WO2018080015A1 - C-met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 hgf - Google Patents

C-met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 hgf Download PDF

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WO2018080015A1
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met
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심선희
김경아
김보규
남도현
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삼성전자 주식회사
사회복지법인 삼성생명공익재단
삼성바이오에피스 주식회사
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    • G01N2333/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • Biomarkers for Predicting Efficacy of c-Met Inhibitors Compositions for predicting the efficacy of c-Met inhibitors including HGF (Hepatocyte Growth Factor) and detection agents of HGF and / or for screening subjects of c-Met inhibitors are provided.
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • Biomarker is an indicator that can identify changes caused inside the living body due to external influences, and is actively researched for diagnosing various diseases such as cancer, stroke, and dementia or for predicting the efficacy of certain therapeutic agents. ought.
  • Biomarkers related to drug development include pharmacodynamic markers (PD markers) for confirming the in vivo activity of drugs, and predictive efficacy markers for predicting drug reactivity prior to in vivo administration. markers). The use of such markers helps to establish the clinical strategy of the drug. For example, the efficacy predictive markers expected to be effective through the action of the drug can be used in the patient selection process to establish a more effective drug treatment strategy.
  • Cancer is one of the leading causes of death to date. Advances in medical technology are bringing notable changes in cancer treatment technology, but the five-year survival rate has only improved by 10% over the past 20 years. This is because the rapid growth and metastasis of cancer is difficult to diagnose and treat at the proper time.
  • appropriate biomarkers into cancer treatments, the success of cancer treatments can be greatly increased by increasing the chance of identifying the characteristics of the cancer and using the appropriate treatment in a timely manner. For example, even in the same lung cancer patients, the characteristics of lung cancer classification, gene, and secreted protein are different, and accordingly, appropriate treatment is also different. Therefore, in chemotherapy using a specific therapeutic agent, if a biomarker corresponding to the therapeutic agent is present, trial and error can be reduced and the probability of success can be increased.
  • the search for biomarkers for predicting or testing efficacy of anticancer drugs is very important, and if a suitable biomarker is successfully derived, the efficacy and value of anticancer drugs and the success rate of treatment using the same may be greatly increased.
  • c-Met is a receptor for hepatocyte growth factor (HGF), and HGF binds to the extracellular site of c-Met receptor tyrosine kinase, resulting in division, movement, and morphogenesis in various normal and tumor cells. It is a type of cytokine that causes angiogenesis.
  • c-Met is a representative receptor tyrosine kinase on the surface of the cell, which itself is a cancer-causing gene and sometimes cancer development, cancer metastasis, cancer cell migration, cancer cell invasion, neovascularization, regardless of the ligand HGF. Since it is involved in various mechanisms related to tumors, etc., it is a protein recently attracting attention as a target of anticancer treatment, and development of a target therapeutic agent such as an antibody that inhibits the action of c-Met is in progress.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the efficacy of the therapeutic agent is predicted or assayed to select patients who are suitable for application of the therapeutic agent to establish a more effective treatment strategy. There is a need for the development of applicable biomarkers.
  • One example provides a biomarker for predicting the efficacy of a c-Met inhibitor comprising at least one selected from the group consisting of HGF (Hepatocyte Growth Factor) and genes encoding them and / or selecting a target for application of the c-Met inhibitor. .
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • compositions and kits for predicting the efficacy of a c-Met inhibitor and / or selecting a subject for application of a c-Met inhibitor comprising a substance that interacts with one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding them. do.
  • Another example provides for use in predicting the efficacy of a c-Met inhibitor of a substance interacting with one or more selected from the group consisting of HGF and the genes encoding them and / or selecting a subject for application of the c-Met inhibitor.
  • Another example is the prediction of the efficacy of a c-Met inhibitor and / or the application of a c-Met inhibitor, comprising measuring the presence and / or level of one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding them in a biological sample.
  • Another example provides a method of treating cancer, comprising administering a c-Met inhibitor to the selected patient.
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • the HGF level in a kidney cancer cell line or a xenograft model transplanted therewith, the HGF level is high in a cell line or xenograft model in which the anti-c-Met antibody is efficacious, whereas in a cell line or xenograft model in which the anti-c-Met antibody is ineffective,
  • the levels were found to be low. As such, it was confirmed that HGF in water or gene expression levels could exhibit anti-c-Met antibody efficacy, thereby confirming the applicability of HGF as a c-Met inhibitor efficacy marker.
  • the efficacy of the c-Met inhibitor may include c-Met inhibitory effects (such as c-Met internalization and / or degradation) of the c-Met inhibitor, c-Met related diseases such as cancer, more specifically, kidney cancer. It means the prevention, improvement, alleviation, and / or therapeutic effect of, for example, reduction of cancer cells or cancer tissues of kidney cancer, death of cancer cells or cancer tissues, inhibition of migration and / or penetration of cancer cells associated with cancer metastasis. Or the like.
  • 'predicting c-Met inhibitor efficacy' refers to the desired efficacy of a c-Met inhibitor in patients receiving it, ie c-Met inhibition (such as c-Met internalization and / or degradation), c- Efficacy in preventing, ameliorating, alleviating, and / or treating a Met-related disease, such as cancer, more specifically, renal cancer (eg, reducing cancer cells or cancerous tissue of kidney cancer, killing cancer cells or cancerous tissue, cancer cells associated with cancer metastasis). And / or suppression of infiltration), and / or resistance to c-Met inhibitors in a patient receiving the same.
  • a Met-related disease such as cancer, more specifically, renal cancer (eg, reducing cancer cells or cancerous tissue of kidney cancer, killing cancer cells or cancerous tissue, cancer cells associated with cancer metastasis).
  • renal cancer eg, reducing cancer cells or cancerous tissue of kidney cancer, killing cancer cells or cancerous tissue, cancer cells associated with cancer metastasis.
  • suppression of infiltration and
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • mesenchymal cells mainly targets and acts on epithelial and endothelial cells, and is known to act on haemopoietic progenitor cells.
  • the HGF may be derived from mammals such as primates, including humans, monkeys, and the like, and rodents, including mice, rats, and the like.
  • HGF can be expressed in human HGF (eg, NCBI Accession Nos.
  • NP_000592.3 (gene: NM_000601.4), MP_001010932.1 (gene: NM001010932.1), XP_006716019.1 (gene: XM_006715956.2), XP_011514417.1 ( Gene: XM_011516115.1), etc.), mouse HGF (e.g.
  • NP_001276387.1 (gene: NM_001289458.1), NP_001276388.1 (gene: NM_001289459.1), XP_011248050.1 (gene: XM_011249748.1), etc.
  • Rat HGF eg, XP_006236041.1 (gene: XM_006235979.2), NP_058713.1 (gene: NM_017017.2), etc.
  • rabbit HGF eg, XP_008256401.1 (gene: XM_008258179.1), XP_008256400.1 (gene: XM_008258178.1), XP_008256402.1 (gene: XM_008258180.1), NP_001162178.1 (gene: NM_001168707.1, etc.
  • monkey HGF e.g., XP_001108226.2 (gene: XM_00110822
  • One embodiment provides a biomarker for predicting the efficacy of a c-Met inhibitor comprising one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding the same and / or selecting a subject (or patient) for applying the c-Met inhibitor. .
  • compositions for predicting the efficacy of c-Met inhibitors and / or for selecting a subject (patient) for c-Met inhibitors comprising a substance that interacts with one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding the same; Provide the kit.
  • Another example is a method for predicting the efficacy of a c-Met inhibitor comprising measuring the level of one or more selected from the group consisting of HGF and a gene encoding the same in a biological sample, providing information for predicting the efficacy of a c-Met inhibitor.
  • a method, a method for screening a subject (patient) to be applied to a c-Met inhibitor, or a method for providing information for screening a subject (patient) to be applied to a c-Met inhibitor is provided.
  • the biological sample may be a cell, tissue, or culture thereof isolated from a living body (patient), for example, a cell (eg cancer cell), tissue (eg cancer tissue), and / or culture thereof isolated from a cancer patient. Specifically, cells isolated from kidney cancer patients (eg, kidney cancer cells), kidney cancer tissues (eg, kidney cancer tissues), and / or cultures thereof.
  • HGF is required for the c-Met inhibitor to act in the biological sample, so that the c-Met inhibitor is well It may mean that it can work. Therefore, in the method of predicting the efficacy of the c-Met inhibitor or the screening method of applying the c-Met inhibitor, when the level of one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding the biological sample, the biological sample or the The c-Met inhibitor may be determined (predicted) to be effective in the patient from which the biological sample is derived, or the biological sample or the patient from which the biological sample is derived may be judged as an application target of the c-Met inhibitor.
  • the method of providing information for predicting the efficacy or predicting the efficacy of the c-Met inhibitor after the step of measuring at least one level selected from the group consisting of the HGF and the gene encoding it, HGF in the biological sample And determining (predicting) that the c-Met inhibitor will be effective in the biological sample or a patient from which the biological sample is derived, when one or more levels selected from the group consisting of genes encoding the same are high. can do.
  • the method of selecting a target of the c-Met inhibitor or the method of providing information for selecting a target of the c-Met inhibitor is measured at least one level selected from the group consisting of the HGF and the gene encoding the same.
  • the method may further include determining the target.
  • the HGF may be HGF, eg, human HGF, and the gene encoding it may be an HGF gene, eg, a human HGF gene.
  • the high level of one or more selected from the group consisting of HGF and / or genes encoding the same may be determined based on the following criteria.
  • a biological sample isolated from a patient in which HGF and / or a gene encoding it is present or the c-Met inhibitor to be applied is ineffective, or a biological sample in which the c-Met inhibitor is ineffective (Comparative Criteria)
  • Samples such as RXF2282 (Oncotest, Germany) kidney cancer cell line, RXF631 (Oncotest, Germany) kidney cancer cell line, RXF1393 (Oncotest, Germany) kidney cancer cell line, RXF488 (Oncotest, Germany) kidney cancer cell line, H1373 (ATCC, CRL- 5866) Lung cancer cell line, HCC1806 (ATCC, CRL-2335) breast cancer cell line, Caki-1 (ATCC, HTB-46) kidney cancer cell line, SKBR3 (ATCC, HTB-30) breast cancer cell line, BT474 (ATCC, HTB-20) breast cancer Cell Line, HT-29 (ATCC, HTB-38) Colon Cancer Cell Line, LoVo (ATCC, CCL-229) Col
  • the comparative reference sample may be a cell, tissue, or a culture thereof, isolated from a living body or artificially cultured.
  • the efficacy prediction method and / or the subject selection method may further comprise the step of measuring the level of HGF and / or the gene encoding the comparative reference sample prior to the determining step.
  • the determining of the methods may include comparing one or more levels selected from the group consisting of HGF and genes encoding the biological samples with one or more levels selected from the group consisting of HGF and genes encoding the reference sample. And / or i) the c-Met inhibitor is efficacious in the biological sample or in a patient from which the biological sample is derived if at least one level selected from the group consisting of HGF in the biological sample and the gene encoding it is higher than the comparative reference sample. (Predictive) or judging the patient as a subject suitable for applying a c-Met inhibitor, or ii) at least one level selected from the group consisting of HGF and genes encoding the same in a biological sample. If lower than the sample, c-Met in the biological sample or in the patient from which the biological sample is derived. Judging that the inhibitor will not exert efficacy (prediction) or determining the patient as a subject not suitable for applying the c-Met inhibitor.
  • an IHC score of +1 or less such as A negative value can be determined as negative when a value of -0 or +1 is obtained, and a positive value can be determined as a value higher than +1 or more than +2, such as +2 to +3, is obtained.
  • a positive value can be determined as a value higher than +1 or more than +2, such as +2 to +3, is obtained.
  • +1 or +2 or more such as +2 to +3
  • the step of measuring the HGF level of the biological sample of the method of predicting efficacy and / or screening the subject can be performed by immunohistochemistry using a conventional antibody to HGF, the determining step is i C) If the result of immunohistochemistry is greater than +1 or more than +2, such as +2 to +3, the c-Met inhibitor will be effective in the biological sample or the patient from which the biological sample is derived.
  • Prediction or judging the patient as a subject suitable for applying a c-Met inhibitor, or ii) if the immunohistochemistry yields a value of +1 or less, e.g.,-, 0 to +1, Determining that a c-Met inhibitor will not be effective in a biological sample or a patient from which the biological sample is derived (predicted), or subjects not suitable for applying the c-Met inhibitor to the patient It may comprise determining a.
  • the level of the HGF or gene encoding it can be measured by any conventional protein or gene analysis method using the protein or a substance that interacts with the gene.
  • Substances that interact with the HGF or genes encoding them include small molecule chemicals (proteins, small molecules), proteins, peptides, nucleic acid molecules (polynucleotides, oligonucleotides, etc.) that specifically bind to the HGF or HGF genes. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • a substance that interacts with the HGF or a gene encoding it may be a small molecule compound that specifically binds to HGF, an antibody, an aptamer, and a nucleic acid molecule that binds to all or a portion of the HGF gene (eg, , Primers, probes, aptamers, etc.) may be one or more selected from the group consisting of.
  • the level of HGF can be measured through conventional enzymatic reactions, fluorescence, luminescence and / or radiation detection using compound compounds, antibodies, aptamers, etc. that specifically bind to the HGF, and specifically, immunity Immunochromatography, immunohistochemical staining, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay : FIA), luminescence immunoassay (LIA), Western blotting, microarray, and the like may be measured by a method selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the level of the HGF gene (DNA, cDNA or mRNA) can also be measured using conventional genetic analysis methods, such as conventional genetic analysis methods, such as using primers, probes, or aptamers that hybridize with the gene.
  • conventional genetic analysis methods such as using primers, probes, or aptamers that hybridize with the gene.
  • polymerase chain reaction PCR; for example, qPCR, real-time PCR, etc.
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • the primer is capable of detecting gene fragments of consecutive 5 to 1000 bp such as 10 to 500 bp, 20 to 200 bp, or 50 to 200 bp in the nucleotide sequence of the HGF gene (full length DNA, cDNA, or mRNA) And (eg, complementary) sequences capable of hybridizing with consecutive 5 to 100 bp, such as 5 to 50 bp, 5 to 30 bp, or 10 to 25 bp sites, each of the 3'- and 5'-ends of the gene fragment. It may be a primer pair.
  • the probe or aptamer may be one having a total length of 5 to 100 bp, 5 to 50 bp, 5 to 30 bp, or 5 to 25 bp, and is continuous in the nucleotide sequence of a gene encoding the HGF (full length DNA, cDNA, or mRNA).
  • 5 to 100 bp, 5 to 50 bp, 5 to 30 bp, or 5 to 25 bp gene fragment may be one having a sequence capable of binding or hybridizing (eg, complementary).
  • the term 'combinable' may mean that the gene may be bound to the gene site by chemical and / or physical bonds such as covalent bonds, and the term “hybridization possible” may refer to the nucleotide sequence of the gene site.
  • complementary binding may be achieved by having at least%, such as at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or at least 100% of sequence complementarity.
  • the step of measuring the level of one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding the same in the biological sample optionally i) preparing a biological sample; ii) treating (adding) and reacting the biological sample with a substance that interacts with at least one selected from the group consisting of HGF and genes encoding the same; And iii) analyzing the obtained reactant to quantify one or more selected from the group consisting of HGF and genes encoding the same.
  • Preparing the biological sample of step i) may include obtaining (separating) a biological sample from the patient or obtaining a biological sample separated from the patient.
  • the interacting substance consists of chemical, small molecules, proteins, peptides, nucleic acid molecules (polynucleotides, oligonucleotides, etc.) that specifically bind to HGF and / or HGF genes. It may be one or more selected from the group.
  • the interacting agent may be a small molecule that specifically binds to HGF, an antibody, an aptamer, or a polynucleotide that binds to some or all of a gene encoding HGF (eg, a primer, a probe, an aptamer). Etc.), and the like, which may or may not be labeled with a labeling material such as a fluorescent material or a coloring material.
  • the reactant may be a complex generated by interaction (binding) of at least one selected from the group consisting of HGF and / or HGF gene obtained in step ii) and a substance interacting with ,
  • the quantifying step is to quantify the generated complex, to measure the labeling material labeled on the complex, or to separate the complex from the sample, HGF and / or HGF gene from the separated HGF and And / or quantifying the HGF gene.
  • Quantification of the HGF is conventional protein quantification methods, such as immunochromatography, immunohistochemical staining, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunity Analysis (enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA), Western blotting, microarray, etc. It may be, but is not limited thereto.
  • Quantification of the HGF gene is a method selected from the group consisting of conventional gene quantification methods, such as polymerase chain reaction (PCR; such as qPCR, real-time PCR, etc.), fluorescent in situ hybridization (FISH), microarray method, and the like. It may be performed by, but is not limited thereto.
  • the method for predicting efficacy and / or subject selection may be performed after the step of judging to a patient judged (predicted) that the c-Met inhibitor will exhibit efficacy or to a patient determined to be suitable for applying the c-Met inhibitor.
  • the method may further comprise administering a pharmaceutically effective amount of a c-Met inhibitor.
  • the subject of application of the c-Met inhibitor refers to a patient suitable for applying a therapy using the c-Met inhibitor, and all mammals, such as primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats.
  • the biological sample may be any patient (eg, a mammal, including primates such as humans, monkeys, rodents, mice, etc.), for example cancer patients, more specifically kidney cancer patients, or the patient to which the c-Met inhibitor is to be applied.
  • Cells, tissues, body fluids eg, blood, serum, urine, saliva, etc. isolated from or artificially cultured, and the like, for example, cancer cells, cancer tissues and / or cultures thereof.
  • the subject may not be a lung cancer patient, and the biological sample may not be serum.
  • c-Met inhibitor in order for the c-Met inhibitor to be effective, it may be assumed that the target material, c-Met high expression conditions (present a certain level or more) is satisfied.
  • the composition (or kit) for predicting the efficacy of the c-Met inhibitor, or the composition (or kit) for selecting a target to be applied is a group consisting of c-Met and genes encoding the same (eg, full-length DNA, cDNA, mRNA, etc.). It may further comprise a substance interacting with at least one selected from.
  • a substance that interacts with the c-Met and / or a gene encoding the same may be a chemical, small molecule, protein, peptide or nucleic acid molecule that specifically binds to the c-Met and / or a gene encoding the same. (Polynucleotides, oligonucleotides, and the like) and the like.
  • a substance that interacts with the c-Met and / or a gene encoding the c-Met may be a compound that specifically binds to c-Met, an antibody, an aptamer, and a nucleic acid molecule that binds to all or a portion of the c-Met gene. (Eg, primers, probes, aptamers, etc.) and the like.
  • the method of predicting the efficacy of the c-Met inhibitor or the screening method to be applied may include the presence and / or level of c-Met protein in a biological sample obtained from a patient, and / or a gene encoding the same (eg, full-length DNA, cDNA, measuring the level of expression and / or expression of mRNA, etc.) may be further included.
  • Determining the level of c-Met protein in the sample or the gene encoding the same comprises the steps of measuring the level of HGF and / or genes encoding the same as described above
  • the specific measuring method is the same as the method of measuring the level of HGF described above and / or the gene encoding the same.
  • the c-Met inhibitor is a cancer. It may provide additional evidence for determining efficacy in c-Met related diseases such as (eg kidney cancer).
  • the “high level of c-Met protein” means, for example, a certain amount of total intracellular protein (eg, 10 ⁇ g (microgram) obtained from the biological sample (eg, cancer cells or cancer tissues), using a conventional western blotting method. )) And a band is detected when the membrane is exposed to the membrane for a predetermined time (eg, about 30 seconds).
  • the c-Met protein is present at a high level, and it may be determined that the treatment with the c-Met inhibitor has met the prerequisites for showing efficacy.
  • an IHC score is greater than +1 or greater than +2, such as between +2 and +3, upon immunohistochemistry (eg, using SP44 Ventana antibody) in a manner as described above, the "c-Met protein Or the level of expression of the gene is high. " As such, when c-Met high expression is recognized, it may be determined that treatment with c-Met inhibitors has met the prerequisites for efficacy.
  • the cancer cells having high expression characteristics of c-Met may be mainly cancer cells such as lung cancer, breast cancer, brain cancer, gastric cancer, liver cancer, and kidney cancer, but all of these cancer cells do not exhibit c-Met inhibitors.
  • a process of predicting efficacy by HGF level must be additionally performed to enable more accurate prediction of efficacy.
  • the biological sample used in the method of predicting the efficacy of the c-Met inhibitor or a screening method for applying the c-Met inhibitor may be a tissue, cell, or body fluid (blood, serum, urine, saliva, etc.) with high c-Met expression. ), Such as cancer tissue, cancer cells, and / or cultures thereof, more specifically cancer cells of kidney cancer, cancer tissues and / or cultures thereof.
  • Another example provides a method of inhibiting (or cleaving) c-Met comprising administering a c-Met inhibitor to at least one high level subject selected from the group consisting of HGF and / or genes encoding the same.
  • Another example provides a method of treating cancer comprising administering a c-Met inhibitor to at least one high level subject selected from the group consisting of HGF and / or a gene encoding the same.
  • One or more levels selected from the group consisting of HGF and / or genes encoding the same may be determined as described above.
  • At least one high level patient selected from the group consisting of the HGF and the gene encoding the same may be a subject selected by the selection composition, kit and / or method to which the c-Met inhibitor described above is applied. Therefore, the c-Met inhibition method or the method of treating cancer may further comprise the step of selecting the anti-c-Met antibody application target prior to the administering step, the specific methods and steps as described above.
  • the c-Met inhibition method or a method for preventing and / or treating cancer More specifically, the c-Met inhibition method or a method for preventing and / or treating cancer,
  • Selecting at least one level of c-Met inhibitor by measuring one or more levels selected from the group consisting of HGF and / or genes encoding the biological samples;
  • the administration conditions of the c-Met inhibitor such as the dosage, the interval of administration, and / or the number of administrations may be appropriate administration conditions of the c-Met inhibitor determined in the efficacy assay method of the c-Met inhibitor.
  • a "c-Met inhibitor” may be any substance that recognizes and / or binds to and degrades, inhibits expression or inhibits function of c-Met.
  • the c-Met inhibitor may be at least one selected from the group consisting of anti-c-Met antibodies, antigen-binding fragments thereof, small molecule c-Met inhibitors, and the like.
  • the small molecule c-Met inhibitor is crizotinib (PF-02341066; 3-((R) -1- (2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethoxy) -5- (1- (piperidin-4- yl) -1H-pyrazol-4-yl) pyridin-2-amine), cabozantinib; XL-184; N- (4- (6,7-dimethoxyquinolin-4-yloxy) phenyl) -N- ( 4-fluorophenyl) cyclopropane-1,1-dicarboxamide), forretinib; N- (3-fluoro-4- (6-methoxy-7- (3-morpholinopropoxy) quinolin-4-yloxy) phenyl) -N- (4-fluorophenyl) cyclopropane-1,1-dicarboxamide), PHA-665752 ((R, Z) -5- (2,6-dichlorobenz
  • the anti-c-Met antibody or antigen-binding fragment thereof may be any antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes c-Met as an antigen.
  • the antigen binding fragment may be selected from the group consisting of scFv, (scFv) 2, scFv-Fc, Fab, Fab 'and F (ab') 2 of the antibody.
  • the anti-c-Met antibody may be any antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to c-Met to induce intracellular migration and degradation.
  • the anti-c-Met antibody may be to recognize a specific site of c-Met, such as a specific site in the SEMA domain as an epitope.
  • the "c-Met protein” refers to receptor tyrosine kinase that binds to hepatocyte growth factor.
  • the c-Met protein may be from any species, eg, from a primate such as human c-Met (eg NP_000236), monkey c-Met (eg Macaca mulatta, NP_001162100), or mouse c- Or from rodents such as Met (eg NP — 032617.2), rat c-Met (eg NP — 113705.1), and the like.
  • the protein includes, for example, a polypeptide encoded by a nucleotide sequence provided in GenBank Aceession Number NM_000245, or a protein encoded by a polypeptide sequence provided in GenBank Aceession Number NM_000236, or an extracellular domain thereof.
  • Receptor tyrosine kinase c-Met is involved in various mechanisms, for example, cancer development, cancer metastasis, cancer cell migration, cancer cell infiltration, neovascularization process, and the like.
  • c-Met is divided into three parts: the extracellular site, the transmembrane site, and the intracellular site.
  • the SEMA domain is an HGF binding domain in which ⁇ - and ⁇ -subunits are linked by disulfide bonds.
  • PSI domain plexin-semaphorins-integrin homology domain
  • IPT domain immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain.
  • the SEMA domain of the c-Met protein may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 79, and is a domain existing at an extracellular site of c-Met and corresponds to a site to which HGF binds.
  • epitope is an antigenic determinant and is understood to mean a portion of an antigen recognized by an antibody.
  • the epitope is the 106th site in a site comprising five or more contiguous amino acids in the SEMA domain (SEQ ID NO: 79) of the c-Met protein, eg, the SEMA domain (SEQ ID NO: 79) of the c-Met protein.
  • SEMA domain SEQ ID NO: 79
  • To 124 th may include the contiguous 5 to 19 amino acids located in SEQ ID NO: 71.
  • the epitope may be composed of 5 to 19 consecutive amino acids including SEQ ID NO: 73 (EEPSQ) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, for example, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 or SEQ ID NO: 73 It may be a polypeptide having.
  • the epitope having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 corresponds to the outermost position of the loop site between the domains of propeller structure 2 and 3 in the SEMA domain of c-Met protein, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73
  • the epitope having is the site to which the antibody or antigen binding fragment according to one embodiment most specifically binds.
  • the anti-c-Met antibody may specifically bind to an epitope comprising 5 to 19 consecutive amino acids comprising SEQ ID NO: 73 (EEPSQ) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, eg, a sequence.
  • an antibody or antigen binding fragment that specifically binds to an epitope having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, or SEQ ID NO: 73.
  • the anti-c-Met antibody the anti-c-Met antibody
  • Consecutive 8 to 19 comprising CDR-H1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or the third to tenth amino acids within the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 CDR-H2 having an amino acid sequence consisting of four amino acids, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, or a contiguous 6 to 6 amino acid including the first to sixth amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85; At least one heavy chain complementarity determining region (CDR) selected from the group consisting of CDR-H3 having an amino acid sequence of 13 amino acids, or a heavy chain variable region comprising said at least one heavy chain complementarity determining region;
  • CDR heavy chain complementarity determining region
  • CDR-L1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, CDR-L2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, or One or more light chain complementarity determining regions or one or more light chain complementarity determining regions selected from the group consisting of CDR-L3 having an amino acid sequence consisting of 9 to 17 amino acids comprising the first to ninth amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89; Light chain variable region comprising a region;
  • SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence represented by the general formulas (I) to (VI), respectively:
  • Trp-Xaa 11 -Ser-Xaa 12 -Arg-Val-Xaa 13 SEQ ID NO: 8
  • Xaa 1 is absent or Pro or Ser
  • Xaa 2 is Glu or Asp
  • Xaa 3 is Asn or Lys
  • Xaa 4 is Ala or Val
  • Xaa 5 is Asn or Thr
  • Xaa 6 is Ser or Thr
  • Xaa 7 is His, Arg, Gln or Lys
  • Xaa 8 is Ser or Trp
  • Xaa 9 is His or Gln
  • Xaa 10 is Lys or Asn
  • Xaa 11 is Ala or Gly
  • Xaa 12 is Thr or Lys
  • Xaa 13 is Ser or Pro
  • Xaa 14 is Gly, Ala or Gln
  • Xaa 15 is Arg, His, Ser, Ala, Gly or Lys
  • Xaa 16 is Leu, Tyr, Phe or Met.
  • the CDR-H1 may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • the CDR-H2 may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26.
  • the CDR-H3 may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 85.
  • the CDR-L1 may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 106.
  • the CDR-L2 may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 36.
  • the CDR-L3 may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 86, and SEQ ID NO: 89.
  • the antibody or antigen-binding fragment is a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 (CDR-H1), SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25, and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 26 (CDR-H2), and a poly having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 85
  • a heavy chain variable region comprising a peptide (CDR-H3); And polypeptide (CDR-L1), SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 106;
  • the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 or An amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, wherein the light chain variable region is SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96 , SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 or may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107.
  • Animal-derived antibodies that are produced by immunizing a desired antigen with an immunized animal are generally capable of immunorejection upon administration to humans for therapeutic purposes, and chimeric antibodies have been developed to suppress such rejection.
  • Chimeric antibodies are obtained by replacing the constant region of an animal-derived antibody causing an anti-isotype reaction with the constant region of a human antibody using genetic engineering methods. Chimeric antibodies have been significantly improved in anti-isotype responses compared to animal derived antibodies, but still contain adverse effects on potential anti-idiotypic reactions due to the presence of animal-derived amino acids in the variable region. Doing. Humanized antibodies have been developed to ameliorate these side effects. It is produced by implanting a complementary region determining region (CDR), which plays an important role in antigen binding, among the variable regions of chimeric antibodies in the human antibody framework.
  • CDR complementary region determining region
  • CDR grafting technology for producing humanized antibody is to select an optimized human antibody that can best accept the CDR region of an animal-derived antibody.
  • structure analysis and molecular modeling techniques are used to select an optimized human antibody that can best accept the CDR region of an animal-derived antibody.
  • amino acids that are located in the skeleton of an animal-derived antibody and affect antigen binding.
  • additional antibody engineering techniques to restore antigen binding capacity is essential.
  • the antibody may be a mouse derived antibody, a mouse-human chimeric antibody, a humanized antibody, or a human derived antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be isolated in vivo or non-naturally occurring (ie, not naturally present).
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be prepared recombinantly or synthetically.
  • a complete antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • the constant region of the antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has a gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) type, and a subclass.
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • variable chain refers to the variable region domain V H and the three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 and hinges, comprising an amino acid sequence having a variable region sequence sufficient to confer specificity to the antigen. It is interpreted to include both the full length heavy chain including the hinge and fragments thereof.
  • light chain refers to both the full-length light chain and fragment thereof comprising the variable region domain V L and the constant region domain C L comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. It is interpreted to include.
  • complementarity determining region refers to the amino acid sequences of the hypervariable regions of the heavy and light chains of immunoglobulins.
  • the heavy and light chains may each comprise three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3).
  • the CDRs can provide key contact residues for the antibody to bind antigen or epitope.
  • the term “specifically binds” or “specifically recognized” is the same as commonly known to those skilled in the art, and the antigen and the antibody specifically interact with each other to perform an immunological response. Means that.
  • antigen binding fragment refers to a portion of a polypeptide that includes a portion to which an antigen can bind, as a fragment thereof for the entire structure of an immunoglobulin.
  • the antigen binding fragment may be, but is not limited to, scFv, (scFv) 2 , Fab, Fab 'or F (ab') 2 .
  • Fab of the antigen-binding fragment has one antigen-binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and a first constant region of the heavy chain (C H1 ).
  • F (ab ') 2 antibodies are produced when the cysteine residues of the hinge region of Fab' form disulfide bonds. Recombinant techniques for generating Fv fragments with minimal antibody fragments in which Fv has only heavy and variable chain regions are well known in the art.
  • Double-chain Fv is a non-covalent bond in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked, and the single-chain Fv is generally shared by the variable region of the heavy chain and the short chain variable region through a peptide linker. It may be linked by bond or directly at the C-terminus to form a dimer-like structure such as a double chain Fv.
  • the peptide linker may be a polypeptide consisting of 1 to 100 or 2 to 50 arbitrary amino acids, and the amino acid type included therein is not limited.
  • the antigen binding fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain can yield Fab and cleavage with pepsin can yield F (ab ') 2 fragment). It can be produced through genetic recombination technology.
  • proteolytic enzymes e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain can yield Fab and cleavage with pepsin can yield F (ab ') 2 fragment. It can be produced through genetic recombination technology.
  • the previously defined CDR or light chain variable region and heavy chain variable region of the anti-c-Met antibody are immunoglobulins of all subtypes (eg, IgA, IgD, IgE, And (eg, light chain constant region and heavy chain constant region) derived from IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, and the like.
  • flankinge region refers to a region included in the heavy chain of an antibody, which exists between CH1 and CH2 regions, and which functions to provide flexibility of the antigen binding site in the antibody.
  • the animal-derived IgG1 hinge When an animal-derived antibody undergoes chimerization, the animal-derived IgG1 hinge is replaced with a human IgG1 hinge, but the animal-derived IgG1 hinge is shorter than the human IgG1 hinge and has a disulfide bond between two heavy chains. Disulfide bonds are reduced from three to two, resulting in different rigidity of the hinges.
  • modification of the hinge region can increase the antigen binding efficiency of the humanized antibody. Deletion, addition or substitution of amino acids for modifying the amino acid sequence of the hinge region is well known to those skilled in the art.
  • the anti-c-Met antibody or antigen-binding fragment comprises a hinge region in which the amino acid sequence is modified by deletion, addition or substitution of one or more amino acids.
  • the antibody may comprise a hinge region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, or SEQ ID NO: 104, or a hinge region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 (unmodified human hinge). Area). More specifically, the hinge region may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 or SEQ ID NO: 101.
  • the anti-c-Met antibody may be a monoclonal antibody that specifically binds to an extracellular region of the c-Met protein produced in a hybridoma cell with accession number KCLRF-BP-00220. (See Korean Patent Publication No. 2011-0047698; which document is incorporated herein by reference).
  • the anti-c-Met antibody may include all of the antibodies defined in Korean Patent Publication No. 2011-0047698.
  • the light chain constant region and the heavy chain constant region except for the previously defined CDR region or the light chain variable region and the heavy chain variable region of the anti-c-Met antibody may be the light chain constant region and the heavy chain constant region of all subtypes of immunoglobulins.
  • the anti-c-Met antibody the anti-c-Met antibody
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 (wherein the first to seventeenth amino acid sequences are signal peptides), the amino acid sequence of the 18th to 462th sequences of SEQ ID NO: 62, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 (from the first The 17th amino acid sequence is the signal peptide) or the 18th to 461th amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 (wherein the 1st to 17th amino acid sequences are signal peptide), And a heavy chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the 18th to 460th amino acid sequences of SEQ ID 66; And
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68 (the amino acid sequence of 1st to 20th among them is a signal peptide), the amino acid sequence of the 21st to 240th amino acids of SEQ ID NO: 68, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 (from 1st of these)
  • a light chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of the 20th amino acid sequence), the 21st to 240th amino acid sequence of SEQ ID 70, and the amino acid sequence of SEQ ID 108
  • the anti-c-Met antibody for example, the anti-c-Met antibody,
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 or the amino acid sequence of the 18th to 462th sequence of SEQ ID NO: 62 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68 or the amino acid sequence of the 21st to 240th amino acids of SEQ ID NO: 68;
  • Antibody comprising;
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 or the amino acid sequence of the 18th to 461th sequences of SEQ ID NO: 64 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68 or the amino acid sequence of the 21st to 240th amino acids of SEQ ID NO: 68;
  • Antibody comprising;
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or the amino acid sequence of the 18th to 460th sequence of SEQ ID NO: 66 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68 or the amino acid sequence of the 21st to 240th amino acids of SEQ ID NO: 68;
  • Antibody comprising;
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 or the amino acid sequence of the 18th to 462th sequence of SEQ ID NO: 62 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or the amino acid sequence of the 21st to 240th amino acids of SEQ ID NO: 70;
  • Antibody comprising;
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 or the amino acid sequence of the 18th to 461th sequence of SEQ ID NO: 64 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or the amino acid sequence of the 21st to 240th amino acids of SEQ ID NO: 70;
  • Antibody comprising; or
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or the amino acid sequence of the 18th to 460th sequence of SEQ ID NO: 66 and a light chain comprising the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or the 21st to 240th amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; Containing antibody
  • An antibody comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 or the amino acid sequence of the 18th to 462th sequence of SEQ ID NO: 62 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108;
  • An antibody comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 or the amino acid sequence of the 18th to 461th sequences of SEQ ID NO: 64 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108;
  • An antibody comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or the amino acid sequence of the 18th to 460th sequence of SEQ ID NO: 66 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 is a light chain consisting of a human kappa constant region
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68 is 36 times (kabat numbering) in the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70
  • histidine is a form of polypeptide substituted with tyrosine. Due to the substitution, the yield of the antibody according to one embodiment may be increased.
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108 is located at position 27e by kabat numbering in the polypeptide having the 21st to 240th amino acid sequence except for the 1st to 20th signal peptides among the amino acid sequences of SEQ ID NO: 68 serine (Ser) of position 32 according to kabat numbering (in SEQ ID NO: 108; inside CDR-L1) is substituted with tryptophan (Trp), and because of this substitution, the activity of the antibody according to one embodiment (eg, binding affinity for c-Met, c-Met degrading activity and Akt phosphorylation inhibitory activity, etc.) may be further enhanced.
  • the activity of the antibody according to one embodiment eg, binding affinity for c-Met, c-Met degrading activity and Akt phosphorylation inhibitory activity, etc.
  • the anti-c-Met antibody may be an anti-c-Met antibody comprising a light chain complementarity determining region of SEQ ID NO: 106, a light chain variable region of SEQ ID NO: 107, or a light chain of SEQ ID NO: 108.
  • the c-Met inhibitor may be applied (administered) together with a pharmaceutically acceptable carrier, and the pharmaceutically acceptable carrier, which is commonly used in the formulation of drugs, includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol , Mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate , Talc, magnesium stearate, mineral oil and the like may be one or more selected from the group, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutically acceptable carrier which is commonly used in the formulation of drugs, includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol , Mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water
  • the c-Met inhibitor further comprises one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions in addition to the above components. can do.
  • the c-Met inhibitor may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration or rectal administration.
  • oral administration because proteins or peptides are digested, oral compositions should be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the c-Met inhibitor may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount in which a drug can produce a pharmaceutically meaningful effect.
  • the pharmaceutically effective amount of a c-Met inhibitor for a single dose depends on factors such as the formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, interval of administration, route of administration, rate of excretion and response to response. It can be prescribed in various ways.
  • the pharmaceutically effective amount of the c-Met inhibitor for single administration may range from 0.001 to 100 mg / kg, or from 0.02 to 10 mg / kg, but is not limited thereto.
  • Pharmaceutically effective amounts for single administration may be formulated into one formulation in unit dosage form, may be formulated in appropriate quantities, or may be prepared within a multi-dose container.
  • c-Met inhibitors can be used for the prevention and / or treatment of cancer and / or cancer metastasis.
  • the cancer may be associated with overexpression and / or abnormal activation of c-Met, for example the cancer may be kidney cancer.
  • Such cancers include primary cancer as well as metastatic cancer.
  • the cancer may also be a cancer that is resistant to existing c-Met inhibitors (eg, anti-c-Met antibodies).
  • the prophylactic and / or therapeutic effect of the cancer is not only an effect of inhibiting the growth of cancer cells, but also an effect of inhibiting migration, invasion, and / or metastasis, and / or worsening of cancer. Includes inhibitory effects.
  • 1 to 8 are graphs showing the efficacy (tumor volume) of anti-c-Met antibodies against eight patient-derived xenograft models.
  • FIGS. 9 shows ELGF levels in tissues of the anti-c-Met antibody potency group (anti-c-Met antibody reactivity model) and the ineffective group (anti-c-Met antibody non-responsive model) determined as a result shown in FIGS. This graph shows the result of quantification.
  • FIG. 10 shows ELGF levels of HGF levels in serum of the anti-c-Met antibody potency group (anti-c-Met antibody reactivity model) and the ineffective group (anti-c-Met antibody non-responsive model) determined as a result shown in FIGS. This graph shows the result of quantification.
  • FIG. 11 shows HGF mRNA levels in tissues of the anti-c-Met antibody potency group (anti-c-Met antibody reactivity model) and the ineffective group (anti-c-Met antibody non-responsive model) determined as a result shown in FIGS. This graph shows the result of quantification.
  • FIG. 12 is a graph showing anti-c-Met antibody potency ( ⁇ : efficacy group; ⁇ : ineffective group) and serum HGF levels against lung cancer mouse xenograft model along with results in kidney cancer mouse xenograft model.
  • FIG. 13 is a graph showing anti-c-Met antibody potency ( ⁇ : efficacy group; ⁇ : ineffective group) and HGF levels in tissues against lung cancer mouse xenograft model with results from kidney cancer mouse xenograft model.
  • IHC immunohistochemistry
  • Figure 16 is a graph showing the correlation between the ELISA results and T / C ratio of HGF.
  • 17 is a graph showing the correlation between the ICH score and T / C ratio of HGF.
  • mice each had 100 ⁇ g of human c-Met / Fc fusion protein (R & D Systems) equivalent to a complete Freund's adjuvant.
  • human c-Met / Fc fusion protein R & D Systems
  • mice obtained with sufficient amounts of antibodies were selected, and the following cell fusion process was performed.
  • the obtained splenocytes 1x10 8 and myeloma cells (Sp2 / 0) 1x10 8 were mixed and centrifuged to precipitate the cells.
  • the centrifuged precipitate was slowly dispersed, treated with 45% (w / v) polyethylene glycol (PEG) (1 mL) contained in the culture medium (DMEM), maintained at 37 ° C. for 1 minute, and then culture medium. 1 ml (DMEM) was added. Thereafter, 10 ml of culture medium (DMEM) was added for 1 minute, left for 5 minutes in water at 37 ° C., and centrifuged again at 50 ml.
  • PEG polyethylene glycol
  • the cell precipitate was resuspended in a separation medium (HAT medium) at about 1 ⁇ 2 ⁇ 10 5 / ml, aliquoted in 96 ml well plates, and cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator to prepare a hybridoma cell group.
  • HAT medium a separation medium
  • Human c-Met / Fc fusion protein and human Fc protein were used as antigens to select hybridoma cells that specifically react with c-Met protein among the hybridoma cell groups prepared in Reference Example 1.1.2. Screened through ELISA assay method.
  • hybridoma cell lines that do not bind to human Fc but secrete antibodies with high specificity only to human c-Met protein were repeatedly selected. Limiting dilution of the hybridoma cell line obtained through repeated screening yielded a final clone of one hybridoma cell line producing monoclonal antibody.
  • the final screened monoclonal antibody-producing hybridomas were deposited on October 6, 2009 with the Korea Cell Line Research Foundation, located in Yeongun-dong, Jongno-gu, Seoul, under the Treaty of Budapest, and received accession number KCLRF-BP-00220 (Korea See Publication 2011-0047698).
  • the hybridoma cells obtained in Reference Example 1.1.3 were cultured in serum-free medium, and monoclonal antibodies were produced and purified from the culture.
  • the hybridoma cells cultured in 50 ml of culture medium (DMEM) medium containing 10% (v / v) FBS were centrifuged, and the cell precipitates were washed two or more times with 20 ml PBS to remove FBS.
  • the cell precipitate was resuspended in 50 ml of culture medium (DMEM) medium, and then cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator for 3 days.
  • the cells producing the antibody were removed by centrifugation, and the culture medium in which the antibodies were secreted was separated and stored at 4 ° C. or collected immediately and used for separation and purification of the antibody.
  • a protein aggregation filter (Amicon) was used. Purified antibody was stored by substituting the supernatant with PBS for use in subsequent examples.
  • mouse antibodies are highly likely to show immunogenicity when injected into humans for therapeutic purposes.
  • mutations related to antigen binding from the mouse antibody AbF46 produced in Reference Example 1.1.4 above may be solved.
  • a chimeric antibody chAbF46 was constructed in which the constant region except for the variable region was substituted with the sequence of the human IgG1 antibody.
  • the nucleotide sequence corresponding to the heavy chain is 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI' (SEQ ID NO: 38), and the nucleotide sequence corresponding to the light chain is 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-TGA'
  • SEQ ID NO: 39 Each gene was designed to be composed of -XhoI '(SEQ ID NO: 39).
  • the DNA fragment (SEQ ID NO: 38) having the nucleotide sequence corresponding to the heavy chain was added to the pOptiVEC TM -TOPO TA Cloning Kit included in the OptiCHO TM Antibody Express Kit (Cat no.
  • the constructed vectors were amplified using Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662), respectively, and the temporary expression was Freestyle TM. This was done using the MAX 293 Expression System (invitrogen).
  • the cell line used was 293 F cells, and cultured by suspension culture using FreeStyle TM 293 Expression Medium as a medium. The cells were prepared at a concentration of 5x10 5 cells / ml one day before the temporary expression, and then after 24 hours, the cells were temporarily expressed when the number of cells reached 1x10 6 cells / ml.
  • the cultured cells were centrifuged to obtain 100 ml of supernatant, respectively, and purified using AKTA Prime (GE healthcare).
  • Protein A column (GE healthcare, 17-0405-03) was installed in AKTA Prime, and the culture solution was flowed at a flow rate of 5 ml / min, and then eluted with IgG elution buffer (Thermo Scientific, 21004).
  • the obtained eluate was exchanged with PBS buffer to finally purify the chimeric antibody AbF46 (hereinafter referred to as chAbF46).
  • VH gene of the mouse antibody AbF46 purified in Reference Example 1.2 above through Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)
  • Ig Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
  • CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 of mouse antibody AbF46 were defined as Kabat numbering
  • the CDR portion of mouse antibody AbF46 was defined as It was designed to be introduced into the framework of VH3-71.
  • amino acids 30 S ⁇ T
  • 48 V ⁇ L
  • 73 D ⁇ N
  • 78 T ⁇ L
  • H1 mutated the amino acids 83 R ⁇ K
  • 84 A ⁇ T
  • H4-heavy the framework sequence of human antibody was found. As a result, Kabat numbering was defined using the most stable VH3 subtype known to be similar to that of AbF46 antibody. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 of the mouse antibody AbF46 were introduced. This established H4-heavy (SEQ ID NO: 42).
  • H1-light SEQ ID NO: 43
  • H2-light SEQ ID NO: 44
  • mouse antibody AbF46 via Ig Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
  • Ig Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
  • VK4-1 had 75% homology at the amino acid level
  • CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 of mouse antibody AbF46 were defined as Kabat numbering
  • the CDR portion of mouse antibody AbF46 was defined as It was designed to be introduced into the backbone of VK4-1.
  • H3-light SEQ ID NO: 45
  • Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
  • VK2-40 was selected in addition to VK4-1.
  • CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 of the mouse antibody AbF46 was defined as Kabat numbering, and the CDR of the mouse antibody AbF46 was determined.
  • the part was designed to be introduced into the backbone of VK4-1.
  • H3-light was constructed by back-mutating three amino acids 36 (Y ⁇ H), 46 (L ⁇ M), and 49 (Y ⁇ I).
  • H4-light For the design of H4-light (SEQ ID NO: 46), we found the framework sequences of human antibodies and found that CDR-L1 of mouse antibody AbF46, defined by Kabat numbering, using the most known Vk1 subtype, CDR-L2, CDR-L3 were introduced. At this time, H4-light was constructed by further back-mutation of three amino acids 36 (Y ⁇ H), 46 (L ⁇ M), 49 (Y ⁇ I).
  • the constructed vectors were amplified using Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662), respectively, and the temporary expression was Freestyle TM. This was done using the MAX 293 Expression System (invitrogen).
  • the cell line used was 293 F cells, and cultured by suspension culture using FreeStyle TM 293 Expression Medium as a medium. The cells were prepared at a concentration of 5x10 5 cells / ml one day before the temporary expression, and then after 24 hours, the cells were temporarily expressed when the number of cells reached 1x10 6 cells / ml.
  • the cultured cells were centrifuged to take 100 ml of each supernatant, and purified using AKTA Prime (GE healthcare). Protein A column (GE healthcare, 17-0405-03) was installed in AKTA Prime, and the culture solution was flowed at a flow rate of 5 ml / min, and then eluted with IgG elution buffer (Thermo Scientific, 21004). This was exchanged with PBS buffer to finally purify the humanized antibody AbF46 (hereinafter referred to as huAbF46). Meanwhile, the heavy and light chain combinations of the humanized antibody huAbF46 used in the following examples are H4-heavy (SEQ ID NO: 42) and H4-light (SEQ ID NO: 46).
  • Genes for constructing the scFv of the huAbF46 antibody were designed using the heavy and light chain variable regions of the huAbF46 antibody.
  • Each heavy and light chain variable region was in the form of 'VH-linker-VL' and the linker was designed to have an amino acid sequence of 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS' (SEQ ID NO: 54).
  • the polynucleotide encoding the scFv of the huAbF46 antibody thus designed (SEQ ID NO: 55) was synthesized by Bioneer, and a vector for expressing it was shown in SEQ ID NO: 56.
  • CDRs Six complementarity determining regions (CDRs) were defined by 'Kabat numbering' from the mouse antibody AbF46 prepared above for affinity maturation of the huAbF46 antibody, and each CDR is shown in Table 1 below. .
  • CDR Amino acid sequence CDR-H1 DYYMS (SEQ ID NO: 1) CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG (SEQ ID NO: 2) CDR-H3 DNWFAY (SEQ ID NO: 3) CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA (SEQ ID NO: 10) CDR-L2 WASTRVS (SEQ ID NO: 11) CDR-L3 QQSYSAPLT (SEQ ID NO: 12)
  • Primers were prepared as follows to introduce random sequences of antibody CDRs. Conventional random sequence introduction method using N codon to introduce the same ratio of bases (25% A, 25% G, 25% C, 25% T) to the site to be mutated, but in this example huAbF46 antibody To introduce a random base into the CDRs of the 85% of the first and second nucleotides of the wild-type nucleotides were preserved and 5% of the remaining three bases were introduced. In addition, primers were designed such that the third nucleotide was introduced equally (33% G, 33% C, 33% T).
  • Construction of the antibody library gene by random sequence introduction of CDRs was performed using primers prepared in the same manner as in Reference Example 1.5.1. Using the polynucleotide containing the scFv of the huAbF46 antibody as a template, two PCR fragments were prepared, and the scFv library of the huAbF46 antibody mutated only the desired CDRs by the overlap extension PCR method. Libraries were constructed to target each of the six CDRs prepared by securing the gene.
  • each library showed a tendency to lower the binding capacity for c-Met than the wild type, but the binding capacity for some c-Met Remaining mutations were identified.
  • the gene sequence of scFv was analyzed from each individual clone.
  • the obtained gene sequences are shown in Table 2, respectively, and these were converted into IgG forms.
  • four antibodies produced from L3-1, L3-2, L3-3, L3-5 were selected for subsequent experiments.
  • the polynucleotides encoding the heavy chains of the four selected antibodies consist of 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI' (SEQ ID NO: 38), and the heavy chains do not alter the amino acid of the antibody after affinity maturation.
  • the heavy chain of huAbF46 antibody was used as it was.
  • the hinge region was replaced with the U6-HC7 hinge (SEQ ID NO: 57), not the hinge of human IgG1.
  • the light chains were designed to be composed of 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI' to synthesize genes, and the polynucleotides encoding the light chain variable regions of the four antibodies selected after affinity maturation (sequences). No. 58 to SEQ ID NO: 61) were synthesized by applying to Bioneer. Subsequently, the DNA fragment (SEQ ID NO: 38) having the nucleotide sequence corresponding to the heavy chain was added to the pOptiVEC TM -TOPO TA Cloning Kit included in the OptiCHO TM Antibody Express Kit (Cat no.
  • pcDNA TM 3.3 -TOPO DNA fragment having a nucleotide sequence corresponding to the light chain (TA fragment containing L3-1 derived CDR-L3: SEQ ID NO: 58, including CDR-L3 derived from L3-2) in TA Cloning Kit (Cat no. 8300-01) DNA fragment comprising SEQ ID NO: 59, L3-3-derived CDR-L3 DNA fragment: SEQ ID NO: 60, L3-5-derived CDR-L3 DNA fragment: SEQ ID NO: 61) by EcoRI (NEB, R0101S) By cloning with the XhoI (NEB, R0146S) restriction enzyme, a vector was constructed for expression of affinity matured antibodies.
  • the constructed vectors were amplified using Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662), respectively, and the temporary expression was Freestyle TM. This was done using the MAX 293 Expression System (invitrogen).
  • the cell line used was 293 F cells, and cultured by suspension culture using FreeStyle TM 293 Expression Medium as a medium. The cells were prepared at a concentration of 5x10 5 cells / ml one day before the temporary expression, and then after 24 hours, the cells were temporarily expressed when the number of cells reached 1x10 6 cells / ml.
  • the cultured cells were centrifuged to take 100 ml of each supernatant, and purified using AKTA Prime (GE healthcare). Protein A column (GE healthcare, 17-0405-03) was installed in AKTA Prime, and the culture solution was flowed at a flow rate of 5 ml / min, and then eluted with IgG elution buffer (Thermo Scientific, 21004). It was exchanged with PBS buffer to finally produce four types of antibodies (hereinafter, huAbF46-H4-A1 (from L3-1), huAbF46-H4-A2 (from L3-2), huAbF46-H4-A3 (L3-). 3), and huAbF46-H4-A5 (named from L3-5)).
  • huAbF46-H4-A1 from L3-1
  • huAbF46-H4-A2 from L3-2
  • huAbF46-H4-A3 L3-
  • the hinge region of huAbF46-H4-A1 which was determined to have the highest binding affinity with c-Met and the lowest degree of Akt phosphorylation and c-Met differentiation.
  • an antibody was prepared in which the constant region and the hinge region were substituted.
  • a polynucleotide encoding the polypeptide consisting of the heavy chain variable region of huAbF46-H4-A1, the U6-HC7 hinge and the IgG1 constant region of human (SEQ ID NO: 62), huAbF46- Polynucleotide encoding the polypeptide consisting of the heavy chain variable region of H4-A1, the human IgG2 hinge and the human IgG1 constant region (SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 65), the heavy chain variable region of huAbF46-H4-A1, human IgG2 Polynucleotide encoding the polypeptide consisting of a hinge and a human IgG2 constant region (SEQ ID NO: 66) (SEQ ID NO: 67), a light chain variable region of huAbF46-H4-A1 where histidine 36 is substituted with tyrosine and a human kappa constant region
  • the DNA fragment having the nucleotide sequence corresponding to the heavy chain was added to the pOptiVEC TM -TOPO TA Cloning Kit included in the OptiCHO TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019) of Invitrogen, pcDNA TM 3.3-TOPO
  • a DNA fragment having a nucleotide sequence corresponding to the light chain was inserted into a TA Cloning Kit (Cat no. 8300-01) to construct a vector for expression of the antibody.
  • the constructed vectors were amplified using Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662), respectively, and the temporary expression was Freestyle TM. This was done using the MAX 293 Expression System (invitrogen).
  • the cell line used was 293 F cells, and cultured by suspension culture using FreeStyle TM 293 Expression Medium as a medium. The cells were prepared at a concentration of 5x10 5 cells / ml one day before the temporary expression, and then after 24 hours, the cells were temporarily expressed when the number of cells reached 1x10 6 cells / ml.
  • the cultured cells were centrifuged to take 100 ml of each supernatant, and purified using AKTA Prime (GE healthcare). Protein A column (GE healthcare, 17-0405-03) was installed in AKTA Prime, and the culture solution was flowed at a flow rate of 5 ml / min, and then eluted with IgG elution buffer (Thermo Scientific, 21004). Finally, three antibodies (huAbF46-H4-A1 (U6-HC7), huAbF46-H4-A1 (IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1 (IgG2 Fc)) were purified.
  • huAbF46-H4-A1 (IgG2 Fc) was selected for the anti-c-Met antibody according to the present invention and used in the following examples, and for convenience, the antibody was named L3-1Y / IgG2.
  • Example 1 Identification of anti-c-Met antibody efficacy on kidney cancer xenograft model
  • Candidate drug final form (L3-1Y / IgG2 antibody) and empty vehicle (control) were administered to the eight mouse xenograft models, and tumor tissue size was measured to determine reactivity to the antibody.
  • L3-1Y / IgG2 PBS buffer in the case of control
  • Tumor size (mm 3 ) was calculated by volume using the formula of long diameter * short diameter * short diameter * 1/2, and discrimination of efficacy group was performed by rejecting the hypothesis of p-value less than 0.05 through ANOVA analysis.
  • the ANOVA test hypothesis that the tumor size distribution did not change compared to the group not administered in the antibody administration group, the group with a p-value less than 0.05 was determined as the ineffective group, the excess group.
  • mice xenograft models Tumor sizes of the obtained mouse xenograft models are shown in FIGS. 1 to 8.
  • Results of reactivity for L3-1Y / IgG2 treatment of each mouse xenograft model obtained from the results of FIGS. 1 to 8 are shown in Table 3 below:
  • Non-response group (ineffective group) Sample name RXF616, RXF2264, RXF1114, RXF739 RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488
  • the prepared FFPE block is used to measure membrane MET according to a standard protocol provided by the manufacturer using Ventana MET IHC (immunohistochemistry) (Roche; see US2013089541 A1), and the extracted total RNA is Real Time PCR (RT- PCR was used for the c-MET mRNA expression experiment (MET sense primer: CCTTGAACAGAATCACTG (SEQ ID NO: 110); MET anti-sense primer: CCATGTTTCATGTATGGTA (SEQ ID NO: 111)).
  • the IHC score obtained using the Ventana MET IHC method obtained is shown in Table 4 below.
  • an IHC score of 2 to 3 can be determined as an efficacy group.
  • all samples can be classified into an efficacy group having an IHC score of 3.
  • RXF616, RXF2264, RXF1114, and RXF739 are the only effective group of the anti-c-Met antibody and the rest are ineffective groups, and thus, c-Met level analysis by IHC method It can be seen that it is difficult to accurately select the efficacy group and the ineffective group for the c-Met antibody.
  • Example 2 against anti-c-Met antibodies Efficacy group Ineffective Within the organization HGF Level measurement
  • the eight patient-derived kidney cancer tissue prepared in Example 1 (RXF161, RXF2264, RXF1114, HGF levels in the tissues of the mouse xenograft model implanted with RXF739, RXF2282, RXF631, RXF1393, and RXF488) were measured to confirm the difference in tissue HGF levels between the L3-1Y / IgG2 and non-responder groups.
  • HGF quantification was performed according to Manufacture's protocol using HGF ELISA kit (R & D, DY194).
  • the expression level of HGF was high in the efficacy groups RXF1114 and RXF616 (IHC score 2 to 3), and the level of HGF expression was low in the ineffective groups RXF1393 and RXF488 (IHC score 0 to 1). ).
  • Correlation between HGF levels and reactivity with c-Met inhibitors was measured by measuring the correlation between the obtained ELISA results and the IHC score and the T / C (tumor / control) ratio of each sample. Check once. The lower the T / C ratio value, the higher the reactivity with the c-Met inhibitor.
  • FIG. 16 correlation between ELISA results and T / C ratio
  • FIG. 17 correlation between IHC score and T / C ratio
  • Example 3 anti-c-Met antibody Efficacy group Ineffective In serum HGF Level measurement
  • mice xenograft models prepared in Example 1 were measured to determine the difference in serum HGF levels between the L3-1Y / IgG2 and non-responder groups.
  • the collected serum of each mouse xenograft model was analyzed using the R & D HGF ELISA kit (DY194), and the experiment was carried out in an assay diluent buffer at 1/2 (v / v) of mouse serum according to the manufacture's guideline. After dilution, the plate was coated with biotinylated anti-human HGF antibody (R & D, DY194) for 1 hour and 30 minutes at room temperature. After the reaction was finished, the sample was washed with the wash buffer included in the HGF ELISA (DY194) kit, and reacted with the detection antibody included in the kit, and the result was measured in an ELISA reader by HRP reaction. The analyzed data was calculated by calculating the HGF concentration in serum using the standard included in the kit, and multiplied by dilution factor to quantify the serum HGF level.
  • Example 4 against anti-c-Met antibodies Efficacy group Ineffective HGF mRNA Level measurement
  • Example 5 Lung Cancer Xenograft Model In serum And Within the organization HGF Level measurement
  • Oncotest (Oncotest) (Oncotest Co., Ltd.), a mouse xenograft model transplanted with patient-derived lung cancer cells (non-small cell lung cancer (NSCLC); LXFA289, LXFA400, LXFA526, LXFA623, LXFA677, LXFA749, LXFA923, LXFA1647, LXFA1848, LXFA2158, LXFA2201) , Freibrug Germany) (NMRI nude mice (4-6 weeks old, female; Harlan) cultured in patient-derived lung cancer cells were injected).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • FIG. 12 also shows the results (FIG. 10) obtained in the kidney cancer mouse xenograft model ( ⁇ : efficacy group; ⁇ : ineffective group).
  • FIG. 13 also shows the results (FIG. 9) obtained from the kidney cancer mouse xenograft model ( ⁇ : efficacy group; ⁇ : ineffective group).
  • serum HGF levels in kidney cancer do not accurately reflect responsiveness to L3-1Y / IgG2, and in the case of lung cancer, serum HGF levels were detected in both the effective and ineffective groups. Significantly deviated (no HGF detected), indicating no responsiveness to L3-1Y / IgG2.
  • HGF levels in tissues in kidney cancer accurately reflect reactivity to L3-1Y / IgG2, whereas in lung cancer, HGF levels in tissues in both afflicted and ineffective groups showed a detection range. Off (no HGF detected), it did not appear to reflect any responsiveness to L3-1Y / IgG2.
  • HGF is a ligand of c-Met, but whether or not it reflects the efficacy of a c-Met inhibitor according to the type of cancer is particularly useful as a marker that specifically reflects the efficacy of a c-Met inhibitor in kidney cancer.
  • HGF in tissues, rather than serum can be used to predict the reactivity of c-Met inhibitors more accurately.

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Abstract

c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 HGF, 및 HGF의 검출 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 조성물이 제공된다.

Description

C-MET 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 HGF
c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 HGF (Hepatocyte Growth Factor) 및 HGF의 검출 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 조성물이 제공된다.
바이오마커(Biomarker)란 외부적인 영향으로 인해 생명체 내부에서 유발된 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 암, 뇌졸중, 치매 등 각종 질병을 진단하거나 특정 치료제의 효능을 예측하기 위한 용도로 연구가 활발해 지고 있다. 약물 개발과 관련한 바이오마커로는 약물의 생체 내 작용여부를 확인하기 위한 효능 검정 마커 (Pharmacodynamic marker; PD 마커), 생체 내 투여이전에 약물의 반응성을 미리 예측하여 투여할 수 있는 효능 예측 마커(Predictive marker) 등이 있다. 이러한 marker의 활용은 약물의 임상전략을 수립하는데 도움이 되는데, 가령 약물의 작용을 통해 효능이 예상되는 효능 예측 마커의 경우에는 환자 선별 과정에 활용하여 보다 효과적인 약물 치료 전략을 수립할 수 있도록 한다.
한편, 암은 현재까지 주요 사망원인중의 하나이다. 의료기술의 발달로 암의 치료 기술에 눈에 뛰는 변화가 오고 있지만, 5년 생존률 수치는 지난 20년 동안 10%정도 향상에 그쳤을 뿐이다. 이는 암의 급속한 성장, 전이 등의 특성으로 적정시기의 진단과 치료가 어렵기 때문이라고 할 수 있다. 적절한 바이오마커를 암 치료에 도입함으로써, 암의 특성을 파악하여 적절한 치료제를 적기에 사용할 수 있는 기회를 증대시켜 암 치료의 성공률을 크게 높일 수 있다. 가령, 동일한 폐암 환자라도 폐암 분류별, 유전자별, 분비하는 단백질별 특성이 상이하고 이에 따른 적합한 치료제도 상이하다. 따라서 특정 치료제를 사용하는 화학요법에 있어서, 상기 치료제에 상응하는 바이오마커가 존재한다면, 시행착오를 줄이고 성공 확률을 보다 높일 수 있다. 이러한 취지로 항암 치료제의 효능 예측 또는 검정을 위한 바이오마커 탐색이 매우 중요하며, 적합한 바이오마커가 성공적으로 도출된다면, 항암제의 효용과 가치 및 이를 사용하는 치료의 성공률을 크게 상승시킬 수 있을 것이다.
한편, c-Met은 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종 양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로, 그 자체가 암유발 유전자이며, 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 치료의 타겟으로 주목받는 단백질이며, c-Met의 작용을 저해하는 항체 등의 표적 치료제의 개발이 진행되고 있다.
이와 같이 개발된 c-Met 표적 치료제를 이용한 치료의 효능을 보다 증진시키고 성공 가능성을 높이기 위하여, 상기 치료제의 효능을 예측 또는 검정하여 상기 치료제의 적용이 적합한 환자의 선별하여 보다 효과적인 치료 전략을 수립하는데 적용 가능한 바이오마커의 개발이 요구된다.
일 예는 HGF (Hepatocyte Growth Factor) 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 바이오마커를 제공한다.
다른 예는 HGF 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
다른 예는 HGF 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질의 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 생물 시료 내의 HGF 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 존재 여부 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함하는, c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법, 또는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 선별된 환자에게 c-Met 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.
c-Met 저해제의 효능을 예측할 수 있는 마커로서 HGF (Hepatocyte Growth Factor) 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 용도가 제공된다. 항 c-Met 항체 등의 c-Met 저해제에 대한 반응성이 우수한 환자, 즉 c-Met 저해제의 효능이 잘 발휘되는 환자의 경우, c-Met이 발현되고 HGF 수준 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 높다는 것을 확인하였다. 이와 같은 HGF의 수준은 암호화 유전자 수준뿐 아니라 조직 시료내의 단백질 수준에서도 측정 가능하다.
일 예에서, 신장암 세포주 또는 이를 이식한 이종이식 모델에서, 항 c-Met 항체가 효능을 나타내는 세포주 또는 이종이식모델의 경우 HGF 수준이 높은 반면, 효능을 나타내지 않는 세포주 또는 이종이식모델의 경우 HGF 수준 (단백질 또는 유전자 수준)이 낮음을 확인하였다. 이와 같이 HGF 수중 또는 유전자 발현 수준이 항 c-Met 항체 효능을 나타낼 수 있음을 확인하여, HGF의 c-Met 저해제 효능 마커로서의 적용 가능성을 확인하였다.
이에, HGF 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 c-Met 저해제의 효능을 미리 예측하거나, 및/또는 c-Met 저해제의 적용이 적절한 환자를 선별하기 위한 마커로서의 용도가 제공된다.
본 명세서에서, 상기 c-Met 저해제의 효능은 c-Met 저해제의 c-Met 억제 (c-Met internalization 및/또는 분해 등) 효과, c-Met 관련 질병, 예컨대, 암, 보다 구체적으로, 신장암의 예방, 개선, 경감, 및/또는 치료 효과 등을 의미하는 것으로, 예컨대, 신장암의 암세포 또는 암조직의 감소, 암세포 또는 암조직의 사멸, 암전이와 관련된 암세포의 이동 및/또는 침투의 억제 등의 효과를 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 'c-Met 저해제 효능 예측'이라 함은 c-Met 저해제가 이를 투여받은 환자에서 소망하는 효능, 즉, c-Met 억제 (c-Met internalization 및/또는 분해 등) 효능, c-Met 관련 질병, 예컨대 암, 보다 구체적으로, 신장암의 예방, 개선, 경감, 및/또는 치료 효능 (예컨대, 신장암의 암세포 또는 암조직의 감소, 암세포 또는 암조직의 사멸, 암전이와 관련된 암세포의 이동 및/또는 침투의 억제 등의 효능) 등을 발휘할 것인지 여부 및/또는 이를 투여 받은 환자에서 c-Met 저해제에 대한 저항성이 발생할 것인지 여부를 예측하는 것을 의미할 수 있다.
HGF (Hepatocyte Growth Factor; 간세포성장인자)은 중간엽세포에 의하여 분비되고 주로 상피세포 및 내피세포를 표적으로 하고 여기에 작용하며, haemopoietic progenitor cell에도 작용하는 것으로 알려져 있다. 상기 HGF은 포유류, 예컨대, 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, HGF은 인간 HGF (예컨대, NCBI Accession Nos. NP_000592.3 (유전자: NM_000601.4), MP_001010932.1 (유전자: NM001010932.1), XP_006716019.1 (유전자: XM_006715956.2), XP_011514417.1 (유전자: XM_011516115.1), 등), 마우스 HGF (예컨대, NP_001276387.1 (유전자: NM_001289458.1), NP_001276388.1 (유전자: NM_001289459.1), XP_011248050.1 (유전자: XM_011249748.1) 등), 래트 HGF (예컨대, XP_006236041.1 (유전자: XM_006235979.2), NP_058713.1 (유전자: NM_ 017017.2) 등), 래빗 HGF (예컨대, XP_008256401.1 (유전자: XM_008258179.1), XP_008256400.1 (유전자: XM_008258178.1), XP_008256402.1 (유전자: XM_008258180.1), NP_001162178.1 (유전자: NM_001168707.1 등), 원숭이 HGF (예컨대, XP_001108226.2 (유전자: XM_001108226.2) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예는 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 (또는 환자) 선별을 위한 바이오마커를 제공한다.
다른 예는 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상(환자) 선별을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
다른 예는 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 방법, c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 정보를 제공하는 방법, c-Met 저해제의 적용 대상(환자)의 선별 방법, 또는 c-Met 저해제의 적용 대상(환자)의 선별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 생물 시료는 생체(환자)로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 암환자로부터 분리된 세포 (예컨대, 암세포), 조직 (예컨대, 암조직), 및/또는 이의 배양물, 구체적으로 신장암 환자로부터 분리된 세포 (예컨대, 신장암 세포), 신장암 조직 (예컨대, 신장암 조직), 및/또는 이의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 경우는 상기 생물 시료에 c-Met 저해제가 작용하는데 필요한 HGF이 존재하여, c-Met 저해제가 잘 작용할 수 있는 것을 의미하는 것일 수 있다. 그러므로, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법에 있어서, 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 것으로 판단(예측)하거나, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자를 c-Met 저해제의 적용 대상으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 또는 효능 예측을 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계 이후에, 상기 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 것으로 판단(예측)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 c-Met 저해제의 적용 대상의 선별 방법 또는 c-Met 저해제의 적용 대상의 선별을 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계 이후에, 상기 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자를 상기 c-Met 저해제를 적용하기에 적절한 대상으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 마커, 조성물, 키트 및 방법에 있어서, 상기 HGF은 HGF, 예컨대, 인간 HGF일 수 있고, 이를 암호화하는 유전자는 HGF 유전자, 예컨대, 인간 HGF 유전자일 수 있다.
HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높다함은 다음과 같은 기준으로 판단될 수 있다
(1) HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자가 존재하거나, 적용하고자 하는 c-Met 저해제가 효능을 발휘하지 못하는 환자로부터 분리된 생물 시료 또는 c-Met 저해제가 효능을 발휘하지 못하는 생물 시료(비교 기준 시료; 예컨대, RXF2282 (Oncotest, Germany) 신장암 세포주, RXF631 (Oncotest, Germany) 신장암 세포주, RXF1393 (Oncotest, Germany) 신장암 세포주, RXF488 (Oncotest, Germany) 신장암 세포주, H1373 (ATCC, CRL-5866) 폐암 세포주, HCC1806 (ATCC, CRL-2335) 유방암 세포주, Caki-1 (ATCC, HTB-46) 신장암 세포주, SKBR3 (ATCC, HTB-30) 유방암 세포주, BT474 (ATCC, HTB-20) 유방암 세포주, HT-29 (ATCC, HTB-38) 대장암 세포주, LoVo (ATCC, CCL-229) 대장암 세포주, HCT116 (ATCC, CCL-247) 대장암 세포주, SW620 (ATCC, CCL-227) 대장암 세포주, Ls174T (ATCC, CL-188) 대장암 세포주, 또는 c-Met 저해제의 반복적 또는 지속적 투여에 의하여 이에 대한 저항성이 발생한 세포주, 등)와 비교하여 HGF 양 및/또는 이를 암호화하는 유전자 (DNA, cDNA 또는 mRNA)의 양이 많은 경우를 의미하는 것일 수 있다. 상기 비교 기준 시료는 생체로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 또는 이의 배양물일 수 있다. 이 경우, 상기 효능 예측 방법 및/또는 대상 선별 방법은 상기 판단하는 단계 이전에 상기 비교 기준 시료의 HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법들의 판단하는 단계는 생물 시료의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 비교 기준 시료의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준과 비교하는 단계 및/또는 i) 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 비교 기준 시료보다 높은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 것으로 판단 (예측) 또는 상기 환자를 c-Met 저해제를 적용하기에 적합한 대상으로 판단하는 단계, 또는 ii) 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 비교 기준 시료보다 낮은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 c-Met 저해제가 효능을 발휘하지 못할 것으로 판단 (예측) 또는 상기 환자를 c-Met 저해제를 적용하기에 적합하지 않은 대상으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
(2) 다른 방법으로, HGF에 대한 통상의 항체(예컨대, Ab-294; R&D System 제공 항체)를 사용하는 통상의 면역조직화학검사(IHC)로 측정하여, IHC score가 +1 이하, 예컨대, -, 또는 0 내지 +1의 값이 얻어지는 경우를 Negative로 판단하고, 그 이상의 값, 즉, +1 초과 또는 +2 이상, 예컨대 +2 내지 +3이 얻어지는 경우를 Positive로 판단할 수 있는데, Positive인 경우 생물 시료 내에 HGF의 수준이 높은 경우로 볼 수 있다. 따라서, HGF에 대한 통상의 항체를 사용하는 통상의 면역조직화학검사(IHC)로 측정하여 +1 초과 또는 +2 이상, 예컨대 +2 내지 +3이 얻어지는 경우, HGF의 수준이 높다고 판단할 수 있다. 이 경우, 상기 효능 예측 방법 및/또는 대상 선별 방법의 생물 시료의 HGF 수준을 측정하는 단계는 HGF에 대한 통상의 항체를 사용하는 면역조직화학검사에 의하여 수행될 수 있으며, 상기 판단하는 단계는 i) 상기 면역조직화학검사 결과 +1 초과 또는 +2 이상, 예컨대, +2 내지 +3의 값이 얻어지는 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 것으로 판단 (예측) 또는 상기 환자를 c-Met 저해제를 적용하기에 적합한 대상으로 판단하는 단계, 또는 ii) 상기 면역조직화학검사 결과 +1 이하, 예컨대, -, 0 내지 +1의 값이 얻어지는 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 c-Met 저해제가 효능을 발휘하지 못할 것으로 판단 (예측), 또는 상기 환자를 c-Met 저해제를 적용하기에 적합하지 않은 대상으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 HGF 또는 이를 암호화하는 유전자 (예컨대, HGF 유전자)의 수준은 상기 단백질 또는 유전자와 상호작용하는 물질을 이용하는 통상적인 모든 단백질 또는 유전자 분석 방법에 의하여 측정될 수 있다. 상기 HGF 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 상기 HGF 또는 HGF 유전자에 특이적으로 결합하는 소분자 화학 물질(chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 HGF 또는 이를 암호화하는 유전자 (예컨대, HGF 유전자)와 상호작용하는 물질은 HGF에 특이적으로 결합하는 소분자 화합물, 항체, 압타머, 및 HGF 유전자의 전부 또는 일부에 결합하는 핵산 분자 (예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 HGF의 수준은 상기 HGF에 특이적으로 결합하는 화합물 화합물, 항체, 압타머 등을 이용하는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이법, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 HGF 유전자 (DNA, cDNA 또는 mRNA)의 수준은 통상의 유전자 분석 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, 예컨대 상기 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 또는 압타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR; 예컨대 qPCR, real-time PCR 등), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프라이머는 HGF 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000bp 예컨대 10 내지 500bp, 20 내지 200bp, 또는 50 내지 200bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 10 내지 25bp 부위와 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브 또는 압타머는 총 길이가 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp인 것일 수 있으며, HGF을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp의 유전자 단편과 결합 가능 또는 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자 부위와 공유 결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다.
상기 c-Met 저해제의 효능 예측 방법 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상의 선별 방법에 있어서, 상기 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계는, 임의로 i) 생물 시료를 준비하는 단계; ii) 상기 생물 시료에 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 처리(첨가)하여 반응시키는 단계; 및 iii) 상기 얻어진 반응물을 분석하여 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 정량하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계 i)의 생물 시료를 준비하는 단계는 환자로부터 생물 시료를 얻는(분리하는) 단계 또는 환자로부터 분리된 생물 시료를 입수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 단계 ii)에서 상기 상호작용하는 물질은 HGF 및/또는 HGF 유전자에 특이적으로 결합하는 화학 물질(chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 상호작용하는 물질은 HGF에 특이적으로 결합하는 화합물 (small molecule), 항체, 압타머, 또는 HGF을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부에 결합하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머 등), 등일 수 있으며, 이들은 형광 물질, 발색 물질 등의 표지 물질로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다. 상기 단계 iii)에서, 상기 반응물은 단계 ii)에서 얻어진 HGF 및/또는 HGF 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 및 이와 상호작용하는 물질이 상호작용(결합)하여 생성된 복합체(complex)일 수 있으며, 상기 정량하는 단계는 상기 생성된 복합체를 정량하거나, 상기 복합체에 표지된 표지 물질을 측정하거나, 상기 복합체를 시료로부터 분리한 후, 이로부터 HGF 및/또는 HGF 유전자를 다시 분리하여 분리된 HGF 및/또는 HGF 유전자를 정량하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 HGF의 정량은 통상적인 단백질 정량 방법, 예컨대, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이법, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. HGF 유전자의 정량은 통상적인 유전자 정량 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR; 예컨대 qPCR, real-time PCR 등), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법 등으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 효능 예측 방법 및/또는 대상 선별 방법은 상기 판단하는 단계 이후에, c-Met 저해제가 효능을 나타낼 것으로 판단 (예측)된 환자 또는 c-Met 저해제를 적용하기에 적합한 것으로 판단된 환자에게 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 c-Met 저해제의 적용 대상은 c-Met 저해제를 사용하는 치료법을 적용하기에 적합한 환자를 의미하는 것으로, 모든 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류일 수 있고, 예컨대 암환자일 수 있다. 상기 생물 시료는 c-Met 저해제를 적용하고자 하는 모든 환자(예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류), 예컨대 암환자, 보다 구체적으로 신장암 환자 또는 상기 환자로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 소변, 타액 등) 등일 수 있으며, 예컨대, 암세포, 암조직 및/또는 이들의 배양물일 수 있다. 일 예에서 상기 적용 대상은 폐암 환자가 아닐 수 있고, 상기 생물 시료는 혈청이 아닐 수 있다.
한편, c-Met 저해제가 효능을 발휘하기 위해서는 표적 물질인 c-Met 고발현 조건 (일정 수준 이상 존재)이 충족될 것이 전제될 수 있다.
따라서, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측용 조성물 (또는 키트), 또는 적용 대상 선별용 조성물 (또는 키트)은 c-Met 및 이를 암호화하는 유전자(예컨대, 전장 DNA, cDNA, mRNA 등)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용 하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 c-Met 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 상기 상기 c-Met 및/또는 이를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 화학 물질(chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 상기 c-Met 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 c-Met에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 및 c-Met 유전자의 전부 또는 일부에 결합하는 핵산 분자(예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 방법 또는 적용 대상 선별 방법은 환자로부터 얻어진 생물 시료의 c-Met 단백질의 존재 여부 및/또는 수준, 및/또는 이를 암호화하는 유전자 (예컨대, 전장 DNA, cDNA, mRNA 등)의 발현 여부 및/또는 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 시료의 c-Met 단백질 수준 또는 이를 암호화하는 유전자 (예컨대, 전장 DNA, cDNA, mRNA 등)의 수준을 측정하는 단계는 단계는 앞서 설명한 HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 수준을 측정하는 단계와의 순서에 있어서 제한이 없으며, 상기 두 측정 단계는 동시에 또는 순서에 관계없이 순차적으로 수행될 수 있다. 그 구체적인 측정 방법은 앞서 기재한 HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 수준을 측정하는 방법과 같다.
이 경우, 환자로부터 얻어진 생물 시료의 c-Met 단백질의 존재 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 발현이 검출되거나, 상기 단백질의 수준 및/또는 상기 유전자의 발현 수준이 높은 경우, c-Met 저해제가 암 (예컨대, 신장암)과 같은 c-Met 관련 질환에 효능을 나타낸다고 판단하는데 추가적 근거가 될 수 있다. 상기 "c-Met 단백질의 수준이 높다"함은, 예컨대, 통상적인 웨스턴 블라팅 방법을 사용하여, 상기 생물시료 (예컨대, 암세포 또는 암조직)으로부터 얻어진 전체 세포내 단백질 일정량 (예컨대, 10ug(microgram))을 로딩하고, 멤브레인에 일정시간 (예컨대, 30초 정도) 노출시 band가 검출되는 경우를 의미할 수 있다. 이 경우, c-Met 단백질의 높은 수준으로 존재함이 인정되어, c-Met 저해제를 사용하는 치료가 효능을 나타낼 수 있는 전제 요건이 충족되었다고 판단할 수 있다. 다른 예에서, 앞서 설명한 바와 같은 방법으로 면역조직화학검사시 (예컨대, SP44 Ventana 항체 사용), IHC score가 +1 초과 또는 +2 이상, 예컨대, +2 내지 +3인 경우, "c-Met 단백질의 수준 또는 유전자의 발현 수준이 높다"고 판단될 수 있다. 이와 같이, c-Met 고발현이 인정되는 경우, c-Met 저해제를 사용하는 치료가 효능을 나타낼 수 있는 전제 요건이 충족되었다고 판단할 수 있다. 이와 같은 c-Met의 고발현 특성을 갖는 암세포는 주로 폐암, 유방암, 뇌암, 위암, 간암, 신장암 등의 암세포일 수 있으나, 이들 암세포에서 모두 c-Met 저해제가 효능을 나타내는 것은 아니며, 앞서 설명한 바와 같이 HGF 수준에 의한 효능 예측 과정이 추가로 수반되어야 보다 정확한 효능 예측이 가능하다.
다른 구체예에서, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법에서 사용된 생물 시료는 c-Met 발현량이 높은 조직, 세포, 또는 체액 (혈액, 혈청, 소변, 타액 등), 예컨대 암조직, 암세포, 및/또는 이들의 배양물, 보다 구체적으로 신장암의 암세포, 암조직 및/또는 이의 배양물일 수 있다.
다른 예는 HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 대상에게 c-Met 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 억제 (또는 분해) 방법을 제공한다.
다른 예는 HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 대상에게 c-Met 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높다함은 앞서 설명한 바와 같이 판단될 수 있다.
상기 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 환자는 앞서 설명한 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 조성물, 키트 및/또는 방법에 의하여 선별된 대상일 수 있다. 따라서, 상기 c-Met 억제 방법 또는 암의 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 항 c-Met 항체 적용 대상을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 구체적 방법 및 단계를 앞서 설명한 바와 같다.
보다 구체적으로, 상기 c-Met 억제 방법 또는 암의 예방 및/또는 치료 방법은,
c-Met 저해제의 적용 대상을 확인하는 단계; 및
상기 c-Met 저해제의 적용 대상에게 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 투여하는 단계
를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 c-Met 억제 방법 또는 암의 예방 및/또는 치료 방법은,
생물 시료 내의 HGF 및/또는 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하여 c-Met 저해제의 적용 대상을 선별하는 단계;
상기 선별된 c-Met 저해제의 적용 대상에게 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 투여하는 단계
를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 c-Met 저해제의 투여 조건 예컨대, 투여량, 투여 간격, 및/또는 투여 회수는 상기 c-Met 저해제의 효능 검정 방법에서 판단된 c-Met 저해제의 적절한 투여 조건일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "c-Met 저해제"는 c-Met를 인식 및/또는 결합하여 이를 분해하거나 발현을 억제하거나 기능을 저해하는 모든 물질일 수 있다. 예컨대, 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체, 이의 항원 결합 단편, 소분자 c-Met 저해제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소분자 c-Met 저해제는 크리조티닙(crizotinib; PF-02341066; 3-((R)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy)-5-(1-(piperidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-amine), 카보잔티닙(cabozantinib; XL-184; N-(4-(6,7-dimethoxyquinolin-4-yloxy)phenyl)-N-(4-fluorophenyl)cyclopropane-1,1-dicarboxamide), 포레티닙(foretinib; N-(3-fluoro-4-(6-methoxy-7-(3-morpholinopropoxy)quinolin-4-yloxy)phenyl)-N-(4-fluorophenyl)cyclopropane-1,1-dicarboxamide), PHA-665752((R,Z)-5-(2,6-dichlorobenzylsulfonyl)-3-((3,5-dimethyl-4-(2-(pyrrolidin-1-ylmethyl)pyrrolidine-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-yl)methylene)indolin-2-one), SU11274((Z)-N-(3-chlorophenyl)-3-((3,5-dimethyl-4-(1-methylpiperazine-4-carbonyl)-1H-pyrrol-2-yl)methylene)-N-methyl-2-oxoindoline-5-sulfonamide), SGX-523(6-(6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-ylthio)quinoline), PF-04217903(2-(4-(3-(quinolin-6-ylmethyl)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyrazin-5-yl)-1H-pyrazol-1-yl)ethanol), EMD 1214063(Benzonitrile, 3-[1,6-Dihydro-1-[[3-[5-[(1-Methyl-4-Piperidinyl)Methoxy]-2-PyriMidinyl]Phenyl]Methyl]-6-Oxo-3-Pyridazinyl]), 골바티닙(Golvatinib; N-(2-fluoro-4-((2-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidine-1-carboxamido)pyridin-4-yl)oxy)phenyl)-N-(4-fluorophenyl)cyclopropane-1,1-dicarboxamide), INCB28060(2-fluoro-N-methyl-4-(7-(quinolin-6-ylmethyl)imidazo[1,2-b][1,2,4]triazin-2-yl)benzamide), MK-2461(N-((2R)-1,4-Dioxan-2-ylmethyl)-N-methyl-N'-[3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-oxo-5H-benzo[4,5]cyclohepta[1,2-b]pyridin-7-yl]sulfamide), 티반티닙(tivantinib; ARQ 197; (3R,4R)-3-(5,6-Dihydro-4H-pyrrolo[3,2,1-ij]quinolin-1-yl)-4-(1H-indol-3-yl)pyrrolidine-2,5-dione), NVP-BVU972(6-[[6-(1-Methyl-1H-pyrazol-4-yl)imidazo[1,2-b]pyridazin-3-yl]methyl]quinoline), AMG458({1-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-N-[5-(7-methoxyquinolin-4-yloxy)pyridin-2-yl]-5-met hyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazole-4-carboxamide}), BMS 794833(N-(4-((2-amino-3-chloropyridin-4-yl)oxy)-3-fluorophenyl)-5-(4-fluorophenyl)-4-oxo-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide), BMS 777607(N-[4-[(2-Amino-3-chloropyridin-4-yl)oxy]-3-fluorophenyl]-4-ethoxy-1-(4-fluorophenyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridine-3-carboxamide), MGCD-265(N-(3-Fluoro-4-(2-(1-methyl-1H-imidazol-4-yl)thieno[3,2-b]pyridin-7-yloxy)phenylcarbamothioyl)-2-phenylacetamide), AMG-208(7-Methoxy-4-[(6-phenyl-1,2,4-triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl)methoxy]quinoline), BMS-754807((2S)-1-[4-[(5-Cyclopropyl-1H-pyrazol-3-yl)amino]pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-2-yl]-N-(6-fluoro-3-pyridinyl)-2-methyl-2-pyrrolidinecarboxamide), JNJ-38877605(6-[Difluoro[6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-1,2,4-triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl]methyl]quinoline), 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met을 항원으로 인식하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met에 특이적으로 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있다.
상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.
c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.
따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열이다:
일반식 Ⅰ
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr (서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr (서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13 (서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa1은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa2는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa3은 Asn 또는 Lys이며, Xaa4는 Ala 또는 Val이고, Xaa5는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa6은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa7은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa8은 Ser 또는 Trp이고, Xaa9은 His 또는 Gln이며, Xaa10는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa11은 Ala 또는 Gly이며, Xaa12은 Thr 또는 Lys이고, Xaa13는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa14은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa15는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa16는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 부위; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위는 서열번호 109, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변영역을 인간 항체의 불변영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 부위에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 부위 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 발생한 것 (즉, 자연적으로 존재하지 않는 것)일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합적 또는 합성적으로 제조된 것일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변영역은 중쇄 불변영역과 경쇄 불변영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 부위 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 부위 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 부위(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 부위와 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 부위와 단쇄의 가변 부위가 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위를 제외한 부위 (예컨대, 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역)은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM 등)으로부터 유래하는 것 (예컨대, 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역)일 수 있다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역(비변형 인간 힌지 영역)을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨). 상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위를 제외한 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역은 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 106의 경쇄 상보성결정영역, 서열번호 107의 경쇄 가변 부위, 또는 서열번호 108의 경쇄를 포함하는 항 c-Met 항체일 수 있다.
상기 c-Met 저해제는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적용 (투여)될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는, 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 c-Met 저해제는 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 c-Met 저해제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 c-Met 저해제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "약학적 유효량"은 약물이 약학적으로 의미있는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다. 1회 투여를 위한 c-Met 저해제의 약학적 유효량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라서 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 1회 투여를 위한 상기 c-Met 저해제의 약학적 유효량은 0.001 내지 100mg/kg, 또는 0.02 내지 10mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 투여를 위한 약학적 유효량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 c-Met 저해제는 암 및/또는 암전이의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 c-Met의 과발현 및/또는 비정상적인 활성화와 관련된 것일 수 있으며, 예컨대, 상기 암은 신장암 일 수 있다. 상기 암은 원발성 암뿐 아니라 전이성 암도 포함한다. 또한 상기 암은 기존의 c-Met 저해제 (예컨대, 항 c-Met 항체에 대하여 저항성을 갖는 암일 수 있다.
상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 및/또는 전이(metastasis) 등을 억제하는 효과, 및/또는 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.
본 발명을 통해서, 환자 개개인의 c-Met 저해제에 대한 반응성 (c-Met 저해제의 효능)을 미리 예측함으로써, c-Met 저해제를 이용한 효과적인 개별 맞춤 치료가 가능하고, 보다 효율적인 치료 전략을 수립할 수 있다.
도 1 내지 8는 8개의 환자유래 이종이식 모델 (patient-derived xenograft models)에 대한 항 c-Met 항체의 효능 여부(종양부피)를 보여주는 그래프이다.
도 9는 도 1 내지 8에 나타난 결과로서 결정된 항 c-Met 항체 효능군 (항 c-Met 항체 반응성 모델)과 비효능군 (항 c-Met 항체 비반응성 모델)의 조직에서의 HGF 수준을 ELISA로 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 도 1 내지 8에 나타난 결과로서 결정된 항 c-Met 항체 효능군 (항 c-Met 항체 반응성 모델)과 비효능군 (항 c-Met 항체 비반응성 모델)의 혈청에서의 HGF 수준을 ELISA로 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 도 1 내지 8에 나타난 결과로서 결정된 항 c-Met 항체 효능군 (항 c-Met 항체 반응성 모델)과 비효능군 (항 c-Met 항체 비반응성 모델)의 조직에서의 HGF mRNA 수준을 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 폐암 마우스 이종이식 모델에 대한 항 c-Met 항체 효능(□: 효능군; ■: 비효능군)과 혈청 내 HGF 수준을 신장암 마우스 이종이식 모델에서의 결과와 함께 보여주는 그래프이다.
도 13은 폐암 마우스 이종이식 모델에 대한 항 c-Met 항체 효능(□: 효능군; ■: 비효능군)과 조직 내 HGF 수준을 신장암 마우스 이종이식 모델에서의 결과와 함께 보여주는 그래프이다.
도 14는 항 c-Met 항체 효능군과 비효능군의 면역 염색 결과를 보여주는 사진이다.
도 15는 항 c-Met 항체 효능군과 비효능군의 HGF의 immunohistochemistry(IHC) score를 보여주는 그래프이다 (□: 효능군; ■: 비효능군)).
도 16은 HGF의 ELISA 결과와 T/C ratio 간 상관관계를 보여주는 그래프이다.
도 17은 HGF의 ICH score와 T/C ratio 간 상관관계를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 항 c-Met 항체의 제작
1.1. c -Met에 대한 마우스 항체 ' AbF46 '의 생산
1.1. 1. 마우스의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.
1.1. 2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조
세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x108 개와 골수종세포(Sp2/0) 1x108 개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45%(w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2x105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.
1.1. 3. c -Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.
마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.
상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).
1.1. 4. 단일클론 항체의 생산 및 정제
상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.
먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.
1.2. c -Met에 대한 키메릭 항체 chAbF46의 제작
일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 참고예 1.1.4에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.
중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2, 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
이후, 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.
1.3. 키메릭 항체 chAbF46으로부터 인간화 항체 huAbF46의 제작
1.3. 1. 중쇄의 인간화(Heavy chain humanization)
H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.
H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.
1.3. 2. 경쇄의 인간화(Light chain humanization)
H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.
H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.
H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.
이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2, 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.
1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작
huAbF46 항체의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.
이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.　
1.5. 친화도 성숙(affinity maturation)을 위한 라이브러리 유전자의 제작
1.5. 1. 표적 CDR의 선정 및 프라이머 제작
huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 1과 같다.
CDR 아미노산 서열
CDR-H1 DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3 DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2 WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(서열번호 12)
항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다. 　
1.5. 2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c-Met에 대한 결합력 확인
CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.
이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.　
1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별
상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 2와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.
클론 이름 도출된 라이브러리 CDR 서열
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(서열번호 22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(서열번호 23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(서열번호 24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(서열번호 25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(서열번호 27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(서열번호 28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(서열번호 34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(서열번호 37)
1.7. 선별된 항체의 IgG로의 변환
선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변 부위를 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2, 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.
1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 -H4-A1의 제조
상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.
huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.
상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2, 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 L3-1Y/IgG2로 명명하였다.
실시예 1: 신장암 이종이식모델에 대한 항 c-Met 항체 효능 확인
신장암 환자 유래 종양 조직 (patient driven tumor tissues (Renal cancer))이 복강내 이식된 마우스 이종이식 모델 (mouse xenograft model) 8종 (RXF616, RXF2264, RXF1114, RXF739, RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488)을 Oncotest사(Oncotest GmbH, Freibrug Germany)로부터 입수하였다 (NMRI nude 마우스 (4-6주령, female; Harlan)에 배양한 환자유래 신장암 세포 주입하여 제작).
상기 8종의 마우스 이종이식 모델에 candidate drug final form (L3-1Y/IgG2 항체)과 empty vehicle (control)을 투여하고 종양 조직의 크기를 측정하여 상기 항체에 대한 반응성 여부를 측정하였다.
상기 마우스 이종이식 모델 내 종양 크기가 100mm3 이상 자라게 되는 시점으로부터 L3-1Y/IgG2 (control의 경우 PBS buffer)를 5mg/kg의 양으로 1주에 1회 투여하여, 총 6주 동안 실험을 진행하고, 종양 크기가 1000 mm3 이상이 되면 실험을 중단하였다.
종양 크기(mm3)는 장경*단경*단경*1/2의 식을 이용하여 부피로 계산하고, 효능군의 판별은 ANOVA 분석을 통하여 p-value 0.05 이하의 가설만을 기각하여 수행하였다. 즉, 항체를 투여한 군에서 투여하지 않은 군에 비해 종양의 크기 분포가 변하지 않았다는 가설을 ANOVA 테스트 하여, p-value가 0.05 이하의 군은 비효능군, 초과하는 군을 효능군으로 판별하였다.
상기 얻어진 마우스 이종이식 모델별 종양 크기를 도 1 내지 8에 나타내었다. 도 1 내지 8의 결과로부터 얻어진 각 마우스 이종이식 모델의 L3-1Y/IgG2 처리에 대한 반응성 여부 결과를 아래의 표 3에 나타내었다:
반응군 (효능군) 비반응군 (비효능군)
샘플명 RXF616, RXF2264, RXF1114, RXF739 RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488
실험을 마친 mouse의 종양 조직을 적출하여, 일부는 FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) block을 제작하고, 나머지는 종양 조직으로부터는 Qiagen RNeasy Mini Kit (Cat. No. 74104)를 이용하여 제조사 protocol에 따라서 total RNA를 추출하였다.
상기 제작된 FFPE block은 Ventana MET IHC (immunohistochemistry) (Roche; US2013089541 A1 참조)를 이용하여 제작사에서 제공하는 standard protocol에 따라서 membrane MET을 측정하는데 사용하고, 상기 추출된 total RNA는 Real Time PCR (RT-PCR)에 의한 c-MET mRNA expression 실험에 사용하였다 (MET sense primer: CCTTGAACAGAATCACTG (서열번호 110); MET anti-sense primer: CCATGTTTCATGTATGGTA (서열번호 111)).
상기 얻어진 Ventana MET IHC 방법을 사용하여 얻어진 IHC score를 아래의 표 4에 나타내었다.
mem resp.
RXF1114 3 Efficacy
RXF1393 3 -
RXF2264 3 Efficacy
RXF2282 3 -
RXF488 -
RXF616 3 Efficacy
RXF631 3 -
RXF739 3 Efficacy
이 방법에서, IHC score가 2~3이면 효능군으로 판단할 수 있다. 상기 표 4의 결과에 따르면, 모든 시료가 IHC score가 3인 효능군으로 분류될 수 있다. 그러나, 상기 도 1 내지 8에서 확인되는 바와 같이, RXF616, RXF2264, RXF1114, 및 RXF739만이 항 c-Met 항체의 효능군이고 나머지는 비효능군이므로, IHC 방법에 의한 c-Met 수준 분석으로는 항 c-Met 항체에 대한 효능군과 비효능군의 정확한 선별이 곤란함을 알 수 있다.
실시예 2: 항 c-Met 항체에 대한 효능군과 비효능군의 조직내 HGF 수준 측정
항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2에 대한 반응성과 조직 (cytosol) 내 HGF 수준과의 관련성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 준비된 8종의 환자유래 신장암 조직(RXF161, RXF2264, RXF1114, RXF739, RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488)가 이식된 마우스 이종이식 모델의 조직 내 HGF 수준을 측정하여, L3-1Y/IgG2에 대한 반응군과 비반응군의 조직 내 HGF 수준의 차이를 확인하였다.
구체적으로, 조직의 whole cell lysate에서 단백질 100ug을 취하여 96well plate에 loading하고, HGF ELISA kit(R&D, DY194)를 이용하여 Manufacture’s protocol에 따라 HGF 정량을 실시하였다.
상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 L3-1Y/IgG2 효능군으로 입증된 4종 마우스 이종이식 모델 (RXF161, RXF2264, RXF1114, RXF739)의 조직에서는 모두 HGF 농도가 약 900pg/ml 이상인 것으로 관찰된 반면, L3-1Y/IgG2 효능군으로 입증된 4종 마우스 이종이식 모델 (RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488)의 조직에서는 HGF가 검출되지 않았다. 이러한 결과는 조직 내 HGF 수준은 항 c-Met 항체에 대한 반응성을 정확하게 반영함을 입증하는 것이다.
또한, 상기 실시예 1에서 준비된 환자유래 신장암 조직 중 6종(RXF616, RXF2264, RXF1114, RXF631, RXF1393, RXF488)이 이식된 마우스 이종이식 모델로부터 얻어진 종양조직을 파라핀 블락으로 고정시킨 후, 실시예 2의 방법을 참조하여 HGF immunohistochemistry(IHC)를 진행해서 HGF의 발현 수준(IHC score)을 측정하였다 (R&D社 항체 사용하여 MANUFACTURE'S GUIDE에 따라 수행함).
상기 얻어진 결과를 도 14 (면역 염색 결과) 및 도 15 (IHC score: 3 개체에서 얻어진 수치의 평균값을 나타냄; □: 효능군; ■: 비효능군)에 나타내었다.
도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 효능군인 RXF1114 및 RXF616의 경우 HGF의 발현 수준이 높았고 (IHC score 2~3), 비효능군인 RXF1393 및 RXF488은 HGF 발현 수준이 낮은 것(IHC score 0~1)으로 확인되었다. 상기 얻어진 HGF의 ELISA 결과 및 IHC score과 각 시료의 T/C (tumor/control) ratio 간의 상관 관계를 측정하여 HGF 수준과 c-Met 저해제 (L3-1Y/IgG2)에 대한 반응성 간 상관 관계를 다시 한번 확인하였다. 상기 T/C ratio 값이 낮을수록 c-Met 저해제에 대한 반응성이 높음을 의미한다.
상기 얻어진 결과를 도 16 (ELISA 결과와 T/C ratio 간 상관관계) 및 도 17 (IHC score와 T/C ratio 간 상관관계)에 나타내었다. 도 16 및 17에서 확인되는 바와 같이, HGF의 ELISA 결과 및 IHC score과 각 시료의 T/C (tumor/control) ratio 간에 유의적인 linear correlation이 있음을 확인할 수 있다. 즉, 상기 결과는 HGF 수준이 높을수록 T/C ratio 값이 낮아서 c-Met 저해제에 대한 반응성이 높음을 유의미하게 예측할 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 항 c-Met 항체의 효능군과 비효능군의 혈청내 HGF 수준 측정
항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2에 대한 반응성과 혈청 내 HGF 수준과의 관련성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 준비된 8종의 마우스 이종이식 모델 (RXF161, RXF2264, RXF1114, RXF739, RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488)의 혈청 내 HGF 수준을 측정하여, L3-1Y/IgG2에 대한 반응군과 비반응군의 혈청 내 HGF 수준의 차이를 확인하였다.
구체적으로, 각 마우스 이종이식 모델의 채취된 혈청을 R&D HGF ELISA kit(DY194)을 사용하여 분석을 진행하였으며, 실험은 manufacture's guideline에 따라 마우스 혈청을 1/2(v/v)로 Assay diluent buffer에 희석한 후, biotinylation 되어있는 항 인간 HGF 항체가 코팅되어 있는 plate(R&D, DY194)에 상온에서 1시간 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 시료를 상기 HGF ELISA (DY194) kit에 포함된 wash buffer로 wash하고, kit에 포함된 detection antibody로 반응 시킨 후 HRP반응으로 ELISA reader기에서 결과값을 측정하였다. 분석이 끝난 데이터는 kit에 포함된 standard를 이용 혈청 내 HGF 농도를 계산하고, dilution factor를 곱하여 혈청내 HGF 수치를 정량화 하였다.
상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, RXF739 이식 모델의 경우, L3-1Y/IgG2 효능군 (실시예 1 및 도 4 참조)이지만, 혈청내 HGF 수준은 매우 낮은 (거의 검출되지 않음) 것으로 나타났다. 이러한 결과는 혈청 내 HGF 수준은 항 c-Met 항체에 대한 반응성을 정확하게 나타내는데 한계가 있음을 보여준다.
실시예 4: 항 c-Met 항체에 대한 효능군과 비효능군의 HGF mRNA 수준 측정
HGF의 mRNA 수준이 독립 항 c-Met 항체 반응성 판단에 사용될 수 있음을 시험하였다.
상기 실시예 1에서 준비된 8종의 마우스 이종이식 모델 (RXF161, RXF2264, RXF1114, RXF739, RXF2282, RXF631, RXF1393, RXF488)에 대하여 Affymetrix U133Plus 2.0를 사용하여 실험하였다.
mRNA의 capture및 prep은 U133 Plus 2.0 표준 프로토콜에 따랐다 (http://www.affymetrix.com/estore/browse/products.jsp?productId=131455#1_3/3'; IVT Express Kit User Manual (pdf, 1.17 MB)). 실험후 DNA chip에서 얻어진 데이터를 quantile normalization (Bolstad, B. M., Irizarry R. A., Astrand, M, and Speed, T. P. (2003) A Comparison of Normalization Methods for High Density Oligonucleotide Array Data Based on Bias and Variance. Bioinformatics 19(2), pp 185-193)하여 발현값을 보정한 후, HGF의 유전자의 발현값을 얻었다(Affymetrix probe id: 205009_at). HGF의 유전자 발현 (mRNA 수준)은 본 실시예에서 사용한 DNA chip 이외에도 이 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 지닌 자에 의하여 다른 실험 방법으로 대체될 수 있다.
상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, L3-1Y/IgG2 효능군은 모두 높은 HGF mRNA 수준을 보이는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 HGF 단백질 수준뿐 아니라 유전자 (mRNA) 수준도 역시 항 c-Met 항체 대한 반응성을 정확하게 반영함을 보여준다.
실시예 5: 폐암 이종이식 모델의 혈청내 및 조직내 HGF 수준 측정
폐암에서 HGF 수준이 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2에 대한 반응성을 반영할 수 있는지 확인하였다. 이를 위하여 환자 유래 폐암 세포 (비소세포성폐암 (NSCLC); LXFA289, LXFA400, LXFA526, LXFA623, LXFA677, LXFA749, LXFA923, LXFA1647, LXFA1848, LXFA2158, LXFA2201)가 이식된 마우스 이종이식 모델을 Oncotest사(Oncotest GmbH, Freibrug Germany)에 의뢰하여 제작하였다 (NMRI nude 마우스 (4-6주령, female; Harlan)에 배양한 환자유래 폐암 세포 주입하여 제작).
상기 실시예 3의 방법을 참조하여, 폐암 마우스 이종이식 모델의 혈청 내의 HGF 수준을 측정하여, 도 12에 나타내었다. 비교를 위하여, 도 12는 신장암 마우스 이종이식 모델에서 얻어진 결과 (도 10)도 함께 보여준다 (□: 효능군; ■: 비효능군). 또한, 상기 실시예 2의 방법을 참조하여 폐암 마우스 이종이식 모델의 조직 내의 HGF 수준을 측정하여 도 13에 나타내었다. 비교를 위하여, 도 13은 신장암 마우스 이종이식 모델에서 얻어진 결과 (도 9)도 함께 보여준다 (□: 효능군; ■: 비효능군).
도 12에서 보여지는 바와 같이, 신장암에서 혈청 내 HGF 수준은 L3-1Y/IgG2에 대한 반응성을 정확하게 반영하지 못할 뿐 아니라, 폐암의 경우 효능군과 비효능군 모두에서 혈청 내 HGF 수준이 detection range를 크게 벗어나 (HGF 검출되지 않음), L3-1Y/IgG2에 대한 반응성을 전혀 반영하지 못하는 것으로 나타났다. 또한 도 13에서 보여지는 바와 같이, 신장암에서 조직 내 HGF 수준은 L3-1Y/IgG2에 대한 반응성을 정확하게 반영하는 반면, 폐암의 경우 효능군과 비효능군 모두에서 조직내 HGF 수준이 detection range를 벗어나 (HGF 검출되지 않음), L3-1Y/IgG2에 대한 반응성을 전혀 반영하지 못하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 HGF이 c-Met의 리간드이지만 암 종류에 따라서 c-Met 저해제의 효능 반영 여부가 상이하며, 특히 신장암에서의 c-Met 저해제의 효능을 특이적으로 반영하는 마커로서 유용함을 보여주는 것이며, 신장암의 경우에도 혈청보다는 조직 내의 HGF이 보다 정확한 c-Met 저해제의 반응성 예측이 가능함을 제안하는 것이다.

Claims (18)

  1. HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 신장암에 대한 효능 예측용 조성물.
  2. HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는, 신장암 치료를 위한 c-Met 저해제의 적용 대상 선별용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상호작용하는 물질은 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 결합하는 소분자 화학물질, 단백질, 펩타이드, 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 상호작용하는 물질은 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, c-Met 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용 하는 물질을 추가로 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 소분자 c-Met 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 소분자 c-Met 저해제는 크리조티닙, 카보잔티닙, 포레티닙, PHA-665752, SU11274, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, 골바티닙, INCB28060, MK-2461, 티반티닙, NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807, JNJ-38877605, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 5 내지 19개 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
    서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
    을 포함하는 것인, 조성물.
  10. 신장암 환자로부터 분리된 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장암에 대한 c-Met 저해제의 효능 예측 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생물 시료는 신장암 환자로부터 분리된 암조직인, c-Met 저해제의 효능 예측 방법.
  12. 신장암 환자로부터 분리된 생물 시료 내의 HGF 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장암 치료를 위한 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생물 시료는 신장암 환자로부터 분리된 암조직인, 신장암 치료를 위한 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, c-Met 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 소분자 c-Met 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 소분자 c-Met 저해제는 크리조티닙, 카보잔티닙, 포레티닙, PHA-665752, SU11274, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, 골바티닙, INCB28060, MK-2461, 티반티닙, NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807, JNJ-38877605, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 5 내지 19개 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
    서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
    을 포함하는 것인, 방법.
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