WO2018091479A1 - Procédé de purification d'iridals - Google Patents

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WO2018091479A1
WO2018091479A1 PCT/EP2017/079233 EP2017079233W WO2018091479A1 WO 2018091479 A1 WO2018091479 A1 WO 2018091479A1 EP 2017079233 W EP2017079233 W EP 2017079233W WO 2018091479 A1 WO2018091479 A1 WO 2018091479A1
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iridals
water
solvent
iris
phase
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PCT/EP2017/079233
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Victor SAYOUS
Pierre WAFFO TEGUO
Jean-Michel Merillon
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Universite de Bordeaux
Original Assignee
Universite de Bordeaux
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1892—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns the sorbent material moving as a whole, e.g. continuous annular chromatography, true moving beds or centrifugal chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C07C403/14—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains substituted by doubly-bound oxygen atoms
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    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C07C403/24—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains substituted by six-membered non-aromatic rings, e.g. beta-carotene

Definitions

  • the present invention relates to a process for the purification of iridals, preferably cyclic bicyclic acid, by centrifugal partition chromatography. It also relates to the composition obtainable according to the process above, as well as to the use of this composition for the preparation of irones. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • Iridals are triterpenoids of plant origin, derived from plants of the family Iridaceae, which are sought for their pharmaceutical properties, especially anti-cancer, and which are especially the subject of special attention as precursors of irones.
  • Irones are indeed molecules with the typical smell of violets, which constitute the fragrant principle of Iris Absolute, which is very popular in perfumery not only for its odoriferous properties, but also for its ability to attach perfumes. .
  • the direct extraction of irones from plants of the family Iridaceae poses a number of technical problems. In particular, the production of irones is currently done by extracting Iris rhizomes aged two or three years and stored for several years for maturation at room temperature.
  • This stage of maturation is essential for the oxidative degradation of irone precursors, the iridals, in irones.
  • the irones are then recovered by steaming the ground rhizomes, and washing the iris butter thus obtained with an aqueous alkaline solution, or by extracting the rhizomes with an organic solvent, for obtain a resinoid, followed by separation of the irones (the absolute) by dissolving the residue in ethanol.
  • 500 mg of irones are obtained from a kilogram of dried rhizomes. It is understood that these processes are long and expensive, because of the slow maturation of rhizomes, essential to obtain irones having the desired olfactory quality.
  • the extract containing the iridals may be fractionated by countercurrent or thin layer chromatography, in particular, and then the iridals may be purified by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Countercurrent Chromatography is a separation technique using a two-phase system of liquid solvents to separate and / or purify compounds from a complex extract, based on the partition coefficient (Kp) of solutes in the two liquid phases.
  • Kp partition coefficient
  • CCC hydrodynamic devices
  • the column is constituted by a PTFE tube (Teflon ® ) of variable section and of great length, wound around a coil and rotated about an axis, itself subjected to a rotation around a second axis.
  • Teflon ® PTFE tube
  • This double planetary rotation allows the progression of solutes in the tube and the creation a periodically variable gravitational field, inducing in the same tube the formation of an emulsion and its decantation.
  • CPCs hydrostatic type devices
  • individualized cells are interconnected and rotated about a single axis responsible for a constant centrifugal force field.
  • CCC has been applied to the purification of various compounds present in petal, seed or iris root extracts, such as stilbene derivatives (CN 105085453), flavones and isoflavones (CN102329351; CN 101906091; CN101357933) and quinones (CN102649722; CN103694098).
  • stilbene derivatives CN 105085453
  • flavones and isoflavones CN102329351; CN 101906091; CN101357933
  • quinones CN102649722; CN103694098
  • CPC centrifugal partition chromato graphy
  • the present invention thus provides a simple, inexpensive and effective method of purifying iridals which results in iridals of sufficient purity for use as such, especially in the pharmaceutical industry, or for transformation into irones having good olfactory and aromatic properties.
  • the subject of the invention is a process for purifying iridals, preferably bicycloiridals, contained in a starting composition, comprising mixing the starting composition with an aqueous phase and an organic phase, and then treating said mixture by chromatography.
  • centrifugal partitioning device using a liquid stationary phase and a liquid mobile phase, one of which consists of said aqueous phase and the other of said organic phase, characterized in that the aqueous phase consists of water and optionally of at least one water-miscible organic solvent and the organic phase consists of a mixture of at least one water-immiscible solvent, formed from an optionally halogenated hydrocarbon, and at least one solvent that is partially miscible with water. the water.
  • a composition in particular a plant extract, obtainable according to the process above.
  • the invention also relates to the use of this composition for the preparation of irones.
  • the purification process according to the invention aims at enriching a starting composition in iridals.
  • This starting composition can in particular be obtained by means of a solvent extraction process of a raw material chosen from: a plant extract containing iridals, a mixture containing iridals produced by plant cells producing iridals or by microorganisms producing iridals, and a mixture obtained by organic synthesis containing iridals.
  • the starting composition is a plant extract, preferably obtained by a method of solvent extraction of a plant material chosen from whole plants or parts of plants of the family of plants.
  • Plant part means at least one of the aerial parts (buds, stems, leaves, flowers) or underground (roots, rhizomes) of the plant, preferentially its aerial parts and / or its rhizomes, more preferably its rhizomes.
  • the rhizomes and / or leaves of a plant of the genus Iris in particular of the species Iris germanica, Iris pallida, Iris florentina, Iris versicolor, Iris sibirica or Iris pseudacorus.
  • the plant of the family Iridaceae is selected from Iris pallida.
  • the plant material is peeled, crushed, milled and / or dried prior to solvent extraction.
  • the solvent used for the extraction of iridals may be any suitable organic solvent, such as an alcoholic solvent, in particular methanol or ethanol, a chlorinated solvent, such as methylene chloride or dichloroethane, or an aromatic or aliphatic hydrocarbon, such as benzene or hexane, generally at the reflux temperature of the solvent; it is possible to use solvent mixtures or to carry out two successive extractions with different solvents. It is better to use solvents alcoholic or chlorinated, which are better solvents of the terpene compounds than hydrocarbons and, better still, methanol, 70% ethanol and methylene chloride.
  • the extraction solvent may comprise a C 1 -C 3 alkyl lactate such as methyl or ethyl lactate and more preferably ethyl lactate.
  • Such an extraction process particularly preferably comprises the successive steps of:
  • the raw material is brought into contact with an extraction solvent comprising an alkyl lactate, generally a C 1 -C 3 alkyl lactate and preferentially methyl lactate or methyl lactate. ethyl, better, ethyl lactate.
  • the extraction solvent further comprises ethanol, in a volume ratio of ethanol to alkyl lactate of between 5 and 80% and preferably between 20 and 50%.
  • the process further comprises a step b ') of evaporation of ethanol, preferably at a temperature below 40 ° C, more preferably at a temperature of 28 to 35 ° C, after step b ) of filtration and before step c).
  • the extraction solvent contains no other solvent than alkyl lactate and optionally ethanol.
  • This contacting step may be carried out by any suitable physical method and in particular by maceration, ultrasonic mixing or microwave passage of the mixture of the raw material containing iridals with the alkyl lactate.
  • This step is generally carried out with stirring, at a temperature of 0 to 40 ° C., preferably of 20 to 25 ° C., for a duration ranging, for example, from 20 to 72 hours, in particular from 40 to 60 hours.
  • the amount of solvent used must be sufficient to wet the raw material and may for example be between 1 and 2 liters of solvent per kilogram of raw material, for example plant material.
  • the resulting suspension is then treated to remove the solid fraction and recover the liquid fraction.
  • This treatment step can be carried out by filtration, centrifugation or by means of a membrane, preferably by filtration.
  • the liquid fraction contains the desired terpenic compounds solubilized in alkyl lactate.
  • the alkyl lactate can not be evaporated, the inventors have developed a simple and inexpensive method to break the solubility of terpene in the mixture, consisting of diluting the liquid fraction with water, so as to increase the polarity of this fraction and thus to obtain a homogeneous mixture containing water and alkyl lactate and a colloid containing the desired iridals, which are not soluble in the mixture of water and alkyl lactate.
  • the volume ratio of water to liquid fraction is generally between 10: 1 and 50: 1, for example between 10: 1 and 20: 1.
  • the colloid can then be recovered by any appropriate means, in particular by filtration or by use of flocculating agents or by centrifugation.
  • the iridals may not be recovered at this stage, but after a freeze / thaw step which will be described hereinafter.
  • part of the iridals can be recovered in this step and another part in the rest of the process, as described below.
  • the method according to the invention then comprises a step of freezing the mixture (without or without the colloid) to obtain a heavy phase containing ethyl lactate, a light phase containing water in solid form and optionally an intermediate phase containing iridals that were not recovered in the previous step.
  • the freezing step makes it possible to separate the alkyl lactate from the water and / or the desired compounds, overcoming the problems related to the low volatility of alkyl lactate.
  • This step is carried out at a temperature of -5 to -25 ° C, preferably -10 to -20 ° C, for a sufficient time (for example from 1 to 10 days) to observe a phase separation between the ethyl lactate, which will be the heavy phase of the mixture, and water, less dense than ethyl lactate and which will be the light phase of the mixture.
  • the process comprises an additional step of melting the mixture, generally by bringing it back to room temperature, so as to be able to recover the alkyl lactate, then the intermediate phase containing the desired iridals. . If necessary, one or more freezing cycles can be implemented. The steps of freezing / thawing / recovery of the alkyl lactate (steps e) to g) of the process according to the invention) can be repeated to obtain a purified heavy phase.
  • This method may further comprise a step of mixing the colloid recovered in step d) with the intermediate phase from step g).
  • the yield of the extraction process according to the invention, as well as the chemical nature of the iridals obtained, will depend on the starting composition, for example of the plant material, implemented.
  • the iridals may thus be in reduced form, or if necessary in oxidized form, or dehydrated, leading to cyclic or polymerized structures.
  • the iridals side chain may comprise double bonds resulting from dehydration or dehydrogenation of natural iridals, or may be hydroxylated. They can also be obtained in hydroxylated or esterified form, for example with fatty acids, or etherified.
  • the term "iridal” covers all these variants. This term also designates both mono-cycloiridals and bicycloiridals and mixtures thereof.
  • Monocycloiridals include especially iridal (21-deoxy-iridogermanal), 16-O-acetylisoiridogermanal, 17-hydroxyiridal, 26-hydroxyiridal, 17,26-dihydroxyiridal, 21-hydroxyiridal (iridogermanal). ), 10-deoxy-21-hydroxyiridal (10-deoxy-iridogermanal), 10-deoxy-17-hydroxyiridal, iriversical, 16,17-didehydro-26-acetoxy-iriversical, 16,17-didehydro -iridal, 16,17-didehydro-26-hydroxy-iridal and 17,29-didehydroiridal.
  • Bicycloiridals include iriflorental, iripallidal, ⁇ -irigermanal, ⁇ -irigermanal and deoxy-iripallidal.
  • the present invention is more particularly concerned with the purification of a starting composition containing bicycloiridals and in particular iripallidal and / or iriflorental.
  • the starting composition, containing iridals, is purified by centrifugal partition chromatography (CPC) according to the present invention.
  • the CPC column used to implement the method according to the invention may consist of a rotor formed by a stack of stainless steel discs on which radially distributed cells are etched.
  • the seal between the disks is provided by PTFE seals (Teflon ® ) of the same diameter, as described in particular in the application WO 00/58722. Columns of this type are available from KROMATON.
  • the starting composition is mixed with an aqueous phase and an organic phase, before being injected into the CPC column.
  • aqueous phase is meant here a phase consisting of water and optionally at least one, and preferably only one, organic solvent miscible with water, that is to say which can be solubilized in water. water in all proportion. It can be ethanol or methanol, preferably methanol.
  • organic phase is meant here a phase consisting of a mixture of at least one, and preferably only one, water immiscible solvent, formed of an optionally halogenated hydrocarbon, and at least one preferably a single solvent partially miscible with water.
  • the optionally halogenated hydrocarbon may in particular be chosen from hydrocarbons aliphatics, such as hexane, heptane and cyclohexane, and halogenated hydrocarbons, such as chloroform, dichloromethane and dichloro-2,2-ethane. Heptane is preferred for use in the present invention.
  • partially water-miscible solvent a solvent capable of dissolving in water at the level of 0.1 to 10 g of solvent per 100 ml of water at 25 ° C.
  • solvents are C2-C4 alkyl acetates, particularly ethyl acetate.
  • the starting composition may further be mixed with a "bridge solvent", i.e. a solvent that is at least partially soluble in water and in the water. hydrocarbons, that is to say at least 4 g per 100 ml of water and at least 4 g per 100 ml of hydrocarbon at 25 ° C.
  • the bridge solvent is therefore at least partially miscible with the aqueous phase and with the organic phase. It may be in particular a C 1 -C 3 alkyl lactate, advantageously ethyl lactate.
  • the organic phase consists of a mixture of heptane and ethyl acetate.
  • the volume ratio of heptane to ethyl acetate can be between 1: 1 and 2: 1, more preferably the volume ratio heptane: ethyl acetate is 1.5: 1. that the aqueous phase consists of a mixture of methanol and water.
  • the volume ratio of methanol to water is advantageously between 1: 1 and 2: 1. More preferably, the ratio by volume methanol: water is 1.5: 1.
  • the total amount of solvents used, as well as their relative proportions, are determined in such a way that the constituents of the starting composition are completely solubilized, if necessary by resorting to agitation of the mixture or even to the use of ultrasound.
  • the starting composition may, for example, be dissolved in a mixture of the aqueous and organic phases, in a volume ratio of the aqueous phase to the organic phase of 40:60 to 60:40, preferably 50:50.
  • the mixture of the starting composition with the aqueous phase, the organic phase and optionally the bridge solvent is treated by centrifugal partition chromatography using a liquid stationary phase and a liquid mobile phase.
  • the stationary phase may consist of said aqueous phase and the mobile phase of said organic phase, or the reverse.
  • the column is filled with the stationary phase at a flow rate ranging for example from 10 to 80 mL / min, by rotating the rotor, for example at a speed of 300 to 700 revolutions / min.
  • the column is then equilibrated by percolating the mobile phase through the stationary phase by means of a pump, at a flow rate ranging for example from 5 to 20 ml / min, until a hydrodynamic equilibrium is reached.
  • the speed of rotation of the rotor is then generally between 800 and 1000 revolutions / min.
  • composition to be purified is then introduced into the column via an injection valve, equipped for example with a loop of 50 ml, and the elution is carried out at a flow rate generally between 5 and 30 ml / min, preferably 20 mL / min.
  • the chromatography can be carried out in ascending mode, in which case the stationary phase is the aqueous phase. Alternatively, it can be done in descending mode, in which case the stationary phase is the organic phase. It is preferred that the mobile phase is introduced into the riser column.
  • the compounds are eluted at the outlet of the column as a function of their partition coefficient in the biphasic solvent system chosen.
  • the detection of iridals is carried out in the UV range around 240 nm, in particular using a UV-visible detector, for example a detector with a diode array. If necessary, the iridals can then be separated by any appropriate technique, including high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • composition enriched in iridals containing at least 50% by weight, preferably at least 60% by weight, or even at least 70% by weight, iridals, preferably bicycloiridals.
  • the purified iridals obtained according to the process of the present invention may advantageously be used as pharmaceutical active ingredients, especially in the treatment of cancers or malaria.
  • they are generally included in an effective amount in a composition comprising a pharmaceutically acceptable medium, particularly adapted for oral administration or by intravenous, subcutaneous or intramuscular injection.
  • the iridals can be converted to irons according to any method known to those skilled in the art, for use as perfume components in the cosmetics industry or perfumery or as food flavorings.
  • the conversion of iridals to irones can in particular be carried out microbiologically, in particular enzymatically, in the presence of a peroxidative system comprising hydrogen peroxide. and a peroxidase or oxygen and a lipoxygenase, optionally in the presence of a substrate of the enzyme (as described in particular in EP 0 443 926), or by subjecting the iridals to the action of a microorganism of the genus Botryotinia or Sclerotinia or by permanganic oxidation (as described in particular in FR 2 620 702).
  • the desired irone can then be obtained by steam distillation, hydrodistillation or extraction using a supercritical fluid or a solvent immiscible with water.
  • FIG. 1 represents the HPLC chromatogram at 242 nm of the Iris pallida extract obtained according to Example 1, by extraction with ethyl lactate, as well as the UV-visible spectra a) to c) of the compounds at 14.996 min. , 16.671 min and 16.244 min, respectively.
  • Figure 2 illustrates the HPLC chromatogram at 242 nm of fraction B obtained by centrifugal partition chromato graphy of the Iris pallida extract.
  • An iridals-enriched extract was prepared from rhizomes of Iris pallida.
  • the ethyl lactate was removed by means of the bottom tap, then the upper and intermediate phases were filtered and centrifuged to recover all the aggregates formed. The material thus recovered was taken up with a minimum volume of ethanol, so as to clean the filters and equipment. Finally, after adding water and evaporation of the alcohol, the desired compounds were lyophilized. 12 g of a powder rich in iridals was obtained, ie a yield of 0.8% from the fresh rhizomes.
  • the extract obtained as described above was analyzed by HPLC.
  • the analysis was carried out using an Agilent®1100 HPLC chain equipped with a degasser, a low pressure quaternary pump, an autosampler, a UV-Visible-DAD detector (200 nm at 800 nm) and a Prontosil C 18 column (250 x 4.0 mm; 5 ⁇ , 120A).
  • the mobile phase was composed of water (solvent A) and acetonitrile (solvent B). Elution was performed at 1 mL / min depending on the gradient described in Table 1. 10 ⁇ ⁇ of a methanolic solution of the extract at 2 mg / mL are injected. Detection was performed at 242 nm and 280 nm.
  • the peaks of the compounds between 14 and 17 min are all compounds of the family of bicycloiridals. These bicycloiridals have an absorption maximum close to 240 nm.
  • the peak at the retention time of 14.996 min corresponds to the iriflorental and that to 16.761 to the iripallidal.
  • the 3rd peak at 16.244 min may correspond to an isomer of previous bicycloiridals.
  • the assay on the crude extract indicates that it is composed of 15% Iriflorental and 17.6% Iripallidal, a total for both bicycloiridals of 33.6%.
  • the column was then equilibrated by passing the mobile phase, composed of a mixture of heptane and ethyl acetate (60% / 40%), with a flow rate of 20 ml / min at 900 rpm. .
  • the dead volume (Vm) was 170 mL.
  • the sample to be purified was injected into the column, using a high pressure Rhéodyne ® injection valve equipped with a 50 mL injection loop. Elution was carried out with a flow rate of 20 ml / min.
  • the compounds were recovered at the column outlet according to their partition coefficient.
  • the compounds were detected at four wavelengths: 210 nm, 242 nm, 254 nm and 280 nm, using an ECOM Flash 06DAD detector.
  • the bicycloiridals were eluted between 40 and 60 min.
  • the chromatogram of this fraction consisted mainly of two peaks B4 and B5.
  • the compounds corresponding to these peaks were separated by preparative HPLC, with a stationary phase identical to that of the analytical HPLC.
  • the pure products were then characterized by NMR and mass spectrometry coupled with ultra high performance liquid chromatography (UHPLC-MS).
  • UHPLC-MS ultra high performance liquid chromatography
  • Their structure has been confirmed as that of iriflorental (B4) and iripallidal (B5), in comparison with the literature (Krick et al., 1983, Z. Naturforsch, 38C, 179-184, Masson et al. ., Journal of Chromato graphy, A 1368 (November 14, 2014): 143-54).
  • compound B6 possesses the same mass and the same fragments, as well as the same UV-visible spectrum, as iripallidal and iriflorental, so that it would probably be isomer of B4 and B5.
  • the CPC yield (addition of all fractions) is 79%.
  • the recovery rate of iridals from the crude extract is 62.2%. Iridals are obtained with a purity of more than 75%.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de purification d'iridals, de préférence de bicycloiridals, par chromatographie de partage centrifuge utilisant un système de solvants particulier. Elle porte également sur la composition susceptible d'être obtenue suivant le procédé ci-dessus, ainsi que sur l'utilisation de cette composition pour la préparation d'irones.

Description

PROCEDE DE PURIFICATION D'IRIDALS
OBJET DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de purification d'iridals, de préférence de bicycloiridals, par chromatographie de partage centrifuge. Elle porte également sur la composition susceptible d'être obtenue suivant le procédé ci-dessus, ainsi que sur l'utilisation de cette composition pour la préparation d'irones. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
Les iridals sont des triterpénoïdes d'origine végétale, issus des plantes de la famille des Iridacées, qui sont recherchés pour leurs propriétés pharmaceutiques, notamment anticancéreuses, et qui font surtout l'objet d'une attention particulière en tant que précurseurs d'irones. Les irones sont en effet des molécules à l'odeur typique de violette, qui constituent le principe odorant de l'absolu d'Iris, lequel est très prisé en parfumerie non seulement pour ses propriétés odoriférantes, mais également pour sa capacité de fixation de parfums. L'extraction directe des irones à partir des plantes de la famille des Iridacées pose un certain nombre de problèmes techniques. En particulier, la production d'irones se fait actuellement par extraction de rhizomes d'Iris âgés de deux ou trois ans et stockés plusieurs années pour maturation à température ambiante. Cette étape de maturation est indispensable à la dégradation oxydative des précurseurs d'irones, les iridals, en irones. Les irones sont ensuite récupérées par entraînement à la vapeur d'eau des rhizomes matures broyés, et lavage du beurre d'iris ainsi obtenu par une solution aqueuse alcaline, ou bien par extraction des rhizomes à l'aide d'un solvant organique, pour obtenir un résinoïde, suivie d'une séparation des irones (l'absolu) par dissolution du résidu dans l'éthanol. On obtient au final seulement 500 mg d'irones à partir d'un kilogramme de rhizome secs. On comprend que ces procédés sont longs et coûteux, en raison de la lente maturation des rhizomes, indispensable à l'obtention d'irones ayant la qualité olfactive recherchée. La demande en irone ne faiblissant pas, en dépit de la réduction de la production d'Iris en Europe, il est donc utile de développer de nouveaux procédés d'obtention d'irone de bonne qualité qui soient plus rapides à mettre en œuvre et présentent de meilleurs rendements que les procédés connus. L'obtention des irones par voie synthétique constitue une solution pour contourner les problèmes précités. Les procédés de synthèse qui ont été décrits à ce jour ont toutefois un rendement très modeste et ne conduisent pas toujours à des irones de qualité. Les procédés visant à accélérer l'étape de maturation des rhizomes par traitement à l'aide de nitrite de sodium en milieu aqueux acide (WO 98/49139) ou à l'aide d'un traitement ionisant (FR 2 653 637) ne permettent pas non plus d'obtenir un absolu ayant les propriétés olfactives recherchées avec un rendement correct.
Une autre solution a consisté à obtenir les irones à partir des iridals, plus faciles à extraire des Iridacées (EP 0 914 316 ; EP 0 443 926 ; FR 2 620 702). Les iridals sont généralement extraits à l'aide de solvants organiques (FR 2 746 645 ; WO 97/36604). Les extraits les contenant ne sont toutefois pas suffisamment purs et il est donc nécessaire de les soumettre à une étape de purification, soit pour pouvoir utiliser ces iridals comme actifs pharmaceutiques, soit dans l'objectif de les transformer en irones par voie enzymatique. Dans ce dernier cas, en effet, les extraits contenant des iridals renferment généralement des composés sur lesquels les enzymes sont susceptibles d'agir pour former des substances volatiles qu'il sera nécessaire d'éliminer ultérieurement par distillation. On comprend que cette étape additionnelle de distillation impacte négativement l'économie du procédé de production d'irones. Ainsi, dans le document FR 2 746 645, l'extrait contenant les iridals peut être fractionné par chromatographie à contre-courant ou sur couche mince, notamment, puis les iridals peuvent être purifiés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Il n'est pas fait mention des solvants utilisés dans l'étape de fractionnement chromato graphique. La chromatographie à contre-courant (CCC) est une technique séparative utilisant un système biphasique de solvants liquides pour séparer et/ou purifier des composés à partir d'un extrait complexe, en se basant sur le coefficient de partage (Kp) des solutés dans les deux phases liquides. L'une des phases liquides constitue la phase mobile, tandis que l'autre constitue la phase stationnaire. Cette dernière est maintenue dans la colonne par la rotation du rotor, qui génère une force centrifuge. Deux types d'appareils existent sur le marché. On citera tout d'abord les appareils de type hydrodynamique (CCC) ; dans ce cas, la colonne est constituée par un tube en PTFE (Teflon®) de section variable et de grande longueur, enroulé autour d'une bobine et mise en rotation autour d'un axe, lui-même soumis à une rotation autour d'un second axe. Cette double rotation planétaire permet la progression des solutés dans le tube et la création d'un champ gravitationnel variable périodiquement, induisant dans le même tube la formation d'une émulsion et sa décantation. Un autre type d'appareil est constitué des dispositifs de type hydrostatique (CPC), dans lesquels des cellules individualisées sont interconnectées et soumises à une rotation autour d'un seul axe responsable d'un champ de force centrifuge constant. La CCC a été appliquée à la purification de différents composés présents dans des extraits de pétales, de graines ou de racines d'iris, tels que des dérivés de stilbène (CN 105085453) des flavones et isoflavones (CN102329351 ; CN 101906091 ; CN101357933) et des quinones (CN102649722 ; CN103694098). A la connaissance des inventeurs, il n'a toutefois jamais été suggéré d'appliquer cette technique à la purification des iridals contenus dans des extraits végétaux ou dans d'autres matrices.
Après de nombreuses recherches, les inventeurs ont démontré que la chromato graphie de partage centrifuge (CPC) permettait de purifier d'autres composés issus des Iridacées, à savoir les iridals et leurs dérivés. Ils ont pour ce faire sélectionné un système biphasique de solvants spécifiquement adapté aux composés à purifier.
La présente invention offre ainsi un procédé simple, peu coûteux et efficace de purification d'iridals qui conduit à des iridals ayant une pureté suffisante pour être utilisés en tant que tels, notamment dans l'industrie pharmaceutique, ou pour être transformés en irones présentant de bonnes propriétés olfactives et aromatiques.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention a pour objet un procédé de purification d'iridals, de préférence de bicycloiridals, contenus dans une composition de départ, consistant à mélanger la composition de départ à une phase aqueuse et à une phase organique, puis à traiter ledit mélange par chromatographie de partage centrifuge utilisant une phase stationnaire liquide et une phase mobile liquide, dont l'une est constituée de ladite phase aqueuse et l'autre de ladite phase organique, caractérisé en ce que la phase aqueuse est constituée d'eau et éventuellement d'au moins un solvant organique miscible à l'eau et la phase organique est constituée d'un mélange d'au moins un solvant non miscible à l'eau, formé d'un hydrocarbure éventuellement halogéné, et d'au moins un solvant partiellement miscible à l'eau. Elle porte également sur une composition, notamment un extrait végétal, susceptible d'être obtenue suivant le procédé ci-dessus.
L'invention porte également sur l'utilisation de cette composition pour la préparation d'irones.
DESCRIPTION DETAILLEE
Le procédé de purification selon l'invention vise à enrichir une composition de départ en iridals. Cette composition de départ peut en particulier être obtenue au moyen d'un procédé d'extraction par solvant d'une matière première choisie parmi : un extrait de plante contenant des iridals, un mélange contenant des iridals produit par des cellules végétales produisant des iridals ou par des micro-organismes produisant des iridals, et un mélange obtenu par synthèse organique contenant des iridals.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la composition de départ est un extrait végétal, obtenu préférentiellement suivant un procédé d'extraction par solvant d'une matière végétale choisie parmi les plantes entières ou les parties de plantes de la famille des Iridacées. Par "partie de plante", on entend au moins l'une des parties aériennes (bourgeons, tiges, feuilles, fleurs) ou souterraines (racines, rhizomes) de la plante, préférentiellement ses parties aériennes et/ou ses rhizomes, plus préférentiellement ses rhizomes. On préfère selon l'invention utiliser les rhizomes et/ou les feuilles d'une plante du genre Iris, notamment des espèces Iris germanica, Iris pallida, Iris florentina, Iris versicolor, Iris sibirica ou Iris pseudacorus. Dans une forme d'exécution préférée de l'invention, la plante de la famille des Iridacées est choisie parmi Iris pallida.
Dans un mode de réalisation, la matière végétale est pelée, concassée, broyée et/ou séchée avant l'extraction par solvant.
En tout état de cause, le solvant mis en œuvre pour l'extraction des iridals peut être tout solvant organique approprié, tel qu'un solvant alcoolique, en particulier le méthanol ou l'éthanol, un solvant chloré, tel que le chlorure de méthylène ou le dichloréthane, ou un hydrocarbure aromatique ou aliphatique, comme le benzène ou l'hexane, en général à la température de reflux du solvant; on peut éventuellement utiliser des mélanges de solvants ou réaliser deux extractions successives avec des solvants différents. Il est préférable d'utiliser des solvants alcooliques ou chlorés, qui sont de meilleurs solvants des composés terpéniques que les hydrocarbures et, mieux, le méthanol, l'éthanol à 70% et le chlorure de méthylène. On peut aussi, pour éliminer les composés hydrosolubles entraînés lors de cette extraction, redissoudre le résidu d'évaporation dans un solvant non miscible à l'eau, comme le chlorure de méthylène, et laver la phase organique à l'eau, avant d'éliminer de nouveau le solvant organique.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le solvant d'extraction peut comprendre un lactate d'alkyle en C1-C3 tel que le lactate de méthyle ou d'éthyle et plus préférentiellement le lactate d'éthyle. Un tel procédé d'extraction comprend de manière particulièrement préférée les étapes successives consistant à :
a) extraire une matière première renfermant des iridals à l'aide d'un procédé physique, dans un solvant comprenant un lactate d'alkyle,
b) traiter la suspension obtenue pour éliminer la fraction solide et récupérer la fraction liquide, c) diluer la fraction liquide avec de l'eau pour obtenir un mélange contenant de l'eau et du lactate d'alkyle et un colloïde contenant des iridals,
d) éventuellement, récupérer le colloïde,
e) congeler le mélange éventuellement dépourvu du colloïde pour obtenir une phase lourde contenant du lactate d'alkyle, une phase légère contenant de l'eau sous forme solide et éventuellement une phase intermédiaire contenant les iridals qui n'ont pas été récupérés à l'étape d),
f) éventuellement, faire fondre ledit mélange congelé, et
g) récupérer la phase lourde et, le cas échéant, ladite phase intermédiaire.
Dans la première étape du procédé selon l'invention, la matière première est mise en contact avec un solvant d'extraction comprenant un lactate d'alkyle, généralement un lactate d'alkyle en C1-C3 et préférentiellement le lactate de méthyle ou d'éthyle, mieux, le lactate d'éthyle. Dans un mode de réalisation, le solvant d'extraction comprend en outre de l'éthanol, dans un rapport volumique de l'éthanol au lactate d'alkyle compris entre 5 et 80% et de préférence entre 20 et 50%. Dans ce cas, le procédé comprend en outre une étape b') d'évaporation de l'éthanol, de préférence à une température inférieure à 40°C, plus préférentiellement à une température de 28 à 35°C, après l'étape b) de filtration et avant l'étape c). Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le solvant d'extraction ne renferme pas d'autre solvant que le lactate d'alkyle et éventuellement l'éthanol. Cette étape de mise en contact peut être effectuée par tout procédé physique adéquat et notamment par macération, mélange aux ultrasons ou passage au micro-ondes du mélange de la matière première contenant des iridals avec le lactate d'alkyle. Cette étape est généralement mise en œuvre sous agitation, à une température de 0 à 40°C, de préférence de 20 à 25°C, pendant une durée allant par exemple de 20 à 72 heures, notamment de 40 à 60 heures. La quantité de solvant mise en œuvre doit être suffisante pour mouiller la matière première et peut par exemple être comprise entre 1 et 2 litres de solvant par kilogramme de matière première, par exemple de matière végétale. La suspension obtenue est ensuite traitée pour éliminer la fraction solide et récupérer la fraction liquide. Cette étape de traitement peut être effectuée par filtration, centrifugation ou à l'aide d'une membrane, de préférence par filtration.
La fraction liquide renferme les composés terpéniques recherchés, solubilisés dans le lactate d'alkyle. Le lactate d'alkyle ne pouvant être évaporé, les inventeurs ont mis au point un procédé simple et peu coûteux permettant de rompre la solubilité du terpène dans le mélange, consistant à diluer la fraction liquide avec de l'eau, de façon à augmenter la polarité de cette fraction et et à obtenir ainsi un mélange homogène contenant de l'eau et du lactate d'alkyle et un colloïde contenant les iridals recherchés, qui ne sont pas solubles dans le mélange d'eau et de lactate d'alkyle. Dans cette étape, qui peut être réalisée à température ambiante, le rapport volumique de l'eau à la fraction liquide est généralement compris entre 10: 1 et 50: 1, par exemple entre 10: 1 et 20: 1.
Le colloïde peut alors être récupéré par tout moyen approprié, notamment par filtration ou par utilisation d'agents flocculants ou encore par centrifugation. En variante, les iridals peuvent ne pas être récupérés à ce stade, mais après une étape de congélation / décongélation qui sera décrite ci-après. Selon encore une autre variante, une partie des iridals peut être récupérée dans cette étape et une autre partie dans la suite du procédé, comme décrit ci-après. Le procédé selon l'invention comprend ensuite une étape de congélation du mélange (dépourvu ou non du colloïde) pour obtenir une phase lourde contenant du lactate d'éthyle, une phase légère contenant de l'eau sous forme solide et éventuellement une phase intermédiaire contenant les iridals qui n'ont pas été récupérés à l'étape précédente. On comprend que l'étape de congélation permet de séparer le lactate d'alkyle de l'eau et/ou des composés recherchés, en s'affranchissant des problèmes liés à la faible volatilité du lactate d'alkyle. Cette étape est mise en œuvre à une température de -5 à -25°C, de préférence de -10 à -20°C, pendant une durée suffisante (par exemple de 1 à 10 jours) pour observer une séparation de phase entre le lactate d'éthyle, qui constituera la phase lourde du mélange, et l'eau, moins dense que le lactate d'éthyle et qui constituera la phase légère du mélange.
Dans le cas où la phase intermédiaire est absente, il est possible, à l'issue de cette étape, de récupérer directement le lactate d'alkyle pour pouvoir le recycler dans le procédé, par exemple à l'aide d'un robinet de fond de cuve. Dans le cas où une phase intermédiaire est présente, le procédé comprend une étape supplémentaire consistant à faire fondre le mélange, généralement en le ramenant à température ambiante, de manière à pouvoir récupérer le lactate d'alkyle, puis la phase intermédiaire contenant les iridals recherchés. Si nécessaire, un ou plusieurs cycles de congélation peuvent être mis en œuvre. Les étapes de congélation / décongélation / récupération du lactate d'alkyle (étapes e) à g) du procédé selon l'invention) peuvent être répétées pour obtenir une phase lourde purifiée.
Ce procédé peut en outre comprendre une étape consistant à mélanger le colloïde récupéré à l'étape d) avec la phase intermédiaire issue de l'étape g).
En particulier, il a été observé que la mise en œuvre de ce procédé d'extraction sur des rhizomes secs d'iris pour obtenir une composition de départ contenant des iridals, suivi du procédé de purification des iridals selon l'invention, permettait d'obtenir des iridals ayant une pureté élevée (d'au moins 70%) et ce, sans utiliser de solvant organique potentiellement toxique pour l'homme et/ou l'environnement. Ces iridals peuvent ensuite être convertis en irones selon des techniques classiques, pour obtenir un absolu ayant d'excellentes propriétés olfactives.
Le rendement du procédé d'extraction selon l'invention, ainsi que la nature chimique des iridals obtenus, dépendront de la composition de départ, par exemple de la matière végétale, mise en œuvre. Les iridals pourront ainsi se trouver sous forme réduite, ou le cas échéant sous forme oxydée, ou encore déshydratée, conduisant à des structures cycliques ou polymérisées. En particulier, la chaîne latérale des iridals peut comporter des doubles liaisons résultant de déshydratations ou de déshydrogénations des iridals naturels, ou peut être hydroxylée. Ils peuvent également être obtenus sous forme hydroxylée ou estérifiée, par exemple avec des acides gras, ou éthérifiée. Dans la présente description, le terme "iridal" recouvre toutes ces variantes. Ce terme désigne en outre aussi bien les mono-cycloiridals que les bicycloiridals et leurs mélanges. Les mono-cycloiridals comprennent plus spécialement l'iridal (21-désoxy- iridogermanal), le 16-0-acétyl-isoiridogermanal, le 17-hydroxyiridal, le 26-hydroxyiridal, le 17,26-dihydroxyiridal, le 21-hydroxyiridal (iridogermanal), le 10-désoxy-21-hydroxyiridal (10-désoxy-iridogermanal), le 10-désoxy-17-hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17-didéhydro- 26-acétoxy-iriversical, le 16,17-didéhydro-iridal, le 16, 17-didéhydro-26-hydroxy- iridal et le 17,29-didéhydroiridal. Les bicycloiridals comprennent notamment l'iriflorental, l'iripallidal, Γα-irigermanal, le γ-irigermanal et le désoxy-iripallidal.
La présente invention s'intéresse plus particulièrement à la purification d'une composition de départ renfermant des bicycloiridals et en particulier l'iripallidal et/ou l'iriflorental.
La composition de départ, renfermant des iridals, est purifiée par chromatographie de partage centrifuge (CPC), conformément à la présente invention.
La colonne de CPC utilisée pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention peut être constituée d'un rotor formé par un empilement de disques en acier inoxydable sur lequel sont gravées des cellules distribuées radialement. L'étanchéité entre les disques est assurée par des joints en PTFE (Teflon®) de même diamètre, comme décrit notamment dans la demande WO 00/58722. Des colonnes de ce type sont disponibles auprès de la société KROMATON.
Dans la présente invention, la composition de départ est mélangée à une phase aqueuse et à une phase organique, avant d'être injectée dans la colonne de CPC.
Par "phase aqueuse", on désigne ici une phase constituée d'eau et éventuellement d'au moins un, et de préférence un seul, solvant organique miscible à l'eau, c'est-à-dire qui peut être solubilisé dans l'eau en toute proportion. Il peut s'agir d'éthanol ou de méthanol, de préférence de méthanol.
Par "phase organique", on désigne ici une phase constituée d'un mélange d'au moins un, et de préférence un seul, solvant non miscible à l'eau, formé d'un hydrocarbure éventuellement halogéné, et d'au moins un, de préférence un seul, solvant partiellement miscible à l'eau. L'hydrocarbure éventuellement halogéné peut notamment être choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques, tels que l'hexane, l'heptane et le cyclohexane, et les hydrocarbures halogénés, tels que le chloroforme, le dichlorométhane et le dichloro-2,2-éthane. L'heptane est préféré pour une utilisation dans la présente invention. Par "solvant partiellement miscible à l'eau", on entend un solvant capable de se dissoudre dans l'eau à hauteur de 0,1 à 10g de solvant pour 100 mL d'eau à 25°C. Des exemples de tels solvants sont les acétates d'alkyle en C2-C4, en particulier l'acétate d'éthyle.
Dans une forme d'exécution de l'invention, la composition de départ peut en outre être mélangée à un "solvant pont", c'est-à-dire à un solvant qui est au moins partiellement soluble dans l'eau et dans les hydrocarbures, c'est-à-dire à hauteur d'au moins 4 g pour 100 mL d'eau et d'au moins 4 g pour 100 mL d'hydrocarbure, à 25°C. Le solvant pont est donc au moins partiellement miscible avec la phase aqueuse et avec la phase organique. Il peut s'agir en particulier d'un lactate d'alkyle en C1-C3, avantageusement du lactate d'éthyle. Dans une forme d'exécution préférée de la présente invention, la phase organique est constituée d'un mélange d'heptane et d'acétate d'éthyle. Le rapport volumique de l'heptane à l'acétate d'éthyle peut être compris entre 1: 1 et 2: 1, plus préférentiellement le rapport volumique heptane : acétate d'éthyle est de 1,5: 1. En outre, on préfère que la phase aqueuse soit constituée d'un mélange de méthanol et d'eau. Le rapport volumique du méthanol à l'eau est avantageusement compris entre 1: 1 et 2: 1. Plus préférentiellement, le rapport volumique méthanol : eau est de 1,5: 1.
La quantité totale de solvants utilisée, ainsi que leurs proportions relatives, sont déterminées de manière à ce que les constituants de la composition de départ soient entièrement solubilisés, si nécessaire en ayant recours à une agitation du mélange voire à l'utilisation d'ultrasons. Pour ce faire, la composition de départ peut par exemple être dissoute dans un mélange des phases aqueuse et organique, dans un rapport volumique de la phase aqueuse à la phase organique de 40:60 à 60:40, de préférence de 50:50. Pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention, le mélange de la composition de départ avec la phase aqueuse, la phase organique et éventuellement le solvant pont est traité par chromatographie de partage centrifuge utilisant une phase stationnaire liquide et une phase mobile liquide. La phase stationnaire peut être constituée de ladite phase aqueuse et la phase mobile de ladite phase organique, ou l'inverse. La colonne est remplie avec la phase stationnaire à un débit allant par exemple de 10 à 80 mL/min, en faisant tourner le rotor, par exemple à une vitesse de 300 à 700 tours/min. Puis la colonne est équilibrée en percolant la phase mobile au travers de la phase stationnaire grâce à une pompe, à un débit allant par exemple de 5 à 20 mL/min, jusqu'à atteindre un équilibre hydrodynamique. La vitesse de rotation du rotor est alors généralement comprise entre 800 et 1000 tours/min. La composition à purifier est ensuite introduite dans la colonne via une vanne d'injection, équipée par exemple d'une boucle de 50 mL, et l'élution s'effectue à un débit généralement compris entre 5 et 30 mL/min, de préférence de 20 mL/min. La chromatographie peut s'effectuer en mode ascendant, auquel cas la phase stationnaire est la phase aqueuse. En variante, elle peut s'effectuer en mode descendant, auquel cas la phase stationnaire est la phase organique. On préfère que la phase mobile soit introduite dans la colonne en mode ascendant.
Les composés sont élués en sortie de colonne en fonction de leur coefficient de partage dans le système biphasique de solvants choisi. La détection des iridals s'effectue en UV autour de 240 nm, notamment à l'aide d'un détecteur UV- visible, par exemple d'un détecteur à barrette de diodes. Si nécessaire, les iridals peuvent ensuite être séparés par toute technique appropriée, notamment par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
On obtient ainsi une composition enrichie en iridals, renfermant au moins 50% en poids, de préférence au moins 60% en poids, voire au moins 70% en poids, d'iridals, avantageusement de bicycloiridals.
Les iridals purifiés obtenus suivant le procédé de la présente invention peuvent avantageusement être utilisés comme principes actifs pharmaceutiques, notamment dans le traitement de cancers ou de la malaria. Dans ces applications, ils sont généralement inclus en quantité efficace dans une composition comprenant un milieu pharmaceutiquement acceptable, adaptée en particulier à une administration par voie orale ou par injection intraveineuse, sous- cutanée ou intra-musculaire. En variante, les iridals peuvent être convertis en irones selon tout procédé connu de l'homme de l'art, afin d'être utilisés comme constituants de parfums dans l'industrie cosmétique ou la parfumerie ou comme arômes alimentaires. La conversion des iridals en irones, en particulier en a-irone, β-irone et/ou γ-irone, peut notamment être effectuée par voie microbiologique, notamment par voie enzymatique, en présence d'un système peroxydant comprenant de l'eau oxygénée et une peroxydase ou de l'oxygène et une lipoxygénase, éventuellement en présence d'un substrat de l'enzyme (comme décrit notamment dans EP 0 443 926), ou en soumettant les iridals à l'action d'un microorganisme du genre Botryotinia ou Sclerotinia ou encore par oxydation permanganique (comme décrit notamment dans FR 2 620 702). L'irone recherchée peut ensuite être obtenue par entraînement à la vapeur, hydrodistillation ou extraction à l'aide d'un fluide supercritique ou d'un solvant non miscible à l'eau.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente le chromatogramme HPLC à 242 nm de l'extrait d'Iris pallida obtenu suivant l'Exemple 1, par extraction au lactate d'éthyle, ainsi que les spectres UV-visible a) à c) des composés à 14,996 min, 16,671 min et 16,244 min, respectivement.
La Figure 2 illustre le chromatogramme HPLC à 242 nm de la fraction B obtenue par chromato graphie de partage centrifuge de l'extrait d'Iris pallida.
EXEMPLES
L'invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants, qui sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas pour but de limiter la portée de l'invention, définie par les revendications annexées. Exemple : Procédé d'obtention d'iridals
1- Extraction des iridals
On a préparé un extrait enrichi en iridals à partir de rhizomes d'Iris pallida.
Pour ce faire, on a lavé à l'eau et broyé 1,5 kg de rhizomes d'Iris pallida. On a fait macérer ce broyât dans un mélange de 2 L de lactate d'éthyle et d'éthanol (60/40, v/v), sous agitation, pendant 48 h à température ambiante. Le mélange a ensuite été filtré et essoré pour éliminer la fraction solide et la fraction liquide a été récupérée. L'alcool a alors été évaporé sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif. Après évaporation, il restait 1,2 L d'une phase organique à base de lactate d'éthyle renfermant les composés recherchés. Cette phase organique a été diluée et homogénéisée dans 15 L d'eau, au sein d'un contenant comprenant un robinet en fond de cuve. On a observé la formation d'un précipité blanchâtre colloïdal, comprenant les composés recherchés. Le mélange d'eau et de lactate d'éthyle a ensuite été placé à -20°C pendant 2 jours, jusqu'à ce que l'eau se trouve congelée et que le lactate d'éthyle ait décanté en fond de cuve. Le mélange a ensuite été décongelé, puis recongelé à nouveau pendant 2 jours. Au total, 5 cycles de congélation / décongélation ont été effectués. Lors de la dernière décongélation, on observait un système triphasique, constitué d'une partie supérieure composée d'eau claire, d'une phase intermédiaire renfermant les iridals ayant précipité et d'une partie inférieure contenant le lactate d'éthyle.
Le lactate d'éthyle a été retiré au moyen du robinet de fond de cuve, puis les phases supérieure et intermédiaire ont été filtrées et centrifugées de façon à récupérer l'ensemble des agrégats formés. La matière ainsi récupérée a été reprise avec un volume minimal d'éthanol, de façon à nettoyer les filtres et appareillages. Enfin, après ajout d'eau et évaporation de l'alcool, les composés recherchés ont été lyophilisés. On a ainsi obtenu 12g d'une poudre riche en iridals, soit un rendement de 0,8% à partir des rhizomes frais.
Caractérisation de l'extrait :
L'extrait obtenu comme décrit ci-dessus a été analysé par HPLC.
L'analyse a été effectuée à l'aide d'une chaîne HPLC Agilent®1100 équipée d'un dégazeur, d'une pompe quaternaire basse pression, d'un passeur automatique, d'un détecteur UV-Visible- DAD (200 nm à 800 nm) et d'une colonne Prontosil C18 (250 x 4,0 mm ; 5μιη, 120A). La phase mobile était composée d'eau (solvant A) et d'acétonitrile (solvant B). L'élution a été réalisée à 1 mL/min selon le gradient décrit dans le Tableau 1. 10 μΐ^ d'une solution méthanolique de l'extrait à 2 mg/mL sont injectés. La détection a été effectuée à 242 nm et 280 nm.
τ % B
(min) (acétonitrile)
0 60
5 60
8 68
13 68
16 69
21 69
24 71
29 71
32 100
37 100
40 60
45 60
Tableau 1 Sur la Figure 1, les pics des composés entre 14 et 17 min sont tous des composés de la famille des bicycloiridals. Ces bicycloiridals présentent un maximum d'absorption proche de 240 nm. Le pic au temps de rétention de 14,996 min correspond à l'iriflorental et celui à 16,761 à l'iripallidal. Le 3eme pic à 16,244 min pourrait correspondre à un isomère des bicycloiridals précédents. Le dosage sur l'extrait brut (comme décrit plus bas) indique qu'il est composé de 15 % d'Iriflorental et de 17,6 % d'Iripallidal, soit un total pour les deux bicycloiridals de 33,6 %.
2- Purification des iridals L'extrait brut obtenu comme décrit ci-dessus a été purifié par chromatographie de partage centrifuge (CPC) sur un équipement Kromaton® FCPC A 1000 de 1 L utilisé en mode ascendant. On a utilisé comme système de solvants biphasique un système quaternaire constitué de n- heptane, d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau, dans un rapport volumique de 3:2:3:2, respectivement. L'élution a été réalisée en mode isocratique. La colonne de CPC a été remplie avec la phase stationnaire, constituée d'un mélange de méthanol et d'eau (60% / 40%), à un débit de 50 mL/min, à une vitesse de rotation de 500 tours/min. La colonne a ensuite été équilibrée en faisant passer la phase mobile, composée d'un mélange d'heptane et d'acétate d'éthyle (60% / 40%), avec un débit de 20 mL/min, à 900 tours/min. Le volume mort (Vm) était de 170 mL.
1,4 g de l'extrait brut obtenu comme décrit précédemment ont d'abord été repris dans 10 mL d'un mélange de solvants constitué des phases mobile et stationnaire dans un rapport volumique de 50/50. Une émulsion a été obtenue, elle a été filtrée à l'aide d'un filtre seringue en polyamide (Nylon®) de 0,45 μιη.
L'échantillon à purifier a été injecté dans la colonne, en utilisant une vanne d'injection Rhéodyne® haute pression équipée d'une boucle d'injection de 50 mL. L'élution était réalisée avec un débit de 20 mL/min.
Les composés ont été récupérés en sortie de colonne en fonction de leur coefficient de partage. Les composés ont été détectés à quatre longueurs d'onde : 210 nm, 242 nm, 254 nm et 280 nm, à l'aide d'un détecteur Flash 06DAD d'ECOM. Les bicycloiridals étaient élués entre 40 et 60 min.
Cinq fractions ont été obtenues en se basant sur le profil chromato graphique CPC de l'extrait. L'analyse HPLC des différentes fractions a été effectuée en utilisant le même appareillage et la même méthode que précédemment. Les fractions 2 et 3 présentaient le même profil chromato graphique, avec les pics correspondant aux iridals kmax proche de 240 nm). Ces fractions ont été regroupées, évaporées et lyophilisées pour donner le bloc B (387,5 mg, 62,2% m/m), sous forme de poudre cristalline de couleur ivoire.
Comme illustré à la Figure 2, le chromatogramme de cette fraction comprenait principalement deux pics B4 et B5. Les composés correspondant à ces pics ont été séparés par HPLC préparative, avec une phase stationnaire identique à celle de la HPLC analytique. Les produits purs ont ensuite été caractérisés par RMN et par spectrométrie de masse couplée à une chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC-MS). Leur structure a été confirmée comme étant celle de l'iriflorental (B4) et de l'iripallidal (B5), en comparaison avec la littérature (Krick et al., 1983, Z. Naturforsch, 38C, 179-184 ; Masson et al., Journal of Chromato graphy, A 1368 (14 Novembre 2014): 143-54). En outre, il a été observé que le composé B6 possédait la même masse et les mêmes fragments, ainsi que le même spectre UV- visible, que l'iripallidal et l'iriflorental, de sorte qu'il s'agirait probablement d'un isomère de B4 et B5.
Sur la base des étalons ainsi obtenus, on a effectué un dosage des bicycloiridals présents dans la fraction B issue de la CPC. Ce dosage a été effectué sur la même chaîne HPLC Agilent® 1100. Les résultats du dosage montrent que la fraction B (387,5 mg) enrichie en bicycloiridals, obtenue par CPC, contenait 36% d'iriflorental et 39,6% d'iripallidal, soit 75,6% de bicycloiridals. A partir de 1,4 g d'extrait brut, la CPC a ainsi permis d'obtenir une fraction de 387,5 mg contenant plus de 75% de bicycloiridals.
Le rendement de la CPC (addition de toutes les fractions) est de 79 %. Le taux de récupération des iridals à partir de l'extrait brut est de 62,2%. Les iridals sont obtenus avec une pureté de plus de 75%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de purification d'iridals, de préférence de bicycloiridals, contenus dans une composition de départ, consistant à mélanger la composition de départ à une phase aqueuse et à une phase organique, puis à traiter ledit mélange par chromatographie de partage centrifuge utilisant une phase stationnaire liquide et une phase mobile liquide, dont l'une est constituée de ladite phase aqueuse et l'autre de ladite phase organique, caractérisé en ce que la phase aqueuse est constituée d'eau et éventuellement d'au moins un solvant organique miscible à l'eau et la phase organique est constituée d'un mélange d'au moins un solvant non miscible à l'eau, formé d'un hydrocarbure éventuellement halogéné, et d'au moins un solvant partiellement miscible à l'eau.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase aqueuse renferme un solvant organique miscible à l'eau, qui est choisi parmi l'éthanol et le méthanol, de préférence le méthanol.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'hydrocarbure éventuellement halogéné est choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques, tels que l'hexane, l'heptane et le cyclohexane, et les hydrocarbures halogénés, tels que le chloroforme, le dichlorométhane et le dichloro-2,2-éthane.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant non miscible à l'eau est l'heptane.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le solvant partiellement miscible à l'eau est choisi parmi les acétates d' alkyle en C2-C4, tels que l'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle, en particulier l'acétate d'éthyle.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la phase organique est constituée d'heptane et d'acétate d'éthyle dans un rapport volumique de l'heptane à l'acétate d'éthyle compris entre 1: 1 et 2: 1, plus préférentiellement le rapport volumique heptane : acétate d'éthyle est de 1,5: 1.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase aqueuse est constituée d'eau et de méthanol dans un rapport volumique du méthanol à l'eau compris entre 1: 1 et 2: 1, plus préférentiellement le rapport volumique méthanol : eau est de 1,5: 1.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la composition de départ est obtenue au moyen d'un procédé d'extraction par solvant d'une matière première choisie parmi : un extrait de plante contenant des iridals, un mélange contenant des iridals produit par des cellules végétales produisant des iridals ou par des micro-organismes produisant des iridals, et un mélange obtenu par synthèse organique contenant des iridals.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'extrait végétal est obtenu suivant un procédé d'extraction par solvant d'une matière végétale choisie parmi les plantes entières ou les parties de plantes, de préférence les parties aériennes et/ou les rhizomes, de la famille des Iridacées.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'extrait végétal est un extrait de rhizomes et/ou de feuilles d'une plante du genre Iris, de préférence de l'espèce Iris pallida, Iris germanica, Iris florentina, Iris versicolor, Iris sibirica ou Iris pseudacorus, plus préférentiellement Iris pallida.
11. Composition enrichie en iridals, susceptible d'être obtenue suivant le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 10.
12. Utilisation de la composition selon la revendication 11 pour la préparation d'irones.
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