WO2018074497A1 - 抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法 - Google Patents

抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018074497A1
WO2018074497A1 PCT/JP2017/037624 JP2017037624W WO2018074497A1 WO 2018074497 A1 WO2018074497 A1 WO 2018074497A1 JP 2017037624 W JP2017037624 W JP 2017037624W WO 2018074497 A1 WO2018074497 A1 WO 2018074497A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
arteriosclerosis
mice
group
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/037624
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
友章 石上
琳 陳
Original Assignee
公立大学法人横浜市立大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人横浜市立大学 filed Critical 公立大学法人横浜市立大学
Priority to EP17863032.3A priority Critical patent/EP3533469A4/en
Priority to JP2018546372A priority patent/JP7012366B2/ja
Priority to US16/343,246 priority patent/US20190339267A1/en
Publication of WO2018074497A1 publication Critical patent/WO2018074497A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis

Definitions

  • the present invention relates to an anti-arteriosclerotic agent and a method for determining a pathological condition of arteriosclerosis.
  • Arteriosclerosis is a terminal image of lifestyle-related diseases.
  • risk factors such as diabetes, hypertension, dyslipidemia, chronic kidney disease, and smoking
  • Non-Patent Document 1 the accuracy of the onset of this disease can be controlled, or an acute catastrophic condition (myocardial infarction, brain In the case of presenting infarction, severe limb ischemia), in addition to making the best use of medical resources (fire-fighting emergency system, acute hospital with equipment and human resources capable of performing acute endovascular treatment) and saving lives There is no way to suppress it.
  • Risk control strategies are uncertain, and clinical trials can only be assessed with relative risk reduction from population-based trials.
  • the pathogenesis of this disease is considered to be a high-risk state due to lifestyle-related diseases as well as a pathological condition derived from an inflammatory / immune response.
  • the present inventors have also reported that serum autoantibodies against molecules such as IL-5 are involved in arteriosclerosis (Non-patent Document 2, Patent Document 1). However, no aggressive treatment has yet been developed to act on the pathogenesis of arteriosclerosis.
  • Patent Document 2 discloses an invention in which atherosclerosis is treated or prevented by depleting B cells with an anti-CD20 antibody.
  • CD20 is a 35 kDa non-glycosylated phosphoprotein found on the surface of more than 90% of B cells in peripheral blood or lymphoid organs and is expressed during early pre-B cell development and persists until plasma cell differentiation ( Patent Document 2). That is, when an anti-CD20 antibody is administered, it is assumed that all B cells are targeted and the number of those cells decreases.
  • An object of the present invention is to provide a novel means capable of suppressing the occurrence of arteriosclerotic lesions and treating arteriosclerosis.
  • the present inventors have found that the intestinal symbiotic microbiota promotes arteriosclerosis through activation of the TLR signaling pathway in B2 cells, using anti-CD23 antibodies. It is found that depletion of B2 cells in the mouse suppresses the development of arteriosclerosis, and the onset, exacerbation / improvement, etc. of arteriosclerosis are indicated by the expression level of a specific gene or serum IgG3 level or serum total IgG level. It was found that it can be determined, and the present invention was completed.
  • the present invention provides an anti-arteriosclerotic agent comprising a substance that selectively inhibits B2 cells as an active ingredient.
  • the present invention also includes measuring at least one gene selected from the group consisting of the following gene group A and gene group B using a sample isolated from a subject, A method for assisting in the determination of a disease state is provided.
  • Gene group A Ccl2, Cd14, Hspa1a, Il1b, Il1r1, Ptgs2, Tnfrsf1a, Tlr5
  • Gene group B Cebpb, Fos, Jun, Nfkbib, Chuk, Ikbkb, Irf1, Mapk8, Mapk8ip3, Mapk9, Tollip, Traded
  • the present invention provides a method for assisting determination of arteriosclerosis pathology, comprising measuring IgG3 level or total IgG level in a serum sample isolated from a subject.
  • the present invention provides a means for treating arteriosclerosis itself. Lifestyle-related diseases are a risk of arteriosclerosis, but are not the cause. Even if lifestyle-related diseases are improved, arteriosclerosis itself cannot be treated. Endovascular treatment is only symptomatic treatment for acute thrombosis resulting from arteriosclerosis.
  • the anti-arteriosclerotic agent according to the present invention targeting B2 cells suppresses the onset, progression and exacerbation of arteriosclerosis by controlling the pathogenesis of this disease, and is a treatment method that is fundamentally different from conventional treatments. , Can greatly contribute to the extension of healthy life expectancy.
  • arteriosclerosis In the onset of arteriosclerosis, B2 cells are activated by a mechanism independent of lipid metabolism, and when B2 cell activation is suppressed, arterial arteries can be used even when serum lipid levels rise and visceral / subcutaneous fat is high It can suppress sclerosis. Therefore, according to the anti-arteriosclerotic agent of the present invention, there is a possibility that severe lipid restriction imposed on arteriosclerotic patients can be alleviated. Further, according to the disease state determination method of the present invention, it is possible to appropriately grasp the state of arteriosclerosis of a patient, and also to monitor the therapeutic effect of an anti-arteriosclerotic agent and determine the therapeutic effect of an anti-arteriosclerotic candidate substance. Furthermore, it can contribute to the development of further arteriosclerosis treatment means.
  • mice were fed a Western diet or standard chow diet with or without antibiotic treatment for 8 weeks.
  • E-H Serum levels of (E-H) total cholesterol (E), LDL cholesterol (F), HDL cholesterol (G), and triglyceride (H) were examined.
  • LDL low density lipoprotein
  • F and G The concentrations of total IgG (F) and IgG3 (G) were measured by ELISA. The value was expressed as mean ⁇ standard error.
  • Each group n 6 from 3 independent experiments. Tukey's post-test: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001.
  • MRNA preparations of sorted FO B cells from PVAT and spleen were analyzed with the mouse Toll-like receptor signaling pathway RT2 Profiler PCR array.
  • the expression of genes reported to be associated with the TLR signaling pathway in FO B2 cells was compared between the groups. It is a heat map showing the gene expression profile relevant to the TLR signal transduction pathway in B2 cells after WD feeding and AT.
  • Sorted MZ ⁇ ⁇ ⁇ B cell mRNA preparations from spleen were analyzed with the mouse Toll-like receptor signaling pathway RT2 Profiler PCR array.
  • the expression of genes reported to be associated with the TLR signaling pathway in MZ B2 cells was compared between the groups.
  • A Weight of the spleen measured at the end of the sputum experiment. Data are expressed as a percentage of body weight.
  • B and C Sputum spleen sections were stained with HE (B) and the number of germinal centers was examined (C).
  • A shows the results of flow cytometry of FO B cells of PVAT
  • B shows the results of flow cytometry of spleen FO B cells and MZ B cells.
  • Each group n 5.
  • the graph is the number of cells (mean ⁇ standard error). * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01. Effect of anti-mouse CD23 antibody on the number of T cells and macrophages in the spleen.
  • the anti-atherosclerotic agent of the present invention contains a substance that selectively suppresses B2 cells as an active ingredient.
  • B2 cell suppression includes suppression of B2 cell activation, eg, reduction in the number of detectable B2 cells.
  • a substance that selectively inhibits B2 cells is a substance that inhibits B2 cells and does not inhibit B1 cells and other subsets of B cells.
  • the number of B1 cells in the spleen is 65% or more (for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85%, or 90%) And the number of B2 cells in the spleen has been reduced to less than 20% (for example, less than 15%, less than 10%, less than 7%, or less than 5%)
  • the substance corresponds to “a substance that selectively inhibits B2 cells”.
  • arteriosclerosis can be treated by selectively inhibiting B2 cells.
  • treatment of arteriosclerosis includes the suppression of the progression and severity of arteriosclerotic lesions and the suppression of the occurrence of new arteriosclerotic lesions.
  • Whether or not a substance has an action of suppressing B2 cells is determined by, for example, treating a peripheral blood sample with the substance, measuring the number of B2 cells by a flow cytometry method, and controlling the peripheral of a control not treated with the substance. It can be examined by comparing with the number of B2 cells in the blood sample.
  • CD23 which is a low affinity IgE receptor, is a surface antigen highly specific to B2 cells among B cells, and B2 cells in vivo can be selectively suppressed by using an anti-CD23 antibody.
  • Anti-human CD23 monoclonal antibodies that can be administered to humans are already known (eg, WO98 / 37099).
  • amino acid sequence of CD23 of various animals including humans and the sequence of the cDNA encoding it are known and registered in the database, so it is possible to produce anti-CD23 antibodies by conventional methods. is there.
  • human CD23 is registered in NCBI GenBank with an accession number such as NM_002002.
  • sequences described in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing are human CD23 sequences registered under NM_002002.4.
  • an anti-human CD23 monoclonal antibody is produced by the hybridoma method
  • human CD23 protein or an appropriate fragment thereof extracellular region, eg, aa48-321 of human CD23
  • antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes are collected from the animal, fused with myeloma cells to prepare hybridomas, and hybridomas producing antibodies that bind to CD23 protein may be screened.
  • the hybridoma selected by screening can be grown, and an anti-human CD23 monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • a human chimeric antibody typically a chimeric antibody of rodents or primates with humans
  • a humanized antibody the CDR region of a non-human-derived antibody is a human antibody
  • Immunogenicity to humans such as human antibodies (similar to those produced in humans, produced using non-human animals or human cell lines) Reduced antibodies are preferred.
  • Methods for producing chimeric antibodies, humanized antibodies and human antibodies have also been established as well-known methods.
  • the anti-CD23 antibody includes an antibody having various activities such as neutralizing activity (neutralising, blocking, blocking or inhibiting), ADCC activity, CDC activity and the like.
  • the anti-CD23 antibody may have any activity as long as it can suppress B2 cells.
  • arteriosclerosis is typically atherosclerosis.
  • the subject of administration of the anti-atherosclerotic agent of the present invention includes various mammals, but is typically a human.
  • the anti-atherosclerotic agent of the present invention can be preferably administered to a patient having arteriosclerosis, typically a human patient.
  • the dose of the anti-arteriosclerotic agent may be an amount that can treat arteriosclerosis, and can be appropriately selected according to the age, weight, severity, etc. of the administration target.
  • the dosage may be about 1.5 ⁇ g / kg body weight to about 1.5 g / kg body weight, for example, about 10 ⁇ g / kg body weight to about 100 mg / kg body weight as the amount of active ingredient per day for the subject.
  • the daily administration may be performed once or may be divided into several times. It may be administered every day or every few days or weeks.
  • the administration route of the anti-arteriosclerotic agent may be oral administration or parenteral administration, but generally, parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration, intraarterial administration and the like is preferable. Normally, systemic administration is preferable, but local administration may be performed in the vicinity of the atherosclerotic lesion.
  • the dosage form of the anti-arteriosclerotic agent is not particularly limited, and is formulated by appropriately mixing additives such as pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients and the like with the above active ingredients according to each administration route. be able to.
  • additives such as pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients and the like with the above active ingredients according to each administration route.
  • examples of the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids.
  • Formulation methods and usable additives are well known in the field of pharmaceutical formulations, and any method and additive can be used.
  • the present invention also provides a method for assisting the determination of the pathology of arteriosclerosis.
  • the first aspect of the method includes measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of the following gene group A and gene group B using a sample isolated from a subject.
  • Gene group A Ccl2 (UniGene Hs.303649, Refseq NM_002982.3) Cd14 (UniGene Hs.163867, Refseq NM_000591.3) Hspa1a (UniGene Hs.274402, Refseq NM_005345.5) Il1b (UniGene Hs.126256, Refseq NM_000576.2) Il1r1 (UniGene Hs.701982, Refseq NM_000877.2) Ptgs2 (UniGene Hs.196384, Refseq NM_000963.2) Tnfrsf1a (UniGene Hs.279594, Refseq NM_001065.3) Tlr5 (UniGene Hs.604542, Refseq NM_003268.5) Gene group B: Cebpb (UniGene Hs.719041, Refseq
  • pathological condition determination includes determination of the presence or absence of onset of arteriosclerosis, severity / exacerbation, reduction / improvement.
  • the subject is typically an arteriosclerosis patient.
  • the sample in the first embodiment is not particularly limited as long as it is a sample containing B cells, particularly B2 cells.
  • B cells particularly B2 cells.
  • peripheral blood is collected from a subject, and a mononuclear cell fraction is concentrated and isolated by conventional cell sorting using an appropriate surface marker. What is necessary is just to examine the expression of at least one of the genes.
  • Gene group A is a gene whose expression level was confirmed to be higher in individuals who developed arteriosclerosis than individuals whose onset was suppressed.
  • high expression of a gene belonging to gene group A it can be determined that the subject has developed arteriosclerosis or has deteriorated.
  • low expression of a gene belonging to gene group A it can be determined that the subject has not developed arteriosclerosis.
  • the expression level of the gene of gene group A is lower than the expression level of the same patient in the past, it can be determined that the arteriosclerosis of the patient has improved. .
  • Gene group B is a gene whose expression level was confirmed to be lower in individuals who developed arteriosclerosis than individuals whose onset was suppressed. When low expression of a gene belonging to gene group B is detected, it can be determined that the subject has developed arteriosclerosis or has deteriorated. Conversely, when high expression of genes belonging to gene group B is detected, it can be determined that the subject has not developed arteriosclerosis. Further, in an arteriosclerosis patient, when the expression level of the gene of gene group B is increased compared to the past expression level of the patient, it can be determined that the arteriosclerosis of the patient is improved. .
  • high expression means that the expression level is higher than the reference value of healthy persons (for example, the average expression level of each healthy person) determined based on the expression level of the healthy population, or the same subject. This means that the expression level is higher than the past expression level measurement value.
  • low expression means that an expression level is lower than a healthy subject reference value, or an expression level is low compared with the past measured expression level value of the same subject.
  • the measurement of gene expression includes measurement of mRNA expression level and protein expression level.
  • the mRNA expression level can be measured by a conventional method such as real-time PCR, microarray, or Northern blotting.
  • the protein expression level can be measured by a conventional method such as immunoassay.
  • the second aspect of the disease state determination method includes measuring an IgG3 level or a total IgG level in a serum sample separated from a subject.
  • serum IgG3 levels are high, in healthy individuals who do not have arteriosclerosis, and in individuals in which arteriosclerosis is suppressed by administration of anti-CD23 antibody, etc.
  • Serum IgG3 levels are low. This change in serum IgG3 level can also be regarded as a change in serum total IgG. Therefore, the pathology of arteriosclerosis can be determined based on the IgG3 level or total IgG level in the serum sample.
  • the measurement of the IgG3 level or the total IgG level in the serum sample may be either one or both.
  • the serum IgG3 level or the total IgG level When the serum IgG3 level or the total IgG level is high, it can be determined that the subject has developed arteriosclerosis or has worsened arteriosclerosis. In patients with arteriosclerosis, if the serum IgG3 level or total IgG level is lower than the patient's past serum IgG3 level or total IgG level, it is determined that the patient's arteriosclerosis has improved. can do.
  • the high value of the serum IgG3 level here means that the serum IgG3 level is higher than the healthy person reference value (for example, the average value of the serum IgG3 level of each healthy person) determined based on the serum IgG3 level of the healthy person population, Or it is higher than the past serum IgG3 level of the same subject.
  • the healthy person reference value for example, the average value of the serum IgG3 level of each healthy person
  • Serum IgG3 level and serum total IgG level can be measured by conventional methods such as immunoassay.
  • ELISA kits that can measure serum IgG3 or total serum IgG of various animals such as humans and mice are commercially available, and such commercially available products may be used.
  • Mouse ApoE knockout (KO) mouse is a known mouse (Lo Sasso et al., J Transl Med 2016, 14: 146, DOI 10.1186 / s12967-016-0901-1; Kapourchali et al. al., World J Clin Cases 2014 May 16, vol. 2, issue 5, p.126-132; Li et al., Protein Cell 2011, vol. 2, issue 3, p.189-201).
  • C57BL / 6J mice were purchased from Oriental Yeast (Tokyo, Japan). The number of mice per group used in each experiment was described as n in the description of the drawings. All mice used in the study survived the intended experimental period and only 5 week old male mice were used for the experiment. Mice had free access to standard food and tap water until needed for the experiment. All animal experiments were conducted in accordance with the guidelines for handling animals at Yokohama City University graduate School of Medicine.
  • mice were assigned to a control group or antibiotic treatment (AT) group.
  • AT antibiotic treatment
  • the mice in the AT group were treated with a broad spectrum antibiotic cocktail AVNM containing 0.5 g / L vancomycin, 1 g / L neomycin sulfate, 1 g / L metronidazole and 1 g / L ampicillin.
  • Antibiotic cocktails were added to the drinking water and given continuously over the experimental period from one week before the start of Western feed (Croswell et al., 2009; Rakoff-Nahoum et al., 2004; Wang et al., 2011) ).
  • Antibiotics were purchased from Sigma or Wako (Tokyo, Japan). Drinking water with antibiotics was changed every 3-4 days.
  • mice contain Western diet (WD; 21.22% [g / 100 g] lipids, 17.01% protein, 48.48% carbohydrates, and 0.15% cholesterol) after 1 week of antibiotic treatment; Oriental yeast ) And a standard chow diet (ND), respectively, and each feed was raised for 8 weeks.
  • WD Western diet
  • ND standard chow diet
  • Micro CT Prior to sacrifice, a micro CT scan was performed to assess visceral and subcutaneous fat. Mice were imaged under anesthesia using a biological micro X-ray CT system R_mCT2 (Rigaku Corporation, Tokyo, Japan) (scanning conditions: voltage 90 kV; current 160 ⁇ A; FOV 60 mm; scanning time 17 seconds). The volume of total visceral fat and total subcutaneous fat was traced. Quantitative measurement was performed using metabolic analysis software (Rigaku Corporation).
  • the lesion area was calculated using the Image J program (National Institutes of Health; http://rsb.info.nih.gov/ij). For plaque measurement, the lesion size was compared between groups using the section with the largest lesion area. Plaque area and total vessel area were measured and relative plaque extension was expressed as a percentage of total vessel area.
  • the single cell suspension was filtered through nylon mesh (100 ⁇ m, BD Biosciences), and fluorescent dye-labeled anti-mouse monoclonal anti-CD21 antibody (APC-labeled, Catalog No. 561770, BD Biosciences), anti-CD23 antibody (PE-labeled, Catalog No. 561773, BD Biosciences), anti-CD45R / B220 antibody (FITC label, Catalog No. 561877, BD Biosciences) or anti-CD45 antibody (FITC label, Catalog No. 561088, BD Biosciences), anti-F4 / 80 antibody (PE label) , Catalog No. 565410, BD Biosciences) and anti-CD3e antibody (APC-labeled, Catalog No.
  • FO B cells are B220 + CD21 + / lo CD23 + cells
  • MZ B cells are B220 + CD21 high CD23- / lo cells
  • transitional B cells are B220 + CD21 - CD23 - cells
  • B1 The cells were identified as B220 low CD23 ⁇ cells.
  • T cells were identified as CD45 + CD3e + F4 / 80 ⁇ cells and macrophages were identified as CD45 + F4 / 80 + CD3e ⁇ cells.
  • FO B cells and MZ B cells were selected from the parent gate so that the purity was higher than 99%.
  • RNA was isolated from pooled sorted cells using the RiboPure kit (Catalog No. AM1924, Life Technologies) or RNeasy Plus Micro kit (Catalog No. 74034, QIAGEN) according to the manufacturer's protocol. Released. 1 ⁇ g of RNA was reverse transcribed into cDNA using the High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Catalog No. 4387406, Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) class II expression levels by RT-PCR using SYBR-Green (Catalog No.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Relative mRNA expression levels were determined by the 2 [- ⁇ C (T)] method using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as a housekeeping gene.
  • the primers used were as follows: Mouse MHC-Class II (LeibundGut-Landmann et al., 2004): I-Aa forward, 5'-AAATTCCACCCCAGCTACCAAT-3 '(SEQ ID NO: 1); I-Aa reverse, 5'- GCTGACCCAGCAGCACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 2).
  • TLR Toll-like receptor
  • RT2 Profiler PCR array Catalog No. PAMM-018Z, Qiagen.
  • Total RNA from pooled sorted cells is used to synthesize single-stranded cDNA from 25 ng of total RNA using RT2 PreAMP cDNA synthesis kit and RT2 PreAMP Pathway Primer Mix (Catalog No. 330451; PBM-018Z, Qiagen) did.
  • the cDNA was mixed with RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix and RT-PCR was performed according to the manufacturer's instructions.
  • LDL-cholesterol kit (Catalog No. 30173000, Sekisui Medical, Tokyo, Japan)
  • HDL-cholesterol kit Catalog No. 30169000, Sekisui Medical Co., Ltd.
  • cholesterol kit Catalog No. 460-44301, Wako Pure Chemical Industries, Tokyo, Japan
  • triglyceride kit Catalog No.
  • LDL-cholesterol kits and HDL-cholesterol kits are reliable assay kits for LDL-C and HDL-C, and are certified by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and Cholesterol Reference Method Laboratory Network (CRMLN) certification programs.
  • CDC Centers for Disease Control and Prevention
  • CMLN Cholesterol Reference Method Laboratory Network
  • B2 cells were removed by intraperitoneal administration of 50 ⁇ g (100 ⁇ l of 0.5 ⁇ g / ⁇ l) one week before the start of feeding, followed by 50 ⁇ g intraperitoneally weekly during the induction of atherosclerosis (Coyle et al., 1996 Dasic et al., 1999). Saline was administered to the control group.
  • the rat anti-CD23 monoclonal antibody B3B4 used here has been reported to block IgE binding to CD23 in vitro and in vivo (Rao M, et al. 1987. J. Immunol. 138: 1845 Oshiba A, et al. 1997. J. Immunol. 159: 4056 .; Dasic G, et al. 1999. Eur. J. Immunol. 29: 2957).
  • Intestinal symbiotic microbiota accelerates the development of atherosclerosis
  • the intestinal symbiotic microbiota was removed by antibiotic treatment. Quantitative analysis of the entire biota by fecal culture and RT-PCR amplification of 16S rRNA gene sequences was not performed, but previous studies have shown that it is possible to deplete all symbiotic bacteria that can be detected by a broad spectrum antibiotic cocktail (AVNM).
  • AVNM broad spectrum antibiotic cocktail
  • Antibiotic treatment reduces atherosclerosis by eliminating the WD-induced increase in FO B cells.
  • B cells are known to be present in the spleen as well as in the adventitial membrane (Grabner et al. al., 2009; Hamze et al., 2013).
  • the role of intestinal microorganisms in the regulation of the immune system through metabolic-independent pathways has also been reported (Brown and Hazen, 2015; Drosos et al., 2015). Therefore, we hypothesized that the intestinal microbiota affects atherosclerosis through the activation of B2 cells, and in order to verify this, we first analyzed the B2 cell population in the spleen and PVAT.
  • adipocyte progenitor cells that differentiate into small adipocytes, thereby expanding the adipose tissue.
  • pathological expansion of adipose tissue is characterized by rapid growth of the fat pad via expansion of existing adipocytes.
  • Such pathological expansion is associated with chronic inflammation (Sun et al., 2011). Therefore, the metabolic disorder syndrome observed in WD fed mice and WD fed AT mice indicates the possibility of pathological adipose tissue expansion in these mice.
  • adipocytes in PVAT from WD-fed mice were larger in size, less organized, and loosely packed (p ⁇ 0.001; FIG. 2A-2B). However, as shown in FIGS.
  • PVAT B2 cells were examined by flow cytometry.
  • a representative flow cytometry plot is shown in FIG. 2D.
  • the proportion of activated FO B cells in PVAT was dramatically increased in WD fed mice compared to ND fed mice (p ⁇ 0.001).
  • the WD-induced increase in FO B cells has disappeared (p ⁇ 0.001), which is consistent with the above results.
  • B2 cells in the spleen which is the main reservoir of B cells, were also examined, there was no significant difference in spleen weight (Figure 6A), and WD feeding and antibiotic treatment changed the proportion of FO B cells in the spleen.
  • WD-AT mice showed a decrease in serum IgG3 levels compared to WD mice (p ⁇ 0.05; Fig. 2G). Furthermore, although not statistically significant, WD mice also tended to have higher serum IgG3 levels than ND mice.
  • MHC class II B2 cells molecules that mediate antigen presentation and represent another important function of activated B cells. As a result of flow cytometry analysis, there was no difference in the proportion of spleen FO B2 cells between WD group and WD-AT group (Fig. 2E), but as shown in Fig. 2H, spleen FO B2 cells in WD group The expression of MHC class II was significantly decreased by antibiotic treatment. Thus, these data suggest that intestinal microbiota-induced atherosclerosis is characterized by B2 cell activation.
  • Intestinal microbiota promotes B2 cell TLR signaling and activation of inflammatory gene expression during atherogenesis
  • B cells have variations in TLR expression patterns that may directly transmit signals from the microbiota .
  • signals from the microflora via TLRs may alter B cell responses such as antibody production, antigen presentation, and cytokine secretion (Nickerson et al., 2010; Pasare and Medzhitov, 2005; Rawlings et al ., 2012).
  • the foregoing results indicate that the antibody response disappears through removal of the intestinal microbiota in WD fed mice.
  • B2 cells were isolated from spleen and PVAT. Then, gene expression of TLR signaling was quantified. As expected, as a result of comparison between the WD group and the WD-AT group, it was revealed that there was a substantial difference in the gene expression profile (FIG. 3A and Tables 1 and 2). Although TLR expression was not affected (FIG. 5), the gene expression level of proinflammatory cytokines was elevated in PVAT-derived FO B2 cells of WD fed mice.
  • CD14 is a component of the innate immune system and, together with TLR2 and TLR4, acts as a co-receptor for the detection of bacterial lipopolysaccharide (LPS) (Heumann et al., 2001 ; Tasaka et al., 2003).
  • LPS bacterial lipopolysaccharide
  • chemokine ligand 2 (Ccl2), heat shock 70 kDa protein 1a (Hspa1a), interleukin 1 ⁇ (IL1 ⁇ ), interleukin 1 receptor type 1 (IIl1r1), prostaglandin endoperoxide synthase 2 (Ptgs2), and tumor necrosis Genes encoding inflammatory activation-related molecules including factor receptor superfamily member 1a (Tnfrsf1a) were also up-regulated.
  • Atherosclerosis induced by microbiota is attenuated by B cell depletion
  • Depletion of intestinal microbiota may affect the onset of atherosclerosis by reducing the number of activated B2 cells Therefore, we investigated whether B2 cell depletion provides protection against atherosclerosis induced by microbiota.
  • a cohort of WD fed mice was pretreated with anti-mouse CD23 antibody (purified rat anti-mouse CD23, BD Pharmingen, B3B4, isotype IgG2a) capable of depleting B cells.
  • Intraperitoneal administration of anti-CD23 antibody started one week before the onset of atherosclerosis. Saline was administered to mice in the control group.
  • Serum IgG levels and serum IgG3 levels increased only in WD-fed mice without antibody administration (FIGS. 4L-4M). These results confirmed that the induction of atherosclerosis by the microbiota requires help from the early B2 cells. Overall, these data indicate that the microbiota exacerbates atherosclerosis by stimulating activated B2 cell generation and shifting host responses to TH1-related immunity.
  • Circ Res 110 e1-12. Drosos, I., Tavridou, A., and Kolios, G. (2015) .New aspects on the metabolic role of intestinal microbiota in the development of atherosclerosis. Metabolism 64, 476-481. Edfeldt, K., Swedenborg, J., Hansson, GK, and Yan, Z.-q. (2002). Expression of Toll-Like Receptors in Human Atherosclerotic Lesions.A Possible Pathway for Plaque Activation 105, 1158-1161.
  • Avicenna Ibn Sina
  • Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels.FASEB J 27, 3437-3445.
  • B1a B Lymphocytes are Atheroprotective by Secreting Natural IgM That Increases IgM Deposits and Reduces Necrotic Cores in Atherosclerotic Lesions. Circulation Research 109, 830-840. Lammers, B., Zhao, Y., Foks, AC, Hildebrand, RB, Kuiper, J., Van Berkel, TJ, and Van Eck, M. (2012). Leukocyte ABCA1 remains atheroprotective in splenectomized LDL receptor knockout mice.
  • TLR9 Regulates TLR7- and MyD88-Dependent Autoantibody Production and Disease in a Murine Model of Lupus.
  • Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bari, xE, ty, J., and Hansson, GK (1998) .Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. The Journal of Clinical Investigation 102, 910 -918.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

動脈硬化病変の発生を抑制し、動脈硬化症を治療できる新規な手段が開示されている。本発明による抗動脈硬化剤は、B2細胞を選択的に抑制する物質を有効成分とする。B2細胞を選択的に抑制する物質は、例えば抗CD23抗体である。本発明による動脈硬化の病態の判定を補助する方法の第１の態様では、被検者から分離された試料を用いて、特定の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することを含む。該方法の第２の態様では、被検者から分離された血清試料中のIgG3レベル又は総IgGレベルを測定することを含む。

Description

抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法
　本発明は、抗動脈硬化剤、及び動脈硬化の病態判定方法に関する。
　動脈硬化症は生活習慣病の終末像である。糖尿病、高血圧、脂質異常、慢性腎臓病、喫煙といったリスクファクター（非特許文献１）を制御することで、本症の発症の確度を制御するか、急性のカタストロフ的な病状(心筋梗塞症、脳梗塞、重症下肢虚血)を呈した場合には、医療資源（消防救急システム、急性期血管内治療を施行できる設備と人材を備えた急性期病院）を最大限の活用し、救命する以外に制圧の方法はない。リスク制御による戦略は、確実性に乏しく、臨床試験でも、集団を対象にした試験による、相対的なリスク低下をもって有効性を判断する以外にない。
　本症の成因には、生活習慣病による高リスク状態とともに、炎症・免疫応答に由来する病態が考えられている。本願発明者らも、これまでに、IL-5等の分子に対する血清中自己抗体が動脈硬化症に関与していることを報告している（非特許文献２、特許文献１）。しかしながら、動脈硬化症の成因に働きかける積極的な治療手段は未だ開発されていない。
　特許文献２には、抗CD20抗体によりB細胞を枯渇させてアテローム性動脈硬化を治療ないし予防するという発明が開示されている。CD20は、末梢血またはリンパ器官のＢ細胞の９０％超の表面に見出される３５kDaの非グリコシル化リンタンパク質であり、初期プレB細胞の発生の間に発現され、形質細胞の分化まで存続する（特許文献２）。つまり、抗CD20抗体を投与した場合、B細胞全般がターゲットとなり、それらの細胞数が低減することが想定される。
国際公開第2012/067165号公報 特表2012-514587号公報
Anderson KM. et al., Am Heart J, 1991;121:293-8 Ishigami T. et al., FASEB J, 2013;27:3437-3445
　本発明は、動脈硬化病変の発生を抑制し、動脈硬化症を治療できる新規な手段を提供することを目的とする。
　本願発明者らは、マウス動脈硬化発症モデルを用いて鋭意研究した結果、腸管共生微生物叢がB2細胞におけるTLRシグナル伝達経路の活性化を介して動脈硬化を促進すること、抗CD23抗体を用いてマウス体内のB2細胞を枯渇させると動脈硬化の発症が抑制されることを見出すとともに、特定の遺伝子の発現量又は血清IgG3レベル若しくは血清総IgGレベルを指標として動脈硬化の発症や増悪・改善等を判定し得ることを見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、B2細胞を選択的に抑制する物質を有効成分とする、抗動脈硬化剤を提供する。
　また、本発明は、被検者から分離された試料を用いて、以下の遺伝子群A及び遺伝子群Bからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することを含む、動脈硬化の病態の判定を補助する方法を提供する。
遺伝子群A：
Ccl2、Cd14、Hspa1a、Il1b、Il1r1、Ptgs2、Tnfrsf1a、Tlr5
遺伝子群B：
Cebpb、Fos、Jun、Nfkbib、Chuk、Ikbkb、Irf1、Mapk8、Mapk8ip3、Mapk9、Tollip、Tradd
　さらに、本発明は、被検者から分離された血清試料中のIgG3レベル又は総IgGレベルを測定することを含む、動脈硬化の病態の判定を補助する方法を提供する。
　本発明により、動脈硬化症そのものを治療できる手段が提供された。生活習慣病は動脈硬化症のリスクであるが原因ではなく、生活習慣病を改善しても動脈硬化それ自体を治療できるわけではない。血管内治療は、動脈硬化症の結果である急性の血栓症に対する対症療法に過ぎない。B2細胞を標的にした本発明による抗動脈硬化剤は、本症の成因を制御することで動脈硬化の発症や進行、悪化を抑制するものであり、従来治療と根本的に異なる治療法であり、健康寿命の延長に大いに貢献できる。動脈硬化の発症においては脂質代謝に非依存のメカニズムでB2細胞が活性化されており、B2細胞の活性化を抑制した場合には、血清脂質値が上昇し内臓・皮下脂肪も多い状態でも動脈硬化症を抑制することができる。従って、本発明の抗動脈硬化剤によれば、動脈硬化症患者に課せられる厳しい脂質制限を緩和できる可能性がある。また、本発明の病態判定方法によれば、患者の動脈硬化の状態を適切に把握できるほか、抗動脈硬化剤の治療効果のモニタリングや、抗動脈硬化剤候補物質の治療効果の判定も可能となり、さらなる動脈硬化治療手段等の開発にも貢献できる。
抗生物質処置したマウスが飼料誘導性のアテローム性動脈硬化に対して抵抗性であることを示すデータである。マウスには抗生物質処置ありで又はなしでウェスタン飼料又は標準的な固形飼料を8週間給与した。(A)各マウス群の体重である。AT: 抗生物質処置; WD: ウェスタン飼料; ND: 標準固形飼料。3回の独立した実験からプールしたデータである（平均値±標準誤差、各群n=7）。(B-D) 脂肪の代表的なマイクロCT画像(B)、内臓脂肪体積の割合(C)、皮下脂肪体積の割合(D)を示す。データは独立した3回の実験の平均値±標準誤差である。各群n=7。事後ANOVA統計解析で*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。(E-H) 総コレステロール(E)、LDLコレステロール (F)、HDLコレステロール(G)、及びトリグリセライド(H)の血清値を調べた。LDL: 低密度リポタンパク質; HDL: 高密度リポタンパク質。結果は平均値±標準誤差で示す。各群n=7。*p<0.05, **p<0.001。(I, J) 大動脈病変サイズをオイルレッドO染色(I)及びHE染色(J)で調べた。正面向きで調製された大動脈のオイルレッドO染色の代表的な画像及び定量結果をIに示す（大動脈表面積に対するパーセンテージ、各群n=12）。HE染色で測定した大動脈根切片内の最大病変面積の代表的な画像及び定量結果をJに示す（各群n=12）。スケールバーは100μm。3回の独立した実験からプールしたデータである。WDと他の群をANOVAで比較して*p<0.05, **p=0.001。 抗生物質処置はB2細胞増殖をブロックすることによりアテローム性動脈硬化を制御することを示すデータである。ウェスタン飼料（WD）又は標準固形飼料（ND）の8週間給与の終了時点で、血管周囲脂肪組織（PVAT）拡大の典型的特徴およびCD23陽性細胞の蓄積に抗生物質処置（AT）が及ぼす効果をA～Cに示す。(A) 脂肪細胞直径の平均値をPVAT切片で定量した。1画像につき少なくとも250個の脂肪細胞の表面積を計測し、PVAT当たり7画像の合計をImageJソフトウェアで解析した。データはn=7の実験からの平均値±標準誤差を表す。1元配置ANOVA及びTukeyの補正で*p<0.001。(B及びC) PVAT切片のCD23陽性染色の代表的画像(B)及び定量結果(C)である。スケールバーは50μm。値は平均値±標準誤差を表す。WDと他の群をANOVAで比較して*p<0.001。(D及びE) PVATの濾胞性(FO)B細胞、並びに脾臓のFO B細胞と辺縁帯(MZ)B細胞のフローサイトメトリー解析結果をそれぞれ示す。各群マウスはn=6。3回の独立した実験からプールしたマウス14匹に由来するデータである。細胞数は平均値±標準誤差で表した。*p<0.01, **p<0.001。(F及びG) 総IgG(F)、IgG3(G)の濃度をELISAで測定した。値は平均値±標準誤差で表した。3回の独立した実験より各群n=6。Tukeyの事後検定で*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。(H) WD群及びWD-AT群の脾臓消化物より精製しセルソーティングしたB220+CD21+/loCD23+ (FO B細胞)及びB220+CD21highCD23-/lo (MZ B細胞)でMHCクラスIIのRNA発現をリアルタイムPCRにより解析し、GAPDHに対してノーマライズした結果である。2△Ctの相対発現量（fold change）を平均値±標準誤差で表した。*p<0.05。各群n = 7。 WD給与及びAT後のB2細胞中のTLRシグナル伝達経路に関連する遺伝子発現プロファイルを表すヒートマップである。PVAT及び脾臓由来のソート済みFO B細胞のmRNA調製物をマウストール様受容体シグナル伝達経路RT2 Profiler PCRアレイで解析した。TLRシグナル伝達経路との関連が報告されている遺伝子のFO B2細胞での発現を各群間で比較した。 WD給与及びAT後のB2細胞中のTLRシグナル伝達経路に関連する遺伝子発現プロファイルを表すヒートマップである。脾臓由来のソート済みMZ B細胞のmRNA調製物をマウストール様受容体シグナル伝達経路RT2 Profiler PCRアレイで解析した。TLRシグナル伝達経路との関連が報告されている遺伝子のMZ B2細胞での発現を各群間で比較した。 B2細胞の薬理学的枯渇はマウスをアテローム性動脈硬化から防御することを示すデータである。(A及びB) マウス特異的CD23抗体又は生理食塩水を投与したマウスのPVAT (A)及び脾臓(B)中のB2細胞数の代表的なフローサイトメトリープロットである（各群n=6）。(C) マウス特異的CD23抗体又は生理食塩水を投与したマウスについて、ウェスタン飼料8週間給与の終了時点で測定した体重である。値はn=6の実験からの平均値±標準誤差。(D及びE) 内臓脂肪体積(D)及び皮下脂肪体積(E)の割合をマイクロCTで調べた結果である。データは平均値±標準誤差。各群n=6。(F-I) 総コレステロール(F)、LDLコレステロール(G)、HDLコレステロール(H)及びトリグリセライド(I)の血清値を測定した。結果は平均値±標準誤差。各群n=6。(J及びK) 高マウスCD23抗体がプラーク形成に及ぼす効果をJ～Kに示す。(J) 正面向きで調製したオイルレッドO染色の代表的画像及び定量結果である。(K) 大動脈根切片のHE染色の代表的画像及び最大病変面積の定量結果である。n=6の実験からのデータ（平均値±標準誤差）。スケールバーは100μm。一元配置ANOVA及びTukeyの補正で*p<0.05, **p<0.001。(L及びM) マウス特異的CD23抗体又は生理食塩水を投与したマウスの血清中の総IgG (L) 及びIgG3 (M) の濃度である。値はn=6の実験の平均値±標準誤差。一元配置ANOVA及びTukeyの補正で*p<0.05, **p<0.01。 WD給与及び抗生物質処置を受けたC57BL/6J野生型マウスの特徴。(A) 各マウス群の体重の平均値±標準誤差。有意差は一元配置ANOVAで計算した。**p<0.001。各群n=5。(B) 脾臓重量を体重に対する割合（％）で示した。結果は平均値±標準偏差で表す。各群n=5。(C及びD) マイクロCTで調べた内臓脂肪量(C)及び皮下脂肪量(D)の割合である。各群n=5。事後ANOVA解析で*p<0.05, **p<0.001。(E-H) 総コレステロール(E)、LDLコレステロール(F)、HDLコレステロール(G)及びトリグリセライド(H) の血清値である。各群n=5。*p<0.01, **p<0.001。 各群の脾臓の典型的特徴。(A) 実験終了時に測定した脾臓の重量である。データは体重に対する割合で示した。(B及びC) 脾臓切片をHEで染色し(B)、胚中心の数を調べた(C)。スケールバーは300μm。統計学的有意性は一元配置ANOVAで算出した。*p<0.05.。各群n=7。 C57BL/6J野生型マウスのPVAT及び脾臓中のB2細胞数に抗生物質処置が及ぼす効果。(A)はPVATのFO B細胞のフローサイトメトリーの結果であり、(B)は脾臓のFO B細胞及びMZ B細胞のフローサイトメトリーの結果である。各群n=5。グラフは細胞数である（平均値±標準誤差）。*p<0.05、**p<0.01。 抗マウスCD23抗体が脾臓中のT細胞数及びマクロファージ数に及ぼす効果。(A及びB) 生理食塩水又はマウス特異的CD23抗体を投与したマウスの脾臓中のT細胞及びマクロファージの総数である。(A)は代表的なフローサイトメトリープロット、(B)は群のデータである。数値はn=6の実験からの平均値±標準誤差である。
　本発明の抗動脈硬化剤は、B2細胞を選択的に抑制する物質を有効成分とする。B2細胞の抑制という語には、B2細胞の活性化の抑制、例えば検出可能なB2細胞数の低減が包含される。B2細胞を選択的に抑制する物質とは、B2細胞を抑制し、かつ、B1細胞及びその他のB細胞のサブセットを抑制しない物質である。例えば、ある物質を全身投与した生体において、脾臓中のB1細胞数が非投与の脾臓中B1細胞数の６５％以上（例えば７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％、又は９０％以上）に維持され、かつ、脾臓中のB2細胞数が非投与の脾臓中B2細胞数の２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、７％未満、又は５％未満）に低減した場合、その物質は「B2細胞を選択的に抑制する物質」に該当する。下記実施例に具体的に示される通り、B2細胞を選択的に抑制することにより、動脈硬化症を治療することができる。動脈硬化症の治療という語には、動脈硬化病変の進行・重症化の抑制、新たな動脈硬化病変の発生の抑制が包含される。
　ある物質がB2細胞を抑制する作用を有するか否かは、例えば、末梢血試料を当該物質で処理し、フローサイトメトリー法によりB2細胞数を測定し、当該物質で処理していないコントロールの末梢血試料中のB2細胞数と比較することにより調べることができる。
　B2細胞を選択的に抑制する物質の典型例として、抗CD23抗体を挙げることができる。低親和性IgE受容体であるCD23は、B細胞の中でもB2細胞に特異性の高い表面抗原であり、抗CD23抗体を用いれば生体内のB2細胞を選択的に抑制することができる。
　抗CD23抗体は各種のものが知られており、市販もされている。ヒトに投与可能な抗ヒトCD23モノクローナル抗体も既に公知である（例えば、WO98/37099）。また、ヒトをはじめとする各種動物のCD23のアミノ酸配列及びそれをコードするcDNAの配列が知られており、データベースにも登録されているので、常法により抗CD23抗体を作出することも可能である。例えば、ヒトCD23は、NCBIのGenBankにNM_002002などのaccession番号で登録されている。配列表の配列番号３、４に記載した配列は、NM_002002.4で登録されているヒトCD23の配列である。
　抗ヒトCD23モノクローナル抗体をハイブリドーマ法により製造する場合には、例えば、ヒトCD23タンパク質又はその適当な断片（細胞外領域、例えばヒトCD23のaa48-321）を免疫原として用いて非ヒト動物に免疫し、該動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、CD23タンパク質と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすればよい。スクリーニングにより選択したハイブリドーマを増殖させ、培養上清から抗ヒトCD23モノクローナル抗体を得ることができる。
　ヒト用の医薬として抗CD23抗体を用いる場合、ヒト型キメラ抗体（典型的には、げっ歯類や霊長類とヒトとのキメラ抗体）、ヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域をヒト抗体の相当する領域に移植したもの）、又はヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）のように、ヒトに対する免疫原性を低減した抗体が好ましい。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法も周知の方法として確立している。
　抗CD23抗体には、中和活性（neutralising, blocking, 又はinhibiting）、ADCC活性、CDC活性などの種々の活性を有する抗体が包含される。本発明では、B2細胞を抑制できる限り、抗CD23抗体はいずれの活性を有していても良い。
　本発明において、動脈硬化とは、典型的にはアテローム性動脈硬化である。
　本発明の抗動脈硬化剤の投与対象には、種々の哺乳動物が包含されるが、典型的にはヒトである。本発明の抗動脈硬化剤は、動脈硬化症を有する患者、典型的にはヒト患者に対して好ましく投与することができる。
　抗動脈硬化剤の投与量は、動脈硬化症を治療できる量であればよく、投与対象の年齢、体重、重症度等に応じて適宜選択できる。特に限定されないが、投与量は、対象に対し１日当たりの有効成分量として1.5μg/kg体重～1.5g/kg体重程度、例えば10μg/kg体重～100mg/kg体重程度であり得る。１日の投与は１回でもよいし、数回に分けて投与しても良い。毎日投与してもよいし、又は数日、数週おきに投与してもよい。
　抗動脈硬化剤の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、一般には筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。通常は全身投与が好ましいが、動脈硬化病変部近傍に局所投与してもよい。
　抗動脈硬化剤の剤形は特に限定されず、各投与経路に応じて、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を上記の有効成分と適宜混合させて製剤することができる。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。
　また、本発明は、動脈硬化の病態の判定を補助する方法も提供する。該方法の第１の態様では、被検者から分離された試料を用いて、以下の遺伝子群A及び遺伝子群Bからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することを含む。
遺伝子群A：
Ccl2（UniGene Hs.303649, Refseq NM_002982.3）
Cd14（UniGene Hs.163867, Refseq NM_000591.3）
Hspa1a（UniGene Hs.274402, Refseq NM_005345.5）
Il1b（UniGene Hs.126256, Refseq NM_000576.2）
Il1r1（UniGene Hs.701982, Refseq NM_000877.2）
Ptgs2（UniGene Hs.196384, Refseq NM_000963.2）
Tnfrsf1a（UniGene Hs.279594, Refseq NM_001065.3）
Tlr5（UniGene Hs.604542, Refseq NM_003268.5）
遺伝子群B：
Cebpb（UniGene Hs.719041, Refseq NM_005194.3）
Fos（UniGene Hs.25647, Refseq NM_005252.3）
Jun（UniGene Hs.696684, Refseq NM_002228.3）
Nfkbib（UniGene Hs.9731, Refseq NM_002503.4）
Chuk（UniGene Hs.198998, Refseq NM_001278.3）
Ikbkb（UniGene Hs.597664, Refseq NM_001556.2）
Irf1（UniGene Hs.436061, Refseq NM_002198.2）
Mapk8（UniGene Hs.138211, Refseq NM_002750.2）
Mapk8ip3（UniGene Hs.207763, Refseq NM_015133.3）
Mapk9（UniGene Hs.484371, Refseq NM_002752.4）
Tollip（UniGene Hs.368527, Refseq NM_019009.3）
Tradd（UniGene Hs.460996, Refseq NM_003789.3）
　本発明において、病態の判定という語には、動脈硬化症の発症の有無、重症化・増悪、軽減・改善の判定が包含される。
　本発明において、被検者は、典型的には動脈硬化症患者である。
　第１の態様における試料は、B細胞、特にB2細胞を含む試料であれば特に限定されない。例えば、被検者より末梢血を採取し、適当な表面マーカーを用いて常法のセルソーティングにより単核球細胞分画を濃縮・単離し、この細胞分画について、上記した遺伝子群のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現を調べればよい。
　遺伝子群Aは、動脈硬化を発症した個体において、発症が抑制された個体と比較して発現量が高いことが確認された遺伝子である。遺伝子群Aに属する遺伝子の高発現が検出された場合、当該被検者は動脈硬化症を発症している、又は動脈硬化症が悪化していると判定することができる。逆に、遺伝子群Aに属する遺伝子の低発現が検出された場合、当該被検者は動脈硬化症を発症していないと判定することができる。また、動脈硬化症患者において、遺伝子群Aの遺伝子の発現量が過去の同患者の発現量と比べて低下した場合には、当該患者の動脈硬化症が改善していると判定することができる。
　遺伝子群Bは、動脈硬化を発症した個体において、発症が抑制された個体と比較して発現量が低いことが確認された遺伝子である。遺伝子群Bに属する遺伝子の低発現が検出された場合、当該被検者は動脈硬化症を発症している、又は動脈硬化症が悪化していると判定することができる。逆に、遺伝子群Bに属する遺伝子の高発現が検出された場合、当該被検者は動脈硬化症を発症していないと判定することができる。また、動脈硬化症患者において、遺伝子群Bの遺伝子の発現量が同患者の過去の発現量と比べて上昇した場合には、当該患者の動脈硬化症が改善していると判定することができる。
　ここでいう高発現とは、健常者集団の発現量に基づき定められた健常者参照値（例えば、各健常者の発現量の平均値）よりも発現量が高いこと、又は、同じ被検者の過去の発現量測定値と比較して発現量が高いことをいう。また、低発現とは、健常者参照値よりも発現量が低いこと、又は、同じ被検者の過去の発現量測定値と比較して発現量が低いことをいう。
　遺伝子発現の測定には、mRNA発現量の測定とタンパク質発現量の測定が包含される。mRNA発現量は、リアルタイムPCR、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の常法により測定できる。タンパク質発現量は、免疫測定等の常法により測定できる。
　病態判定方法の第２の態様では、被検者から分離された血清試料中のIgG3レベル又は総IgGレベルを測定することを含む。下記実施例に示される通り、動脈硬化を発症している個体群では血清IgG3レベルが高く、動脈硬化を有しない健常個体群、及び抗CD23抗体の投与等により動脈硬化が抑制された個体群では、血清IgG3レベルが低い。この血清IgG3レベルの変動は、血清総IgGの変動としてとらえることもできる。従って、血清試料中のIgG3レベル又は総IgGレベルに基づいて動脈硬化の病態を判定することができる。血清試料中のIgG3レベル又は総IgGレベルの測定は、いずれか一方のみの測定でも良いし、両者を測定してもよい。
　血清IgG3レベル又は総IgGレベルが高値の場合、該被検者は動脈硬化を発症している、又は動脈硬化が悪化していると判定することができる。また、動脈硬化症患者において、血清IgG3レベル又は総IgGレベルが同患者の過去の血清IgG3レベル又は総IgGレベルと比べて低下した場合には、当該患者の動脈硬化症が改善していると判定することができる。
　ここでいう血清IgG3レベルの高値とは、健常者集団の血清IgG3レベルに基づき定められた健常者参照値（例えば、各健常者の血清IgG3レベルの平均値）よりも血清IgG3レベルが高いこと、又は、同じ被検者の過去の血清IgG3レベルよりも高いことをいう。血清総IgGレベルの高値という語も同様である。
　血清IgG3レベルや血清総IgGレベルは、免疫測定等の常法により測定できる。ヒトやマウス等の各種動物の血清IgG3又は血清総IgGを測定できるELISAキット等が市販されており、そのような市販品を用いてよい。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜材料及び方法＞
マウス
　ApoEノックアウト(KO)マウスは、C57BL/6J系統をバックグラウンドとする公知のマウス（Lo Sasso et al., J Transl Med 2016, 14:146, DOI 10.1186/s12967-016-0901-1; Kapourchali et al., World J Clin Cases 2014 May 16, vol. 2, issue 5, p.126-132; Li et al., Protein Cell 2011, vol. 2, issue 3, p.189-201）を用いた。C57BL/6Jマウスはオリエンタル酵母（日本国東京）から購入した。各実験で用いた１群当たりのマウス頭数は図面の説明中にｎとして記載した。研究に用いた全てのマウスは意図した実験期間生存し、５週齢の雄マウスのみを実験に用いた。実験に必要になるまで、マウスには標準的な飼料と水道水を自由に摂取させた。全ての動物実験は横浜市立大学大学院医学研究科の動物取扱いガイドラインに従って実施した。
共生細菌の除去
　微生物叢の役割は、マウスを抗生物質で処置して調べた。実験のため、５週齢の雄のApoE KOマウスをコントロール群又は抗生物質処置（AT）群に割り当てた。AT群のマウスは、0.5 g/Lバンコマイシン、1 g/L硫酸ネオマイシン、1 g/Lメトロニダゾール及び1 g/Lアンピシリンを含む広域スペクトル抗生物質カクテルAVNMで処置した。抗生物質カクテルは飲水に添加し、ウェスタン飼料の給与開始の１週間前から実験期間にわたって継続して与えた（Croswell et al., 2009; Rakoff-Nahoum et al., 2004; Wang et al., 2011）。抗生物質はシグマ又は和光（日本国東京）から購入した。抗生物質を添加した飲水は３～４日ごとに交換した。
アテローム性動脈硬化の積極的誘導
　マウスには抗生物質処置の１週間後にウェスタン飼料（WD; 21.22% [g/100 g]脂質、17.01%タンパク質、48.48%炭水化物、及び0.15%コレステロールを含む; オリエンタル酵母）及び標準的な固形飼料（ND）をそれぞれ与え、各飼料で８週間飼育した。
マイクロCT
　屠殺前にマイクロCTスキャンを実施し、内臓脂肪及び皮下脂肪を評価した。生体マイクロX線CTシステムR_mCT2（株式会社リガク、日本国東京）を用いてマウスを麻酔下で撮像した（スキャン条件：電圧90 kV; 電流160 μA; FOV 60 mm; 走査時間17 秒）。全内臓脂肪及び全皮下脂肪の体積をトレースした。定量的測定は代謝解析ソフトウェア（株式会社リガク）を用いて実施した。
アテローム性動脈硬化の定量及び組織学的解析
　ウェスタン飼料を８週間給与した後、心臓及び大動脈を摘出し、大動脈根の横断面解析及び大動脈全体の正面像解析によりアテローム硬化病変を定量した。心臓はパラフィン包埋し、３つの大動脈弁尖の始端から上行大動脈まで5μm厚の連続切片を切り出し、ヘマトキシリン－エオシン（H&E）染色した。その後、大動脈を１０％ホルマリンで固定し、長軸方向に展開し、オイルレッドO溶液（シグマ－アルドリッチ、米国）で脂質沈着を染色した。Image Jプログラム (米国国立衛生研究所; http://rsb.info.nih.gov/ij)を用いて病変部面積を算出した。プラークの測定のため、病変面積が最大となった切片を用いて群間で病変サイズを比較した。プラーク面積及び総血管面積を測定し、相対プラーク伸展を総血管面積の百分率で表した。
組織学的・免疫組織化学的解析
　新鮮分離した脾臓の重量を測定し、撮像後、ホルマリン固定とパラフィン包埋を行ない5μm厚で切り出した。脾臓の構造はH&E染色後に評価した。胚中心の数はImage Jソフトウェアを用いて評価した。血管周囲の脂肪組織（PVAT）からの組織サンプルは、標準的な手順に従いプロセシングとパラフィン包埋を行なった。5μm厚切片をH&E又はCD23抗体（Product code: ab185807、アブカム、米国）で染色した。H&E染色スライド上の脂肪細胞面積の測定にはImage Jソフトウェアを使用し、マウス1匹につき異なる組織切片2枚を定量した（各画像において、少なくともマウス3匹、少なくとも脂肪細胞100個）。さらに、B2細胞に特異的なCD23抗体を用いてPVAT中のB2細胞を染色した。Image Jソフトウェアを使用し、CD23陽性フィールドの百分率面積を盲検化して評価した。
フローサイトメトリー及びセルソーティングのための組織の調製
　脾細胞及びPVAT細胞を採取し、フローサイトメトリー用にプロセシングした。簡潔には、カプセルをニッキングすることにより脾臓から細胞を放出させ、２つの顕微鏡スライドを穏やかに回転させた。赤血球溶解バッファー（Product No. R7757、Sigma）でインキュベートすることにより、残りの赤血球を除去した。一方、完全PVAT細胞は倍率4倍の視野で大動脈から分離し、4型コラゲナーゼ（0.5 mg/ml）（Catalog No. LS004186, Worthington Biochemicals）で30分間、37℃で消化し、次いで総PVAT細胞を回収した。単一細胞懸濁液をナイロンメッシュ（100 μm, BD Biosciences）で濾過し、蛍光色素標識抗マウスモノクローナル抗CD21抗体 (APC標識, Catalog No. 561770, BD Biosciences)、抗CD23抗体 (PE標識, Catalog No. 561773, BD Biosciences)、抗CD45R/B220抗体 (FITC標識, Catalog No. 561877, BD Biosciences) 又は抗CD45抗体 (FITC標識, Catalog No. 561088, BD Biosciences)、抗F4/80抗体 (PE標識, Catalog No. 565410, BD Biosciences)、抗CD3e抗体 (APC標識, Catalog No. 557306, BD Biosciences) のいずれかの混合物で氷上30分間染色した。次いで、固定可能な生存率解析用試薬である4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI, Catalog No. P4864, Sigma) をフローサイトメトリー染色バッファー（Catalog No. 00-4222-57, eBioscience）で希釈した溶液中に細胞を懸濁した。フローサイトメトリー解析はMoFlo Astrios (Beckman Coulter)にて実施し、得られた結果はソフトウェアver. 6.2.3で解析した。死細胞はFSC, SSC, 及びDAPI染色により除外した。異なるB細胞集団、T細胞、及びマクロファージは、それぞれの細胞表面抗原の発現によって同定した。具体的には、FO B細胞はB220+CD21+/loCD23+細胞として、MZ B細胞はB220+CD21highCD23-/lo細胞として、移行期B細胞はB220+CD21-CD23-細胞として、B1細胞はB220lowCD23-細胞として同定した。T細胞はCD45+CD3e+F4/80-細胞として、マクロファージはCD45+F4/80+ CD3e-細胞として同定した。セルソーティング実験のため、FO B細胞及びMZ B細胞を純度が99％より高くなるように親ゲートから選別した。
リアルタイムPCR（RT-PCR）解析
　プールした選別細胞より、RiboPureキット (Catalog No. AM1924, Life Technologies) 又はRNeasy Plus Microキット (Catalog No. 74034, QIAGEN) を製造者のプロトコールに従い用いて全RNAを単離した。High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Catalog No. 4387406, Applied Biosystems) を製造者のプロトコールに従い用いて1 μgのRNAをcDNAに逆転写した。製造者の推奨する条件に従い、SYBR-Green (Catalog No. 4309155, Applied Biosystems)及びABI 7500 RT-PCR装置を用いたRT-PCRにより、主要組織適合複合体（MHC）クラスIIの発現レベルを解析した。相対mRNA発現レベルは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)をハウスキーピング遺伝子として使用し、2[－ΔΔC (T)]法により決定した。使用したプライマーは次の通り: マウスMHC-クラスII (LeibundGut-Landmann et al., 2004): I-Aa forward, 5’-AAATTCCACCCCAGCTACCAAT-3’（配列番号１）; I-Aa reverse, 5’-GCTGACCCAGCAGCACAG-3’（配列番号２）。トール様受容体(TLR) シグナル伝達遺伝子の解析のため、マウスTLRシグナル伝達経路RT2 Profiler PCRアレイ (Catalog No. PAMM-018Z, Qiagen) を用いて、TLRシグナリングに関わる84遺伝子の発現をプロファイリングした。プールした選別細胞からの全RNAを使用し、RT2 PreAMP cDNA synthesis kit及びRT2 PreAMP Pathway Primer Mix (Catalog No. 330451; PBM-018Z, Qiagen)を用いて25 ngの全RNAから一本鎖cDNAを合成した。cDNAをRT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermixと混合し、製造者の指示書に従いRT-PCRを実施した。温度サイクリング及び蛍光検出は、ABI 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用いて行なった。データの定量はオンラインのソフトウェアRT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5 (Qiagen, http:// pcrdataanalysis. Sabiosciences. Com/pcr/arrayanalysis.php?target=upload)を用いて行なった。Ct値<35のみを含めて計算を行い、ハウスキーピング遺伝子であるβ2ミクログロブリン（β2M）及びGAPDHの平均発現量に対して遺伝子発現を相対評価した。β2M及びGAPDHは、使用したアレイに搭載された５つのハウスキーピング遺伝子のうちで最も安定的であったために採用した。目的の転写物はlog2 fold change及び平均発現量として表し、TLR制御転写物の発現はヒートマップとして群間で比較した。
血清パラメータの定量
　マウスの屠殺時に右心室穿刺により全血を採取した。総コレステロール、低密度リポタンパクコレステロール(LDL-C)、高密度リポタンパクコレステロール (HDL-C) 及びトリグリセライドはSRLに委託し、LDL-コレステロールキット（Catalog No. 30173000, 積水メディカル株式会社、日本国東京）、HDL-コレステロールキット（Catalog No. 30169000, 積水メディカル株式会社）、コレステロールキット（Catalog No. 460-44301, 和光純薬工業、日本国東京）及びトリグリセライドキット（Catalog No. 464-44201, 和光純薬工業）を用いて測定した（Hashimoto et al., 2006; Hosoi et al., 2010; Irie et al., 2015）。上記のLDL-コレステロールキット及びHDL-コレステロールキットは、LDL-C及びHDL-Cの信頼できるアッセイキットであり、疾病予防管理センター（CDC）及びCholesterol Reference Method Laboratory Network (CRMLN)の認証プログラムで認証されている。免疫グロブリン測定：血清総IgG及びIgG3は、マウスIgG ELISAキット（Bethyl Laboratories, E99-131）及びマウスIgG3 ELISAキット（Bethyl Laboratories, E99-111）を製造者の指示書に従い用いて希釈血清で測定した。データはアイソタイプスタンダードの標準曲線に基づきμg/mLで表した。
抗体処置によるB2細胞の除去
　アテローム発生進展における共生微生物特異的なB2細胞サブセット活性化の関与を調べるため、抗CD23中和抗体（精製ラット抗マウスCD23, BD Pharmingen, B3B4, アイソタイプIgG2a）をウェスタン飼料の給与開始の1週間前に50μg（0.5μg/μlを100μl）腹腔内投与、次いでアテローム性動脈硬化の誘導期間中に毎週50μg腹腔内投与し、B2細胞を除去した（Coyle et al., 1996; Dasic et al., 1999）。コントロール群には生理食塩水を投与した。なお、ここで使用したラット抗CD23モノクローナル抗体B3B4については、IgEのCD23への結合をビトロ及びビボでブロックすることが報告されている（Rao M, et al. 1987. J. Immunol. 138:1845.; Oshiba A, et al. 1997. J. Immunol. 159:4056.; Dasic G, et al. 1999. Eur. J. Immunol. 29:2957）。
統計解析
　統計解析にはSPSS 22ソフトウェアプログラムを用いた。適当な検定を用いてP<0.05の時に群間に統計学的な有意差ありとした。値が正規分布に従う場合は1元配置ANOVAの後にTukeyの事後検定を行い、値が正規分布に従わない場合はノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定を行なった。
＜結果＞
腸管共生微生物叢はアテローム性動脈硬化の発症を促進する
　腸管共生微生物叢がアテローム性動脈硬化に及ぼす影響を調べるため、抗生物質処置により腸管共生微生物叢を除去した。糞便培養や16S rRNA遺伝子配列のRT-PCR増幅による全生物相の定量解析は実施しなかったが、広域スペクトル抗生物質カクテル（AVNM）により検出可能な共生細菌の全てを枯渇できることが過去の研究で示されており（Rakoff-Nahoum et al., 2004; Wang et al., 2011）、腸管共生微生物叢の枯渇に関連する特徴的な二次所見（未消化の粘液の蓄積による盲腸の顕著な腫脹など）（Barthel et al., 2003; Croswell et al., 2009）が消化管の肉眼検査から明らかとなった。これらの所見は細菌定着レベルが低下していることを示している（データ省略）。抗生物質処置（AT）あり又はなしのウェスタン飼料（WD）群及び標準飼料（ND）群の体重は毎週計測した。図1Aは体重計測結果である。WD群及びND群間では体重に有意差があった（p<0.05）が、WD給与マウス及び同齢のWD給与ATありマウスの間で比較すると体重に明らかな差はみられなかった。この結果は、抗生物質処理で腸管内微生物叢を除去してもWDで誘導される体重増加には影響がないことを示している。興味深いことに、抗生物質処理をするとWD給与期間の内臓脂肪及び皮下脂肪が増大したが、8週間の飼料給与実験の終了時のマイクロCTによると、ND給与したApoE KOマウスと比べてもWD給与したApoE KOマウスの内臓脂肪及び皮下脂肪に変化はみられなかった。しかしながら、抗生物質処置をした場合、WD給与マウスのみで内臓脂肪（p<0.05）及び皮下脂肪（p<0.01）に有意な増加が見られた（図1B-1D）。WD-ATマウスでの内臓脂肪及び皮下脂肪の増加について、この現象が代謝の変調を伴っているかを調べたところ、WD-ATマウスに脂質代謝異常が検出された。WD-ATマウスでは血清脂質値が有意に上昇しており、血清総コレステロール値、LDL-C値はWD-ATマウスでWD給与マウスよりも有意に高値であった（p<0.05）（図1E-1H）。血漿コレステロール値の変化は明らかであったが、8週間WD給与後の大動脈全体のオイルレッドO染色によって動脈硬化病変サイズを測定した結果では、WDに関連する正面動脈硬化病変サイズは抗生物質処置によって有意に減少していた（p<0.001）（図1I）。大動脈根の組織学的検査では、動脈硬化病変サイズに同様の減少が確認され（p<0.05）（図1J）、マクロファージ・T細胞リッチな領域面積にも同様の減少が確認された（データ省略）。これらの表現型がApoE KOマウスに特異的なものであるかを調べるため、正常なC57BL/6Jマウスを用いて同じ解析を行なったところ、予想通り同様の結果が得られた（図５）。プラークサイズと総コレステロール値との間の関係を解析したところ、これらの変数の間には相関がなかった。この結果は、アテローム誘発作用が腸管共生微生物叢に関連しており、高コレステロール血症には依存していないことを示している。まとめると、以上のデータは、腸管共生微生物叢が脂質代謝に非依存のメカニズムで動脈硬化発症を促進することを示唆している。
抗生物質処置はWDで誘導されるFO B細胞の増加を消失させることによりアテローム性動脈硬化を低減する
　B細胞は、脾臓のほか血管外膜層にも存在することが知られている（Grabner et al., 2009; Hamze et al., 2013）。一方で、代謝非依存の経路による免疫系の制御における腸管微生物の役割も報告されている（Brown and Hazen, 2015; Drosos et al., 2015）。そこで、腸管微生物叢はB2細胞の活性化を通じてアテローム性動脈硬化に影響を及ぼしているという仮説を立て、これを検証すべく、まずは脾臓及びPVAT中のB2細胞集団を解析した。
　健常個体では、小さい脂肪細胞に分化する脂肪細胞前駆細胞の集積促進を経て脂肪パッド塊が拡大し、それにより脂肪組織が拡張する。対照的に、脂肪組織の病的な拡張は、既存の脂肪細胞の拡大を経て脂肪パッドが急速に増殖することを特徴とする。そのような病的な拡張は慢性炎症と関連している（Sun et al., 2011）。従って、WD給与マウス及びWD給与ATありマウスにおいて観察された代謝異常症候群は、これらのマウスで病的な脂肪組織の拡張が生じている可能性を示している。予想通り、WD給与マウスのPVAT中の脂肪細胞は、コントロール群の脂肪細胞と比べてサイズが大きく、組織化の程度が少なく、充填も緩かった（p<0.001; 図2A-2B）。しかしながら、図2A-2Bに示される通り、WD-ATマウスのPVAT中の脂肪細胞の典型的特徴には、ND給与マウスのものと有意な差はなかった。さらに、腸管共生微生物叢の除去がWD給与マウスのPVAT中のB2細胞蓄積に及ぼす効果を調べたところ、上記の結果と合致して、免疫組織化学的解析により評価したCD23陽性細胞の蓄積がWD給与マウスで有意に増大していた（p<0.001; 図2B-2C）。WD-AT群のCD23陽性細胞はコントロール群と同等であった（図2B-2C）。このことは、WD給与マウスのPVATでは明白なB2細胞浸潤が増強されたこと、このB2細胞浸潤は全ての検出可能な共生微生物の枯渇とともに完全に消失したことを示唆している。これらの結果は、蓄積したB2細胞が腸管微生物叢によるアテローム性動脈硬化の誘導に本質的に寄与しているという見解を支持している。
　上記の結果をさらに確認すべく、PVATのB2細胞をフローサイトメトリーにより調べた。代表的なフローサイトメトリープロットを図2Dに示す。PVAT中の活性化FO B細胞の割合は、ND給与マウスと比較してWD給与マウスで劇的に増大していた（p<0.001）。しかしながら、抗生物質処置で微生物叢を枯渇させた後は、WDで誘導されたFO B細胞の増加が消失しており（p<0.001）、この結果は上記の結果と合致する。B細胞の主たる貯蔵庫である脾臓内のB2細胞についても調べたところ、脾臓重量には有意差が無く（図6A）、また、WD給与と抗生物質処理は脾臓中FO B細胞の割合に変化を与えず（図2E）、FO B細胞活性化の指標となる脾臓構造の変化にも関連がなかったが（図6B-6C）、MZ B細胞の割合は抗生物質処置後にWDを給与したマウスで有意に減少していた（p<0.01; 図2E）。正常なC57BL/6Jマウスにおいても上記の結果を確認した(図7)。注目すべきことに、WD給与マウスのPVATでは活性化FO B細胞の数が増大していた一方で、AVNMによる微生物叢枯渇はFO B2細胞の有意な減少をもたらし、上記のFO B細胞数の増大はC57BL/6Jマウスでは完全に失われていた（図7）。活性化B細胞の主たる機能は抗体生産であることから、抗生物質処置が循環IgG力価を変化をもたらすかを調べた（図2F-2G）。FO B細胞数の増大は、ND給与マウスとの比較でWD給与マウスの血清中の総IgG力価の上昇には関連がなかったが、抗生物質処置により血清中の総IgG力価は急激に低下し、それに続きFO B細胞及びMZ B細胞も減少した（p<0.01; 図2F）。さらに、IgGの特異的サブクラスであり、主としてMZ B細胞がT細胞非依存の経路によって免疫前又は免疫後に産生する（Guinamard et al., 2000; Panda et al., 2013）IgG3を解析したところ、WD-ATマウスはWDマウスとの比較で血清IgG3値の低下を示した（p<0.05; 図2G）。さらにまた、統計学的な有意差にまでは至らなかったが、WDマウスではNDマウスと比べて血清IgG3値が上昇する傾向もみられた。また、抗原提示を媒介するとともに活性化B細胞の別の重要な機能を表す分子であるMHCクラスIIのB2細胞におけるmRNA発現レベルを調べた。フローサイトメトリー解析の結果ではWD群とWD-AT群との間で脾臓FO B2細胞の割合には差異がなかったが（図2E）、図2Hに示す通り、WD群の脾臓FO B2細胞におけるMHCクラスIIの発現は抗生物質処置により有意に低下した。従って、これらのデータは、腸管微生物叢が誘導するアテローム性動脈硬化がB2細胞の活性化を特徴とすることを示唆している。
腸管微生物叢はアテローム発生過程のB2細胞TLRシグナル伝達及び炎症遺伝子発現の活性化を促進する
　B細胞はTLR発現パターンにバリエーションがあり、これが微生物叢からのシグナルを直接伝達している可能性がある。あるいは、TLRを経由した微生物叢からのシグナルが抗体生産、抗原提示、サイトカイン分泌等のB細胞応答を変化させているかもしれない（Nickerson et al., 2010; Pasare and Medzhitov, 2005; Rawlings et al., 2012）。前述の結果は、WD給与マウスにおいて腸管微生物叢の除去を介して抗体応答が消失することを示している。そこで、B2細胞をさらに特徴づけ、WD給与マウスにおいて観察された微生物叢誘導性のアテローム性動脈硬化にB2細胞TLRシグナリングが寄与しているかどうかを解読するため、脾臓及びPVATからB2細胞を単離し、TLRシグナリングの遺伝子発現を定量した。予想した通り、WD群及びWD-AT群の比較の結果、遺伝子発現プロファイルに実質的な差異があることが明らかとなった（図3A及び表１、表２）。TLR発現は影響されていなかったが（図５）、前炎症性サイトカインの遺伝子発現レベルはWD給与マウスのPVAT由来のFO B2細胞で上昇していた。最も顕著な相違点として、B細胞機能に必要な分子である表面抗原CD14をコードするCD14遺伝子の転写はPVATのFO B細胞で有意にアップレギュレートされていた。過去の報告でも、CD14が自然免疫系の構成成分であり、TLR2及びTLR4とともに細菌のリポ多糖（LPS）の検出のためのコレセプターとして働くことが明らかとなっている（Heumann et al., 2001; Tasaka et al., 2003）。さらに、ケモカインリガンド2（Ccl2）、熱ショック70kDaタンパク質1a（Hspa1a）、インターロイキン1β（IL1β）、インターロイキン1受容体タイプ1（IIl1r1）、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ2（Ptgs2）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1a（Tnfrsf1a）をはじめとする炎症活性化関連分子をコードする遺伝子もアップレギュレートされていた。WD給与マウスの脾臓由来のFO B2細胞とは対照的に、WD-ATマウスでは、TLRシグナル伝達のネガティブレギュレーターであるCCAAT/エンハンサー結合タンパク質β(Cebpb) 及びNF-kappa-Bインヒビターβ (Nfkbib)の発現が誘導されており、炎症活性化関連遺伝子Hspa1a及びPtgs2の発現は劇的に低下していた（表1）。これらの結果は、観察された変化が腸管微生物叢の除去によってもたらされていること、腸管微生物叢はB2細胞TLRシグナル伝達経路の活性化を介してアテローム性動脈硬化を促進することを強く示唆している。従って、B2細胞TLRシグナリングは微生物叢によって起こるアテローム性動脈硬化を媒介している。総合すると、これらの結果は、微生物叢によるアテローム性動脈硬化の過程でB2細胞におけるTLRシグナル伝達が特異的な役割を担っていることを裏付けている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
微生物叢により誘導されるアテローム性動脈硬化はB細胞の枯渇により減弱される
　腸管微生物叢の枯渇が活性化B2細胞の数を減少させることでアテローム性動脈硬化の発症に影響を及ぼしている可能性があることから、B2細胞の枯渇が微生物叢により誘導されるアテローム性動脈硬化に対する防御をもたらすかどうかを検討した。WD給与マウスのコホートは、B細胞を枯渇できる抗マウスCD23抗体（精製ラット抗マウスCD23, BD Pharmingen, B3B4, アイソタイプIgG2a）で前処置した。抗CD23抗体の腹腔内投与はアテローム性動脈硬化の発症の1週間前に開始した。コントロール群のマウスには生理食塩水を投与した。期待した通り、抗CD23抗体を投与したマウスでは、脾臓及びPVAT内のB2細胞数が生理食塩水を投与したマウスよりもはるかに少なかった（図4A-4B）。B2細胞以外の細胞集団には変化が見られなかった（図8）。抗CD23抗体投与したWD給与マウスでは、WD給与コントロールマウスと同様に、内臓脂肪、皮下脂肪及び血清脂質値の増加と関連した体重の増加がみられた（図4C-4I）。しかしながら、8週間のWD給与後にWD給与マウスとWD給与＋抗CD23抗体投与マウスとでプラークを比較したところ、WD給与＋抗CD23抗体投与マウスではプラーク形成が顕著に低下していた（図4J-4K）。血清IgG値及び血清IgG3値は抗体非投与のWD給与マウスのみで上昇がみられた（図4L-4M）。これらの結果より、微生物叢によるアテローム性動脈硬化の誘発には初期のB2細胞からの助けが必要であることが確認された。全体として、これらのデータは、微生物叢が活性化B2細胞生成を刺激し宿主応答をTH1関連免疫へシフトさせることによりアテローム性動脈硬化を増悪することを示している。
References
　Ait-Oufella, H., Herbin, O., Bouaziz, J.D., Binder, C.J., Uyttenhove, C., Laurans, L., Taleb, S., Van Vre, E., Esposito, B., Vilar, J., et al. (2010). B cell depletion reduces the development of atherosclerosis in mice. J Exp Med 207, 1579-1587.
　Balazs, M., Martin, F., Zhou, T., and Kearney, J.F. (2002). Blood Dendritic Cells Interact with Splenic Marginal Zone B Cells to Initiate T-Independent Immune Responses. Immunity 17, 341-352.
　Barthel, M., Hapfelmeier, S., Quintanilla-Martinez, L., Kremer, M., Rohde, M., Hogardt, M., Pfeffer, K., Russmann, H., and Hardt, W.-D. (2003). Pretreatment of Mice with Streptomycin Provides a Salmonella enterica Serovar Typhimurium Colitis Model That Allows Analysis of Both Pathogen and Host. Infection and Immunity 71, 2839-2858.
　Brown, J.M., and Hazen, S.L. (2015). The gut microbial endocrine organ: bacterially derived signals driving cardiometabolic diseases. Annu Rev Med 66, 343-359.
　Canducci, F., Saita, D., Foglieni, C., Piscopiello, M.R., Chiesa, R., Colombo, A., Cianflone, D., Maseri, A., Clementi, M., and Burioni, R. (2012). Cross-reacting antibacterial auto-antibodies are produced within coronary atherosclerotic plaques of acute coronary syndrome patients. PLoS One 7, e42283.
　Cerutti, A., Puga, I., and Cols, M. (2012). New helping friends for B cells. Eur J Immunol 42, 1956-1968.
　Coyle, A.J., Wagner, K., Bertrand, C., Tsuyuki, S., Bews, J., and Heusser, C. (1996). Central role of immunoglobulin (Ig) E in the induction of lung eosinophil infiltration and T helper 2 cell cytokine production: inhibition by a non-anaphylactogenic anti-IgE antibody. The Journal of Experimental Medicine 183, 1303-1310.
　Croswell, A., Amir, E., Teggatz, P., Barman, M., and Salzman, N.H. (2009). Prolonged impact of antibiotics on intestinal microbial ecology and susceptibility to enteric Salmonella infection. Infect Immun 77, 2741-2753.
　Dasic, G., Juillard, P., Graber, P., Herren, S., Angell, T., Knowles, R., Bonnefoy, J.-Y., Kosco-Vilbois, M.H., and Chvatchko, Y. (1999). Critical role of CD23 in allergen-induced bronchoconstriction in a murine model of allergic asthma. European Journal of Immunology 29, 2957-2967.
　Doran, A.C., Lipinski, M.J., Oldham, S.N., Garmey, J.C., Campbell, K.A., Skaflen, M.D., Cutchins, A., Lee, D.J., Glover, D.K., Kelly, K.A., et al. (2012). B-cell aortic homing and atheroprotection depend on Id3. Circ Res 110, e1-12.
　Drosos, I., Tavridou, A., and Kolios, G. (2015). New aspects on the metabolic role of intestinal microbiota in the development of atherosclerosis. Metabolism 64, 476-481.
　Edfeldt, K., Swedenborg, J., Hansson, G.K., and Yan, Z.-q. (2002). Expression of Toll-Like Receptors in Human Atherosclerotic Lesions. A Possible Pathway for Plaque Activation 105, 1158-1161.
　Emtiazy, M., Choopani, R., Khodadoost, M., Tansaz, M., and Nazem, E. (2013). Atheroprotector role of the spleen based on the teaching of Avicenna (Ibn Sina). Int J Cardiol 167, 26-28.
　Fu, J., Bonder, M.J., Cenit, M.C., Tigchelaar, E.F., Maatman, A., Dekens, J.A., Brandsma, E., Marczynska, J., Imhann, F., Weersma, R.K., et al. (2015). The Gut Microbiome Contributes to a Substantial Proportion of the Variation in Blood Lipids. Circ Res 117, 817-824.
　Grabner, R., Lotzer, K., Dopping, S., Hildner, M., Radke, D., Beer, M., Spanbroek, R., Lippert, B., Reardon, C.A., Getz, G.S., et al. (2009). Lymphotoxin β receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged ApoE-/- mice. The Journal of Experimental Medicine 206, 233-248.
　Guinamard, R., Okigaki, M., Schlessinger, J., and Ravetch, J.V. (2000). Absence of marginal zone B cells in Pyk-2-deficient mice defines their role in the humoral response. Nat Immunol 1, 31-36.
　Hamze, M., Desmetz, C., Berthe, M.L., Roger, P., Boulle, N., Brancherau, P., Picard, E., Guzman, C., Tolza, C., and Guglielmi, P. (2013). Characterization of resident B cells of vascular walls in human atherosclerotic patients. J Immunol 191, 3006-3016.
　Hashimoto, K., Cohen, R.N., Yamada, M., Markan, K.R., Monden, T., Satoh, T., Mori, M., and Wondisford, F.E. (2006). Cross-talk between thyroid hormone receptor and liver X receptor regulatory pathways is revealed in a thyroid hormone resistance mouse model. J Biol Chem 281, 295-302.
　Hermansson, A., Ketelhuth, D.F., Strodthoff, D., Wurm, M., Hansson, E.M., Nicoletti, A., Paulsson-Berne, G., and Hansson, G.K. (2010). Inhibition of T cell response to native low-density lipoprotein reduces atherosclerosis. J Exp Med 207, 1081-1093.
　Heumann, D., Adachi, Y., Le Roy, D., Ohno, N., Yadomae, T., Glauser, M.P., and Calandra, T. (2001). Role of plasma, lipopolysaccharide-binding protein, and CD14 in response of mouse peritoneal exudate macrophages to endotoxin. Infect Immun 69, 378-385.
　Hilgendorf, I., Theurl, I., Gerhardt, L.M., Robbins, C.S., Weber, G.F., Gonen, A., Iwamoto, Y., Degousee, N., Holderried, T.A., Winter, C., et al. (2014). Innate response activator B cells aggravate atherosclerosis by stimulating T helper-1 adaptive immunity. Circulation 129, 1677-1687.
　Hosoi, T., Yokoyama, S., Matsuo, S., Akira, S., and Ozawa, K. (2010). Myeloid differentiation factor 88 (MyD88)-deficiency increases risk of diabetes in mice. PLoS One 5.
　Irie, D., Kawahito, H., Wakana, N., Kato, T., Kishida, S., Kikai, M., Ogata, T., Ikeda, K., Ueyama, T., Matoba, S., et al. (2015). Transplantation of periaortic adipose tissue from angiotensin receptor blocker-treated mice markedly ameliorates atherosclerosis development in apoE-/- mice. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst 16, 67-78.
　Ishigami, T., Abe, K., Aoki, I., Minegishi, S., Ryo, A., Matsunaga, S., Matsuoka, K., Takeda, H., Sawasaki, T., Umemura, S., et al. (2013). Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels. FASEB J 27, 3437-3445.
　Jiang, Y., Arase, N., Kohyama, M., Hirayasu, K., Suenaga, T., Jin, H., Matsumoto, M., Shida, K., Lanier, L.L., Saito, T., et al. (2013). Transport of misfolded endoplasmic reticulum proteins to the cell surface by MHC class II molecules. International Immunology 25, 235-246.
　Jin, H., Arase, N., Hirayasu, K., Kohyama, M., Suenaga, T., Saito, F., Tanimura, K., Matsuoka, S., Ebina, K., Shi, K., et al. (2014). Autoantibodies to IgG/HLA class II complexes are associated with rheumatoid arthritis susceptibility. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 3787-3792.
　Kawai, T., and Akira, S. (2010). The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat Immunol 11, 373-384.
　Koeth, R.A., Wang, Z., Levison, B.S., Buffa, J.A., Org, E., Sheehy, B.T., Britt, E.B., Fu, X., Wu, Y., Li, L., et al. (2013). Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes atherosclerosis. Nat Med 19, 576-585.
　Koren, O., Spor, A., Felin, J., Fak, F., Stombaugh, J., Tremaroli, V., Behre, C.J., Knight, R., Fagerberg, B., Ley, R.E., et al. (2011). Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 4592-4598.
　Kyaw, T., Tay, C., Khan, A., Dumouchel, V., Cao, A., To, K., Kehry, M., Dunn, R., Agrotis, A., Tipping, P., et al. (2010). Conventional B2 B Cell Depletion Ameliorates whereas Its Adoptive Transfer Aggravates Atherosclerosis. The Journal of Immunology 185, 4410-4419.
　Kyaw, T., Tay, C., Krishnamurthi, S., Kanellakis, P., Agrotis, A., Tipping, P., Bobik, A., and Toh, B.-H. (2011). B1a B Lymphocytes Are Atheroprotective by Secreting Natural IgM That Increases IgM Deposits and Reduces Necrotic Cores in Atherosclerotic Lesions. Circulation Research 109, 830-840.
　Lammers, B., Zhao, Y., Foks, A.C., Hildebrand, R.B., Kuiper, J., Van Berkel, T.J., and Van Eck, M. (2012). Leukocyte ABCA1 remains atheroprotective in splenectomized LDL receptor knockout mice. PLoS One 7, e48080.
　Le Chatelier, E., Nielsen, T., Qin, J., Prifti, E., Hildebrand, F., Falony, G., Almeida, M., Arumugam, M., Batto, J.-M., Kennedy, S., et al. (2013). Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers. Nature 500, 541-546.
　Lecoanet-Henchoz, S., Gauchat, J.-F., Aubry, J.-P., Graber, P., Life, P., Paul-Eugene, N., Ferrua, B., Corbi, A.L., Dugas, B., Plater-Zyberk, C., et al. (1995). CD23 Regulates monocyte activation through a novel interaction with the adhesion molecules CD11b-CD18 and CD11c-CD18. Immunity 3, 119-125.
　LeibundGut-Landmann, S., Waldburger, J.-M., e Sousa, C.R., Acha-Orbea, H., and Reith, W. (2004). MHC class II expression is differentially regulated in plasmacytoid and conventional dendritic cells. Nat Immunol 5, 899-908.
　Libby, P. (2002). Inflammation in atherosclerosis. Nature 420, 868-874.
　Lipinski, M.J., Perry, H.M., Doran, A.C., Oldham, S.N., and McNamara, C.A. (2011). Comment on “Conventional B2 B Cell Depletion Ameliorates whereas Its Adoptive Transfer Aggravates Atherosclerosis”. The Journal of Immunology 186, 4.
　Martin, F., and Kearney, J.F. (2002). Marginal-zone B cells. Nat Rev Immunol 2, 323-335.
　Nickerson, K.M., Christensen, S.R., Shupe, J., Kashgarian, M., Kim, D., Elkon, K., and Shlomchik, M.J. (2010). TLR9 Regulates TLR7- and MyD88-Dependent Autoantibody Production and Disease in a Murine Model of Lupus. The Journal of Immunology 184, 1840-1848.
　Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bari, xE, ty, J., and Hansson, G.K. (1998). Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. The Journal of Clinical Investigation 102, 910-918.
　Panda, S., Zhang, J., Tan, N.S., Ho, B., and Ding, J.L. (2013). Natural IgG antibodies provide innate protection against ficolin‐opsonized bacteria. The EMBO Journal 32, 2905-2919.
　Pasare, C., and Medzhitov, R. (2005). Control of B-cell responses by Toll-like receptors. Nature 438, 364-368.
　Puga, I., Cols, M., Barra, C.M., He, B., Cassis, L., Gentile, M., Comerma, L., Chorny, A., Shan, M., Xu, W., et al. (2012). B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nat Immunol 13, 170-180.
　Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., and Medzhitov, R. (2004). Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 118, 229-241.
　Rawlings, D.J., Schwartz, M.A., Jackson, S.W., and Meyer-Bahlburg, A. (2012). Integration of B cell responses through Toll-like receptors and antigen receptors. Nat Rev Immunol 12, 282-294.
　Rezende, A.B., Neto, N.N., Fernandes, L.R., Ribeiro, A.C., Alvarez-Leite, J.I., and Teixeira, H.C. (2011). Splenectomy increases atherosclerotic lesions in apolipoprotein E deficient mice. J Surg Res 171, e231-236.
　Serino, M., Blasco-Baque, V., Nicolas, S., and Burcelin, R. (2014). Far from the eyes, close to the heart: dysbiosis of gut microbiota and cardiovascular consequences. Curr Cardiol Rep 16, 540.
　Shapiro-Shelef, M., and Calame, K. (2005). Regulation of plasma-cell development. Nat Rev Immunol 5, 230-242.
　Spence, J.D., Urquhart, B.L., and Bang, H. (2016). Effect of renal impairment on atherosclerosis: only partially mediated by homocysteine. Nephrol Dial Transplant 31, 937-944.
　Stief, A., Texido, G., Sansig, G., Eibel, H., Le Gros, G., and van der Putten, H. (1994). Mice deficient in CD23 reveal its modulatory role in IgE production but no role in T and B cell development. The Journal of Immunology 152, 3378-3390.
　Sun, K., Kusminski, C.M., and Scherer, P.E. (2011). Adipose tissue remodeling and obesity. The Journal of Clinical Investigation 121, 2094-2101.
　Tang, W.H., and Hazen, S.L. (2014). The contributory role of gut microbiota in cardiovascular disease. J Clin Invest 124, 4204-4211.
　Tang, W.H., Wang, Z., Levison, B.S., Koeth, R.A., Britt, E.B., Fu, X., Wu, Y., and Hazen, S.L. (2013). Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk. N Engl J Med 368, 1575-1584.
　Tasaka, S., Ishizaka, A., Yamada, W., Shimizu, M., Koh, H., Hasegawa, N., Adachi, Y., and Yamaguchi, K. (2003). Effect of CD14 blockade on endotoxin-induced acute lung injury in mice. Am J Respir Cell Mol Biol 29, 252-258.
　Tsiantoulas, D., Diehl, C.J., Witztum, J.L., and Binder, C.J. (2014). B cells and humoral immunity in atherosclerosis. Circ Res 114, 1743-1756.
　Velagapudi, V.R., Hezaveh, R., Reigstad, C.S., Gopalacharyulu, P., Yetukuri, L., Islam, S., Felin, J., Perkins, R., Boren, J., Oresic, M., et al. (2010). The gut microbiota modulates host energy and lipid metabolism in mice. J Lipid Res 51, 1101-1112.
　Victora, G.D. (2014). ILCs in the zone. Nat Immunol 15, 313-314.
　Vinuesa, C.G., and Chang, P.P. (2013). Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nat Immunol 14, 119-126.
　Wang, Z., Klipfell, E., Bennett, B.J., Koeth, R., Levison, B.S., Dugar, B., Feldstein, A.E., Britt, E.B., Fu, X., Chung, Y.M., et al. (2011). Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature 472, 57-63.
　Wardemann, H., Boehm, T., Dear, N., and Carsetti, R. (2002). B-1a B Cells that Link the Innate and Adaptive Immune Responses Are Lacking in the Absence of the Spleen. The Journal of Experimental Medicine 195, 771-780.
　Weill, J.-C., Weller, S., and Reynaud, C.-A. (2009). Human Marginal Zone B Cells. Annual Review of Immunology 27, 267-285.
　Wick, G., Knoflach, M., and Xu, Q. (2004). Autoimmune and inflammatory mechanisms in atherosclerosis. Annu Rev Immunol 22, 361-403.

Claims (7)

  1. 　B2細胞を選択的に抑制する物質を有効成分とする、抗動脈硬化剤。
  2. 　B2細胞を選択的に抑制する物質が抗CD23抗体である、請求項１記載の抗動脈硬化剤。
  3. 　被検者から分離された試料を用いて、以下の遺伝子群A及び遺伝子群Bからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することを含む、動脈硬化の病態の判定を補助する方法。
    遺伝子群A：
    Ccl2、Cd14、Hspa1a、Il1b、Il1r1、Ptgs2、Tnfrsf1a、Tlr5
    遺伝子群B：
    Cebpb、Fos、Jun、Nfkbib、Chuk、Ikbkb、Irf1、Mapk8、Mapk8ip3、Mapk9、Tollip、Tradd
  4. 　前記被検者が動脈硬化症患者である、請求項３記載の方法。
  5. 　前記試料がB2細胞を含む試料である、請求項３又は４記載の方法。
  6. 　前記遺伝子群Aは、高発現が動脈硬化の存在又は悪化の指標となる遺伝子であり、前記遺伝子群Bは、低発現が動脈硬化の存在又は悪化の指標となる遺伝子である、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　被検者から分離された血清試料中のIgG3レベル又は総IgGレベルを測定することを含む、動脈硬化の病態の判定を補助する方法。
PCT/JP2017/037624 2016-10-19 2017-10-18 抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法 WO2018074497A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17863032.3A EP3533469A4 (en) 2016-10-19 2017-10-18 ANTI-ATHEROSCLEROSIS AGENT AND SYMPTOM IDENTIFICATION METHOD FOR ARTERIOSCLEROSIS
JP2018546372A JP7012366B2 (ja) 2016-10-19 2017-10-18 抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法
US16/343,246 US20190339267A1 (en) 2016-10-19 2017-10-18 Anti-atherosclerotic agent and symptom identification method for arteriosclerosis

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016204783 2016-10-19
JP2016-204783 2016-10-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018074497A1 true WO2018074497A1 (ja) 2018-04-26

Family

ID=62018747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/037624 WO2018074497A1 (ja) 2016-10-19 2017-10-18 抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20190339267A1 (ja)
EP (1) EP3533469A4 (ja)
JP (1) JP7012366B2 (ja)
WO (1) WO2018074497A1 (ja)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037099A1 (en) 1997-02-20 1998-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Gamma-1 and gamma-3 anti-human cd23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
JP2004508420A (ja) * 2000-09-18 2004-03-18 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション Ｂ細胞枯渇抗体／免疫調節性抗体の組合せを用いて自己免疫疾患を治療するための併用療法
WO2005007890A2 (en) * 2003-07-21 2005-01-27 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for detecting a risk of infarction related to atherosclerosis
WO2007002677A2 (en) * 2005-06-24 2007-01-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for diagnosis and monitoring of atherosclerotic cardiovascular disease
US20110014613A1 (en) * 2009-04-01 2011-01-20 Pfuetzner-Riehn Elisabeth Genotyping for Risk of Atherosclerosis
WO2012067165A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 国立大学法人愛媛大学 自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法
JP2012514587A (ja) 2009-01-06 2012-06-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル アテローム性動脈硬化の処置のためのｂ細胞枯渇剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009111085A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Biogen Idec Ma Inc. Use of cd23 antibodies to treat malignancies in patients with poor prognosis

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037099A1 (en) 1997-02-20 1998-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Gamma-1 and gamma-3 anti-human cd23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
JP2004508420A (ja) * 2000-09-18 2004-03-18 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション Ｂ細胞枯渇抗体／免疫調節性抗体の組合せを用いて自己免疫疾患を治療するための併用療法
WO2005007890A2 (en) * 2003-07-21 2005-01-27 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for detecting a risk of infarction related to atherosclerosis
WO2007002677A2 (en) * 2005-06-24 2007-01-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for diagnosis and monitoring of atherosclerotic cardiovascular disease
JP2012514587A (ja) 2009-01-06 2012-06-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル アテローム性動脈硬化の処置のためのｂ細胞枯渇剤
US20110014613A1 (en) * 2009-04-01 2011-01-20 Pfuetzner-Riehn Elisabeth Genotyping for Risk of Atherosclerosis
WO2012067165A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 国立大学法人愛媛大学 自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法

Non-Patent Citations (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI GenBank", Database accession no. NM 002002
AIT-OUFELLA, H.HERBIN, O.BOUAZIZ, J.D.BINDER, C.J.UYTTENHOVE, C.LAURANS, L.TALEB, S.VAN VRE, E.ESPOSITO, B.VILAR, J. ET AL.: "B cell depletion reduces the development of atherosclerosis in mice", J EXP MED, vol. 207, 2010, pages 1579 - 1587
ANDERSON KM. ET AL., AM HEART J, vol. 121, 1991, pages 293 - 8
BALAZS, M.MARTIN, F.ZHOU, T.KEARNEY, J.T: "Blood Dendritic Cells Interact with Splenic Marginal Zone B Cells to Initiate T-Independent Immune Responses", IMMUNITY, vol. 17, 2002, pages 341 - 352
BARTHEL, M.HAPFELMEIER, S.QUINTANILLA-MARTINEZ, L.KREMER, M.ROHDE, M.HOGARDT, M.PFEFFER, K.RUSSMANN, H.IIARDT, W.-D.: "Pretreatment of Mice with Streptomycin Provides a Salmonella enterica Serovar Typhimurium Colitis Model That Allows Analysis of Both Pathogen and Host", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 71, 2003, pages 2839 - 2858
BEST, CG. ET AL., MURINE B- CELL SUBSETS DEFINED BY CD 23, METHODS, vol. 8, 1995, pages 3 - 10, XP055477785 *
BROWN, J.M.HAZEN, S.L.: "The gut microbial endocrine organ: bacterially derived signals driving cardiometabolic diseases", ANNU REV MED, vol. 66, 2015, pages 343 - 359
CANDUCCI, F.SAITA, D.FOGLIENI, C.PISCOPIELLO, M.R.CHIESA, R.COLOMBO, A.CIANFLONE, D.MASERI, A.CLEMENTI, M.BURIONI, R.: "Cross-reacting antibacterial auto-antibodies are produced within coronary atherosclerotic plaques of acute coronary syndrome patients", PLOS ONE, vol. 7, 2012, pages e42283
CERUTTI, A.PUGA, I.COLS, M.: "New helping friends for B cells", EUR J IMMUNOL, vol. 42, 2012, pages 1956 - 1968
CHEN, L. ET AL.: "Commensal Microbe-specific Activation : of B2 Cell Subsets Contributes to Atherosclerosis Development Independently of Lipid Metabolism", EBIOMEDICINE, vol. 13, 20 October 2016 (2016-10-20), pages 237 - 247, XP055477783 *
CHISTIAKOV, DA. ET AL.: "Role of gut microbiota in the modulation of atherosclerosis-associated immune response", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 6, 2015, XP055477786 *
COYLE, A.J.WAGNER, K.BERTRAND, C.TSUYUKI, S.BEWS, J.HEUSSER, C.: "Central role of immunoglobulin (Ig) E in the induction of lung eosinophil infiltration and T helper 2 cell cytokine production: inhibition by a non-anaphylactogenic anti-IgE antibody", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 183, 1996, pages 1303 - 1310, XP002919106, DOI: doi:10.1084/jem.183.4.1303
CROSWELL, A.AMIR, E.TEGGATZ, P.BARMAN, M.SALZMAN, N.H.: "Prolonged impact of antibiotics on intestinal microbial ecology and susceptibility to enteric Salmonella infection", INFECT IMMUN, vol. 77, 2009, pages 2741 - 2753
DASIC G ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 29, 1999, pages 2957
DASIC, G.JUILLARD, P.GRABER, P.HEN-EN, S.ANGELL, T.KNOWLES, R.BONNEFOY, J.-Y.KOSCO-VILBOIS, M.H.CHVATCHKO, Y.: "Critical role of CD23 in allergen-induced bronchoconstriction in a murine model of allergic asthma", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 29, 1999, pages 2957 - 2967
DORAN, A.C.LIPINSKI, M.J.OLDHAM, S.N.GARMEY, J.C.CAMPBELL, K.A.SKAFLEN, M.D.CUTCHINS, A.LEE, D.J.GLOVER, D.K.KELLY, K.A. ET AL.: "B-cell aortic homing and atheroprotection depend on Id3", CIRC RES, vol. 110, 2012, pages el-12
DOUNA, H. ET AL.: "Novel B- cell subsets in atherosclerosis", CURRENT OPINION IN LIPIDOLOGY, vol. 27, no. 5, October 2016 (2016-10-01), pages 493 - 498, XP009514166, ISSN: 0957-9672, DOI: 10.1097/MOL.0000000000000335 *
DROSOS, I.TAVRIDOU, A.KOLIOS, G.: "New aspects on the metabolic role of intestinal microbiota in the development of atherosclerosis", METABOLISM, vol. 64, 2015, pages 476 - 481, XP029143700, DOI: doi:10.1016/j.metabol.2015.01.007
EDFELDT, K.SWEDENBORG, J.HANSSON, G.K.YAN, Z.-Q.: "Expression of Toll-Like Receptors in Human Atherosclerotic Lesions", A POSSIBLE PATHWAY FOR PLAQUE ACTIVATION, vol. 105, 2002, pages 1158 - 1161
EMTIAZY, M.CHOOPANI, R.KHODADOOST, M.TANSAZ, M.NAZEM, E.: "Atheroprotector role of the spleen based on the teaching of Avicenna (Ibn Sina", INT J CARDIOL, vol. 167, 2013, pages 26 - 28, XP028556745, DOI: doi:10.1016/j.ijcard.2012.06.020
FU, J.BONDER, M.J.CENIT, M.C.TIGCHELAAR, E.F.MAATMAN, A.DEKENS, J.A.BRANDSMA, E.MARCZYNSKA, J.IMHANN, F.WEERSMA, R.K. ET AL.: "The Gut Microbiome Contributes to a Substantial Proportion of the Variation in Blood Lipids", CIRC RES, vol. 117, 2015, pages 817 - 824
GRABNER, R.LOTZER, K.DOPPING, S.HILDNER, M.RADKE, D.BEER, M.SPANBROEK, R.LIPPERT, B.REARDON, C.A.GETZ, G.S. ET AL.: "Lymphotoxin β receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged ApoE-/- mice", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 206, 2009, pages 233 - 248
GUINAMARD, R.OKIGAKI, M.SCHLESSINGER, J.RAVETCH, J.V.: "Absence of marginal zone B cells in Pyk-2-deficient mice defines their role in the humoral response", NAT IMMUNOL, vol. 1, 2000, pages 31 - 36
HAMZE, M.DESMETZ, C.BERTHE, M.L.ROGER, P.BOULLE, N.BRANCHERAU, P.PICARD, E.GUZMAN, C.TOLZA, C.GUGLIELMI, P.: "Characterization of resident B cells of vascular walls in human atherosclerotic patients", J IMMUNOL, vol. 191, 2013, pages 3006 - 3016
HASHIMOTO, K.COHEN, R.N.YAMADA, M.MARKAN, K.R.MONDEN, T.SATOH, T.MORI, M.WONDISFORD, F.E.: "Cross-talk between thyroid hormone receptor and liver X receptor regulatory pathways is revealed in a thyroid hormone resistance mouse model", J BIOL CHEM, vol. 281, 2006, pages 295 - 302
HEUMANN, D.ADACHI, Y.LE ROY, D.OHNO, N.YADOMAE, T.GLAUSER, M.P.CALANDRA, T.: "Role of plasma, lipopolysaccharide-binding protein, and CD 14 in response of mouse peritoneal exudate macrophages to endotoxin", INFECT IMMUN, vol. 69, 2001, pages 378 - 385
HILGENDORF, I.THEURL, I.GERHARDT, L.M.ROBBINS, C.S.WEBER, G.F.GONEN, A.IWAMOTO, Y.DEGOUSEE, N.HOLDERRIED, T.A.WINTER, C. ET AL.: "Innate response activator B cells aggravate atherosclerosis by stimulating T helper-1 adaptive immunity", CIRCULATION, vol. 129, 2014, pages 1677 - 1687
HOSOI, T.YOKOYAMA, S.MATSUO, S.AKIRA, S.OZAWA, K.: "Myeloid differentiation factor 88 (MyD88)-deficicncy increases risk of diabetes in mice", PLOS ONE, 2010, pages 5
ILERMANSSON, A.KETELHUTH, D.F.STRODTHOFF, D.WURM, M.HANSSON, E.M.NICOLETTI, A.PAULSSON-BERNE, G.HANSSON, G.K.: "Inhibition of T cell response to native low-density lipoprotein reduces atherosclerosis", J EXP MED, vol. 207, 2010, pages 1081 - 1093, XP055015851, DOI: doi:10.1084/jem.20092243
IRIE, D.KAWAHITO, II.WAKANA, N.KATO, T.KISHIDA, S.KIKAI, M.OGATA, T.IKEDA, K.UEYAMA, T.MATOBA, S. ET AL.: "Transplantation of periaortic adipose tissue from angiotensin receptor blocker-treated mice markedly ameliorates atherosclerosis development in apoE-/- mice", J RENIN ANGIOTENSIN ALDOSTERONE SYST, vol. 16, 2015, pages 67 - 78
ISHIGAMI T. ET AL., FASEB J., vol. 27, 2013, pages 3437 - 3445
ISHIGAMI, T.ABE, K.AOKI, I.MINEGISHI, S.RYO, A.MATSUNAGA, S.MATSUOKA, K.TAKEDA, H.SAWASAKI, T.UMEMURA, S. ET AL.: "Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels", FASEB J, vol. 27, 2013, pages 3437 - 3445
JIANG, Y.ARASE, N.KOHYAMA, M.HIRAYASU, K.SUENAGA, T.JIN, H.MATSUMOTO, M.SHIDA, K.LANIER, L.L.SAITO, T. ET AL.: "Transport of misfolded endoplasmic reticulum proteins to the cell surface by MHC class II molecules", INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 25, 2013, pages 235 - 246
JIN, H.ARASE, N.HIRAYASU, K.KOHYAMA, M.SUENAGA, T.SAITO, F.TANIMURA, K.MATSUOKA, S.EBINA, K.SHI, K. ET AL.: "Autoantibodies to IgG/HLA class II complexes arc associated with rheumatoid arthritis susceptibility", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 111, 2014, pages 3787 - 3792
KAPOURCHALI ET AL., WORLD J CLIN CASES, vol. 2, no. 5, 16 May 2014 (2014-05-16), pages 126 - 132
KAWAI, T.AKIRA, S.: "The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors", NAT IMMUNOL, vol. 11, 2010, pages 373 - 384
KOETH, R.A.WANG, Z.LEVISON, B.S.BUFFA, J.A.ORG, E.SHEEHY, B.T.BRITT, E.B.FU, X.WU, Y.LI, L. ET AL.: "Intestinal microbiota metabolism ofL-carnitine, a nutrient in red meat, promotes atherosclerosis", NAT MED, vol. 19, 2013, pages 576 - 585
KOREN, O.SPOR, A.FELIN, J.FAK, F.STOMBAUGH, J.TREMAROLI, V.BEHRE, C.J.KNIGHT, R.FAGERBERG, B.LEY, R.E. ET AL.: "Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 108, 2011, pages 4592 - 4598, XP055001767, DOI: doi:10.1073/pnas.1011383107
KYAW, 1.TAY, C.KRISHNAMURTHI, S.KANELLAKIS, P.AGROTIS, A.TIPPING, P.BOBIK, A.TOH, B.-H.: "Bla B Lymphocytes Are Atheroprotective by Secreting Natural IgM That Increases IgM Deposits and Reduces Necrotic Cores in Atherosclerotic Lesions", CIRCULATION RESEARCH, vol. 109, 2011, pages 830 - 840
KYAW, T. ET AL.: "Conventional B2 B Cell Depletion Ameliorates whereas Its Adoptive Transfer Aggravates Atherosclerosis", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 185, 2010, pages 4410 - 4419, XP055477780 *
KYAW, T.TAY, C.KHAN, A.DUMOUCHEL, V.CAO, A.TO, K.KEHRY, M.DUNN, R.AGROTIS, A.TIPPING, P. ET AL.: "Conventional B2 B Cell Depletion Ameliorates whereas Its Adoptive Transfer Aggravates Atherosclerosis", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 185, 2010, pages 4410 - 4419, XP055477780, DOI: doi:10.4049/jimmunol.1000033
LAMMERS, B.ZHAO, Y.FOKS, A.C.HILDEBRAND, R.B.KUIPER, J.VAN BERKEL, T.J.VAN ECK, M.: "Leukocyte ABCA1 remains atheroprotective in splenectomized LDL receptor knockout mice", PLOS ONE, vol. 7, 2012, pages e48080
LE CHATELICR, E.NIELSEN, T.QIN, J.PRIFTI, E.HILDEBRAND, F.FALONY, G.ALMEIDA, M.ARUMUGAM, M.BATTO, J.-M.KENNEDY, S. ET AL.: "Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers", NATURE, vol. 500, 2013, pages 541 - 546, XP055087499, DOI: doi:10.1038/nature12506
LECOANET-HENCHOZ, S.GAUCHAT, J.-F.AUBRY, J.-P.GRABER, P.LIFE, P.PAUL-EUGENE, N.FERRUA, B.CORBI, A.L.DUGAS, B.PLATER-ZYBERK, C. ET : "CD23 Regulates monocyte activation through a novel interaction with the adhesion molecules CDI lb-CD18 and CD1 lc-CD18", IMMUNITY, vol. 3, 1995, pages 119 - 125, XP000770571, DOI: doi:10.1016/1074-7613(95)90164-7
LEIBUNDGUT-LANDMANN, S.WALDBURGER, J.-M.E SOUSA, C.R.ACHA-ORBEA, H.REITH, W.: "MHC class II expression is differentially regulated in plasmacytoid and conventional dendritic cells", NAT IMMUNOL, vol. 5, 2004, pages 899 - 908
LI ET AL., PROTEIN CELL, vol. 2, no. 3, 2011, pages 189 - 201
LIBBY, P.: "Inflammation in atherosclerosis", NATURE, vol. 420, 2002, pages 868 - 874, XP002964811, DOI: doi:10.1038/nature01323
LIPINSKI, M.J.PERRY, H.M.DORAN, A.C.OLDHAM, S.N.MCNAMARA, C.A.: "Comment on ''Conventional B2 B Cell Depletion Ameliorates whereas Its Adoptive Transfer Aggravates Atherosclerosis", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 186, 2011, pages 4
LO SASSO ET AL., J TRANSL MED, vol. 14, 2016, pages 146
MARTIN, F.KEARNEY, J.F.: "Marginal-zone B cells", NAT REV IMMUNOL, vol. 2, 2002, pages 323 - 335
NICKERSON, K.M.CHRISTENSEN, S.R.SHUPE, J.KASHGARIAN, M.KIM, D.ELKON, K.SHLOMCHIK, M.J.: "TLR9 Regulates TLR7- and MyD88-Dependent Autoantibody Production and Disease in a Murine Model of Lupus", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 184, 2010, pages 1840 - 1848
NICOLETTI, A.KAVERI, S.CALIGIURI, G.BARI, XE, TY, J.HANSSON, G.K.: "Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice", THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 102, 1998, pages 910 - 918
OSHIBA A ET AL., J. IMMUNOL., vol. 159, 1997, pages 4056
PANDA, S.ZHANG, J.TAN, N.S.HO, B.DING, J.L.: "Natural IgG antibodies provide innate protection against ficolin-opsonized bacteria", THE EMBO JOURNAL, vol. 32, 2013, pages 2905 - 2919
PASARE, C.MEDZHITOV, R.: "Control of B-cell responses by Toll-like receptors", NATURE, vol. 438, 2005, pages 364 - 368, XP055552927, DOI: doi:10.1038/nature04267
PUGA, 1.COLS, M.BARRA, C.M.HE, B.CASSIS, L.GENTILE, M.COMERMA, L.CHORNY, A.SHAN, M.XU, W. ET AL.: "B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen", NAT IMMUNOL, vol. 13, 2012, pages 170 - 180
RAKOFF-NAHOUM, S.PAGLINO, J.ESLAMI-VARZANEH, F.EDBERG, S.MEDZHITOV, R.: "Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis", CELL, vol. 118, 2004, pages 229 - 241, XP008166084, DOI: doi:10.1016/j.cell.2004.07.002
RAO M ET AL., J. IMMUNOL., vol. 138, 1987, pages 1845
RAWLINGS, D.J.SCHWARTZ, M.A.JACKSON, S.W.MEYER-BAHLBURG, A.: "Integration of B cell responses through loll-like receptors and antigen receptors", NAT REV IMMUNOL, vol. 12, 2012, pages 282 - 294
REZCNDC, A.B.NETO, N.N.FERNANDES, L.R.RIBEIRO, A.C.ALVAREZ-LEITE, J.I.TEIXEIRA, H.C.: "Splenectomy increases atherosclerotic lesions in apolipoprotein E deficient mice", J SURG RES, vol. 171, 2011, pages e231 - 236, XP028108543, DOI: doi:10.1016/j.jss.2011.08.010
See also references of EP3533469A4
SERINO, M.BLASCO-BAQUE, V.NICOLAS, S.BURCELIN, R.: "Far from the eyes, close to the heart: dysbiosis of gut microbiota and cardiovascular consequences", CURR CARDIOL REP, vol. 16, 2014, pages 540
SHAPIRO-SHELEF, M.CALAME, K.: "Regulation of plasma-cell development", NAT REV IMMUNOL, vol. 5, 2005, pages 230 - 242, XP055093844, DOI: doi:10.1038/nri1572
SPENCE, J.D.URQUHART, B.L.BANG, H.: "Effect of renal impairment on atherosclerosis: only partially mediated by homocysteine", NEPHROL DIAL TRANSPLANT, vol. 31, 2016, pages 937 - 944
STIEF, A.TCXIDO, G.SANSIG, G.EIBEL, H.LE GROS, G.VAN DER PUTTEN, H.: "Mice deficient in CD23 reveal its modulatory role in IgE production but no role in T and B cell development", THE JOURNAL OFLMMUNOLOGY, vol. 152, 1994, pages 3378 - 3390
SUN. K.KUSMINSKI, C.M.SCHERER, P.E.: "Adipose tissue remodeling and obesity", THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 121, 2011, pages 2094 - 210 1
TANG, W.H.HAZEN, S.L.: "The contributory role of gut microbiota in cardiovascular disease", J CLIN INVEST, vol. 124, 2014, pages 4204 - 4211
TANG, W.H.WANG, Z.LEVISON, B.S.KOETH, R.A.BRITT, E.B.FU, X.WU, Y.HAZEN, S.L.: "Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk", N ENGL J MED, vol. 368, 2013, pages 1575 - 1584, XP055448252, DOI: doi:10.1056/NEJMoa1109400
TASAKA, S.ISHIZAKA, A.YAMADA, W.SHIMIZU, M.KOH, H.HASCGAWA, N.ADACHI, Y.YAMAGUCHI, K.: "Effect of CD14 blockade on endotoxin-induced acute lung injury in mice", AM J RESPIR CELL MOL BIOL, vol. 29, 2003, pages 252 - 258
TSIANTOULAS, D.DIEHL, C.J.WITZTUM, .1.L.BINDER, C.J.: "B cells and humoral immunity in atherosclerosis", CIRC RES, vol. 114, 2014, pages 1743 - 1756
VELAGAPUDI, V.R.ΣIEZAVEH, R.REIGSTAD, C.S.GOPALACHARYULU, P.YETUKURI, L.ISLAM, S.FELIN, J.PERKINS, R.BOREN, J.ORESIC, M. ET AL.: "The gut microbiota modulates host energy and lipid metabolism in mice", J LIPID RES, vol. 51, 2010, pages 1101 - 1112
VICTORA, G.D.: "ILCs in the zone", NAT IMMUNOL, vol. 15, 2014, pages 313 - 314
VINUESA, C.G.CHANG, P.P.: "Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses", NAT IMMUNOL, vol. 14, 2013, pages 119 - 126
WANG, Z.KLIPFELL, E.BENNETT, B.J.KOETH, R.LEVISON, B.S.DUGAR, B.FELDSTEIN, A.E.BRITT, E.B.FU, X.CHUNG, Y.M. ET AL.: "Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease", NATURE, vol. 472, 2011, pages 57 - 63, XP055120871, DOI: doi:10.1038/nature09922
WARDEMANN, H.BOEHM, T.DEAR, N.CARSETTI, R.: "B-la B Cells that Link the Innate and Adaptive Immune Responses Are Lacking in the Absence of the Spleen", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 195, 2002, pages 771 - 780
WEILL, J.-C.WELLER, S.REYNAUD, C.-A.: "Human Marginal Zone B Cells", ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY, vol. 27, 2009, pages 267 - 285
WICK, G.KNOFLACH, M.XU, Q.: "Autoimmune and inflammatory mechanisms in atherosclerosis", ANNU REV IMMUNOL, vol. 22, 2004, pages 361 - 403

Also Published As

Publication number Publication date
JP7012366B2 (ja) 2022-02-14
EP3533469A4 (en) 2020-11-25
JPWO2018074497A1 (ja) 2019-09-05
US20190339267A1 (en) 2019-11-07
EP3533469A1 (en) 2019-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fatkhullina et al. An interleukin-23-interleukin-22 axis regulates intestinal microbial homeostasis to protect from diet-induced atherosclerosis
Rogier et al. Alteration of the intestinal microbiome characterizes preclinical inflammatory arthritis in mice and its modulation attenuates established arthritis
Lanternier et al. Inherited CARD9 deficiency in otherwise healthy children and adults with Candida species–induced meningoencephalitis, colitis, or both
Chen et al. Commensal microbe-specific activation of B2 cell subsets contributes to atherosclerosis development independently of lipid metabolism
Ghadimi et al. Epigenetic imprinting by commensal probiotics inhibits the IL-23/IL-17 axis in an in vitro model of the intestinal mucosal immune system
Steinmetz et al. The Th17-defining transcription factor RORγt promotes glomerulonephritis
Mor et al. Role of naturally occurring CD4+ CD25+ regulatory T cells in experimental atherosclerosis
Zhang et al. ASIC1a induces synovial inflammation via the Ca2+/NFATc3/RANTES pathway
McLean et al. Targeting interleukins for the treatment of inflammatory bowel disease—what lies beyond anti-TNF therapy?
Tai et al. TLR9 deficiency promotes CD73 expression in T cells and diabetes protection in nonobese diabetic mice
JP6999417B2 (ja) Ｉｂｄにおける治療標的及びバイオマーカー
Gwag et al. Macrophage-derived thrombospondin 1 promotes obesity-associated non-alcoholic fatty liver disease
Lapointe et al. Interleukin-18 facilitates neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent disruption of occludin, without altering epithelial permeability
Ma et al. Lupus gut microbiota transplants cause autoimmunity and inflammation
Dobrian et al. STAT4 deficiency reduces obesity-induced insulin resistance and adipose tissue inflammation
Liu et al. The expression of Th17-associated cytokines in human acute graft-versus-host disease
Ding et al. Toll-like receptor 9 deficiency induces osteoclastic bone loss via gut microbiota-associated systemic chronic inflammation
Mukai et al. SH3BP2 gain-of-function mutation exacerbates inflammation and bone loss in a murine collagen-induced arthritis model
Prins et al. Monocyte TREM-1 levels associate with anti-TNF responsiveness in IBD through autophagy and Fcγ-receptor signaling pathways
Kang et al. The colonic macrophage transcription factor RBP-J orchestrates intestinal immunity against bacterial pathogens
Yurdakök What next in necrotizing enterocolitis?
Liang et al. Survival of stem cells and progenitors in the intestine is regulated by LPA5-dependent signaling
Zhang et al. Inflammatory macrophages exacerbate neutrophil-driven joint damage through ADP/P2Y 1 signaling in rheumatoid arthritis
Xie et al. An agonistic anti-signal regulatory protein α antibody for chronic inflammatory diseases
Fang et al. CXCL12/CXCR4 Axis drives the chemotaxis and differentiation of B cells in bullous pemphigoid

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17863032

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018546372

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017863032

Country of ref document: EP

Effective date: 20190520