  • X 2 stands for N and X 3 is C
  • X 3 is N
  • Xi is CH or CF
  • X 3 is N
  • Xi is NH
  • X 3 is C
  • Xi is CH or CF
  • X 3 is C, -H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) o- 3 Z,
  • R 6 and R 7 independently of one another are -H, -CN, C 1 -10-alkyl, fluoro-C 1 -10-alkyl,
  • R 8 represents straight-chain or branched C 1-10 -alkyl, fluoro-C 1-10 -alkyl, C 2-10-
  • R 9 is Is -H, -F, -CH 3 , -CF 3 , -CH 2 F or -CHF 2 ,
  • -MOD is the group - (NR 10 ) n - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3
  • R 10 is -H or C 1 -C 3 -alkyl-
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • C 3 alkyl or phenyl stands,
  • G3 is -H or -COOH and wherein the group -MOD preferably has at least one group -COOH and in which R 1 and R 3 are not simultaneously -L- # 1,
  • Xi stands for CH
  • X 3 stands for N.
  • particular preference is furthermore given to the compounds of the general formulas (I la), (Ib), (Ib) and (Idb) in which, for a Ci-10-alkyl, C6-io-aryl, C6-io Aralkyl, Cs-io-heteroalkyl,
  • X 3 is C
  • X 3 is N
  • Xi is CH or CF
  • X 3 is N
  • X 3 is C
  • Xi is CH or CF
  • X 3 is C, -H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) o- 3 Z,
  • R 3 is L- # 1, -MOD or an alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl,
  • -H, -S ( O) 3 H, -IMH2 or -COOH, independently of one another represent -H or halogen, represents straight-chain or branched C 1-10 -alkyl or fluoro-C 1-10 -alkyl-, is -H, -F, -CH 3 , -CF 3 , -CH 2 F or -CHF 2 , the group - (Lb) 0 - (LIG) P is, stands for a binder which, after binding to a Receptor one
  • Tumor cell is internalized by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally, is a linker, o and p are each independently 0 or 1, -MOD is -CH 2 -Sx- (CH 2 ) o-4-CHY 5 -COOH,
  • x is 0 or 1
  • Y 5 is -H or -NHY 6 ,
  • R 1 and R 3 are not simultaneously L- # 1, and their salts, solvates and salts of the solvates.
  • Xi stands for CH
  • X 3 stands for N.
  • R 3 is a C 1-10 -alkyl-, C 6-10 -aryl or C 6-10 -aralkyl- , Cs-io-heteroalkyl-,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another represent -H, -IM H2, or - (CH 2) o-3Z ',
  • alkyl is preferably C1-C10-alkyl.
  • halogen is fluorine (-F), chlorine (-CI) and bromine (-Br).
  • R 1 , R 2 and R 5 are -H and R 4 has the meanings given in the general formula (IIa).
  • Binder that binds to a receptor of a tumor cell
  • the term "binder” is broadly understood to mean a molecule that binds to a target molecule that binds to a particular binding agent
  • binder is to be understood in its broadest interpretation and includes e.g. also lectins, proteins that can bind certain sugar chains, or phospholipid-binding proteins.
  • binders include, for example, high molecular weight proteins (binding proteins), polypeptides or
  • Binding proteins are, for example, antibodies and antibody fragments or antibody mimetics such as Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, Nanobodies (review article by Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13: 245-255; Nuttall SD et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8: 608-617).
  • Binding peptides are, for example, ligands of a ligand-receptor pair, such as VEGF of the ligand receptor pair VEGF / KDR, such as transferrin of the ligand Receptor pair transferrin / transferrin receptor or cytokine / cytokine receptor such as TNFalpha of the ligand receptor pair TNFalpha / TNFalpha receptor.
  • ligands of a ligand-receptor pair such as VEGF of the ligand receptor pair VEGF / KDR
  • transferrin of the ligand Receptor pair transferrin / transferrin receptor or cytokine / cytokine receptor such as TNFalpha of the ligand receptor pair TNFalpha / TNFalpha receptor.
  • the prodrugs according to the invention preferably contain a binder which can bind to a receptor of a tumor cell and is usually internalized after binding to the receptor by the tumor cell and is processed intracellularly, preferably lysosomally.
  • This binder may either be linked to the group cleavable by the enzyme legumain, if appropriate via a linker, so that after cleavage of the legume-cleavable group the active substance is present separately from the binder or a derivative thereof.
  • -D in the general formula (la) represents -D-
  • and R in the general formula (Ia) represents (L c ) r -LIG (Embodiment A).
  • the binder may optionally be linked to the active substance molecule via a linker, so that after cleavage of the legume-cleavable group, the active ingredient is present together with the binder or a derivative thereof.
  • the compounds of the embodiment A preferably have the following general formula (III '):
  • n, r, LIG, La, Lc, and Di are those given in the general formula (Ia)
  • the compounds of the embodiment B preferably have the following general formula (IV):
  • n, o, R, LIG, La, Lb and Di have the meanings given in the general formula (Ia).
  • the binder LIG is usually a peptide, protein or derivative thereof.
  • the peptide or derivative thereof is preferably selected from octreotide, GnRH-III, [D-Tyr 6 , ⁇ -Ala 11 , Phe 13 , Nle 14 ] BN (6-14), NT (8-13), c (RGDfK ), HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2 (SEQ ID NO: 161),
  • NAPamide [Phe 7 , Pro 34 ] NPY, HER2-targeting peptide, ATEPRKQYATPRVFWTDAPG (SEQ ID NO: 162) or LQWRRDDNVHNFGVWARYRL (SEQ ID NO: 163) [the peptide sequences are given in the common 1-letter code for amino acids here]. It is possible to detect additional peptide sequences using a screening method as described in Umlauf et al., Bioconj. Chem. 2014, Oct. 15; 25 (10): 1829-37.
  • the peptide may be linked directly (eg, with its C-terminus) to the N-terminus of the legume-cleavable group through a peptide bond. It is also possible that the peptide is linked to the N via a linker Lc. Terminus of the legumain-cleavable group is bound, with the linker
  • peptide preferably attached to the C- or N-terminus of the peptide or to a lysine or cysteine side chain of the peptide.
  • the peptide may be bound directly to the drug molecule.
  • the peptide is linked to the drug molecule via a linker Lb, the linker preferably being attached to the C- or N-terminus of the peptide or to a lysine or cysteine side chain of the peptide.
  • the binding of Lb or the peptide is usually carried out by substitution of an H atom in the drug molecule.
  • Binder LIG is an antibody or an antigen-binding fragment or derivative thereof which binds to an extracellular target molecule of a tumor cell.
  • LIG is particularly preferably an antibody or fragment thereof to which or to which one or more cytotoxic active substance molecules are bound.
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • AB represents an antibody
  • s represents a number from 1 to 20, preferably 2 to 8, more preferably 2 to 6 such as 4 ,
  • Di is preferably a compound of the general formula (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) or (VII) wherein one substituent selected from R 1 , R 2 , R 3 R 4 , R 8 does not have the meanings given above under the general formulas (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) and (VII), but for a bond to La , ie the self-immolative linker or a bond to a carbonyl group.
  • the compounds according to the invention are antibody prodrug conjugates (APDCs) of the following general formula (IVa '):
  • D 1 is preferably a compound represented by the general formulas (IIa), (IIb), (IIc), (Id), (V), (VI) or (VII), wherein a substituent R 4 does not satisfy the above general formula (IIa), (IIb), (IIc), (lld), (V), (VI) or (VII) has the meaning given, but represents the bond to La or a carbonyl group.
  • the antibody (such as AB in the above general formulas (IIIa) and (IVa) is
  • a human, humanized or chimeric monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof in particular an anti-TWEAKR antibody, an anti-EGFR antibody, an anti-B7H3 antibody or an anti-HER2 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • an anti-TWEAKR antibody an anti-EGFR antibody
  • an anti-B7H3 antibody an anti-HER2 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the anti-TWEAKR antibodies TPP-7006, TPP-7007 and TPP-10337
  • the anti-B7H3 antibodies TPP-8382 and TPP-8567
  • the anti-EGFR antibody cetuximab (TPP-981) and the anti - HER2 antibodies trastuzumab and TPP-1015 or an antigen-binding fragment of these are particularly preferred.
  • conjugation of organic molecules to antibodies
  • the conjugation to the antibody is preferably via one or more sulfur atoms of cysteine residues of the antibody and / or via one or more NH groups of lysine residues of the antibody.
  • target molecule is broadly understood to be a molecule present in the target cell population, and may be a protein (eg, a growth factor receptor) or a non-peptidic molecule (eg, a sugar or phospholipid) Receptor or an antigen.
  • extracellular target molecule describes a cell-bound one
  • Target molecule which is located on the outside of a cell or the part of a target molecule, which is located on the outside of a cell, i.
  • An antibody can bind to an extracellular target molecule on an intact cell.
  • An extracellular targeting molecule may be anchored in the cell membrane or be part of the cell membrane. The person skilled in the art knows methods to identify extracellular target molecules. For proteins, this can be achieved by determining the transmembrane domain (s) and the
  • Orientation of the protein in the membrane happen. This information is usually stored in protein databases (e.g., SwissProt).
  • protein databases e.g., SwissProt
  • cancer target molecule describes a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer cells as compared to non-cancerous cells of the same tissue type
  • the cancer target molecule is on one or more cancer cell types compared to non-cancer cells of the same tissue type selectively present, with selective at least two-fold accumulation on cancer cells in the Describes the comparison with non-cancer cells of the same tissue type (a "selective cancer target molecule”) .
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates of the invention.
  • binder is understood to mean a binder peptide, a derivative of a binder peptide, a binder protein or a derivative of a binder protein.
  • the binder is linked to the linker via a bond.
  • the linkage of the binder can be effected by means of a heteroatom of the binder.
  • Heteroatoms of the binder according to the invention which can be used for linking are:
  • Nitrogen via a primary or secondary amine group.
  • the term "binder” means an antibody.
  • heteroatoms listed above may be present in the natural antibody or introduced by chemical or molecular biological methods.
  • the linkage of the antibody with the organic radical in formula (I) has only a small influence on the binding activity of the antibody to
  • the linkage has no influence on the binding activity of the binder to the target molecule.
  • an immunoglobulin molecule preferably comprises a molecule having four polypeptide chains, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains), which are typically linked by disulfide bridges.
  • Each heavy chain comprises a heavy chain variable domain (abbreviated VH) and heavy chain constant domain.
  • the heavy chain constant domain may comprise three domains CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable domain (abbreviated VL) and a constant domain.
  • the constant Light chain domain comprises a domain (abbreviated CL).
  • VH and VL domains can be further subdivided into regions of hypervariability, also called complementarity determining regions (abbreviated to CDR) and regions of lower sequence variability (FR).
  • CDR complementarity determining regions
  • FR regions of lower sequence variability
  • Each VH and VL region typically consists of three CDRs and up to four FRs. For example, from the amino terminus to
  • An antibody can be obtained from any suitable species, e.g. Rabbit, llama, camel, mouse, or rat. In one embodiment, the antibody is of human or murine origin. An antibody can e.g. be humane, humanized or chimeric.
  • monoclonal antibody refers to antibodies obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, individual antibodies of the population are identical except for naturally occurring mutations which can occur in small numbers.Monoclonal antibodies recognize with high specificity a single antigenic binding site The term monoclonal antibody does not refer to a particular manufacturing process.
  • the term "intact" antibody refers to antibodies comprising both an antigen-binding domain and the light and heavy chain constant domain
  • the constant domain may be a naturally occurring domain, or a variant thereof in which multiple amino acid positions are altered were.
  • modified intact antibody refers to intact antibodies that have been fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (eg, a peptide linkage) modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925-32).
  • a covalent bond eg, a peptide linkage
  • human antibody refers to antibodies that can be obtained from a human or are synthetic human antibodies
  • a "synthetic” human antibody is an antibody that is available in part or in full as a whole from synthetic sequences in silico that are based on the Human analysis
  • Antibody sequences are based.
  • a human antibody can e.g. by a
  • An example of such antibodies is in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18: 853-856.
  • humanized or chimeric antibody describes antibodies consisting of a non-human and a human sequence portion.
  • Antibodies a part of the sequences of the human immunoglobulin (recipient) is replaced by sequence portions of a non-human immunoglobulin (donor).
  • the donor is a murine immunoglobulin in many cases.
  • Amino acids of the CDR of the recipient replaced by amino acids of the donor.
  • CDR complementarity determining region
  • Each variable region typically has three CDR regions, referred to as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • Each CDR region may comprise amino acids as defined by Kabat and / or amino acids of a hypervariable loop defined by Chotia.
  • the Kabat definition includes, for example, the region of approximately amino acid position 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the variable light chain and 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2). and 95-102 (CDR3) variable heavy chain (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
  • the definition according to Chotia includes the region of approximately amino acid position 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) of the variable light chain and 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2).
  • a CDR may comprise amino acids from a CDR region as defined by Kabat and Chotia.
  • antibodies can be divided into different classes. There are five major classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, several of which can be broken down into other subclasses. (Isotypes), eg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the heavy chain constant domain corresponding to the different classes are referred to as [alpha / a], [delta / ⁇ ], [epsilon / ⁇ ], [gamma / ⁇ ] and [my / ⁇ ]. Both the three-dimensional structure and the subunit structure of antibodies are known.
  • the term "functional fragment” or "antigen-binding antibody fragment" of an antibody / immunoglobulin is defined as a fragment of an antibody
  • Antibodies / immunoglobulins e.g., the variable domains of an IgG which still comprise the antigen binding domains of the antibody / immunoglobulin.
  • the "antigen binding domain" of an antibody typically comprises one or more
  • Hypervariable regions of an antibody e.g. the CDR, CDR2 and / or CDR3 region.
  • the "framework" or “framework” region of an antibody may also play a role in binding the antibody to the antigen.
  • the framework region provides the framework for the CDRs.
  • the antigen binding domain comprises at least amino acids 4 to 103 of the variable light chain and amino acids 5 to 109 of the variable heavy chain, more preferably amino acids 3 to 107 of the variable light chain and 4 to 11 of the variable heavy chain are particularly preferred the complete variable light and heavy chains, so amino acid 1 - 109 of the VL and 1 to 1 13 of the VH (numbering according to WO97 / 08320).
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” of the invention do not exhaustively include Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments, diabodies, single domain antibodies (DAbs), linearae antibodies, single chain antibodies (single-chain Fv , abbreviated scFv); and multi-specific, e.g. bi- and tri-specific antibodies formed from antibody fragments C.
  • DAbs single domain antibodies
  • single chain antibodies single chain antibodies
  • scFv single chain antibodies
  • Multispecific antibodies are those with identical binding sites. Multispecific antibodies may be specific for
  • An F (ab ') 2 or Fab molecule can be designed to reduce or completely prevent the number of intermolecular disulfide interactions that occur between the Chi and CL domains.
  • Epitopic determinants refers to protein determinants that can specifically bind to an immunoglobulin or T cell receptor Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains, or combinations thereof, and typically have specific 3-dimensional structural properties such as also specific charge characteristics.
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” may be fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino-terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (e.g., a peptide linkage). Furthermore, antibodies and antigen-binding fragments can be modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925-32) ).
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Köhler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
  • Humanized humanized monoclonal antibodies can be used for the
  • Amino acid sequences of a variety of antibodies which were created from a large number of healthy volunteers.
  • Antibodies can also be made by known recombinant DNA technology.
  • the nucleic acid sequence of an antibody can be obtained by routine sequencing, or is available from publicly available databases.
  • An "isolated" antibody or binder has been purified from other components of the cell Contaminating components of a cell that may interfere with a diagnostic or therapeutic use are, for example, enzymes, hormones, or other peptidic or non-peptidic components of a cell an antibody or binder which is greater than 95% by weight of the antibody or Binder was purified (determined by eg Lowry method, UV-Vis spectroscopy or by SDS capillary gel electrophoresis).
  • an antibody which has been purified to the extent that at least 15 amino acids of the amino terminus or an internal amino acid sequence can be determined, or purified to homogeneity, the homogeneity is determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions (the detection can by means Coomassie blue staining or preferably determined by silver staining).
  • an antibody is usually produced by one or more purification steps.
  • the term “specific binding” or “specific binding” refers to one
  • Antibody or binder that binds to a predetermined antigen / target molecule typically describes an antibody or binding with an affinity of at least 10 "7 M_ (as Kd value, so preferably those with smaller Kd values than 10" ⁇ M), wherein the antibody or a binder has at least two-fold higher affinity for the predetermined antigen / target molecule than for a non-specific antigen / target molecule (eg, bovine serum albumin, or casein) that is not the predetermined antigen / target molecule or a closely related antigen / target molecule.
  • Specific binding of an antibody or binder does not preclude the antibody or binder from binding to multiple antigens / target molecules (eg, orthologs from different species).
  • the antibodies preferably have an affinity of at least 10 " ⁇ M (as Kd value, so preferably those with smaller Kd values than 10 ⁇ 7 M), preferably at least 10" 8 M, more preferably in the range of 10 -9 M to KT M on.
  • Kd values can be determined by eg
  • the antibody-drug conjugates of the invention also have affinities in these areas.
  • affinity is not significantly affected by the conjugation of the drugs (as a rule, the affinity becomes less than one)
  • the antibodies used according to the invention are furthermore preferably characterized by a high selectivity.
  • a high selectivity is present when the
  • Antibodies according to the invention have an affinity to the target protein which is better by at least a factor of 2, preferably factor 5 or particularly preferably factor 10 than on an independent other antigen, eg human serum albumin (the affinity can be determined, for example, by surface plasmon resonance spectroscopy).
  • the antibodies used according to the invention are preferably cross-reactive. In order to facilitate and better interpret preclinical studies, eg toxicological or efficacy studies (eg in xenograft mice), it is advantageous if the antibody used according to the invention binds not only the human target protein but also in the species used for the studies the species target protein binds.
  • the antibody used according to the invention is, in addition to the human target protein, cross-reactive to the target protein of at least one other species.
  • species of the family rodents, dogs and non-human primates are preferably used.
  • Preferred rodent species are mouse and rat.
  • Preferred non-human primates are rhesus monkeys, chimpanzees and long-tailed macaques.
  • the antibody used according to the invention is cross-reactive to the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and
  • Macaca fascicularis Long-tailed Macaque (Macaca fascicularis). Particularly preferred
  • Antibodies used according to the invention which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive with the mouse target protein. Preference is given to cross-reactive antibodies whose affinity for the target protein of the further non-human species does not differ by more than a factor of 50, in particular not more than a factor of ten, from the affinity for the human target protein.
  • the target molecule against which the binder e.g. an antibody or antigen-binding fragment thereof, a cancer target molecule.
  • cancer target molecule describes a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer cells as compared to non-cancerous cells of the same tissue type, Preferably, the cancer target molecule is on one or more cancer cell types compared to non-cancer cells of the same tissue type selectively present, selectively expressing at least two-fold accumulation on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a "selective cancer target molecule").
  • Antibodies that are specifically directed against an antigen may be made by those of ordinary skill in the art by methods known to those in the art (such as recombinant expression) or purchased commercially (such as from Merck KGaA, Germany). Examples of known commercially available antibodies in cancer therapy are Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) and Herceptin® (Trastuzumab, Genentech).
  • the antibody is produced recombinantly in CHO cells.
  • the target molecule is a selective cancer target molecule.
  • the target molecule is a protein.
  • the target molecule is an extracellular target molecule.
  • the extracellular target molecule is a protein.
  • Cancer target molecules are known to the person skilled in the art. Examples of this are listed below.
  • cancer target molecules are:
  • EGFR EGF receptor, NCBI reference sequence NP_005219.2, NCBI genes ID: 1956
  • Mesothelin StewissProt reference Q13421-3
  • Amino acids 37-286 encode "megakaryocyte-potentiating factor”.
  • Mesothelin is anchored in the cell membrane by a GPI anchor and is localized extracellularly.
  • CD52 NCBI reference sequence NP_001794.2
  • HER2 (ERBB2; NCBI Reference Sequence NP_004439.2; NCBI Gene ID: 2064)
  • CD20 NCBI reference sequence NP_068769.2
  • lymphocyte activation antigen CD30 (SwissProt ID P28908)
  • lymphocyte adhesion molecule CD22 (SwissProt ID P20273, NCBI genes ID: 933)
  • myloid cell surface antigen CD33 (SwissProt ID P20138, NCBI genes ID: 945)
  • the B lymphocyte antigen CD19 (SwissProt ID P15391, NCBI Gene ID: 930)
  • the prostate-specific membrane antigen PSMA (Swiss Prot ID: Q04609, NCBI genes ID: 2346)
  • the tyrosine protein kinase EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317, NCBI genes ID: 1969)
  • Ephrin receptor EPHB2 (SwissProt: P29323)
  • the B cell antigen receptor complex associated protein CD79a (SwissProt: P1 1912) (45) the receptor protein CXCR5 (CD185; SwissProt: P32302; NCBI genes ID 643, NCBI reference sequence: NP_001707.1)
  • T-cell protein VTCN1 SwissProt: Q7Z7D3
  • TWEAKR FN14, TNFRSF12A, NCBI reference sequence: NP_057723.1, NCBI genes ID: 51330
  • lymphocyte antigen CD37 (Swiss Prot: P1 1049, NCBI Gene ID: 951)
  • the FGF receptor 2; FGFR2 (NCBI gene ID: 2263; Official symbol: FGFR2).
  • the FGFR2 receptor occurs in different splice variants (alpha, beta, IIIb, IIIc). All splice variants can act as a target molecule.
  • NCBI genes ID: 960 the cell surface glycoprotein CD44 (NCBI genes ID: 960)
  • CDH15 cadherin 15, NCBI genes ID: 1013)
  • NCBI genes ID: 4233 the receptor tyrosine kinase c-Met (NCBI genes ID: 4233)
  • NCBI genes ID: 10683 the Notch ligand DLL3
  • Ephrin A4 (67) Ephrin A4 (EFNA4, NCBI Gene ID: 1945)
  • folate receptor 1 (FOLR1, NCBI gene ID: 2348)

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Prodrugs bzw. Konjugate der allgemeinen Formel (Ia), in der La, n, R und D die in der Beschreibung angegebenen Bedeutungen haben und die ein auf ein Asparaginderivat reduziertes Strukturmotif als Spaltstelle für tumor-assoziierte Proteasen wie Legumain aufweisen, bei denen cytotoxische Wirkstoffe wie z.B. Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren durch Legumain-Spaltung freigesetzt werden, sowie die Verwendung dieser Prodrugs bzw. Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Prodrugs bzw. Konjugate zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Durch Reduktion der Legumain-spaltbaren Substratpeptid-Sequenz auf ein Asparaginderivat als Strukturmotif wird durch verlangsamte Legumain-Spaltung eine Erhöhung der Stabilität in den Lysosomen von gesunden Organen bei gleichzeitigem Erhalt der hohen Anti-Tumor-Wirkung erreicht.

Description

Prodrugs von cytotoxischen Wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren Gruppen Einleitung und Stand der Technik
Die Erfindung betrifft neuartige Prodrugs, bei denen cytotoxische Wirkstoffe wie z.B. Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren mit Gruppen konjugiert werden, die selektiv von
Tumor-assoziierten Proteasen abgespalten werden und so den Wirkstoff freisetzen, sowie die Verwendung dieser Prodrugs bzw. Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Prodrugs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyper- proliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.
Krebszellen exprimieren häufig bestimmte Proteasen in stärkerem Maße als normale Zellen. Dies hat zu Ansätzen zur Erhöhung der Selektivität von cytotoxischen Wirkstoffen für Krebszellen geführt, bei denen die Wirkstoffe mit Gruppen verbunden werden, die von solchen Proteasen abgespalten werden, wodurch der Wirkstoff freigesetzt wird.
Eine solche Tumor-assoziierte Protease ist Legumain. Legumain ist eine Asparaginyl- Endopeptidase (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J. M. Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) und wurde zur Prozessierung von Prodrugs von kleinen cytotoxischen Molekülen wie zum Beispiel unter anderem von Doxorubicin und Etoposid Derivaten genutzt (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L.Stern et al; Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al. ChemMedChem 201 1 , 6, 54).
In der US 2015-0343083 A1 werden Legumain-spaltbare Peptid-Wirkstoff-Konjugate der Formel R-Y-Z-Asn-Linker-D beschrieben, in der Linker für p-Aminobenyzyl carbamoyl oder p-Aminobenzyl carbonat steht, R ein aus unterschiedlichen chemischen Gruppen ausgewählter Rest ist, D ein cytotoxischer Wirkstoff ist, Asn die Aminosäure Asparagin ist, Y eine Aminosäure ausgewählt aus Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr und Phe ist und Z eine Aminosäure ausgewählt aus Ala, Thr, Asn und Pro ist, wobei diese
Aminosäuren stets in der natürlichen L-Konfiguration vorliegen.
Alle bisher beschriebenen Legumain-spaltbaren Prodrugs enthalten als Legumain- Substrat eine Oligopeptidsequenz. Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Tumorselektivität von cytotoxischen Wirkstoffen noch weiter zu verbessern. Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung Prodrugs von cytotoxischen Wirkstoffmolekülen bereit. Hierbei ist an das Wirkstoffmolekül eine durch das Enyzm Legumain spaltbare Gruppe konjugiert, wobei der Wirkstoff und die durch Legumain spaltbare Gruppe entweder direkt über eine kovalente Bindung oder über einen self-immolative linker verbunden sind. Diese Prodrugs enthalten vorzugsweise einen Binder, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär (vorzugsweise lysosomal) prozessiert wird. Dieser Binder kann entweder mit dem mit der Legumain-spaltbaren Gruppe modifizierten
Wirkstoffmolekül gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so daß zur Bildung eines aktiven Metaboliten beide Gruppen (Legumain spaltbare Gruppe und Binder) unabhängig voneinander prozessiert werden müssen, oder der Binder kann mit der durch das Enyzm Legumain spaltbaren Gruppe gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein (so dass nach Spaltung der Legumain-spaltbaren Gruppe der Wirkstoff getrennt von dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt). Als Wirkstoffmolekül wird ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor) bevorzugt. Als Binder, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär
(vorzugsweise lysosomal) prozessiert wird, wird ein Antikörper bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), wobei Antikörper und Wirkstoff über einen Linker, der eine Legumain spaltbare Gruppe aufweist, miteinander verbunden sind. Zudem sind bevorzugt Konjugate von Prodrugs mit Antikörpern (APDCs), wobei der Antikörper mit einem Prodrug des Wirkstoffs über einen Linker verbunden ist und wobei die Wirkung des Wirkstoffs durch eine Legumain spaltbare Gruppe maskiert ist. Die erfindungsgemäß verwendetet^ Legumain spaltbare Gruppe, die mit dem Wirkstoff verbunden ist, weist ein auf die Aminosäure Asparagin reduziertes Strukturmotif auf. Durch diese Reduktion wird bedingt durch eine verlangsamte Spaltung durch Legumain eine Erhöhung der Stabilität in den Lysosomen von gesunden Organen erreicht ohne dass jedoch die hohe anti-Tumorwirkung beeinträchtigt wird, (siehe Kapitel C-1 c infra). Wie anhand von repräsentativen Vergleichen mit geeigneten Referenzbeispielen, die ein Tripeptid als Legumain spaltbare Gruppe enthalten, gezeigt wurde (siehe Kapitel C-1 a infra), zeigen die erfindunsgemäßen ADCs und APDCs mit nur noch einer Aminosäure (Asparagin) als enzymatischer Spaltstelle im Linker eine hohe anti-Tumorwirkung, die den Analoga mit klassischen Tripeptidsubstraten (drei Aminosäuren) im Linker
(Referenzbeispiele R1 und R6) überraschenderweise nicht oder kaum nachsteht (s. Kapitel C-1 a). Die Protease-spaltbare Linkersequenz kann damit auf nur einen
Aminosäurebaustein (eine Aminosäure) reduziert werden. Selbst für nah verwandte Konjugate mit Aminosäuren wie Glutamin oder Leucin statt Asparagin (siehe
Modellverbindung C RM-C infra) konnte im enzymatischen Assay keine Spaltung durch Legumain gezeigt werden. Entsprechend zeigten verwandte ADCs zu den Beispielen 1 mit Glutamin statt Asparagin-Resten im Prodrugrest der Payload keine cytotoxische Wirkung. Das gleiche gilt für analoge ADCs zu Beispiel 6, die einen Leucinrest an Stelle von Asparagin im Linker tragen; auch sie zeigen im Gegensatz zu den ADCs in Beispiel 6 praktisch keine cytotoxische Wirkung. Während Oligopeptid-Linker auch durch
verschiedene Proteasen gespalten werden können, zeigen die erfindungsgemäßen ADCs eine hohe Präferenz für die Spaltung durch eine tumor-assoziierte Asparagin-spaltende Protease wie Legumain.
Die erfindungsgemäßen Prodrugs weisen die folgende allgemeine Formel
Figure imgf000005_0001
in der
La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;
D -(Lb)0-(LIG)p steht, Di für ein cytotoxisches Agens steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht, o und p jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, R für LIG-(Lc)e- steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist oder
R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist, für eine Ci-10-Alkyl-, C5-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-
Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, C1-10- Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IMH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder
-Ox-(CH2CH20)v-R1 steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH oder
-CH2-CH2-NH2 steht. Hierbei steht R1 in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für Ci-12-Alkyl.
Vorzugsweise ist der Binder (LIG) ein Antikörper oder eine Antigen-bindendes Fragment hiervon. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, insbesondere ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Die erfindungsgemäßen Prodrugs enthalten vorzugsweise einen Binder, der an einen Rezeptor einer Tumorzelle binden kann und in der Regel nach Bindung an den Rezeptor von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird.
Hierbei kommen vorzugsweise zwei Ausführungsformen in Betracht.
Der Binder kann entweder mit der durch das Enyzm Legumain spaltbaren Gruppe gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain- spaltbaren Gruppe der Wirkstoff getrennt von dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt. Die Verbindungen der Ausführungsform A weisen somit vorzugsweise die folgende allgemeine Formel III' auf:
Figure imgf000007_0001
Ml' wobei n, e, LIG, La, Lc, und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen
Bedeutungen haben.
In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -D-| dar und -R in der allgemeinen Formel (la) stellt LIG-(Lc)e- dar (Ausführungsform A).
Somit betrifft die vorliegende Erfindung vorzugsweise Verbindungen der allgemeinen Formel (la), in der
La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;
D -(Lb)0-(LIG)p steht, o und p 0 sind, für ein cytotoxisches Agens steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
R für LIG-(Lc)e- steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist. Oder der Binder kann mit dem Wirkstoffmolekül gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain-spaltbaren Gruppe der Wirkstoff zusammen mit dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt.
In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -Di-(L|3)0-LIG dar und R- in der allgemeinen Formel (la) stellt Zi-(C(=0))q- dar (Ausführungsform B).
Die Verbindungen der Ausführungsform B weisen somit vorzugsweise die folgend allgemeine Formel (IV) auf:
Figure imgf000009_0001
wobei n, o, LIG, La, Lb und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen
Bedeutungen haben und R für Zi-(C=0)q- steht, wobei q 0 oder 1 ist und Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C5-io-Aryl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C3-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cö-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6- 10-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, - S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl) oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder -Ox-(CH2CH20)v-R1 steht, X 0 oder 1 ist eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder
-CH2-CH2-NH2 steht.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung vorzugsweise Verbindungen der allgemeinen Formel (la), in der
La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;
D für -Di-(Lb)0-(LIG)p steht, o 0 oder 1 p 1 ist, Di für ein cytotoxisches Agens steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht, R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,
Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C5-io-Aryl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C3-10-
Heteroalkyl-, d-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, C5-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, C5-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkoxy-, C5-10-
Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, C5-io-Heterocyclo-alkoxy- Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder
-Ox-(CH2CH20)v-R1 steht,
0 oder 1 ist eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder
-CH2-CH2-NH2 steht.
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 zeigt die Strategie der Transglutaminase-katalysierten
konjugationsstellenspezifischen Funktionalisierung aglykosylierter Antikörper.
Fig. 2 zeigt annotierte Sequenzen von bevorzugten Antikörpern für Binder-Wirkstoff-
Konjugate. Gezeigt sind die Proteinsequenzen der schweren und leichten Ketten der IgGs, sowie die VH und VL Regionen dieser Antikörper. Unterhalb der Sequenzen werden wichtige Regionen annotiert (VH und VL Regionen in IgGs, und die CDR Regionen (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2, L- CDR3)).
Fig. 3 zeigt das Sequenzlisting von Sequenzen der bevorzugten Antikörper für Binder- Wirkstoff-Konjugate und von Sequenzen der Zielproteine.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Folgenden werden zunächst erfindungsgemäß verwendbare Legumain spaltbare Gruppen sowie die cytotoxischen Wirkstoffe D, die gegebenenfalls über einen seif- immolative linker miteinander verbunden sind, beschrieben. Anschließend wird der erfindungsgemäß bevorzugte Binder LIG, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär (vorzugsweise lysosomal) prozessiert wird, beschrieben. Die verschiedenen Elemente der erfindungsgemäßen Verbindungen können ohne Einschränkung in beliebiger Kombination verwendet werden. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Wirkstoffe D in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder LIG, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw.
besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.
Durch Legumain spaltbare Gruppe
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (la) weisen eine durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel (la') auf
Figure imgf000012_0001
(la'),
in der
La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist,
#1 für die Bindung an den cytotoxischen Wirkstoff (cytotoxisches Agens) steht,
R für LIG-(Lc)e- steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist, oder
R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,
Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C5-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-
Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-,
Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IMH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H , -S(=0)2-NH2, -S(=0)2- N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder
-Ox-(CH2CH20)v-R1 steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und
R1 für -H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 steht. Hierbei steht R1 in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für Ci-12-Alkyl.
Wenn R für LIG-(Lc)e- steht, wird die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' auch als durch Legumain spaltbarer Linker bezeichnet (Ausführungsform A).
Wenn R für Zi-(C=0)q- steht, wird die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' auch als durch Legumain spaltbare Schutzgruppe bezeichnet (Ausführungsform B).
Wenn die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' eine durch Legumain spaltbare Schutzgruppe bezeichnet, ist q vorzugsweise 1 .
Zi stellt vorzugsweise eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkoxy- oder Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-Gruppe dar die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)- Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)- N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann.
Zi stellt besonders bevorzugt eine Ci-3-Alkyl-, C6-7-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-6-Heteroaryl-Ci-3- alkyl-, oder C6-7-Aryl-Ci-6-alkoxy-Gruppe dar, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -COOH, -C(=0)- oder -OH substituiert sein kann.
Self-immolative linker La
Um eine effiziente Freisetzung des freien Wirkstoffs zu gewährleisten, können
gegebenenfalls auch sogenannte self-immolative Linkerelemente (La) zwischen enzymatischer Spaltstelle und Wirkstoff eingebaut werden (Anticancer Agents in
Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). Die Freisetzung des Wirkstoffs kann dabei nach verschiedenen Mechanismen erfolgen, beispielsweise nach initialer enzymatischer Freisetzung einer nukleophilen Gruppe durch anschließende Elimierung über eine elektronische Kaskade (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71 ) oder durch Cyclisierung des entsprechenden Linkerelements (Bioorg. Med. Chem., 2003, 1 1 , 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett, 2007, 17, 2241 ) oder durch eine Kombination aus beidem (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Beispiele für solche Linkerelemente sind in der Abbildung dargestellt:
Figure imgf000015_0001
Der in den allgemeinen Formeln (la) und (la') unter La genannte self-immolative linker steht hier beispielsweise für eine der folgenden Gruppen:
Figure imgf000015_0002
wobei #1 die Bindung zur Carbonylgruppe und #2 die Bindung zur Hydroxyl- bzw.
Aminogruppe von D1 darstellt. Cytotoxische Wirkstoffe den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel la stellt D die Gruppe
(LIG)p dar, wobei ein cytotoxischer Wirkstoff (cytotoxisches Agens) ist,
LIG einen Binder darstellt, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb einen Linker darstellt und o und p unabhängig voneinander 0 oder 1 sind.
Als cytotoxischer Wirkstoff wird vorzugsweise Mitomycin, Doxorubicin, Aminopterin, Actinomycin, Bleomycin, 9-Amino-Camptothecin, n8-Acetyl-spermidin, 1 -(2-Chloroethyl)- 1 ,2-dimethansulfonyl-hydrazid, Tallysomycin, Cytarabin, Etoposid, Camptothecin, Taxol, Esperamicin, Podophyllotoxin, Anguidin, Vincristin, Vinblastin, Morpholin-doxorubicin, n- (5,5-diacetoxy-pentyl)-doxorubicin, Duocarmycin, Auristatin, Monomethylauristatin, Dolastatin, Tubulysin, Maytansinoid, Cryptophycin, Amanitine, Pyrrolobenzodiazepin- Derivate, Indolinobenzodiazepine, Calicheamicin, Daunorubicin, Camptophecin DX8951 (Exatecan) oder ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor) verwendet, wobei der Wirkstoff über seine Hydroxyl- oder Aminogruppe an La (bei n=1 ) oder die
Carbonylgruppe (bei n=0) gemäß der allgemeinen Formel (la) gebunden ist. Eine entsprechende Derivatisierung dieser Wirkstoffe kann auf Grundlage bekannter Methoden erfolgen (siehe z.B. Synthesis, 1999, 1505 bzgl. Duocarmycin, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 337, Journal of Med. Chem., 2010, 53(3), 1043 bzgl. Camptothecin, ChemMedChem,. 201 1 , 6(1 ), 54 bzgl. Auristatin, Mol. Cancer. Thier., 2005, 4, 751 bzgl. Doxorubicin und J. Biol. Chem, 2008, 283, 9318 bzgl. Pyrrolobenzodiazepin-Derivate (PBD-Derivate); s.a. J. Med. Chem 2013, 56, 7564 und weitere Referenzen in der Einleitung, J. Med. Chem. 2001 , 44, 1341 , Oncology Reports 201 1 , 26, 629)).
Insbesondere können auch als ADC-Payloads bereits etablierte Wirkstoffklassen, wie sie im Review von A. Beck et al. (Nature Rev. Drug Discovery; 2017, 16, 315) zusammengefasst wurden, über die hier beschriebenen Linker-Chemien mit Antikörpern verknüpft werden. Bevorzugt können die spaltbaren Linker in den beschriebenen ADCs durch die hier beschriebenen Linker ersetzt werden. Besonders bevorzugt werden solche cytotoxischen Wirkstoffe, die eine für ihre
Wirksamkeit essentielle freie Hydroxyl- oder Aminogruppe aufweisen, insbesondere solche, die eine für ihre Wirksamkeit essentielle freie Aminogruppe aufweisen. Durch die Kopplung der Legumain spaltbaren Gruppe an eine solche Gruppe kann die Wirksamkeit des cytotoxischen Wirkstoffs maskiert werden. Zu dieser Gruppe der Wirkstoffe gehört z.B. Doxorubicin, welches die folgende Formel aufweist:
Figure imgf000017_0001
Durch Konjugation der Legumain spaltbaren Gruppe an die freie Aminogruppe des Doxorubicins kann dessen Wirksamkeit maskiert werden. Insbesondere bevorzugt sind Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren als cytotoxische
Wirkstoffe (cytotoxische Agenzien), wie sie z.B. in der internationalen Patentanmeldung WO2015/096982 offenbart sind.
Als cytotoxische Wirkstoffe sind hierbei insbesondere solche Kinesin Spindel Protein- Inhibitoren der folgenden Formel (II)
Figure imgf000018_0001
bevorzugt, in der
Figure imgf000018_0002
X3 für C steht,
oder
Figure imgf000018_0003
X3 für N steht,
oder
Figure imgf000018_0004
X3 für N steht,
oder
Figure imgf000018_0005
X3 für C steht,
oder
Figure imgf000018_0006
X3 für C steht.
A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0)2-, oder -S(=0)2-NH- steht,
R1 für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH2)o-3Z steht,
Z für -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(=0)-NY1Y2, oder
-C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH2W)Z' stehen,
für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -IMH2, -S(=0)3H, -COOH,
-NH-C(=0)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder
-(C(=0)-NH-CHY4)i-3COOH steht,
für -H oder -OH steht,
für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert ist, für -H, -L-#1 , -MOD, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z steht, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder
-C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht,
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert ist,
für-H oder -C(=0)-CHY6-NH2 steht,
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht,
für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,
Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-
Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei
Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten
Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-
Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl
Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-
Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei
-(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
0, 1 oder 2 ist, Z für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder
-(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R5 für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)o-3Z steht,
Z für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)- OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht, R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen,
R8 für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10-
Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl-, Fluor-C4-io-Cycloalkyl- oder -(CH2)o-2-(HZ2) steht,
HZ2 für einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei
Heteroatome, ausgewählt aus N, O und S steht, der mit -OH, -COOH, -NH2 oder -L-#1 substituiert sein kann,
R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht,
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, -MOD für -(N R10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht,
G1 für -NH-C-(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /N CO steht, n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -NH-C(=0)-NH2,
-COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder
Sulfonsaure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht und
-MOD mindestens eine, vorzugsweise zwei -COOH Gruppen aufweist, und eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann, sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen, in denen
R3 für— L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, C5-10-
Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH- Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-
Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-
C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl- Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei Nh -Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
n 0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z,,-(CH2)o-3-CH(NH2)Z, oder -(CH2)o-3Z' steht und
für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeine Formel (II), in denen
Figure imgf000022_0001
X3 für N steht.
Durch Konjugation der Legumain spaltbaren Gruppe an die freie Aminogruppe der Verbindungen der Formel II kann dessen Wirksamkeit maskiert werden.
Diese erfindungsgemäß verwendeten Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren besitzen eine für die Wirkung essentielle Aminogruppe. Durch Modifizierung dieser Aminogruppe mit Peptidderivaten oder Asparaginderivaten wird die Wirkung gegenüber dem Kinesin- Spindelprotein blockiert und damit auch die Entfaltung einer cytotoxischen Wirkung inhibiert. Kann dieser Peptidrest jedoch durch Tumor-assoziierte Enzyme wie Legumain freigesetzt werden, so lässt sich die Wirkung gezielt im Tumorgewebe wieder herstellen. Definitionen
Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffe an dem bezeichneten Atom bzw. der bezeichneten Gruppe durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt ist/sind, mit der Maßgabe, dass die normale Wertigkeit des bezeichneten Atoms unter den vorliegenden Umständen nicht überschritten wird.
Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen sind zulässig.
Der Begriff„gegebenenfalls substituiert" bedeutet, dass die Anzahl an Substituenten gleich oder verschieden von Null sein kann. Wenn nicht anders angegeben, können gegebenenfalls substituierte Gruppen durch so viele fakultative Substituenten substituiert sein, wie sich durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch einen Nicht-Wasserstoff- Substituenten an einem beliebigen verfügbaren Kohlenstoff- oder Stickstoff- oder Schwefelatom unterbringen lassen. Normalerweise kann die Anzahl an fakultativen Substituenten (falls vorhanden) 1 , 2, 3, 4 oder 5, insbesondere von 1 , 2 oder 3 sein. So, wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ein- oder mehrfach", zum Beispiel in der Definition der Substituenten der Verbindungen der allgemeinen Formeln der vorliegenden Erfindung, "1 , 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1 , 2, 3 oder 4, besonders bevorzugt 1 , 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt 1 oder 2".
Sind Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert, so können die Reste, wenn nicht anders angegeben, ein- oder mehrfach substituiert sein. Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen aller Reste, die mehrfach auftreten, unabhängig voneinander. Eine Substitution durch einen, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Substituenten ist bevorzugt. Die Substitution durch einen Substituenten ist besonders bevorzugt.
Alkyl
Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten, monovalenten
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), in der Regel 1 bis 6 (Ci-C6-Alkyl), bevorzugt 1 bis 4 (Ci-C4-Alkyl), und besonders bevorzugt 1 bis 3
Kohlenstoffatomen (Ci-C3-Alkyl).
Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, iso-Propyl-, iso-Butyl-, sec-Butyl, tert-Butyl-, iso-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, 1 -Methylbutyl-, 1 -Ethylpropyl-, 1 ,2-Dimethylpropyl, neo-Pentyl-, 1 ,1 -Dimethylpropyl-, 4-Methylpentyl-, 3-Methylpentyl-, 2-Methylpentyl-, 1 - Methylpentyl-, 2-Ethylbutyl-, 1 -Ethylbutyl-, 3,3-Dimethylbutyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, 1 ,1 - Dimethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, 1 ,3-Dimethylbutyl- und 1 ,2-Dimethylbutyk
Besonders bevorzugt ist ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- und tert-Butylrest.
Heteroalkyl
Heteroalkyl steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der
Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)-NRY-,
-NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoff kette einschließlich der Seitenketten (verzweigte
Kohlenwasserstoffkette), sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
-NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, Hierbei steht Ry jeweils für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C10- Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, Ci -Cß-Alkyl- oder Phenyl-.
Alkenyl
Alkenyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoff kette mit einer oder zwei Doppelbindungen und 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-Cio-Alkenyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2-C3-Alkenyl), wobei es sich versteht, dass, wenn die Alkenylgruppe mehr als eine Doppelbindung enthält, die
Doppelbindungen isoliert voneinander oder miteinander konjugiert sein können. Bei der Alkenylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethenyl- (bzw. Vinyl-),
Prop-2-en-1 -yl- (bzw.„Allyl-"), Prop-1 -en-1 -yl-, But-3-enyl-, But-2-enyl-, But-1 -enyl-, Pent-4-enyl-, Pent-3-enyl-, Pent-2-enyl-, Pent-1 -enyl-, Hex-5-enyl-, Hex-4-enyl-,
Hex-3-enyl-, Hex-2-enyl-, Hex-1 -enyl-, Prop-1 -en-2-yl- (bzw.„Isopropenyl-"), 2- Methylprop-2-enyl-, 1 -Methylprop-2-enyl-, 2-Methylprop-1 -enyl-, 1 -Methylprop-1 -enyl-,
3- Methylbut-3-enyl-, 2-Methylbut-3-enyl-, "l -Methylbut-3-enyl-, 3-Methylbut-2-enyl-,
2- Methylbut-2-enyl-, 1 -Methylbut-2-enyl-, 3-Methylbut-1 -enyl-, 2-Methylbut-1 -enyl-, 1 -Methylbut-1 -enyl-, 1 -,1 -Dimethylprop-2-enyl-, 1 -Ethylprop-1 -enyl-, 1 -Propylvinyl-, 1 -lsopropylvinyl-, 4-Methylpent-4-enyl-, 3-Methylpent-4-enyl-, 2-Methylpent-4-enyl-, 1 -Methylpent-4-enyl-, 4-Methylpent-3-enyl-, 3-Methylpent-3-enyl-, 2-Methylpent-3-enyl-, 1 -Methylpent-3-enyl-, 4-Methylpent-2-enyl-, 3-Methylpent-2-enyl-, 2-Methylpent-2-enyl-, 1 -Methylpent-2-enyl-, 4-Methylpent-1 -enyl-, 3-Methylpent-1 -enyl-, 2-Methylpent-1 -enyl-,
1 - Methylpent-l -enyl-, 3-Ethylbut-3-enyl-, 2-Ethylbut-3-enyl-, 1 -Ethylbut-3-enyl-,
3- Ethylbut-2-enyl-, 2-Ethylbut-2-enyl-, 1 -Ethylbut-2-enyl-, 3-Ethylbut-1 -enyl-,
2- Ethylbut-1 -enyl-, 1 -Ethylbut-1 -enyl-, 2-Propylprop-2-enyl-, 1 -Propylprop-2-enyl-, 2-lsopropylprop-2-enyl-, 1 -lsopropylprop-2-enyl-, 2-Propylprop-1 -enyl-,
1 -Propylprop-1 -enyl-, 2-lsopropylprop-1 -enyl-, 1 -lsopropylprop-1 -enyl-,
3,3-Dimethylprop-1 -enyl-, 1 -(1 , 1 -Dimethylethyl)ethenyl-, Buta-1 ,3-dienyl-,
Penta-1 ,4-dienyl- oder Hexa-1 -5-dienylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Gruppe um Vinyl oder Allyl.
Alkinyl
Alkinyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoff kette mit einer Dreifachbindung und mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C10- Alkinyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2-C3-Alkinyl). Bei der
C2-C6-Alkinylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethinyl-, Prop-1 -inyl-,
Prop-2-inyl- (bzw. Propargyl-), But-1 -inyl-, But-2-inyl-, But-3-inyl-, Pent-1 -inyl-, Pent-2-inyl- , Pent-3-inyl-, Pent-4-inyl-, Hex-1 -inyl-, Hex-2-inyl-, Hex-3-inyl-, Hex-4-inyl-, Hex-5-inyl-, 1 -Methylprop-2-inyl-, 2-Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-2-inyl-,
3-Methylbut-1 -inyl-, 1 -Ethylprop-2-inyl-, 3-Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-4-inyl-, 1 -Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-3-inyl-, 1 -Methylpent-3-inyl-, 4-Methylpent-2-inyl-, 1 -Methylpent-2-inyl-, 4-Methylpent-1 -inyl-, 3-Methylpent-1 -inyl-, 2-Ethylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbut-2-inyl-, 1 -Propylprop-2-inyl-, 1 -lsopropylprop-2-inyl-,
2.2- Dimethylbut-3-inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-3-inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-2-inyl- oder
3.3- Dimethylbut-1 -inylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Alkinylgruppe um Ethinyl, Prop-1 -inyl oder Prop-2-inyl. Cvcloalkyl
Cycloalkyl steht für einen gesättigten einwertigen mono- oder bicyclischen
Kohlenwasserstoff rest mit 3-12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl).
Hierbei steht ein monocyclischer Kohlenwasserstoffrest für einen monovalenten
Kohlenwasserstoff rest mit in der Regel 3 bis 10 (C3-Cio-Cycloalkyl), bevorzugt 3 bis 8 (Cs-Cs-Cycloalkyl), und besonders bevorzugt 3 bis 7 (C3-C7-Cycloalkyl)
Kohlenstoffatomen.
Beispielhaft und bevorzugt für einen monocyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt: Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl- und Cyclooctyk Besonders bevorzugt ist ein Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cylopentyl-, Cyclohexyl- und Cycloheptyl-.
Hierbei steht ein bicyclischer Kohlenwasserstoff rest für einen Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl), wobei hierbei eine Fusion aus zwei gesättigten Ringsystemen zu verstehen ist, die sich gemeinsam zwei direkt benachbarte Atome teilen. Beispielhaft und bevorzugt für einen bicyclischen
Kohlenwasserstoff rest seien genannt: Bicyclo[2.2.0]hexyl-, Bicyclo[3.3.0]octyl-,
Bicyclo[4.4.0]decyl-, Bicyclo[5.4.0]undecyl-, Bicyclo[3.2.0]heptyl-, Bicyclo[4.2.0]octyl-, Bicyclo[5.2.0]nonyl-, Bicyclo[6.2.0]decyl-, Bicyclo[4.3.0]nonyl-, Bicyclo[5.3.0]decyl-, Bicyclo[6.3.0]undecyl- und Bicyclo[5.4.0]undecyl-,
Heterocycloalkyl
Heterocycloalkyl steht für ein nicht aromatisches mono- oder bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können Stickstoffatome, Sauerstoffatome oder Schwefelatome vorkommen.
Ein monocyclisches Ringsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 oder 6 Ringatome aufweisen.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 3 Ringatomen seien genannt: Aziridinyk
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 4 Ringatomen seien genannt: Azetidinyl-, Oxetanyk
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 5 Ringatomen seien genannt: Pyrrolidinyl-, Imidazolidinyl- , Pyrazolidinyl-, Pyrrolinyl-, Dioxolanyl- und Tetrahydro- furanyk
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 6 Ringatomen seien genannt: Piperidinyl-, Piperazinyl-, Morpholinyl-, Dioxanyl-, Tetrahydropyranyl- und
Thiomorpholinyk
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 7 Ringatomen seien genannt: Azepanyl-, Oxepanyl-, 1 ,3-Diazepanyl-, 1 ,4-Diazepanyk
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 8 Ringatomen seien genannt: Oxocanyl-, Azocanyk
Unter monocyclischem Heterocycloalkyl sind 4 bis 7-glied rige, gesättigte
Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Morpholinyl-, Piperidinyl-, Pyrrolidinyl- und Tetrahydrofuranyk
Ein bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können, können gemäß der vorliegenden Erfindung 6 bis 12, bevorzugt 6 bis 10 Ringatome aufweisen, wobei ein, zwei, drei oder vier Kohlenstoffatome gegen gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe O, N und S ausgetauscht sein können.
Beispielhaft seien genannt: Azabicyclo[3.3.0]octyl-, Azabicyclo[4.3.0]nonyl-,
Diazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Oxazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Thiazabicyclo[4.3.0]nonyl- oder Azabicyclo[4.4.0]decyl- sowie aus weiteren möglichen Kombinationen gemäß Definition abgeleitete Reste.
Besonders bevorzugt ist Perhydrocyclopenta[c]pyrrolyl-, Perhydrofuro[3,2-c]pyridinyl-, Perhydropyrrolo[1 ,2-a]pyrazinyl-, Perhydropyrrolo[3,4-c]pyrrolyl- und 3,4- Methylenedioxyphenyl. Heterocycloalkoxy
Heterocycloalkoxy steht für Heterocycloalkyl, welches über eine -O- Gruppe mit dem Rest des Moleküls verbunden ist.
Alkoxy
Alkoxy steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten Alkyletherrest der Formel -O- Alkyl mit in der Regel 1 bis 6 (Ci-C6-Alkoxy), bevorzugt 1 bis 4 (Ci-C4-Alkoxy), und besonders bevorzugt 1 bis 3 (Ci-C3-Alkoxy) Kohlenstoffatomen.
Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:
Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, Isopropoxy-, ierf-Butoxy-, n-Pentyloxy- und n-Hexyloxy-. Aryl
Aryl bedeutet ein monovalentes, mono- oder bicyclisches, aus Kohlenstoffatomen bestehendes aromatisches Ringsystem. Beispiele sind Naphthyl- und Phenyl-; bevorzugt ist Phenyl- beziehungsweise ein Phenylrest.
C6-Cio-Aralkyl bzw. Arylalkyl
Unter C6-Cio-Aralkyl bzw. Arylalkyljst ein linearer oder verzweigter, gesättigter,
monovalenter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), zu verstehen, an dem ein Arylrest gemäß obiger Definition gebunden ist. Darunter zu verstehen ist z.B. eine Gruppe C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, Benzyl.
Heteroaryl
Heteroaryl bedeutet ein einwertiges monocyclisches, bicyclisches oder tricyclisches aromatisches Ringsystem mit 5, 6, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 oder 14 Ringatomen (eine„5- bis 14- gliedrige Heteroaryl"gruppe), insbesondere 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen, zu verstehen, das mindestens ein Ringheteroatom und gegebenenfalls ein, zwei oder drei weitere Ringheteroatome aus der Gruppe N, O und S enthält und das über ein Ringkohlenstoffatom oder gegebenenfalls (wenn es die Wertigkeit erlaubt) über ein Ringstickstoffatom gebunden ist. Bei der Heteroarylgruppe kann es sich um eine 5-glied rige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Thiadiazolyl oder Tetrazolyl; oder eine 6-gliedrige Heteroarylgrupoe wie zum Beispiel Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl oder Triazinyl; oder eine tricyclische Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Carbazolyl, Acridinyl oder Phenazinyl; oder eine 9-glied rige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, Benzimidazolyl, Benzothiazolyl,
Benzotriazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Indolizinyl oder Purinyl; oder eine 10-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Chinolinyl, Chinazolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinoxalinyl oder Pteridinyl handeln.
Im Allgemeinen, und wenn nicht anders erwähnt, schließen die Heteroarylreste alle möglichen isomeren Formen davon ein, z. B. Tautomere und Positionsisomere in Bezug auf den Anbindungspunkt zum Rest des Moleküls. Somit schließt, als erläuterndes, nicht einschließendes Beispiel, der Begriff Pyridinyl Pyridin-2-yl, Pyridin-3-yl und Pyridin-4-yl ein; oder der Begriff Thienyl schließt Thien-2-yl und Thien-3-yl ein.
C5-Cio-Heteroaryl
C5-io-Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für ein mono-oder bicyclisches, aromatisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatome, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können vorkommen: N, O, S, S(=0) und/ oder S(=0)2. Die Bindungsvalenz kann sich an einem beliebigen aromatischen
Kohlenstoffatom oder an einem Stickstoffatom befinden.
Ein monocyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 5 oder 6 Ringatome.
Bevorzugt sind solche Heteroarylreste mit ein oder zwei Heteroatomen. Besonders bevorzugt sind hierbei ein oder zwei Stickstoffatome.
Heteroarylreste mit 5 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Thienyl, Thiazolyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl,
Oxadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl und Thiadiazolyl.
Heteroarylreste mit 6 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe: Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl und Triazinyl.
Ein bicyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 9 oder 10
Ringatome.
Heteroarylreste mit 9 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Phthalidyl, Thiophthalidyl, Indolyl, Isoindolyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzofuryl, Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Azocinyl, Indolizinyl, Purinyl, Indolinyl.
Heteroarylreste mit 10 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Isochinolinyl, Chinolinyl, Chinolizinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl,
1 ,7- und 1 ,8-Naphthyridinyl, Pteridinyl, Chromanyl.
Heteroaryl-alkyl
Unter Heteroaryl-alkyl ist ein linearer oder verzweigter, gesättigter, monovalenter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), zu verstehen, an dem ein Heteroarylrest gemäß obiger Definition gebunden ist. Darunter zu verstehen ist z.B. eine Gruppe C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyk
Aralkoxy bzw. Arylalkoxy
Unter Aralkoxy bzw. Arylalkoxy ist ein linearer oder verzweigter, gesättigter, monovalenter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), zu verstehen, an dem ein Arylrest gemäß obiger Definition gebunden ist. Darunter zu verstehen ist z.B. eine Gruppe C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-.
Aryloxy
Aryloxy steht für einen Arylrest, der Formel Aryl-O-.
Beispielhaft und bevorzugt seien genannt: Phenoxy- und Naphthyloxy- Heteroalkoxy
Heteroalkoxy steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die über -O- an den Rest des Moleküls gebunden ist und die weiterhin einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -
S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)-NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der
Seitenketten (verzweigte Kohlenwasserstoffkette), sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)- NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Hierbei steht Ry jeweils für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| Q- Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, Ci -Cß-Alkyl- oder Phenyl-.
Halogen beziehungsweise Halogenatom steht im Rahmen der Erfindung für Fluor (-F), Chlor (-CI), Brom (-Br), oder lod (-1).
Bevorzugt ist Fluor (-F), Chlor (-CI) und Brom (-Br).
Die erfindungsgemäßen Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren (cytotoxisches Agens) weisen vorzugsweise die folgende Formel (IIa) auf:
Figure imgf000032_0001
in der
X1 für ,
X2 für N und
Xs für C steht,
oder
Figure imgf000032_0002
x2 für C und
Xs für N steht,
oder
Figure imgf000032_0003
X2 für C und
X3 für N steht,
oder
Figure imgf000032_0004
X2 für C und
Xs für C steht,
oder
Figure imgf000032_0005
X2 für N und
Xs für C steht. A für -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, oder -S(=0)2-NH- steht
R1 für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH2)0-3Z steht,
Z für -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -NH2, -(ΟΗ2ΟΗ20)ο-3-(ΟΗ2)ο-3Ζ'
oder -CH(CH2W)Z' stehen, γ3 für -Η oder -(CH2)o-3Z' steht,
Ζ' fÜr -H, -NH2, -S(=0)3H, -COOH, -NH-C(=0)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(C(=0)-NH-CHY4)i-3COOH steht,
w für -H oder -OH steht,
γ4 für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit
-NH-C(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -NH2 substituiert ist, für -H, -L-#1 , -MOD, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z steht, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-OY3 steht,
Υ1 und Υ2 unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
γ3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Ζ' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
γ4 für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit
-NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -NH2 substituiert ist,
γ5 für-H oder -C(=0)-CHY6-NH2 steht,
γ6 für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,
Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2- NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2- Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, η 0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H, -(CH2)o-3-CH(NHC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder -(CH2)0-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -C(=0)-OH steht,
für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' steht, für -H, -NH2, -N02, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)0-3Z steht,
für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht, unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-io-Alkinyl-, Hydroxy-, -N02, -NH2, -COOH oder Halogen stehen, für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-io- Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-io-Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl-, Fluor-C4-io-Cycloalkyl- oder -(CH2)o-2-(HZ2) steht, für einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatome, ausgewählt aus N, O und S steht, der mit -OH, -COOH, -NH2 oder -L-#1 substituiert sein kann,
R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht,
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht, o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,
-MOD für -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, G1 für -NH-C-(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /N co stehti
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach durch -O-, -S-, -S(=0)-,
-S(=0)2-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -NH-C(=0)-NH2,
-COOH, -OH, -IM H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| 0"Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon,
Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht und
-MOD mindestens eine, vorzugsweise zwei -COOH Gruppen aufweist und
eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen bei denen
R3 für— L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, C5-10-
Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppe, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl- Gruppen, 1 -3-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, wobei n und Z die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Der Rest -(C(=0)-NH-CHY4)i-3-COOH bedeutet, dass ein Rest -C(=0)-NH-CHY4-COOH vorliegt, oder zwei Reste -(C(=0)-NH-CHY4) aneinander gebunden sein können, gemäß -C(=0)-NH-CHY4-C(=0)-NH-CHY4-COOH, oder drei Reste aneinander gebunden sein können, gemäß
-C(=0)-NH-CHY4-C(=0)-NH-CHY4-C(=0)-NH-CHY4-COOH.
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen
Xi für N steht,
x2 für N steht und
Xs für C steht,
oder
Xi für CH oder CF steht,
x2 für C steht und
Xs für N steht,
oder
Xi für NH steht,
x2 für C steht und
Xs für C steht,
oder
Xi für H steht,
X2 für N steht und
Xs für C steht.
Insbesondere sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa) bevorzugt, in denen X1 für N steht, X2 für N steht und
Xs für C steht,
oder
Xi für CH steht,
x2 für C steht und
Xs für N steht.
Ganz besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen
Xi für CH steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht. Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen A für - C(=0)- steht.
Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen R1 für -L-#1 , -MOD, -H, -COOH, -C(=0)-NH-NH2, -(CH2)i-3NH2, -C(=0)-NZ"(CH2)i-3 NH2 und -C(=0)-NZ"CH2COOH steht und
Z" für -H oder -NH2 steht.
Falls in der allgemeinen Formel (IIa) R4 für -L-#1 steht, dann steht R1 vorzugsweise für - MOD.
Insbesondere steht in der allgemeinen Formel (IIa) R4 für -L-#1 und R1 für -MOD falls R3 nicht für -MOD steht.
In der allgemeinen Formel (IIa) steht R2 vorzugsweise für -H.
In der allgemeinen Formel (IIa) steht R3 bevorzugt für
-L-#1 oder -MOD, oder für Ci-10-Alkyl-, das gegebenenfalls mit -OH, -O-Alkyl, -SH, -S- Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl, -NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0)n-Alkyl, -S(=0)2-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, oder -NH2 substituiert sein kann. Alkyl bedeutet hier vorzugsweise Ci-3Alkyk In der allgemeinen Formel (IIa) steht R5 ist bevorzugt für -H oder -F.
In der allgemeinen Formel (IIa) steht bevorzugt R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-io-Alkyl, Fluor- Ci-io-Alkyl, C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2- io-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen-.
In der allgemeinen Formel (IIa) steht bevorzugt R8 für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe, insbesondere für eine Gruppe -C(CH3)2-(CH2)o-2-Ry, wobei Ry für -H, -OH, -C(=0)2H, oder -IMH2 steht.
Besonders bevorzugt steht R8 für die Gruppe-C(CHs)2-(CH2) -Ry , wobei Ry für -H steht.
In der allgemeinen Formel (IIa) steht R9 bevorzugt für -H oder -F. In der allgemeinen Formel (IIa) steht -MOD bevorzugt für die Gruppe
QOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-C(=0)-,
wobei
x eine Zahl von 2 bis 6 ist,
Q für -OH oder -NH2 steht
X in den -(CHX)x- Gruppen unabhängig voneinander für -H, -IMH2, COOH oder -
CONH2 steht, und
AM für -C(=0)-NH- oder -NH-C(=0)- steht. In der allgemeinen Formel (IIa) steht -MOD besonders bevorzugt für die Gruppe
QOC-CH2-CH2-CH(COQ)-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-,
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-C(=0)- und
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-. wobei Q für -OH oder -IMH2 steht
Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in der
Xi für CH, für C und
für N steht, für -C(=0)- steht, für -L-#1 , -H, oder -MO D steht für -(Lb)0-(LIG)p steht, für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird, für einen Linker steht, unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht, für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, 0 oder 1 ist,
für -NH-C-(=0)- oder -C(=0)-NH- steht, 0 oder 1 ist und für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein kann,
für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,
für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, für -H oder -COOH steht für -H, für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei
Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH- Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z>(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -C(=0)-OH steht, R4 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')
steht,
R5 für -H steht,
R6 und R7 für Fluor stehen,
R8 für t-Butyl steht,
R9 für -H steht,
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Hierbei ist Ci-3-Alkyl besonders bevorzugt.
Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (I Ia), in der
Figure imgf000041_0001
X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht,
R1 für -L-#1 , -H, oder -MO D steht
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht, o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, -MOD für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, n 0,
G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -NRY- oder -C(=0)- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -C(=0)-NH2, -COOH, substituiert sein kann,
Ry für -H oder C-| -C 0-Alkyl- steht, das mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH,
-OH, -IMH2, substituiert sein kann, G3 für -COOH steht
R2 für -H, für-L-#1 steht, R4 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')
steht,
R5 für -H steht,
R6 und R7 für Fluor stehen,
R8 für t-Butyl steht,
R9 für -H steht,
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,
sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Auch sind Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa')
Figure imgf000043_0001
(IIa')
bevorzugt, in der
Figure imgf000043_0002
X2 für N und X3 für C steht,
oder
Figure imgf000044_0001
X2 für C und
X3 für N steht,
oder
Figure imgf000044_0002
X2 für C und
X3 für N steht,
oder
Figure imgf000044_0003
X2 für C und
X3 für C steht,
oder
Figure imgf000044_0004
X2 für N und
X3 für C steht.
A für die Gruppe *-C(=0)-(CH2)x-S-CH2-CH(COOH)-NH-** steht, x für 1 oder 2 steht,
* für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht, für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la') steht,
R1 für -MOD steht,
-MOD für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
>10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, n 0 ist, G1 für -C(=0)-NH- steht, o für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht
R2 für -H steht,
R3 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')
steht,
R4 für -H steht,
R5 für -H, -NH2, -N02, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)0-3Z steht,
Z für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-
OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-io- Alkinyl-, Hydroxy-, -N02, -NH2, -COOH oder Halogen stehen, für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-1 Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,
für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Davon besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemein Formel (IIa'), in der
Figure imgf000046_0001
X3 für N steht,
A für die Gruppe *-C(=0)-(CH2)x-S-CH2-CH(COOH)-NH-** steht, x für 1 oder 2 steht,
* für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht,
** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der
Formeln (la') steht,
R1 für -MOD steht,
-MOD für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, n 0 ist,
G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-, -NRvC(=0)-, -C(=0)NRy-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRyNRy-,
-C(=0)-NRyNRy-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder
Sulfonsaure substituiert sein kann,
für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,
für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, für -H oder -COOH steht
für -H steht,
für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la) steht, für -H steht, für -H steht, für Fluor stehen, für t-Butyl steht und für -H steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa")
Figure imgf000048_0001
(Ha")
Figure imgf000048_0002
X2 für N und
X3 für C steht,
oder
Figure imgf000048_0003
X2 für C und
X3 für N steht,
oder
X! für CH oder CF,
X2 für C und
X3 für N steht,
oder
Xi für NH,
X2 für C und
X3 für C steht,
oder
Xi für CH,
X2 für N und
X3 für C steht.
A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0)2-, oder -S(=0)2-NH- steht, für die Gruppe * - (G1 )0-G2-NH- ** steht,
* für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches
Agens) steht,
** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der
Formeln la' steht,
G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder
Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
R2 für -H steht,
R3 für eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-,
Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei - NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei Nh -Gruppen oder ein bis drei (CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, n 0, 1 oder 2 ist,
Z für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, Y3 für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder
-(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R4 für -H steht, R5 für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)o-3Z steht,
Z für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-
OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, Y3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen,
R8 für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10- Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,
R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate. Davon besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (II"), in der
Figure imgf000051_0001
X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht,
R1 für die Gruppe * - (G1 )0-G2-NH- ** steht,
* für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches
Agens) steht,
** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der
Formeln (la') steht,
G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| o-Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, R2 für -H steht, R3 für -CH2-OH steht,
R4 für -H steht, R5 für -H steht,
R6 und R7 für Fluor stehen,
R8 für t-Butyl steht und
R9 für -H steht,
sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Weiterhin sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa) bevorzugt bei denen
R1 für -H, -L-#1 , -COOH,
QOC-CH2-CH2-CH(COQ)-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-;
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-C(=0)- oder HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)- steht,
R2 für -H steht,
A für -C(=0)- steht,
Q für -OH oder -NH2 steht
R3 für -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2-S-CH2CH-(COOH)-NH-C(=0)-CH3,
-CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei Aminogruppen, ein bis drei Alkylgruppen oder ein bis drei Halogenalkylgruppen, substituiert sein kann,
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-;
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-C(=0)-;
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)- oder
-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH steht,
x 0 oder 1 ist,
Y5 für -H oder -NHY6 steht,
Y6 für -H, -C(=0)-CH3 oder -L-#1 steht, R5 für -H steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl- oder Halogen- stehen,
R8 für Ci-4-Alkyl- steht und
R9 für -H steht.
Hierbei bevorzugt sind insbesondere dolche Verbindungen bei denen
R6 und R7 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Fluor stehen und
R8 für tert-Butyl steht.
Weiterhin sind solche Verbindungen bevorzugt, bei denen
R1 für -H, -COOH,
QOC-CH2-CH2-CH(COQ)-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-,
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-C(=0)- oder HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)- steht,
R2 für -H steht,
A für -C(=0)- steht,
R3 für -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2-S-CH2CH(COOH)NH-C(=0)-CH3,
-CH(CH3)OCH3,
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-,
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-C(=0)-,
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-, -CH2-Sx-(CH2)o-4-CHY5-COOH oder für eine Phenylgruppe steht, die mit 1 -3 Halogenatomen, ein bis drei Aminogruppen, ein bis drei Alkylgruppen oder ein bis drei Haloalkylgruppen substituert sein kann, x 0 oder 1 ist,
Y5 für -H oder -NHY6 steht,
Y6 für -H, -C(=0)-CH3 oder -L-#1 steht, R5 für -H steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl- oder Halogen- stehen,
R8 für Ci-4-Alkyl steht und
R9 für -H steht,
wobei einer der Substituenten R1 oder R3für -L-#1 steht.
Hierbei sind insbesondere solche Verbindungen bevorzugt bei denen
R6 und R7 für -F steht und
R8 für tert-Butyl steht.
Weiterhin sind Verbindungen der allgemeinen Formel (IIb)
Figure imgf000054_0001
bevorzugt, in der
Xi, X2,X3, R1, R2, R4, R5, R6,
R7, R8 und R9 die in der allgemeinen Formel (IIa) angegebenen Bedeutungen haben und
A für -C(=0)- steht,
B für eine Einfachbindung, -O-CH2- oder -CH2-O- steht,
R20 für -NH2, -F, -CF3, oder -CH3 steht und
n 0, 1 , oder 2 ist.
Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIb), in der Xi für CH steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht.
Auch sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (llc)
Figure imgf000055_0001
bevorzugt, in der
Xi, X2, X3 A, R1, R3, R4, R6, R7, R8 und R9 die in der allgemeinen Formel (IIa)
angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (llc), in der Xi für CH steht,
X2 für C steht, X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht und
R3 für -CH2OH, -CH2OCH3, -CH(CH3)OH oder -CH(CH3)OCH3 steht.
Ferner sind auch solche Verbindungen der allgemeinen Formel (l ld):
Figure imgf000056_0001
bevorzugt, in der
Χι , X2, X3, A, R3, R4, R6, R7, R8 und R9 die in der allgemeinen Formel (I Ia) angegebenen Bedeutungen haben. Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (l ld), in der
Xi für CH steht,
X2 für C steht,
X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht,
R3 für -CH2-Sx-(CH2)o-4-CHY5-COOH steht,
x für 0 oder 1 steht,
Y5 für -H oder -NHY6 steht und
Y6 für -H oder -C(=0)CH3 steht.
Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (IIb), (l lc) und (lld), bei denen • Z für -Cl oder -Br steht;
• R1 für -(CH2)o-3Z steht,
Z für -C(=0)-NY1Y2 steht,
Y1 für -H, -NH2, oder -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'steht;
Y2 für -(CH2CH20)o-3-(CH2)0-3Z' steht und
Z' für -C(=0)-OH steht;
• Y für -H steht,
Y2 für -(CH2CH20)3-CH2CH2Z' steht und
Z' für -C(=0)-OH steht;
• Y1 für -H steht,
Y2 für -CH2CH2Z' steht,
Z' für -(C(=0)NHCHY4)2-COOH steht und
Y4 die in der allgemeinen Formel (I Ia) angegebene Bedeutung hat;
• Y1 für -H steht,
Y2 für -CH2CH2Z' steht,
Z für -(C(=0)-NHCHY4)2-COOH steht und
Y4 für /-Propyl- oder -(CH2)3-NH-C(=0)-N H2 steht;
• Y1 für -H steht,
Y2 für -CH2CH2Z' steht,
Z' für -(C(=0)-NHCHY4)2-COOH steht und
Y4 für -CH3 oder -(CH2)3-NH-C(=0)-N H2 steht;
• Y4 für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiertes C1-6 Alkyl steht; · Y4 für /'-Propyl- oder -CH3 steht;
• Y1 für -H steht,
Y2 für -CH2CH2Z' steht,
Z' für -C(=0)-NHCHY4-COOH steht und
Y4 für gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl- oder Benzyl- steht; Y4 für Aminobenzyl- steht;
R2 für -(CH2)o-3Z steht,
Z für -SY3 steht und
Y3 die oben angegebene Bedeutung hat;
R4 für -C(=0)-CHY4-NHY5 steht,
Y4 die oben angegebene Bedeutung hat und
Y5 für -H steht;
R4 für -C(=0)-CHY4-NHY5 steht,
Y5 für -C(=0)-CHY6-NH2 steht und
Y4 undY6 die oben angegebene Bedeutungen haben; · Y4 für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit
-NH-C(=0)-NH2 substituiert sein kann.
Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in der R1 , R2 oder R3 für -MOD steht.
Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen bei denen R3 für -MOD und R1 für— L-#1 steht,
wobei
-MOD für -(NR10)n-(G )o-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht;
G1 für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /N CO steht, n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch
-O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRy-, -NRyC(=0)-, -C(=0)-NRy, -NRyNRy-, -S(=0)2-NRyNRy-, -C(=0)-NRyNRy-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| o-Alkenyl-, oder C2-C-| o-Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid,
Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können, Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,
G3 für -H oder -COOH steht und
wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine oder bevorzugt zwei -COOH Gruppen aufweist und eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann.
Besonders bevorzugt weist die Gruppe -MOD mindestens eine -COOH-Gruppe auf, z.B. in einer Betaingruppe.
Vorzugsweise ist diese -COOH-Gruppe terminal ständig.
Weiterhin besonders bevorzugt ist die Gruppe -MOD die Gruppe
-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH, in der
x 0 oder 1 ist,
Y5 für -H oder -NHY6 steht und
Y6 für -H oder -C(=0)CH3 steht.
Weiterhin bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc) und
(lld), in denen
Xi für N steht,
X2 für N steht und X3 für C steht,
oder
Xi für N steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht,
oder
Xi für CH oder CF steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht,
oder
Xi für NH steht,
X2 für C steht und
X3 für C steht,
oder
Xi für CH oder CF steht,
X2 für N steht und
X3 für C steht, für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH2)o-3Z steht,
für -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH2W)Z' stehen,
für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -IMH2, -S(=0)3H, -COOH, -NH-C(=0)-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH oder -(C(=0)-NH-CHY4)i-3COOH steht,
für -H oder -OH steht,
für lineares oder verzweigtes Ci-β Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl- oder Benzyl- steht, die gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert sind, für -H, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z steht,
für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für - H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht;
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert ist oder für Aryl- oder Benzyl- steht, die gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert sind,
für -H oder -C(=0)-CHY6-NH2 steht,
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl steht, für -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2- oder -S(=0)2-NH- steht, für— L-#1 , -MOD oder eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-,
Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die gegebenenfalls mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkyl-Gruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei
-NH((CH2CH20)i-2oH)-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(NH-C(=0)-CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht, für -H, -MOD, -NH2, -NO2, Halogen, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH -(CH2)o-3Z steht,
für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht und
für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -C(=0)-OH steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-io-Alkinyl-, Hydroxy, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen, R8 für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-10-
Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-,C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-io-Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor- C4-io-Cycloalkyl- steht, R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht,
-MOD für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht,
G1 für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /N CO steht,
n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen steht, die ein- oder mehrfach durch -O-, -S-, -S(=0)-,
-S(=0)2-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)-NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH,
-IM H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, Ry für -H, -C(=0)-, -CRx=N-0- oder für gegebenenfalls mit NH-C(=0)-NH2,
-COOH, -OH, -IM H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiertes Phenyl-, C-i -C-i Q-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist und wobei R1 und R3 nicht gleichzeitig für— L-#1 stehen,
sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Hierbei besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (I Ib), (l lc) und (l ld), in denen
Xi für CH steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht. Hierbei weiterhin besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (I Ib), (l lc) und (lld), in denen für eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl-, C6-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-,
Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkyl-Gruppen, ein bis drei -O- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei -NH((CH2CH20)i-2oH)-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(NH-C(=0)-CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' steht und
für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht.
Weiterhin bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (I Ib), (l lc) und (lld) sind die , in denen Xi für N steht,
X2 für N steht und
X3 für C steht,
oder
Xi für N steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht,
oder
Xi für CH oder CF steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht,
oder Xi für NH steht,
X2 für C steht und
X3 für C steht,
oder
Xi für CH oder CF steht,
X2 für N steht und
X3 für C steht, für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH2)o-3Z steht,
für -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH2W)Z' steht,
für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -IMH2, -S(=0)3H, -COOH, -NH-C(=0)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(C(=0)-NH-CHY4)i-3COOH steht,
für -H oder -OH steht,
für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiertes Ci-β Alkyl- steht oder für gegebenenfalls mit -IMH2
substituiertes Aryl- oder Benzyl- steht, für -H, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z steht,
für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht,
für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiertes C1-6 Alkyl- steht oder für gegebenenfalls mit -IMH2 substituiertes Aryl- oder Benzyl- steht,
für -H oder -C(=0)-CHY6-NH2 steht,
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht,
A für -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2- oder -S(=0)2-NH- steht,
R3 für— L-#1 , -MOD oder eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-,
Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die gegebenenfalls mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkyl-Gruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei -NH((CH2CH20)i-2oH)-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(NH-C(=0)-CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht, für -H, -MOD, -NH2, -NO2, Halogen, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)o-3Z steht,
für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-OY3 steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht, unabhängig voneinander für -H oder Halogen stehen, für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl- oder Fluor- Ci-10-Alkyl- steht, für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht, für die Gruppe -(Lb)0-(LIG)P steht, für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird, für einen Linker steht, o und p jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, -MOD für -CH2-Sx-(CH2)o-4-CHY5-COOH steht,
x 0 oder 1 ist,
Y5 für -H oder -NHY6 steht,
Y6 für -H oder -C(=0)-CH3 steht und
wobei R1 und R3 nicht gleichzeitig für— L-#1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate. Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc) und (lld), in denen
Xi für CH steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht.
Hierbei weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc) und (lld) in denen R3 für eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-,
Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppe, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei IM H2- Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, Z für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IM H2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H , -(CH2)o-3-CH(N H-C(=0)-CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(N H2)Z', oder -(CH2)o-3Z' steht und -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht.
Sofern der Begriff „Alkyl" nicht weiter definiert ist, steht Alkyl vorzugsweise für C1-C10- Alkyl.
Sofern der Begriff„Halogen" nicht weiter definiert ist, steht Halogen für Fluor( -F), Chlor (-CI) und Brom (-Br).
Besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der allgemeinen Formeln (V), (VI) und (VII), in denen R1, R2, R3, R4 und R5 die in der allgemeinen Formel (IIa) angegebenen Bedeutungen haben:
Figure imgf000067_0001
Formel (VI) und
Figure imgf000068_0001
Formel (VII)
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (V), (VI) und (VII), in denen
R1, R2 und R5 für -H stehen und R4 die in der allgemeinen Formel (IIa) angegebenen Bedeutungen hat.
Insbesondere bevorzugt sind hierbei die Verbindungen der allgemeinen Formel (VI).
Binder, der an einen Rezeptor einer Tumorzelle bindet Der Begriff„Binder" wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches an ein Zielmolekül, das auf einer bestimmten, mit dem Binder-Wirkstoffkonjugat zu
adressierenden Zielzellen-Population vorhanden ist, bindet. Der Begriff Binder ist in seiner breitesten Auslegung zu verstehen und umfasst z.B. auch Lektine, Proteine die bestimmte Zuckerketten binden können, oder Phospholipid-bindende Proteine. Solche Binder umfassen beispielsweise hochmolekulare Proteine (Bindeproteine), Polypeptide oder
Peptide (Bindepeptide), nicht-peptidische (z.B. Aptamere (US5,270,163) Übersichtsartikel von Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), oder Vitamine) und alle anderen zellbindenden Moleküle oder Substanzen. Bindeproteine sind z.B. Antikörper und Antikörperfragmente oder Antikörpermimetika wie z.B. Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, Nanobodies (Übersichtsartikel von Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Bindepeptide sind z.B. Liganden eines Liganden-Rezeptorspaares, wie z.B. VEGF des Liganden-Rezeptorpaares VEGF/KDR, wie Transferrin des Liganden- Rezeptorpaares Transferrin/Transferrin-Rezeptor oder Cytokine/Cytokin-Rezeptor, wie TNFalpha des Liganden-Rezeptorpaares TNFalpha/TNFalpha Rezeptor.
Die erfindungsgemäßen Prodrugs enthalten vorzugsweise einen Binder, der an einen Rezeptor einer Tumorzelle binden kann und in der Regel nach Bindung an den Rezeptor von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird. Dieser Binder kann entweder mit der durch das Enyzm Legumain spaltbaren Gruppe gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain- spaltbaren Gruppe der Wirkstoff getrennt von dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt. In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -D-| dar und -R in der allgemeinen Formel (la) stellt (Lc)r-LIG dar (Ausführungsform A). Ferner kann der Binder mit dem Wirkstoffmolekül gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain-spaltbaren Gruppe der Wirkstoff zusammen mit dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt. In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -Dr (Lb)0-LIG dar und R- in der allgemeinen Formel (la) stellt Zi-(C(=0))q- dar
(Ausführungsform B).
Die Verbindungen der Ausführungsform A weisen vorzugsweise die folgende allgemeine Formel (III') auf:
Figure imgf000069_0001
(Ι Ν'),
wobei n, r, LIG, La, Lc, und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen
Bedeutungen haben.
Die Verbindungen der Ausführungsform B weisen vorzugsweise die folgende allgemeine Formel (IV) auf:
Figure imgf000070_0001
wobei n, o, R, LIG, La, Lb und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben.
Der Binder LIG ist in der Regel ein Peptid, Protein oder Derivat hiervon.
Entsprechende Peptide sind aus der Literatur bekannt (einen Überblick geben D.Böhme und A. Beck-Sickinger, J.Pept.Sci. 2015-21.186; siehe auch B. Forner et al., Specialty Chemicals Magazine, May 2012; V. Ahrens et al., Future Med. Chem. 2012, 4, 1567; W.Tai et al., Mol. Pharmaceutics 201 1 , 8, 901 ; R.Soudy et al.,
J. Med. Chem.2013, 56, 7564 und weitere Referenzen in der Einleitung von R.Soudy et al., M. Langer et al., J. Med. Chem. 2001 , 44, 1341 ; C.Gruendker et al., Oncology Reports 201 1 , 26, 629). Das Peptid bzw. Derivat hiervon wird vorzugsweise ausgewählt aus Octreotid, GnRH-lll, [D-Tyr6, ß-Ala11, Phe13, Nle14]BN(6-14), NT(8-13), c(RGDfK), HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2 (SEQ ID NO: 161 ),
NAPamide, [Phe7, Pro34]NPY, HER2-targeting peptide, ATEPRKQYATPRVFWTDAPG (SEQ ID NO: 162) oder LQWRRDDNVHNFGVWARYRL (SEQ ID NO: 163) [die Peptidsequenzen sind hier im geläufigen 1 -Buchstaben-Code für Aminosäuren angegeben]. Es ist möglich, weitere Peptidsequenzen mit Hilfe eines Screening- Verfahrens zu ermitteln, wie in Umlauf et al, Bioconj.Chem. 2014, Oct. 15; 25(10): 1829-37 beschrieben.
Im Falle der Ausführungsform A kann das Peptid direkt (z.B. mit seinem C-Terminus) an den N-Terminus der Legumain-spaltbaren Gruppe durch eine Peptidbindung gebunden sein. Es ist auch möglich, dass das Peptid über einen Linker Lc an den N- Terminus der Legumain-spaltbaren Gruppe gebunden ist, wobei der Linker
vorzugsweise an den C- oder N-Terminus des Peptids oder an eine Lysin- oder Cystein-Seitenkette des Peptids gebunden wird.
Im Falle der Ausführungsform B kann das Peptid direkt an das Wirkstoffmolekül gebunden sein. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Peptid über einen Linker Lb an das Wirkstoffmolekül gebunden ist, wobei der Linker vorzugsweise an den C- oder N- Terminus des Peptids oder an eine Lysin- oder Cystein-Seitenkette des Peptids gebunden wird. Die Bindung von Lb bzw. des Peptids erfolgt in der Regel durch Substitution eines H-Atoms im Wirkstoffmolekül.
So können im Falle der Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII) durch Substitution eines H-Atoms an R1, R2, R3, R5 oder R8 in einer dem Durchschnittsfachmann bekannten Weise Konjugate erhalten werden, wobei einer der Substituenten R1, R2, R3, R5, oder R8 -(L )0-LIG darstellt.
Besonders bevorzugt wird als Binder LIG ein Antikörper bzw. ein Antigen-bindendes Fragment oder Derivat hiervon, der bzw. das an ein extrazelluläres Zielmolekül einer Tumorzelle bindet. Besonders bevorzugt ist LIG ein Antikörper bzw. Fragment hiervon, an den bzw. an das ein oder mehrere cytotoxische Wirkstoffmoleküle gebunden sind. Im Falle der Ausführungsform A sind die erfindungsgemäßen Verbindungen also Antikörper-Drug-Konjugate (ADCs) der folgenden allgemeinen Formel (lila'):
Figure imgf000071_0001
(lila'), wobei n, r, La, Lc und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben, AB einen Antikörper darstellt, und s eine Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise 2 bis 8, besonders bevorzugt 2 bis 6 wie z.B. 4 darstellt.
Hierbei ist Di vorzugsweise eine Verbindung der allgemeinen Formel (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII), wobei ein Substituent ausgewählt aus R1, R2, R3, R4, R8 nicht die oben unter den allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) und (VII) angegebenen Bedeutungen aufweist, sondern für eine Bindung an La, also den self-immolative linker bzw. eine Bindung an eine Carbonylgruppe steht.
Im Falle der Ausführungsform B sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Antikörper- Prodrug-Konjugate (APDCs) der folgenden allgemeinen Formel (IVa'):
Figure imgf000072_0001
(IVa'),
in der n, o, R, La und Lb die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben und AB einen Antikörper darstellt, und s eine Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise 2 bis 8, besonders bevorzugt 2 bis 6 wie z.B. 4 darstellt. Hierbei ist Di vorzugsweise eine Verbindung gemäß den allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII), wobei ein Substituent R4 nicht die oben unter den allgemeinen Formenl (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII) angegebene Bedeutung aufweist, sondern die Bindung an La bzw. eine Carbonylgruppe darstellt.
Der Antikörper (wie z.B. AB in obigen allgemeinen Formeln (lila) und (IVa) ist
vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, insbesondere ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2 -Antikörper oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR- Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das organische Molekül an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.
Der Antikörper bindet an ein extrazelluläres Zielmolekül der Tumorzelle. Ein„Zielmolekül" wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches in der Zielzellenpopulation vorhanden ist, und kann ein Protein (z.B. ein Rezeptor eines Wachstumsfaktors) oder ein nicht-peptidisches Molekül sein (z.B. ein Zucker oder Phospholipid). Bevorzugt ist es ein Rezeptor oder ein Antigen.
Der Begriff„extrazelluläres" Zielmolekül beschreibt ein an die Zelle gebundenes
Zielmolekül, welches sich auf der Außenseite einer Zelle befindet oder den Teil eines Zielmoleküls, welcher sich auf der Außenseite einer Zelle befindet, d.h. ein Antikörper kann an einer intakten Zelle an sein extrazelluläres Zielmolekül binden. Ein extrazelluläres Zielmolekül kann in der Zellmembran verankert sein oder Bestandteil der Zellmembran sein. Der Fachmann kennt Verfahren, um extrazelluläre Zielmoleküle zu identifizieren. Für Proteine kann dies über eine Bestimmung der Transmembrandomäne(n) und die
Orientierung des Proteins in der Membran geschehen. Diese Angaben sind in der Regel in Proteindatenbanken (z.B. SwissProt) hinterlegt.
Der Begriff„Krebs-Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein„selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Unter dem Begriff "Binder" wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Binderpeptid, ein Derivat eines Binderpeptids, ein Binderprotein oder ein Derivat eines Binderproteins verstanden. Der Binder ist über eine Bindung mit dem Linker verknüpft. Die Verknüpfung des Binders kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Binders, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind:
Schwefel, über eine Sulfhydrylgruppe des Binders, Sauerstoff , über eine Carboxylgruppe oder Hydroxylgruppe des Binders und
Stickstoff, über eine primäre oder sekundäre Amingruppe.
Insbesondere wird gemäß der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff„Binder" ein Antikörper verstanden.
Die oben aufgeführten Heteroatome können im natürlichen Antikörper vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden.
Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Antikörpers mit dem organischen Rest in Formel (I) nur einen geringen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörpers zum
Zielmolekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluß auf die Bindeaktivität des Binders zum Zielmolekül.
Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CH1 , CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum
Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein.
Der Begriff„monoklonaler" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren.
Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen- bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden.
Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32).
Der Begriff„humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein„synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner
Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine
Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden.
Der Begriff„humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen
Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nicht-humanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden
Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt.
Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In machen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. Bei Chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert. Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1 , CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR1 ), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette und 31 - 35 (CDR1 ), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1 ), 50 - 52 (CDR2) und 91 -96 (CDR3) der variablen leichetn Kette und 26 - 32 (CDR1 ), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901 -917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.
Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 und lgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [delta/δ], [epsilon/ε], [gamma/γ] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt. Der Begriff„funktionales Fragment" oder„antigen-bindendes Antikörperfragment" eines Antikorpers/Immunoglobulins ist definiert als ein Fragment eines
Antikorpers/Immunoglobulins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen- Bindedomänen des Antikorpers/Immunoglobulins noch umfasst. Die„Antigen- Bindedomäne" eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere
Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen-Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 1 1 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 1 13 der VH (Nummerierung nach WO97/08320).
„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" der Erfindung umfassen nicht abschliessend Fab, Fab', F(ab')2 und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), linerae Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-chain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S.
Duebel, editors (2001 ) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als„multi-spezifische" oder„multi-funktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Multispezifische Antikörper können spezifisch für
unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO
92/05793; Tutt, et al., 1991 , J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601 ,8 19; oder Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab')2 oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder oder komplett verhindert werden kann. „Epitope" bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptoren eingehen können. Epitopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3-dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.
„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen- bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).
Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den
Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397). Der Durchschnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1 ):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den
Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich. Ein„isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV-Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Ausserdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden).
Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt. Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen
Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10"7 M_(als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10"^ M), wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nichtspezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders schließt nicht aus, dass der Antikörper oder Binder an mehrere Antigene/Zielmoleküle bindet (z.B. Orthologe aus verschiedenen Spezies). Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10"^ M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10~7 M), vorzugsweise von mindestens 10"8 M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10-9 M bis KT M auf. Die Kd-Werte können durch z.B.
Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine
Größenordnung verringert, also z.B. maximal von 10"8 M auf 10"^ M).
Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der
erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweisst als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden). Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft- Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zielprotein bindet. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Langschwanzmakaken.
In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und
Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind
erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zielprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet.
Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper
Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs- Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein„selektives Krebs-Zielmolekül"). Die
Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten. Antikörper, welche spezifisch gegen ein Antigen, wie z.B. ein Krebszell-Antigen, gerichtet sind, können vom Durchschnittsfachmann mittels ihm bekannter Verfahren hergestellt werden (wie z.B. rekombinante Expression) oder kommerziell erworben werden (wie z.B. von Merck KGaA, Deustchland). Beispiele bekannter kommerziell erhältlicher Antikörper in der Krebstherapie sind Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) und Herceptin® (Trastuzumab, Genentech). Trastuzumab ist ein rekombinanter humanisierter monokloaler Antikörper vom IgGl kappa Typ, welcher mit hoher Affinität in einem Zell-basierten Assay (Kd = 5 nM) die extrazelluläre Domäne des humanen epidermalen Wachstumsrezeptors bindet. Der Antikörper wird rekombinant in CHO-Zellen hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein selektives Krebs- Zielmolekül.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein Protein.
In einer Ausführungsform ist das Zielmolekül ein extrazelluläres Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das extrazelluläre Zielmolekül ein Protein.
Krebs-Zielmoleküle sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind im Folgenden aufgeführt.
Beispiele für Krebs-Zielmoleküle sind:
(1 ) EGFR (EGF-Rezeptor, NCBI-Referenzsequenz NP_005219.2, NCBI-Gene ID: 1956) (2) Mesothelin (SwissProt-Referenz Q13421 -3), wobei Mesothelin von den Aminosäuren 296-598 kodiert wird. Aminosäuren 37-286 kodieren für "megakaryocyte-potentiating factor". Mesothelin ist durch einen GPI-Anker in der Zellmembran verankert und ist extrazellulär lokalisiert.
(3) Carboanhydrase IX (CA9, SwissProt-Referenz Q16790), NCBI-Gene ID: 768) (4) C4.4a (NCBI -Referenzsequenz NP_055215.2; Synonym LYPD3, NCBI-Gene ID: 27076)
(5) CD52 (NCBI-Referenzsequenz NP_001794.2)
(6) HER2 (ERBB2; NCBI-Referenzsequenz NP_004439.2; NCBI-Gene ID: 2064) (7) CD20 (NCBI-Referenzsequenz NP_068769.2)
(8) das Lymphozyten Aktivierungsantigen CD30 (SwissProt ID P28908)
(9) das Lymphozyten Adhesionsmolekül CD22 (SwissProt ID P20273; NCBI-Gene ID: 933) (10) das Myloidzellen Oberflächenantigen CD33 (SwissProt ID P20138; NCBI-Gene ID: 945)
(1 1 ) das Transmembran Glykoprotein NMB (GPNMB, SwissProt ID Q14956, NCBI-Gene ID: 10457)
(12) das Adhesionsmolekül CD56 (SwissProt ID P13591 ) (13) das Oberflächenmolekül CD70 (SwissProt ID P32970, NCBI-Gene ID: 970)
(14) das Oberflächenmolekül CD74 (SwissProt ID P04233, NCBI-Gene ID: 972)
(15) das B-Lymphozyten Antigen CD19 (SwissProt ID P15391 , NCBI-Gene ID: 930)
(16) das Oberflächenprotein Mucin-1 (MUC1 , SwissProt ID P15941 , NCBI-Gene ID: 4582)
(17) das Oberflächenprotein CD138 (SwissProt ID P18827) (18) das Integrin alphaV (NCBI -Referenzsequenz: NP_002201.1 , NCBI-Gene ID: 3685)
(19) das teratocarcinoma-derived growth factor 1 Protein TDGF1 (NCBI - Referenzsequenz: NP_003203.1 , NCBI-Gene ID: 6997)
(20) das Prostata spezifische Membranantigen PSMA (Swiss Prot ID: Q04609; NCBI- Gene ID: 2346) (21 ) die Tyrosin-Proteinkinase EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317, NCBI-Gene ID: 1969)
(22) das Oberflächenprotein SLC44A4 (NCBI -Referenzsequenz: NP_001 171515.1 , NCBI-Gene ID: 80736)
(23) das Oberflächenprotein BMPR1 B (SwissProt: 000238)
(24) das Transportprotein SLC7A5 (SwissProt: Q01650) (25) das epitheliale Psostataantigen STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8, Gene ID: 26872)
(26) das Ovarkarzinomantigen MUC16 (SwissProt: Q8WXI7, Gene ID: 94025)
(27) das Transportprotein SLC34A2 (SwissProt: 095436, Gene ID: 10568)
(28) das Oberflächenprotein SEMA5b (SwissProt: Q9P283)
(29) das Oberflächenprotein LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)
(30) der Endothelin Rezeptor Typ B EDNRB (SwissProt: P24530, NCBI-Gene ID: 1910)
(31 ) das Ringfingerprotein RNF43 (SwissProt: Q68DV7)
(32) das Prostatakarzinom-assoziierte Protein STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)
(33) der Kationenkanal TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)
(34) der Komplementrezeptor CD21 (SwissProt: P20023)
(35) das B-Zell Antigen Rezeptorkomplex-assoziierte Protein CD79b (SwissProt: P40259, NCBI-Gene ID: 974)
(36) das Zelladhäsionsantigen CEACAM6 (SwissProt: P40199)
(37) die Dipeptidase DPEP1 (SwissProt: P16444)
(38) der Interleukinrezeptor IL20Ralpha (SwissProt: Q9UHF4, NCBI-Gene ID: 3559)
(39) das Proteoglykan BCAN (SwissProt: Q96GW7)
(40) der Ephrin Rezeptor EPHB2 (SwissProt: P29323)
(41 ) das Prostatastammzellen-assoziierte Protein PSCA (NCBI -Referenzsequenz:
NP_005663.2 )
(42) das Oberflächenprotein LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)
(43) das Rezeptorprotein TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)
(44) das B-Zell Antigen Rezeptorkomplex-assoziierte Protein CD79a (SwissProt: P1 1912) (45) das Rezeptorprotein CXCR5 (CD185; SwissProt: P32302; NCBI-Gene ID 643, NCBI -Referenzsequenz: NP_001707.1 )
(46) der lonenkanal P2X5 (SwissProt: Q93086)
(47) das Lymphozytenantigen CD180 (SwissProt: Q99467) (48) das Rezeptorprotein FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)
(49) das Rezeptorprotein FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)
(50) das MHC Klasse II Molekül la Antigen HLA-DOB (NCBI -Referenzsequenz:
NP_0021 1 1 .1 )
(51 ) das T-Zell Protein VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3) (52) TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI -Referenzsequenz: NP_057723.1 , NCBI-Gene ID: 51330)
(53) das Lymphozytenantigen CD37 (Swiss Prot: P1 1049, NCBI-Gene ID: 951 )
(54) Der FGF Rezeptor 2; FGFR2 (NCBI-Gene ID: 2263; Official Symbol: FGFR2). Der FGFR2 Rezeptor kommt in verschiedenen Spleißvarianten vor (alpha, beta, lllb, lllc). Alle Spleißevarianten können als Zielmolekül fungieren.
(55) das transmembrane Glycoprotein B7H3 (CD276; NCBI-Gene ID: 80381 NCBI - Referenzsequenz: NP_001019907.1 , Swiss Prot: Q5ZPR3-1 )
(56) der B Zell Rezeptor BAFFR (CD268; NCBI-Gene ID: 1 15650)
(57) das Rezeptorprotein ROR 1 (NCBI-Gene ID: 4919) (58) der Oberflächenrezeptor CD123 (IL3RA; NCBI-Gene ID: 3563; NCBI - Referenzsequenz: NP_002174.1 ; Swiss-Prot: P26951 )
(59) das Rezeptorprotein Syncytin ( NCBI-Gene ID 30816)
(60) die Aspartat beta Hydroxylase (ASPH; NCBI-Gene ID 444)
(61 ) das Zelloberflächen Glycoprotein CD44 (NCBI-Gene ID: 960) (62) CDH15 (Cadherin 15, NCBI-Gene ID: 1013)
(63) das Zelloberflächen Glycoprotein CEACAM5 (NCBI-Gene ID: 1048)
(64) das Zelladhäsionsmolekül L1 -Iike (CHL1 , NCBI-Gene ID: 10752)
(65) die Rezeptortyrosin-Kinase c-Met (NCBI-Gene ID: 4233) (66) der Notch Ligand DLL3 (NCBI-Gene ID: 10683)
(67) das Ephrin A4 (EFNA4, NCBI-Gene ID: 1945)
(68) die Ectonucleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 3 (ENPP3, NCBI-Gene ID: 5169)
(69) der Koagulationsfaktor III (F3, NCBI-Gene ID: 2152) (70) der FGF Rezeptor 3 (FGFR3, NCBI-Gene ID: 2261 )
(71 ) die Folatehydrolase FOLH1 (NCBI-Gene ID: 2346)
(72) der Folaterezeptor 1 (FOLR1 ; NCBI-Gene ID: 2348)
(73) die Guanylatzyklase 2C (GUCY2C, NCBI-Gene ID: 2984)
(74) die KIT proto-Oncogen Receptortyrosinkinase (NCBI-Gene ID: 3815) (75) das lysosomal-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP1 , NCBI-Gene ID: 3916)
(76) der Lymphocytenantigen 6 Complex, locus E (LY6E, NCBI-Gene ID: 4061 )
(77) das Protein NOTCH3 (NCBI-Gene ID: 4854)
(78) die Proteintyrosinkinase 7 (PTK7, NCBI-Gene ID: 5754)
(79) das Nectin Zelladhäsionsmolekül 4 (PVRL4, NECTIN4, NCBI-Gene ID: 81607) (80) das Transmembranprotein Syndecan 1 (SDC1 , NCBI-Gene ID: 6382)
(81 ) das SLAM Familienmitglied 7 (SLAMF7, NCBI-Gene ID: 57823)
(82) das Transportprotein SLC39A6 (NCBI-Gene ID: 25800) (83) das SLIT und NTRK artige Familienmitglied 6 (SLITRK6, NCBI-Gene ID: 84189)
(84) der Zelloberflächenrezeptor TACSTD2 (NCBI-Gene ID: 4070)
(85) das Rezeptorprotein TNFRSF8 (NCBI-Gene ID: 943)
(86) das Rezeptorprotein TNFSF13B (NCBI-Gene ID: 10673) (87) das Glykoprotein TPBG (NCBI-Gene ID: 7162)
(88) der Zelloberflächenrezeptor TROP2 (TACSTD2, NCBI-Gene ID: 4070)
(89) der Galanin-like G Protein-gekoppelte Rezeptor KISS1 R (GPR54, NCBI-Gene ID: 84634)
(90) das Transportprotein SLAMF6 (NCBI-Gene ID: 1 14836) In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen (1 ) - (90), insbesondere
TWEAKR, B7H3, EGFR und HER2.
In einem weiteren besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung bindet der Binder an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus aus den Krebs-Zielmolekülen (1 ) - (90), insbesondere TWEAKR, B7H3, EGFR und HER2.
In einem weiteren besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung bindet der Binder spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus aus den Krebs-Zielmolekülen (1 ) - (90), insbesondere TWEAKR, B7H3, EGFR und HER2. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert. Dies bewirkt, dass das Binder-Wirkstoffkonjugat, welches ein Immunokonjugat oder ein ADC sein kann, von der Zielzelle aufgenommen wird.
Anschliessend wird der Binder vorzugsweise intrazellulär, bevorzugt lysosomal, prozessiert.
In einer Ausführungsform ist der Binder ein Bindeprotein. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper, ein antigen-bindendes Antikörperfragment, ein multispezifischer Antikörper oder ein Antikörpermimetikum. Bevorzugte Antikörpermimetika sind Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, oder Nanobodies. Bevorzugte multispezifischer Antikörper sind bispezifische und trispezifische Antikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper oder ein antigen- bindendes Antikörperfragment, weiter bevorzugt ist ein isolierter Antikörper oder ein isoliertes antigen-bindendes Antikörperfragment.
Bevorzugte antigen-bindende Antikörperfragmente sind Fab, Fab', F(ab')2 und Fv
Fragmente, Diabodies, DAbs, lineare Antikörper und scFv. Besonders bevorzugt sind Fab, Diabodies und scFv. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon. Weiter besonders bevorzugt sind humane, humanisierte oder chimäre Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon.
Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder
rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22„Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK-Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,. Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033,1989 oder in WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vo1 . 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1 -3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (19881 , Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines lgG1 -Antikörpers sind z.B. in WO
2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die
Internalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur
Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)-Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.
Bakterielle Expression
Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe bakterieller Expression hergestellt werden können.
Geeignete Expressionsvektoren zur bakteriellen Expression gewünschter Proteine werden durch Insertion einer DNA Sequenz, welche das gewünschte Protein kodiert, im funktionellen Leserahmen zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und
Translationsterminationssignalen und mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor umfasst ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen
Replikationsursprung, um die Erhaltung des Vektors und, falls erwünscht, die
Amplifikation desselben innerhalb des Wirtes zu ermöglichen. Geeignete prokaryotische Wirte zur Transformation umfassen, sind aber nicht limitiert auf, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies aus dem Genus Pseudomonas,
Streptomyces, und Staphylococcus. Bakterielle Vektoren können zum Beispiel basieren auf Bakteriophagen, Plasmiden, oder Phagemiden. Diese Vektoren können selektierbare Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, welche aus kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind. Viele kommerziell erhältlichen Plasmide enthalten typischerweise Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von vorteilhaften Expressionsvektoren auf Basis der beabsichtigten Verwendung des zu exprimierenden Proteins ausgewählt werden.
Nach Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Wachstum des Wirtsstammes zu einer angemessenen Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturveränderung oder chemische Induktion) de-reprimiert / induziert, und die Zellen werden für eine zusätzliche Periode kultiviert. Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, falls nötig auf physikalische Weise oder mit chemischen Mitteln aufgeschlossen, und der resultierende Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückgehalten.
Daher ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein
Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäure umfasst, welche einen neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert.
Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindende Fragmente von diesen beinhalten natürlich gereinigte Produkte, Produkte, die aus chemischen Synthesen stammen, und Produkte, die durch rekombinante Technologien in prokaryotischen Wirten, wie zum Beispiel £ coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene
Spezies aus dem Genus Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus, bevorzugt £. coli, produziert werden.
Säugerzellexpression Dem Fachmann ist bekannt, auf weiche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe von Säugerzellexpression hergestellt werden können.
Bevorzugte regulatorische Sequenzen zur Expression in Säugerzellwirten umfassen virale Elemente, die zu einer hohen Expression in Säugerzellen führen, wie Promotoren und/oder Expressionsverstärker, welche vom Cytomegalovirus (CMV) (wie dem CMV Promotor/Enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (wie dem SV40 Promotor/Enhancer), vom Adenovirus, (z.B. der Adenovirus major late promoter (AdMLP)) und vom Polyoma abgeleitet sind. Die Expression der Antikörper kann konstitutiv oder reguliert erfolgen (z.B. induziert durch Zugabe oder Entfernen von Kleinmolekül Induktoren wie Tetracyclin in Kombination mit dem Tet-System).
Zur weiteren Beschreibung viraler regulatorischer Elemente und Sequenzen von diesen sei verwiesen auf z.B. U.S. 5,168,062 von Stinski, U.S. 4,510,245 von Bell et al. und U.S. 4,968,615 von Schaffner et al.. Die rekombinanten Expressionsvektoren können ebenfalls einen Replikationsursprung und selektierbare Marker beinhalten (siehe z.B. U.S.
4,399,216, 4,634,665 und U.S. 5,179,017). Geeignete selektierbare Marker umfassen Gene, die Resistenz gegenüber Substanzen wie G418, Puromycin, Hygromycin,
Blasticidin, Zeocin/Bleomycin, oder Methotrexate verleihen, oder selektierbare Marker, welche zur Auxotrophie einer Wirtszelle führen, wie Glutamine Synthetase (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2): 169-75), wenn der Vektor in die Zelle
eingebracht wurde.
Zum Beispiel vermittelt das Dihydrofolate-Reductase (DHFR) Gen Resistenz gegenüber Methotrexate, das neo Gen vermittelt Resistenz gegenüber G418, das bsd Gen aus Aspergillus terreus vermittelt Resistenz gegenüber Blasticidin, Puromycin N-acetyl- transferase vermittelt Resistenz gegenüber Puromycin, das Sh ble Genprodukt vermittelt Resistenz gegenüber Zeocin, und Resistenz gegenüber Hygromycin wird vermittelt durch das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hyg or hph). Selektierbare Marker wie DHFR oder Glutamine-Synthetase sind auch hilfreich für Amplifikationstechniken in Verbindung mit MTX und MSX.
Die Transfektion eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle kann mit Hilfe von
Standardtechniken ausgeführt werden, unter anderem mit Elektroporation, Nucleofection, Calcium-Phosphate-Präzipitation, Lipofection, Polykation-basierter Transfektion wie Polyethlylenimine (PEI)-basierter Transfektion und DEAE-Dextran Transfection.
Geeignete Säugerwirtszellen für die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen umfassen Chinese Hamster Ovary (CHO Zellen) wie CHO-K1 , CHO-S, CHO-K1 SV [inbegriffen DHFR-CHO Zellen, beschrieben in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 und Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12, verwendet mit einem DHFR selektierbaren Marker, wie beschrieben in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 -621 , sowie andere Knockout-Zellen, wie ausgeführt in Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15), NSO myeloma Zellen, COS Zellen, HEK293 Zellen, HKB1 1 Zellen, BHK21 Zellen, CAP Zellen, EB66 Zellen, und SP2 Zellen. Die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen kann auch transient oder semi-stabil in Expressionssystemen erfolgen, wie HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293- Freestyle, HKB1 1 , Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-K1 , CHO- K1 SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 oder CAP-T Zellen (beispielsweise wie Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9)
In einigen Ausführungsformen ist der Expressionsvektor in jener Weise konstruiert, dass das zu exprimierende Protein in das Zellkulturmedium, in welchem die Wirtszellen wachsen, sekretiert wird. Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus dem Zellkulturmedium mit Hilfe dem
Fachmann bekannten Proteinreinigungsmethoden gewonnen werden.
Reinigung
Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus rekombinanten Zellkulturen mit Hilfe gut bekannter Methoden gewonnen und gereinigt werden, umfassend beispielsweise Ammoniumsulfat- oder Ethanol- Präzipitation, Säureextraktion, Protein A Chromatographie, Protein G
Chromatographie, Anion- oder Kationenaustauschchromatographie, Phospho-Cellulose Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC),
Affinitätschromatographie, Hydroxylapatite Chromatographie and Lectin
Chromatographie. High Performance Flüssigchromatographie ("HPLC") kann ebenfalls zur Reinigung angewendet werden. Siehe, beispielsweise, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001 ), e.g., Chapters 1 , 4, 6, 8, 9, 10.
Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, welche mit Hilfe rekombinanter Techniken in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen hergestellt werden. Eukaryotische Wirte umfassen beispielsweise Hefezellen, höhere Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen. Abhängig von der für die rekombinanten Expression gewählten Wirtszelle kann das exprimierte Protein glykosyliert oder nicht-glykosyliert vorliegen. In einer bevorzugen Ausführungsform wird der Antikörper gereinigt (1 ) zu mehr als 95 Gew.-% gemessen beispielsweise mit der Lowry-Methode, mit UV-Vis Spektroskopie oder mit der SDS-Kapillargelelektrophorese (zum Beispiel mit einem Caliper LabChip GXII, GX 90 oder Biorad Bioanalyzer Gerät), und in mehr bevorzugten
Ausführungsformen mehr als 99 Gew.-%, (2) zu einem Grade geeignet zur Bestimmung von mindestens 15 Resten der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz, oder (3) zur Homogenität bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht- reduzierenden Bedingungen mit Hilfe von Coomassie-Blau oder bevorzugt Silber- Färbung.
Gewöhnlich wird ein isolierter Antikörper mit Hilfe wenigstens eines
Proteinreinigungsschrittes gewonnen.
Vorzugsweise ist das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen oder das antigenbindende Fragment eines Antikörpers gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen ein scFv-, Fab-, Fab ' -Fragment oder ein F(ab ^-Fragment. Vorzugsweise ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen ein monoklonaler Antikörper oder ein
antigenbindendes Fragment davon.
Vorzugsweise ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen ein humaner, humanisierter oder chimärer Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment.
anti-TWEAKR-Antikörper
Erfindungsgemäß können anti-TWEAKR Antikörper verwendet werden. Der Begriff„anti-TWEAKR Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an TWEAKR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül TWEAKR (NCBI - Referenzsequenz: NP_057723.1 ; SEQ ID NO: 164) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper TWEAKR mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Beispiele für Antikörper, die an TWEAKR binden, sind zum Beispiel in
WO2009/020933(A2), WO2009/140177 (A2), WO 2014/198817 (A1 ) and WO
2015/189143 (A1 ) offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
ITEM-4 ist ein anti-TWEAKR-Antikörper, der von Nakayama et al. beschrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Humanisierte Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") werden von Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) sowie in WO
2009/020933 beschrieben. Humanisierte Varianten des ITEM-4 sind TPP-7006, TPP- 7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 und TPP-10337 Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
Bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-TWEAKR Antikörper TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP- 10336 und TPP-10337. Mehr bevorzugt sind die anti-TWEAKR Antikörper TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 und TPP-10337. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337.
anti-B7H3 Antikörper
Erfindungsgemäß können anti-B7H3 Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti-B7H3 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an B7H3 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül B7H3 (NCBI - Referenzsequenz: NP_001019907.1 ; SEQ ID NO: 165) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper B7H3 mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < "Ι μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Beispiele für Antikörper und antigen-bindene Fragmente die an B7H3 binden, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B in WO201 109400, EP1773884 und WO2014061277 beschrieben. EP2121008 beschreibt den anti-B7H3 Antikörper 8H9 sowie seine CDR Sequenzen.
Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der ant-B7H3 Antikörper wurden durch Screening einer Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek auf rekombinant B7H3 aus der Maus (Maus CD276; Gene ID: 102657) und humanes B7H3 (human CD276; Gene ID: 80381 ) exprimierenden Zellen erhalten. Die gewonnenen Antikörper wurden in das humane lgG1 Format überführt. Der anti-B7H3 Antikörper TPP-8382 ist ein bevorzugtes Beispiel. Bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-B7H3 Antikörper TPP-8382 und TPP-8567.
anti-HER2 -Antikörper:
Erfindungsgemäß können anti-HER2 Antikörper verwendet werden. Der Begriff„anti- HER2Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an HER2 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül HER2 (NCBI - Referenzsequenz: NP_004439.2; SEQ ID NO: 166) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In
bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper HER2 mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle HER2 bindet, ist
Trastuzumab (Genentech). Trastuzumab ist ein humanisierter Antikörper, der zur unter anderem Behandlung von Brustkrebs eingesetzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der anti-Her2 Antikörper TPP-1015 (analog Trastuzumab).
Weitere Beispiele für Antikörper, die an HER2 binden, sind neben Trastuzumab (INN 7637, CAS NR: RN: 180288-69-1 ) und Pertuzumab (Cas NR: 380610-27-5), auch Antikörper, wie offenbart in WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2, oder in WO 201 1/044368-A2. Beispiel für ein anti-HER2 Konjugat ist Trastuzumab-Emtansine (INN- Nr. 9295). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
Besonders bevorzugt ist im Rahmen dieser Erfindung der anti-HER2Antikörper
Trastuzumab und TPP-1015.
anti-EGFR-Antikörper
Erfindungsgemäß können anti- EGFR Antikörper verwendet werden.
Der Begriff„anti-EGFR Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an EGFR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül EGFR (NCBI -
Referenzsequenz: NP_005219.2; SEQ ID NO: 167) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität bindet. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper EGFR mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die anti-EGFR Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-981 (Cetuximab), Panitumumab, Nimotuzumab. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der anti-EGFR Antikörper TPP-981
(Cetuximab). Weitere Ausführungsformen für EGFR-Antikörper sind:
• Zalutumumab / 2F8 / HuMax-EGFR, Firma Genmab A/S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN-Nummer 8605) Necitumumab / 1 1 F8, ImClone / IMC-1 1 F8, Firma ImClone Systems Inc [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1 , US 2007/0264253-A1 , US 7,598,350, WO 2005/090407-A1 ), INN- Nummer 9083)
Matuzumab / anti-EGFR MAb, Merck KGaA / anti-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 und EMD-55900 / MAb 425 / monoclonal antibody 425, Firma Merck KGaA / Takeda ( WO 92/15683, INN-Nummer 8103 (Matuzumab))
RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO- 5083945 / R04858696 / RO5083945, Firma Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/1 12413-A1 , WO 2010/1 15554)
GT-MAB 5.2-GEX / CetuGEX, Firma Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1 , EP 0191 1766-A1 , EP 02073842-A2, US 2010/0028947-A1 )
ISU-101 , Firma Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd) / Scancell (WO 2008/004834- A1 )
ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / anti-EGFR monoclonal antibody 806, Firma Ludwig Institute for Cancer Research / Abbott / Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771 , WO 2005/081854 und WO 2009/023265)
SYM-004 (consists of two chimeric lgG1 antibodies (992 and 1024)), Firma Symphogen A/S (WO 2010/022736-A2)
MR1 -1 /MR1 -1 KDEL, Firma IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (Patent: WO2001/062931 -A2)
Antikörper gegen die Deletionsmutante, EGFRvlll, Firma Amgen/Abgenix (WO 2005/010151 , US 7,628,986)
SC-100, Firma Scancell Ltd (WO 01/088138-A1 )
MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA, Firma Bristol-Myers Squibb (US) / Merck KGaA (DE) / Takeda (JP), (WO
91/05871 , WO 92/15683) • anti-EGFR-Mab, Firma Xencor (WO 2005/056606)
• DXL-1218 / anti-EGFR monoclonal antibody (cancer), InNexus, Firma InNexus Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638
anti-Carboanhydrase IX Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmoleküle Carboanhydrase IX binden, sind in WO 2007/070538-A2 (z.B. Anspüche 1 - 16) beschrieben.
anti-CD123 Antikörper Der Begriff„anti- CD123 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CD123 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CD123 (NCBI - Referenzsequenz: NP_002174.1 ; Swiss-Prot: P26951 ) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In
bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CD123 mit einer
Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Die Generierung und Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers 7G3, welcher die N- terminale Domäne von IL-3Ra, CD123, bindet, werden von Sun et al. beschrieben (Sun et al., 1996, Blood 87(1 ):83-92). US Patent Nummer 6,177,078 (Lopez) bezieht sich auf den anti-CD123-Antikörper 7G3. Eine chimäre Variante dieses Antikörpers (CSL360) ist in WO 2009/070844 sowie eine humanisierte Version (CSL362) in WO 2012/021934
beschrieben. Die Sequenz des 7G3 Antikörpers ist in EP2426148 offenbart worden. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt für humanisierten Antikörper dar, die durch CDR- Umsetzung („CDR grafting") erhalten werden Einen Antikörper, der besonders gut nach Zelloberflächenantigenbindung internalisiert, ist der anti-CD123 Antikörper 12F1 , der von Kuo et al. offenbart wurde (Kuo et a., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82). Der Antikörper 12F1 bindet mit einer höheren Affinität an CD123 als der Antikörper 7G3 und internalisiert nach Zelloberflächenantigenbindung deutlich schneller als 7G3. Bispezifische scFv Immunofusionsproteine basierend auf 12F1 werden in WO 2013/173820 offenbart. Antikörper TPP-6013 ist eine chimäre Variante des 12F1 .
Humanisierte Varianten dieser murinen Antikörpern wurden basierend auf CDR- Umsetzung („CDR grafting") in germline Sequenzen und Optimierung generiert. anti-CXCR5 Antikörper
Der Begriff„anti-CXCR5 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CXCR5 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CXCR5 (NCBI - Referenzsequenz: NP_001707.1 ) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CXCR5 mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.
Beispiele für Antikörper und antigen-bindene Fragmente die an CXCR5 binden, sind dem Fachmann bekannt und z.B in EP2195023 beschrieben
Die Hybridomzellen für den Rattenantikörpers RF8B2 (ACC2153) wurden von DSMZ bezogen und die Sequenz des Antikörpers nach Standardmethoden identifiziert. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt der humanisierten Antikörper dar, die durch CDR- Umsetzung („CDR grafting") erhalten werden
Humanisierte Varianten dieses Antikörpers werden basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") in germline Sequenzen generiert.
anti-C4.4a Antikörper:
Beispiele für C4.4a Antikörper und antigen-bindende Fragmente sind in WO 2012/143499 A2 beschrieben. Die Sequenzen der Antikörper sind in Tabelle 1 der WO 2012/143499 A2 angegeben, wobei jede Zeile die jeweiligen CDR Aminosäuresequenzen der variablen leichten Kette bzw. der variablen Schweren Kette des in Spalte 1 aufgeführten Antikörpers wiedergibt. anti-CD20-Antikörper:
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle CD20 bindet, ist Rituximab (Genentech). Rituximab (CAS-Nummer: 174722-31 -7) ist ein chimärer Antikörper, der zur Behandlung von Non-Hodgkin-Lymphom verwendet wird. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-CD52 -Antikörper:
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle CD52 bindet, ist
Alemtuzumab (Genzyme). Alemtuzumab (CAS-Nummer: 216503-57-0) ist ein
humanisierter Antikörper, der zur Behandlung von chronischer lymphatischer Leukämie eingesetzt wird. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-Mesothelin-Antikörper:
Beispiele für anti-Mesothelin -Antikörper sind z.B. WO2009/068204 beschrieben. Alle in WO2009/068204 offenbarten Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen der hierin offenbarten Erfindung verwendet werden können. Besonders bevorzugt ist der in WO2009/068204 offenbarte Antikörper MF-T.
anti-CD30-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD30 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Hodgkin-Lymphoma verwendet werden können, sind Brentuximab,
Iratumumab und Antikörper, wie in WO 2008/0921 17, WO 2008/036688 oder WO 2006/089232 offenbart. Beispiele für ein anti- CD30 Konjugat ist Brentuximab Vedotin (INN-Nr. 9144). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD22-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD22 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Lymphoma verwendet werden können, sind Inotuzumab oder Epratuzumab. Beispiele für anti- CD22 Konjugate sind Inotuzumab Ozagamycin (INN-Nr. 8574), oder anti-CD22-MMAE und anti-CD22-MC-MMAE (CAS RN: 139504-50-0 bzw. 474645-27-7). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-CD33-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD33 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Leukämie verwendet werden können, sind Gemtuzumab oder Lintuzumab (INN 7580). Ein Beispiel für ein anti-CD33 Konjugat ist Gemtuzumab-Ozagamycin. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-NMB-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül NMB bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Melanom oder Brustkrebs verwendet werden kann, ist Glembatumumab (INN 9199). Ein Beispiel für ein anti-NMB Konjugat ist Glembatumumab Vedotin (CAS RN: 474645-27-7). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-CD56-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD56 bindet und zur Behandlung von Krebs z.B. Multiples Myelom, Kleinzelliges Lungenkarzinom, MCC oder Ovarialkarzinom verwendet werden kann, ist Lorvotuzumab. Ein Beispiel für ein anti-CD56 Konjugat ist Lorvotuzumab Mertansine (CAS RN: 139504-50-0). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD70-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD70 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodgkin-Lymphom oder Nierenzellkrebs verwendet werden können, sind in WO 2007/038637-A2 oder WO 2008/070593-A2 offenbart. Ein Beispiel für ein anti- CD70 Konjugat ist SGN-75 (CD70 MMAF). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-CD74-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD74 bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Multiplem Myelom verwendet werden kann, ist Milatuzumab. Ein Beispiel für ein anti-CD74 Konjugat ist Milatuzumab-Doxorubicin (CAS RN: 23214-92- 8). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser
Erfindung verwendet werden.
anti-CD19-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD19 bindet und zur
Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodgkin-Lymphom verwendet werden kann, ist in WO 2008/031056-A2 offenbart. Weitere Antikörper und Beispiele für ein anti-CD19 Konjugat (SAR3419) sind in WO 2008/047242-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-Mucin-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül Mucin-1 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodkin-Lymphom verwendet werden können, sind Clivatuzumab oder die in WO 2003/106495-A2, WO 2008/028686-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti-Mucin Konjugate sind in WO 2005/009369-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD138-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD138 binden und Konjugate davon, die zur Behandlung von Krebs z.B. Multiples Myelom verwendet werden können, sind WO 2009/080829-A1 , WO 2009/080830-A1 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-Integrin-alphaV -Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül Integrin alphaV binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Melanoma, Sarcoma oder Carcinoma verwendet werden können, sind Intetumumab (Cas RN: 725735-28-4), Abciximab (Cas-RN: 143653-53-6), Etaracizumab (Cas-RN: 892553-42-3) oder die in US 7,465,449, EP 719859-A1 , WO 2002/012501 -A1 oder WO2006/062779-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti- Integrin AlphaV Konjugate sind lntetumumab-DM4 und weitere in WO 2007/024536-A2 offenbarte ADCs. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-TDGF1 -Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül TDGF1 binden und zur Behandlung von Krebs verwendet werden können, sind die in WO 02/077033-A1 , US 7,318,924, WO 2003/083041 -A2 und WO 2002/088170-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti- TDGF1 Konjugate sind in WO 2002/088170-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-PSMA-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül PSMA binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Prostatakarzinom verwendet werden können, sind die in WO 97/35616-A1 , WO 99/47554-A1 , WO 01/009192-A1 und WO2003/034903 offenbarten Antikörper.
Beispiele für anti-PSMA Konjugate sind in WO 2009/026274-A1 und WO 2007/002222 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-EPHA2-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül EPHA2 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs verwendet werden können, sind in WO
2004/091375-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-SLC44A4-Antikörper
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül SLC44A4 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs, z.B. Pankreas- oder Prostatakarzinom verwendet werden können, sind in WO2009/033094-A2 und US2009/0175796-A1 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
anti-HLA-DOB-Antikörper
Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül HLA-DOB bindet, ist der Antikörper Lym-1 (Cas-RN: 301344-99-0), der zur Behandlung von Krebs, z.B. Non- Hodgkin-Lymphom verwendet werden kann. Beispiele für anti-HLA-DOB Konjugate sind z.B. in WO 2005/08171 1 -A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
a n ti -VTC N 1 -An ti kö rpe r
Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül VTCN1 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs, z.B. Ovarialkarzinom, Pankreas-, Lungen-, oder Brustkrebs verwendet werden können, sind in WO 2006/074418-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-FGFR2-Antikörper
Beispiele für anti-FGFR2 Antikörper und antigen-bindende Fragmente sind in
WO2013076186 beschrieben. Die Sequenzen der Antikörper sind in Tabelle 9 und Tabelle 10 der WO2013076186 angegeben. Bevorzugt sind Antikörper, Antigen-bindende Fragmente und Varianten der Antikörper, die sich von den als M048-D01 und M047-D08 bezeichneten Antikörpern ableiten.
Bevorzugte Antikörper und Antigen-bindende Antikörperfragmente für
erfindungsgemäße Binder-Wirkstoff-Konjugate In dieser Anmeldung wird bei den Binder-Wirkstoff-Konjugaten auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP- 10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-751 1 , TPP-8382 und TPP- 8567.
Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper:
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TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP- 10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-751 1 , TPP-8382 und TPP- 8567 sind Antikörper umfassend eine oder mehrere der in obiger Tabelle angegebenen CDR-Sequenzen (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3) der variable Region der schwere Kette (VH) oder der variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene variable Region der schwere Kette (VH) und/oder die variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene Region der schweren Kette (IgG Schwere Kette) und/oder die angegebene Region der leichten Kette (IgG Leichte Kette).
TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8.
TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18.
TPP-2090 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28. TPP-2658 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38. TPP-5442 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48. TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58.
TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68.
TPP-7510 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 78.
TPP-751 1 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 88.
TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 92, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 93 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 94, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 96, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 97 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 98.
TPP-8567 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 102, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 103 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 104, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 106, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 107 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 108.
TPP-8825 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 17 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 18.
TPP-10334 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 122, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 123 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 124, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 126, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 127 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 128.
TPP-10335 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 132, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 133 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 134, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 136, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 137 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 138.
TPP-10336 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 142, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 143 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 144, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 146, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 147 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 148.
TPP-10337 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 152, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 153 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 154, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 156, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 157 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 158.
TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 5.
TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15.
TPP-2090 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25.
TPP-2658 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35. TPP-5442 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45.
TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55. TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65.
TPP-7510 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75.
TPP-751 1 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85. TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 95.
TPP-8567 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 101 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 105.
TPP-8825 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 15.
TPP-10334 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 121 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 125.
TPP-10335 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 131 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 135. TPP-10336 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 141 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 145. TPP-10337 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 151 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 155.
TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10.
TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20.
TPP-2090 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30.
TPP-2658 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 40.
TPP-5442 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 50. TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60.
TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70.
TPP-7510 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80. TPP-751 1 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 90.
TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 100.
TPP-8567 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 109 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 10. TPP-8825 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 120.
TPP-10334 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 129 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 130.
TPP-10335 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 139 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 140.
TPP-10336 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 149 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 150.
TPP-10337 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 159 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 160.
Linker für den Binder LIG (Lb und Lc)
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Peptide oder Proteine wie Antikörper bekannt (siehe z.B. K. Lang and J. W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die
Konjugation des organischen Rests an einen Antikörper über ein oder mehrere
Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers, die entweder als freie Thiole bereits vorliegen oder durch Reduktion von Disulfidbrücken generiert werden, und/oder über eine oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, den KSP-lnhibitor bzw. Prodrug an den Antikörper über Tyrosinreste, über
Glutaminreste, über Reste unnatürlicher Aminosäuren, über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, die Wirkstoffmoleküle an spezifische
Konjugationsstellen des Binders zu konjugieren, wodurch die Produkthomogenität verbessert wird. Die Literatur beschreibt verschiedene Methoden zur
konjugationsstellenspezifischen Konjugation (Agarwal et al., Bioconjug. Chem. 26, 176- 192 (2015); Cal et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.53, 10585-10587 (2014); Behrens et al., MAbs 6_, 46-53 (2014); Panowski et al., MAbs 6, 34-45 (2014)). Diese Methoden enthalten insbesondere auch enzymatische Konjugationsmethoden, die beispielsweise Transglutaminasen (TGases), Glykosyltransferasen oder das Formylglycin generierende Enzym ((Sochaj et al., Biotech nology Advances 33, 775-784, (2015)) verwenden.
Erfindungsgemäß können konjugationsstellenspezifische Binder-Konjugate des Kinesin- Spindel-Protein-Inhibitors, in welchen die Kinesin-Spindel-Protein-Inhibitoren an Glutamin- Seitenketten der Binder konjugiert sind, bereitgestellt werden.
Wenn der Binder ein Antikörper ist, beinhaltet er ein Akzeptor-Glutamin, bevorzugt in der konstanten Region. Solche Akzeptor-Glutamine können durch Mutation von geeigneten Positionen zu Glutamin eingeführt werden (zum Beispiel die Mutation N297Q der schweren Kette, Kabat EU Nummerierung) oder durch Generierung von deglycosylierten oder aglycosylierten Antikörpern (zum Beispiel durch enzymatische Deglykosylierung durch PNGase F oder durch Mutation N297X der schweren Kette, Kabat EU
Nummerierung (X kann hier jede Aminosäure außer N sein)). Im letzteren Fall eines deglykosylierten oder aglykosylierten Antikörpers wird der Glutaminrest Q295 (Kabat EU Nummerierung) der schweren Kette ein Akzeptor-Glutamin. Besonders bevorzugt ist ein Antikörper, der die Mutation N297A oder N297Q (Kabat EU Nummerierung) enthält.
Daher beinhalten alle in dieser Erfindung beschriebenen Antikörper ebenso agiykosylierte Varianten dieser Antikörper, die entweder durch Deglykosylierung durch PNGase F oder durch Mutation von N297 (Kabat EU Nummerierung) (Kabat numbering System of antibodies, see Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )) der schweren Kette zu jeder anderen Aminosäure außer N hergestellt werden. Desweiteren enthalten alle hier beschriebenen Antikörper ebenso Varianten der beschriebenen Antikörper, die durch ein Engineering ein oder mehrere Akzeptor-Glutamin-Reste für Transglutaminase- katalysierte Reaktionen enthalten.
Ein Weg für solche konjugationsstellenspezifischen Konjugationen sind
literaturbeschriebene Ansätze, die sich mit konjugationsstellenspezifischer Konjugation von Bindern mittels Transglutaminase befassen. Transglutaminasen (TGases), die auch die bakterielle Transglutaminase (BTG) (EC 2.3.2.13) beinhalten, sind eine Familie von Enzymen, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der v-Carbonyl-Amid- Gruppe von Glutaminen und der primären Amin-Gruppe von Lysinen katalysieren. Da solche Transglutaminasen auch andere Substrate als Lysin als Amin-Donor akzeptieren, wurden sie verwendet, um Proteine einschließlich Antikörper an geeigneten Akzeptor- Glutaminen zu modifizieren (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995- 9997 (2010); Josten et al., J. Immunol. Methods 240, 47-54 (2000); Mindt et al.,
Bioconjugate Chem. 19, 271 -278 (2008); Dennler et al., in Antibody Drug Conjuagtes (Ducry, L, Ed.), pp 205-215, Humana Press. (2013)). Auf der einen Seite wurden
Transglutaminasen für die Konjugation von Wirkstoffen an Antikörper verwendet, welche artifizielle Glutamin-Tags enthalten, welche Akzeptorglutamin-Reste sind, welche durch genetisches Engineering in den Antikörper eingefügt wurden ((Strop et al., Chem. Biol. 20, 161 -167 (2013)). Auf der anderen Seite wurde beschrieben, dass der konservierte
Glutamin-Rest Q295 (Kabat EU Nummerierung) der konstanten Region der schweren Kette von Antikörpern der einzige γ-Carbonyl-Amid-Donor für die bakterielle
Transglutaminase (EC 2.3.2.13) im Rückgrat von agiykosylierten lgG1 -Molekülen ist, und somit ein Akzeptor-Glutamin darstellt, während kein Akzeptor-Glutamin im Rückgrat des lgG1 vorhanden ist, wenn der Antikörper an Position N297 (Kabat EU Nummerierung) der schweren Kette glykosyliert ist (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995- 9997 (2010)). Zusammenfassend kann die bakterielle Transglutaminase für die
Konjugation eines Amin-Donor-Substrats, zum Beispiel eines Wirkstoff-Linker-Konstrukts, an einen Akzeptor-Glutamin-Rest eines Antikörpers verwendet werden. Solche Akzeptor- Glutamine können durch Engineering des Antikörpers durch Mutationen oder durch die Generierung aglykosylierter Antikörper eingeführt werden. Solche agiykosylierten
Antikörper können durch Deglykosylierung unter Verwendung von N-glycosidase F (PNGase F) oder durch Mutation von N297 der Glykosylierungsstelle der schweren Kette (Kabat EU Nummerierung) zu jeder anderen Aminosäure außer N eingeführt werden. Die enzymatische Konjugation solcher aglykosylierter Antikörper unter Verwendung von bakterieller Transglutaminase wurde für aglykosylierte Antikörpervarianten beschrieben, die die Mutationen N297D, N297Q (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) oder N297S (siehe Patentanmeldungen WO2013092998A1 und WO2013092983A2) enthalten. Die enzymatische Konjugation solcher aglykosylierter Antikörperm mittels Transglutaminase liefert generell ADCs mit einer DAR von 2, in welchen beide schweren Ketten spezifisch an Position Q295 (Kabat EU Nummerierung) funktionalisiert sind. Nur die Mutation N297Q der schweren Kette liefert eine zusätzliche Konjugationsstelle pro schwerer Kette. Die Konjugation solcher Varianten führt zu ADCs mit einer DAR von 4, in welchen beide schweren spezifisch an den Positionen Q295 und Q297 funktionalisiert sind. Antikörpervarianten, in welchen die schweren Ketten die Mutationen Q295N und N297Q tragen, weisen pro schwerer Kette nur einen Akzeptor- Glutamin-Rest an Position Q297 (Kabat Nummerierung) auf (Simone Jeger, Site specific conjugation of tumour targeting antibodies using transglutaminase, Dissertation at ETH Zürich (2009)). In der Literatur existieren mehrere Beispiele, die die
konjugationsstellenspezifische Konjugation von aglykosylierten Antikörpern unter
Verwendung von bakterieller Transglutaminase beschreiben (zum Beispiel Dennler et al., Bioconjugate Chemistry 1_9, 569-578 (2014); Lhospice et al., Molecular Pharmaceutics 12, 1863-1871 (2015)). Die Strategie der Transglutaminase-katalysierten
konjugationsstellenspezifischen Funktionalsisierung aglykosylierter Antikörper ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
Zur Kopplung - sowohl konjugationsstellenspezifisch als auch
konjugationsstellenunspezifisch - werden sogenannte Linker verwendet. Linker lassen sich in die Gruppe der in vivo spaltbaren Linker und in die Gruppe der in vivo stabilen Linker unterteilen (siehe L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21_, 5-13 (2010)). Die in vivo spaltbaren Linker weisen eine in vivo spaltbare Gruppe auf, wobei wiederum zwischen chemisch in vivo spaltbaren und enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen unterschieden werden kann.„Chemisch in vivo spaltbar" bzw.„enzymatisch in vivo spaltbar" bedeutet, dass die Linker bzw. Gruppen im Blutkreislauf stabil sind und erst an bzw. in der Zielzelle durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (niedrigerer pH-Wert; erhöhte Glutathion-Konzentration; Vorliegen lysosomaler Enzyme wie Cathepsin oder Plasmin, oder Glyosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen) sich spalten, um so den niedermolekularen KSP-lnhibitor oder ein Derivat davon freizusetzen. Die chemisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; die enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere 2-8- Oligopeptidgruppe, insbesondere eine Dipeptidgruppe oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341 -3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Alanin-Alanin-Asparagin, Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin- Lysin und Phenylalanin-Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).
Um eine effiziente Freisetzung des freien Wirkstoffs zu gewährleisten, können
gegebenenfalls auch sogenannte self-immolative Linkerelemente (SIG) zwischen enzymatischer Spaltstelle und Wirkstoff eingebaut werden (Anticancer Agents in
Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). Die Freisetzung des Wirkstoffs kann dabei nach verschiedenen Mechanismen erfolgen, beispielsweise nach initialer enzymatischer Freisetzung einer nukleophilen Gruppe durch anschließende Elimierung über eine elektronische Kaskade (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71 ) oder durch Cyklisierung des entsprechenden Linkerelements (Bioorg. Med. Chem., 2003, 1 1 , 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett, 2007, 17, 2241 ) oder durch eine Kombination aus beidem (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Beispiele für solche Linkerelemente sind in der Abbildung dargestellt:
Figure imgf000117_0001
Elimination linker Cyclisation linker Elongated linker
Beispiele für nacheinander geschaltete enzymatische Schritte zur Wirkstofffreisetzung z.B. durch Histone Deacetylase und Cathepsin L sind in Nat. Commun., 2013, 4, 2735 beschrieben und sind in Abbildung 2 veranschaulicht.
Die in vivo stabilen Linker zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus (weniger als 5 % Metabolite nach 24 Stunden in Plasma) und weisen die oben genannten chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen nicht auf. Der Linker -U- bzw. -Lc- weist vorzugsweise eine der folgenden Grundstrukturen (i) und (ii) auf:
Figure imgf000118_0001
-(C=0)m -L1 -SG-L2- wobei
m und n 0 oder 1 ist
SG eine (chemisch oder enzymatisch) in vivo spaltbare Gruppe (insbesondere
Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8-Oligopeptidgruppe) ist,
L1 für eine in vivo stabile organische Gruppen steht und
L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder oder eine Einfachbindung steht.
Die Kopplung erfolgt hierbei vorzugsweise an einen Cysteinrest oder einen Lysinrest des Antikörpers. Alternativ kann die Kopplung an einen Tyrosinrest, Glutaminrest oder an eine unnatürliche Aminosäure des Antikörpers erfolgen. Die unnatürlichen Aminosäuren können beispielsweise Aldehyd- oder Ketogruppen (wie z.B. Formylglycin) oder Azid- oder Alkingruppen enthalten (siehe hierzu Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 1 14, 4764-4806).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist insbesondere die Linker-Grundstruktur (i). Die
Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats der Ausführungsform B mit einer Linker-Grundstruktur (i) und Kopplung des Linkers an einen Cystein- oder Lysinrest des Antikörpers führt durch Metabolisierung zu Cystein- bzw. Lysinderivaten der folgenden Formeln:
Figure imgf000118_0002
wobei L1 jeweils an den cytotoxischen Wirkstoff wie z.B. den niedermolekularen KSP- Inhibitor gebunden ist, z.B. einer Verbindung der Formel (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII). Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (i) in der Ausführungsform A führt nach dem Metabolismus zu einem KSP-lnhibitor der vorzugsweise die Struktur einer Verbindung der allgemeinen Formel (IIa), (IIa'), (IIa"), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII) aufweist.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch die Linker-Grundstrukturen (ii) , insbesondere bei Anbindung an die Position in einer Verbindung der Formel (IIa), (IIb), (llc), (lld), oder (V), insbesondere wenn Li eine der folgenden Strukturen aufweist: (a) -NH-(CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-C(=0)-Y7 , in der
Y5 für -H oder -NHY6 steht,
Y6 für -H oder -C(=0)-CH3 steht und
Y7 für eine Einfachbindung oder -NH -(CH2)o-4-CHNH2-C(=0)- steht, so dass nach der Spaltung der Ausführungsform B die entsprechende Struktur -NH-(CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-COOH bzw.
-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)o-4-CHY5-C(=0)-NH -(CH2)o-4 -CHNH2-COOH erhalten wird.
Figure imgf000119_0001
x 0 oder 1 ist,
Y5 für -H oder -NHY6 steht und
Y6 für -H oder -C(=0)-CH3 steht,
so dass nach der Spaltung der Ausführungsform B die entsprechende Struktur -CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH
erhalten wird.
Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (ii) in der Ausführungsform A führt nach dem Metabolismus zu einem KSP-lnhibitor mit der Struktur der allgemeinen Formel (II).
Wenn der Linker an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest gebunden ist, leitet sich L2 vorzugsweise von einer mit der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins reaktiven Gruppe ab. Hierzu zählen Haloacetyle, Maleimide, Aziridine, Acryloyle, Arylierende Verbindungen, Vinylsulfone, Pyridyldisulfide, TNB-thiole and Disulfid-reduzierende Mittel. Diese Gruppen reagieren in der Regel elektrophil mit der Sulfhydryl-Bindung unter Bildung einer Sulfid (z.B. Thioether)- oder Disulfid-Brücke. Bevorzugt sind stabile Sulfidbrücken.
L2 weist vorzugsweise folgende Strukturen auf:
Figure imgf000120_0001
in denen
#1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe kennzeichnet, und
R22 für -COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)R, -C(=0)-NHR oder -C(=0)N(R)2 steht und für Ci-3-Alkyl- steht.
Hierbei bevorzugt ist, wenn R22 für -COOH steht.
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in denen L2 die folgenden Formeln A3 und A4 aufweist:
Figure imgf000121_0001
Formel A3,
Figure imgf000121_0002
Formel A4, in denen
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, #2 für die Verknüpfungsstelle mit dem Wirkstoffmolekül steht,
x 1 oder 2 ist und
R22 für -COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)-R, -C(=0)-NR2, -C(=0)-NHR oder -C(=0)-NH2 steht und
R für Ci-s-Alkyl- steht. Vorzugsweise steht hierbei R22 für -COOH und insbesondere steht hierbei R22 für - COOH, falls x für 1 steht. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen kann der Linker Lb bzw. Lc an eine Cystein- Seitenkette bzw. einen Cysteinrest des Binders gebunden sein und weist dann die folgenden Formeln auf:
(I) -(C=0)m -(L1 )n-(L2)n- und
-(C=0)m -L1 -SG-L2 in denen
m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe
(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,
L2 für eine Einfachbindung oder für die Gruppe
Figure imgf000122_0001
steht, wobei
#1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht,
R1 0 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,
G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, - NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)-NH2), -Nme-, -NHNH-, - S(=0)2-NHNH-, -NH- C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, - NH2, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000123_0001
darstellt, wobei
für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, bei denen der Linker Lb bzw. Lc an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest des Binders gebunden ist und die folgende Formel aufweist:
§-(C=0)m-L1 -(L2)n-§§ 0 oder 1 ist,
0 oder 1 ist, für die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltbare Gruppe der Formel (la') steht und für die Bindung an den Binder steht, für die Gruppe
Figure imgf000124_0001
oder für eine Bindung steht, wobei
#1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht,
R1 0 für -H oder d-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist, für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)-NH2), -Nme-, -NHNH-, - S(=0)2-NHNH-, -NH- C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, - NH2, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000125_0001
darstellt, wobei
Rx für -H, C<| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen kann der Linker Lb bzw. Lc auch an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden sein und weist dann die allgemeinen Grundstrukturen (i) und (ii)
(i) -(C=0)m -(L1 )n-(L4)n-(C=0)-§§
und
(ii) -(C=0)m -L1 -SG-L4-(C=0)-§§ auf, in denen
m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe
(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,
L1 für -(NR1 0)n-(G1 )o-G2- steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, 0 oder 1 ist, 0 oder 1 ist,
G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)- NH2), -NMe-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000126_0001
darstellt, wobei
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,
L4 für eine Einfachbindung oder eine Gruppe
-(C=0)y-G4- steht,
0 oder 1 ist und
für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0)2-NHNH-,
-C(=0)-NHNH-, -CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder
S(=0)2 unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)- NH2, -COOH, -OH, -NH-CN-Nh , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können
die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom eines Lysinrestes des Binders ist.
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, bei denen der Linker Lb bzw. Lc auch an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden sein kann und dann die folgende Formel
§-(C=0)m-L1 -(L4)n-C(=0)-§§
aufweist, in der
0 oder 1 ist,
0 oder 1 ist, die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltb; Gruppe der Formel (la') steht und
§§ die Bindung an ein Stickstoffatom des Binders darstellt, L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht,
R1 0 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,
G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)- NH2), -NMe-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000128_0001
darstellt, wobei
für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,
für eine Einfachbindung oder eine Gruppe
Figure imgf000128_0002
steht,
0 oder 1 ist und G4 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH-, - CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder S(=0)2 unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH-CN-NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Besonders bevorzugt weist der Linker L2 eine oder beide der folgenden Formeln
Figure imgf000129_0001
Figure imgf000129_0002
auf, wobei
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binder steht, #2 für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht, R22 für -COOH steht und die Bindungen an das Schwefelatom des Bindesr zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Formeln vorliegen. In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A3 oder A4 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000130_0001
vor, in der #1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht und #2 für die Verknüpfungsstelle zu L1 mit dem Wirkstoffmolekül steht,
L4 weist vorzugsweise folgende Strukturen auf:
Figure imgf000130_0002
wobei die Kette durch 1 -4 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann und
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom eines Lysins des Antikörpers steht und
#2 für die Verknüpfungsstelle zu L1 mit dem Wirkstoffmolekül steht,
Erfindungsgemäß wird L1 vorzugsweise durch die Formel -(NR10)n-(G1 )o-(G2>
dargestellt, in der
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht und #2 für die Verknüpfungsstelle mit dem Wirkstoffmolekül oder mit der Legumain- spaltbaren Gruppe steht,
R10 für -H, -NH2 oder Ci-C3-Alkyl- steht,
n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist,
w' 0 oder 1 ist
G1 für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /N co steht und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen steht, die aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen besteht, die ein- oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, -NRY-, -
CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)-NH2),
-NRYC(=0)-, -C(NH)NRY-, -C(=0)-NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein kann und wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette zusätzlich mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder
Sulfonsäure substituiert sein kann, Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl oder C2-C-| 0"Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können und
-H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht.
N N CO
Hierbei steht G1 vorzugsweise für \ / und R1U steht vorzugsweie nicht für
-NH2, falls G1 für -NH-C(=0)- oder \ /N C° steht. Bevorzugt steht G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten 5 und/oder cyclischen Alkylengruppen, die ein- oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis 10gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann
o
— N N-CO—
Besonders bevorzugt steht G1 für \ / , und wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette zusätzlich mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert sein kann. steht ferner vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)- , -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)- NH2), -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH-, -CRx=N-0- und einen 3 bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette zusätzlich mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann und für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht.
— N N-CO—
Hierbei steht G2 vorzugsweise für \ /
0
Vorzugsweise steht G2 für die unterbrechenden Gruppen der Strukturen
Figure imgf000133_0001
in denen
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, #1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor bzw. Prodrug steht und
#2 für die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen umfasst in der Regel einen α,ω-divalenten Alkylrest mit der jeweils angegebenen Zahl von
Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-1 ,2- diyl (1 ,2-Ethylen), Propan-1 ,3-diyl (1 ,3-Propylen), Butan-1 ,4-diyl (1 ,4-Butylen), Pentan- 1 ,5-diyl (1 ,5-Pentylen), Hexan-1 ,6-diyl (1 ,6-Hexylen), Heptan-1 ,7-diyl (1 ,7-Hexylen), Octan-1 ,8-diyl (1 ,8-Octylen), Nonan-1 ,9-diyl (1 ,9-Nonylen), Decan-1 ,10-diyl (1 ,10- Decylen).
Eine verzweigte Kohlenwasserstoff kette bedeutet, dass ein oder mehrere H-Atome der geradkettigen Kohlenwasserstoffkette bzw. der geradkettigen Alkylengruppen durch CMO- Alkylgruppen substituiert sind und so verzweigte Kohlenwasserstoff- bzw. Seitenketten (verzweigte Kohlenwasserstoffkette) bilden.
Die Kohlenwasserstoffkette kann weiterhin cyclische Alkylengruppen (Cycloalkandiyl) enthalten, z.B. 1 ,4-Cyclohexandiyl oder 1 ,3-Cyclopentandiyl. Diese cyclischen Gruppen können ungesättigt sein. Insbesondere können in der Kohlenwasserstoff kette aromatische Gruppen (Arylengruppen) vorliegen, z.B. Phenylen. Auch in den cyclischen Alkylengruppen und den Arylengruppen können wiederum ein oder mehrere H-Atome ggf. durch Ci-10-Alkylgruppen substituiert sein. Es wird so eine Kohlenwasserstoffkette gebildet, die ggf. verzweigt ist. Diese Kohlenwasserstoffkette weist insgesamt 0 bis 100 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 25
Kohlenstoffatome auf.
Die verzweigten Kohlenwasserstoff- bzw. Seitenketten (verzweigte Kohlenwasserstoffkette) können mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein.
Die Kohlenwasserstoffketten können einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-,
-CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)-NH2), -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis l Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein.
Bevorzugt ist hier eine Gruppe
Figure imgf000134_0001
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
Figure imgf000135_0001
Besonders bevorzugt und mit Bezug auf die obigen Definitionen entspricht der folgenden vereinfachten Formel
-NR11B- , in der
R11 für -H oder -NH2 steht,
B für die Gruppe -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- steht,
w 0 bis 20 ist,
x 0 bis 5 ist,
y 0 oder 1 ist,
z 0 bis 5 ist und
NH
X4 für -O-, -C(=0)-NH-,-NH-C(=0)- oder
Figure imgf000136_0001
Bevorzugt weist der Linker L die Formel
Figure imgf000136_0002
auf,
in der
#3 für die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. Prodrug steht,
#4 für die Bindung an das Binderpeptid oder -protein steht,
R11 für -H oder -NH2 steht,
B für die Gruppe-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- steht,
w 0 bis 20 ist,
x 0 bis 5 ist, y 0 oder 1 ist,
z 1 bis 5 ist und
NH
für -O-, -C(=0)-NH-, -NH-C(=0)- oder
Figure imgf000137_0001
steht.
Die oben genannten Linker werden insbesondere bevorzugt in Konjugaten der Formel (IIa), in denen der Linker durch Substitution eines H-Atoms an R1 d.h. R1 für -L-#1 steht, wobei #1 für die Bindung an den Antikörper steht.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % vor, jeweils bezogen auf die
Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper.
Hierbei besonders bevorzugt sind die beiden Strukturen der allgemeinen Formeln und (A6)
Figure imgf000137_0002
(A5) und
Figure imgf000137_0003
(A6), in denen #1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, #2 für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,
R22 für -COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)-R, -C(=0)-NH2, -C(=0)-NR2 oder -C(=0)-NHR steht und
R für Ci-s-Alkyl- steht. Besonders bevorzugt steht R22 für -COOH.
Hierbei liegen die Strukturen der allgemeinen Formeln A5 und A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000138_0001
vor, in der
#1 und #2 die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Bevorzugte Gruppen für L1 in der obigen Formel §-(C(=0))m-(L1 )n-L2-§§ sind die, die in der folgenden Tabelle aufgeführt sind, wobei r eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, insbesondere bevorzugt von 0 bis 10 aufweist. 
Figure imgf000139_0001
Figure imgf000140_0001
Figure imgf000141_0001
Figure imgf000142_0001
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000144_0001
Figure imgf000145_0001
Figure imgf000147_0001
Figure imgf000148_0001
L1
Figure imgf000149_0001
Figure imgf000149_0002
L1
Figure imgf000150_0001
Figure imgf000150_0002
Figure imgf000150_0003
Figure imgf000150_0004
Figure imgf000151_0001
Figure imgf000152_0001
Figure imgf000153_0001
Figure imgf000154_0001
Besonders bevorzugt ist AK1 ein Antikörper oder eine Antigen-bindendes Fragment hiervon. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, insbesondere ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen- bindendes Fragment von diesen. Weiterhin bevorzugt ist ein Linker mit der Grundstruktur (ii),
(ii) -(C=0)m -(L1 )n-SG-L2, wobei SG eine durch Protease, wie z.B. Cathepsin, spaltbare Gruppe darstellt, und m, n, SG, L1 und L2 die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Besonders bevorzugt sind die folgenden Gruppen:
-Val-Ala-C(=0)-NH- (hierdurch Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Alanin)
-NH-Val-Lys-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin) -NH-Val-Cit-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin) -NH-Phe-Lys-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin) -NH-Ala-Lys-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin) -NH-Ala-Cit-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin)
Hierbei steht SG vorzugsweise für:
Figure imgf000155_0001
Figure imgf000155_0002
und
Figure imgf000156_0001
für -H oder eine Ci-10-Alkylgruppe, die gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 -COOH, -OH, -IMH2, oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
Im Falle der Transglutaminase-katalysierten Konjugation offenbart die Literatur verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder wie z.B. Antikörper in einer konjugationsstellenspezifischen Art und Weise, (siehe zum Beispiel (Sochaj et al., Biotechnology Advances, 33^ 775-784, (2015), Panowski et al., MAbs 6, 34-45 (2014)). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der KSP-lnhibitoren bzw. Prodrugs an einen Antikörper über Akzeptor-Glutaminreste des Antikörpers unter Verwendung von Transglutaminase. Solche Akzeptorglutaminreste können über Engineering des Antikörpers oder durch Mutationen generiert werden, die agiykosylierte Antikörper erzeugen. Die Anzahl dieser Akzeptorglutamine im Antikörper ist bevorzugt 2 oder 4. Für die Kopplung (Konjugation) werden geeignete Linker verwendet. Geeignete Linkerstrukturen sind solche, die über eine über eine freie Amin-Donor- Funktionalität verfügen, die ein geeignetes Substrat für die Transglutaminase darstellt. Die Verknüpfung des Linkers an den Antikörper kann dabei auf vielfältige Weise erfolgen.
Vorzugsweise weist bei einer Transglutaminase-katalysierten Konjugation der Linker eine der bereits oben genannten Grundstrukturen (i) und (ii)
(i) -(C=0)m -(L1 )n-L2-
(ii) -(C=0)m -(L1 )n-SG-L2 auf, in denen
L1 , SG, SG1 und m die oben genannten Bedeutungen haben,
L2 jedoch vorzugsweise eine der folgenden Gruppen darstellt:
Figure imgf000157_0001
in denen
Ry für -H, -NH-C(=0)-alkyl, steht,
#1 für den Verknüpfungspunkt mit L1 steht und #2 für den Verknüpfungspunkt mit dem Glutaminrest des Binders steht. Vorzugsweise steht hierbei Ry für -H oder -NH-C(=0)-CH3.
Beispiele entsprechender Konjugate weisen die folgenden Strukturen auf, wobei MOD und L1 die oben angegebenen Bedeutungen haben, AK3 für einen Binder steht, der vorzugsweise ein Antikörper ist und n vorzugsweise 2 oder 4 ist.
Figure imgf000157_0002
Figure imgf000158_0001
Besonders bevorzugte KSP-lnhibitor-Konjugate
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden KSP-lnhibitor-Konjugate, bei denen
AK (ΑΚι; AK2; AK3) für einen Binder, vorzugsweise für einen Antikörper oder ein
Antigen-bindendes Fragment steht und
n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 , 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 8 und insbesondere 2 bis 6 steht.
AKi steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Cysteinrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist.
AK2 steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Lysinrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist.
AK3 steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen
Glutaminrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist.
Als Binder oder Antikörper werden hierbei vorzugswiese die in der Beschreibung als bevorzugt beschriebenen Binder bzw. Antikörper verwendet. Insbesondere bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR- Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2 -Antikörper Trastuzumab und TPP- 1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.
Besonders bevorzugte Konjugate sind:
Figure imgf000159_0001

Figure imgf000160_0001
Figure imgf000161_0001
Figure imgf000161_0002
Figure imgf000162_0001
Figure imgf000162_0002
Figure imgf000163_0001
Figure imgf000164_0001
Figure imgf000164_0002
ı63
Figure imgf000165_0001
Figure imgf000165_0002
ı64
Figure imgf000166_0001
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ı65
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Figure imgf000167_0002
ı66
Figure imgf000168_0001
Figure imgf000168_0002
Figure imgf000169_0001
Figure imgf000169_0002
und
Figure imgf000170_0001
in denen
AKi und AK2 für einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht, und
n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, besonders
bevorzugt 2 bis 8 und insbesondere 2 bis 6 steht.
KSP-lnhibitor - Linker-Intermediate bzw. Prodrug-Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugate Die erfindungsgemäßen Konjugate werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP-lnhibitor bzw. das Prodrug hiervon mit einem Linker versehen wird. Da so erhaltene Intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt. Für die Kopplung an einen Cysteinrest wird vorzugsweise eine der folgenden
Verbindungen mit dem Cystein-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper, der dazu ggf. partiell reduziert wurde, umgesetzt:
Figure imgf000171_0001
Figure imgf000172_0001
Figure imgf000173_0001
5
Figure imgf000173_0002
ı72
Figure imgf000174_0001
Figure imgf000175_0001
in denen
Xi für CH steht,
X2 für C steht,
X3 für N steht,
R für -H oder -COOH steht,
K für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit C1-C6 Alkoxy- oder -OH substituiertes C1-C6 Alkyl- steht und
Figure imgf000175_0002
und L4 die oben angegebenen Bedeutungen haben. In den zuvor beschriebenen Formeln wie auch in den folgenden Reaktionsschemata bzw. Strukturformeln kann das Wasserstoffatom in Position R4 gemäß Formel IIa, d.h. in der Gruppe
-IMH2, durch die durch die erfindungsgemäß verwendete, durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la ersetzt sein.
In jeder der obigen Verbindungen wie auch den folgenden Verbindungen kann die tert- butyl-Gruppe durch Cyclohexyl ersetzt sein.
Die Verbindung kann z.B in Form ihres Trifluoressigsäuresalzes verwendet werden. Zur Reaktion mit dem Binder wie z.B. dem Antikörper wird die Verbindung vorzugsweise in 2 bis 12fachem molaren Überschuss gegenüber dem Binder verwendet. Für die Kopplung an einen Lysinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Lysin-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper umgesetzt:
Figure imgf000176_0001
In der Formel steht
Xi für CH steht,
X2 für C steht,
X3 für N steht und
l_4 die gleiche Bedeutung wie hat, wobei die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben hat.
Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermediat können die Reaktionen wie folgt veranschaulicht werden:
Figure imgf000177_0001
Die anderen Intermediate und anderen Antikörper können entsprechend umgesetzt werden. Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Intermediat kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:
Figure imgf000178_0001
Erfindungsgemäß werden so die folgenden Konjugate erhalten:
Figure imgf000178_0002
Figure imgf000178_0003
Diese Umsetzung (Ringöffnung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 ° C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden. In den obigen Formeln stellen X1 CH, X2 C, und X3 N dar; haben SG1 und L1 die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben, und L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung wie L1 ; und R und K haben die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben.
AK1 ist ein über einen Cysteinrest gekoppelter anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen, und AK2 ist ein über einen Lysinrest gekoppelter anti- TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti- HER2-Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind AK1 und AK2 die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Weitere Definitionen Der Ausdruck„Transglutaminase", austauschbar auch verwendet als„TGase" oder„TG", wird verstanden als ein Enzym, welches die Fähigkeit besitzt, Proteine durch eine Acyl- Transfer-Reaktion zwischen der γ-Carboxamid-Gruppe von peptidgebundenem Glutamin und der ε-Aminogruppe von Lysin oder einem strukturell verwandten primären Amin, so wie zum Beispiel einer Aminopentylgruppe oder zum Beispiel einem peptidgebundenen Lysin, zu verknüpfen, was in einer 8-(Y-glutamyl)-Lysin-lsopeptidbindung resultiert.
TGasen schließen unter anderem bakterielle Transglutaminase (BTG) wie zum Beispiel das Enzym mit der EC Referenznummer 2.3.2.13 (Protein-Glutamin-v- Glutamyltransferase) ein.
Der Ausdruck Akzeptorglutamin meint, wenn er bezogen ist auf einen Aminosäurerest eines Antikörpers, einen Glutaminrest, der, unter geeigneten Bedingungen, durch eine Transglutaminase erkannt wird und transglutaminasekatalysiert durch eine Reaktion zwischen ebendiesem Glutamin und einem Lysin oder einem strukturell verwandten primären Amin, wie zum Beispiel einer Aminopentylgruppe, mit diesem verknüpft werden kann. Gegebenenfalls ist das Akzeptor-Glutamin ein oberflächen-exponiertes Glutamin. Mit„Aminosäuremodifikation" oder„Mutation" ist hier eine Aminosäuresubstitution, - Insertion, und/oder eine -deletion in einer Polypeptidsequenz gemeint. Die bevorzugte Aminosäuremodifikation ist hier eine Substitution. Mit„Aminosäuresubstitution" oder „Substitution" ist hier ein Austausch einer Aminosäure an einer gegebenen Position in einer Proteinsequenz durch eine andere Aminosäure gemeint. Zum Beispiel beschreibt die Substitution Y50W eine Variante eines parentalen Polypeptids, in welcher das Tyrosin an Position 50 durch ein Tryptophan ausgetauscht ist. Eine„Variante" von einem
Polypeptid beschreibt ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz hat, die substanziell identisch zu einem Referenzpolypeptid ist, typischerweise einem nativen oder „parentalen" Polypeptid. Die Polypeptidvariante kann eine oder mehrere
Aminosäureaustauche, -deletionen, und/oder -Insertionen an bestimmten Positionen in der nativen Aminosäuresequenz aufweisen.
Der Ausdruck„konjugationsstellenspezifisches Konjugat" beschreibt ein Konjugat eines Binders, vorzugsweise eines Antikörpers, und einem Rest, vorzugsweise einem Linker- Wirkstoff-Rest, wobei der Binder an einer oder mehreren definierten Positionen, vorzugsweise Glutamin-Resten, funktionalisiert ist. Transglutaminasen (TGasen,
TGases), beinhaltend bakterieller Transglutaminase (BTG) (EC 2.3.2.13), zeigen starke Spezifität in der Erkennung von Glutamin-Protein-Substraten und können eine
„konjugationsstellenspezifische Konjugation" katalysieren.
Der Ausdruck„homogenes Konjugat" oder„homogenes ADC" beschreibt ein Gemisch von konjugationsstellenspezifischen Konjugaten wobei mindestens 60, 70, 80, oder 90 % der Binder dieselbe Anzahl von konjugierten Resten pro Binder haben. Im Fall eines
Antikörpers sollte diese Anzahl eine gerade Zahl sein, vorzugsweise 2 oder 4.
Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer
erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie 2H (Deuterium), 3H (Tritium), 13C, 14C, 15N, 170, 180, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36CI, 82Br, 123l, 124l, 129l und 1311. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein
beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff-Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit 3H- oder 14C-lsotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der
Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der
erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder
Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalin- disulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyl- diisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, /V-Methylpiperidin, /V-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
Besondere Ausführungsformen
Die folgenden Ausführungsformen sind besonders bevorzugt:
Ausführungsform A':
Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (lle)
Figure imgf000182_0001
(lle)
ist, in der
Figure imgf000183_0001
x2 für N und
x3 für C steht
oder
Xi für CH steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht
oder
Xi für NH steht,
X2 für C steht und
X3 für C steht
oder
Xi für CH steht,
X2 für N steht und
X3 für C steht,
A für -C(=0)- steht,
R1 für -L-#1 , -H, -COOH, -C(=0)-NHNH2, -(CH2)i-3N H2, -C(=0)-NZ"(CH2)i- 3NH2 und -C(=0)-NZ"CH2C(=0)-OH steht,
Z" für -H oder -NH2 steht,
R2 für -H steht,
R4 für eine Gruppe der Formel (la) steht,
R3 für -L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit -OH,
-O-Alkyl, -SH, -S-Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl,
-NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0)n-Alkyl, -S(=0)2-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, oder -NH2 substituiert sein kann,
R5 für -H oder -F steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Ci-3-Alkyl, C2-4-Alkenyl-,
Fluor- C2-4-Alkenyl-, C2-4-Alkinyl-, Fluor- C2-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,
R8 für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl-Gruppe steht,
R9 für -H oder -F steht, -L-#1 für die Linker-Gruppe
§-(C(=0))m-(L1 )„-L2-§§ steht, in der
unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
die Bindung an den Antikörper darstellt,
für eine der Gruppen
Figure imgf000184_0001
steht, für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht, für die Gruppe
#1-(NR10)n-(G1 )o-G2-#2 steht, in der
R10 für -H, -IMH2 oder Ci-3-Alkyl- steht,
— N N-CO—
G1 für -NHC(=0)- oder \ / steht,
n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N- -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH,
-OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,
#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht,
wobei einer der Substituenten R1 und R3 für die Linker-gruppe -L-#1 steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.
Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP- 10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.
Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (lle) in denenRß in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für C1-3 Alkyl- steht.
Hierbei steht G2 vorzugsweise für
Figure imgf000186_0001
Alternativ kann der Linker -L-#1 an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden sein. Dann, weist er vorzugsweise die folgende Formel
-§-(SG)x-L4-C(=0)-§§, auf, in der
§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,
x 0 oder 1 ist,
SG für eine spaltbare Gruppe steht,
L4 für eine Einfachbindung oder eine Gruppe
-(C(=0))y-G4- steht,
y 0 oder 1 ist und
G4 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein kann , wobei die geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoffkette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, Sulfonamid, Sulfon,
Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
Hierbei steht SG vorzugsweise für ein 2-8 Oligopeptid, besonders bevorzugt für ein Dipeptid.
Vorzugsweise kann die geradkettige oder verzweigte Kohlenstoffkette von G4 durch
Figure imgf000187_0001
nterbrochen sein.
Ausführungsform B'
Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa' bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (llf)
Figure imgf000187_0002
(llf)
ist, in der
Xi für N steht,
X2 für N steht und
Xs für C steht, oder
Xi für CH steht,
X2 für C steht und
x3 für N steht,
oder
Xi für NH steht,
x2 für C steht und
Xs für C steht,
oder
Xi für CH steht,
X2 für N steht und
Xs für C steht, für -C(=0)- steht,
R1 für -L-#1 , -H, -COOH, -C(=0)-NHNH2, -(CH2)i-3NH2,
-C(=0)-NZ"(CH2)i-3NH2 und -C(=0)-NZ"CH2C(=0)-OH steht,
Z" für -H oder -NH2 steht,
R2 für -H steht,
R4 für eine Gruppe der Formel (la) steht,
R3 für -L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit -OH,
-O-Alkyl, -SH, -S-Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl, -NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0)n-Alkyl, -S(=0)2-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2 und -NH2 substituiert sein kann,
R5 für -H oder -F steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Ci-3-Alkyl, C2-4-Alkenyl-,
Fluor- C2-4-Alkenyl-, C2-4-Alkinyl-, Fluor- C2-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,
R8 für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe steht,
R9 für -H oder -F steht,
-L-#1 für die Gruppe
§-(C(=0))m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der
m 0 oder 1 ist; die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
die Bindung an den Antikörper darstellt,
für die Gruppe
Figure imgf000189_0001
steht, #1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht,
#2 für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,
L1 für die Gruppe
#1-(NR1 0)n-(G1 )o-G2-#2 steht, in der R10 für -H, -IMH2 oder Ci-ca-Alkyl- steht,
— N N-CO—
G1 für -NH-C(=0)- oder \ / steht, n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,
#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht, wobei einer der Substituenten R1 und R3 für die Linker-Gruppe-L-#1 steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.
Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP- 10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen. Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (llf) in der R3 in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für C1-3 Alkyl- steht.
Hierbei steht G2 vorzugsweise für
Figure imgf000191_0001
Alternativ kann der Linker -L-#1 an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden sein. Dann, weist er vorzugsweise die folgende Formel
-§-(SG)x-L4-C(=0)-§§ auf, in der
§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,
x 0 oder 1 ist,
SG für eine spaltbare Gruppe steht,
L4 für eine Einfachbindung oder für eine Gruppe
Figure imgf000191_0002
steht,
y 0 oder 1 ist und
G4 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann. Hierbei steht SG vorzugsweise für ein 2-8 Oligopeptid, besonders bevorzugt für ein Dipeptid. Vorzugsweise kann die geradkettige oder verzweigte Kohlenstoff kette von G4 durch
Figure imgf000192_0001
unterbrochen sein.
Ausführungsform C:
Ein APDC der Formel IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (Ilg)
Figure imgf000192_0002
ist, in der
Figure imgf000192_0003
x2 für N und
X3 für C steht
oder
Xi für CH steht,
x2 für C steht und
Xs für N steht
oder
Xi für NH steht,
x2 für C steht und
Xs für C steht für CH steht,
für N steht und
für C steht, für -C(=0)- steht, für -L-#1 steht, für -H steht,
für eine Gruppe der Formel (la) steht,
für eine Ci-10-Alkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit -OH, -O-Alkyl, -SH, -S-Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl, -NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0)n-Alkyl, -S(=0)2-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2 oder -NH2 substituiert sein kann oder für -MOD steht,
für die Gruppe
Figure imgf000193_0001
steht,
für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht,
für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder N\ /N C° steht
0 oder 1 ist,
0 oder 1 ist,
für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -SO-, -S(=0)2, -NRY-, -NRYC(=0)-,
-C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-C(=0)- oder -CRx=N-0- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2,-COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| Q-Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
für -H oder -F steht, R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Ci-3-Alkyl, C2-4-Alkenyl-, Fluor- C2-4-Alkenyl-, C2-4-Alkinyl-, Fluor- C2-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,
R8 für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe steht,
R9 für -H oder -F steht,
-L-#1 für die Linker-Gruppe
§-(C(=0))m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der
m, n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,
L2 für eine der Gruppen
Figure imgf000194_0001
Figure imgf000194_0002
Figure imgf000194_0003
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht,
#2 für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,
L1 für die Gruppe
#1-(NR10)n-(G1 )o-G2-#2 steht, in der
R10 für -H, -NH2 oder Ci-3-Alkyl- steht,
G1 für -NHC(=0)- oder
Figure imgf000195_0001
steht,
n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH,
-OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,
#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht,
sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist. Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP- 10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.
Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (llg), in der R3 in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für C1-3 Alkyl- steht.
Hierbei weist -MOD vorzugsweise zumindest eine COOH-Gruppe auf.
Ausführungsform D':
Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (llh)
Figure imgf000196_0001
(llh) ist, in der
Xi für N, X2 für N und
X3 für C steht
oder
Xi für CH steht,
X2 für C steht und
X3 für N steht
oder
Xi für NH steht,
X2 für C steht und
X3 für C steht
oder
Xi für CH steht,
X2 für N steht und
X3 für C steht,
A für -C(=0)- steht,
R1 für -H oder -COOH steht,
R2 für -H steht,
R4 für eine Gruppe der Formel la steht,
R3 für -L-#1 steht,
R5 für -H oder -F steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, Ci-3
Fluor- C2-4-Alkenyl-, C2-4-Alkinyl-, Fluor- C2-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,
R8 für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe steht,
R9 für -H oder -F steht,
-L-#1 für die Linker-Gruppe
§-(C(=0))m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der
m, n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,
L2 für eine der Gruppen
Figure imgf000198_0001
Figure imgf000198_0002
Figure imgf000198_0003
steht,
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht,
#2 für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,
L1 für die Gruppe
#1-(NR10)n-(G1 )o-G2-#2 steht, in der
R10 für -H, -IMH2 oder Ci-3-Alkyl- steht,
— N N-CO—
G1 für -NHC(=0)- oder \ / steht,
n 0 oder 1 ist,
o 0 oder 1 ist und G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100
Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-,
-C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,
#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht, sowie deren Salze, Solvate und
Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.
Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP- 10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.
Hierbei steht G2 vorzugsweise für
Figure imgf000199_0001
Ausführungsform Ε':
Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (Iii)
Figure imgf000200_0001
(Iii) ist, in der
R1 für -L-#1 steht,
-L-#1 für die Linker-Gruppe
§-(C(=0))m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der
m, n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, L2 für die Gruppe
Figure imgf000201_0001
Figure imgf000201_0002
Figure imgf000201_0003
steht,
für -COOH, -C(=0)-0-Ci-3-Alkyl, -C(=0)-Ci-3-Alkyl, -C(=0)-NH-Ci-3-Alkyl oder -C(=0)-NH2 steht,
für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, für die Bindung zu L1 steht,
für die Gruppe
#1-(NR10)n-(G1 )o-G2-#2 steht, in der für -H steht, für -NHC(=0)- oder
Figure imgf000201_0004
steht,
0 oder 1 ist,
0 oder 1 ist, G2 für Ci-s-Alkyl steht,
#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,
#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht,
R2 und R5 für -H stehen,
R3 für -CH2OH steht und
R4 für eine Gruppe der Formel (la) steht,
sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (Iii), in der R22 für -COOH steht.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers, jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper, vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % vor.
Hierbei besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß Konjugate, die als L2 die Gruppe
Figure imgf000202_0001
aufweisen, in denen R22 die oben angegebenen Bedeutungen hat. In der Regel liegen Konjugate mit beiderlei L2 Gruppen vor, vorzugsweise in einem
Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann mit der Struktur
Figure imgf000203_0001
vor, in der #1 und #2 die oben angegebenen Bedeutungen haben
Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.
Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP- 10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.
Therapeutische Verwendungen
Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypopharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi- Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome,
Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome,
Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und
Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retino- blastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und para- thyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome,
Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und
Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des
Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute mye- loide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AIDS-korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non- Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.
Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den
Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung metastasierter oder zirkulierender Formen hiervon.
Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung
konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfin- dungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder
Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfin- dungsgemäßen Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen
Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder
Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti- hyperproliferativen, zytostatischen, zytotoxischen oder immuntherapeutischen
Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
131 1-chTNT, Abarelix, Abirateron, Aclarubicin, Adalimumab, Ado-Trastuzumab Emtansin, Afatinib, Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alendronsäure, Alitretinoin, Altretamin, Amifostine, Aminoglutethimid, Hexyl-5-Aminolevulinat, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Ancestim, Anethole dithiolethione, Anetumab ravtansine, Angiotensin II, Antithrombin III, Aprepitant, Arcitumomab, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, Atezolizumab, Avelumab, Axitinib, Azacitidin, Belotecan, Bendamustin, Besilesomab, Belinostat, Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, Blinatumomab, Bortezomib, Buserelin, Bosutinib, Brentuximab vedotin, Busulfan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calcitonin,
Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Capromab, Carbamazepine, Carboplatin, Carboquon, Carfilzomib, Carmofur, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Celmoleukin, Ceritinib, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cidofovir, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Cobimetinib, Copanlisib, Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin,
Daratumumab, Dabrafenib, Darolutamide, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Denileukin-Diftitox, Denosumab, Depreotid, Deslorelin, Dexrazoxane,
Dibrospidiumchlorid, Dianhydrogalactitol, Diclofenac, Docetaxel, Dolasetron, Doxifluridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Dronabinol, Durvalumab, Edrecolomab,
Elliptiniumacetat, Endostatin, Enocitabin, Enzalutamid, Epacadostat, Epirubicin,
Epitiostanol, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epoetin-zeta, Eptaplatin, Eribulin, Erlotinib, Esomeprazol, Estramustin, Etoposid, Ethinylestradiol, Everolimus, Exemestan, Fadrozol, Fentanyl, Fluoxymesteron, Floxuridin, Fludarabin, Fluoruracil, Flutamid, Folinsäure, Formestan, Fosaprepitant, Fotemustin, Fulvestrant, Gadobutrol, Gadoteridol,
Gadotersäure-Megluminsalz, Gadoversetamid, Gadoxetsäure Dinatriumsalz (Gd-EOB- DTPA Dinatriumsalz), Galliumnitrat, Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glucarpidase, Glutoxim, Goserelin, Granisetron, Granulocyten Kolonie stimulierender Factor (G-CSF), Granulocyten Macrophagen Kolonie stimulierender Factor (GM-CSF), Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, Ι-125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Imiquimod, Improsulfan, Indisetron, Incadronic acid, Ingenolmebutat, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon- gamma, lobitridol, lobenguane (1231), lomeprol, Ipilimumab, Irinotecan, Itraconazole, Ixabepilon, Ixazomib, Lanreotid, Lansoprazol, Lapatinib, Lasocholine, Lenalidomid, Lenvatinib, Lenograstim, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamisol, Levonorgestrel, Levothyroxin-Natrium, Lipegfilgrastim, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin,
Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melarsoprol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Mesna, Methadon, Methotrexat, Methoxsalen, Methylaminolevulinat, Methylprednisolon, Methyltestosteron, Metirosin, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin,
Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, Mogamulizumab, Molgramostim, Mopidamol, Morphinhydrochlorid, Morphinsulfat, Nabilon, Nabiximols, Nafarelin, Naloxon + Pentazocin, Naltrexon, Nartograstim, Necitumumab, Nedaplatin, Nelarabin, Neridronsäure, Netupitant/palonosetron, Nivolumab, Nivolumabpentetreotid, Nilotinib, Nilutamid, Nimorazol, Nimotuzumab, Nimustin, Nintedanib, Nitracrin, Nivolumab, Obinutuzumab, Octreotid, Ofatumumab, Olaparib, Olaratumab, Omacetaxin- Mepesuccinat, Omeprazol, Ondansetron, Orgotein, Orilotimod, Osimertinib, Oxaliplatin, Oxycodon, Oxymetholon, Ozogamicin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palbociclib,
Palifermin, Palladium-103-Seed, Palonosetron, Pamidronsäure, Panitumumab,
Panobinostat, Pantoprazol, Pazopanib, Pegaspargase, Pembrolizumab, Peg-interferon- alfa-2b, Pembrolizumab, Pemetrexed, Pentostatin, Peplomycin, Perflubutane,
Perfosfamid, Pertuzumab, Picibanil, Pilocarpin, Pirarubicin, Pixantron, Plerixafor,
Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polyvinylpyrrolidone + Natriumhyaluronat, Polysaccharid-K, Pomalidomid, Ponatinib, Porfimer-Natrium, Pralatrexat, Prednimustin, Prednison, Procarbazin, Procodazole, Propranolol, Quinagolid, Rabeprazol,
Racotumomab, Radium-223-chlorid, Radotinib, Raloxifen, Raltitrexed, Ramosetron, Ramucirumab, Ranimustin, Rasburicase, Razoxan, Refametinib, Regorafenib,
Risedronsäure, Rhenium-186 Etidronat, Rituximab, Rogaratinib, Rolapitant, Romidepsin, Romurtid, Roniciclib, Samarium (153Sm) lexidronam, Satumomab, Secretin, Siltuximab, Sipuleucel-T, Sizofiran, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, Sonidegib, Sorafenib,
Stanozolol, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Talimogen Laherparepvec, Tamibaroten, Tamoxifen, Tapentadol, Tasonermin, Teceleukin, Technetium (99mTc) Nofetumomab Merpentan, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotid, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteracil, Temoporfin, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin,
Thalidomid, Thiotepa, Thymalfasin, Thyrotropin alfa, Tioguanin, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Trabectedin, Trametinib, Tramadol, Trastuzumab, Treosulfan, Tretinoin, Trifluridine + Tipiracil, Trametinib, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid,
Thrombopoietin, Ubenimex, Valrubicin, Vandetanib, Vapreotid, Valatinib, Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Vismodegib, Vorinostat, Yttrium-90- Glasmikrokugeln, Zinostatin, Zinostatin-Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin.
Zudem können die Antikörper ausgewählt sein aus der Klasse der MPS1 -Inhibitoren oder Antikörper gegen die Targets OX-40, CD137 / 4-1 BB, DR3, ID01 / ID02, LAG-3, und CD40.
Die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit einer Krebsimmuntherapie zur Verwendung in der Behandlung von Krebs oder Tumoren ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung. Der intrinsische Wirkmechanismus von
zytotoxischen Binder-Wirkstoffkonjugaten beinhaltet die direkte Auslösung von Zelltod der Tumorzellen und somit die Freisetzung von Tumorantigenen, die eine Immunantwort stimulieren können. Zudem gibt es Hinweise, dass die KSP-lnhibitor-Toxophorklasse Marker des sogenannten immunogenen Zelltod [immunogenic cell death (ICD)] in vitro induziert. Somit stellt die Kombination der Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs- Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen, bevorzugt Antikörpern, gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie eine bevorzugte Methode zur Behandlung von Krebs oder Tumoren da. i) Beispiele therapeutischer Ansätze zur Krebs-Immuntherapie umfassen Immun-modulatorische monoklonale Antikörper und niedermolekulare Substanzen gerichtet gegen Targets aus der Krebs Immuntherapie, Vakzine, CAR T Zellen, bi-spezifische T Zell-rekrutierende Antikörper, onkolytische Viren, zellbasierte Vakzinierungsansatze. ii) Beispiele ausgewählter Targets aus der Krebs Immuntherapie geignet für Immun-modulatorische monoklonale Antikörper umfassen CTLA-4, PD-1/PDL-1 , OX-40, CD137, DR3, ID01 , ID02,TD02, LAG-3, TIM-3 CD40.JCOS / ICOSL,TIGIT; GITR/GITRL, VISTA, CD70, CD27, HVEM/BTLA,
CEACAM1 , CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3, TLR's. Die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit eine Krebsimmuntherapie könnte daher zum einen Tumoren mit schwach immunogenen Eigenschaften
immunogener machen und die Wirksamkeit eine Krebsimmuntherapie verstärken und außerdem eine langanhaltende therapeutische Wirkung entfalten.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden. Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch, zytotoxisch oder immuntherapeutisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden:
• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im
Vergleich zur Einzelgabe; · die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; • eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, vaginal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende
Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder
Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder
Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. . intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen,
Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.
Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien,
Augentropfen, Augensalben, Augenbäder, okulare Inserte, Ohrentropfen, -sprays, -pulver, -Spülungen, -tampons, , Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen,
Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Emulsionen, Mikroemulsionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit
pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. · Füll- und Trägerstoffe (beispielsweise Cellulose, mikrokristalline Cellulose wie z.B.
Avicel®, Laktose, Mannitol, Stärke, Calciumphosphate wie z.B. Di-Cafos®),
• Salbengrundlagen (beispielsweise Vaselin, Paraffine, Triglyceride, Wachse,
Wollwachs, Wollwachsalkohole, Lanolin, hydrophile Salbe, Polyethylenglycole),
• Suppositoriengrundlagen (zum Beispiel Polyethylenglycole, Kakaobutter, Hartfett), · Lösungsmittel (z.B. Wasser, Ethanol, Isopropanol, Glycerol, Propylenglycol,
mittelkettige Triglyceride fetter Öle, flüssige Polyethylenglycole, Paraffine),
• Tenside, Emulgatoren, Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise
Natriumdodecylsulfat, Lecithin, Phospholipide, Fettalkohole wie z.B. Lanette®, Sorbitanfettsäureester wie z.B. Span®, Polyoxy-ethylen-Sorbitanfettsäureester wie z.B. Tween®, Polyoxyethylen-Fettsäureglyceride wie z.B. Cremophor®, Polyoxethlyen-Fettsäureester, Polyoxethlyen-Fettalkoholether, Glycerolfettsäure- ester, Poloxamere wie z.B. Pluronic®),
Puffersubstanzen sowie Säuren und Basen (beispielsweise Phosphate,
Carbonate, Citronensäure, Essigsäure, Salzsäure, Natronlauge,
Ammoniumcarbonat, Trometamol, Triethanolamin),
Isotonisierungsmittel (beispielsweise Glucose, Natriumchlorid),
Adsorptionsmittel (beispielsweise hochdisperse Siliciumdioxide),
Viskositätserhöhende Mittel, Gelbildner, Verdickungs- bzw. Bindemittel
(beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Methylcellulose, Hydroxypropylmethyl- cellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose-Natrium, Stärke, Carbomere, Polyacrylsäuren wie z.B. Carbopol®, Alginate, Gelatine),
Sprengmittel (beispielsweise modifizierte Stärke, Carboxymethylcellulose-Natrium, Natriumstärkeglycolat wie z.B. Explotab®, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Croscarmellose-Natrium wie z.B. AcDiSol®),
Fließregulier-, Schmier-, Gleit- und Formtrennmittel (beispielsweise Magnesium- stearat, Stearinsäure, Talkum, hochdisperse Siliciumdioxide wie z.B. Aerosil®),
Überzugsmittel (beispielsweise Zucker, Schellac) sowie Filmbildemittel für sich schnell oder modifiziert auflösende Filme bzw. Diffusionsmembranen
(beispielsweise Polyvinylpyrrolidone wie z.B. Kollidon®, Polyvinylalkohol,
Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Ethylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Celluloseacetat, Celluloseacetatphthtalat, Polyacrylate, Polymethacrylate wie z.B. Eudragit®),
Kapselmaterialien (z.B. Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose),
Synthetische Polymere (beispielsweise Polylactide, Polyglycolide, Polyacrylate, Polymethacrylate wie z.B Eudragit®, Polyvinylpyrrolidone wie z.B. Kollidon®, Polyvinylalcohole, Polyvinylacetate, Polyethylenoxide, Polyethylenglycole und deren Copolymere und Blockcopolymere),
Weichmacher (beispielsweise Polyethylenglycole, Propylenglykol, Glycerol, Triacetin, Triacetylcitrat, Dibutylphthalat),
Penetrationsenhancer, • Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure,
Ascorbylpalmitat, Natriumascorbat, Butylhydroxyanisol, Butylhydroxytoluol, Propylgallat),
• Konservierungsmittel (beispielsweise Parabene, Sorbinsäure, Thiomersal,
Benzalkoniumchlorid, Chlorhexidinacetat, Natriumbenzoat),
• Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide,
Titandioxid),
• Aromen, Süßungsmittel, Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische
Zusammensetzungen, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.1 bis 20 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.3 bis 7 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg,
individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als isotopische Varianten vorliegen. Die Erfindung umfasst daher eine oder mehrere isotopische Varianten der
erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere deuteriumhaltige Verbindungen. Der Begriff "isotopische Variante" einer Verbindung oder eines Reagenzes ist definiert als eine Verbindung mit einem unnatürlichen Anteil eines oder mehrerer der Isotope, aus denen eine derartige Verbindung aufgebaut ist.
Der Begriff "isotopische Variante der erfindungsgemäßen Verbindungen" ist definiert als eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem unnatürlichen Anteil eines oder mehrerer der Isotope, aus denen eine derartige Verbindung aufgebaut ist.
Unter dem Ausdruck "unnatürlicher Anteil" ist ein Anteil eines derartigen Isotops zu verstehen, der höher als dessen natürliche Häufigkeit ist. Die in diesem Zusammenhang anzuwendenden natürlichen Häufigkeiten von Isotopen finden sich in "Isotopic
Compositions of the Elements 1997", Pure Appl. Chem., 70(1 ), 217-235, 1998.
Beispiele für derartige Isotope sind stabile und radioaktive Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie 2H (Deuterium), 3H (Tritium), 11C, 13C, 14C, 15N, 170, 180, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36CI, 82Br, 123l, 124l, 125l, 129l bzw. 131l.
Im Hinblick auf die Behandlung und/oder Prophylaxe der hier angegebenen Störungen enthalten die isotopischen Variante(n) der erfindungsgemäßen Verbindungen
vorzugsweise Deuterium ("deuteriumhaltige erfindungsgemäße Verbindungen").
Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen, in die ein oder mehrere radioaktive Isotope, wie 3H oder 14C, eingebaut sind, sind beispielsweise bei Arzneistoff- und/oder Substratsgewebeverteilungsstudien von Nutzen. Diese Isotope sind wegen ihrer leichten Einbaubarkeit und Nachweisbarkeit besonders bevorzugt. In eine
erfindungsgemäße Verbindung können Positronen emittierende Isotope wie 18F oder 11C eingebaut werden. Diese isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Verwendung bei in-vivo-Bildgebungsanwendungen. Deuteriumhaltige und 13C-haltige erfindungsgemäße Verbindungen können im Rahmen präklinischer oder klinischer Studien bei Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden
Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können im Allgemeinen nach dem Fachmann bekannten Verfahren wie den in den hier beschriebenen Schemata und/oder Beispielen beschrieben hergestellt werden, indem man ein Reagenz durch eine isotopische Variante des Reagenzes, vorzugsweise ein deuteriumhaltiges Reagenz, ersetzt. Je nach den gewünschten Deuterierungsstellen kann in einigen Fällen Deuterium aus D2O entweder direkt in die Verbindungen oder in Reagenzien, die für die Synthese derartiger Verbindungen verwendet werden können, eingebaut werden. Ein nützliches Reagenz zum Einbau von Deuterium in Moleküle ist auch Deuteriumgas. Eine schnelle Route zum Einbau von Deuterium ist die katalytische Deuterierung von olefinischen Bindungen und acetylenischen Bindungen. Zum direkten Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium in funktionelle Gruppen enthaltenden Kohlenwasserstoffen können auch Metallkatalysatoren (d.h. Pd, Pt und Rh) in Gegenwart von Deuteriumgas verwendet werden. Verschiedene deuterierte Reagenzien und Synthesebausteine sind im Handel von Firmen wie beispielsweise C/D/N Isotopes, Quebec, Kanada; Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA, USA; und CombiPhos Catalysts, Inc., Princeton, NJ, USA, erhältlich.
Der Begriff "deuteriumhaltige Verbindung" ist definiert als eine erfindungsgemäße
Verbindung, in der ein oder mehrere Wasserstoffatome durch ein oder mehrere
Deuteriumatome ersetzt sind und in der die Häufigkeit von Deuterium in jeder deuterierten Position der Verbindung der allgemeinen Formel (I) höher ist als die natürliche Häufigkeit von Deuterium, die etwa 0,015% beträgt. Insbesondere ist in einer deuteriumhaltigen erfindungsgemäßen Verbindung die Häufigkeit von Deuterium in jeder deuterierten
Position der Verbindung der allgemeinen Formel (I) höher als 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% oder 80%, vorzugsweise höher als 90%, 95%, 96% oder 97%, noch weiter bevorzugt höher als 98% oder 99% in dieser Position bzw. diesen Positionen. Es versteht sich, dass die Häufigkeit von Deuterium in jeder deuterierten Position von der Häufigkeit von Deuterium in anderen deuterierten Positionen unabhängig ist.
Durch den selektiven Einbau eines oder mehrerer Deuteriumatome in eine
erfindungsgemäße Verbindung können die physikalisch-chemischen Eigenschaften (wie beispielsweise Acidität [C. L. Perrin, et al., J. Am. C em. Soc, 2007, 129, 4490], Basizität [C. L. Perrin et al., J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 9641 ], Lipophilie [B. Testa et al., Int. J. Pharm., 1984, 19(3), 271 ]) und/oder das Stoffwechselprofil des Moleküls verändert und Veränderungen des Verhältnisses von Stammverbindung zu Metaboliten oder der gebildeten Mengen von Metaboliten verursacht werden. Derartige Veränderungen können zu bestimmten therapeutischen Vorteilen führen und daher unter bestimmten Umständen bevorzugt sein. Es ist über verringerte Stoffwechsel raten und Stoffwechselumschaltung, bei der sich das Verhältnis von Metaboliten ändert, berichtet worden (A. E. Mutlib et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 2000, 169, 102). Diese Veränderungen der Exposition gegenüber Stammverbindung und Metaboliten können wichtige Konsequenzen hinsichtlich Pharmakodynamik, Verträglichkeit und Wirksamkeit einer deuteriumhaltigen erfindungsgemäßen Verbindung haben. In einigen Fällen wird durch den Deuteriumersatz die Bildung eines unerwünschten oder toxischen Metaboliten verringert oder eliminiert und die Bildung eines gewünschten Metaboliten verstärkt (z.B. Nevirapin: A. M. Sharma et al., Chem. Res. Toxicol., 2013, 26, 410; Efavirenz: A. E. Mutlib et al., Toxicol. Appl.
Pharmacol., 2000, 169, 102). In anderen Fällen besteht der Haupteffekt der Deuterierung darin, die Geschwindigkeit der systemischen Clearance zu verringern. Dadurch wird die biologische Halbwertszeit der Verbindung erhöht. Zu den potentiellen klinischen Vorteilen gehören die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung einer ähnlichen systemischen Exposition mit verringerten Spitzenspiegeln und erhöhten Talspiegeln. Dies könnte je nach der
Pharmakokinetik/Pharmakodynamik-Beziehung der jeweiligen Verbindung zu geringeren Nebenwirkungen und erhöhter Wirksamkeit führen. Beispiele für diesen Deuterium-Effekt sind ML-337 (C. J. Wenthur et al., J. Med. Chem., 2013, 56, 5208) und Odanacatib (K. Kassahun et al., WO2012/1 12363). Es ist auch noch über weitere Fälle berichtet worden, bei denen verringerte Verstoffwechslungsraten zu einer Erhöhung der
Arzneistoffexposition ohne Änderung der Rate der systemischen Clearance führen (z.B. Rofecoxib: F. Schneider et al., Arzneim. Forsch. / Drug. Res., 2006, 56, 295; Telaprevir: F. Maltais et al., J. Med. Chem., 2009, 52, 7993). Deuterierte Arzneistoffe, die diesen Effekt zeigen, können verringerte Dosierungsanforderungen haben (z.B. geringere Zahl von Dosen oder niedrigere Dosierung zur Erzielung der gewünschten Wirkung) und/oder zu geringeren Metabolitenbelastungen führen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mehrere potenzielle Angriffsstellen für die Verstoffwechslung aufweisen. Zur Optimierung der oben beschriebenen Effekte auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften und das Stoffwechselprofil können
deuteriumhaltige erfindungsgemäße Verbindungen mit einem bestimmten Muster eines oder mehrerer Deuterium-Wasserstoff-Austausche gewählt werden. Insbesondere ist/sind das Deuteriumatom/die Deuteriumatome deuteriumhaltiger erfindungsgemäßer
Verbindung(en) an ein Kohlenstoffatom gebunden und/oder steht/stehen in den
Positionen der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen es sich um Angriffsstellen für Verstoffwechslungsenzyme wie z.B. Cytochrom P450 handelt. Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Ausführbarkeit der vorliegenden Erfindung, ohne die Erfindung nur alleine auf diese Beispiele zu beschränken.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
Synthesewege:
Exemplarisch zu den Ausführungsbeispielen sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege dargestellt.
In diesen Schemata kann gemäß Formel IIa der an der Amino-Gruppe -NHR4 stehende Substituent R4 durch die Gruppe Zi-(C=0)-N H-CH(CH2C(=0)N H2)-C(=0) substituiert sein.
Hierbei steht
Zi für eine Ci-10-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, C1-10-
Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Cö-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl-Ci-io- alkyloxy- oder C6-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io- Aryloxy- oder Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach mit -NH2, -C(=0)-, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 steht, x für 0 oder 1 , v für eine Zahl von 1 bis 20 und für die in der Formel (II) angegebenen Bedeutungen. Schema 1 : Synthese von Cystein-verknüpften ADCs
Figure imgf000217_0001
Figure imgf000217_0002
Schema 3: Synthese von Lysin-verknüpften ADCs
Figure imgf000217_0003
Schema 4: Synthese von Cvstein-verknüpften ADCs über hydrolysierte Bernsteinsäureamide
Dieses Verfahren wurde insbesondere bei ADCs mit L1 = #1-CH2-#2 angewendet um diese ADCs in die offenkettige Verknüpfungsform zu überführen.
Figure imgf000218_0001
Schema 5: S nthese von ADC-Precurser Molekülen
Figure imgf000218_0002
[a): HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.] Schema 6: Allgemeines Verfahren zur Synthese von Intermediaten und ADC-Precursern
Figure imgf000219_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Z1-COOH, EDCI, HOBT, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOH, HATU, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOSu, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]
Schema 7: Synthese von ADC-Precurser Molekülen mit Legumain-spaltbaren Linkern
Figure imgf000220_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan- 1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]
chema 8: Synthese von ADC-Precurser Molekülen mit Legumain-spaltbaren Linkern
Figure imgf000221_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) ) 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan- 1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]
Weiterhin können andere Intermediate gemäß Schema 6, 7 und 8 in Legumain-spaltbare ADC-und APDC Precursor überführt werden.
Alternativ zu der in Schemata 6-8 dargestellten Benzyloxycarbonyl-Gruppe können andere in der Peptidchemie etablierte Schutzgruppen eingesetzt werden und nach entsprechenden ebenso bekannten Methoden abgespalten werden. Die Auswahl der Schutzgruppenstrategie erfolgt nach entsprechenden dem Fachmann bekannten Anforderungen zur Kompatibilität mit anderen im Molekül vorkommenden
Strukturelementen. Falls noch vorhanden können weitere Schutzgruppen im Molekül in einem letzten Schritt entfernt werden. Synthesen können auch ggf. in ihrer Sequenz umgestellt werden.
Schema 9: Synthese von C stein-verknüpften ADCs mit Legumain-spaltbarer Kopfgruppe
Figure imgf000222_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b) 2-5 Eq TCEP, PBS pH7.2, 30 min Rühren bei RT; c) 90 min Rühren bei RT unter Argon, dann Umpuffern auf pH 8 mittels PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) und Rühren über Nacht unter Argon bei RT und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten Konzentration mit PBS bei pH 7.2)] Schema 10: Synthese von L sin-verknüpften ADCs mit Legumain-spaltbarem Linker
Figure imgf000223_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b) H2, 10% Pd-C, Methanol 1.5 h, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, Rühren über Nacht bei RT; d) AK2 in PBS, 5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO zugeben, 60 min Rühren bei RT unter Argon, erneut 5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO nachsetzen, 60 min Rühren bei RT unter Argon, dann Reinigung über mit PBS Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten
Konzentration mit PBS Puffer (pH 7.2)]. chema 1 1 : Synthese von ADC-Precursern mit Legumain-spaltbarer Kopfgruppe
Figure imgf000224_0001
[a): NaBH(OAc)3, HOAc, Dichlormethan, RT; b) Chloracetylchlorid, NEt3, DCM, RT; c) L- Cystein, NaHCOs, DBU, Isopropanol/Wasser, 50 °C; d) HATU, DMF,
Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C; f) d) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT] hema 12: Synthese von ADCs über Transglutaminase-Kupplung
Figure imgf000224_0002
[a: 5 mg AK3 in DPBS pH 7.4 (c~10mg/ml_), 6 Equivalente eines Toxophor-Linker- Precursors, 50 μΙ_ einer Lösung aus 12.5 μί (1.25 U) rekombinanter bakterieller Transglutaminase Lösung in Wasser (100 U/mL) und 37.5 μί DPBS pH 7.4 hinzugegeben, 24h bei 37°C inkubieren]
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P- gp und MDR1 )
abs. Absolut
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
aq. wässrig, wässrige Lösung
ATP Adenosintriphosphat
BCRP Brustkrebs-Resistenz-Protein, ein Efflux-Transporter
BEP 2-Brom-1 -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat
Boc ie/f.-Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
BxPC3 humane Tumorzelllinie
ca. circa, ungefähr
Cl chemische Ionisation (bei MS)
D Dublett (bei NMR)
D Tag(e)
DAR Drug Antibody Ratio (Beladung des Antikörpers)
DC Dünnschichtchromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichlormethan
Dd Dublett von Dublett (bei NMR)
DMAP 4-/V,/V-Dimethylaminopyridin
DME 1 ,2-Dimethoxyethan DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (standardisiertes
Nährmedium für die Zellkultur)
DMF Λ/,/V-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DPBS, D-PBS, Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
D/P Dye (FlopreszenzfarbstoffyProtein Verhältnis
PBS PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537
Zusammensetzung:
0,2 g KCl
0,2 g KH2PO4 (anhyd)
8,0 g NaCI
1 ,15 g Na2HP04 (anhyd)
ad 1 I mit H2O auffüllen
Dt Dublett von Triplett (bei NMR)
DTT DL-Dithiothreitol
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC /V'-(3-Dimethylaminopropyl)-/V-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid
EGFR Epidermal growth factor receptor = Epidermaler
Wachstumsfaktor Rezeptor
El Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
ELISA Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay
eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof =
Time Of Flight und q = Quadrupol)
FCS fötales Kälberserum
Fmoc (9/-/-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl
ges. Gesättigt
GTP Guanosin-5'-triphosphat
H Stunde(n)
HATU 0-(7-Azabenzotriazol-1 -yl)-/V,/V,/V',/V'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1 -ethansulfonsäure
HOAc Essigsäure
HOAt 1 -Hydroxy-7-azabenzotriazol HOBt 1 -Hydroxy-1 H-benzotriazol-Hydrat
HOSu /V-Hydroxysuccinimid
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
IC50 halbmaximale Inhibitionskonzentration
i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel
i.v. intravenös, Applikation in die Vene
konz. konzentriert
KPL-4 humane Tumorzelllinien
KU-19-19 humane Tumorzelllinie
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
LLC-PK1 -Zellen Lewis lung Carcinoma pork kidney cell line
L-MDR Human MDR1 transfizierte LLC-PK1 Zellen
LoVo humane Tumorzelllinie
M Multiplett (bei NMR)
MDR1 Multidrug resistence protein 1
MeCN Acetonitril
Min Minute(n)
MS Massenspektrometrie
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid
NCI-H292 humane Tumorzelllinie
-Nme- Eine am Stickstoffatom gebundene Methyl-Gruppe bedeutet
NMM /V-Methylmorpholin
NMP /V-Methyl-2-pyrrolidinon
NMR Kernresonanzspektrometrie
NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medical Research
Institute (NMRI)
Nude Mäuse Nacktmäuse(Versuchstiere)
NSCLC Non small cell lung Cancer (Nicht-kleinzelliges
Bronchialkarzinom)
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/C Palladium auf Aktivkohle P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein
PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung
quant. quantitativ (bei Ausbeute)
Quart Quartett (bei NMR)
Quint Quintett (bei NMR)
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
S Singulett (bei NMR)
s.c. subcutan, Applikation unter die Haut
SCID Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten
Immundefekt (severe combined immunodeficiency)
SK-HEP-1 humane Tumorzelllinie
t Triplett (bei NMR)
TBAF Tetra-n-butylammoniumfluorid
TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphin
TEMPO (2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin-1 -yl)oxyl
Teoc Trimethylsilylethoxycarbonyl
tert. Tertiär
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
T3P® 2!4!6-Tripropyl-1 !3!5!2!4!6-trioxatriphosphinan-2!4,6-trioxid
U251 humane Tumorzelllinie
UV Ultraviolett-Spektrometrie
v/v Volumen zu Volumen-Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
Aminosäuren Abkürzungen
Ala = Alanin
Arg = Arginin
Asn = Asparagin
Asp = Asparaginsäure Cys = Cystein
Glu = Glutaminsäure
Gin = Glutamin
Gly = Glycin
His = Histidin
lle = Isoleucin
Leu = Leucin
Lys = Lysin
Met = Methionin
Nva = Norvalin
Phe = Phenylalanin
Pro = Prolin
Ser = Serin
Thr = Threonin
Trp = Tryptophan
Tyr = Tyrosin
Val = Valin
HPLC- und LC-MS-Methoden: Methode 1 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A 1 .2 min 5% A
2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm.
Methode 2 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 m; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 %
Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B— > 1 .5 min 2% B -> 8.5 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV- Detektion: 220 nm
Methode 3 (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 I Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A -> 0.2min 98% A -> 3.0 min 5% A^ 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1 .75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm Methode 4 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 0.3 min 10% B -> 1 .7 min 95% B -> 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1 .20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 5 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -> 6.0 min 5% A -> 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 mL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.
Methode 6 (LC-MS):
Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo
Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A -> 0.5 min 97% A -> 3.2 min 5% A -> 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL/min; UV- Detektion: 210 nm. Methode 7 (LC-MS):
Instrument: Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 0.3 min 90% A -> 1 .7 min 5% A -> 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1 ,20 mL/min; UV- Detektion: 205 - 305 nm. Methode 8 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 2.0 min 2% B -> 13.0 min 90% B -> 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 9: LC-MS-Prep Reinigungsmethode für die Beispiele 181 -191 (Methode LIND- LC-MS-Prep)
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 μηη, Eluent A: Wasser + 0.05% Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm).
Methode 10: LC-MS-Analytik-Methode für die Beispiele 181 -191 ( L I N D_S Q D_S B_AQ ) Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq
(Agilent), 50 mm x 2.1 mm, 1 .8 μηη; Eluent A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1 .0 min 5%A - 1 .4 min 5%A - 1 .41 min 98%A - 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 nm.
Methode 1 1 (HPLC):
Gerät: HP1 100 Serie Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6mm, Best-
Nr.1 .51450.0001 , Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e,
5-4,6mm, Best.-Nr. 1 .51470.0001
Gradient: Flow 5ml_/ Min
Injection Volume 5μΙ
Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4
Solvent B: Acetonitril
Start 20% B
0.50 Min 20% B
3.00 Min 90% B
3.50 Min 90% B
3.51 Min 20% B
4.00 Min 20% B
Säulentemperatur: 40°C
Wellenlänge: 210nm
Methode 12: (LC-MS):
Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1 .8 [Ji m ; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 2.5 min 95% B -> 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 210 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm
Methode 13: (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1 .7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 mol
Ammoniumformiat, Eluent B: 1 I Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A— > 0.1 min 95% A— > 2.0 min 15% A -> 2.5 min 15% A^ 2.51 min 10% A -> 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
Methode 14: (LC-MS) (MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10min)
Gerätetyp MS: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent, POROSHELL 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μπι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.1 % Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.1 % Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 0.3 min 2% B -> 5.0 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Ausgangsverbindungen und Intermediate: Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignete
Ausgangsverbindungen sowie die Herstellung geeigneter Intermediate sind bereits in der WO2015/96982 A1 sowie in der WO2016/96610 A1 beschrieben.
Die Intermediate C1 bis C73, L1 bis L73, F1 bis F58 sowie F82 bis F91 , F103 bis F129, F142 bis F156, F163 bis F180, F192 bis F196, F204 bis F207, F209 bis F218, F235, F236, F238, F241 bis F245, F247, F248 und F254 gemäß WO2015/96982 A1 gehören zur Offenbarung der vorliegenden Anmeldung. Ebenso gehören weitere Intermediate, die in WO2016/96610 A1 beschrieben wurden, zur Offenbarung der vorliegenden
Anmeldung. Sofern im Folgenden auf Verbindungen mit bestimmten Nummern verwiesen wird (z.B. Intermediat C1 , L1 oder F1 ), handelt es sich um die Verbindungen mit diesen Nummern gemäß WO2015/96982 A1. Weitere Ausgangsverbindungen und Intermediate werden im Folgenden beschrieben. Intermediat C102
(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glycoloyl)amino]-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butansäure
Figure imgf000234_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4- oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .31 min; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)\
Intermediat C109
Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-glutamat
Figure imgf000235_0001
Zunächst wurde das Dipeptidderivat Di-tert-butyl-beta-alanyl-L-glutamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von kommerziell erhältlichen N- [(Benzyloxy)carbonyl]-beta-alanin und Di-tert-butyl L-glutamat Hydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von HATU und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z- Schutzgruppe hergestellt. Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C102 in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 45-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+. Intermediat C111
Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000235_0002
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat C109.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .06 min; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+.
Intermediat C116
Trifluoressigsäure N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]- amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Figure imgf000236_0001
Trifluoressigsäure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl] 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2 -{[(2, 5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino}ethyl)butanamid (1 :1 ) (81 .0 mg, 100 μηιοΙ) (Intermediat F104) und 2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat (43.0 mg, 131 μmol) wurden 5.0 ml DMF gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit N,N-Diisopropylethylamin (61 μΙ, 350 μηηοΙ), 1 h bei RT nachgerührt, und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule:
Chromatorex 125x30; 10μ, Fluss: 75 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand lyophilisiert. Man erhielt 84 mg (88 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-[(2S)-4-amino-1 -({(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4 (2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}amino)-1 ,4- dioxobutan-2-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .09 min; MS (ESIpos): m/z = 907 [M+H]+ Tert-Butyl-[(2S)-4-amino-1 -({(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}amino)-1 ,4-dioxobutan-2-yl]carbamat (83.0 mg, 91.5 μηηοΙ) wurde in 5.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (74.8 mg, 549 μηηοΙ) versetzt und 15 min bei 50°C nachgerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (160 mg, 549 μηηοΙ) versetzt, mit 5.0 ml Acetonitril/Wasser verdünnt, mit TFA (20 μΙ) versetzt und 10 min nachgerührt. Der Ansatz wurde durch einen Spritzenfilter filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule:
Chromatorex 125x30; 10μ, Fluss: 75 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 50 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 807 [M+H]+
Intermediat C118
tert-Butyl-N-[(8S)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]ethyl}-2,2-dimethyl-6,9-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2- siladodecan-12-yl]-D-alpha-glutaminat
Figure imgf000237_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von Intermediat L1 19 und Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .05 min; MS (ESIpos): m/z = 885 (M+H)+. Intermediat C119
tert-Butyl-glycyl-N-[(8S)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]ethyl}-2,2-dimethyl-6,9-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2- siladodecan-12-yl]-D-alpha-glutaminat
Figure imgf000238_0001
Intermediat C1 19 wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]glycinat und Intermediat C1 18 in Gegenwart von HATU und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol/Dichlormethan bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .03 min; MS (ESIpos): m/z = 942 (M+H)+.
Intermediat C121
Dibenzyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000239_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Dibenzyl-D-glutamat, das zuvor durch Verteilung zwischen Ethylacetat und 5%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung aus seinem p-Toluolsulfonsäure-Salz freigesetzt wurde mit Intermediat C61 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Teoc- Schutzgruppe mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
Intermediat C122 tert-Butyl-N-[2-({(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-
2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-N2-(tert-butoxycarbonyl)-D- alpha-glutaminat
Figure imgf000240_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von tert-Butyl N-(2-aminoethyl)-N2-(tert- butoxycarbonyl)-D-alpha-glutaminat trifluoracetat , mit Intermediat C102 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.06 min; MS (ESIpos): m/z = 841 [M+H]+.
Intermediat C123 tert-Butyl-N-[2-({(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-N2-(tert- butoxycarbonyl)-D-alpha-glutaminat
Figure imgf000241_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 4-Nitrophenyl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L- asparaginat mit Intermediat C122 in DMF in Gegenwart Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 955 [M+H]+.
Intermediat C130
9H-Fluoren-9-ylmethyl-{3-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat
Figure imgf000242_0001
9H-Fluoren-9-ylmethyl-[3-({(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat (2.50 g, 3.94 mmol) (Intermediat C67) und Triethylamin (1 .6 ml, 12 mmol) wurden in Dichlormethan (200 ml) vorgelegt.
Chloracetylchlorid (2.23 g, 19.7 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion wurde für 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit 10%iger Zitronensäurelösung, Wasser, ges.
Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen.
Anschließend wurde die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 1 .7 g der Titelverbindung
Intermediat C131
tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]a
cysteinat
Figure imgf000243_0001
Unter Argon wurden Di-tert-butyl-L-cystinatdihydrochlorid (135 mg, 317 μmol) in 6.0 mL Wasser und 7.5 mL /'so-Propanol vorgelegt und mit TCEP (303 mg, 1.06 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 9H-Fluoren-9-ylmethyl-{3-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (300 mg, 422 μηιοΙ) und 1 ,8- Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (760 μΙ, 5.1 mmol) in 1.5 mL /'so-Propanol zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 360 mg der Titelverbindung.
LC-MS (Methodel ): Rt = 1 .17 min; MS (ESIpos): m/z = 851 [M+H]+ Intermediat C132
tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino}propyl)amino]-2-oxoeth (2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L-cysteinat
Figure imgf000244_0001
tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino}propyl)amino]-2-oxoeth cysteinat (361 mg, 424 μηηοΙ) wurden in absolutem DMF (3 ml_) gelöst und zu 2,2- Dimethyl-4-oxo-3, 8,1 1 ,14, 17-pentaoxa-5-azaicosan-20-säure (186 mg, 509 μηιοΙ) gegeben. Die Mischung wurden mit HATU (193 mg, 509 μηηοΙ) sowie mit N,N- Diisopropylethylamin (300 μΙ, 1 .7 mmol) versetzt und die Reaktion wurde 5 min. bei RT gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA gequencht und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 167 mg der Zielverbindung erhalten
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .56 min; MS (ESIpos): m/z = 1 198 [M+H]+
Intermediat C133
tert-Butyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5- azaicosan-20-yl)-L-cysteinat
Figure imgf000245_0001
Eine Lösung aus tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino}propyl)amino]-2- oxoethyl}-N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L- cysteinat (214 mg, 178 μηιοΙ) in DMF (5 mL) wurde mit Morpholin (160 μΙ, 1 .8 mmol) versetzt und bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Der Ansatz wird mit Wasser +0,1 % TFA gequencht und direkt über die präp. HPLC (Acetoniril/Wasser + 0.1 % TFA Gradient) gereinigt. Es wurden 1 1 1 mg der Zielverbindung erhalten
LC-MS (Methodel ): Rt = 1 .03 min; MS (ESIpos): m/z = 976 [M+H]+
Intermediat C134
tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoeth N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L-cysteinat
Figure imgf000246_0001
tert-Butyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5- azaicosan-20-yl)-L-cysteinat (27.2 mg, 27.9 μmol) und N2-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-asparagin (8.40 mg, 33.4 μηηοΙ, Intermediat L136) wurden in absolutem DMF (3 ml_) gelöst und mit HATU (12.7 mg, 33.4 μηιοΙ) sowie mit N,N-Diisopropylethylamin (15 μΙ, 84 μmol) versetzt. Die Reaktion wurde 10 min. bei RT gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA gequencht und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 23 mg der Zielverbindung erhalten LC-MS (Methode 12): Rt = 2.12 min; MS (ESIpos): m/z = 1209 [M+H]+
Intermediat C135
N-(15-Amino-4,7, 10,13-tetraoxapentadecan-1 -oyl)-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L- asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-L-cystein Trifluoressigsäure Salz
Figure imgf000247_0001
tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-o^ N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L-cysteinat (63.6 mg, 52.6 μηηοΙ) wurde in Trifluorethanol (3.0 ml, 41 mmol) gelöst und mit Zinkchlorid (43.0 mg, 316 μηηοΙ) versetzt. Die Reaktion wurde 2h 20 min bei 50°C nachgerührt. Es werden noch einmal 6eq. ZnCI2 nachgegeben und 1 h bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (184 mg, 631 μηηοΙ) versetzt und auf
Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der Reaktionsmischung wurde mit Wasser (+ 01. %TFA) versetzt, filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 40 mg der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.75 min; MS (ESIneg): m/z = 1051 lntermediat C136
Benzyl [2-({(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]carbamat trifluoracetat
Figure imgf000248_0001
Zunächst wurde Intermediat C58 mit Benzyl-(2-aminoethyl) carbamathydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Anschließend erfolgte die Abspaltung der Teoc-Schutzgruppe durch 2-stündiges Rühren bei 50°C in Tnfluorethanol mit 8 Equiv. Zinkchlorid. Das erhaltene Intermediat wurde dann mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 - yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt. Im letzten Schritt erfolgte durch 1 -stündiges Rühren bei 50°C in Tnfluorethanol mit 6 Equiv. Zinkchlorid die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe, wobei die Zielverbindung erhalten wurde. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 804 [M+H]+. Intermediat C137
Benzyl N-(2-{[2-({(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]sulfonyl}ethyl)-N2- [(benzyloxy)carbonyl]-D-alpha-glutaminat trifluoracetat
Figure imgf000249_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L81 durch Kupplung mit
Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2R)-5- (Benzyloxy)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-5-oxopentansäure in Gegenwart von 2 Equiv. HATU und 3 Equiv. N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Entschützung mit 6 Equiv. Zinkchlorid (1 h Rühren bei 50°C in Trifluorethanol) in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .89 min; MS (ESIpos): m/z = 1001 (M+H)+.
Intermediat C138 tert-Butyl-N-[(8S)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glykoloyl)amino]ethyl}-2,2-dimethyl-13 ,13-dioxido-6,9-dioxo-5-oxa-13lambda6-thia- 7,10-diaza-2-silapentadecan-15-yl]-D-alpha-glutaminat
Figure imgf000250_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 durch Kupplung mit
Intermediat L81 Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2R)-2- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-tert-butoxy-5-oxopentansäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 2-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck in die Titelverbindung überführt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.14 min; MS (ESIpos): m/z = 977 (M+H)+. Intermediat C139
Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000251_0001
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte durch Kupplung von Intermediat C1 1 1 mit 1.5 Equiv. 4-Nitrophenyl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 2-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 940 [M+H]+.
Intermediat C140
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-N N5-dibenzyl-D-glutamamid trifluoracet
Figure imgf000252_0001
Zunächst wurde N1,N5-Dibenzyl-D-glutamamid-trifluoracetat durch Kupplung von N-(tert- Butoxycarbonyl)-D-glutaminsäure mit Benzylamin in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit TFA hergestellt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin mit Boc-ß-Alanin gekuppelt und anschließend die Boc-Schutzgruppe mit TFA in DCM entfernt. Die erhaltene Verbindung wurde anschließend mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt und schließlich wurde durch Abspaltung der Teoc-Schutzgruppe mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 892 [M+H]+.
Intermediat C141
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-asparagin trifluoracetat
Figure imgf000253_0001
Zunächst wurde Intermediat C61 mit tert-Butyl-L-asparaginat in Gegenwart von 1 .5 Equiv. HATU und 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Anschließend wurde durch Rühren mit 6Equiv. Zinkchlorid in Trifluorethanol bei 50°C die Teoc-Schutzgruppe sowie der tert-Butylester entfernt und somit die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 892 [M+H]+.
Intermediat C142
Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)bu beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000254_0001
Zu einer Lösung aus N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]- beta-alanin (745 mg, 1.02 mmol, Intermediat C61 ) in DMF (10 ml) wurde Di-tert-butyl-D- glutamathydrochlorid (363 mg, 1.23 mmol), HATU (505 mg, 1.33 mmol) und N,N- Diisopropylethylamin (530 μΙ, 3.1 mmol) gegeben und die Reaktion wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde Ethylacetat versetzt und mit Wasser und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet eingeengt und der Rückstand wurde mittels präp. RP- HPLC (Gradient, MeCN/Wasser + 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .58 min; MS (ESIpos): m/z = 970 [M+H]+ Intermediat C143
Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-({(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}{[(methylsulfonyl)oxy]acetyl}amino)-2-({[2-(trimethylsilyl)etho^ amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000255_0001
Zu einer Lösung aus Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}- amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat (257 mg, 264 μηιοΙ Intermediat C142) in Dichlormethan (20 ml) wurde bei 0°C Methansulfonylchlorid (49 μΙ, 630 μηηοΙ) und Triethylamin (92 μΙ, 660 μmol) geben und die Reaktion wurde für 1 h bei 0°C gerührt. Anschließend wurde mit Dichlormethan verdünnt und mit einer gesättigten
Natriumhydrogencarbonat Lösung (3 x) und einer gesättigten Natriumchlorid Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet eingeengt und der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter umgesetzt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .52 min; MS (ESIpos): m/z = 1048 [M+H]+ Intermediat C144
Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-amino-3-tert-butoxy-3-oxopropyl]sulfanyl}acetyl){(1 R)-1 - [1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-({[2-(trim silyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat trifluoracetat
Figure imgf000256_0001
Unter Argon wurden Di-tert-butyl-L-cystinatdihydrochlorid (306 mg, 719 μmol) in 25 mL Wasser und 50 mL /'so-Propanol vorgelegt und mit TCEP (687 mg, 2.40 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-({(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}{[(methylsulfonyl)oxy]acetyl}amino)-2-({[2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat (1 .00 g, 958 μηηοΙ Intermediat C143) und 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (1 .7 ml, 1 1 mmol) in 35 mL /'so- Propanol zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 14 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges.
Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Gradient, MeCN/Wasser + 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 923 mg der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.46 min; MS (ESIpos): m/z = 1 129 [M+H]+ Intermediat C145
Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}({[(2R)-3-tert-butoxy-2-({N2-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L- asparaginyl}amino)-3-oxopropyl]sulfanyl}acetyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)- ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000257_0001
Zu einer Lösung aus Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-amino-3-tert-butoxy-3- oxopropyl]sulfanyl}acetyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl- D-glutamat trifluoracetat (60.0 mg, 48.2 μηιοΙ Intermediat C144) und N2-[(9H-Fluoren-9- ylmethoxy)carbonyl]-L-asparagin (20.5 mg, 57.9 μηηοΙ) in DMF (3.0 ml) wurde HATU (22.0 mg, 57.9 μηηοΙ) und N,N-Diisopropylethylamin (25 μΙ, 140 μηηοΙ) gegeben und die
Reaktion wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA versetzt und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 71 mg der Zielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 3.15 min; MS (ESIpos): m/z = 1466 [M+H]+ Intermediat C146
Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-(L-asparaginylamino)-3-tert-butoxy-3-oxopropyl]sulfanyl}- acetyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2- ({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat trifluoracetat
Figure imgf000258_0001
Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}({[(2R)-3-tert-butoxy-2-({N2-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L- asparaginyl}amino)-3-oxopropyl]sulfanyl}acetyl)amino]-2-({[2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat (63.5 mg, 43.3 μηηοΙ, Intermediat C145) wurde in DMF (3 ml) vorgelegt, mit Morpholin (38 μΙ, 430 μηιοΙ) versetzt und bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA versetzt und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 38 mg der Zielverbindung erhalten.
LC-MS (Methodel ): Rt = 1 .25 min; MS (ESIpos): m/z = 1243 [M+H]+ Intermediat L81
Trifluoressi
Figure imgf000259_0001
250 mg (1 .1 1 mmol) 2,2'-Sulfonyldiethanamin wurden mit 92.3 mg (0.37 mmol) 1 - {[(Benzyloxy)carbonyl] oxy}pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Nach anschließender HPLC Reinigung wurden 70 mg (47% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. C-MS (Methode 12): Rt = 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 257.1 1 (M+H)+.
Intermediat L103
N-(pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-asparagine trifluoroacetate
Figure imgf000259_0002
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie beginnend mit der Kupplung von 4-Pyridinessigsäure mit kommerziell erhältlichem tert-Butyl-L-alanyl-L- alaninat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin, dann folgender Entschützung mit Trifluoressigsäure, Kupplung mit tert-Butyl-L-asparaginat und anschließender Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.15 min; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
Intermediat L119
Trifluoressigsäure -tert-butyl-N-(2-aminoethyl)-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-D-;
glutaminat Salz
Figure imgf000260_0001
Intermediat L1 19 wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von kommerziell erhältlichen (2R)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-tert-butoxy-5- oxopentansäure (1 .00 g, 2.96 mmol) und tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat (560 μΙ, 3.6 mmol) in Gegenwart von HATU und anschließender saurer Abspaltung der Boc- Schutzgruppe mit TFA in Dichlormethan hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.62 min; MS (ESI-pos): m/z = 380 (M+H)+.
Intermediat L136 2-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-asparagin
Figure imgf000260_0002
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Pyridin-4-ylessigsäurehydrochlorid mit tert-Butyl-L-asparaginat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der ί-Butyl-Schutzgruppe mittels Trifluoressigsaeure in Dichloromethan hergestellt. LC-MS (Methode 12): Rt = 0.65 min; MS (ESIneg): m/z = 250 [M-H]" Intermediat L137
Figure imgf000261_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Pyridin-4-ylessigsäurehydrochlorid (1 :1 ) mit tert-Butyl-L-glutaminat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der ί-Butyl-Schutzgruppe mittels Trifluoressigsaeure in Dichloromethan hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 0.59 min; MS (ESIneg): m/z = 264 [M-H]" Intermediat L138
1 -Brom-2-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure
Figure imgf000261_0002
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 1 -Amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- säure mit Bromessigsäureanhydrid in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin hergestellt.
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 386 und 388 (M+H)+. Intermediat F104
Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-
2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]- amino}ethyl)butanamid
Figure imgf000262_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 hergestellt. 15 mg (0.023 mmol) von Intermediat C58 wurden zunächst mit 1 1 mg (0.036 mmol) Intermediat L1 in Gegenwart von 13 mg ( 0.034 mmol) HATU sowie 10 μΙ N,N-Diisopropylethylamin umgesetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 12.3 mg (63% d. Th.) des geschützten
Intermediats erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .3 min; MS (Elpos): m/z = 837 [M+H]+. Im zweiten Schritt wurde dieses Intermediat in 3 ml_ 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure sowie 2 ml_ einer 0.1 %-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 8.1 mg (68% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 693 (M+H)+. Allgemeine Vorschrift zur Synthese der APDC oder ADC Precursor (Intermediatserie S)
Die zuvor in früheren Offenbarungen WO2015/96982 A1 und WO2016/096610 A1 beschriebenen Intermediate der F-Serie (F1-F305) können ggf. nach Anpassung der Syntheseroute oder der Schutzgruppenstrategie in die APDC-Precurser S überführt werden. Wie in Schema 1 a und Schema 1 b exemplarisch dargestellt kann im Falle einer Freisetzung der N-terminalen Aminogruppe des Legumain-spaltbaren Asparagins im APDC-Precursormolekül diese zur Verbesserung des Eigenschaftsprofils im letzten Schritt mit strukturdiversen substituierten Acylresten oder Alkylresten modifiziert werden. Gegebenenfalls kann die proteinreaktive Gruppe (beispielsweise Maleinimid oder Aktivester) zu späteren Zeitpunkten in der Synthese eingeführt werden.
Eine examplarische Vorschrift ist hier dargestellt:
0.037 mmol eines Intermediats F1 -Fx werden in 1-20 ml_ bevorzugt 5-10 ml_ eines geeigneten Lösungsmittels wie beispielsweise DMF, DMSO, DCM, Chloroform, Toluol, THF, Methanol oder einer Mischung derselben aufgenommen und mit 0.039 mmol eines N-terminal modifizierten Asparaginsäurederivat wie z.B. Intermediat L136 sowie mit 0.041 mmol eines gängigen Kupplungsreagenzes wie z. B. HATU, EDCI/HOBT, BEP etc. und 0.1 1 mmol einer gängigen Base wie z.B. Ν,Ν-Diisopropylethylamin, Triethylamin, 4- Methylmorpholin etc. versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wird der Ansatz mit 2 Tropfen Trifluoressigsäure angesäuert und eingeengt. Der Rückstand wird durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert.
Wenn es sich bei der besagten N-terminalen Modifizierung des angeknüpften Tripeptid- Derivats um eine Schutzgruppe handelt, kann diese anschließend nach bekannten Methoden abgespalten werden, beispielsweise eine Z-Schutzgruppe bevorzugt mittels Hydrogenolyse, eine Boc-Schutzgruppe mittels Säurespaltung, eine Fmoc-Schutzgruppe durch basische Spaltung oder eine Teoc-Gruppe mittels Fluoriden oder mit Zinkchorid. Schließlich kann die so freigesetzte Aminogruppe zur Verbesserung des
Eigenschaftsprofils acyliert oder alkyliert werden, beispielsweise mit aminreaktiven Gruppen wie Aktivestern, Säurechloriden, Isocyanaten etc. oder durch Kupplung mit Carbonsäurederivaten in Gegenwart eines gängigen Kupplungsreagenzes wie z. B. HATU, EDCI/HOBT, BEP etc. sowie einer gängigen Base wie z.B. Ν,Ν-Diisopropylethylamin, Triethylamin, 4-Methyl- morpholin etc. Falls noch vorhanden können weitere Schutzgruppen im Molekül in einem letzten Schritt entfernt werden.
Schema 1 a:
Figure imgf000264_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Zi-COOH, EDCI, HOBT, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOH, HATU, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOSu, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT] Schema 1 b:
Figure imgf000265_0001
[a): 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat, DMF, N,N-
Diisopropylethylamin, RT; b) ZnC , Trifluorethanol, 50°C; c) Zi-COOH, EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOH, HATU, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOSu, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]
Weiterhin können andere Intermediate gemäß Schema 2a und 3a in Legumain-spaltbare ADC-Precursor überführt werden: Sche
Figure imgf000266_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT; alternativ kann die Acylierung beispielsweise auch mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in DMF erfolgen; b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]
chema 3a:
Figure imgf000267_0001
[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT; alternativ kann die Acylierung beispielsweise auch mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in DMF erfolgen; b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]
Alternativ zu der in Schemata 1 -3 dargestellten Benzyloxycarbonyl-Gruppe können andere in der Peptidchemie etablierte Schutzgruppen eingesetzt werden und nach entsprechenden ebenso bekannten Methoden abgespalten werden. Die Auswahl der Schutzgruppenstrategie erfolgt nach entsprechenden dem Fachmann bekannten Anforderungen zur Kompatibilität mit anderen im Molekül vorkommenden
Strukturelementen. Falls noch vorhanden können weitere Schutzgruppen im Molekül in einem letzten Schritt entfernt werden.
Die Synthesen können auch ggf. in ihrer Sequenz umgestellt werden. Weiterhin kann die proteinreaktive Gruppe im Sinne des Linkerstrukturen L1 -L2 im Rahmen der Ansprüche variiert werden.
Intermediat S1 N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino}ethyl)amino]- 1 -oxobutan-2-yl}-N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-aspartamid
Figure imgf000268_0001
5 mg (0.0062 mmol) von Intermediat F104 wurden in 2 ml DMF gelöst und mit 1.9 mg (0.0074 mmol) von Intermediat L136 in Gegenwart von 3.5 mg (0.0093 mmol) HATU und 3 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach 16 h Rühren bei RT und Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 2.8 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 926 (M+H)+.
Intermediat S2
N2-Acetyl-N1-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl] amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid
Figure imgf000269_0001
6 mg (0.0065 mmol) von Intermediat C1 16 wurden in 2 mL DMF mit 2 mg (0.013 mmol) 1 - Acetoxypyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 3 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 5 mg (90% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 849 (M+H)+.
Intermediat S3
Benzyl-[(2S)-4-amino-1 -({(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]- amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}amino)-1 ,4-dioxobutan-2-yl]carbamat
Figure imgf000270_0001
10 mg (0.0124 mmol) von Intermediat F104 wurden in DMF mit 3.6 mg (0.0136 mmol) N2- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-asparagin in Gegenwart von 5.7 mg (0.0149 mmol) HATU und 9 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach 30 min Rühren bei RT und Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 6 mg (51 % d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.06 min; MS (ESIneg): m/z = 939 (M-H)\
Intermediat S4
N-[2-({(2S)-2-[(N2-Acetyl-L-asparaginyl)amino]-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-N2-[(2,5-dioxo 2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-D-alpha-glutamin
Figure imgf000271_0001
15 mg (0.016 mmol) von Intermediat C123 wurden in 3 mL DMF mit 7.4 mg (0.047 mmol) 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 8 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 10 mg (64% d.Th.) des geschützen Intermediats erhalten. Dann erfolgte die Abspaltung des tert.-Butylesters sowie der Boc- Schutzgruppe durch 3 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im letzten Schritt wurde aus 6 mg (0.006 mmol) des erhaltenen Intermediats durch Kupplung mit 1 .9 mg (0.008 mmol) 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H- pyrrol-2,5-dion in DMF in Gegenwart von 3 μΙ Ν,Ν-Diisopropylethylamin die
Titelverbindung hergestellt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 3 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 978 (M+H)+. Intermediat S5
N-(2-{[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}bi amino}ethyl)-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-D-alpha-glutamin
Figure imgf000272_0001
15 mg (0.016 mmol) von Intermediat C123 wurden in 5.6 ml_ DMF mit 3.3 mg (0.019 mmol) Pyridin-4-ylessigsäurehydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von 7.2 mg (0.019 mmol) HATU und 14 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels
präparativer HPLC wurden 1 1 mg (63% d.Th.) des geschützen Intermediats erhalten.
Dann erfolgte die Abspaltung des tert.-Butylesters sowie der Boc-Schutzgruppe durch 3 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im letzten Schritt wurde aus 6.5 mg (0.006 mmol) des erhaltenen Intermediats durch Kupplung mit 1 .2 mg (0.008 mmol) 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in 2 ml_ DMF in Gegenwart von 3.3 μΙ Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 3 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 1055 (M+H)+. Intermediat S6
N-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glycoloyl)amino]-2-[(N2-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-asparaginyl) amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000273_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5- diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 1039 [M+H]+. Intermediat S7
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2-({N2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)hexanoyl]-L-asparaginyl} amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000274_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 .5 Equivalenten 1 -{6-[(2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-6-oxohexyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equivalenten Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .81 min; MS (ESIneg): m/z = 1019 [M-H]\ Intermediat S8
N1-{3-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl) amino]propyl}-N2-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-aspartamid
Figure imgf000275_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von dem in WO 2015096982 beschriebenen Beispiel 98 hergestellt:
Zunächst wurde die Verbindung aus Beispiel 98 mit 1 .8 Equivalenten 4-Nitrophenyl-N2- [(benzyloxy) carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 2 Equivalenten N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte die Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff- Normaldruck bei RT. Im letzten Schritt wurde die Titelverbindung durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in DMF hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 795 [M+H]+.
Intermediat S9
(8S,1 1 S)-1 1 -(2-Amino-2-oxoethyl)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]ethyl}-1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)- 2,7,10,13-tetraoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-säure
Figure imgf000276_0001
Zunächst wurde Intermediat C136 mit 1 .4 Equiv. Dihydrofuran-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Im nächsten Schritt wurden der Benzylester sowie die Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol-DCM unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt. Im letzten Schritt wurde durch Umsetzung mit 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 907 [M+H]+.
Intermediat S10
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glykoloyl)amino]-2-({N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-asparaginyl}- amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000277_0001
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat S6 hergestellt, wobei im letzten Schritt an Stelle von 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion die Kupplung mit 1.5 Equiv. 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin erfolgte.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 965 [M+H]+.
Intermediat S11
N-(2-{[2-({(2S)-2-[(N2-Acetyl-L-asparaginyl)amino]-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}amino sulfonyl}ethyl)-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-D-alpha-glutamin
Figure imgf000278_0001
Zunächst wurde Intermediat C137 mit 1 .3 Equiv. 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert- butoxycarbonyl)-L-asparaginat in Gegenwart von 3 Equiv. N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt. Die Boc-Gruppe wurde anschließend durch 3-stündiges Rühren mit 6 Equiv. Zinkchlorid in Trifluorethanol bei 50°C abgespalten. Das Reaktionsprodukt wurde mit 2 Equiv. 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann wurde die Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt. Im letzten Schritt wurde schließlich durch Umsetzung mit 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2- oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .66 min; MS (ESIpos): m/z = 1070 [M+H]+. Intermediat S12
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glykoloyl)amino]-2-{[N2-(bromacetyl)-L-asparaginyl]amino}butanoyl]-beta-alanyl-D- glutaminsäure
Figure imgf000279_0001
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat S10 hergestellt, wobei die
Umsetzung im letzten Schritt mit 3 Equiv. 1 -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion an Stelle von 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 2 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin erfolgte.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 948 und 950 [M+H]+.
Intermediat S13
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-({N2-[1 -(2,5-dioxo-2!5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)-2!18-dioxo-6!9!12,15- tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-asparaginyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D- glutaminsäure
Figure imgf000280_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Das erhaltene Intermediat wurde im nächsten Schritt mit 3-Oxo-1 -phenyl-2,7,10,13,16- pentaoxa-4-azanonadecan-19-säure in Gegenwart 1 .2 Equiv. HATU und 3 Equiv. von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Dann wurden die Benzylester sowie die Z- Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in
Methanol/DCM 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2- oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1212 [M+H]+. Intermediat S14
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-({N2-[1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)-6,22-dioxo- 3,10,13,16,19-pentaoxa-7-azadocosan-22-yl]-L-asparaginyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl- D-glutaminsäure
Figure imgf000281_0001
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat S13 hergestellt, wobei die
Umsetzung im letzten Schritt mit 3 Equiv. 1 -(2-{3-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-3- oxopropoxy}ethyl)-1 H-pyrrol-2,5-dion an Stelle von 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2- oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin erfolgte.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1270 [M+H]+. Intermediat S15
N2-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-asparaginyl-N-(2-{[2-({(2S)-2-amino-4- [{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl) amino]butanoyl}amino)ethyl]sulfonyl}ethyl)-D-alpha-glutamin trifluoracetat
Figure imgf000282_0001
Die Synthese der Titelverbindung begann zunächst mit der Kupplung von Intermediat C138 mit 4-Nitrophenyl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 2 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin. Anschließend erfolgte die Abspaltung der Z-Schutz- gruppe durch 2-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in
DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT. Dann erfolgte die Umsetzung mit 1 .2 Equiv. 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF. Im letzten Schritt wurde durch 2 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 [M+H]+.
Intermediat S16
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-{[N2-(18-brom-17-oxo-4,7, 10,13-tetraoxa-16-azaoctadecan-1 -oyl)-L- asparaginyl]amino}butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000283_0001
H
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte zunächst durch Kupplung von Intermediat C139 mit Intermediat L138 in DMF in Gegenwart von 1.2 Equiv. HATU und 3 Equiv. N,N- Diisopropylethylamin. Anschließend erfolgte die Abspaltung der tert.-Butylestergruppen durch 1 h Rühren bei 50°C mit 18 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.91 min; MS (ESI-neg): m/z = 1 193 und 1 195 [M-H]\
Intermediat S17
S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2- (pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-N-[1 -(2,5-dioxo-2,5- dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein
Figure imgf000284_0001
Zu einer Lösung aus N-(15-Amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-1 -oyl)-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 - benzyl-4-(2!5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)- L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-L-cystein Trifluoressigsäure Salz (10.0 mg, 8.57 μηηοΙ) und 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion (2.38 mg, 9.42 μηηοΙ) in DMF (1 ml) wurde 4-Methylmorpholin (2.8 μΙ, 26 μmol) gegeben und die Reaktion wurde für 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der
Reaktionsmischung wurde mit einem Tropfen Essigsäure versetzt und mittles präp. RP- HPLC (Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 2.2 mg der Titelverbindung
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .62 min; MS (ESIpos): m/z = 1 190 [M+H]+
Intermediat S18
S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2- (pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-N-{21 -[(2,5-dioxo- pyrrolidin-1 -yl)oxy]-17,21 -dioxo-4,7, 10,13-tetraoxa-16-azahenicosan-1 -oyl}-L-cystein
Figure imgf000285_0001
Zu einer Lösung aus N-(15-Amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-1 -oyl)-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 - benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)- L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-L-cystein Trifluoressigsäure Salz (10.6 mg, 9.08 μηηοΙ) in DMF (1 mL) wurde 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin- 2,5-dion (7.41 mg, 22.7 μηηοΙ) und N,N-Diisopropylethylamin (6.3 μΙ, 36 μηηοΙ) gegeben und die Reaktionsmischung wurde bis zur vollständigen Umsetzung bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wurde mit Wasser + 0,1 %TFA versetzt , filtriert und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 1.2 mg der Zielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1263 [M-H]+
Intermediat S19
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}({[(2R)-2-carboxy-2-({N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L- asparaginyl}amino)ethyl]sulfanyl}acetyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamin säure trifluoracetat
Figure imgf000286_0001
Zu einer Lösung aus Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-(L-asparaginylamino)-3-tert-butoxy- 3-oxopropyl]sulfanyl}acetyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl- D-glutamat trifluoracetat (12.0 mg, 8.84 μηιοΙ, Intermediat C146) und 1 -{2-[(2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion (2.45 mg, 9.72 μηηοΙ) wurden in DMF (1 .0 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (6.2 μΙ, 35 μmol) gegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2h gerührt. Anschließend wurde 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 - yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion (2.45 mg, 9.72 μmol)hinzugeben und für weitre 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA versetzt und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt.
Anschließend wurden die Schutzgruppen durch 4 h Rühren bei 50°C mit 12 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol abgespalten.
LC-MS (Methodel ): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 1068 [M+H]+ Intermediat S20
N-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-
(glykoloyl)amino]-2-[(N2-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-asparaginyl)- amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-asparagin
Figure imgf000287_0001
Zunächst wurde Intermediat C141 mit 1 .8 Equivalenten 4-Nitrophenyl-N2-[(benzyloxy) carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 12 Equivalenten N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte die Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter
Wasserstoff-Normaldruck bei RT. Im letzten Schritt wurde die Titelverbindung durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 1024 [M+H]+.
Intermediat S21
N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- (glykoloyl)amino]-2-({N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-asparaginyl}- amino)butanoyl]-beta-alanyl-L-asparagin
Figure imgf000288_0001
Zunächst wurde Intermediat C141 mit 1 .8 Equivalenten 4-Nitrophenyl-N2-[(benzyloxy) carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 12 Equivalenten N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte die Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT. Im letzten Schritt wurde die Titelverbindung durch
Umsetzung mit 2.5 Equiv. 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5- dion in Gegenwart von 4 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 950 [M+H]+.
Intermediat S22
N-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-[(N2-{16-[(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-16-oxo-4,7, 10,13-tetraoxa- hexadecan-1 -oyl}-L-asparaginyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000289_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 3 Equiv. 1 ,1 '-[(1 ,19- Dioxo-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecan-1 ,19-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in
Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 1245 [M+H]+. B: Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADO
B-1. Allgemeines Verfahren zur Generierung von Antikörpern
Die Proteinsequenz (Aminosäuresequenz) der verwendeten Antikörper, zum Beispiel TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP- 10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-751 1 , TPP-8382 und TPP- 8567, wurde in eine für das Protein kodierende DNA Sequenz nach einem dem
Fachmann gut bekannten Verfahren überführt und in einen für die transiente
Säugerzellkultur geeigneten Expressionsvektor inseriert (wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben).
B-2. Allgemeines Verfahren zur Expression von Antikörpern in Säugerzellen
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP- 751 1 , TPP-8382 und TPP-8567, wurden in transienten Säugerzellkulturen produziert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben.
B-3. Allgemeines Verfahren zur Aufreinigung von Antikörpern aus
Zellüberständen.
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP- 751 1 , TPP-8382 und TPP-8567, wurden aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zellüberstände wurden durch Zentrifugation von Zellen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM
Natriumacetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschliessend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.
Die kommerziell erhältlichen Antikörper wurden mit Standard- Chromatographiemethoden aufgereinigt (Protein A Chromatopgraphie, präparative Gelfiltrationschomatographie (SEC - size exclusion Chromatographie)).
B-4. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Cystein-Seitenketten
In die Kupplungsreaktionen wurde folgender Antikörper eingesetzt: Beispiele a: Cetuximab (Anti EGFR AK) Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK) Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-7007) Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-2658)
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 10mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis 1 h bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 20 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid-Vorläufer-Verbindung oder Halogenid-Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20
Äquivalente eingesetzt werden. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maleinimid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Halogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und anschließend über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 ml_ PBS-Puffer erhalten.
Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den
Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7.
beschriebenen Methoden ermittelt.
Die in den Beispielen dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen.
Insbesondere die KSP-l-ADCs, die über die Linker-Substruktur
Figure imgf000292_0001
mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffern im Anschluss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Rühren bei pH 8 gemäß Schema 4 und 9 gezielt in die die über offenkettige Bersteinsäureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.
#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-lnhibitor Solche ADCs, bei denen der Linker über hydrolysierte offenkettige Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach exemplarischen Vorschrift wie folgt dargestellt werden:
Small Scale Kupplung:
Zu einer Lösung von 2-5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im
Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2- carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 20 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20 Äquivalente eingesetzt werden. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde 60-240 min bei RT gerührt und anschließend mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5-7.5 ml verdünnt und dann über eine mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde die Lösung durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Medium scale Kupplung:
20-200 mg des betreffenden Antikörpers in PBS-Puffer (c~5-15 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 2-5 Equivalenten, bevorzugt 3 Equivalenten TCEP in PBS- Puffer (c-0.2-0.8 mg/ml bevorzugt 0.5 mg/ml) versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2-20, bevorzugt 5-10 Equivalente einer Maleinimid- Vorläuferverbindung gelöst in DMSO zugegeben. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20 Äquivalente eingesetzt werden. Nach weiteren 1.5h-2h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf eine Konzentration von 1 -7 mg/mL verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Umpuffern auf pH 7.2. Die ADC-Lösung wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzentration von etwa 10mg/ml_ aufkonzentriert.
Weitere potentiell hydrolyse-sensitive Thianylsuccinimid-Brücken zum Antikörper in den Ausführungsbeispielen enthalten folgende Linker-Substrukturen, wobei #1 die
Thioetherverknüpfung zum Antikörper und #1 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-lnhibitor darstellt:
Figure imgf000294_0001
Diese Linker-Substrukturen stellen die Verknüpfungseinheit zum Antikörper dar und haben (neben der weiteren Linkerzusammensetzung) einen signifikanten Einfluß auf die Struktur und das Profil der in Tumorzellen gebildeten Metabolite.
In den dargestellten Strukturformeln kann dabei AKi die Bedeutung haben
Beispiele a: Cetuximab (partiell reduziert)- S§1
Beispiele e: anti-HER2 AK (TPP-1015 partiell reduziert)- S§1 Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-7007 partiell reduziert) - S§1 Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-2658 partiell reduziert) - S§1
wobei §1 die Verknüpfung mit der Succinimid-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamiden bzw. des
Alkylenrestes bedeutet, und
S für das Schwefelatom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers steht.
B-5. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Lvsin-Seitenketten
In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Beispiele a: Cetuximab (Anti EGFR AK) Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK)
Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-7007) Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658)
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt. Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 10 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer-Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS- Puffer zur Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 ml_ PBS-Puffer erhalten.
Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt.
Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt. In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK2 die Bedeutung
Beispiele a: Cetuximab - NH§2
Beispiele e: Anti-HER2 AK (TPP-1015) - NH§2
Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-7007) - NH§2
Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658) - NH§2 wobei
§2 die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und
NH für die Seitenketten-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht. B-5a. Allgemeines Verfahren zur ADC Synthese mittels bakterieller Transglutaminase
In die Kupplungsreaktionen mit bakterieller Transglutaminase können folgende Antikörper eingesetzt werden (die nachfolgende Nomenklatur Antikörper-HC-N297Z meint den Antikörper, bei dem an beiden schweren Ketten die Aminosäure N297 (Kabat- Nummerierung) durch die Aminosäure Z ausgetauscht wurde, die Nomenklatur TPP-xxxx- HC-Q295N-HC-N297Q meint den Antikörper mit der TPP-XXXX, bei dem an beiden schweren Ketten die Aminosäure Q295 (Kabat-Nummerierung) durch die Aminosäure N und die Aminosäure N297 (Kabat-Nummerierung) durch die Aminosäure Q ausgetauscht wurde. Der Antikörpername des Ursprungsantikörpers kann dabei entweder als Name (Beispiel Trastuzumab) oder als TPP-XXXX angegeben sein (Antikörper mit der TPP- Nummer XXXX)):
AK3a: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658) (entspricht TPP-2090-HC-N297A)
AK3b: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-5442) (entspricht TPP-2090-HC-N297Q) AK3c: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-8825) (entspricht TPP-2090-HC-Q295N-HC- N297Q)
AK3d: anti-HER2 Antikörper (TPP-7510) (entspricht TPP-1015-HC-N297A) AK3e: anti-HER2 Antikörper (TPP-751 1 ) (entspricht TPP-1015-HC-N297Q)
Allgemeine Vorschrift um eine maximale DAR von 2 zu erzielen:
Zu einer Lösung von 5 mg der entsprechenden aglyco Antikörper Variante (HC-N297A) in DPBS pH 7.4 (c-5-15 mg/mL) wurden 20 μί (6 Equivalente) einer Lösung eines geeigneten Toxophor-Linker-Precursors (e.g. Intermediate R50 und R51 ; 10 mM Lösung in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 50 μί einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase Lösung in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Reaktionsmischung mit DPBS pH 7.4 auf ein
Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt und durch Gelfiltration über mit DPBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit DPBS-Puffer bei pH 7.4 eluiert. Anschließend wurde die ADC Lösung mittels Amicon Ultracel-30K
Zentrifugation (Millipore) aufkonzentriert und wieder rückverdünnt mit DPBS auf ein Volumen von etwa 2.5 mL. Schließlich wurden noch 0.00625 μηηοΙ des b- Transglutaminase Blockers Zedira C100 in 12.5 μί DPBS zu der Lösung hinzugefügt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene
Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
Allgemeine Vorschrift um eine maximale DAR von 4 zu erzielen: Zu einer Lösung von 5 mg der entsprechenden agiyco Antikörper Variante (HC-N297Q) in DPBS pH 7.4 (c~5-15mg/mL) wurden 16-24 Euivalente einer Lösung eines geeigneten Toxophor-Linker-Precursors (e.g. Intermediat R50 und R51 ; 10 mM Lösung in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 400 μί (10 U) einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase Lösung in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Reaktionsmischung mit DPBS pH 7.4 auf ein
Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt und durch Gelfiltration über mit DPBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit DPBS-Puffer bei pH 7.4 eluiert. Anschließend wurde die ADC Lösung mittels Amicon Ultracel-30K
Zentrifugation (Millipore) aufkonzentriert und wieder rückverdünnt mit DPBS auf ein Volumen von etwa 2.5 mL. Schließlich wurden noch 0.1 μηηοΙ des b-Transglutaminase Blockers Zedira C100 in 200 μί DPBS zu der Lösung hinzugefügt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
Allgemeine Vorschrift für Transglutaminase vermittelte Kupplung im größeren Maßstab um eine maximale DAR von 2 zu erhalten:
Zu einer Lösung von 30 mg der aglycosylierten Variante (HC-N297A) des jeweiligen Antikörpers in DPBS pH 7.4 (c~5-15 mg/mL) wurden 6 Equivalente einer Lösung des entsprechenden Toxophor-Linker-Precursors (10 mM in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 200 [i L (7.5 U) einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde über Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 gereinigt, um kleine Moleküle und die
Transglutaminase vom ADC abzutrennen. Anschließend wurde die ADC-Lösung über Amicon Ultracel-30K Zentrifugationsrohrchen (Millipore) auf finale Konzentrationen von 5- 25 mg/mL ankonzentriert. Die Lösung wurde anschließend sterilfiltriert.
Die jeweiligen in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentrationen der ADC- Lösungen wurden bestimmt. Die Beladung wurde nach den in Kapitel B7 beschriebenen Methoden bestimmt. Die ADC batches wurden wie in den Ausführungsbeispielen angezeigt charakterisiert.
Allgemeine Vorschrift für Transglutaminase vermittelte Kupplung im größeren Maßstab um eine maximale DAR von 4 zu erhalten:
Zu einer Lösung von 30 mg der aglycosylierten Variante (HC-N297Q) des jeweiligen Antikörpers in DPBS pH 7.4 (c~5-15 mg/mL) wurden 16-24 Equivalente einer Lösung des entsprechenden Toxophor-Linker-Precursors (10 mM in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 2400 μί (60 U) einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde über Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 gereinigt, um kleine Moleküle und die
Transglutaminase vom ADC abzutrennen. Anschließend wurde die ADC-Lösung über Amicon Ultracel-30K Zentrifugationsrohrchen (Millipore) auf finale Konzentrationen von 5- 25 mg/mL ankonzentriert. Die Lösung wurde anschleießend sterilfiltriert.
Die jeweiligen in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentrationen der ADC- Lösungen wurden bestimmt. Die Beladung wurde nach den in Kapitel B7 beschriebenen Methoden bestimmt. Die ADC batches wurden wie in den Ausführungsbeispielen angezeigt charakterisiert.
AK3 hat jeweils die Bedeutung AK3a: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658) (entspricht TPP-2090-HC-N297A) - C0-§2
AK3b: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-5442) (entspricht TPP-2090-HC-N297Q) - C0-§2
AK3c: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-8825) (entspricht TPP-2090-HC-Q295N-HC- N297Q) - C0-§2 AK3d: anti-HER2 Antikörper (TPP-7510) (entspricht TPP-1015-HC-N297A) - C0-§2 AK3e: anti-HER2 Antikörper (TPP-751 1 ) (entspricht TPP-1015-HC-N297Q) - C0-§2
wobei
§2 die Verknüpfung mit der Aminogruppe eines Toxophor-Linker-Precursors bedeutet, und
CO für die Seitenketten-Carbonylgruppe eines Glutamin-Restes des Antikörpers steht.
Potenziell geeignete Substrate für bakterielle Transglutaminase im Sinne der Anmeldung sind:
Figure imgf000300_0001
Figure imgf000301_0001
300
Figure imgf000302_0001
B-6a. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschlossenen Succinimid-
Cystein-Addukten:
In einer beispielhaften Ausführung wurden 10 μηιοΙ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen wurden in 3-5 ml_ DMF aufgenommen und mit 2.1 mg (20 μηηοΙ) L- Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 2h und 24 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels praparativer HPLC gereinigt.
B-6aa. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von isomeren geöffneten
Bernsteinsäureamid-Cvstein-Addukten: In einer beispielhaften Ausführung wurden 68 μηηοΙ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen in 15 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (136 μηηοΙ) N-{[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde ~20h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der
Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 131 L einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer 1 M Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative H PLC gereinigt. Es wurden -50% d. Th. der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
Im letzten Schritt wurden 0.023 mmol von diesen regiosisomeren Hydrolyseprodukten in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol)
Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Aceton itril/Wasser wurden die hydrolysierten offenen Sulfanylbernsteinsäure-amide als
Regioisomerengemisch erhalten. Weitere Aufreinigung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugate
Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugat lyophilisiert werden.
B-7. Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbeladung und des Anteils geöffneter Cvstein-Addukte Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestimmung nach
Deglykosylierung und/oder Denaturierung ein tryptischer Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptischen Peptide bestätigt.
Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen
Konjugate in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung wie folgt bestimmt:
Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Lysin-verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen
Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe angesäuert und nach HPLC-T rennung/Entsalzung
massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das
Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt
Deconvolution berechnet. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet. Hierzu wurde die Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies.
Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknüpften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC-Lösung (1 mg/mL, 50μί) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 [iL) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.
Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μηι particle size, 1000 A) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 %B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden der leichten Kette mit einem Toxophor (L1 ) und den schweren Ketten mit einem, zwei und drei Toxophoren (H 1 , H2, H3) zugeordnet.
Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnete, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten
Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnete. In vereinzelten Fällen konnte es vorkommen, dass die Toxophorbeladung aufgrund von Ko-Elutionen einiger Peaks nicht exakt möglich war.
In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-T rennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten mittels massenspektrometrischer Bestimmung der
Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.
Dazu wurde zur ADC-Lösung (1 mg/mL, 50μί) Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μί) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und massenspektrometrisch nach online Entsaltzung mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Zur DAR-Bestimmung wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion
Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch
Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt. Hierbei berechnete sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks und die HC- Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks.
Bei den geöffneten Konstukten wurde zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein-Addukts das Molekulargewichtsflächenverhältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta 18Dalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianten ergab den Anteil des geöffneten Cystein-Addukts.
Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Glutamin-verknüpften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC-Lösung (1 mg/ml_, 50μΙ_) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΙ_) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.
Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μηι particle size, 1000 A) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 31 %B; 1 min, 31 %B; 14 min, 38 %B, 16 min, 95 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden den schweren Ketten mit einem und zwei Toxophoren (H1 , H2) zugeordnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflachen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnete, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten
Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnete.
Alternativ erfolgte die Bestimmung der Toxophor Beladung von Glutamin-verknüpften ADCs nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Hierbei wurde die Probe angesäuert und nach HPLC- Trennung/Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet. Hierzu wurde die Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies.
Alternativ wurde die Toxophor Beladung unabhängig von der Verknüpfungsstelle über UV-Absorption während der Size Exclusion Chromatographie (SEC) bestimmt, im
Folgenden abgekürzt als SEC-UV. Hierzu wurde 50 μΙ_ der ADC-Lösung über SEC analysiert. Die Analytik wurde auf einem Agilent 1260 HPLC System mit einer Detektion bei 280 nm und einer Detektion bei 260 nm durchgeführt. Eine Superdex 200 10/300 GL Säule von GE Healthcare (Lot No: 10194037) (10 x 310 mm, 1 μηι Partikelgröße) wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min unter isokratischen Bedingungen verwendet. Die mobile Phase bestand aus PBS Puffer (pH 7.2). Für die Bestimmung der Drug Load aus dem HPLC-Chromatogramm wurde das Verhältnis R der Peakflächen des Monomerpeaks bei 260 nm und bei 280 nm bestimmt. Aus diesem Verhältnis wurde die Drug Load (DAR) wie folgt ermittelt:
Figure imgf000307_0001
Hierbei steht ε für den molaren Extinktionskoefizienten des Antikörpers (Ab) und der Drug (D). λ steht für die Wellenlänge 260 nm, während 280 für 280 nm steht. Die
Extinktionskoeffizienten der Antikörper bei 280 nm und bei 260 nm wurden experimentell bestimmt. Der Mittelwert dieser Bestimmungen für verschiedene Antikörper wurde für die DAR Kalkulation verwendet. Auch für das KSP Toxophor wurden die molaren
Extinktionskoeffizienten bei 280 nm und bei 260 nm experimentell bestimmt. Die folgenden Wellenlängen und Extinktionskoeffizienten wurden für die DAR Berechnungen verwendet:
Figure imgf000308_0001
Die Konzentration der ADCs wurde über die Bestimmung der UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Konzentration wurde unter Verwendung des molaren
Absorptionskoeffizienten des jeweiligen Antikörpers bestimmt. Um ebenfalls die
Absorption des Toxophors bei 280 nm zu berücksichtigen, wurde die bei 280 nm gemessene Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung korrigiert: concentration = preliminary concentration / (1 +DARuv * (nToxo hore 280nm nAntibody 280nm))
Hierbei steht "preliminary concentration" für die Konzentration, die nur unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten des Antikörpers kalkuliert wurde, DARuv ist die über SEC-UV bestimmte DAR des jeweiligen ADCs, und DToxo hore 280nm Und DAntibody 280nm sind die jeweiligen Extinktionskoeffizienten des Toxophors und des Antikörpers bei 280 nm. B-8. Überprüfung der Antigen-Bindung des ADCs
Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder
Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen,
beispielsweise für Antikörper-Konjugate mittels Proteinbestimmung, (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 und Polson et al., Blood 2007; 1 102:616-623).
Ausführungsbeispiele APDCs und ADCs
Die in den Strukturformen der Ausführungsbeispiele dargestellten APDCs und ADCs, die über Maleinimid-Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt wurden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ring-geöffneten bzw. ring-geschlossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein. Die Kupplungsreaktionen wurden unter Argon durchgeführt.
Beispiel 1
Figure imgf000310_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.4 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S1 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde die Lösung mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
1 a-981 EGFR 981 A 1 .93 3.3
1 e-1015 HER2 1015 A 1 .69 3.7
1 k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .90 3.4
Beispiel 2
Figure imgf000311_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.4 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.2 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S2 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Exemplarische Vorschrift B: 30 mg des entsprechenden Antikörpers in 2.52 ml PBS (c=1 1.9 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.172 mg TCEP in 0.2 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1 .2 mg (0.0014 mmol) von Intermediat S2 gelöst in 200 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Volumen von 7.5 mL verdünnt und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Figure imgf000312_0001
Für Beispiel 2k*-7007 wurde der Prozentsatz der ring-geöffneten Form durch
Massenspektrometrie mit 87.4% ermittelt.
Beispiel 3
Figure imgf000313_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S3 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
3a-981 EGFR 981 A 1 .93 4.3
3e-1015 HER2 1015 A 1 .9 4.8
3k-2658 TWEAKR 2658 A 1 .88 3.6 Beispiel 4
Figure imgf000314_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S4 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
4a-981 EGFR 981 A 1 .79 2.8
4e-1015 HER2 1015 A 2.22 3.2
4k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .84 2.8 Beispiel 5
Figure imgf000315_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00019 mmol) von Intermediat S5 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
5a-981 EGFR 981 A 1 .87 3.5
5e-1015 HER2 1015 A 1 .79 3.6
5k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .73 3.5 Beispiel 6
Figure imgf000316_0001
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml_ PBS (c = 12.5 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.18 mg) von Intermediat S6 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Exemplarische Vorschrift B:
Zu 80 mg des betreffenden Antikörpers in 5.58 ml_ PBS (c = 14.3 mg/mL; die
Konzentration kann im Allgemeinen aber auch zwischen 3 und 20 mg/mL liegen) wurden unter Argon 5 Eq (2.8 mg) von Intermediat S6 gelöst in 500 μί DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 7.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
6a-981 EGFR 981 A 2.6 5.9
6e-1015 HER2 1015 A 2.32 6.9 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
6k-7007 TWEAKR 7007 A 2.53 5.3
Beispiel 7
Figure imgf000317_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.24 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S7 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer (pH 7.2) eluiert.
Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
7a-981 EGFR 981 A 2.13 3.6 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
7e-1015 HER2 1015 A 2.02 3.9
7k-7007 TWEAKR 7007 A 2.12 3.8
Figure imgf000318_0001
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml_ PBS (c = 12.5 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.14 mg) von Intermediat S8 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
8a-981 EGFR 981 A 1 .23 3.8 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
8e-1015 HER2 1015 A 1 .59 4.5
8k-7007 TWEAKR 7007 A 2.22 3.1
Beispiel 9
Figure imgf000319_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S9 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
9a-981 EGFR 981 A 2.06 3.4
9e-1015 HER2 1015 A 1 .92 3.6
9k-7007 TWEAKR 7007 A 2.05 3.1
Beispiel 10
Figure imgf000320_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S10 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
10a-981 EGFR 981 A 2.13 3.0
10e-1015 HER2 1015 A 1 .8 3.1
10k-7007 TWEAKR 7007 A 2.02 2.6
Beispiel 11
Figure imgf000321_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.4 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S1 1 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
1 1 a-981 EGFR 981 A 1 .90 3.2
1 1 e-1015 HER2 1015 A 1 .77 3.5
1 1 k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .99 3.4
Beispiel 12
Figure imgf000322_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S12 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde über eine mit PBS-Puffer equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
12a-981 EGFR 981 A 1 .92 2.2
12e-1015 HER2 1015 A 1 .66 2.5
12k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .84 2.5
Beispiel 13
Figure imgf000323_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.28 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S13 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
13a-981 EGFR 981 A 1 .72 3.0
13e-1015 HER2 1015 A 1 .67 3.0
13k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .73 2.3
Beispiel 14
Figure imgf000324_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.3 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S14 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein
Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde über eine mit PBS-Puffer (pH 8) equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer (pH 8) eluiert und über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
14a-981 EGFR 981 A 1 .77 3.3
14e-1015 HER2 1015 A 1 .65 3.4
14k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .65 2.5
Bei den unter diesen Bedingungen und mit diesem Linker hergestellten ADCs von Beispiel 14 verlief die Ringöffnung unvollständig. Sie enthielten noch größere Anteile (über 50%), bei denen die Verknüpfung mit dem Antikörper über die ringgeschlossene Succinimid Form vorlag (vgl. Beispiel 7).
Beispiel 15
Figure imgf000325_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.27mg (0.00023 mmol) von Intermediat S15 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 90 min bei RT gerührt. Die Lösung wurde dann mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Figure imgf000326_0002
Beispiel 16
Figure imgf000326_0001
Exemplarische Vorschrift A (zum Erzielen einer höheren DAR):
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.067 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.68mg (0.00057 mmol) von Intermediat S16 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiterem Rühren unter Argon über Nacht bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer pH7.2 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH7.2 eluiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Figure imgf000327_0002
Beispiel 17
Figure imgf000327_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.45 ml PBS (c=1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.30mg (0.00023 mmol) von Intermediat S17 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 90 min bei RT gerührt. Die Lösung wurde dann mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
17a-981 EGFR 981 A 1 .45 3.0
17e-1015 HER2 1015 A 0.86 3.0
17k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .01 2.5
Figure imgf000328_0001
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 3 mg des betreffenden Antikörpers in 0.3 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.12 mg) von Intermediat S18 gelöst in 30μί DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
18a-981 EGFR 981 A 1 .98 2.8
18e-1015 HER2 1015 A 1 .16 3.8
18k-7007 TWEAKR 7007 A 2.00 3.7
Figure imgf000329_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.45 ml PBS (c=1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.28 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S19 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 90 min bei RT gerührt. Die Lösung wurde dann mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule
(Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch
Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Figure imgf000329_0002
Beispiel 20
Figure imgf000330_0001
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.17 mg) von Intermediat S20 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
20a-981 EGFR 981 A 2.0 6.2
20e-1015 HER2 1015 A 2.19 4.3
20k-7007 TWEAKR 7007 A 2.1 4.6 Beispiel 21
Figure imgf000331_0001
Exemplarische Vorschrift A:
5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S21 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 ml_ verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
21 a-981 EGFR 981 A 1 .79 2.5
21 e-1015 HER2 1015 A 1 .72 2.7
21 k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .95 2.0 Beispiel 22
Figure imgf000332_0001
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.22 mg) von Intermediat S22 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR
TPP-
22a-981 EGFR 981 A 1 .86 6.4
22e-1015 HER2 1015 A 1 .97 5.6
22k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .90 5.3 Ausführungsbeispiele Metabolite:
Die aus den erfindungsgemäßen ADCs in den verschiedenen Ausführungsbeispielen im Tumor gebildeten Metabolite wurden zu Vergleichszwecken hergestellt und
charakterisiert. Teilweise wurden sie bereits in früheren Offenbarungen von anderen ADCs beschrieben.
Metabolite, die beispielsweise aus Beispiel 2, 3 und 9 gebildet werden können
Figure imgf000333_0001
Die Synthese der 4 isomeren Cystein-Metabolite, die aus Beispiel 1 , 2, 3, 9 gebildet werden können, wurden in WO2016/096610 beschrieben und dort als Beispiele M13, M14, M15 und M16 charakterisiert.
Metabolite M1 und M2, die beispielsweise aus Beispiel 4 und 5 gebildet werden können
Figure imgf000334_0001
Beispiel M1 N-(3-{[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-carboxypropanoyl)glycyl-N-[2-({(2S)-2- amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino] butanoyl}amino)ethyl]-D-alpha-glutamin -Trifluoressigsäure Salz
Regioisomer 1 , Epimerengemisch
Figure imgf000334_0002
Zu einer Lösung von Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 :1 ) (5.00 g, 29.1 mmol) in 1 ,4- Dioxan (200 ml) wurde Triethylamin (10 ml, 73 mmol) und anschließend 1 -({[2- (Trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5-dion (8.31 g, 32.0 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde 20 h bei Raumtemperatur gerürht. Anschließend wurde der Feststoff abfiltriert und das Filtrat wurde im Hochvakkum eingeengt. Der Rückstand wurde über präparative HPLC gereinigt.
Zu einer Lösung des erhaltenen Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cysteinat (130 mg, 465 μηηοΙ) und 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure (393 mg, 1 .86 mmol) in DMF (6.5 ml) wurden 210 μΙ (1 .4 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben und die Reaktion wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch praparative HPLC gereinigt. Das Lösemittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.
Dieses erhaltene Intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie in Gegenwart von HATU mit Intermediat C1 19 gekuppelt. Anschließend wurden die
Methylester durch Behandlung mit einer Lithiumhydroxid-Lösung in THF/Wasser (1 :1 ) verseift.
Im letzten Schritt wurden 22 mg von dem erhaltenen Intermediat in 10 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 34 mg (0.252 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 74 mg (0.252 mmol) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure 10 mL Wasser und 500 μί TFA zugesetzt. Die Mischung wurde filtriert und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 13 mg (72% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (ESIneg): m/z = 959 [M-H]" Beispiel M2
N-(2-{[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-carboxypropanoyl)glycyl-N-[2-({(2S)-2- amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-D-alpha-glutamin -trifluoressigsäure Salz
Regioisomer 2, Epimerengemisch
Figure imgf000335_0001
Die Titelverbindungen M2 wurden als Epimerengemisch analog Beispiel M1 hergestellt:
Zu einer Lösung aus Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cysteinat ( 1000 mg, 3.58 mmol) und 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure ( 926 mg, 4.1 1 mmol) in DMF (40 ml) wurden801 μΙ, 5.4 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben und die Reaktion wurde für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt.
Das erhaltene Intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie in Gegenwart von HATU und Methylmorpholin mit Intermediat C1 19 gekuppelt.
Anschließend wurden der Methylester sowie der Ethylester durch Behandlung mit einer Lithiumhydroxid-Lösung in THF/Wasser (1 :1 ) verseift.
Im letzten Schritt wurden 48 mg von diesem Intermediat in 5 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 75 mg (0.550 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 3 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 160 mg (0.550 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure 2 mL Wasser und 20 μί TFA zugesetzt. Das Lösemittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand wurde mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 14 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 5): Rt = 2.41 min; MS (ESIneg): m/z = 959 [M-H]"
Metabolit M3, der beispielsweise aus Beispiel 6, 7, 10, 12, 13, 14, 16 und 22 gebildet werden kann
Beispiel M3 N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000336_0001
Intermediat C121 wurden durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1 .78 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+.
Metabolit M4, der beispielsweise aus Beispiel 8 gebildet werden kann Beispiel Metabolit M4:
N-(3-Aminopropyl)-N-{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydrox acetamid
Figure imgf000337_0001
Die Herstellung sowie die Charakterisierung dieses Metaboliten M4 wurde in
WO2016/096610 als Metabolit M9 beschrieben. Dieser aus den erfindungsgemäßen ADCs in Beispiel 8 gebildete Metabolit zeigt ein Profil, das sich bzgl. Transportersubstrateigenschaften und zellulärer Cytotoxizität von den anderen Metaboliten M1 , M2 und M3 unterscheidet.
Referenzbeispiele: APDCs und kleine Moleküle
Zunächst wurden zu Vergleichszwecken das APDC R1 e sowie das ADC R6k jeweils mit Tripeptidsequenzen als Legumainsubstrat hergestellt.
Weiterhin wurden zur Untersuchung der Legumain-vermittelten Spaltung zu
Vergleichszwecken die Legumain-spaltbaren Prodrugs von kleinen Molekülen RM-A und RM-B hergestellt. Referenzbeispiel R1e mit TPP1015
Figure imgf000338_0001
Die Herstellung des ADCs mit TPP1015 erfolgte in Analogie zu Beispiel 1 .
Protein Konzentration: 1.7 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.3
Der Precursor wurde in Analogie zu Intermediat S1 durch Kupplung von Intermediat F104 mit Intermediat L103 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 1068 (M+H)+.
Referenzbeispiel R6k mit TPP7007
Figure imgf000339_0001
Die Herstellung des ADCs mit TPP7007 erfolgte in Analogie zu Beispiel 6.
Protein Konzentration: 2.1 1 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 5.3
Der Precursor wurde in Analogie zu Intermediat S6 ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-L- asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten
Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurde das erhaltene Intermediat mit N- (tert-Butoxycarbonyl)-L-alanyl-L-alanin in DMF in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte wiederum die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 2 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5- diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 1 181 [M+H]+. RM-A (Modellverbindung A)
N-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-L-alanyl-N1-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -(methylamino)-l -oxobutan-2-yl]-L- aspartamid
Figure imgf000340_0001
Zunächst wurde Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N- methylbutanamid(1 :1 ) wie in WO 2015096982 A1 (Beispiel 99) beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L103 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H]+.
RM-B (Modellverbindung B)
N1-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-1 -(methylamino)-1 -oxobutan-2-yl]-N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-aspartami
Figure imgf000341_0001
Zunächst wurde Trifluoressigsaure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) -1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methylbutanamid (1 :1 ) wie in WO 2015096982 A1 (Beispiel 99) beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L136 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .57 min; MS (ESIpos): m/z = 760 [M+H]+.
RM-C (Modellverbindung C) N1-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-1 -(methylamino)-1 -oxobutan-2-yl]-N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-glutamamid
Figure imgf000341_0002
Zunächst wurde Trifluoressigsaure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) -1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methylbutanamid (1 :1 ) wie in WO 2015096982 A1 (Beispiel 99) beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L137 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1 .56 min; MS (ESIpos): m/z = 774 [M+H]+.
Bewertung der biologischen Wirksamkeit
Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden:
C-1 a Bestimmung der cvtotoxischen Wirkung der ADCs
Die Analyse der cytototoxischen Wirkung der ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:
NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL-1848,
Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv; EGFR-positiv. BxPC3: humane Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, ATCC-CRL-1687, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR- positiv.
LoVo humane kolorektale Krebszellen, ATCC No. CCL-229, Kultivierung für MTT-Assay: Standardmedium: Kaighn's + L-Glutamin (Invitrogen 21 127) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064). Kultivierung für CTG-Assay: RPMI 1640 (Biochrom;
#FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442). TWEAKR-positiv.
KPL4: humane Brustkrebszelllinie, Bayer Pharma AG (identity checked and confirmed on 19.7.2012 at DSMZ), Standardmedium: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875- 059, stab. L- Glutamin) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); HER2-positiv. SK-HEP-1 : humane Leberkrebszelllinie, ATCC No. HTB-52, Standardmedium: MEM mit Earle's Salzen + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); EGFR-positiv, TWEAKR-positiv. KU-19-19: humane
Blasenkarzinomzellen, DMSZ, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv
U251 : humane Glioblastomzellen, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S0415);B7H3-positiv. Die Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) oder des Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) für die jeweiligen Zelllinien angegeben.
CTG -Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standard-Methode, mit den unter C-1 a angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Trypsin (0.05%) und EDTA (0.02%) in PBS (Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weissem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75μΙ/ίοοΙι, folgende Zellzahlen je Loch: NCI- H292: 2500 Zellen/ Loch, BxPC3 2500 Zellen / Loch, LoVo 3000 Zellen / Loch) und im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24h wurden die Antikörper- Wirkstoff konjugate in 25μΙ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikörper-Wirkstoffkonjugate von 3 x 10"7 M bis 3 x 10"11 M auf den Zellen erreicht wurden (Triplikate). Anschließend wurden die Zellen im
Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die Zellvitalität zu Beginn der Wirkstoffbehandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #G7573 und #G7571 ) bestimmt. Dazu wurden pro Zellansatz 100μΙ des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttler bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat detektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zellen, wobei ein Lumineszenz-Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikorper-Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die I C50 der
Wachstumshemmung im Vergleich zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose
Response Curve) Analysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Analysis Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform IDBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK). MTT-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-1 a angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCI-H292: 2500 Zellen/well; SK-HEP-1 : 1000 Zellen/well; KPL4: 1200 Zellen/well; in 100μί Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Antikörper-Wirkstoff-Konjugate in 10μΙ Kulturmedium in Konzentrationen von 10"5M bis 10"13M zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-101 OK). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite M1000 pro, Fa.
Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde die I C50 der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne
Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.
In der folgenden Tabelle sind die I Cso-Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesen Assays aufgeführt:
Tabelle 1 a
NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT]
1 a-981 4.08E-1 1 5.29E-08
1 e-1015 1 .42E-10
1 k-7007 2.96E-10 4.14E-1 1 4.76E-10
2a-981 7.96E-12 3.30E-07
2e-1015 8.03E-1 1
2k-7007 2.48E-10 1 .50E-1 1 5.75E-10 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT] k*-7007 3.99E-10 1.50E-11 4.07E-10
3a-981 9.73E-10 1.69E-07
3e-1015 4.50E-10
3k-2658 2.44E-08 4.78E-10 4.62E-09
4a-981 1.56E-11 3.18E-07
4e-1015 2.93E-10
4k-7007 3.71E-10 8.11E-11 7.14E-10
5a-981 2.63E-12 5.60E-08
5e-1015 1.43E-10
5k-7007 2.68E-10 6.21 E-11 5.55E-10
6a-981 1.00E-11 5.00E-07
6e-1015 1.91E-10
6k-7007 7.60E-11 1.50E-11 9.67E-11
7a-981 4.29E-12 1.22E-07
7e-1015 1.82E-10
7k-7007 2.09E-10 4.81 E-11 2.27E-10
8a-981 4.50E-10 4.25E-09
8e-1015 3.84E-09
8k-7007 5.68E-10 2.18-09 7.68E-10
9a-981 4.50E-12 4.34E-09
9e-1015 1.31E-10
9k-7007 2.80E-10 3.32E-11 6.06E-10
10a-981 5.15E-12 8.42E-09
0e-1015 2.54E-12 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT]0k-7007 1.83E-10 3.29E-11 2.25E-10
11a-981 3.25E-11 8.38E-09
1e-1015 4.97E-10 1 k-7007 9.95E-10 8.07E-11 3.68E-09
12a-981 2.50E-11 2.62E-08
2e-1015 7.66E-10 2k-7007 7.38E-10 6.14E-11 3.81E-10
13a-981 3.71 E-11
3e-1015 7.72E-11 3k-7007 2.07E-10 5.31 E-11 2.61E-10
14a-981 7.81E-10
4e-1015 4.32E-11 4k-7007 6.13E-11 1.5E-11 8.67E-11
15a-981 4.13E-10
5e-1015 7.91E-10 5k-7007 9.97E-09 6.00E-07 7.47E-09
6e-1015 2.01 E-11 6k-7007 5.45E-11 1.50E-11 4.00E-11
17a-981 1.40E-12 3.16E-11
7e-1015 2.99E-11 7k-7007 8.95E-10 2.36E-10 8.96E-10
18a-981 1.00E-12 6.01 E-11
8e-1015 2.07E-11 8k-7007 1.62E-10 6.00E-07 2.55E-10 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4
Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]
MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT]
19e-1015 3..48E-11
19k-7007 1.20E-10 1.50E-11 1.37E-10
20Θ-1015 1.17E-11
20k-7007 1.54E-10 1.52E-10 1.91E-10
21e-1015 3.66E-11
21k-7007 3.14E-10 1.08E-09 3.60E-10
22e-1015 6.13E-11
22k-7007 8.26E-11 1.50E-11 9.41 E-11
In der folgenden Tabelle 1b sind die ICso-Werte der Referenzbeispiele aus diesen Assays aufgeführt.
Tabelle 1b
Figure imgf000348_0001
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele mit den angegebenen Drug/mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Exprimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der Antikörper-Wirkstoffkonjugate war selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt. C-1 b Bestimmung der Inhibition des Kinesinspindelproteins KSP/ Eg5 durch die aus ausgewählten Beispiele gebildeten aktiven Metabolite
Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/
Cytoskeleton Inc, No. 027EG01 -XL) wurde in einer Konzentration von 10nM mit δθμς/ηηΐ Taxol (Fa. Sigma No. T7191 -5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc) für 5 min bei RT in 15mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgC und 10mM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Corning) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1 .0 x10-6M bis 1 .0x 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgt. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M8515-1 mg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience A10486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis-Wirkungskurve stellen achtfach
Bestimmungen dar. Bei den I Cso-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe.
In der folgenden Tabelle 2 sind die I Cso-Werte von den aus repräsentativen
Ausführungsbeispielen gebildeten aktiven Metaboliten aus dem beschriebenen Assay und den korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay) zusammengefasst:
Tabelle 2
Figure imgf000349_0001
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele. C-1 c Enzymatische Assays und Stabilitätsuntersuchungen
Zunächst wurde die Spaltung der kleinen Molekül Prodrugs RM-A und RM-B unter verschiedenen Bedingungen getestet:
Figure imgf000350_0001
a: Legumain Assay
Der Legumain Assay wurde mit rekombinantem humanen Enzym durchgeführt. Die rhLegumain Enzymlösung (Catalog # 2199-CY, R&D Systems) wurde in 50mM Na-Acetat Puffer/ 100mM NaCI, pH4.0 auf die gewünschte Konzentration verdünnt und 2h bei 37°C vorinkubiert. rhLegumain wurde dann in 50mM MES Puffer, 250mM NaCI, pH 5.0 auf eine finale Konzentration von 1 ng^L eingestellt. Für jede zu untersuchende Legumain- spaltbare Prodrug wurde ein Ansatz in einem Mikroreaktionsgefäße (0.5ml, Fa.
Eppendorf) angesetzt. Hierzu wurde die Substratlösung mit 50mM MES Puffer, 250mM NaCI, pH 5.0 auf die gewünschte Konzentration (2-fach konzentriert) eingestellt. Für die kinetische Messung der enzymatischen Reaktion wurden zunächst 250μί der
Legumainlösung vorgelegt und durch Zugabe von 250μί der Substratlösung (finale Konzentration einfach konzentriert) wurde die Enzymreaktion gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden je 50μΙ_ Proben entnommen. Diese Probe wurde sofort mit 100μΙ_ eiskaltem Methanol versetzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei - 20°C eingefroren. Die gewählten Zeitpunkte zur Probenentnahme waren nach 0,5h, 1 h, 3h und 24h. Die Proben wurden dann anschließend mittels RP-HPLC-Analyse und durch LC-MS Analytik untersucht. Die Bestimmung des freigesetzten Toxophors ermöglichte die Bestimmung der Halbwertszeit ti/2 der enzymatischen Reaktion (Abbildung 1 ).
Modellverbindung A (RM-A) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen des Legumain-Assays mit einer Halbwertszeit von 0.2 h zur Zielverbindung gespalten.
Modellverbindung B (RM-B) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen des Legumain-Assays mit einer Halbwertszeit von ca. 10 h zur Zielverbindung gespalten.
Modellverbindung C (RM-C) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen des Legumain-Assays nicht zur Zielverbindung gespalten.
b: Assay zur Ermittlung der Stabilität in Rattenplasma
Zur Untersuchung der Stabilität von Verbindung A und B wurden jeweils 1 mL
Rattenplasma in 1 .5 mL Eppendorftubes auf einem Eppendorfschüttler auf 37°C temperiert. Es wurde eine Stammlösung (9 Acetonitril/ 1 DMSO) mit einer Konzentration von 100 μg mL für Verbindung A und Verbindung B hergestellt. Jeweils 10 μί der Stammlösung wurden in 1 mL temperiertes Rattenplasma pipettiert, sodass sich eine Konzentration von ^g mL ergab.
Die Proben wurden bei 450 rpm über 24 h bei 37°C gehalten. Bei den
Entnahmezeitpunkten 0, 0.25h, 0.5h, 1 h, 2h, 4h, 6h und 24h wurden jeweils 50 μί entnommen und zu 150 μί Methanol pipettiert. Interner Standard wurde mit einer Konzentration von 0.05 μg mL im Methanol vorgelegt. Nach kurzem vortexen wurden 300 L 10 mM Ammoniumacetat Puffer (pH 6.8) zugegeben und bei 1881 g 10 min zentrifugiert. Die Proben wurden dann anschließend mittels RP-HPLC-Analyse und durch LC-MS Analytik untersucht. c: Assay zur Ermittlung der Stabilität in Rattenleberlysosomen
Zur lysosomalen Stabilitätsuntersuchung der Verbindungen RM-A und RM-B wurden lysosomale Enzyme aus Rattenleberzellen isoliert. Zu diesem lysosomalen Extrakt wurde jeweils Verbindung A und B zugegeben, um die Stabilität unter lysosomalen Bedingungen zu untersuchen. Das proteolytische Enzym Legumain ist in Rattenleberlysosomen nicht oder nur in sehr geringem Maße expremiert (Chen, J-M. et al 1997). Zur Kontrolle der enzymatischen Aktivität der lysosomalen Enzyme wurde ein Cathepsin spezifisches Substrat zugegeben.
Zunächst wurde eine frische Rattenleber entnommen, gewogen und sofort auf Eis in Homogenisierungs-Medium (0.25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH7) gelegt. Die Leber wurde zerkleinert und ein Medienwechsel vorgenommen. Die
Homogenisierung der Rattenleber erfolgte mit der 4-fachen Menge des
Rattenlebergewichts bei 750 rpm in einem Potter (B. Braun). Das Homogenat wurde 10 min bei 1000g zentrifugiert und der Überstand filtriert. Im nächsten Schritt wurde mithilfe einer Ultrazentrifuge die„leichte mitochondriale Fraktion" (LMF) aus dem Überstand bei 26500g über 20 min abzentrifugiert. Im Pellet sind außer Mitochondrien auch die
Lysosomen enthalten. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 0.8 mL/g Homogenisierungs-Medium resuspendiert.
Um die lysosomale Fraktion von den übrigen Zellbestandteilen der LMF abzutrennen wurden 6 Optiprep Dichtegradienten mit 8, 12, 16, 19, 22.5 und 27% Sucroseanteil im Optiprep Puffer (100 mM MOPS, 20mM EDTA, 0.5% EtOH, pH 7.6) hergestellt. Die Sucrose wurde aus einer 2.3M Stammlsoung in der jeweiligen Prozentigkeit zugegben. In die Dichtestufe mit 19% Sucroseanteil wurden zusätzlich 2.5 mL der isolierten LMF gegeben. Anschließend wurden die Dichtestufen in 10 mL Zentrifugenröhrchen übereinandergeschichtet und bei 48500g 17h zentrifugiert. Die Fraktionen 1 -8 liegen in den oberen 5.6 mL des Gradienten und wurden verworfen. Die Fraktionen 9 und 10 befinden sich in den darunter liegenden 1 .6 mL und wurden aus dem Gradient
entnommen und mit 1.6 mL Lysepuffer (25 mM HEPES, 150 mM NACI, 0.1 % Triton X100, pH 5) 5 min auf Eis lysiert. In Fraktion 9 und 10 sind die Lysosomen enthalten. Zur
Lysekontrolle wurde der Proteingehalt der lysierten lysosomalen Fraktion mit Hilfe eines BCA assays (Pierce BCA Protein Assay Kit) kontrolliert.
Zur Untersuchung der lysosomalen Stabilität der Verbindungen RM-A und RM-B wurden nun 6 μί einer 100 g/mL Stammlösung (9 Aectonitril/ 1 DMSO) zu 290 μί 90 mM
Citratpuffer und 300 μί lysosmalem Extrakt gegeben und bei 37°C auf dem Eppendorfschüttler inkubiert. Es wurden nach Oh, 1 h, 2h, 6h, 24h und 48h je 50 [i L aus der Inkubationslösung entnommen und zu 150 μΙ_ MeOH pipettiert. Interner Standard wurde mit 0.05 μg mL vorgelegt. Die Proben wurden final zur RP-HPLC LCMS Analyse mit 300 μΙ_ 10 mM Amoniumacetatpuffer (pH 6.8) verdünnt und gemessen.
Unter den Bedingungen des lysosomalen Stabilitätsassays wurde Verbindung A
(Referenzbeispiel RM-A) mit einer Halbwertszeit von etwa 6 h innerhalb von 24h zu etwa 80% gespalten, während Verbindung B (Referenzbeispiel RM-B) im gleichen Zeitraum zu lediglich 13% gespalten wird. Somit ist RM-B deutlich stabiler als RM-A im lysosomalen Stabilitätsassay, wodurch man von einem reduzierten Ausmaß der Bildung von aktiven Metaboliten in der gesunden Leber ausgehen kann.
C-2 Internalisierungsassay Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug- Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen Antikörpern und einem Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach molarem Überschuss von CypHer 5E mono N HS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8, 3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer: DULBECCO'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgte mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung
(D: P = Adye□ protein :(A280"0, 16Adye)üdye). Die dye load der hier untersuchten Antikörpern sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die
Kupplung zu keiner Affinitätsänderung der Antikörper führte. Die markierten Antikörper wurden im Internalisierungs-Assays eingesetzt. Vor dem Behandlungsstart wurden Zellen (2x104/well) in 100μΙ_ Medium in einer 96-MTP ausgesät (fat, black, clear bottom No 4308776, Fa. Applied Biosystems). Nach 18h Inkubation bei 37°C/5%CC>2 wurde das Medium gewechselt und markierte Antikörper in variierender Konzentration hinzugefügt (10, 5, 2.5, 1 , O.^g/mL). Das gleiche Behandlungsschema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolle (negative Kontrolle). Die gewählten
Inkubationszeiten waren Oh, 0,25h, 0,5h, 1 h, 1 ,5h 2h, 3h, 6h and 24h. Die Fluoreszenz- Messung wurde mit Hilfe des InCellAnalyzer 1000 (Fa. GE Healthcare) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Parameter granule counts/cell und totale granule intensity/cell.
Antikörper wurden nach Bindung an den Rezeptor auf ihre Internalisierungsfähigkeit hin untersucht. Hierzu wurden Zellen mit verschiedenen Expressionsleveln des Rezeptors gewählt. Es konnte Target-vermittelte spezifische Internalisierung mit den im Rahmen der Erfindung beschriebenen Antikörpern beobachtet werden, wohingegen die Isotyp- Kontrolle keine Internalisierung zeigte.
C-3 In vitro Tests zur Bestimmung der Zell-Permeabilität
Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in v/'iro-Testung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R.
Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch- Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol-Massen- spektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu PapP (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war. Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [Pa (B-A)] und das Verhältnis von Pa (B-A) zu Pa (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zellen. Gibt das efflux ratio zudem keine Hinweise auf aktiven Transport, kann die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilen. Damit steigt auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5) zur Verfügung steht.
In der folgenden Tabelle 4 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 4
Figure imgf000355_0001
Die Metabolite M1 , M2 und M3, die aus den erfindungsgemäßen ADCs aus diversen Beispielen gebildet werden, zeigen sowohl einen sehr niedrigen Transport aus der Zelle als auch eine geringe Efflux-Ratio. Der Metabolit M4 zeigt beispiehaft ein anderes Profil.
C-4 In vitro Tests zur Bestimmung der Substrateigenschaften für P-Glycoprotein
Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen.
Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCB1 ) wurden mittels eines Flux- Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDR1 - Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et at., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1 - oder L-MDR1 -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol- Massenspektrometer API 4000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux-Verhältnis PapP (B-A) zu PapP (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDR1 - und LLC-PK1 -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.
C-5 Pharmakokinetik
C5a: Identifizierung der ADC-Metabolite nach Internalisierung in vitro
Methodenbeschreibung:
Internalisierungsuntersuchungen mit Immunkonjugaten werden durchgeführt, um intrazellulär entstandene Metaboliten zu analysieren. Hierzu werden humane
Lungentumorzellen NCI H292 (3x105/well) in 6-well Platten ausgesät und über Nacht inkubiert (37 °C, 5% C02). Es erfolgt eine Behandlung mit 10 g/mL (66 nM) des zu untersuchenden ADCs. Die Internalisierung wurde bei 37 °C und 5% CO2 durch geführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 24, 48, 72h) werden Zellproben zur weiteren Analyse genommen. Zunächst werden die Überstände (ca. 5 ml_) geerntet und nach erfolgter Zentrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofuge 3.0R) bei -80°C gelagert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit Accutase abgelöst und die Zellzahl bestimmt. Nach erneutem Waschen wird eine definierte Zellzahl (2x105) mit 100 ml_ Lysis Puffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1 ) versetzt und unter ständigem Schütteln
(Thermomixer, 15min, 4°C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat.No. 0030 108.1 16) inkubiert. Nach der Inkubation wird das Lysat zentrifugiert (10min, 4°C, 12000g, eppendorf 5415R) und der Überstand geerntet. Der gewonnene Überstand wird bei -80 °C gelagert. Alle Proben werden anschließend wie folgt analysiert.
Die Messung der Verbindungen im Kulturüberstand bzw. Zellysat erfolgt nach Fällung der Proteine mit Methanol oder Acetonitril durch eine Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 μί Kulturüberstand/Zelllysat werden diese mit 150 μί
Fällungsreagenz (Methanol) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das
Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 g/L). Nach dem 10minütigen Zentrifugieren bei 1881 g wird der Überstand in ein Autosampler-Vial überführt, mit 300 μΙ_ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt und 10 min bei 1881 g zentrifugiert. Die Messung der Zelllysat- und Überstandsproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API4500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung wird Leerlysat bzw. Leerüberstand mit entsprechenden Konzentrationen (0.1 - 1000 g L) versetzt. Die Nachweisgrenze (LLOQ) liegt bei ca. 0.2 μg L.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4 und 40 μg L.
C5b: Identifizierung der ADC-Metabolite in vivo
Nach i.v. Applikation von 10 mg/kg verschiedener erfindungsgemäßer Konjugate in Xenograft Mäuse können 24h nach Applikation dieser Konjugate, die Plasma-, Tumor-, Leber- und Nierenkonzentrationen des Antikörpers sowie potentiell auftretender
Metabolite gemessen werden. Unter C-6 ist eine genauere Methodenbeschreibung bezüglich der Xenograft Modelle zu finden. Hier soll nur auf die
Metabolitenkonzentrationen der erfindungsgemäßen Konjugate eingegangen werden. Die Messwerte der Metabolite in den genannten Matrizes geben darüber Aufschluss, wie stark die Belastung mit Metabolit in Plasma, Niere und Leber ausgeprägt ist im Vergleich zur Belastung im Tumor.
Analytik zur Quantifizierung der potentiell auftretenden Metabolite Die Messung der Verbindungen in Plasma, Tumor, Leber und Niere erfolgt nach Fällung der Proteine mit in der Regel Methanol durch eine Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 μί Plasma werden diese mit 150 μί Fällungsreagenz (in der Regel Methanol) versetzt und für 10 sec geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 μg L). Nach dem 10minütigen Zentrifugieren bei 1881 g wird der Überstand in ein
Autosampler-Vial überführt, mit 300 μΙ_ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.
Bei der Aufarbeitung von Tumor- oder Organmaterial wird das jeweilige Material mit der 3- 20 fachen Menge an Extraktionspuffer versetzt. Der Extraktionspuffer enthält 50 mL Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL), zwei Pellets Complete- Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) in einer finaler Konzentration von 1 mM. Je nach Gewebetyp (hart: Tumor; weich: Leber, Niere) wird das Lyse und
Homogeniserungsprogramm des Prescellys 24 Lysis and Homogenization Gerätes (Bertin Technologies) ausgewählt (www.prescellys.com). Die homogenisierten Proben werden über Nacht bei 4°C stehen gelassen. 50 μί des Homogenats werden in ein Autosampler- Vial überführt und mit 150 μί Methanol inklusive ISTD aufgefüllt und 10 sec geschüttelt und darauf 5 min stehen gelassen. Nach Zugabe von 300 μί Ammoniumacetat Puffer (pH6.8) und kurzem Schütteln wird die Probe 10min bei 1881 g zentrifugiert.
Zur Kalibrierung wird für Plasmaproben Plasma und für Gewebeproben entsprechende Leermatrix mit Konzentrationen von 0.6 - 1000 μg L versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) liegt je nach Probentyp bzw. Gewebetyp zwischen 1 und 20 μg L. Die Messung der Plasma und Matrixproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4, 40 und 400 μg L.
C-6 Wirksamkeitstest in vivo
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate wurde in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/08171 1 ; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358- 64). Beispielsweise wurde hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, implantiert. Anschließend wurde den Implantat-Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugat, ein Isotyp-Antikörper-Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurde die
Tumorgröße im Vergleich von Konjugat-behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.
C-6a. Wachstumshemmung / Regression von experimentellen Tumoren in der Maus
Humane Tumorzellen, die das Antigen für das Antikörper-Wirkstoffkonjugat exprimieren, werden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nude- oder SCID-Mäuse. 1 -10 Millionen Zellen werden aus der Zellkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wird unter die Haut der Maus gespritzt.
Innerhalb von einigen Tagen wächst ein Tumor heran. Die Behandlung beginnt nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm2. Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm2 begonnen werden. Die Behandlung mit APDCs und ADCs erfolgt über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5 ml_ / kg appliziert.
Das Behandlungsschema richtet sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers. Als Standard wird drei Mal in Folge jeden vierten Tag behandelt. Bei langsam wachsenden Tumoren bietet sich eine wöchentliche Behandlung an. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen.
Standardmäßig werden 8 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.
Im Verlauf des Experiments wird die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wird mittels Länge x Breite bestimmt. Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C area angegeben.
Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C weight angegeben.
C-6b. Wirksamkeit der anti-TWEAKR-APDCs in verschiedenen Xenograftmodellen
Die Tumorzellen (z.B. KU-19-19, NCI-H292, SCC4) werden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude oder NOD.SCID Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer
Tumorgröße von -40 mm2 wird intravenös mit dem Antikörper-Wirkstoffkonjugat behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wird das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt.

Claims

Patentansprüche
Verbindungen der Formeln
Figure imgf000361_0001
in der
La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;
D für -Di-(Lb)0-(LIG)P steht,
Di für ein cytotoxisches Agens steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht, o und p jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind,
R für LIG-(Lc)e- steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist oder
R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,
Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C5-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-
Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, C1-10- Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IM H2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder
-Ox-(CH2CH20)v-R1 steht,
0 oder 1 ist eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH oder
-CH2-CH2-NH2 steht.
2. Verbindungen der allgemeinen Formel (III')
Figure imgf000362_0001
(ΙΝ'), in der n, e, LIG, La, Lc, und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegeb Bedeutungen haben.
Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)
Figure imgf000363_0001
(iv), in der n, o, LIG, La, Lb und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben und
R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,
Zi für eine Ci-10-Alkyl-, Cs-io-Aryl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C3-io-Heteroalkyl-, Ci- io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Cs-io-Heteroaryl- Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, C5-10- Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)- C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder -Ox-(CH2CH20)v-R1 steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder
-CH2-NH2 steht.
4. Verbindungen der allgemeine Formel (la), gemäß Anspruch 1 , in der La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;
D für -Di-(Lb)0-(LIG)P steht, o und p 0 sind,
Di für ein cytotoxisches Agens steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
R für LIG-(Lc)e- steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist.
5. Verbindungen der allgemeine Formel (la), gemäß Anspruch 1 , in der La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist; D für -Di-(Lb)0-(LIG)P steht, o 0 oder 1 p 1 ist,
Di für ein cytotoxisches Agens steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,
Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C5-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-
Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkoxy-, C5-10- Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-
Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IMH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH2)0-i-Ox-(CH2CH2O)v-R1 oder
-Ox-(CH2CH20)v-R1 steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und
R1 für -H, -Alkyl, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder
-CH2-CH2-NH2 steht.
6. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß den Ansprüchen 1 und 5, wobei q für 1 steht.
7. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß den Ansprüchen 1 und 5, wobei Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, C6-io-Aryl-Ci- 6-alkoxy- oder Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-Gruppe dar, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)- Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)3-H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH2, -C(=0)-N(Alkyl)2 oder -OH substituiert sein kann.
8. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß den Ansprüchen 1 und 5, wobei Zi für eine Ci-3-Alkyl-, C6-7-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-6-Heteroaryl-Ci-3-alkyl-, oder C6-7-Aryl-Ci-6-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -COOH, -C(=0)- oder -OH substituiert sein kann.
9. Verbindungen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker -Lb- bzw. -Lc- an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen
Cysteinrest des Binders gebunden ist und die allgemeinen Grundstrukturen (i) und
(i) -(C=0)m -(L1 )n-(L2)n- und
-(C=0)m -L1 -SG-L2 aufweist, in denen
m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe
(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,
L2 für eine Einfachbindung oder für die Gruppe
Figure imgf000367_0001
Figure imgf000367_0002
steht, wobei
#1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht, R1 0 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,
G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)-NH2), -Nme-, -NHNH-, - S(=0)2-NHNH-, -NH- C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, - NH2, -NH-CNIMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000368_0001
darstellt, wobei
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.
10. Verbindungen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker -Lb- bzw. -Lc- an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden ist und die allgemeine Grundstrukturen (i) und (ii)
(i) -(C=0)m -(L1 )n-(L4)n-(C=0)-§§
und
(ii) -(C=0)m -L1 -SG-L4-(C=0)-§§ aufweist, in denen
m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,
SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe
(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,
L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht,
R1 0 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist, für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)- NH2), -N Me-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000369_0001
darstellt, wobei
für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht, für eine Einfachbindung oder eine Gruppe
Figure imgf000369_0002
steht,
0 oder 1 ist und
für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -N Me-, -S(=0)2-NHNH-,
-C(=0)-NHNH-, -CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder S(=0)2 unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)- NH2, -COOH, -OH, -NH-CN-NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können
die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom eines Lysinrestes des Binders ist.
Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei L1 für eine in der folgenden Tabelle aufgeführte Gruppe steht, wobei r eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, insbesondere bevorzugt von 0 bis 10 ist:
Figure imgf000370_0001
Figure imgf000371_0001
Figure imgf000372_0001
Figure imgf000373_0001
Figure imgf000374_0001
Figure imgf000375_0001
Figure imgf000376_0001
Figure imgf000377_0001
Figure imgf000378_0001
Figure imgf000379_0001
Figure imgf000380_0001
Figure imgf000381_0001
L1
Figure imgf000382_0001
Figure imgf000382_0002
Figure imgf000383_0001
Figure imgf000384_0001
Figure imgf000385_0001
L1
Figure imgf000386_0001
/-CH2-C(=0)-/
12. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei L2 folgende Strukturen
Figure imgf000387_0001
Figure imgf000387_0002
Figure imgf000387_0003
Figure imgf000387_0004
aufweist, in denen
#1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers
kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
-COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)R, -C(=0)-NHR oder -C(=0)N(R)2 steht und
R für Ci-s-Alkyl- steht.
13. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der self-immolative linker La für eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000388_0001
steht, und wobei
#1 für die Bindung zur Carbonylgruppe in der Formel (la) steht und
#2 für die Bindung zur Hydroxyl- bzw. Aminogruppe von Di des cytotoxischen Agens steht.
14. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das cytotoxische Agens Di einen Wirkstoff darstellt, der ausgewählt ist aus Mitomycin, Doxorubicin, Aminopterin, Actinomycin, Bleomycin, 9-Amino- Camptothecin, n8-Acetyl-spermidin, 1 -(2-Chloroethyl)-1 ,2-dimethansulfonyl- hydrazid, Tallysomycin, Cytarabin, Etoposid, Camptothecin, Taxol, Esperamicin, Podophyllotoxin, Anguidin, Vincristin, Vinblastin, Morpholin-doxorubicin, n-(5,5- diacetoxy-pentyl)-doxorubicin, Duocarmycin, Auristatin, Monomethylauristatin, Dolastatin, Tubulysin, Maytansinoid, Cryptophycin, Amanitine,
Indolinobenzodiazepine, Pyrrolobenzodiazepin-Derivate, Calicheamicin,
Daunorubicin, Camptophecin DX8951 (Exatecan) oder einen Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor), wobei der Wirkstoff über seine Hydroxyl- oder Aminogruppe an La (bei n=1 ) oder die Carbonylgruppe (bei n=0) gemäß Formel (la) gebunden ist.
15. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das cytotoxische Agens Di als Wirkstoff ein KSP-lnhibitor ist.
16. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der KSP-lnhibitor eine Verbindung der folgenden Formel (IIa)
Figure imgf000389_0001
(IIa) ist, in der
Figure imgf000389_0002
x2 für N und
Xs für C steht,
oder
Figure imgf000389_0003
x2 für C und
Xs für N steht,
oder
Figure imgf000389_0004
x2 für C und
Xs für N steht,
oder
Figure imgf000389_0005
X2 für C und
Xs für C steht,
oder
Figure imgf000389_0006
x2 für N und
Xs für C steht.
A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0)2-, oder -S(=0)2-NH- steht, für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH2)o-3Z steht,
für -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(=0)-NY1Y2, oder
-C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH2W)Z' stehen,
für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -IMH2, -S(=0)3H, -COOH,
-NH-C(=0)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder
-(C(=0)-NH-CHY4)i-3COOH steht,
für -H oder -OH steht,
für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert ist, für -H, -L-#1 , -MOD, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z steht, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder
-C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -COOH steht,
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiertes ist,
für-H oder -C(=0)-CHY6-NH2 steht,
für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht,
für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,
Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-
Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei
Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten
Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-
Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl
Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-
Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, n 0, 1 oder 2 ist, Z für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder
-(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R4 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la') steht, R5 für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)o-3Z steht,
Z für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)- OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen, R8 für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10- Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl-, Fluor-C4-io-Cycloalkyl- oder -(CH2)o-2-(HZ2) steht,
HZ2 für einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei
Heteroatome, ausgewählt aus N , O und S steht, der mit -OH, -COOH, -NH2 oder -L-#1 substituiert sein kann, R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht, -L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,
-MOD für -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht,
G1 für -NH-C-(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /N CO steht, n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach durch
-O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-,
-NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-,
-CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2,
-COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht und
-MOD mindestens eine, vorzugsweise zwei -COOH Gruppen aufweist und eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
17. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), gemäß Anspruch 16, in der
Figure imgf000393_0001
X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht,
R1 für -L-#1 , -H, oder -MO D steht
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht, o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,
-MOD für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, n 0 oder 1 ist,
G1 für -NH-C-(=0)- oder -C(=0)-NH- steht, o 0 oder 1 ist und
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-, -C(=0)-NRvNRy-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht
R2 für -H,
R3 für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,
Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei
Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-
Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei
-N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, n 0, 1 oder 2 ist,
Z für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z>(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -IMH2 oder -C(=0)-OH steht,
R4 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')
steht,
R5 für -H steht, R6 und R7 für Fluor stehen,
R8 für t-Butyl steht,
R9 für -H steht,
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), gemäß den Ansprüch
und 17, in der
Figure imgf000395_0001
X2 für C und
X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht, R1 für -L-#1 , -H, oder -MO D steht für -(Lb)0-(LIG)P steht, für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird, für einen Linker steht, unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht, für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht,
0,
für -C(=0)-NH- steht, 1 ist und für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -NRY- oder -C(=0)- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -C(=0)-NH2, -COOH, substituiert sein kann,
für -H oder C-| -C 0-Alkyl- steht, das mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH,
-OH, -IMH2, substituiert sein kann, für -COOH steht für -H, für-L-#1 steht, R4 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')
steht,
R5 für -H steht,
R6 und R7 für Fluor stehen,
R8 für t-Butyl steht,
R9 für -H steht,
-L-#1 für -(Lb)0-(LIG)P steht,
LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer
Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,
Lb für einen Linker steht,
o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
19. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa')
Figure imgf000397_0001
(IIa'),
in der
Xi für N, für N und
für C steht, für N,
für C und
für N steht, für CH oder CF,
für C und
für N steht, für NH,
für C und
für C steht, für CH,
für N und
für C steht. für die Gruppe *-C(=0)-(CH2)x-S-CH2-CH(COOH)-NH-** steht, für 1 oder 2 steht, für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht, für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la') steht, für -MOD steht, für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht, für -H oder Ci-Cs-Alkyl- steht, 0 ist, für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
G3 für -H oder -COOH steht
R2 für -H steht,
R3 für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')
steht,
R4 für -H steht,
R5 für -H, -NH2, -N02, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)0-3Z steht,
Z für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-
OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht, unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -N H2, -COOH oder Halogen stehen,
R8 für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10-
Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,
R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
20. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa'), gemäß Anspruch 19, in der
Figure imgf000400_0001
X3 für N steht,
A für die Gruppe *-C(=0)-(CH2)x-S-CH2-CH(COOH)-NH-** steht, x für 1 oder 2 steht,
* für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht,
** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der
Formeln (la') steht,
R1 für -MOD steht,
-MOD für die Gruppe -(NR10)n-(G1 )0-G2-G3 steht,
R10 für -H oder Ci-C3-Alkyl- steht, n 0 ist, G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist, für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRX=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
für-H, Phenyl-, C-|-C-|o-Alkyl-, C2-C-|0"Alkenyl- oder C2-C-|Q-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
für -H, C-|-C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, für-H oder -COOH steht für-H steht, für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la) steht, für-H steht, für-H steht, für Fluor stehen, für t-Butyl steht und für -H steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa")
Figure imgf000402_0001
la"),
in der
Figure imgf000402_0002
x2 für N und
Xs für C steht,
oder
Figure imgf000402_0003
x2 für C und
Xs für N steht,
oder
Figure imgf000402_0004
x2 für C und
Xs für N steht,
oder
Figure imgf000402_0005
X2 für C und
Xs für C steht,
oder
Figure imgf000402_0006
x2 für N und
Xs für C steht.
A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0)2-, oder -S(=0)2-NH- steht, für die Gruppe * - (G1 )0-G2-NH- ** steht,
* für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches
Agens) steht,
** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der
Formeln la' steht, G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| Q-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,
R2 für -H steht, R3 für eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-,
Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei - NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei Nh -Gruppen oder ein bis drei (CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,
0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2 oder -C(=0)-OY3 steht,
unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z' oder -(CH2)o-3Z' steht,
für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R4 für -H steht,
R5 für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH oder -(CH2)o-3Z steht,
Z für -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY1Y2, oder -C(=0)-
OY3 steht,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,
Y3 für -H oder -(CH2)o-3Z' steht,
Z' für -H, -S(=0)3H, -NH2 oder -COOH steht,
R6 und R7 unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10-
Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen,
R8 für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,
C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10- Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,
R9 für -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
22. Verbindungen der allgemeinen Formel (II"), gemäß Anspruch 21 , in der
Figure imgf000405_0001
X3 für N steht,
A für -C(=0)- steht, für die Gruppe * - (G1 )0-G2-NH- ** steht, für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches Agens) steht,
** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der
Formeln (la') steht,
G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,
G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-,
-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)2-NRYNRY-,
-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,
-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Ry für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-
Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, R2 für -H steht, R3 für -CH2-OH steht,
R4 für -H steht,
R5 für -H steht,
R6 und R7 für Fluor stehen,
R8 für t-Butyl steht und
R9 für -H steht,
sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker Lb bzw. Lc an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest des Binders gebunden ist und die folgende Formel aufweist:
Figure imgf000406_0001
wobei
m 0 oder 1 ist,
n 0 oder 1 ist
§ für die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltbare Gruppe der Formel (la') steht und
§§ für die Bindung an den Binder steht,
-L2 für die Gruppe
Figure imgf000407_0001
Figure imgf000407_0002
oder für eine Bindung steht, wobei
#1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht, R1 0 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,
G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, - S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)-NH2), -Nme-, - NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis l Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, - NH2, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000408_0001
darstellt, wobei
Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.
24. Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker Lb und/oder Lc an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden ist und die folgende Formel
§-(C=0)m-L1 -(L4)n-C=0-§§
aufweist, in der m 0 oder 1 ist,
n 0 oder 1 ist,
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltbare
Gruppe der Formel (la') steht und
§§ die Bindung an ein Stickstoffatom des Binders darstellt,
L1 für -(NR1 °)n-(G1 )o-G2- steht,
R1 0 für -H oder Ci-C3-Alkyl steht,
G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH2)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist, für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte
Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH2-C(=0)- NH2), -NMe-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen
Figure imgf000409_0001
darstellt, wobei
für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,
für eine Einfachbindung oder eine Gruppe
Figure imgf000409_0002
steht,
0 oder 1 ist und
für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0)2-NHNH-, -C(=0)-NHNH-, - CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder S(=0)2 unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH-CN-NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei L2 für eine oder beide der folgenden Formeln
Figure imgf000410_0001
steht, wobei
#1 für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binder steht, #2 für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht, R22 für -COOH steht und die Bindungen an das Schwefelatom des Binder zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Formeln vorliegen.
26. Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Binder ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment ist und wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment über einen Cystein-Rest (AK1), einen Lysin-Rest (AK2) oder einen Glutamin-Rest (AK3) gebunden ist. 409
Figure imgf000411_0001
Figure imgf000411_0002
Figure imgf000412_0001
Figure imgf000412_0002
Figure imgf000413_0001
412
Figure imgf000414_0001
413
Figure imgf000415_0001
414
Figure imgf000416_0001
Figure imgf000416_0002
415
Figure imgf000417_0001
Figure imgf000417_0002
416
Figure imgf000418_0001
Figure imgf000418_0002
417
Figure imgf000419_0001
Figure imgf000419_0002
418
Figure imgf000420_0001
Figure imgf000420_0002
419
Figure imgf000421_0001
Figure imgf000421_0002
Figure imgf000422_0001
Figure imgf000422_0002
und
Figure imgf000423_0001
in denen
AKi und AK2 für einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht, und
n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, besonders
bevorzugt 2 bis 8 und insbesondere 2 bis 6 steht.
Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet.
Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert.
30. Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper ein anti-HER2-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper, anti-B7H3-Antikörper, ein anti-TWEAKR-Antikörper, oder ein Antigen- bindendes Antikörperfragment von diesen ist.
Verbindung oder Konjugat nach Anspruch 30 wobei der anti-TWEAKR-Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, der anti-B7H3-Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und der anti- HER2-Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trastuzumab und TPP-1015 ist.
Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper (AK, AK1 , AK2, AK3)
(i) für einen anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8,
(ii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18,
(iii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28,
(iv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38,
(v) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48,
(vi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58,
(vii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68,
(viii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 78, (ix) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 88,
(x) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 92, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 93 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 94, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 96, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 97 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 98,
(xi) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 102, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 103 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 104, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 106, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 107 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 108,
(xii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 18,
(xiii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 122, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 123 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 124, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 126, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 127 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 128,
(xiv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 132, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 133 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 134, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 136, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 137 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 138,
(xv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 142, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 143 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 144, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 146, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 147 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 148, oder
(xvi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 152, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 153 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 154, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 156, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 157 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 158 steht, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
33. Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der Antikörper (AK, AK1 , AK2, AK3)
(i) für einen anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 5,
(ii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15,
(iii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25,
(iv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35, (v) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45,
(vi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55,
(vii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65,
(viii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75,
(ix) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85,
(x) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 95,
(xi) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 101 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 105,
(xii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 15,
(xiii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 121 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 125, (xiv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 131 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 135,
(xv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 141 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 145, oder
(xvi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 151 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 155 steht, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
34. Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der Antikörper (AK, AK1 , AK2, AK3)
(i) für einen anti-EGFR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10,
(ii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20,
(iii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30,
(iv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 40,
(v) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 50, (vi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60,
(vii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70,
(viii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80,
(ix) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 90,
(x) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 100,
(xi) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 109 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 10,
(xii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 120,
(xiii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 129 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 130,
(xiv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 139 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 140, (xv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 149 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 150, oder
(xvi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 159 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 160 steht, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
36. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur
Verwendung in einem Verfahren Behandlung und/oder Prophylaxe von
Krankheiten.
37. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur
Verwendung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von
hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen.
38. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur
Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren.
39. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur
Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren in Kombination mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs- Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie.
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