WO2018094542A1 - Sistema de expresión optogenético en levadura - Google Patents

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WO2018094542A1
WO2018094542A1 PCT/CL2017/050066 CL2017050066W WO2018094542A1 WO 2018094542 A1 WO2018094542 A1 WO 2018094542A1 CL 2017050066 W CL2017050066 W CL 2017050066W WO 2018094542 A1 WO2018094542 A1 WO 2018094542A1
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photoreceptor
sec
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Luis Fernando LARRONDO CASTRO
Eduardo Esteban AGOSIN TRUMPER
Francisco José SALINAS SANHUEZA
Vicente Alberto ROJAS JORQUERA
Verónica Melissa DELGADO HERNÁNDEZ
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Pontificia Universidad Católica De Chile
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention is part of the field of optogenetic expression systems in yeast.
  • the optogenetic expression system allows to solve many of the problems associated with controlled genetic expression with chemical inducers, since the light is non-toxic, its effect can be reversible, and it is not necessary to add extra steps to productive processes to remove from the environment. Chemical induction culture.
  • a photoreceptor is considered to correspond to a light sensitive protein.
  • Optogenetics is a tool through which various cellular processes can be controlled, by light induction. Optogenetic expression systems behave like real switches that lead to transcriptional activation, and have considerable advantages over chemical induction expression systems. Among them is that light is a non-toxic resource, low cost and easy delivery (immediate and reversible), allowing a high spatio-temporal resolution of the expression. For this reason, implementing light-induced expression systems in yeast is a powerful tool for non-invasively controlling the expression of genes of interest.
  • S. cerevisiae yeast does not have active photoreceptors, there are a number of organisms that do have well-characterized photoreceptors, and that can serve as a source of parts to implement new optogenetic switches.
  • the filamentous fungus Neurospora crassa has two blue light photoreceptors. The first is White Collar 1 (WC-1), a GATA type transcription factor that contains an FAD chromophore binding domain (Flavin Adenin Dinucleotide) and two PAS domains (Per-Arnt-Sim) for protein-protein interactions.
  • WC-1 White Collar 1
  • FAD chromophore binding domain Fravin Adenin Dinucleotide
  • PAS domains Per-Arnt-Sim
  • WC-1 is capable of sensing light using the FAD chromophore present in its LOV (Light Oxygen Voltage) domain, a specialized type of PAS domain.
  • the second blue light photoreceptor in N. crassa is the VIVID (WD) protein, which also has a LOV domain with its respective FAD attached.
  • WD VIVID
  • N. crassa WC-1 does not act alone, but dimerizes with the transcription factor White Collar 2 (WC-2) forming the so-called White Collar Complex (WCC), protein interaction mediated by PAS domains present in both proteins.
  • WCC White Collar Complex
  • the WCC complex in the presence of light, the WCC complex is capable of forming a multimer with another WCC, through LOV-LOV interactions of the WC-1s present in each complex.
  • the light-activated WCC changes its sequence specificity and instead of promoting transcription from c-box sequences, it binds as a multimer to the light response elements (pLRE, proximal Light Response Element) found in promoters of hundreds of genes, including the same vvd gene.
  • pLRE proximal Light Response Element
  • the WD protein that begins to accumulate is excited by light, leading to a conformational change at the level of its LOV domain. The latter allows VVD to interact through said region with the photoactivated LOV domain present in WC-1.
  • VVD competes for the WC-1 / WC-1 interaction (which occurs in the WCC-WCC megacomplex) being able to heterodimerize with WC-1.
  • US2013345294 describes a light activatable gene expression system, which comprises as main elements a recombinant transcription factor that can be activated / deactivated by light and includes 1) a DNA binding domain, 2) a light activatable domain, and 3 ) a transcription regulatory domain; in addition to a white transcription unit, including an element recognized by the first polypeptide, a regulated promoter, and a DNA sequence to be transcribed, and publication EP2886653A1 describing a system similar to that described in US2013345294, but adapted to a prokaryotic bacterium.
  • WO2015086818A1 describes chimera proteins, which comprise a light-sensitive section, and a kinase-associated receptor domain. It is described that the light sensitive domains are obtained from different organisms, and VIVID of N. crassa is mentioned.
  • This publication describes the light responses of Neurospora crassa exposed to different lighting conditions, and describes the photoadaptation that depends on the LOV domains present in the WCC complex and on the WD regulator, describing how light induces WD expression and that subsequently, WD competes in the formation of WCC-WCC homodimers producing WC1-WD heterodimers, which block or stop the transcription mediated by WCC-WCC, and which ultimately represent the light adaptation of the system.
  • FIG. 1 shows a schematic of the WC-1 / VVD optogenetic expression system.
  • the WC-1 LOV and VVDLOV photoreceptors are not able to interact and gene transcription is turned off.
  • WC-1 LOV and VVDLOV interact, which reconstitutes a chimeric GAL4 transcription factor.
  • the transcription of the FL01 and TUP1 genes which are under the control of the pGAL1 and p5XGAL1 promoters, is activated.
  • Figure 1 (continued): Evaluation of luciferase reporter gene expression in strain BY4741 wt transformed with plasmids pRS423-WC1 and pRS425-VVD plus the plasmid containing pGAL1-Luc or p5XGAL1-Luc, under conditions of constant light (LL) and constant darkness (DD). The results showed high levels of expression under LL conditions with low levels of background expression in DD ( Figure 1B), showing a maximum luciferase induction of 1258 times (LL / DD) under the control of pGAL1 and 315 times under the control of the p5XGAL1 promoter ( Figure 1 F).
  • Figure 2 Evaluation of gene expression involved in yeast flocculation.
  • the endogenous promoters of FL01, FL011 and TUP1 were exchanged for the promoters pGAL1 and p5XGAL1 in strain BY4741 wt.
  • We use these strains to introduce the WC1-VVD system episomally and control the flocculation by light.
  • the flocculation index between LL and DD conditions is shown, for strains with the exchange of promoters for FL01 and TUP1 carrying the WC1-VVD system.
  • Figure 3 Flocculation phenotype reversibility evaluation. Reversibility was evaluated under different conditions of LL and DD. Initially, the strains were grown 24 hours in LL followed by 24 hours in DD, showing strong flocculation in the strains with the exchange of promoter in FL01 carrying the WC1-VVD system ( Figure 3A and C). However, the strains with promoter exchange for TUP1 plus the WC1-VVD system showed flocculation in DD and no reversal of the phenotype after 24 hours in LL ( Figure 3B and D).
  • the LS gene was cloned into a plasmid pYES2 (pYES2-LS-V5), allowing control of the pGAL1 promoter and labeling the protein with V5 (Figure 4A).
  • the BY4741 strain was co-transformed with the WC1-VVD system plus plasmid pYES2-LS-V5 and we analyzed protein levels by western blotting under LL and DD conditions. These results showed a high level of LS expression in LL with low levels in DD, and comparable with the levels of protein obtained by induction with galactose (Figure 4B and C).
  • the WC1-VVD system showed a protein induction of 110 times (LL / DD), 2.5 times greater than the induction by galactose / glucose (average induction of 44 times) (Figure 4D).
  • the invention corresponds to an optogenetic expression system in yeast and a method to regulate the expression of a gene in a host cell, where the optogenetic expression system comprises at least two photoreceptors, or light-sensitive proteins, that can form a factor. of chimeric transcription, where once the system is exposed to light, a conformational change is generated that allows dimerization between both different photoreceptors, thus forming the transcription factor, allowing the binding of said transcription factor to the promoter, thus generating the transcription of the gene of interest.
  • the optogenetic expression system comprises at least:
  • a functional transcription factor formed by the interaction of the two photoreceptors, with a DNA binding domain associated with the first photoreceptor and the trans-activation domain associated with the second photoreceptor, where said functional transcription factor is capable of binding to elements of default responses present in a specific promoter, and
  • the present invention also considers a method for regulating the expression of a gene in a host cell, comprising the steps of: to. transforming a host cell so that it is capable of expressing an optogenetic expression system as previously described;
  • C. express a protein of interest that is regulated by the specific promoter mentioned in the previous point.
  • the present invention corresponds to an optogenetic expression system in yeast.
  • the description thereof will be made using a particular case, and in the examples section, 3 different embodiments of the invention are shown considering the expression control by means of of light in 3 different cases, expression of a reporter gene (luciferase), expression of a heterologous protein (limonene synthase), and control of yeast flocculation (expression of FLO and TUP proteins).
  • luciferase reporter gene
  • limonene synthase a heterologous protein
  • yeast flocculation expression of FLO and TUP proteins
  • S. cerevisiae has been widely used as a biological platform in order to produce high value metabolites.
  • the yeast is fermented in chemostats or bioreactors, which increases the production yield of these compounds.
  • the cells must be removed from the culture medium. This separation process is usually done by large-scale filtration or centrifugation, which means large expenses for the biotechnology industry.
  • a particular solution to the problem of separating yeasts from the culture medium corresponds to the application of the optogenetic expression system of the present invention to the particular case in which the optogenetic expression system controls the expression of genes responsible for flocculation in yeasts.
  • Flocculation is a process of cell aggregation, where lectin-like surface proteins - encoded by the FLO (flocculation) genes - interact with the trickle residues of adjacent cells, generating aggregation and sedimentation of suspended cells.
  • FLO farnesol
  • flocculation constitutes a highly relevant phenotype, since it is considered as a simple and low-cost method of separation in fermentation processes. Studies have been reported where the flocculation phenotype is induced, however, most of them depend on the administration of some exogenous chemical, which must be captured by the cells in order to exert their inducing effect.
  • the optogenetic expression system of the present invention comprises at least:
  • a first photoreceptor, or light sensitive protein operably linked as a fusion protein with a DNA binding domain
  • a second photoreceptor, or light sensitive protein operably linked as a fusion protein with a trans-activation domain
  • a functional transcription factor formed by the interaction of the first photoreceptor and the second photoreceptor, where in the presence of light both photoreceptors undergo a conformational change that allows them to interact with each other, allowing the DNA binding domain associated with the first photoreceptor and the domain of trans-activation associated with the second photoreceptor form said functional transcription factor, wherein said functional transcription factor is capable of binding to response elements present in a specific promoter, and
  • At least one nucleic acid sequence encoding a protein of interest where the expression of said protein of interest is regulated by the specific promoter mentioned in the previous point.
  • the first photoreceptor corresponds to the LOV domain present in the WC-1 protein, which is expressed as a fusion protein incorporating a DNA binding domain of GAL4; and the second photoreceptor corresponds to the LOV domain present in the WD protein, which is expressed as a fusion protein incorporating a GAL4 trans-activation domain.
  • This particular case of application of the optogenetic expression system of the present invention is illustrated in Figure 1.
  • the DNA binding domains and trans-activation domain can be exchanged, so that: the first photoreceptor corresponds to WC-1 that includes a LOV domain, which is expressed as a fusion protein incorporating a transactivation domain of GAL4; and the second photoreceptor corresponds to WD which includes in the LOV domain, which is expressed as a fusion protein incorporating a DNA binding domain of GAL4.
  • the first photoreceptor corresponds to the LOV domain (nucleotide sequence SEC No. 3, amino acid sequence SEC No. 4) present in a White Collar 1 protein of Neurospora crassa (WC- 1) (SEC No. 1 nucleotide sequence, SEC No. 2 amino acid sequence), which is operably linked as a fusion protein incorporating a DNA binding domain of GAL4 (SEC No. 9 nucleotide sequence, SEC No. 10 amino acid sequence) , and because the second photoreceptor corresponds to the LOV domain (SEC nucleotide sequence No. 7, amino acid sequence SEC No.
  • the first photoreceptor corresponds to the LOV domain present in a White Collar 1 protein of Neurospora crassa (WC-1) (nucleotide sequence SEC No. 3, amino acid sequence SEC No.
  • a method for regulating the expression of a gene in a host cell is considered.
  • the method of regulating the expression of a gene in a host cell comprises the steps of:
  • C. express a protein of interest that is regulated by the specific promoter mentioned in the previous point.
  • the first photoreceptor corresponds to the LOV domain (SEC nucleotide sequence No. 3, amino acid sequence SEC No. 4) present in a White Collar 1 protein of Neurospora crassa (WC-1) (SEC No. 1 nucleotide sequence, SEC No. 2 amino acid sequence), which is operatively linked as a fusion protein incorporating a GAL4 DNA binding domain (SEC No. 9 nucleotide sequence, SEC N amino acid sequence 10), and because the second photoreceptor corresponds to the LOV domain (SEC nucleotide sequence No. 7, amino acid sequence SEC No.
  • VIVID protein of Neurospora crassa (nucleotide sequence SEC No. 5, amino acid sequence SEC No. 6), which is operably linked as a fusion protein incorporating a trans-activation domain of GAL4 (nucleotide sequence SEC No. 11, amino acid sequence SEC No. 12).
  • the first photoreceptor corresponds to the LOV domain present in a White Collar 1 protein of Neurospora crassa (WC-1) (nucleotide sequence SEC No. 3, amino acid sequence SEC No. 4), which is operably linked as a fusion protein incorporating a trans-activation domain of GAL4 (nucleotide sequence SEC No. 11, amino acid sequence SEC No. 12), and because the second photoreceptor corresponds to the LOV domain (sequence nucleotide SEC No. 7, amino acid sequence SEC No.
  • WC-1 White Collar 1 protein of Neurospora crassa
  • VIVID protein of Neurospora crassa (nucleotide sequence SEC No. 5, amino acid sequence SEC No. 6), which is operably linked as a fusion protein incorporating a DNA binding domain of GAL4 (nucleotide sequence SEC No. 9, amino acid sequence SEC No. 10).
  • the promoter is pGAL1 (SEQ No. 27) or p5XGAL1 (SEQ No. 28).
  • the host cell is a yeast.
  • the yeast is Saccharomyces cerevisiae.
  • the protein of interest is luciferase (nucleotide sequence SEC No. 19, amino acid sequence SEC No. 20).
  • the protein of interest is limonene synthase (nucleotide sequence SEC No. 21, amino acid sequence SEC No. 22).
  • the protein of interest is TUP1 (nucleotide sequence SEC No. 17, amino acid sequence SEC No. 18).
  • the protein of interest is FL011 (nucleotide sequence SEC No. 15, amino acid sequence SEC No. 16).
  • the protein of interest is FL01 (nucleotide sequence SEC No. 13, amino acid sequence SEC No. 14).
  • the strains that carry Plasmids with auxotrophic markers are maintained in complete synthetic medium (Se) (0.67% yeast nitrogen based without amino acids, 2% glucose, 0.2% dropout mixture and 2% agar) minus the amino corresponding acid (dropout mixture).
  • Yeast cultures that grow under different conditions of light (LL) or darkness (DD) are carried out in Pervival incubators (Percival Scientific, USA), using a white light intensity of 100 ⁇ m 2 s _1 . Blue light experiments were carried out using an LED lamp with a light intensity of 22 ⁇ 22 m 2 s "1 .
  • Plasmids containing the photo receptor domains LOV of WC1 (pMB1, SEC No. 23) and VVD (pMB2, SEC No. 24) were obtained from (Mal leopard et al., 2010) [Photoadaptation in Neurospora by Competitive Interaction of Activating and Inhibitory LOV Domains, Maltechnik, Erik et al .; Cell, Volume 142, Issue 5, 762-772].
  • the plasmids used and generated in this work are described in Table 2.
  • We use plasmids pMB1 (SEC No. 23) and pMB2 (SEC No.
  • Plasmids used in the examples of the present invention generated using recombinant cloning in yeast.
  • the synthetic version of the pGAL1 promoter (SEC No. 27), called p5XGAL1 (SEC No. 28), which carries five DNA binding sites for the Gal4 transcription factor (GAL4-UAS) was synthesized using the Genewiz synthesis service.
  • the promoters pGAL1 (SEC No. 27) and p5XGAL1 (SEC No. 28) were amplified by PCR using Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo scientific, USA). Additionally, KanMx antibiotic resistance was also amplified by PCR and included the genetic constructs in the reverse direction, the overlap between PCR products was 50 bp.
  • PCR products were co-transformed with the linear plasmid pRS426 in the yeast strain BY4741 for cloning by recombination in yeast.
  • Yeast-generated circular plasmids were transferred to E. coli DH5a strain and analyzed by colony PCR under standard conditions, two clones were selected for sequencing using the Macrogene sequencing service.
  • Strains BY4741 wt and BY4741 with deletions in GAL4 and GAL80 were transformed with complete genetic constructs (KanMxRV-pGAL1 with SEQ No. 30 or KanMxRv-p5XGAL1 with SEQ No.
  • the same assembly procedure was followed to construct different versions of the luciferase reporter gene under the control of pGAL1 and p5XGAL1 promoters.
  • the deletion of GAL4, GAL80 and luciferase reporter gene integrations in the GAL3 locus was carried out using a one-step PCR recombination deletion strategy.
  • the splitters used for deletion of the gene and integration of the reporter gene into the genome are listed in Tables 6 and 7.
  • Cannabis sativa limonene synthase enzyme was optimized in its codons for S. cerevisiae (SEC nucleotide sequence No. 21, amino acid sequence SEC No. 22) and cloned into the expression vector pYES2 (pYES-LS-V5) (SEC No. 32).
  • the BY4741 wt strain was co-transformed with pYES-LS-V5 (SEC No. 32) plus pRS423-WC1 (SEC No. 33) and pRS425-VVD (SEC No. 34).
  • the promoter exchange strains in FL01 (SEC nucleotide sequence No. 13, amino acid sequence SEC No. 14), FL011 (nucleotide sequence SEC No. 15, amino acid sequence SEC No. 16) and TUP1 (nucleotide sequence SEC No. 17 , amino acid sequence SEC No. 18) were co-transformed with plasmid pRS423-WC1 (SEC No. 32) and pRS425-VVD (SEC No. 34), and were evaluated under conditions of DD and LL. Images and analysis of the flocculation phenotype were taken after 24 hours of growth in culture bottles under DD or LL conditions.
  • strains were transformed With a plasmid pRS426 carrying mCherry controlled by the PTDH3 promoter (pRS426-mCherry, SEC No. 35), images of yeast cells were taken with light field microscopy and fluorescence using a Cytation 3 model microscope (BioTek, USA).
  • the flocculation of each strain was quantified by OD 600 nm by the flocculation index, which was calculated as the difference of OD in a yeast culture after 30 min of static incubation: 1- (Final OD / initial OD).
  • EXAMPLE 2 Application of the optogenetic expression system of the invention to control the expression of a reporter gene: Luciferase (LUC)
  • EXAMPLE 4 Application of the optogenetic expression system of the invention to control yeast flocculation, both in constant light (LL) and constant dark (DD) conditions
  • Yeast cell fluorescence microscopy expressing mCherry showed high levels of cell aggregation in LL and little or no aggregation in DD, for strains with FL01 promoter exchange and carrying the WC1-VVD system.
  • a moderate flocculation phenotype was observed in LL for strains with FL011 promoter exchange; and the opposite phenotype of cell aggregation was observed in strains with exchange of promoters for TUP1 carrying the WC1-VVD system, showing high levels of cell aggregation in DD but not in LL.
  • the phenotype of cell aggregation observed in strains with different promoter exchanges and carrying the WC1 -VVD system was confirmed by light field microscopy.
  • the macroscopic flocculation phenotype observed in culture bottles was confirmed with the flocculation index of each strain.
  • the results showed significant differences (t-test, p ⁇ 0.01) in the flocculation index between LL and DD conditions, for strains with the exchange of promoters for FL01 and TUP1 that they carry the WC1-VVD system ( Figure 2).
  • the results demonstrated the viability of the WC1-VVD system to control the yeast flocculation phenotype.
  • the reversibility of the flocculation phenotype was evaluated under different conditions of LL and DD. Initially, the strains were grown 24 hours in LL followed by 24 hours in DD, showing strong flocculation in the strains with the exchange of promoter in FL01 carrying the WC1-VVD system ( Figure 3A and C). However, the strains with promoter exchange for TUP1 plus the WC1-VVD system showed flocculation in DD and no reversal of the phenotype after 24 hours in LL ( Figure 3B and D).
  • the present invention has a great application in the biotechnology industry, since it allows a great advance in the induction of protein expression by means of light, which represents great advantages over traditional methods of chemical induction. Also, the present invention provides an innovative application for the control of yeast flocculation, allowing strains of interest to float under LL conditions or DD conditions, depending on how the system is implemented.

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Abstract

La invención corresponde a un sistema de expresión optogenético en levadura y un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, donde el sistema de expresión optogenético comprende al menos dos fotorreceptores, o proteínas sensibles a luz, distintos que pueden formar un factor de transcripción quimérico, donde una vez que el sistema se expone a la luz, se genera un cambio conformacional que permite la dimerización entre ambos fotorreceptores distintos, formándose así el factor de transcripción, permitiendo la unión de dicho factor de transcripción al promotor, generando así la transcripción del gen de interés.

Description

SISTEMA DE EXPRESIÓN OPTOGENÉTICO EN LEVADURA
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se enmarca en el campo de sistemas de expresión optogenéticos en levadura. El sistema de expresión optogenético permite solucionar muchos de los problemas asociados a la expresión genética controlada con inductores químicos, dado que la luz resulta no tóxica, su efecto puede ser reversible, y no es necesario agregar pasos extra a procesos productivos para retirar del medio de cultivo inductores químicos.
ANTECEDENTES Y ARTE PREVIO
En el contexto de la presente invención, se considera que un fotorreceptor corresponde a una proteína sensible a la luz.
La regulación de la expresión génica es un importante aspecto de algunas invenciones biotecnológicas. Para el control exógeno de la expresión de genes, se han utilizado diversos inductores químicos. Dado que cada compuesto puede ser captado de manera distinta, no es posible controlar a voluntad la temporalidad de la expresión, ni la permanencia de dicho inductor en las células. Además, los inductores químicos suelen tener efectos tóxicos, dada su capacidad de activar respuestas fisiológicas o vías de señalización paralelas. También, la inducción química es prácticamente irreversible, dado que es muy complejo remover estos inductores del medio de cultivo. En este sentido, la luz es un inductor ideal de la expresión génica, ya que es un recurso de bajo costo y no-tóxico, y por su naturaleza, tampoco requiere de pasos adicionales para retirarla del medio de cultivo.
La optogenética es una herramienta a través de la cual se pueden controlar diversos procesos celulares, mediante inducción por luz. Los sistemas de expresión optogenéticos se comportan como verdaderos interruptores que llevan a la activación transcripcional, y presentan considerables ventajas con respecto a los sistemas de expresión de inducción química. Entre ellas se encuentra que la luz es un recurso no-tóxico, de bajo costo y de fácil entrega (inmediata y reversible), permitiendo una alta resolución espacio-temporal de la expresión. Por esta razón, implementar sistemas de expresión inducidos por luz en levadura constituye una poderosa herramienta para controlar de manera no-invasiva la expresión de genes de interés. Por un largo tiempo, la mayoría de los sistemas optogenéticos se centró en el uso de fotorreceptores del tipo opsinas, capaces de permitir la entrada de iones (a nivel de la membrana plasmática) en respuesta a luz, acoplándose dichos cambios de potencial a vías de señalización y a la regulación de algún gen de interés. A pesar de lo invaluable de esas primeras aproximaciones, la entrada de iones produce además otros cambios que pueden potencialmente entregar ruido en el sistema. Así, en los últimos años es posible encontrar sistemas de expresión optogenéticos basados en el fundamento del ensayo de doble híbrido. Es decir, dos proteínas que contienen dominios que responden a luz (fotorreceptores) se expresan como proteínas de fusión, una junto a un dominio de unión a DNA y la otra junto a un dominio de transactivación. Al exponer las células a luz, las proteínas fotosensibles sufren un cambio conformacional e interactúan, reconstituyendo un factor de transcripción funcional capaz de unirse al promotor inducible que controla un gen de interés. Así, se han reportado sistemas de expresión basados en distintos fotorreceptores, que han permitido controlar la expresión génica en diversos organismos.
Así, si bien la levadura S. cerevisiae no posee fotorreceptores activos, hay una serie de organismos que sí poseen fotorreceptores bien caracterizados, y que pueden servir como fuente de piezas para implementar nuevos interruptores optogenéticos. De esta forma, por ejemplo, el hongo filamentoso Neurospora crassa presenta dos fotorreceptores de luz azul. El primero es White Collar 1 (WC-1), un factor de transcripción tipo GATA que contiene un dominio de unión al cromóforo FAD (Flavin Adenin Dinucleotide) y dos dominios PAS (Per- Arnt-Sim) para interacciones proteína-proteína. WC-1 es capaz de sensar la luz mediante el cromóforo FAD presente en su dominio LOV (Light Oxygen Voltage), un tipo especializado de dominio PAS. El segundo fotorreceptor de luz azul en N. crassa es la proteína VIVID (WD), que también posee un dominio LOV con su respectivo FAD unido. En N. crassa WC-1 no actúa solo, sino que dimeriza con el factor de transcripción White Collar 2 (WC-2) formando el denominado White Collar Complex (WCC), interacción proteica mediada por dominios PAS presentes en ambas proteínas. Sin embargo, las características de WCC son aún más complejas: se ha descrito que en condiciones de oscuridad constante (DD) dicho complejo es capaz de reconocer un elemento cis denominado c-box, el cual lleva a transcripción circadiana de genes, incluyendo el gen frequency (frq). La proteína FRQ se considera como el elemento negativo del reloj circadiano, ya que al ser producido inhibe al WCC lo que lleva a que la expresión de nuevo frq cese, mientras que el FRQ que está presente es progresivamente fosforilado hasta ser incapaz de seguir inhibiendo a WCC. Así, un nuevo ciclo de expresión de frq comienza. De esta forma WCC participa de un bucle de retroalimentación transcripcional traduccional negativo, que se repite aproximadamente cada 24 horas. Por otra parte, en presencia de luz, el complejo WCC es capaz de formar un multímero con otro WCC, a través de interacciones LOV-LOV de los WC-1 presentes en cada complejo. Así, el WCC activado por luz cambia su especificidad de secuencia y en vez de promover transcripción desde secuencias tipo c-box, se une como multímero a los elementos de respuesta a luz (pLRE, proximal Light Response Element) que se encuentran en los promotores de cientos de genes, entre ellos el mismo gen vvd. Así, la proteína WD que se empieza a acumular es excitada por luz, llevando a un cambio conformacional a nivel de su dominio LOV. Esto último permite que VVD pueda interactuar a través de dicha región con el dominio LOV fotoactivado presente en WC-1. De esta manera, VVD compite por la interacción WC-1/WC-1 (que ocurre en el megacomplejo WCC-WCC) siendo capaz de heterodimerizar con WC-1. Como consecuencia de la disminución de los niveles de WCC fotoactivado en condiciones de luz constante, la transcripción de los cientos de genes que responden a luz, comienza a atenuarse, proceso conocido como fotoadaptación.
A fin de describir de mejor manera la presente invención, se realizó una búsqueda de arte previo, y a continuación se resumen los documentos cercanos encontrados.
US2013345294 describe un sistema de expresión génica activable por luz, que comprende como principales elementos un factor de transcripción recombinante que puede ser activado/desactivado por luz e incluye 1) un dominio de unión a DNA, 2) un dominio activable por luz, y 3) un dominio regulador de transcripción; además de una unidad de transcripción blanco, incluyendo un elemento reconocido por el primer polipéptido, un promotor regulado, y una secuencia de DNA para transcribirse, y la publicación EP2886653A1 que describe un sistema similar al descrito en US2013345294, pero adaptado a una bacteria procarionte.
WO2015086818A1 describe proteínas quimera, que comprenden una sección sensible a la luz, y un dominio receptor asociado a quinasa. Se describe que los dominios sensibles a luz se obtienen de distintos organismos, y se menciona VIVID de N. crassa.
En la búsqueda realizada también se encontraron publicaciones científicas que describen sistemas de expresión, y a continuación se presenta un breve resumen de las más relevantes.
"Light-lnducible System for Tunable Protein Expression in Neurospora crassa"; Jennifer M. Hurley, Chen-Hui Chen, Jennifer J. Loros, and Jay C. Dunlap. G3 (Bethesda). 2012 Oct; 2(10): 1207-1212. Esta publicación describe un sistema de expresión regulado por el promotor VVD, indicando que puede convertirse en un instrumento útil para el control eficiente de expresión genética. Se menciona que la expresión de mRNA es gradual dependiente de luz. Como prueba de concepto, esta publicación reporta la expresión de 3 genes bajo el control del promotor VVD: wc-1 , gfp, gh5-1.
"Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light". Michael Grusch, Karin Schelch, Robert Riedler, Eva Reichhart, Christopher Differ, Walter Berger, Alvaro Inglés-Prieto, and Harald Janovjak. EMBO J. 2014 Aug 1 ; 33(15): 1713-1726. Esta publicación describe proteínas quimera que combinan una porción de un receptor asociado a tirosina quinasa (RTK) y a un dominio sensor de luz. Se postula este sistema o proteínas quimera como una aproximación poderosa para controlar señalización celular.
"Fine tuning the LightOn light-switchable transgene expression system." Ma Z, Du Z, Chen X, Wang X, Yang Y. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Oct 25;440(3):419-23. Aquí se describe una sintonización fina que permite controlar el nivel de expresión del sistema LightOn, donde se indica que dependiendo del tamaño de un espaciador que une al promotor con la secuencia UASG permite controlar el nivel de expresión, más allá de un switch "on-off".
"Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system." Wang X, Chen X, Yang Y. Nat Methods. 2012 Feb 12;9(3):266-9. Esta publicación describe un sistema similar al sistema LightOn (EP2682469A1 o US2013345294) pero lleva el sistema de control a células animales y organismos multicelulares (ratón).
"Photoadaptation in Neurospora by Competitive Interaction of Activating and Inhibitory LOV Domains" Erik Malzahn et al, Cell 142, 762-772, September 3, 2010.
Esta publicación describe las respuestas a la luz de Neurospora crassa expuesta a distintas condiciones de iluminación, y describen la fotoadaptación que depende de los dominios LOV presentes en el complejo WCC y en el regulador WD, describiendo cómo la luz induce la expresión de WD y que posteriormente, WD compite en la formación de homodímeros WCC- WCC produciéndose heterodímeros WC1-WD, que bloquean o detienen la transcripción mediada por WCC-WCC, y que finalmente representan la adaptación a la luz del sistema.
En ninguna de las publicaciones encontradas se encuentran todos y cada uno de los elementos que conforman el sistema de expresión optogenética de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : (A) muestra un esquema del sistema de expresión optogenético WC-1/VVD. En condiciones de oscuridad, los fotorreceptores WC-1 LOV y VVDLOV no son capaces de interactuar y la transcripción de los genes se encuentra apagada. Al exponer las células a luz, WC-1 LOV y VVDLOV interactúan, lo cual reconstituye un factor de transcripción GAL4 quimérico. Así, se activa la transcripción de los genes FL01 y TUP1, que están bajo el control de los promotores pGAL1 y p5XGAL1.
Figura 1 (continuación): Evaluación de expresión de gen reportero luciferasa en cepa BY4741 wt transformada con los plásmidos pRS423-WC1 y pRS425-VVD más el plásmido que contiene pGAL1-Luc o p5XGAL1-Luc, bajo condiciones de luz constante (LL) y oscuridad constante (DD). Los resultados mostraron altos niveles de expresión bajo condiciones LL con bajos niveles de expresión de fondo en DD (Figura 1 B), mostrando una inducción máxima de luciferasa de 1258 veces (LL/DD) bajo el control de pGAL1 y 315 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (Figura 1 F). En cepa BY4741 con deleciones de GAL4 y GAL80 {gal4A- gal80A) con el sistema WC1-VVD, los resultados mostraron los mayores niveles de expresión del gen reportero en LL (Figura 1 C), con una inducción máxima de luciferasa 3386 veces bajo el control de promotor pGAL1 y 4116 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (Figura 1 F). Expresión de luciferasa en el locus GAL3 para las cepas BY4741 wt y BY4741 gal4A-gal80A, bajo condiciones LL y DD, (Figura 1 D y E). Una expresión máxima de luciferasa de 55 veces y 21 veces para promotores pGAL1 y p5XGAL1 fue observada en la cepa BY4741 wt (Figura 1 G). Niveles comparables de expresión de luciferasa fueron observados en la cepa BY4741 gal4A/gal80A, con 56 veces y 96 veces para promotores pGAL1 y p5XGAL1 , respectivamente (Figura 1 G).
Figura 2: Evaluación de expresión de genes involucrados en floculacion de levaduras. Los promotores endógenos de FL01, FL011 y TUP1 fueron intercambiados por los promotores pGAL1 y p5XGAL1 en la cepa BY4741 wt. Utilizamos estas cepas para introducir episomalmente el sistema WC1-VVD y controlar la floculacion por la luz. Se muestra el índice de floculacion entre condiciones LL y DD, para cepas con el intercambio de promotores para FL01 y TUP1 que llevan el sistema WC1-VVD.
Figura 3: Evaluación de reversibilidad del fenotipo de floculacion. La reversibilidad fue evaluada bajo diferentes condiciones de LL y DD. Inicialmente, se crecieron las cepas 24 horas en LL seguido por 24 horas en DD, mostrando una fuerte floculacion en las cepas con el intercambio de promotor en FL01 que llevan el sistema WC1-VVD (Figura 3A y C). Sin embargo, las cepas con intercambio de promotor para TUP1 más el sistema WC1-VVD, mostraron floculacion en DD y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en LL (Figura 3B y D). Luego, evaluamos los fenotipos de floculacion creciendo las cepas 24 horas en DD seguido por 24 horas en LL, mostrando floculacion en LL y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en DD para las cepas con el intercambio de promotor en FL01 más el sistema WC1-VVD (Figura 3A y E). Cuando las cepas se crecieron con el intercambio de promotor en TUP1 y con el sistema WC1-VVD durante 24 horas en LL, observamos un fenotipo sin floculacion, que estuvo totalmente activo después de 24 horas de DD (Figura 3B y F). Figura 4: Evaluación de expresión del gen limoneno sintasa (LS) de Cannabis sativa. El gen de LS fue clonado en un plásmido pYES2 (pYES2-LS-V5), permitiendo el control del promotor pGAL1 y marcando con V5 la proteína (Figura 4A). La cepa BY4741 fue co-transformada con el sistema WC1-VVD más el plásmido pYES2-LS-V5 y analizamos los niveles de proteínas mediante western-blot en condiciones LL y DD. Estos resultados mostraron un alto nivel de expresión de LS en LL con bajos niveles en DD, y comparable con los niveles de proteína obtenida por inducción con galactosa (Figura 4B y C). El sistema WC1-VVD mostró una inducción de proteína de 110 veces (LL/DD), 2,5 veces mayor que la inducción por galactosa/glucosa (inducción promedio de 44 veces) (Figura 4D).
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención corresponde a un sistema de expresión optogenético en levadura y un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, donde el sistema de expresión optogenético comprende al menos dos fotorreceptores, o proteínas sensibles a luz, distintos que pueden formar un factor de transcripción quimérico, donde una vez que el sistema se expone a la luz, se genera un cambio conformacional que permite la dimerización entre ambos fotorreceptores distintos, formándose así el factor de transcripción, permitiendo la unión de dicho factor de transcripción al promotor, generando así la transcripción del gen de interés.
Más específicamente, el sistema de expresión optogenético comprende al menos:
i. un primer fotorreceptor expresado como proteína de fusión con un dominio de unión a DNA,
¡i. un segundo fotorreceptor expresado como proteína de fusión con un dominio de transactivación,
Ni. un factor de transcripción funcional formado por la interacción de los dos fotoreceptores, con un dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor, donde dicho factor de transcripción funcional es capaz de unirse a elementos de respuesta predeterminados presentes en un promotor específico, y
iv. al menos una proteína de interés cuya expresión se encuentre regulada por el promotor específico.
La presente invención también considera un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, que comprende los pasos de: a. transformar una célula hospedera de manera que sea capaz de expresar un sistema de expresión optogenético como el descrito previamente;
b. exponer a la luz a la célula hospedera transformada de manera de promover el cambio conformacional tanto del primer fotorreceptor como del segundo fotorreceptor de manera que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen el factor de transcripción funcional, y así permitir la unión de dicho factor de transcripción funcional a elementos de respuesta presentes en un promotor específico; y
c. expresar una proteína de interés que se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Tal como se ha indicado previamente, la presente invención corresponde a un sistema de expresión optogenético en levadura. A fin de ejemplificar la invención y mostrar los principales elementos que la componen, se realizará la descripción de la misma utilizando un caso particular, y en la sección de ejemplos, se muestran 3 distintas realizaciones de la invención considerando el control de la expresión por medio de la luz en 3 casos distintos, expresión de un gen reportero (luciferasa), expresión de una proteína heterologa (limoneno sintasa), y control de floculacion en levadura (expresión de proteínas FLO y TUP). No debe entenderse la aplicación particular del sistema de expresión optogenético elegido para ilustrar la presente invención, como una limitante a su alcance.
La elección de la realización particular correspondiente a la promoción de floculacion en levaduras utilizando el sistema de expresión optogenético descrito en la presente invención, se debe a que la levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos más relevantes en biotecnología.
S. cerevisiae ha sido ampliamente utilizado como plataforma biológica con el fin de producir metabolitos de alto valor. Para ello, se fermenta la levadura en quimiostatos o biorreactores, lo cual aumenta el rendimiento en la producción de estos compuestos. Sin embargo, una vez que los procesos de fermentación han finalizado, las células deben ser removidas del medio de cultivo. Este proceso de separación suele hacerse mediante filtración o centrifugación a gran escala, lo cual significa grandes gastos para la industria biotecnológica.
Una solución particular al problema de separación de las levaduras desde el medio de cultivo, corresponde a la aplicación del sistema de expresión optogenético de la presente invención al caso particular en que el sistema de expresión optogenético controla la expresión de genes responsables de la floculacion en levaduras.
La floculacion es un proceso de agregación celular, en donde proteínas de superficie tipo lectinas - codificadas por los genes FLO (floculacion) - interactúan con los residuos de mañosa de las células adyacentes, generando agregación y sedimentación de las células en suspensión. Así, la floculacion constituye un fenotipo altamente relevante, ya que es considerado como un método de separación sencillo y de bajo costo en procesos de fermentación. Se han reportado estudios en donde se induce el fenotipo de floculacion, sin embargo, la mayoría de ellos dependen de la administración de algún químico exógeno, el cual debe ser captado por las células para poder ejercer su efecto inductor.
Luego, el sistema de expresión optogenético de la presente invención, comprende al menos:
a. un primer fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de unión a DNA;
b. un segundo fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de trans-activación;
c. un factor de transcripción funcional formado por la interacción del primer fotorreceptor y del segundo fotorreceptor, donde en presencia de luz ambos fotorreceptores sufren un cambio conformacional que permite que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen dicho factor de transcripción funcional, donde dicho factor de transcripción funcional es capaz de unirse a elementos de respuesta presentes en un promotor específico, y
d. al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de interés, donde la expresión de dicha proteína de interés se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.
Para el caso específico de aplicación utilizado para ejemplificar la presente invención, se considera lo siguiente:
El primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en la proteína WC-1 , que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4; y el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en la proteína WD, que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4. Este caso particular de aplicación del sistema de expresión optogenético de la presente invención se encuentra ilustrado en la Figura 1.
De manera alternativa, se pueden intercambiar los dominios de unión a DNA y dominio de trans-activación, de manera que: el primer fotorreceptor corresponde a WC-1 que incluye un dominio LOV, que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de transactivación de GAL4; y el segundo fotorreceptor corresponde a WD que incluye in dominio LOV, que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4.
Por tanto, en una realización específica, en el sistema de expresión optogenético, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4) presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC- 1) (secuencia nucleotídica SEC N° 1 , secuencia aminoacídica SEC N° 2), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12). Alternativamente, en el sistema de expresión optogenético, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4) , que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10).
En otro aspecto de la presente invención, se considera un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera.
En una realización particular, el método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera comprende los pasos de:
a. transformar una célula hospedera de manera que sea capaz de expresar un sistema de expresión optogenético, como el descrito previamente;
b. exponer a la luz a la célula hospedera transformada de manera de promover el cambio conformacional tanto del primer fotorreceptor como del segundo fotorreceptor de manera que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen el factor de transcripción funcional, y así permitir la unión de dicho factor de transcripción funcional a elementos de respuesta presentes en un promotor específico; y
c. expresar una proteína de interés que se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.
En una realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4) presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N° 1 , secuencia aminoacídica SEC N° 2), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12).
En una realización alternativa del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10).
En una realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, el promotor es pGAL1 (SEC N° 27) o p5XGAL1 (SEC N° 28). En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la célula hospedera es una levadura.
En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.
En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es luciferasa (secuencia nucleotídica SEC N° 19, secuencia aminoacídica SEC N° 20).
En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es limoneno sintasa (secuencia nucleotídica SEC N° 21 , secuencia aminoacídica SEC N° 22).
En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es TUP1 (secuencia nucleotídica SEC N° 17, secuencia aminoacídica SEC N° 18).
En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es FL011 (secuencia nucleotídica SEC N° 15, secuencia aminoacídica SEC N° 16).
En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es FL01 (secuencia nucleotídica SEC N° 13, secuencia aminoacídica SEC N° 14).
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
EJEMPLO 1 : Descripción de Materiales y Métodos en la aplicación de la presente invención
Cepas de levadura, medio y condiciones de cultivo
Las cepas BY4741 wt (MATa; his3M; leu2A0; met15A0; ura3A0) y BY4741 con deleciones de GALA y GAL80 (MATa; his3A1; leu2A0; met15A0; ura3A0, gal4A::NatMx, gal80A::HphMx) de Saccharomyces cerevisiae se usaron como fondo genético para deleciones genéticas e intercambio de promotores. Las cepas usadas y generadas en este trabajo se mantuvieron en medio YDPA (2% glucosa, 2% peptona, 1 % extracto de levadura y 2% agar) a 30°C y sus genotipos se detallan en la Tabla 1. Las cepas que llevan plásmidos con marcadores auxotróficos se mantienen en medio sintético completo (Se) (0,67% base nitrógeno de levadura sin amino ácidos, glucosa 2%, mezcla dropout 0,2% y agar 2%) menos el amino ácido correspondiente (mezcla dropout). Los cultivos de levadura que crecen bajo condiciones diferentes de luz (LL) u oscuridad (DD) se llevan a cabo en incubadoras Pervival (Percival Scientific, USA), usando una intensidad de luz blanca de 100 μΜ m2 s_1. Los experimentos con luz azul se llevaron a cabo usando una lámpara LED con una intensidad de luz de 22 μΜ m2 s"1.
Tabla 1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en la realización de los ejemplos descritos de la presente invención.
Construcción de plásmidos y generación de cepas.
Los plásmidos que contienen los dominios foto recepto res LOV de WC1 (pMB1 , SEC N° 23) y VVD (pMB2, SEC N° 24) fueron obtenidos de (Malzahn et al., 2010) [Photoadaptation in Neurospora by Competitive Interaction of Activating and Inhibitory LOV Domains, Malzahn, Erik et al.;Cell , Volume 142 , Issue 5 , 762 - 772]. Los plásmidos usados y generados en este trabajo se describen en la Tabla 2. Usamos los plásmidos pMB1 (SEC N° 23) y pMB2 (SEC N° 24) para amplificación por PCR y clonación de los constructos que contienen los dominios LOV en plásmidos pRS423 (pRS423-WC1 o WC1 , SEC N° 25) y pRS425 (pRS425-VVD o VVD, SEC N° 26) para selección auxotrofica por HIS3 y LEU2, respectivamente. Todos los experimentos y constructos genéticos fueron generados usando clonación por recombinación mediante ensamblaje in vivo.
Tabla 2. Plásmidos utilizados en los ejemplos de la presente invención, generados usando clonamiento recombinante en levadura.
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La versión sintética del promotor pGAL1 (SEC N° 27), llamada p5XGAL1 (SEC N° 28), que lleva cinco sitios de unión a DNA para el factor de transcripción Gal4 (GAL4-UAS) fue sintetizada usando el servicio de síntesis Genewiz. En el ensamble de constructos, los promotores pGAL1 (SEC N° 27) y p5XGAL1 (SEC N° 28), fueron amplificados por PCR usando Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo scientific, USA). Adicionalmente, la resistencia a antibiótico KanMx fue también amplificada por PCR e incluyó los constructos genéticos en la dirección reversa, la superposición entre productos de PCR fue de 50 bp. Los productos de PCR fueron co-transformados con el plásmido lineal pRS426 en la cepa de levadura BY4741 para clonamiento por recombinación en levadura. Los plásmidos circulares generados en levadura fueron transferidos a la cepa E. coli DH5a y fue analizada por PCR de colonias bajo condiciones estándar, dos clones fueron seleccionados para secuenciación usando el servicio de secuenciación Macrogene. Las cepas BY4741 wt y BY4741 con deleciones en GAL4 y GAL80, fueron transformadas con los constructos genéticos completos (KanMxRV-pGAL1 con SEC N° 30 o KanMxRv-p5XGAL1 con SEC N° 31), que fueron amplificados por PCR usando Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo scientific, USA) y partidores de 70 bp para recombinación homologa directa en el locus diana, permitiendo el intercambio de la región del promotor. El intercambio de promotor de FL01, FL011 y TUP1 fue confirmado por PCR en condiciones estándar, los partidores usados para ensamble de plásmidos, intercambio de promotor y confirmaciones de intercambio de promotores se muestran en Tablas 3, 4 y 5. Tabla 3. Cebadores usados para construcción de plásmidos usando clonamiento recombinante.
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Tabla 4. Cebadores usados para intercambio de promotores.
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Tabla 5. Cebadores usados para confirmar intercambio de promotores.
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El mismo procedimiento de ensamble fue seguido para construir diferentes versiones del gen reportero luciferasa bajo el control de promotores pGAL1 y p5XGAL1. La deleción de GAL4, GAL80 e integraciones de gen reportero luciferasa en locus GAL3 fue llevado a cabo usando una estrategia de deleción por recombinación por PCR en un paso. Los partidores usados para deleción del gen e integración del gen reportero en el genoma se lista en Tablas 6 y 7.
Tabla 6. Cebadores usados para eliminar genes y para integrar el gen reportero al genoma.
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Tabla 7. Cebadores usados para comprobar las eliminaciones e integraciones en el genoma.
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Ensayos de western blot (WB) y expresión de luciferasa.
Hemos usado un luciferasa desestabilizada descrita anteriormente para la cuantificación de la expresión génica en levadura. Hemos clonado en el plásmido pRS426 (SEC N° 29) el gen reportero luciferasa bajo el control de promotores pGAL1 y p5XGAL1 usando clonación por recombinación en levadura como hemos descrito anteriormente. La expresión de luciferasa fue medida en el tiempo bajo condiciones de DD y LL usando un lector de microplacas Cytation 3 (Biotek, USA). La expresión de luciferasa en medio de cultivo Se se normalizó por OD (600 nm) del cultivo de levaduras, todos los experimentos se realizaron en seis réplicas biológicas.
La enzima limoneno sintasa de Cannabis sativa fue optimizada en sus codones para S. cerevisiae (secuencia nucleotídica SEC N° 21 , secuencia aminoacídica SEC N° 22) y clonado en el vector de expresión pYES2 (pYES-LS-V5) (SEC N° 32). La cepa BY4741 wt fue co- transformada con pYES-LS-V5 (SEC N° 32) más pRS423-WC1 (SEC N° 33) y pRS425-VVD (SEC N° 34). Las cepas que llevan los tres plásmidos fueron cultivadas en condiciones de DD y LL hasta obtener OD600=1 , y se realizó la extracción de proteína celulares de levadura. Usamos un total de 25 μg de proteína total de cada una de las muestras para ensayos de western blot, que fueron conducidos en tres réplicas biológicas con un anticuerpo a-V5 (Invitrogen, USA), usando una dilución de 1/500.
Fenotipos de floculación.
Las cepas portadoras del intercambio de promotor en FL01 (secuencia nucleotídica SEC N° 13, secuencia aminoacídica SEC N° 14), FL011 (secuencia nucleotídica SEC N° 15, secuencia aminoacídica SEC N° 16) y TUP1 (secuencia nucleotídica SEC N° 17, secuencia aminoacídica SEC N° 18) fueron co-transformadas con el plásmido pRS423-WC1 (SEC N° 32) y pRS425-VVD (SEC N° 34), y se evaluaron bajo condiciones de DD y LL. Imágenes y análisis del fenotipo de floculación fueron tomadas después de 24 horas de crecimiento en frascos de cultivo bajo condiciones DD o LL. Adicionalmente, las cepas fueron transformadas con un plásmido pRS426 que lleva mCherry controlado por el promotor PTDH3 (pRS426- mCherry, SEC N° 35), imágenes de células de levadura fueron tomadas con microscopía de campo claro y fluorescencia utilizando un microscopio modelo Cytation 3 (BioTek, USA).
La floculación de cada cepa se cuantificó por OD 600 nm mediante el índice de floculación, el cual se calculó como la diferencia de OD en un cultivo de levadura después de 30 min de incubación estática: 1- (OD Final/OD inicial).
EJEMPLO 2: Aplicación del sistema de expresión optogenético de la invención para controlar la expresión de un gen reportero: Luciferasa (LUC)
En este primer ejemplo, se buscó implementar en levadura el sistema optogenético de acuerdo a la presente invención, basado en luz azul para controlar la expresión génica.
Las construcciones genéticas fueron diseñadas in silico y ensambladas in vivo usando clonamiento por recombinación en levadura.
Con el objetivo de implementar un interruptor sintético de acuerdo al sistema de expresión optogenético de la presente invención, basado en la interacción WC1-VVD, usamos los plásmidos pMB1 (SEC N° 23) y pMB2 (SEC N° 24) previamente descritos (Malzahn et al., 2010). Usamos los plásmidos pMB1 (SEC N° 23) y pMB2 (SEC N° 24) para amplificación por PCR y clonación de los constructos que contienen los dominios LOV en plásmidos pRS423 (pRS423-WC1 o WC1) (SEC N° 33) y pRS425 (pRS425-VVD o WD) (SEC N° 34) para selección auxotrófica por HIS3 y LEU2, respectivamente. Así, en respuesta a la estimulación con luz, la interacción WC1-VVD a través de sus dominios LOV activa la transcripción del gen reportero luciferasa (Luc) bajo el control de los promotores pGAL1 y p5XGAL1 (Figura 1A).
Co-transformamos la cepa BY4741 wt con los plásmidos pRS423-WC1 (SEC N° 33) y pRS425-VVD (SEC N° 32) más el plásmido que contiene pGAL1-Luc (SEC N° 36) o p5XGAL1- Luc (SEC N° 37), y evaluamos la expresión de luciferasa de las cepas bajo condiciones de luz constante (LL) y oscuridad constante (DD). Los resultados mostraron altos niveles de expresión bajo condiciones LL con bajos niveles de expresión en DD (Figura 1 B), mostrando una inducción máxima de luciferasa de 1258 veces (LL/DD) bajo el control de pGAL1 (SEC N° 27) y 315 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (SEC N° 28) (Figura 1 F). Dado que el sistema sintético (mencionado en adelante como sistema WC1-VVD) está basado en la reconstitución del factor de transcripción GAL4, y con el objetivo de aumentar los niveles de expresión del gen reportero, desarrollamos una cepa BY4741 con deleciones de GAL4 y GAL80 (ga!4A-gal80A) y evaluamos el sistema WC1-VVD en este fondo genético bajo condiciones LL y DD. Los resultados mostraron los mayores niveles de expresión del gen reportero en LL (Figura 1C), con una inducción máxima de luciferasa 3386 veces bajo el control de promotor pGAL1 (SEC N° 27) y 4116 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (SEC N° 28) (Figura 1 F). Esto representó un aumento de 13 veces en la expresión de luciferasa bajo control del promotor p5XGAL1 (SEC N° 28) en la cepa gal4A-gal80A con respecto al fondo genético tipo silvestre. En general, los altos niveles de expresión de luciferasa confirmaron la activación del sistema WC1-VVD en respuesta a estimulación de luz.
Además, integramos el gen reportero luciferasa en el locus GAL3 de cepas BY4741 wt y BY4741 gal4A-gal80A. Medimos la expresión del gen reportero luciferasa activado por el sistema WC1-VVD en estas dos cepas bajo condiciones LL y DD, mostrando en ambos fondos genéticos, altos niveles de expresión en LL con baja expresión de fondo en DD (Figura 1 D y E). Una expresión máxima de luciferasa de 55 veces y 21 veces para promotores pGAL1 y p5XGAL1 fue observada en la cepa BY4741 wt (Figura 1G). Niveles comparables de expresión de luciferasa fueron observados en la cepa BY4741 gal4A/gal80A, con 56 veces y 96 veces para promotores pGAL1 (SEC N° 27) y p5XGAL1 (SEC N° 28), respectivamente (Figura 1G).
En conclusión, estos resultados demuestran la factibilidad del sistema WC1-VVD para controlar dinámicamente la expresión de luciferasa, episomalmente y también integrada en el genoma de la levadura, abriendo la posibilidad de controlar promotores endógenos, y en definitiva, modular los fenotipos de levadura por la luz.
EJEMPLO 3: Expresión de proteínas heterólogas controladas por luz
Exploramos la posibilidad de expresar proteínas heterólogas por estimulación de luz. Por lo tanto, optimizamos los codones para la expresión del gen de Limoneno Sintasa (LS) de Cannabis sativa (secuencia aminoacídica SEC N°21 , secuencia aminoacídica SEC N° 22), y clonamos este gen en un plásmido pYES2 (pYES2-LS-V5) (SEC N°32), permitiendo el control del promotor pGAL1 (SEC N°27) y marcando con V5 la proteína (Figura 4A). Co- transformamos la cepa BY4741 con el sistema WC1-VVD más el plásmido pYES2-LS-V5 (SEC N°27) y analizamos los niveles de proteínas mediante western-blot en condiciones LL y DD. Estos resultados mostraron un alto nivel de expresión de LS en LL con bajo fondo en DD, y comparable con los niveles de proteína obtenida por inducción con galactosa (Figura 4B y C). El sistema WC1-VVD mostró una inducción de proteína de 110 veces (LL/DD), 2,5 veces mayor que la inducción por galactosa/glucosa (inducción promedio de 44 veces) (Figura 4D). Además, se evaluó la expresión de la proteína después de 2 horas en pulsos de luz azul y luz blanca, mostrando altos niveles de expresión de proteínas sin diferencias entre ambas fuentes de luz. En general, los resultados demuestran la factibilidad del sistema WC1-VVD para expresión de proteínas heterólogas, con una inducción superior que la inducción química con galactosa.
EJEMPLO 4: Aplicación del sistema de expresión optogenético de la invención para controlar la floculación de levaduras, tanto en condiciones de luz constante (LL) como de oscuridad constante (DD)
Con el fin de modular los fenotipos de levadura por la luz, hemos usado el sistema de expresión optogenético de la presente invención para controlar el fenotipo de floculación en la levadura. Inicialmente, hemos intercambiado los promotores endógenos de FL01, FL011 y TUP1 por los promotores pGAL1 (SEC N°27) y p5XGAL1 (SEC N°28) en la cepa BY4741 wt. Confirmamos el intercambio correcto de los promotores endógenos creciendo en cepas en galactosa y glucosa como fuentes de carbono. Usando microscopía de campo brillante observamos una fuerte agregación celular en cepas con intercambio del promotor de FL01 y agregación celular moderada en cepas con intercambio del promotor de FL011, cuando las células se crecieron en galactosa. Como era de esperar, el intercambio de promotor en TUP1 mostró una fuerte agregación celular en glucosa pero no en galactosa, confirmando el fenotipo de floculación por inactivación de TUP1 y el fenotipo opuesto por su expresión en galactosa. En general, nuestros resultados mostraron el correcto intercambio de promotor para estos tres genes relacionados a la floculación de levadura.
Utilizamos estas cepas para introducir episomalmente el sistema WC1-VVD y controlar la floculación por luz. Microscopía de fluorescencia de células de levadura expresando mCherry mostraron altos niveles de agregación celular en LL y poca o ninguna agregación en DD, para cepas con intercambio de promotor FL01 y que llevan el sistema WC1-VVD. Un fenotipo de floculación moderada se observó en LL para cepas con intercambio de promotor FL011; y el fenotipo opuesto de agregación celular fue observado en cepas con intercambio de promotores para TUP1 que llevan el sistema WC1-VVD, mostrando altos niveles de agregación celular en DD pero no en LL. El fenotipo de agregación celular observada en las cepas con diferentes intercambios de promotores y que llevan el sistema WC1 -VVD fue confirmado por microscopía de campo claro. El fenotipo de floculación macroscópico observada en frascos de cultivo se confirmó con el índice de floculación de cada cepa. Los resultados mostraron diferencias significativas (t-test, p<0,01) en el índice de floculación entre condiciones LL y DD, para cepas con el intercambio de promotores para FL01 y TUP1 que llevan el sistema WC1-VVD (Figura 2). En general, los resultados demostraron la viabilidad del sistema WC1-VVD para controlar el fenotipo de floculacion en levadura.
La reversibilidad del fenotipo de floculacion fue evaluada bajo diferentes condiciones de LL y DD. Inicialmente, se crecieron las cepas 24 horas en LL seguido por 24 horas en DD, mostrando una fuerte floculacion en las cepas con el intercambio de promotor en FL01 que llevan el sistema WC1-VVD (Figura 3A y C). Sin embargo, las cepas con intercambio de promotor para TUP1 más el sistema WC1-VVD, mostraron floculacion en DD y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en LL (Figura 3B y D). Luego, evaluamos los fenotipos de floculacion creciendo las cepas 24 horas en DD seguido por 24 horas en LL, mostrando floculacion en LL y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en DD para las cepas con el intercambio de promotor en FL01 más el sistema WC1-VVD (Figura 3A y E). Como era de esperar, cuando crecimos las cepas con el intercambio de promotor en TUP1 y con el sistema WC1-VVD durante 24 horas en LL, observamos un fenotipo sin floculacion, que estuvo totalmente activo después de 24 horas de DD (Figura 3B y F). En conclusión, los resultados mostraron una fuerte activación del fenotipo de floculacion, especialmente desde la condición de no floculacion a condición de floculacion, y mostrando las potenciales aplicaciones de este interruptor sintético para fermentaciones industriales.
APLICACIÓN INDUSTRIAL
La presente invención tiene una gran aplicación en la industria biotecnológica, puesto que permite un gran avance en la inducción de la expresión de proteínas por medio de la luz, lo que representa grandes ventajas con respecto a métodos tradicionales de inducción química. Así también, la presente invención brinda una innovadora aplicación para el control de la floculacion de levaduras, permitiendo que cepas de interés floculen en condiciones de LL o en condiciones de DD, dependiendo de cómo se implemente el sistema.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Sistema de expresión optogenético CARACTERIZADO porque comprende al menos: a. un primer fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de unión a DNA;
b. un segundo fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de trans-activación;
c. un factor de transcripción funcional formado por la interacción del primer fotorreceptor y del segundo fotorreceptor, donde en presencia de luz ambos fotorreceptores sufren un cambio conformacional que permite que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de transactivación asociado al segundo fotorreceptor formen dicho factor de transcripción funcional, donde dicho factor de transcripción funcional es capaz de unirse a elementos de respuesta presentes en un promotor específico, y
d. al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de interés, donde la expresión de dicha proteína de interés se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.
2. Sistema de expresión optogenético de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N°3, secuencia aminoacídica SEC N°4), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N°9, secuencia aminoacídica SEC N°10), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N°7, secuencia aminoacídica SEC N°8), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N°11 , secuencia aminoacídica SEC N°12).
3. Sistema de expresión optogenético de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N°3, secuencia aminoacídica SEC N°4), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N°11 , secuencia aminoacídica SEC N°12), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N°7, secuencia aminoacídica SEC N°8), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N°9, secuencia aminoacídica SEC N°10).
4. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, CARACTERIZADO porque comprende los pasos de:
a. transformar una célula hospedera de manera que sea capaz de expresar un sistema de expresión optogenético que comprende al menos:
i. un primer fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de unión a DNA;
¡i. un segundo fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de trans-activación;
Ni. un factor de transcripción funcional formado por la interacción del primer fotorreceptor y del segundo fotorreceptor, donde en presencia de luz ambos fotorreceptores sufren un cambio conformacional que permite que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen dicho factor de transcripción funcional, donde dicho factor de transcripción funcional es capaz de unirse a elementos de respuesta presentes en un promotor específico, y
iv. al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de interés, donde la expresión de dicha proteína de interés se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior;
b. exponer a la luz a la célula hospedera transformada de manera de promover el cambio conformacional tanto del primer fotorreceptor como del segundo fotorreceptor de manera que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen el factor de transcripción funcional, y así permitir la unión de dicho factor de transcripción funcional a elementos de respuesta presentes en un promotor específico;
c. expresar una proteína de interés que se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.
5. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4, y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4.
6. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de transactivación de GAL4, y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4.
7. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el promotor es pGAL1 o p5XGAL1.
8. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la célula hospedera es una levadura.
9. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la levadura es Saccharomyces cerevisiae.
10. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la proteína de interés es luciferasa.
1 1 . Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la proteína de interés es limoneno sintasa.
12. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la proteína de interés es TUP
13. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la proteína de interés es FL011.
14. Método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la proteína de interés es FL01.
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