WO2018074794A1 - 신규한 퀘르세틴계 화합물 - Google Patents

신규한 퀘르세틴계 화합물 Download PDF

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WO2018074794A1
WO2018074794A1 PCT/KR2017/011404 KR2017011404W WO2018074794A1 WO 2018074794 A1 WO2018074794 A1 WO 2018074794A1 KR 2017011404 W KR2017011404 W KR 2017011404W WO 2018074794 A1 WO2018074794 A1 WO 2018074794A1
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glucopyranoside
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coumaroyl
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홍용덕
최민식
조시영
김정기
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Amorepacific Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/82—Theaceae (Tea family), e.g. camellia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin

Definitions

  • the present specification relates to a novel quercetin-based compound.
  • Green tea is brewed in the form of leaf tea, or fermented tea for a deeper flavor.
  • Fermented green tea means that the green tea leaves are subjected to oxidation treatment, including fermented tea oxidized by the oxidase present in the tea leaves, and post-fermented tea fermented by a separate microorganism other than the enzyme present in the tea leaves. .
  • oxidation treatment including fermented tea oxidized by the oxidase present in the tea leaves, and post-fermented tea fermented by a separate microorganism other than the enzyme present in the tea leaves.
  • it can be classified into weakly fermented tea, semi-fermented tea, and fully fermented tea.
  • fermented green tea is called by various names, such as green tea, oolong tea, black tea, black tea, etc., depending on the type and extent of fermentation.
  • the world's leading producers of post fermented tea are China and Japan.
  • China's aerobic fermented tea uses fungi (Fungi) as fermentation strains, and the main production area is Xiangfan Li, Yunnan province.
  • Japan's aerobic fermented tea uses fungi as the fermentation monarch and Toyama is a major producer of black tea
  • anaerobic fermented tea uses anaerobic Lactobacillus Anaerobe as the fermentation strain.
  • there is a black tea whose anaerobic fungi (Fungi Anaerobe) are used as fermented strains and its main production is Ishizuchi.
  • the fermented tea may not only exhibit a difference in flavor compared to the green tea, but may also show a large difference in the type and content of the active ingredient depending on the specific fermentation process and the type of microorganism. Since various compounds can be produced and separated as described above, various efforts for separating and identifying unknown new compounds using green tea have continued.
  • quercetin compounds are one of flavonoids, most of which exist as glycosides in nature. There are glycosides such as quercitrin, isoquarcitrin, quercimertrin, abicurin, hyperferrin, reinoutrin, quercituron and rutin according to the type of sugar.
  • an object of the present invention is to discover novel quercetin-based compounds through post-fermented tea and use them industrially.
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing the novel quercetin-based compound to improve industrial applicability.
  • the present invention provides, in one aspect, a compound of Formula 1, an isomer thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof.
  • R 1 is C 15 H 9 O 7
  • R 2 is H or C 6 H 11 O 5
  • R 3 is C 9 H 7 O 2 Can be.
  • the present invention also provides a method for preparing the compound, an isomer thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof.
  • the present invention can be widely used in the post-fermented tea-related industry and in each field in which the compound can be used, by separating new specific compounds from post-fermented tea and making them industrially available. Can meet consumer demand
  • Figure 1 shows quercetin 3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-ramnopyranosyl- ( 1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside].
  • FIG. 2 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-lamnopyranosyl- ( 1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] shows the 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance) spectrum.
  • Figure 3 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-lamnopyranosyl- ( 1 ⁇ 6) -O- ⁇ - D- gluconic shows the 13 C-NMR spectrum of the nose Llano side.
  • Figure 4 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- ( 1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] shows the 1 H- 13 C Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) spectrum.
  • HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
  • FIG. 5 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-lamnopyranosyl- ( 1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] shows the 1 H- 13 C Heteronuclear Multiple-Bond Coherence (HMBC) spectrum.
  • HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Coherence
  • Fig. 6 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] The MS spectrum of is shown.
  • Figure 7 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] 1 H-NMR spectrum of is shown.
  • Figure 8 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] 13 C-NMR spectrum of is shown.
  • Figure 9 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside]
  • HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
  • Figure 10 shows quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside]
  • HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Coherence
  • Figure 11 confirms the effect of the compound according to one aspect of the present invention on the aggregation of beta amyloid.
  • Post-fermentation includes fermentation by a separate microorganism or substance other than the enzyme present in tea leaves.
  • Post-fermented tea includes fermented green tea by the above method.
  • fraction includes fractionating or extracting a specific substance or extract using a certain solvent, and extracting them again with a specific solvent. Fractionation methods and extraction methods can be any method known to those skilled in the art.
  • isomers in particular are not only optical isomers (eg, essentially pure enantiomers, essentially pure diastereomers or mixtures thereof), but also form isomers ( conformation isomers (ie, isomers that differ only by their angles of one or more chemical bonds), position isomers (especially tautomers) or geometric isomers (eg, cis-trans isomers) do.
  • essentially pure means at least about 90%, preferably at least about 95%, of a specific compound, for example enantiomers or diastereomers, when used in connection with an enantiomer or diastereomer. More preferably at least about 97% or at least about 98%, even more preferably at least about 99%, even more preferably at least about 99.5% (w / w).
  • pharmaceutically acceptable refers to the approval of a government or equivalent regulatory body for use in animals, more specifically in humans, by avoiding significant toxic effects when used in conventional medicinal dosages. It is meant to be recognized or approved, or recognized as listed in a pharmacopoeia or other general pharmacopoeia.
  • salts means salts according to one aspect of the invention that are pharmaceutically acceptable and have the desired pharmacological activity of the parent compound.
  • the salt is formed from (1) an inorganic acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, or the like; Or acetic acid, propionic acid, hexanoic acid, cyclopentanepropionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, lactic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, 3- (4-hydroxybenzoyl) Benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 1,2-ethane-disulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, 4-chlorobenzenes
  • hydrate refers to a compound to which water is bound, and is a broad concept including an inclusion compound having no chemical bonding force between water and the compound.
  • solvate means a higher order compound produced between molecules or ions of a solute and molecules or ions of a solvent.
  • the present invention provides a compound of Formula 1, an isomer thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof.
  • R 1 may be C 15 H 9 O 7
  • R 2 may be H or C 6 H 11 O 5
  • R 3 may be C 9 H 7 O 2 .
  • R 1 may be a compound of Formula 2 below.
  • R 2 may be a compound of Formula 3 below.
  • R 3 may be a compound of Formula 4 below.
  • the compound is quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L Rampofyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside]
  • quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside]
  • the quercetin 3-O- [3-O "-(E) -p-coumaro I] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] is represented by
  • the compound is quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-ramnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O - ⁇ -D-glucopyranoside] (Quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] Quercetin 3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyrano Side] may be represented as in the following chemical formula.
  • the compound is a novel material that is not known previously, the inventors have discovered and separated a new material after the continuous study on the post-fermented tea.
  • the compound according to an aspect of the present invention exhibits usefulness such as inhibiting beta amyloid aggregation (see FIG. 11), and beta amyloid aggregation is a property that can be clinically applied in medicine and related fields. It can be clearly seen that it can be used industrially. Further studies on the utility of these compounds are expected to be useful in a variety of industries.
  • the content of the compound is 0.01% by weight, 0.05% by weight, 0.1% by weight, 0.2% by weight, 0.3% by weight, 0.4% by weight, based on the total weight of the composition comprising the same, At least 0.5 weight percent, at least 0.7 weight percent, at least 0.9 weight percent, at least 1.0 weight percent, at least 1.3 weight percent, at least 1.5 weight percent, at least 1.7 weight percent, at least 2.0 weight percent, at least 2.2 weight percent, at least 2.5 weight percent, At least 2.8 wt%, at least 3.0 wt%, at least 3.3 wt%, at least 3.5 wt%, at least 3.8 wt%, at least 4.0 wt%, at least 4.5 wt%, at least 5.0 wt%, at least 5.5 wt%, at least 6.0 wt%, At least 8.0 wt%, at least 10 wt%, at least 12 wt%, at least 15 wt%, or at least 20 wt%
  • the present invention provides a process for preparing the compounds, isomers thereof, pharmaceutically acceptable salts thereof, hydrates thereof, or solvates thereof.
  • the manufacturing method may include synthesis, separation from natural products, and the like.
  • the manufacturing method may be to separate after fermenting green tea.
  • the preparation method may include the step of inoculating and fermenting the fermentation bacteria in the green tea leaves and then drying with hot air and then aging, and may include the step of separating the compound through extraction and fractionation after aging.
  • the extraction and fraction may be water, using an organic solvent and the like, any method known to those skilled in the art can be applied.
  • the fraction may be after the extraction, may be fractionated with ketone, and fractionated with ketone may be extracted again with alcohol (for example, ethanol).
  • the ketone is acetone, carvon, pulegone, isolongifolanone, 2-heptanone, 2-pentanone, 3-hexanone, 3-heptanone, 4-heptanone, 2-octanone, 3-octanone, 2-nonanone, 3-nonanone, 2-undecanone, 2-tridecanone, methyl isopropyl ketone, ethyl isoamyl ketone, butylidene acetone, methylheptenone , Dimethyl octenone, geranyl acetone, farnesyl acetone, 2,3-pentadione, 2,3-hexadione, 3,4-hexadione, 2,3-heptadione, amylcyclopentanone, amylcyclopentan
  • the fermentation may be by a post-fermentation method.
  • the post-fermentation may be by strain inoculation, the strain may be Saccharomyces sp., Bacillus sp., Lactobacillus sp., And Leukonostoc mesenteroides sp. Saccharomyces, and preferably Saccharomyces cerevisiae ), Lactobacillus casei , Bacillus subtlis , Lactobacillus bulgarius and Leuconostoc mesenteroides .
  • the water content was adjusted to 40 wt% by adding water to the green tea made from green tea ( Camellia sinensis var. Yabukita ) leaves.
  • Bacillus subtillis Bacillus subtillis 5 ⁇ 10 6 cfu / g was inoculated, fermented for 3 days at 50 °C and then fermented at 80 °C 4 days.
  • the aged tea sample was ground for 15 seconds and filtered through a stainless steel sieve of mesh size 1 mm. Thereafter, the pulverized 50mg was added to 1.5ml Eppendorf tube, 1ml of deionized water was added, stirred at a constant speed for 30 minutes in a 60 ° C constant temperature water bath, and centrifuged for 15 minutes at 25 ° C 13,000rpm. Only insoluble portions of the dried fermented green tea extract were separated.
  • 150 g of the post-fermented tea sample was fractionated with acetone to remove catechin derivatives and caffeine and to obtain a soluble substance in which other compounds were concentrated.
  • acetone solubles a fraction of 5: 1 (v / v) of chloroform: methanol was first obtained by using silica gel column chromatography as a solvent.
  • quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O a compound previously unknown from the fraction
  • quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaro Japanese] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] Quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaro Japanese] [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D
  • each of the compounds is a novel compound which is not known in the art, and quercetin 3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ - having a molecular weight of 918.2430 of C 42 H 46 O 23 .
  • Quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-lamnopyranosyl- (1 ⁇ 6 ) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] and the NMR data are as follows.
  • Quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-lamnopyranosyl- (1 ⁇ 6 ) -O- ⁇ -D-glucopyranoside] is shown in Figure 1
  • 1 H-NMR spectrum and 13 C-NMR spectrum is shown in Figures 2 and 3, respectively
  • HSQC Heteronuclear Single quantum coherence (spectrum) spectrum is shown in FIG. 4
  • HMBC heteronuclear multiple-board coherence
  • beta-amyloid (A ⁇ 1-42, AnaSpec Inc, USA) was obtained and used at a concentration of 0.1 mg / ml, and stored at -80 ° C before use.
  • RFU is relative fluorescence unit and “Increased RFU” is the amount of aggregated beta amyloid, and “Increased RFU (% of Pos. Cont.)” Is the percentage value of the amount of aggregated beta amyloid compared to the positive control. Indicates.
  • New Material 31 refers to quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L-ramnopyra Nosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside], and "New Material 32” refers to quercetin 3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -L-lamnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside].
  • test composition containing 0.5% by weight, 1% by weight, and 3% by weight of the compound, respectively (composition for the skin including an emulsifier, a stabilizer, purified water, etc. in addition to the compound).
  • composition for the skin including an emulsifier, a stabilizer, purified water, etc. in addition to the compound.
  • 20 ⁇ l was added dropwise per chamber (IQ chamber, Epitest Ltd, Finland), and after 24 hours of patching on the upper right side of the subject's upper back, a new patch was replaced.
  • the skin reactions were examined before and after each patch while performing nine patches three times a week for a total of three weeks. The skin reactions were confirmed up to 48 hours after the final patch removal, and the average response was obtained.
  • the skin response was determined according to the criteria of the International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG).
  • "New material 31" in the table refers to quercetin 3-O- [3-O "-(E) -p-coumaroyl] [ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) -O- ⁇ -L -Ramnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside], and "New 32" is quercetin3-O- [3-O "-(E) -p-coumaro. []]-[Alpha] -L-ramnopyranosyl- (1 ⁇ 6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside]. That is, both substances showed negative reactivity in the above content range (no subjects showed ⁇ , +, ++, or +++ reactivity), and thus the substance had no cumulative irritation to the skin, It was found to be safe to use.

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Abstract

본 명세서는 후발효차에서 분리한 신규한 퀘르세틴계 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물에 관한 것이며, 후발효차 관련 산업 및 상기 화합물이 이용될 수 있는 각 분야에서 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 퀘르세틴계 화합물
본 명세서는 신규한 퀘르세틴계 화합물에 관한 것이다.
녹차는 잎 상태의 엽차 형태, 또는 보다 깊은 향취를 느끼기 위해 발효 상태의 차로 음용한다. 발효 녹차는 녹차 잎에 산화 처리를 수행한 것을 의미하며, 차 잎에 존재하는 산화 효소에 의하여 산화시킨 발효차, 차 잎에 존재하는 효소가 아닌 별도의 미생물에 의하여 발효시킨 후발효차를 포함한다. 발효 정도에 따라 약발효차, 반발효차, 완전발효차 등으로 구분할 수 있다. 예를 들어, 발효 녹차는 발효 형태 및 정도에 따라, 녹차, 우롱차, 홍차, 보이차 등과 같은 다양한 명칭으로 불리워진다.
세계적인 후발효차의 제조기술 보유국가는 중국, 일본이다. 중국의 호기적 발효차는 곰팡이류(Fungi)를 발효균주로 사용하고, 주요산지는 운남성 서 쌍판납이다. 일본의 호기적 발효차로는 곰팡이류(Fungi)를 발효군주로 사용하고 토야마(富山)가 주요산지인 흑차가 있고, 혐기적 발효차로는 혐기성 락토바실러스(Lactobacillus Anaerobe)를 발효균주로 사용하고 주요산지가 아와(阿波)인 번차가 있다. 또한, 혐기성 곰팡이류(Fungi Anaerobe)를 발효균주로 사용하고 주요산지가 이시즈치(石鎚)인 흑차가 있다. 중국의 보이현에서 유래된 전통 보이차는 녹차잎을 채취할 때 고의적으로 상처를 주고, 가열하여 볶은 후 적당량의 수분을 가하고 공기중의 미생물을 이용하여 자연 발효시킨다. 우리나라에서는 지리산, 보령 등에서 간헐적으로 가내수공업 형태로 발효차를 제조하여 음용하고 있다.
발효 상태의 차는 엽차와 비교하여 향취에 있어 차이를 나타낼 뿐만 아니라, 구체적 발효 공정 및 미생물의 종류 등에 따라 유효 성분의 종류 및 함량에 있어서 큰 차이를 나타낼 수 있다. 이와 같이 다양한 화합물이 생성, 분리될 수 있다는 점 때문에, 녹차를 이용한 미지의 신규 화합물 분리 및 동정을 위한 다양한 노력이 지속되고 있는 실정이다.
한편, 퀘르세틴계 화합물은 플라보노이드의 하나로서, 자연계에서 대부분이 배당체로서 존재한다. 당의 종류에 의해 퀘르시트린, 이소퀘르시트린, 퀘르시메리트린, 아비쿨라린, 히페린, 레이노우트린, 퀘르시투론, 루틴 등의 배당체가 있다.
본 발명은 일 측면에서, 후발효차를 통해 신규한 퀘르세틴계 화합물을 발굴하고 이를 산업적으로 이용하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 신규한 퀘르세틴계 화합물의 제조방법을 제공하여 산업적 이용가능성을 제고하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 일 측면에서, 하기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 제공한다.
Figure PCTKR2017011404-appb-C000001
상기 화학식 1에서 R1은 C15H9O7 이며, R2는 H 또는 C6H11O5이며, R3는 C9H7O2 일 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 측면에서, 상기 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 일측면에서, 후발효차에서 신규한 특정 화합물을 분리한 뒤 이를 산업적으로 이용할 수 있도록 함으로써, 후발효차 관련 산업 및 상기 화합물이 이용될 수 있는 각 분야에서 널리 활용될 수 있고, 관련 소비자의 수요를 충족시킬 수 있다.
도 1은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 1H-NMR(핵자기공명) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 1H-13C HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 1H-13C HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 1H-13C HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 1H-13C HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 측면에 따른 화합물이 베타 아밀로이드의 응집에 미치는 영향을 확인한 것이다.
본 명세서에서 “후발효”는 차 잎에 존재하는 효소가 아닌 별도의 미생물 또는 물질에 의하여 발효시키는 것을 포함한다. 후발효차는 상기 방식에 의해 녹차를 발효시킨 것을 포함한다.
본 명세서에서 “분획물”은 어떤 용매를 이용하여 특정 물질이나 추출물을 분획한 것 또는 분획하고 남은 것, 그리고 이들을 특정 용매로 다시 추출한 것을 포함한다. 분획 방법 및 추출방법은 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 어떤 방법도 가능하다.
본 명세서에서 "이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.
본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기관의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전에 기재된 것으로 인지되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “수화물(hydrate)”은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.
본 명세서에서 “용매화물”은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.
본 발명은 일측면에서, 하기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017011404-appb-I000001
상기 화학식 1에서 R1은 C15H9O7 이며, R2는 H 또는 C6H11O5이며, R3는 C9H7O2일 수 있다.
일 구현 예에 의하면, 상기 R1은 하기 화학식 2의 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2017011404-appb-C000002
다른 구현 예에 의하면, 상기 R2는 하기 화학식 3의 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2017011404-appb-C000003
상기 R3는 하기 화학식 4의 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2017011404-appb-C000004
다른 구현 예에 의하면, 상기 화합물은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드](Quercetin3-O-[3-O"-(E)-p-coumaroyl][β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside]일 수 있다. 상기 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]는 하기 화학식과 같이 표시할 수 있다.
Figure PCTKR2017011404-appb-C000005
또 다른 구현 예에 의하면, 상기 화합물은 상기 화합물은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드](Quercetin3-O-[3-O"-(E)-p-coumaroyl][α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside]일 수 있다. 상기 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]는 하기 화학식과 같이 표시할 수 있다.
Figure PCTKR2017011404-appb-C000006
본 발명은 일 측면에서, 상기 화합물은 기존에 알려지지 않은 신규한 물질로서, 본 발명자들은 후발효차에 대한 지속적인 연구 끝에 신규한 물질을 발굴 및 분리해낸 것이다. 본 발명의 일 측면에 따른 상기 화합물은 베타 아밀로이드 응집을 억제하는 등의 유용성을 발휘하며(도 11 참조), 베타 아밀로이드 응집 등은 의약 및 관련 분야에서 임상적으로 응용할 수 있는 특성이므로, 상기 화합물을 산업적으로 이용할 수 있음을 명확히 알 수 있다. 상기 화합물에 관한 유용성에 대해 추가적으로 연구할 경우 다양한 산업 분야에 활용할 수 있을 것으로 예상된다.
일 구현 예에 의하면, 상기 화합물의 함량은 이를 포함하는 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 중량%이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1.0 중량% 이상, 1.3 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 1.7 중량% 이상, 2.0 중량% 이상, 2.2 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 2.8 중량% 이상, 3.0 중량% 이상, 3.3 중량% 이상, 3.5 중량% 이상, 3.8 중량% 이상, 4.0 중량% 이상, 4.5 중량% 이상, 5.0 중량% 이상, 5.5 중량% 이상, 6.0 중량% 이상, 8.0 중량% 이상, 10 중량% 이상, 12 중량% 이상, 15 중량% 이상, 또는 20 중량% 이상일 수 있다. 또한, 18 중량% 이하, 15 중량% 이하, 12 중량% 이하, 10 중량% 이하, 8.0 중량% 이하, 6.0 중량% 이하, 5.5 중량% 이하, 5.0 중량% 이하, 4.5 중량% 이하, 4.0 중량% 이하, 3.8 중량% 이하, 3.5 중량% 이하, 3.3 중량% 이하, 3.0 중량% 이하, 2.8 중량% 이하, 2.5 중량% 이하, 2.2 중량% 이하, 2.0 중량% 이하, 1.7 중량% 이하, 1.5 중량% 이하, 1.3 중량% 이하, 1.0 중량% 이하, 0.9 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.7 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.4 중량% 이하, 0.3 중량% 이하, 0.2 중량% 이하, 0.1중량% 이하, 0.05 중량% 이하, 또는 0.03 중량% 이하일 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 화합물, 이의 이성질체, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 수화물 또는 이들의 용매화물의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 합성, 천연물에서의 분리 등을 포함할 수 있다.
일 구현 예에 의하면, 상기 제조 방법은 녹차를 발효시킨 후 분리하는 것일 수 있다. 상기 제조방법은, 녹차 잎에 발효균을 접종하고 발효시킨 후 열풍으로 건조시킨 뒤 숙성시키는 과정을 포함할 수 있고, 숙성 이후 추출 및 분획을 거쳐 상기 화합물을 분리하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 추출 및 분획은 물, 유기용매 등을 이용하는 것일 수 있고, 당업자에게 알려진 어떠한 방법도 적용이 가능하다.
다른 측면에 의하면, 상기 분획은 상기 추출 이후에 하는 것일 수 있고, 케톤으로 분획하는 것일 수 있으며, 케톤으로 분획한 것을 다시 알코올(예를 들어, 에탄올)로 추출한 것일 수도 있다. 상기 케톤은 아세톤, 카르본(carvon), 풀레곤(pulegone), 이소론기폴라논(isolongifolanone), 2-헵타논, 2-펜타논, 3-헥사논, 3-헵타논, 4-헵타논, 2-옥타논, 3-옥타논, 2-노나논, 3-노나논, 2-운데카논, 2-트리데카논, 메틸이소프로필케톤, 에틸이소아밀케톤, 부틸리덴 아세톤, 메틸헵테논, 디메틸옥테논, 게라닐 아세톤, 파르네실 아세톤, 2,3-펜타디온, 2,3-헥사디온, 3,4-헥사디온, 2,3-헵타디온, 아밀시클로펜타논, 아밀시클로펜테논, 2-시클로펜틸 시클로펜타논, 헥실시클로펜타논, 2-n-헵틸시클로펜타논, cis-쟈스몬, 디히드로쟈스몬, 메틸코릴론, 2-tert-부틸시클로헥사논, p-tert-부틸시클로헥사논, 2-sec-부틸시클로헥사논, 셀러리 케톤, 크립톤, p-tert-펜틸시클로헥사논, 메틸시클로시트론, 네론, 4-시클로헥실-4-메틸-2-펜타논, 옥사이드 케톤, 에목시 프론, 메틸나프틸케톤, α-메틸아니살아세톤, 아니실 아세톤, p-메톡시 페닐 아세톤, 벤질리덴 아세톤, p-메톡시아세토페논, p-메틸아세토페논, 프로피오페논, 아세토페논, α-다이나스콘(Dynascone), 일리톤(lritone), 아이오논(ionone), 슈도아이오논(Pseudoionone), 메틸아이오논, 메틸일리톤, 2,4-디-tert-부틸시클로헥사논, 알릴아이오논, 2-아세틸-3,3-디메틸노르보르난, 베르베논, 펜콘(fenchon), 시클로펜타데카논, 시클로헥사데세논 등을 포함할 수 있고, 당업계에서 일반적으로 사용될 수 있는 용매로서의 케톤류 및 이들의 혼합물을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 아세톤일 수 있다.
다른 구현 예에 의하면, 상기 발효는 후발효 방식에 의한 것일 수 있다. 상기 후발효는 균주 접종에 의한 것일 수 있고, 상기 균주는 사카로마이세스속(Saccharomyces sp.), 바실러스속(Bacillus sp.) 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) 및 루코노스톡속(Leuconostoc mesenteroides sp.)으로부터 선택되는 균주일 수 있고, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtlis), 락토바실러스 불가리우스(Lactobacillus bulgarius) 및 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 선택될 수 있다.
이하, 실시예, 및 실험예를 들어 본 명세서의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 명세서에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 명세서의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 후발효차 시료의 제조
녹차(Camellia sinensis var. Yabukita) 잎으로 만든 녹차에 물을 첨가하여 수분 함량을 40중량%으로 조정하였다. 여기에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) 5×106cfu/g을 접종하고, 50℃에서 3일간 발효시킨 후 80℃에서 4일간 발효시켰다.
상기 숙성된 차 시료를 15초 동안 분쇄하고, 메쉬 사이즈 1mm의 스테인리스 체로 걸렀다. 이후 분쇄된 50mg을 1.5ml Eppendorf tube 넣고 1ml의 탈이온수를 첨가하여 60℃ 항온 수조에서 30분간 일정 속도로 교반한 후, 25℃ 13,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 건조시킨 발효 녹차 추출물에서 물에 녹지 않는 부분만을 분리하였다.
[실시예 2] 분획물 수득 및 화합물 분리
상기 후발효차 시료 150g을 아세톤으로 분획하여 카테킨 유도체 및 카페인을 제거하고 다른 화합물들이 농축된 가용물을 수득하였다. 상기 아세톤 가용물 40 g에 대해서 일차적으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여, 클로로포름:메탄올의 5:1 (v/v) 혼합물을 용매로 분획물을 얻었다.
카페인이 제거된 클로로포름:메탄올 5:1 (v/v) 분획물 8.9 g을 대용량 고성능 역류크로마토그래피(high-performance countercurrent chromatography, HPCCC, Dynamic Extractions Ltd, UK)를 이용하여 분획하였다. 이때 사용한 용매는 n-hexane-TBME(Methyl tert-butyl ether)-BuOH-MeCN-Water (0.25:3:1:1:5, v/v)이었고, 유속은 25 ml/min으로 하였다. 상기 조건을 이용하여 총 10개의 하위 분획을 나누었으며, 각 분획을 다시 소용량 HPCCC(Dynamic Extractions Ltd, UK), HPLC(High-performance liquid chromatography), 세파덱스(sephadex) LH-20컬럼(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden) 등을 사용하여 각 분획에 함유된 성분을 분리하였다.
그 결과, 상기 분획물로부터 기존에 알려지지 않은 화합물인, 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드](Quercetin3-O-[3-O"-(E)-p-coumaroyl][β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside]와 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드](Quercetin3-O-[3-O"-(E)-p-coumaroyl][α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside])를 분리할 수 있었으며, 1H, 13C-NMR(nuclear magnetic resonace spectroscopy), UV(ultraviolet spectroscopy), ESI-MS(Electro Spray Ionization Mass Specroscopy)를 이용하여 구조를 동정하여 각 화합물의 구조를 규명하였다. 1H 및 13C 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)의 경우 용매(solvent)로 methanol-d3을 사용하였고, 기기는 Bruker Advance DPX-500(BRUKER사, USA)를 사용하였다. 각 화합물의 MS 스펙트럼은 6200 Series Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC/MS(Agilent, US)를 이용하여 분석하였다.
분석 결과, 상기 각 화합물은 기존에 알려지지 않은 신규한 화합물로서, C42H46O23의 분자량918.2430인 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]와, C36H36O18의 분자량 756.1902인 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]로 확인되었다.
퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 화학식 및 NMR 데이터는 아래와 같다.
Figure PCTKR2017011404-appb-I000002
Position 　 13C-NMR 　 1H-NMR
2 　 159.29 　 　
3 　 135.58 　 　
4 　 179.33 　 　
5 　 163.02 　 　
6 　 99.98 　 6.21 (H6, brs )
7 　 166.03 　 　
8 　 94.95 　 6.41 (H8, brs)
9 　 158.58 　 　
10 　 105.6 　 　
1' 　 123.06 　 　
2' 　 117.79 　 7.68 (H2', m)
3' 　 145.86 　 　
4' 　 149.82 　 　
5' 　 116.13 　 6.86 (H5', d, J =8.3 Hz)
6' 　 123.48 　 7.62 (H6', dd, J = 8.3, 1.3 Hz)
p-coumaric acid
1''' 　 127.3 　 　
2''', 6''' 　 131.18 　 7.48 (H2'''/H6''', d, J = 7.8 Hz)
3''', 5''' 　 116.83 　 6.81 (H3'''/H5''', d, J = 7.8 Hz)
4''' 　 161.27 　 　
7''' 　 115.45 　 6.42 (H7''', d, J = 15.4 Hz)
8''' 　 146.71 　 7.68 (H8''', m)
C=O 　 168.95 　 　
Glc1
1'' 　 104.5 　 5.26 (H1'', d, J = 7.7 Hz)
2'' 　 74.11 　 3.71 (H2'', d, J = 9 Hz)
3'' 　 78.93 　 5.11(H3'', t, J = 9 Hz)
4'' 　 69.43 　 3.54 (H4'', dd, J = 9.8, 9.3 Hz)
5'' 　 77.54 　 3.40 (H5'', m)
6'' 　 68.43 　 3.80 (H6'', brd, J = 10.4 Hz)
　 　 　 　 3.49
Rha
1'''' 　 102.33 　 4.57 (H1''' ', brs)
2'''' 　 70.89 　 3.38 (H2''' ', m)
3'''' 　 83.06 　 3.63 (H3''' ', dd, J = 8.9, 2.2 Hz)
4'''' 　 72.6 　 3.46 (H4''' ', m)
5'''' 　 69.76 　 3.54 (H5''' ', m)
6'''' 　 17.96 　 1.10 (H6''' ', d, J = 5.7 Hz)
Glc2
1''''' 　 105.67 　 4.44 (H1''' '', d, J = 7.5 Hz)
2''''' 　 75.48 　 3.25 (H2''' '', m)
3''''' 　 76.97 　 3.50 (H3''' '', m)
4''''' 　 71.28 　 3.96 (H4''' '', brs)
5''''' 　 77.54 　 3.26 (H5''' '', m)
6''''' 　 62.1 　 3.78-3.72 (H6''' '', m)
퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 MS 스펙트럼은 도 1과 같이 나타났고, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 각각 도 2 및 도 3으로 나타났으며, HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 스펙트럼은 도 4와 같으며, HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence) 스펙트럼은 도 5와 같았다.
한편, 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 화학식 및 NMR 데이터는 아래와 같다.
Figure PCTKR2017011404-appb-I000003
Position 　 13C-NMR 　 1H-NMR
2 159.23
3 135.52
4 179.33
5 163.02
6 99.96 6.21 (H6, brs )
7 166.04
8 94.85 6.40 (H8, brs)
9 158.52
10 105.64
1' 123.06
2' 117.68 7.67 (H2', d, J =8.7 Hz)
3' 145.88
4' 149.86
5' 116.11 6.89 (H5', d, J =8.4 Hz)
6' 123.52 7.63 (H6', dd, J = 8.4, 1.7 Hz)
p-coumaric acid
1''' 127.29
2''', 6''' 131.17 7.48 (H2'''/H6''', d, J = 8.4 Hz)
3''', 5''' 116.82 6.81 (H3'''/H5''', d, J = 8.4 Hz)
4''' 161.26
7''' 115.44 6.42 (H7''', d, J = 15.7 Hz)
8''' 146.7 7.68 (H8''', d, J = 15.7 Hz)
C=O 168.97
Glc1
1'' 101.55 5.28 (H1'', d, J = 7.8 Hz)
2'' 74.14 3.71 (2'', d, J = 9 Hz)
3'' 73.25 5.11 (H3'', t, J = 9.2 Hz)
4'' 70.47 3.54 (H4'', dd, J = 9.8, 9.3 Hz)
5'' 75.51 3.40 (H5'', m)
6'' 67.54 3.80 (H6'', brd, J = 10.4 Hz)
3.49
Rha
1'''' 101.85 4.53 (H1''' ', brs)
2'''' 71.34 3.38 (H2''' ', m)
3'''' 83.09 3.63 (H3''' ', dd, J = 8.9, 2.2 Hz)
4'''' 72.6 3.46 (H4''' ', m)
5'''' 69.49 3.54 (H5''' ', m)
6'''' 18.08 1.12 (H6''' ', d, J = 6.1 Hz)
퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 MS 스펙트럼은 도 6과 같이 나타났고, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 각각 도 7 및 도 8으로 나타났으며, HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 스펙트럼은 도 9와 같으며, HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence) 스펙트럼은 도 10과 같았다.
[실험예 1] 베타아밀로이드 응집 억제 효능 확인
상기 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]와 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 베타-아밀로이드 응집 저해 효과를 형광분석법(ThioflavinT assay)으로 확인하였다.
구체적으로, 베타-아밀로이드(Aβ1-42, AnaSpec Inc, USA)를 입수하여 0.1 mg/ml의 농도로 사용하였으며, 사용 전 -80 ℃에 보관하였다. DMSO에 모린(Morin, 20μM), 페놀레드(Phenol Red, 20μM), 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드] (1mg/ml), 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드] (1mg/ml) 각각을 희석하여 상기 농도로 조절하였다. Aβ1-42 응집 억제 정도를 특정하기 위하여 0.01 M 인산소다 완충용액 50 ㎕에 상기 농도로 준비된 각각의 화합물을 10 μM이 되도록 희석한 후, 0.1 mg/ml의 Aβ1-42를 40 ㎕ 가한 뒤, 2 mM 티오플라빈T(ThioflavinT) 10 ㎕를 가하여 37 ℃ 에서 5분 간격으로 150 분 동안 형광분광 분석기(RF-5300PC, SHIMADZU CORPORATION, Japan)로 형광을 측정하였다.
그 결과는 아래 표 및 도 11과 같이 나타났다.
　 Increased RFU Increased RFU (% of Pos.Cont.)
Pos.Cont. 14595 100.0
신규물질31 12955 88.8
신규물질32 12148 83.2
Morin 11471 78.6
Phenol Red 13655 93.6
상기 표에서 RFU는 relative fluorescence unit이고 “Increased RFU”는 응집된 베타아밀로이드의 양을 나타내며, “Increased RFU (% of Pos.Cont.)”는 응집된 베타아밀로이드의 양을 양성 대조군과 대비한 백분율 값을 나타낸다. “신규물질 31”은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]를 나타내고, “신규물질 32”는 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]를 나타낸다.
즉, 양성 대조군(positive control, “Pos.Cont.”로 표시, 화합물 처리 없이 베타아밀로이드만 응집시킨 것)의 응집을 100%로 보았을 때 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]와 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]은 각각 양성 대조군보다 11.2%, 16.8% 정도로 응집을 억제하는 효과를 보였다. 이 결과는, 상기 물질이 기존에 알려진 억제제인 Morin (21.4 %), Phenol red (6.4 %)만큼 우수한 베타아밀로이드 응집 억제 효능이 있음을 나타낸다. 따라서, 상기 두 화합물은 상기와 같은 유용성을 가지고 있는 바, 관련 산업 분야에 다양하게 활용될 수 있는 것이다.
[실험예 2] 피부 누적 자극 실험
상기 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]와 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]의 피부누적 자극성 여부를 확인하고, 피부에 사용할 수 있는 농도 범위를 산출하기 위해 HRIPT(Human repeated insult patch tests)을 실시하였다.
구체적으로, 건강한 성인 피검자 15인을 무작위로 선정하고, 상기 화합물이 각각 0.5중량%, 1중량%, 3중량%씩 포함된 시험용 조성물(상기 화합물 이외에 유화제, 안정제, 정제수 등을 포함하는 피부용 조성물)을 챔버(IQ chamber, Epitest Ltd, 핀란드) 당 20μl씩 적하하고, 피검자의 등상부 우측 부위에 첩포한 후 24시간 경과하면, 새로운 첩포로 교환하였다. 이러한 방법으로, 1주일에 3회씩 총 3주간 9회의 첩포를 진행하면서 매회 첩포 전후의 피부 반응을 검사하였고, 최종 첩포 제거 후 48시간까지 피부 반응을 확인하였으며, 평균 반응도를 구하였다.
그 결과는 아래 표와 같았다.
시험물질 및 함량 ±, +, 또는 ++ 반응도가 나타난 피검자수(단위: 명) 평균반응도
1회 2회 3회 4회 5회 6회 7회 8회 9회
대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
신규물질 31 0.5중량% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
신규물질 31 1중량% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
신규물질 31 3중량% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
신규물질 32 0.5중량% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
신규물질 32 1중량% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
신규물질 32 3중량% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 　0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
반응도-: 음성(반응 없음)± : 의심스러운 또는 미미한 홍반 등+ : 약한 반응 (소수포를 동반하지 않음), 홍반, 구진++ : 중증도 반응 (소수포를 동반함), 홍반, 구진, 소수포 +++ : 강한 반응, 대수포 반응평균반응도 계산식평균반응도 =[{(반응도를 나타낸 피검자수와 반응지수를 곱한 값의 총합)/(총 피검자수 X 최고점수(4점))} X 100] / 검사회수(9회)상기 식에서 반응도가 -이면 반응지수는 0, 반응도가 ±이면 반응지수는 1, 반응도가 +이면 반응지수는 2, 반응도가 ++이면 반응지수는 4로 함. 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정함
상기 피부반응은 국제접촉피부염 연구(ICDRG;International Contact Dermatitis Research Group)의 기준에 따라 판정하였다. 상기 표에서 "신규물질 31"은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]를 나타내고, "신규물질 32"는 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드]를 나타낸다. 즉, 두 물질 모두 상기 함량 범위에서 모두 (-) 반응도를 나타내었고(±, +, ++, 또는 +++ 반응도가 나타난 피검자가 없음), 이를 통해 상기 물질이 피부 누적 자극이 없어, 피부에 안전하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 명세서의 특정한 실시예 등을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 명세서의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 명세서의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011404-appb-I000004
    상기 화학식 1에서 R1은 C15H9O7 이며, R2는 H 또는 C6H11O5이며, R3는 C9H7O2인, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1은 하기 화학식 2의 화합물인, 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2017011404-appb-I000005
    .
  3. 제1항에 있어서, 상기 R2는 하기 화학식 3의 화합물인, 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2017011404-appb-I000006
    .
  4. 제1항에 있어서, 상기 R3는 하기 화학식 4의 화합물인, 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2017011404-appb-I000007
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드](Quercetin3-O-[3-O"-(E)-p-coumaroyl][β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside]인, 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 퀘르세틴3-O-[3-O"-(E)-p-쿠마로일][α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노사이드](Quercetin3-O-[3-O"-(E)-p-coumaroyl][α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside]인, 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제조 방법은 녹차를 발효시킨 후 분리하는 것인, 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발효는 후발효 방식에 의한 것인, 제조 방법.
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