WO2018061593A1 - アルキン含有分子の濃縮精製方法 - Google Patents

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賢司 大金
孝介 ▲ど▼▲ど▼
三和子 淺沼
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • Methods for concentrating and purifying molecules having a specific chemical structure include immunoprecipitation using an antigen-antibody reaction, a method using an avidin-biotin interaction, and a method using an interaction between a His tag and a Ni-immobilized solid phase.
  • His tags and biotin are large tags, and it is not desirable to introduce them as tags into low-molecular compounds such as physiologically active compounds and metabolites.
  • antibodies are effective against large molecules such as proteins, it is generally not easy to create antibodies against small functional groups, including alkynes, and low molecular weight compounds. Except molecular compounds, it cannot be a general method for concentration purification of low molecular compounds.
  • proteins such as antibodies and avidin cannot be used for a group of compounds that do not dissolve in an aqueous solution and need to be handled in an organic solvent, such as lipids and metabolites thereof, because they are denatured in an organic solvent.
  • the method of directly concentrating and purifying alkyne can be a method for solving the above-mentioned problems. So far, there has been reported a method for concentrating and purifying alkyne-containing lipids, peptides, and proteins using a complex formation reaction between alkyne and cobalt by immobilizing dicobalt octacarbonyl complex on phosphine-modified silica gel or polymer carrier. (Non-Patent Documents 1 to 3). In the methods of Non-Patent Documents 1 and 2, an aqueous solution or an organic solvent can be used by not using a protein.
  • Non-patent Documents 6
  • an example was reported in which silver ions were supported on a sulfonic acid-modified cellulose carrier, ethynyl steroids were captured and eluted with excess hexyne or acetylene (Non-patent Document 7). Used only in.
  • this paper was also cited rarely in the field of silver ion chromatography, it was not recognized in the life science field such as chemical biology.
  • Silver ion chromatography is a technique for separating low molecular weight compounds based on differences in the degree of unsaturation, utilizing the coordinate binding ability of silver ions and unsaturated pi electrons.
  • Non-Patent Documents 4, 5 and 7 are carried out in an organic solvent, and the target is also limited to steroids.
  • silver-supported Florisil and silica gel cannot stably hold silver ions and silver ions elute under conditions including water and buffer.
  • these molecules themselves have the ability to coordinate to silver ions and elute silver ions, making concentration and purification difficult. Therefore, it was necessary to fix the silver ions more firmly on the carrier as in the case of using sulfonic acid-modified cellulose in the prior literature.
  • phosphine As a method of supporting and trapping metal ions, there is a method of using phosphine as a ligand as used in the above alkyne-cobalt complex example. Further, carriers modified with thiols, thioamides, carboxylic acids, and amines such as those commercially available as scavenger resins are generally used for the purpose of trapping and removing metal ions in the solution. However, the influence of these functional groups acting as silver ion ligands on the acetylide formation reaction of silver ions has not been investigated.
  • Non-Patent Documents 4, 5 and 7 there is no description or suggestion regarding the relationship between the influence of the functional group on the support as a ligand and the efficiency of the silver acetylide formation reaction. It is also unclear whether it can be used in the same manner as Florisil, silica gel, and sulfonic acid-modified cellulose in References 4, 5 and 7.
  • Patent Document 1 a process for removing acetylene contained in a gas using a carboxylic acid-modified polymer carrying silver ions has been reported (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 it was applied only to the removal of acetylene contained in a low-polarity gas, and it was unclear whether this carrier could be used in a solution.
  • the filter after use removes acetylene gas and silver ions by treating with dilute nitric acid, and can be reused by supporting silver ions again. Conditions are easily expected to be unusable for biomolecules and the like.
  • An object of the present invention is to provide a method for concentrating and purifying a wide range of alkyne-containing molecules quickly and efficiently under mild conditions in a wide range of solvent systems including aqueous solutions.
  • FIG. 1 shows an example of the method and apparatus or apparatus for concentrating and purifying terminal alkyne-containing molecules of the present invention.
  • FIG. 2 shows functional group tolerance.
  • FIG. 3 shows a comparison between carboxylic acid-modified silica gel (COOH silica gel) and sulfonic acid-modified silica gel (SO 3 H silica gel) in the concentration and purification of terminal alkyne-containing peptides.
  • FIG. 4 shows the result of concentration and purification from a cellular lipid extract of terminal alkyne-containing phospholipids.
  • FIG. 5 shows the result of concentration purification of metabolites in cells of terminal alkyne-containing choline.
  • FIG. 1 shows an example of the method and apparatus or apparatus for concentrating and purifying terminal alkyne-containing molecules of the present invention.
  • FIG. 2 shows functional group tolerance.
  • FIG. 3 shows a comparison between carboxylic acid-modified silica gel (COOH silica gel) and sul
  • FIG. 6 shows the result of concentration and purification from a cultured cell enzyme digest of a terminal alkyne-containing peptide.
  • FIG. 7 shows the results of concentration and purification of alkyne peptides using a spin column in which a silver-supported carrier and a reverse-phase carrier are combined.
  • the present invention utilizes the above-mentioned properties of silver acetylide to fix silver ions to a solid support and to capture terminal alkyne-containing molecules as silver acetylide on the solid phase, and silver acetylide is a halide ion, acid or Utilizing the property of easily reacting with a sulfur-containing reagent to regenerate a terminal alkyne-containing molecule, the terminal alkyne-containing molecule is eluted by regenerating the terminal alkyne-containing molecule from acetylide and concentrated and purified.
  • silica gel modified with the functional group of pKa2-9 examples include ethylcarboxylic acid-modified silica gel (for example, InertSep TM CBA (manufactured by GL Sciences)), propylcarboxylic acid-modified silica gel, Chromatorex COOH (manufactured by Fuji Silysia Chemical), ISOLUTE Carboxylic acid modified silica gels such as TM CBA (Biotage), 3-Carboxypropyl Silica Gel (Aldrich), SiliaMetS TM TAAcOH (SiliCycle), SiliaBond TM Carboxylic Acid (SiliCycle), etc .; Modified silica gel; 4-Ethylbenzene sulfoamide-f nctionalized silica gels (Aldrich) sulfonamide modified silica gel and the like.
  • ethylcarboxylic acid-modified silica gel for
  • the present invention has no particular problem as long as it is a functional group other than a thiol group that binds strongly to a metal with a high tolerance of the functional group present in the target alkyne-containing molecule and contaminants.
  • the present invention can also be applied when the product has an acidic functional group such as a carboxyl group, a basic functional group such as an amine or guanidine, or a thioether group. It can also be applied to a sample containing a thiol group such as a peptide by performing an alkylation treatment with iodoacetamide or the like in advance.
  • FIG. 1 shows an outline of a method for producing a silver-supported solid phase extraction column of the present invention and a method for concentrating and purifying alkyne-containing molecules using the silver-supported solid phase extraction column.
  • Alkyne-containing molecules eluted with ammonium acetate, ammonium carbonate, ammonium chloride, TFA, etc. can be directly analyzed with an analytical instrument such as LCMS.
  • an analytical instrument such as LCMS.
  • steps for desalting and removing excess reagents can be omitted. This point contributes to efficient recovery of alkyne-containing molecules.
  • a reverse phase carrier in which the surface of a silica gel-based or organic polymer-based insoluble carrier is modified with a nonpolar group (such as a long-chain alkyl group such as C18 ) can be used.
  • the reverse phase carrier may be porous.
  • An example of the device of the present embodiment includes a layer containing a silver-supported carrier (for example, a silver-supported carrier in which silver ions are supported on a carboxyl group anion (COO ⁇ ) of MacroPrep TM CM manufactured by Bio-Rad), and a reverse phase carrier It is a chip having a laminated structure including a layer containing (for example, MonoSpin TM C18 manufactured by GL Science). The liquid sample that has passed through the laminated structure can be held on the downstream side of the laminated structure.
  • the alkyne model phospholipid can be concentrated and purified efficiently even in the presence of lipids having various functional groups.
  • Example 6 Concentration purification and analysis of alkyne choline metabolite
  • metabolites in cells of alkyne molecules are concentrated and purified using alkynes that are metabolically incorporated into these metabolites. Since alkyne is small in size, molecules into which alkyne is introduced are often metabolized by intracellular metabolic enzymes and the like in the same manner as endogenous molecules. Therefore, it is possible to administer a precursor of a metabolite into which alkyne has been introduced to a cell and the like, concentrate and purify the metabolite by this technique, and perform structural analysis by a technique such as mass spectrometry.
  • a choline metabolite that is a lipid precursor is concentrated and purified.
  • the left column of FIG. 5 shows the results of selective detection of endogenous choline lipid (detection of a phosphocholine fragment of m / z 184.1), and the right column selectively shows choline lipid derived from propargylcholine. This is a result of detection (detection of a fragment of m / z 208.1).
  • choline lipid derived from propargylcholine accounted for about 44% of the total choline lipid.
  • the flow-through fraction only about 1% of propargylcholine lipid was detected, indicating that the column was efficiently captured on the column.
  • Example 7 Concentration purification from cellular enzyme digest of alkyne peptide
  • FIG. 6 shows the result of analysis by MALDI-TOF mass spectrometer (AutoflexSpeed manufactured by Bruker Daltonics) (overall image and enlarged view around BSA66alk). In the sample before purification with the alkyne purification column, many peaks derived from the cell extract digest were observed.
  • Monospin TM C18 (manufactured by GL Science) reverse-phase monolithic silica gel filter, 400 ⁇ L of isopropanol was added and centrifuged (2000 g, 2 minutes), then carboxylic acid-modified porous polymer carrier MacroPrep TM CM (manufactured by Bio-Rad) ) was added onto a 100 ⁇ L filter. After centrifugation under the same conditions, 300 ⁇ L of methanol was added and centrifuged again. 200 ⁇ L of a 90% methanol aqueous solution of 100 mM silver nitrate was added, mixed by pipetting, and incubated at room temperature for 3 minutes.
  • Measurement was performed using Ultimate 3000 (manufactured by Dionex) as liquid chromatography, TipColumn (manufactured by Nihon Technos) as a column and ionization unit, and LTQ-Orbitrap XL (manufactured by ThermoFisher) as a mass spectrometer. Measurement is performed in data-dependent acquisition mode, and peptide identification is performed using SearchGUI and PeptideShaker software. This was done using Tandem and the MS-GF + algorithm. In addition, the quantification of each identified peptide fragment was performed using Dinosaur software.
  • FIG. 7 shows the results of LC-MS / MS analysis of the sample before the treatment with the alkyne concentration and purification column and the sample subjected to the alkyne concentration and purification treatment.
  • the added alkyne peptide BSA66alk accounted for only 0.38% in terms of ion amount, but after concentration and purification, it was concentrated and purified to account for 86% of the identified peptide ions.
  • the alkyne peptide could be concentrated at a concentration rate of 226 times. It was also confirmed that the recovery rate of BSA66alk peptide was as high as 77%.

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Abstract

本発明は、銀イオンがカルボキシル基等のｐＫａ２～９の官能基を介して担持された不溶性担体を含有する、液体中の末端アルキン含有分子の濃縮精製用吸着剤；及び前記吸着剤に、末端アルキン含有分子を含む液体を接触させて、銀アセチリド形成反応により末端アルキン含有分子を捕捉する工程、及びハロゲン化物イオン、酸又は硫黄含有試薬により溶出する工程を含む、末端アルキン含有分子を濃縮精製する方法に関する。

Description

アルキン含有分子の濃縮精製方法
　本発明は、アルキン含有分子を濃縮精製する方法、並びにそのための銀担持担体及び器具又は装置に関するもので、特にアルキンを部分構造として含有する生体関連分子あるいは合成分子を複雑な混合物から濃縮精製するのに適した方法、並びにそのための担体及び器具又は装置に関するものである。
　特定の化学構造を持つ分子を濃縮精製する方法としては、抗原抗体反応を利用した免疫沈降法やアビジン－ビオチン相互作用を利用した方法、ＨｉｓタグとＮｉ固定化固相の相互作用を利用した方法が古くから利用されてきた。しかしながら、Ｈｉｓタグやビオチンはサイズが大きいタグであり、生理活性化合物や代謝物などの低分子化合物にタグとして導入することは望ましくない。また、抗体はタンパク質などの大きな分子に対しては有効であるが、アルキンを含めた小さな官能基や低分子化合物に対する抗体を作成するのは一般に容易ではなく、抗体がすでに作成された特定の低分子化合物を除き、低分子化合物の濃縮精製のための一般的な方法とはなりえない。更に、脂質やその代謝物のように、水溶液に溶けず、有機溶媒中で扱う必要がある化合物群には、抗体やアビジンといったタンパク質は有機溶媒中で変性するために使用できない。
　このような背景から、近年ではアルキンやアジドといった小さなタグを低分子化合物に導入し、後から銅触媒アジド－アルキン環化付加反応により二次的タグとしてビオチンやフルオラスタグなどを導入する方法が用いられるようになった。これにより、タグの大きさという問題は解決された。しかしながら、銅触媒を用いたタグの導入反応及び反応後の精製というステップが加わることで、プロセス全体としての簡便さ及び効率が低下するという問題がある。
　したがって、アルキンを直接的に濃縮精製する方法は、前記問題点を解決する方法となりうる。これまでに、ジコバルトオクタカルボニル錯体をホスフィン修飾したシリカゲルあるいはポリマー担体上に固定し、アルキンとコバルトの複合体形成反応を利用して、アルキン含有脂質、ペプチド、及びタンパク質を濃縮精製する方法が報告されている（非特許文献１～３）。非特許文献１及び２の方法では、タンパク質を使用しないことで、水溶液でも有機溶媒でも使用が可能である。一方で、非特許文献３の方法では、有機溶媒中での使用に限られ、更に、捕捉したアルキンを溶出する段階で酸化処理を必要とするため、酸化処理に弱い化合物群には適用できなかった。また、非特許文献１及び２の方法では、水溶液中での使用が可能で、酸で溶出することもできるが、プロパルギルカーバメート構造にのみ適用可能な方法であった。また、共通の問題点として、アルキン－コバルト錯体の形成反応が遅いことや、０価コバルトの不安定性や、コバルトと固相上のホスフィンの相互作用が弱いこと、一つのコバルトに対して二つ以上のホスフィンが配位すると錯体形成能がなくなるという問題があった。
　また、１９６０年代にステロイド分析の分野において、アルキンを含むステロイドが硝酸銀処理したフロリジルあるいはシリカゲル上で銀アセチリドを形成することで捕捉され、塩化アンモニウム処理による銀アセチリドの分解反応で溶出可能であることが報告されている（非特許文献４及び５）。この方法は非常に温和な条件であり、かつサンプルを前記担体を詰めたカラムに通すことで、サンプル中のエチニルステロイド（アルキンを含む合成ステロイドホルモン剤）を捕捉し、塩化アンモニウムを含む溶媒を通すことでエチニルステロイドを回収するという簡便かつ迅速な濃縮精製が可能である。しかしながら、この方法は有機溶媒中でのみ使用可能で、ステロイド以外のサンプルに適用された例はなく、１９８０年以降の引用は銀イオンクロマトグラフィーに関する分析分野での総説一報のみである（非特許文献６）。また、１９７９年にはスルホン酸修飾セルロース担体に銀イオンを担持し、エチニルステロイドを捕捉し、過剰のヘキシンあるいはアセチレンで溶出した例が報告されているが（非特許文献７）、こちらも有機溶媒中でのみ使用されている。この論文も、銀イオンクロマトグラフィーの分野においては稀に引用されてはいるが、ケミカルバイオロジーなど生命科学分野では認知されていなかった。なお、銀イオンクロマトグラフィーは、銀イオンと不飽和結合のパイ電子の配位結合能を利用し、低分子化合物を不飽和度の違いにより分離する手法である。
　前記の非特許文献４、５及び７における銀イオン担持固相を用いたアルキンの濃縮精製法は、有機溶媒中で行われており、その対象もステロイドに絞られていた。水やバッファーを含む条件においては、銀担持フロリジルやシリカゲルは銀イオンを安定に保持できず、銀イオンが溶出することが知られている。特に、脂質代謝物やペプチドなどの生体サンプルに適用する場合、これらの分子自体が銀イオンに配位する能力を有し、銀イオンを溶出させるため、濃縮精製は困難である。よって、先行文献でスルホン酸修飾セルロースが用いられたように、より強固に銀イオンを担体上に固定する必要があった。しかしながら、スルホン酸修飾した担体は強酸性陽イオン交換樹脂などに代表されるように、カチオン性の分子や中性条件でも容易にプロトン化して陽電荷を持つ塩基性化合物の吸着に広く用いられている。つまり、カチオン性化合物や塩基性化合物はアルキンの有無にかかわらず担体に吸着され、アルキン選択的な濃縮精製の障害となるという問題がある。
　金属イオンを担持・トラップする方法としては、前記アルキン－コバルト錯体の例で用いられるようなホスフィンを配位子として用いる方法もある。また、スカベンジャーレジンとして市販されているような、チオールやチオアミド、カルボン酸、アミン類で修飾した担体が、溶液中の金属イオンをトラップして除去する目的で一般に使用されている。しかしながら、これら銀イオンの配位子として働く官能基が銀イオンのアセチリド形成反応に与える影響は精査されていない。前記の非特許文献４、５及び７にも、担体上の官能基の配位子としての影響と銀アセチリド形成反応の効率の関係に関しては記載も示唆もなく、これらの担体が前記の非特許文献４、５及び７のフロリジルやシリカゲル、スルホン酸修飾セルロースと同様に使用可能であるのかも不明であった。
　関連する先行技術として、カルボン酸修飾ポリマーに銀イオンを担持したものを用いて、ガス中に含まれるアセチレンを除去するプロセスが報告されている（特許文献１）。しかしながら、低極性のガス中に含まれるアセチレンの除去のみに適用したものであり、この担体が溶液中で使用可能か、不明であった。使用後のフィルターは、希硝酸処理をすることでアセチレンガスと銀イオンを除去し、再度銀イオンを担持して再利用可能であることを報告しているが、このように強酸性かつ酸化的条件は、生体分子などには使用できないことが容易に予想される。
　このように、銀イオン担持固相を用いたアルキンの濃縮精製法は、ステロイド分析及びガス中のアセチレンの除去の分野において１９６０から１９７０年代にかけて研究されていたが、応用対象は有機溶媒中のステロイドあるいはガス中のアセチレンに限られていた。また、化学的な見地から系統的な最適化はされておらず、溶媒や官能基許容性といった適用範囲に関しても精査されていなかった。
　特許文献２には、イオン交換によって銀が担持されていることを特徴とする銀担持シリカゲルが記載されているが、この銀担持シリカゲルは、特にテルペン類や不飽和脂肪酸の分離を目的とするものであり、特許文献２はアセチレン等のアルキン類については何ら言及していない。また、この銀担持シリカゲルは、スルホン酸やカルボン酸で修飾したものではなく、銀は表面シラノール基に水素とイオン交換されて結合されていると記載されている。
米国特許第３，２７３，３１４号明細書 特開平５－３１７６９９号公報
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　本発明の課題は、水溶液系を含めた幅広い溶媒系において、幅広いアルキン含有分子を温和な条件で迅速かつ高効率に濃縮精製する方法を提供することである。
　前記課題を解決するためには、アルキンを銀アセチリドとして担体上に捕捉するための銀イオンの反応性を損なうことなく、溶媒やバッファーにより銀イオンが溶出しないよう強く銀イオンを担持することが必要である。このような観点から、本発明者らはまず、各種官能基化された担体を用いて、銀イオンを担持する能力と担体上での銀アセチリド形成能を精査し、担体と銀を担持する官能基の最適化を行った。鋭意検討の結果、銀イオンの担持力が強いだけではアルキン含有分子を濃縮精製するという目的には不十分であり、この目的に適した担体が存在することを見出した。この知見に基づき、有機溶媒のみならず水溶液系でも使用可能かつ細胞等由来の脂質代謝物やペプチドなどに適用可能な、アルキン含有分子の選択的な濃縮精製手法を確立し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）銀イオンがｐＫａ２～９の官能基を介して担持された不溶性担体を含有する、液体中の末端アルキン含有分子の濃縮精製用吸着剤。
（２）ｐＫａ２～９の官能基がカルボキシル基、リン酸基又はスルホンアミド基である前記（１）に記載の吸着剤。
（３）前記不溶性担体が、銀イオンがカルボキシル基を介して担持されたシリカゲル系又は有機ポリマー系担体である前記（１）に記載の吸着剤。
（４）前記（１）～（３）のいずれかに記載の吸着剤を用いた末端アルキン含有分子の濃縮精製用の器具又は装置。
（５）銀イオンがカルボキシル基を介して担持されたシリカゲルと、チオール又はチオウレアで修飾されたシリカゲルが二層構造で用いられている前記（４）に記載の器具又は装置。
（６）複数の層を有し、少なくとも一層が前記（１）～（３）のいずれかに記載の吸着剤を含有し、及び少なくとも一層が逆相担体を含有する前記（４）又は（５）に記載の器具又は装置。
（７）器具又は装置が固相抽出カラム、キット、フィルター又はチップである前記（４）～（６）のいずれかに記載の器具又は装置。
（８）前記（１）～（３）のいずれかに記載の吸着剤に、末端アルキン含有分子を含む液体を接触させて、末端アルキン含有分子を捕捉する工程、及びハロゲン化物イオン、酸又は硫黄含有試薬により溶出する工程を含む、末端アルキン含有分子を濃縮精製する方法。
（９）前記（４）～（７）のいずれかに記載の器具又は装置を用いる前記（８）に記載の方法。
（１０）末端アルキン含有分子を含む液体における溶媒が有機溶媒又は水系溶媒である前記（８）又は（９）に記載の方法。
　本発明によれば、温和な条件かつ実用的な収率と簡便さで液体中の末端アルキン含有分子の濃縮精製が可能になる。これまで銅触媒アジド－アルキン環化付加反応などにより間接的に濃縮精製を行っていたサンプルが、直接的に濃縮精製可能になる。特に、抗体やアビジン－ビオチンを用いた濃縮精製が適用できず、かつ酸や酸化条件に弱い脂質サンプルに対しては非常に有効な方法となる。
　末端アルキンを含む前駆体から代謝されて生じる代謝物群の網羅的解析や、アルキン化低分子化合物が結合するタンパク質とその結合部位の同定に加えて、特定の官能基と選択的に反応するアルキン化プローブを用いることで、特定の官能基を持つ内在性分子群の濃縮精製・解析が可能となる。
　また、末端アルキン含有分子の精製法としても利用可能である。通常の順相・逆相クロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィー等、一般的な分離法で精製が困難な場合でも、末端アルキン含有分子を選択的に単離・精製することが可能である。よって、分析用途のみならず、有機合成における産物や酵素あるいは生物を利用した合成産物の精製など、末端アルキン含有分子の調製目的にも有用である。
図１は本発明の末端アルキン含有分子の濃縮精製法及び器具又は装置の一例を示す。 図２は官能基許容性を示す。 図３は末端アルキン含有ペプチドの濃縮精製におけるカルボン酸修飾シリカゲル（ＣＯＯＨシリカゲル）とスルホン酸修飾シリカゲル（ＳＯ３Ｈシリカゲル）の比較を示す。 図４は末端アルキン含有リン脂質の細胞脂質抽出物からの濃縮精製の結果を示す。 図５は末端アルキン含有コリンの細胞中での代謝産物の濃縮精製の結果を示す。 図６は末端アルキン含有ペプチドの培養細胞酵素消化物からの濃縮精製の結果を示す。 図７は銀担持担体と逆相担体を組み合わせたスピンカラムを用いたアルキン化ペプチドの濃縮精製の結果を示す。
　末端アルキン構造、すなわちエチニル基（Ｈ－Ｃ≡Ｃ－）を有する化合物は、銀イオン、銅イオン、金イオン等の金属イオンと反応して、金属アセチリドを形成する。金属アセチリドのうち、銀アセチリドは反応性が低いため、有機合成における応用例（反応）は限られているが、液体中で速やかに形成され、安定で単離も可能である。
　本発明は、前記の銀アセチリドの性質を利用して、銀イオンを固相担体に固定し、固相上に末端アルキン含有分子を銀アセチリドとして捕捉するとともに、銀アセチリドはハロゲン化物イオン、酸又は硫黄含有試薬と容易に反応し、末端アルキン含有分子を再生するという性質を利用し、アセチリドから末端アルキン含有分子を再生することで溶出させ、末端アルキン含有分子を濃縮精製するものである。
　本発明は、銀イオンがｐＫａ２～９の官能基を介して担持された不溶性担体を含有する、液体中の末端アルキン含有分子の濃縮精製用吸着剤を提供する。
　銀イオンを担持するために使用する官能基のｐＫａが２未満であると、正電荷を帯びやすい塩基性化合物は強く吸着され、溶出しにくくなり、一方、前記官能基のｐＫａが９を超えると、銀イオンを担持する効果が低くなる。
　本願明細書において、「ｐＫａ」とは、化学便覧（ＩＩ）（改訂４版、１９９３年、日本化学会編、丸善株式会社）に定義されている「酸解離定数Ｋａの逆数の対数値」を指す。
　ｐＫａ２～９の官能基としては、例えばカルボキシル基（カルボン酸基）（ｐＫａ：３～５程度）、リン酸基（ｐＫａ：２～７程度）、スルホンアミド基（ｐＫａ：４～９程度）が挙げられ、ｐＫａ３～５の官能基が好ましい。
　本発明に用いる不溶性担体としては、ｐＫａ２～９の官能基、例えばカルボキシル基（カルボン酸基）、リン酸基又はスルホンアミド基で修飾できるものであれば、制限はなく、通常に、好ましくはクロマトグラフィー用として、市販されているものを用いることができ、例えばシリカゲル、活性アルミナ、活性炭、セルロース、樹脂（例えば、アンバーライトＴＭ、ポリスチレン、スチレンジビニルベンゼン共重合体、メタクリレート系共重合体）が挙げられる。水・有機溶媒どちらにも使用可能な汎用性の高い担体を用いるのが好ましく、汎用性の高い担体の例には、シリカゲルが含まれる。
　ｐＫａ２～９の官能基で修飾されたシリカゲルとしては、エチルカルボン酸修飾シリカゲル（例えば、ＩｎｅｒｔＳｅｐＴＭＣＢＡ（ジーエルサイエンス社製））、プロピルカルボン酸修飾シリカゲル、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ　ＣＯＯＨ（富士シリシア化学社製）、ＩＳＯＬＵＴＥＴＭＣＢＡ（バイオタージ）、３－カルボキシプロピルシリカゲル（アルドリッチ）、ＳｉｌｉａＭｅｔＳＴＭＴＡＡｃＯＨ（ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ）、ＳｉｌｉａＢｏｎｄＴＭＣａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ（ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ）等のカルボン酸修飾シリカゲル；Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｅｔｈｙｌ／ｂｕｔｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ｓｉｌｉｃａ（アルドリッチ）等のリン酸修飾シリカゲル；４－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ　ｓｕｌｆｏａｍｉｄｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌｓ（アルドリッチ）等のスルホンアミド修飾シリカゲルが挙げられる。
　シリカゲル以外の不溶性担体を用いた、ｐＫａ２～９の官能基で修飾されたポリマー担体としては、例えば、カルボン酸修飾された多孔性ポリマー担体ＭａｃｒｏＰｒｅｐＴＭＣＭ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＣＭ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｃｅｒａｍｉｃ　ＨｙｐｅｒＤＴＭＣＭ（Ｐａｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＴＭＣＭ－６５０Ｓ（Ｔｏｓｏｈ社製）が挙げられる。
　本発明に用いる不溶性担体の形状としては、球状、破砕状、モノリス、繊維状等のいずれの形態でもよい。粒子径、細孔径、比表面積は、その用途に応じて適したものを選択すればよいが、平均粒子径として３μｍ～１ｍｍ、細孔径として３０Å～５０００Åのものが使用可能である。一般用途としては、細孔径６０Å～１５０Åのものが通常使用される。平均粒子径としては、高速液体クロマトグラフィー用には、５μｍ～１０μｍのものが、カラムクロマトグラフィー用には、５０μｍ～１００μｍのものが通常使用される。
　本発明に用いるカルボン酸修飾シリカゲルのカルボキシル基密度は、通常０．２～２ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは０．６～１．５ｍｍｏｌ／ｇである。
　カルボン酸修飾シリカゲル等への銀イオンの担持は、水系溶媒、例えば、水又は、エタノール、メタノール、プロパノール、アセトニトリル及びジオキサンの１種類以上が水と混合してなる溶媒中、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等のアンモニウム塩、水酸化ナトリウム等で処理して、カルボン酸修飾シリカゲルにおけるカルボン酸をアンモニウム型又はナトリウム型に変換した後、銀化合物溶液と接触させることにより行うことができる。
　銀化合物としては、水溶性で、化合物中の陰イオンが、銀担持後容易に除去できるものであれば特に制限はなく、例えば、硝酸銀、塩素酸銀、亜硝酸銀等が使用できるが、特に安定性が高く、水溶性の高い硝酸銀が好ましい。
　溶媒、特に水系溶媒やバッファーによる銀イオンの溶出を防止する点から、カルボン酸修飾シリカゲルと、チオール又はチオウレアで修飾されたシリカゲルとを二層構造で組合せることが好ましい。
　チオール修飾シリカゲルとしては、例えば、３－メルカプトプロピルシリカゲル（バイオタージ社製ＩＳＯＬＵＴＥＴＭＳｉ－Ｔｈｉｏｌや東京化成社製３－Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ）、２，４，６－トリメルカプトトリアジンシリカゲル（バイオタージ社製ＩＳＯＬＵＴＥＴＭＳｉ－ＴＭＴ）が挙げられる。
　チオウレア修飾シリカゲルとしては、例えば、ＳｉｌｌａＭｅｔＳＴＭＴｈｉｏｕｒｅａ（ＳｉｌｌｉＣｙｃｌｅ）が挙げられる。
　なお、銀イオンの混入が問題にならない場合や、非極性溶媒中でバッファー等を用いない場合は、チオール又はチオウレアで修飾されたシリカゲルを使用する必要はない。
　細胞抽出物などをプロテアーゼで分解して得られるペプチド混合物のように、逆相担体を用いて脱塩処理後、質量分析法による解析を行う場合には、アルキン化ペプチドの濃縮精製の工程とその後の逆相担体の脱塩処理を一つのスピンカラムで行って、吸着によるサンプルのロスを抑えるため、銀担持担体（例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製ＭａｃｒｏＰｒｅｐＴＭＣＭ）と、逆相担体（例えば、ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製ＭｏｎｏＳｐｉｎＴＭＣ１８）とを二層構造で組合せることが好ましい。
　本発明の対象となるアルキン含有分子は、液体中の末端アルキン含有分子である。したがって、アセチリドを形成しない内部アルキン含有分子は本発明の対象から除外される。
　スルホン酸修飾シリカゲル（ｐＫａ：－３～－２程度）は強く負に帯電しており、陽イオン交換作用が強いため、正電荷を帯びやすい塩基性化合物は強く吸着され、溶出できないが、ｐＫａ２～９の官能基、例えばカルボキシル基（カルボン酸基）、リン酸基又はスルホンアミド基で修飾された不溶性担体を用いる本発明の吸着剤は陽イオン交換作用が弱く、酸性度も低いため、塩基性化合物、例えば、アミン、グアニジン類にも適用でき、アミノ酸誘導体（例えば、アルキンを有するアミノ酸、アルキンとともに、グアニジン、イミダゾール基等の塩基性基及び／又は後述の極性基を１以上有するアミノ酸誘導体）、脂質代謝物や水溶性代謝物、ペプチド、リン脂質、糖脂質等の複合脂質などの生体由来のサンプルへの適用にも適している。
　本発明の対象となるアルキン含有分子としては、特に制限はなく、前記の塩基性化合物（例えば、アミン、グアニジン類）の他、カルボニル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、シアノ基、ニトロ基、スルホンアミド基等の極性基を有する化合物にも適用することができる。
　末端アルキン含有分子を含む液体における溶媒としては、特に制限はなく、有機溶媒に限らず、水系溶媒、例えば、水又は、エタノール、メタノール、プロパノール、アセトニトリル及びジオキサンの１種類以上が水と混合してなる溶媒のいずれでもよく、また、水と水非混和性有機溶媒との混合溶媒も使用することができる。
　本発明は、対象となるアルキン含有分子及び夾雑物中に存在する官能基の許容性が高く、金属に強く結合するチオール基以外の官能基であれば、特に問題はなく、アルキン含有分子又は夾雑物がカルボキシル基等の酸性官能基、アミン、グアニジン類等の塩基性官能基、チオエーテル基を有する場合にも適用できる。ペプチドなどのチオール基を含むサンプルに対しても、ヨードアセトアミドなどによるアルキル化処理をあらかじめ行うことで、適用可能である。
　但し、末端アルキン含有分子を含む液体がハロゲン化物イオンを含む場合や、酸性条件（ｐＨ＜５）は避けることが好ましい。
　本発明は、本発明の吸着剤を用いた末端アルキン含有分子の濃度精製用器具又は装置にも関する。本発明の器具又は装置としては、末端アルキン含有分子を濃縮精製するための器具又は装置であれば、特に制限はなく、例えば、固相抽出カラム、キット、フィルター、チップ等の態様が挙げられる。本発明の器具の一例は、本発明の吸着剤を含有する層が、分離可能もしくは不可能に内部に固定されたチップである。当該チップは、前記層を通過した液状試料を保持する底部を有する。当該チップは、そのまま遠心分離機用のチップとして利用可能な大きさ及び形状であってもよい。　
　本発明の銀担持固相抽出カラムの作成方法、及び前記銀担持固相抽出カラムを用いたアルキン含有分子の濃縮精製方法の概要を図１に示す。
　例えば、ガラス製パスツールピペット、プラスチック製のシリンジ・チップ、スピンカラム等のカラム類の細くなった部分に少量の脱脂綿、グラスウール、フィルター等を詰め、溶媒（例えば、メタノール）を加え、そこにチオウレア修飾シリカゲルを溶媒（例えば、メタノール）に懸濁したものを加え、カルボン酸修飾シリカゲルを同様に加え、シリカゲルを二層に積み重ね、次いで少量の脱脂綿、グラスウール、フィルター等をシリカゲル層の上に敷き、溶媒（例えば、メタノール）で洗浄する。次いで、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等のアンモニウム塩、又は水酸化ナトリウムを含有する水系溶媒で処理して、カルボン酸修飾シリカゲルにおけるカルボン酸をアンモニウム型又はナトリウム型に変換後、銀化合物を含有する水系溶媒と接触させた後、溶媒（例えば、メタノール）で洗浄して、銀担持固相抽出カラムを作成する。
　本発明のアルキン含有分子の濃縮精製方法においては、本発明の吸着剤に、末端アルキン含有分子を含む液体を接触させて、銀アセチリド形成反応により末端アルキン含有分子を捕捉した後、ハロゲン化物イオン、酸又は硫黄含有試薬により溶出することにより、末端アルキン含有分子を濃縮精製することができる。
　ハロゲン化物イオン源としては、塩化物（例えば、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム）、臭化物（例えば、臭化アンモニウム、臭化ナトリウム）、ヨウ化物（例えば、ヨウ化アンモニウム、ヨウ化ナトリウム）が挙げられる。また、ペプチドなど、通常酸性条件で扱うサンプルに対しては、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）など、酸により溶出することも可能である。更に、前記試薬が好ましくない場合は、硫化ナトリウム、チオウレア、ジチオスライトール、メルカプトエタノール等の硫黄含有試薬により溶出することも可能である。
　溶出に用いる試薬として塩化アンモニウムを用いれば、揮発性塩で済むため、溶出液を質量分析計に直接導入して測定することができる。
　溶媒として水系溶媒を用いる場合、アルキン含有分子の捕捉も溶出も、酢酸アンモニウムバッファーや炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７～８）中など、中性条件で行うことが可能である。また、目的に応じて室温、非酸化条件という温和な条件で液体中の末端アルキン含有分子の濃縮精製が可能になる。
　酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ＴＦＡなどで溶出したアルキン含有分子は、ＬＣＭＳなどの分析機器で直接分析することが可能である。本手法では、クリックケミストリーやビオチンを用いた方法と異なり、脱塩や余剰の試薬を除去するステップを省くことができる。この点は、アルキン含有分子の効率的な回収に寄与する。
　本発明の器具又は装置の一態様は、積層構造を有し、少なくとも一層が本発明の吸着剤を含有し、及び少なくとも一層が逆相担体を含有する態様である。試料を注入する側を上流とした場合、本発明の吸着剤を含有する層が、前記逆相担体を含有する層と比較して、より上流に配置されているのが好ましい。本態様の器具又は装置によれば、試料中のアルキン含有分子を本発明の吸着剤に吸着させ、濃縮し、その後、濃縮したアルキン含有分子を吸着剤から溶出させる際に、より下流に存在する逆相担体を含有する層を通過させることで、脱塩処理等を行うことができる。例えば、細胞抽出物をプロテアーゼ（例えばトリプシン）で分解して得られるペプチド混合物は、質量分析等の解析を行う前に、脱塩処理する必要がある。本実施態様の器具又は装置によれば、アルキン化ペプチドの濃縮精製と質量分析のために必要な脱塩処理等を同時に行うことができるので、試料が微量であっても実効性のある試料調製が可能である。本発明の吸着剤と組み合わせて使用可能な逆相担体については特に制限はない。例えば、シリカゲル系又は有機ポリマー系不溶性担体の表面を、非極性基（Ｃ１８等の長鎖アルキル基等）で修飾した逆相担体等を用いることができる。また当該逆相担体は、多孔性であってもよい。本実施の形態の器具の一例は、銀担持担体（例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製ＭａｃｒｏＰｒｅｐＴＭＣＭのカルボキシル基アニオン（ＣＯＯ－）に銀イオンを担持した銀担持担体）を含む層と、逆相担体（例えば、ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製ＭｏｎｏＳｐｉｎＴＭＣ１８）を含む層とを有する積層構造を内部に有するチップである。前記積層構造のより下流側には、該積層構造を通過した液状試料を保持可能に構成されている。
　以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例の範囲に限定されるものではない。
［実施例１：銀担持固相抽出カラム作成及び使用例］
　ガラス製パスツールピペットを用いたアルキン濃縮精製カラムの作成例を示す（図１参照）。
　ガラス製パスツールピペットの細くなった部分に少量の脱脂綿を詰め、先をガラスカッターで切断した。メタノール５００μＬをパスツールピペットに加え、そこに２０ｍｇのチオウレア修飾シリカゲル（ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ社製ＳｉｌｉａＭｅｔＳＴＭＴｈｉｏｕｒｅａ）をメタノール５００μＬに懸濁したものを加えた。メタノール５００μＬで壁面に付着したシリカゲルを落とし、６０ｍｇのカルボン酸修飾シリカゲル（富士シリシア化学社製ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　ＣＯＯＨ、ＭＢ１００－７５／２００）を同様に加え、シリカゲルを二層に積み重ねた。同様に壁面に付着したシリカゲルを落とし、少量の脱脂綿をシリカゲル層の上に敷き、メタノール５００μＬで洗浄した。１００ｍＭ酢酸アンモニウム－９０％メタノール水溶液を４００μＬ加え、カルボン酸をアンモニウム型へ変換した。メタノール５００μＬで洗浄後、１０ｍＭ硝酸銀－９０％メタノール水溶液を２００μＬ加えた。最後に、メタノール５００μＬで洗浄することで、アルキン濃縮精製カラムを完成させた。
　チオウレア修飾シリカゲルは、銀イオンの溶出を防ぐために使用するが、銀イオンの混入が問題にならない場合や、非極性溶媒中でバッファー等を用いない場合は、省略することができる。
　次に、アルキン濃縮精製の具体的な手順を示す（図１参照）。
　使用するサンプルを溶解した溶媒（下記実施例で示す脂質サンプルに対しては、７．５ｍＭ酢酸アンモニウムを添加したイソプロパノール－メタノール－クロロホルム（４：２：１）を使用している）５００μＬで洗浄後、サンプル１ｍＬをカラムに通し、素通り画分を回収した。同溶媒で洗浄後、１０ｍＭ塩化アンモニウムを加えた溶媒２２０μＬを通し、続いて溶媒７８０μＬを流し、１ｍＬの溶出画分を回収する。なお、本実施例においては、すべての画分を１ｍＬに揃えているが、より濃度の高い状態で溶出したい場合は、適宜量を減らすことが可能である。
　なお、Ａｇとアルキンで処理したシリカゲルからのラマンシグナルにおいて、アルキンそのものの振動数（２１２０ｃｍ－１）は検出されず、別途調製した銀アセチリドとほぼ同じ振動数（２０２６ｃｍ－１）にシグナルが検出されたことから、アルキンが銀アセチリドとしてトラップされていることを確認した。
［実施例２：担体の比較］
　アルキン濃縮精製に適した担体をスクリーニングするため、各種シリカゲル等担体を用いて実施例１と同様にしてカラムを作成し、アルキン含有モデル化合物（Ｎ－プロパルギルダンシルアミド）を５０％イソプロパノール水溶液に溶解したサンプルを用いて、銀の担持力及びアルキンの濃縮精製効率を調べた。各画分中のモデル化合物の量は、薄層クロマトグラフィー上での蛍光検出により定量し、銀イオンの各画分への溶出は薄層クロマトグラフィー上で４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンで染色することで調べた。検討結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示した固相担体の詳細、並びに銀の担持能力、アルキンの濃縮精製効率及びバッファー・極性溶媒耐性の判定基準は以下のとおりである。
（固相担体）
Ｎｏｒｍａｌ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌｓ：無修飾のシリカゲル；関東化学社製シリカゲル６０Ｎ（粒子径１００－２１０μｍ）
Ｃ８（ｏｃｔｙｌ）：オクチル基修飾シリカゲル；和光純薬社製ワコーゲルＴＭ５０Ｃ１８（破砕状、粒子径４０－６３μｍ）
ＳＯ３Ｈ：スルホン酸修飾シリカゲル；富士シリシア化学社製ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　ＳＯ３Ｈ、ＭＢ１００－７５／２００（粒子径７５－２００μｍ、平均細孔径１００Å）Ｃｙａｎｏ：シアノプロピル基修飾シリカゲル；ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ社製ＳｉｌｉａＢｏｎｄＴＭＣｙａｎｏ（粒子径４０－６３μｍ、平均細孔径６０Å、比表面積５００ｍ２／ｇ、修飾密度１．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
Ｄｉｏｌ：富士シリシア化学社製ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　Ｄｉｏｌ、ＭＢ１００－７５／２００（粒子径７５－２００μｍ、細孔径１００Å）
ＮＨ２：アミノプロピル修飾シリカゲル；関東化学社製、シリカゲル６０（球状）ＮＨ２（粒子径４０－５０μｍ、平均細孔径６４Å、比表面積７３０ｍ２／ｇ）
－ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２：関東化学社製Ｒ－Ｃａｔ－Ｓｉｌ　ＴＡ（修飾密度１．０ｍｍｏｌ／ｇ）
Ｃｅｌｉｔｅ ５４５：バイオタージ社製ＣｅｌｉｔｅＴＭ５４５
Ｆｌｏｒｉｓｉｌ：US Silica社製フロリジル
ＣＯＯＨ：カルボン酸修飾シリカゲル；富士シリシア化学社製ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　ＣＯＯＨ、ＭＢ１００－７５／２００（粒子径７５－２００μｍ、平均細孔径１００Å）Ｔｈｉｏｕｒｅａ：ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ社製ＳｉｌｉａＭｅｔＳＴＭＴｈｉｏｕｒｅａ（粒子径４０－６３μｍ、平均細孔径６０Å、修飾密度１．０ｍｍｏｌ／ｇ）
Ｔｈｉｏｌ：東京化成社製3-Mercaptopropyl silica gel（０．５－０．８ｍｍｏｌ／ｇ）
Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ：ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ社製ＳｉｌｉａＭｅｔＳＴＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ（粒子径４０－６３μｍ、平均細孔径６０Å、修飾密度１．２ｍｍｏｌ／ｇ
Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ：アルドリッチ社製3-(1-Piperazino)propyl functionalized silica gel（４０－７５μｍ、０．８ｍｍｏｌ／ｇ）
Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ：アルドリッチ社製2-Diphenylphosphinoethyl-functionalized silica gel（４０－７５μｍ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ）
ＴＡＡｃＯＨ（ＥＤＴＡ型）：ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ社製ＳｉｌｌｉａＭｅｔＳＴＭＴＡＡｃＯＨ（粒子径４０－６３μｍ、平均細孔径６０Å、修飾密度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）
（銀の担持能力の判定基準）
強：銀イオン担持時の素通り画分において、４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの明確な発色反応がない。
中：銀イオン担持時の素通り画分において、４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの発色反応がみられる。
弱：銀イオン担持時の素通り画分において、４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの明確な発色が観察される。
無：銀イオン担持時の素通り画分において、４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの明確な発色が観察され、かつその後のバッファーを用いた洗浄などにおいては発色が観察されない（銀イオンが担持されていないことが疑われる場合）。
（アルキンの濃縮精製効率の判定基準）
良：アルキン化ダンシルアミドは、素通り及び洗浄画分には５％以下、溶出画分において９０％以上回収されている。
可：アルキン化ダンシルアミドが、素通り及び洗浄画分に５％以上検出されているが、溶出画分に４０％以上回収されている（溶出条件への切り替えに応じてアルキン化ダンシルアミドが溶出している）。
不可：前記以外。アルキン化ダンシルアミドが素通り及び洗浄画分に検出されるとともに、溶出条件に切り替えることで溶出が始まるという挙動が見られない。
（バッファー・極性溶媒耐性の判定基準）
強：素通り及び洗浄画分に銀イオンによる４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの明確な発色反応が見られない。
中：素通り及び洗浄画分に４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの発色反応が見られる。
弱：素通り及び洗浄画分に４－ジメチルアミノベンジリデンロダニンの発色反応が強く見られ、速やかに銀イオンが溶出されている。
　検討の結果、カルボン酸修飾シリカゲルにおいて、良好な銀イオンの保持と良好なアルキンの濃縮精製効率が両立できることが明らかとなった。スルホン酸修飾シリカゲルも銀イオンを強く保持し、アルキンの濃縮精製も良好であったが、担体の酸性度が高く酸に弱い化合物に使用できない点で望ましくない。また、スルホン酸修飾シリカゲルは強く負に帯電しており、陽イオン交換作用が強い。そのため、正電荷を帯びやすい塩基性化合物は強く吸着され、溶出できないことが分かった。一方、カルボン酸修飾シリカゲルは陽イオン交換作用が弱く、酸性度も低いため、生体由来のサンプルへの適用に適している。
　無修飾のシリカゲルやフロリジル、セライトといった担体は、銀イオンの担持量が少なく、かつ極性溶媒やバッファー（酢酸アンモニウムなど）により銀が容易に溶出することが分かった。また、各種アミン修飾シリカゲルは、銀イオンの担持能力は高いものの、アルキンの捕捉効率が低いことが明らかとなった。硫黄含有官能基を有するシリカゲルも同様に、銀イオンの担持能力は高いが、アルキンの捕捉能力が低いことが分かった。
［実施例３：各種官能基を有するアミノ酸誘導体混合物からのアルキン化アミノ酸の濃縮精製］
　各種官能基を有するアミノ酸誘導体（Ｆｍｏｃ保護体）の混合物から、アルキン含有アミノ酸を濃縮精製した例を示す（図２参照）。サンプルとしては、７．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む５０％イソプロパノール－水混合溶媒中に２５μＭで溶解したものを使用し、前記で説明したアルキン濃縮精製用カラムに通し、同溶媒にて洗浄後、１０ｍＭヨウ化ナトリウムにて溶出を行った。検出は、逆相液体クロマトグラフィー及びＵＶ検出器を用いて行った。なお、溶出に用いる方法は、その後の分析に影響を与えないものを適宜選択することができる。
　濃縮精製前の溶液、カラムからの素通り画分と洗浄画分、そして溶出画分を分析したところ、アルキンを有するプロパルギルグリシン（ＰｒｇＧｌｙ）以外のアミノ酸誘導体は素通り・洗浄画分に観測され、溶出画分に良好な収率でＰｒｇＧｌｙが濃縮精製されたことが確認された。特に、金属イオンに対して配位能を持つイミダゾールやチオエーテル、アミン、グアニジンなどの官能基を有するアミノ酸誘導体も問題なく洗浄されており、官能基許容性が高いことが示された。ただし、更なる検討の結果、ジスルフィド結合を有するアミノ酸誘導体も容易に洗浄可能であることがわかったが、チオールに関しては銀イオンに対して非常に強く結合するため、洗浄は困難であることも明らかとなった。この結果より、本発明の方法をペプチドや水溶性代謝物など、チオールを含みうる試料に対して用いる場合は、ジスルフィド結合を形成した状態で処理するか、あるいは、ヨードアセトアミド等によるキャッピング処理をする必要がある。タンパク質の質量分析においては、通常このようなキャッピング処理を行うことから、ケミカルバイオロジー分野における応用には大きな問題はないと考えられる。
［実施例４：アルキン化ペプチドの濃縮精製への適用例］
　前記実施例において、ペプチドに含まれうる各種官能基存在下においてもアルキン含有分子を濃縮精製できることを示した。本実施例では、アルキン含有モデルペプチドを濃縮精製した例を示す。
　図３に示すように、牛血清アルブミンのトリプシン消化物由来のペプチドをモデルペプチドとし、末端アルキン構造を導入したペプチドをアルキン化モデルペプチドとして調製し、それらの混合物からアルキン化ペプチドを選択的に濃縮精製できるか検討を行った。両ペプチドを１μＭの濃度で７．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む２５％イソプロパノール・水混合溶媒に溶解し、実施例１で作成した、銀イオン担持カルボン酸修飾シリカゲルを充填した固相抽出カラムに通し、同溶媒にて洗浄後、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む同溶媒にて溶出し、液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、図３に示すように、末端アルキン構造を含まないペプチドは素通り・洗浄画分に回収され、アルキン含有ペプチドは溶出画分にほぼ定量的に回収された。この結果より、本発明は、ペプチドに対しても適用可能であることが示された。なお、ペプチドは一般的に溶解性が高いＴＦＡあるいはギ酸を含む溶液で扱うのが一般的であり、同程度の濃度のＴＦＡで溶出できることは、濃縮精製後にバッファー交換や脱塩処理を省くことができるという利点になる。このように、溶出にハロゲン化物塩を用いるか、酸を用いるかは、試料に応じて適したものを選ぶことができる。
［実施例５：アルキン化リン脂質の細胞脂質抽出物からの濃縮精製］
　本実施例では、本発明の方法が複雑な脂質混合物（培養細胞の脂質抽出物）の中から、アルキン化リン脂質(Hexynoyl PE, from avanti polar lipids)を濃縮精製できることを示す。
　細胞の総脂質の抽出は、Matyashらの報告した方法により行った（J Lipid Res 49: 1137-1146, 2008）。抽出した細胞の脂質抽出物を７．５ｍＭ酢酸アンモニウム－イソプロパノール－メタノール－クロロホルム（４：２：１）混合溶媒（以下、ＡｍＡｃ－ＩＭＣと呼ぶ）に溶解し、アルキン化リン脂質であるHexynoyl PEを１μＭの終濃度で添加した。この溶液１ｍＬを実施例１の方法で作成したアルキン濃縮精製カラムに通し、１ｍＬのＡｍＡｃ－ＩＭＣで２回洗浄後、１０ｍＭの塩化アンモニウムを含むＡｍＡｃ－ＩＭＣ（３００μＬ）、ついでＡｍＡｃ－ＩＭＣ（７００μＬ）で溶出し、合わせた１ｍＬを溶出画分として回収した。
　回収した各画分は、直接質量分析による解析に供した。具体的には、５μＬのサンプルをｎａｎｏＳｐｒａｙＴｉｐ（ＨＵＭＡＮＩＸ）を用いて、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ（Thermo Fischer Scientific）でネガティブモードで測定した。脂質種の同定は、data-dependent acquisitionモードにより測定したＭＳ／ＭＳスペクトルより、ＬｉｐｉｄＸｐｌｏｒｅｒソフトウェアを用いて行った（Genome Biol. 12: R8, 2011）。得られたスペクトルを図４に示した。
　細胞由来の複合脂質は、主にｍ／ｚ　６００－９００の範囲に観測され、その中にはホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）など、様々な官能基を持った脂質種が含まれる（主なピークの一部には同定された脂質種を示した）。また、脂質を構成する脂肪酸鎖としては、主に炭素数１４から２２の脂肪酸が含まれ、二重結合の数も主に０から５程度の脂肪酸が含まれている。濃縮精製前のサンプルのスペクトルでは、モデル脂質であるHexynoyl PEのピーク（ｍ／ｚ　７８４．５５）の他に、多数の脂質種が観測されている。これをアルキン濃縮精製カラムに通した素通り画分においては、Hexynoyl PEがカラムに捕捉されたためにこのピークは観測されない。一方、溶出画分においてはHexynoyl PEのピークが強く検出され、他の脂質群の大部分が除去されていることが確認できる。このように、本発明を用いることで、様々な官能基を持つ脂質存在下においても、効率よくアルキン化モデルリン脂質の濃縮精製が可能である。
［実施例６：アルキン化コリン代謝産物の濃縮精製・分析］
　本実施例においては、アルキン化分子の細胞内における代謝産物を、それら代謝産物に代謝的に組み込まれるアルキンを利用して濃縮精製した例を示す。アルキンはサイズが小さいため、アルキンを導入した分子は、多くの場合、細胞内の代謝酵素等にも内在性の分子と同様に代謝される。よって、アルキンを導入した代謝産物の前駆体を細胞などに投与し、その代謝産物を本手法により濃縮精製し、質量分析などの手法により構造解析を行うことが可能である。ここでは、脂質前駆体となるコリンの代謝産物の濃縮精製を行った例を示す。
　プロパルギルコリン臭化物（３００μＭ）でＨＥＫ２９３細胞を２４時間処理し、脂質抽出を行った。抽出した脂質は、ＡｍＡｃ－ＩＭＣ溶媒に溶解し、アルキン濃縮用カラムに通し、素通り画分を得た。カラムを同溶媒１ｍＬにて３回洗浄し（洗浄画分）、１０ｍＭ塩化アンモニウムを加えたＡｍＡｃ－ＩＭＣ（２２０μＬ）、続いてＡｍＡｃ－ＩＭＣ（７８０μＬ）を流すことで、溶出画分を得た。得られた画分は、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ質量分析計にてポジティブモードで測定した。プロパルギルコリンの代謝物として、主にプロパルギルホスファチジルコリンとプロパルギルスフィンゴミエリンが予想される。よって、プロパルギルコリン由来の脂質代謝物が濃縮精製できていることを明確に示すため、これらのコリン含有脂質にターゲットを絞った測定を行った。具体的には、プリカーサーイオンスキャン法（本質量分析計においては、parent ion mappingメソッド、ＰＱＤ法によるフラグメンテーション、そしてリニアイオントラップでの検出を組み合わせることで可能である）を使用することで、ホスファチジルコリンとスフィンゴミエリンの選択的検出を行った。結果を図５に示した。
　図５左側の列は、内在性のコリン脂質を選択的に検出（ｍ／ｚ　１８４．１のホスホコリンフラグメントを検出）した結果であり、右側の列はプロパルギルコリン由来のコリン脂質を選択的に検出（ｍ／ｚ　２０８．１のフラグメントを検出）した結果である。濃縮精製前のサンプルにおいては、プロパルギルコリン由来のコリン脂質は総コリン脂質のうち約４４％ほどを占めていた。素通り画分においては、プロパルギルコリン脂質はわずか１％程度しか検出されず、効率的にカラムに捕捉されていることがわかる。そして、溶出画分においては、アルキンを含まないコリン脂質はわずかにしか検出されず（約１％）、９９％ほどをプロパルギルコリン由来の脂質が占めていることがわかる。以上のように、本発明を用いることで、アルキン化前駆体由来の代謝物を濃縮精製できることが明確に示された。
［実施例７：アルキン化ペプチドの細胞酵素消化物からの濃縮精製］
　生理活性物質の作用機序の解明には、その生理活性物質がどのようなタンパク質群に結合するのか、そのタンパク質上のどの部位に結合して作用しているのかを明らかにすることが重要である。また、タンパク質の機能にはアセチル化や脂質修飾などの翻訳後修飾が重要な役割を担うことが知られており、翻訳後修飾の解析はタンパク質の機能を解明する上で重要である。通常、結合タンパク質群の同定や化合物の結合部位の同定、翻訳後修飾部位の同定には質量分析法が用いられる。一般的な流れとしては、細胞抽出物など試料をトリプシンなどの酵素で消化し、ペプチド断片とし、得られたペプチド断片の質量電荷比及びフラグメンテーションのパターンをデータベースに照合することで、タンパク質及びペプチド配列を同定する。多くの場合、このような解析では細胞抽出物などのような複雑な混合物を用いられるが、複雑な混合物中ではイオン化抑制等が起こるため、量が少ないペプチド・タンパク質の同定は困難である。本発明は、複雑な混合物中からアルキンを持つペプチドを選択的に精製することを可能にし、イオン化抑制などの問題点の解決に資する。本実施例では、代表的な実験例として、細胞抽出物のトリプシン消化物にアルキン化ペプチドを混合し、そのアルキン化ペプチドを精製する例を示す。
　ＨＥＫ２９３細胞（３×１０７細胞）を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。破砕後、遠心分離（１００００ｇ、５分）し、上清を回収した。得られた細胞抽出物（総タンパク質１００μｇ相当、５０μＬ）にアルキン化モデルペプチド（ＢＳＡ６６ａｌｋ、０．１μｇ）を混合し、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）５０μＬ及びジチオスライトール（ＤＴＴ、１０ｍＭ）を加えた。６０℃で１時間加熱後、ヨードアセトアミドを４０ｍＭになるように加え、１時間室温でインキュベートした。その後、再度ＤＴＴを終濃度２０ｍＭになるように加え、１０倍希釈した。リジルＣエンドペプチダーゼを１μｇ加え、３７℃で１２時間インキュベートした。更に、トリプシンを１μｇ加え、６時間インキュベートした。３％ＴＦＡ水溶液を１／１０容加えて酸性とし、ＳｅｐＰａｋ　Ｃ１８（ミリポア）で脱塩処理を行った。０．１％ギ酸－６５％アセトニトリル溶液でＳｅｐＰａｋ　Ｃ１８から溶出した溶液を、Concentrator plus (Eppendorf)により溶媒を除去し、細胞の酵素消化物を得た。
　４０ｍｇのカルボン酸修飾シリカゲル（富士シリシア化学社製、ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　ＣＯＯＨ、ＭＢ１００－７５／２００）をマイクロチューブに取り、２００ｍＭ酢酸アンモニウムを含む８０％メタノール水溶液で懸濁した。遠心分離後、上清を除去し、メタノール４００μＬで洗浄した。メタノール１８０μＬと２００ｍＭ硝酸銀水溶液２０μＬを加えて混合し、遠心分離後に上清を除去した。再度メタノールで洗浄し、スピンカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓｐｉｎ、フィルターユニットをマイクロチューブの上に載せて使用する）のフィルターユニットに銀イオン担持カルボン酸修飾シリカゲルを移した。遠心分離することで、フィルター上に銀イオン担持カルボン酸修飾シリカゲルが残り、溶液は下のマイクロチューブに落ちた。溶液は廃棄し、フィルターユニットを別のマイクロチューブに移した。このシリカゲルに対して、前記で調製した酵素消化物を４０ｍＭ炭酸アンモニウム－５％アセトニトリルバッファーに溶解したものをマイクロピペットで加え、吸引吐出を繰り返すことでシリカゲルを懸濁した。シリカゲルと溶液を遠心分離し、溶液は素通り画分として回収した。フィルターユニットを新たなマイクロチューブに移し、４０ｍＭ炭酸アンモニウム－５％アセトニトリルバッファーを用いて同様の手順で４回洗浄した。洗浄後、新たなマイクロチューブに移し、１０ｍＭ塩化アンモニウムを加えた前記バッファー２００μＬをシリカゲルに加え、懸濁した。遠心分離して得られる溶液を溶出画分とした。溶出は２回繰り返した。
　得られた各画分に内部標準としてＢＳＡ６６ペプチドを各画分に等量ずつ添加し、ＧＬｔｉｐ　ＳＤＢ（ジーエルサイエンス社製）により脱塩処理し、質量分析法による解析に供した。図６にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計（Bruker Daltonics社製AutoflexSpeed）による解析結果（全体像及びＢＳＡ６６ａｌｋ周辺の拡大図）を示した。アルキン精製カラムによる精製前の試料では、細胞抽出物消化物由来のピークが多数観測された。添加したアルキン化ペプチド（ＢＳＡ６６ａｌｋ）由来のピークは質量電荷比１１４５．６付近に観測されるものの、イオン化抑制及びピークの重なりの影響でシグナル－ノイズ比が低かった。アルキン精製カラムの素通り画分には、ＢＳＡ６６ａｌｋ由来のペプチドは観測されなかった。溶出画分においては、細胞消化物由来のピークは大幅に減少し、ＢＳＡ６６ａｌｋ由来のピークが内部標準ピークを除くと最も強いピークとして観測された。更に、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ(Thermo Scientific社)を用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析から、アルキン化ペプチドはその他のペプチドに比べ、相対的に１００倍ほど濃縮されていることが確認された。
［実施例８：銀担持担体と逆相担体を組み合わせたスピンカラムを用いたアルキン化ペプチドの濃縮精製］
　通常、細胞抽出物などをトリプシンなどのプロテアーゼで分解して得られるペプチド混合物は、逆相担体を用いて脱塩処理を行った上で質量分析法による解析が行われる。微量サンプルを扱う場合、工程数が増えるとマイクロチューブなどの容器への吸着が問題となりうる。このような問題に対して、アルキン化ペプチドの濃縮精製の工程とその後の逆相担体の脱塩処理を一つのスピンカラムで行うことが、吸着によるサンプルのロスを抑えるために有効である。本実施例では、銀担持担体と逆相担体を二層構造としたスピンカラムを用いたアルキン含有分子の濃縮精製例を示す。また、銀を担持する担体として、シリカゲル型の担体だけでなく、カルボン酸修飾されたポリマー型の不溶性担体も利用可能であることを示す。代表的な実験例として、ＨｅＬａ細胞抽出物をトリプシン消化したペプチド混合物から、アルキン化ペプチドを濃縮精製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った実験例を示す。
　ＨｅＬａ細胞（１×１０７細胞）をＴＮＥバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。破砕後、遠心分離（１５０００ｇ、２０分）し、上清を回収した。得られた細胞抽出物（総タンパク質１００μｇ相当、５０μＬ）にＴＦＥ５０μＬ及びＤＴＴ（１０ｍＭ）を加え、混合した。６０℃で１時間加熱後、ヨードアセトアミドを４０ｍＭになるように加えて混合し、１時間室温で遮光条件下インキュベートした。得られた反応液を１００μＬの５％ＴＦＥを含む１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（５％ＴＦＥ－１０ｍＭ　ＡｍＢｉｃ）で希釈し、あらかじめ４００μＬの２０％メタノールを含む水溶液で洗浄したＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５　１０Ｋフィルターユニット（ミリポア社製）に移し、遠心分離（１４０００ｇ、２０分）した。ろ液を捨て、フィルターユニットに５％ＴＦＥ－１０ｍＭ　ＡｍＢｉｃを２００μＬ加え、同条件で遠心分離を行った。再度、フィルターユニットに５％ＴＦＥ－１０ｍＭ　ＡｍＢｉｃを２００μＬ加え、同条件で遠心分離を行った。フィルター上に４００μＬの５％ＴＦＥ－１０ｍＭ　ＡｍＢｉｃを加え、１μｇのリジルＣエンドペプチダーゼを加え、３７℃で１２時間インキュベートした。更に、トリプシンを１μｇ加え、６時間インキュベートした。遠心分離（１４０００ｇ、２０分）により、ろ液を回収し、細胞の酵素消化物を得た。この消化物に対して、終濃度１００ｎＭ（消化物のペプチド量に対する質量比で４００ｐｐｍ）になるようにアルキン化モデルペプチド　ＢＳＡ６６ａｌｋを添加し、アルキン化ペプチド濃縮精製実験に用いた。
　ＭｏｎｏＳｐｉｎＴＭＣ１８（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の逆相モノリスシリカゲルフィルターに４００μＬのイソプロパノールを加えて遠心分離（２０００ｇ、２分）後、カルボン酸修飾された多孔性ポリマー担体ＭａｃｒｏＰｒｅｐＴＭＣＭ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を１００μＬフィルター上に添加した。同条件で遠心分離後、３００μＬのメタノールを加えて再度遠心した。１００ｍＭ硝酸銀の９０％メタノール水溶液を２００μＬ加え、ピペッティングで混合し、３分室温でインキュベートした。遠心分離（１０００ｇ、１分）後、３００μＬのメタノールで２回洗浄し（遠心分離は１０００ｇで１分）、銀担持固相担体と逆相固相担体が二層構造となったアルキン濃縮精製スピンカラムを調製した。
　調製したスピンカラムに９０μＬのアルキン化ペプチドを含むペプチド混合物を加え、吸入吐出を繰り返すことで混合し、遠心分離した（３００ｇ、３分）。その後、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムの５０％イソプロパノール水溶液４００μＬで６回洗浄し（溶液を加えて１０００ｇ、２分の遠心分離）、続いて１０ｍＭ重炭酸アンモニウムの５％イソプロパノール水溶液４００μＬで６回洗浄した。続いて、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムの８０％イソプロパノール水溶液４００μＬで２回、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムの５％イソプロパノール水溶液４００μＬで１回洗浄した。次に、５０ｍＭ塩化アンモニウムを含む１０ｍＭ重炭酸アンモニウムの５％イソプロパノール水溶液４００μＬを３回カラムに通し（遠心分離は５００ｇ、３分）、５％イソプロパノール水溶液４００μＬで１回洗浄した。最後に、０．１％ギ酸及び０．００１７％ドデシルマルトシドを含む８０％アセトニトリル水溶液を５０μＬ添加し、遠心分離（５０００ｇ、２分）して得られる溶液を回収した。この溶液に内部標準ペプチドとしてＢＳＡ６６ペプチドを０．００４５ｐｍｏｌ／μＬ加え、遠心エバポレータにより溶媒を除去後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリル水溶液に溶解し、逆相液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析に供した。
　液体クロマトグラフィーとしてＵｌｔｉｍａｔｅ　３０００（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を、カラム及びイオン化部としてＴｉｐＣｏｌｕｍｎ（日京テクノス社製）を、そして質量分析計としてＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて測定を行った。測定はdata-dependent acquisitionモードで行い、ペプチドの同定はＳｅａｒｃｈＧＵＩ及びＰｅｐｔｉｄｅＳｈａｋｅｒソフトウェアを用いてＸ！ＴａｎｄｅｍとＭＳ－ＧＦ＋アルゴリズムを使用して行った。また、同定された各ペプチド断片の定量はＤｉｎｏｓａｕｒソフトウェアを用いて行った。
　図７にアルキン濃縮精製カラムによる処理前のサンプルと、前記のアルキン濃縮精製処理を行ったサンプルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析の結果を示した。アルキン濃縮精製操作前のサンプルでは、添加したアルキン化ペプチドＢＳＡ６６ａｌｋはイオン量でわずか０．３８％を占めるのみであったが、濃縮精製後には同定されたペプチドイオンのうち８６％を占めるまで濃縮精製され、２２６倍の濃縮率でアルキン化ペプチドを濃縮することができた。また、ＢＳＡ６６ａｌｋペプチドの回収率も７７％と高いことが確認された。
　ケミカルバイオロジー・生命科学研究の現場において、アルキンを濃縮精製する技術にはニーズがある。現時点では、銅触媒アジド－アルキン環化付加反応によりアルキンにビオチンを導入し、そのビオチンタグを利用して精製する方法が標準的手法となってきている。このような目的のためのキットは市販されており、汎用されている。本発明は、アルキン含有分子の濃縮精製をより短工程で可能にするものであり、かつ水溶液系・有機溶媒系の両者に対応可能であり、有用である。また、医薬品やファインケミカル等の有機合成において、アルキン含有化合物を精製する場合にも使用可能であろう。

Claims (10)

  1. 　銀イオンがｐＫａ２～９の官能基を介して担持された不溶性担体を含有する、液体中の末端アルキン含有分子の濃縮精製用吸着剤。
  2. 　ｐＫａ２～９の官能基がカルボキシル基、リン酸基又はスルホンアミド基である請求項１記載の吸着剤。
  3. 　前記不溶性担体が、銀イオンがカルボキシル基を介して担持されたシリカゲル系又は有機ポリマー系担体である請求項１記載の吸着剤。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の吸着剤を用いた末端アルキン含有分子の濃縮精製用の器具又は装置。
  5. 　銀イオンがカルボキシル基を介して担持されたシリカゲルと、チオール又はチオウレアで修飾されたシリカゲルが二層構造で用いられている請求項４記載の器具又は装置。
  6. 　複数の層を有し、少なくとも一層が請求項１～３のいずれか１項に記載の吸着剤を含有し、及び少なくとも一層が逆相担体を含有する請求項４又は５記載の器具又は装置。
  7. 　器具又は装置が固相抽出カラム、キット、フィルター又はチップである請求項４～６のいずれか１項に記載の器具又は装置。
  8. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の吸着剤に、末端アルキン含有分子を含む液体を接触させて、末端アルキン含有分子を捕捉する工程、及びハロゲン化物イオン、酸又は硫黄含有試薬により溶出する工程を含む、末端アルキン含有分子を濃縮精製する方法。
  9. 　請求項４～７のいずれか１項に記載の器具又は装置を用いる請求項８記載の方法。
  10. 　末端アルキン含有分子を含む液体における溶媒が有機溶媒又は水系溶媒である請求項８又は９記載の方法。
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