WO2018043098A1 - 液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィーカラム、アミン類化合物の分析方法 - Google Patents

液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィーカラム、アミン類化合物の分析方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a liquid chromatography packing material, a liquid chromatography column, and a method for analyzing an amine compound.
  • Amine compounds are important compounds contained in various substances such as pharmaceuticals, foods, fertilizers and industrial chemicals.
  • An amine compound is a compound to be analyzed in research and development in various industries, quality tests, and the like. In the environmental field, amine compounds that adversely affect the human body contained in tap water are widely analyzed.
  • an analysis method for amine compounds an analysis method by liquid chromatography is generally used.
  • an analysis method of amine compounds by liquid chromatography for example, an analysis method in a reverse phase chromatography (RP) mode using an ODS column is widely known (for example, see Patent Document 1).
  • the ODS column is an analytical column packed with a silica gel-based packing material such as octadecyl silica gel (ODS) subjected to an end capping process for suppressing adsorption of amine compounds.
  • ODS octadecyl silica gel
  • a highly hydrophilic amine compound may not be sufficiently retained in the column.
  • highly hydrophilic amine compounds are not retained on the column. Therefore, in order to sufficiently retain the amine compound in the column, it may be necessary to add an ion pair reagent such as sodium 1-pentanesulfonate. When the ion pair reagent is added in this manner, the lifetime of the column may be significantly deteriorated.
  • an analysis method by a hydrophilic interaction chromatography (HILIC) separation mode using a column packed with a silica gel packing into which a sulfobetaine group which is a zwitterionic group is introduced is also generally known.
  • this analytical method using the HILIC separation mode has a problem that amine compounds having high hydrophobicity are not sufficiently retained in the column.
  • the amine compound, which is a basic substance is adsorbed in the column due to the silanol group remaining in the silica gel packing material for RP or HILIC, and the analysis result is adversely affected. There were issues such as effects.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and a liquid chromatography packing material that enables more accurate and simpler analysis of amine compounds, and a liquid chromatography column packed with the same. And an analysis method of amine compounds using the same.
  • the present inventors have introduced 1.50 mmol or more of carboxyl groups per 1 g of filler, and based on the analysis method based on the determined HILIC separation mode, the pH property of the surface And separation of amine compounds by using not only the HILIC separation mode but also the mixed mode combining RP and ion exchange chromatography by using a column using polymer particles with controlled hydrophilicity as packing material It has been found that a column that exhibits sufficient performance for analysis can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the index indicating the pH property of the surface of the polymer filler is 1.30 or more and the index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler is 1.00 or more and 1 by hydrophilic interaction chromatography (HILIC).
  • HILIC hydrophilic interaction chromatography
  • the index indicating the pH property of the surface of the polymer filler is defined by a separation factor ⁇ 1 (Tb / Tp) when theobromine (Tb) and theophylline (Tp) are subjected to liquid chromatography measurement in the HILIC separation mode. .
  • the index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler has a separation coefficient ⁇ 2 (U / U) when uridine (U) and 2′-deoxyuridine (2dU) are subjected to HILIC separation mode liquid chromatography measurement. 2dU).
  • a liquid chromatography column comprising the liquid chromatography packing material according to [1] or [2] and a liquid chromatography housing filled with the liquid chromatography packing material.
  • the liquid chromatography packing which makes it possible to analyze an amine compound more accurately and simply, the liquid chromatography column with which it was packed, and the amine compound using the same An analysis method can be provided.
  • the liquid chromatography filler of the present invention is a polymer filler having a carboxyl group.
  • the carboxyl group is introduced in an amount of 1.50 mmol or more per 1 g of the polymer filler.
  • the index indicating the pH property of the surface of the polymer filler is 1.30 or more and the index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler is 1.00 by hydrophilic interaction chromatography (HILIC). It is 1.30 or less.
  • index indicating the pH property of the surface of the polymer filler according to the present invention and an index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler will be described.
  • the index indicating the pH property and the index indicating the hydrophilicity on the surface of the polymer filler are performance evaluation indexes of the HILIC column proposed by Ikegami et al. In 2011, and are generally evaluated by an evaluation method based on an applicable technique. Values are defined (Journal of Chromatography A, 1218, 2011, 5903-5919).
  • the index indicating the pH property of the surface of the polymer filler and the index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler indicate that the polymer filler has an inner diameter of 2.0 mm and a length of 150 mm or an inner diameter of 4.6 mm and a length of 150 mm.
  • the cylindrical liquid chromatography housing is filled to prepare a liquid chromatography column, and the liquid chromatography column is used to obtain the liquid chromatography column according to the measurement conditions described above.
  • the linear flow velocity of the mobile phase at this time is 3.3 cm / min (if a housing with an inner diameter of 2.0 mm is used, the flow rate of the mobile phase is 0.11 mL / min. When using a 6 mm housing, the mobile phase flow rate is fixed at 0.55 mL / min.).
  • the index indicating the pH property indicates that theobromine (Tb) and theophylline (Tp) are expressed as HILIC separation modes as an index indicating the pH property of the filler surface corresponding to the ionic interaction (ion exchange effect) including the acid-base interaction. Defined by the separation coefficient ⁇ 1 (Tb / Tp) when the liquid chromatography measurement is performed. If the index indicating pH property is 1.00 or more, the polymer filler exhibits an anionic property and thus exhibits a cation exchange action. On the other hand, when the index indicating pH property is less than 1.00, the polymer filler exhibits a cationic property and exhibits an anion exchange action. Therefore, the higher the index from pH 1.00, the higher the ion exchange property of the polymer filler.
  • the index indicating hydrophilicity is an index indicating the selectivity of the hydrophilic group depending on the thickness of the hydrated phase on the surface of the filler, and uridine (U) and 2′-deoxyuridine (2dU) are liquid chromatographed in HILIC separation mode. It is defined by a separation factor ⁇ 2 (U / 2dU) when measurement is performed.
  • a separation factor ⁇ 2 (U / 2dU) when measurement is performed.
  • the separation coefficients ⁇ 1 and ⁇ 2 are ratios of the retention coefficients k of the respective substances.
  • the HILIC separation mode In the HILIC separation mode, it is presumed that the ion exchange action is expressed by the carboxyl group introduced into the polymer filler, but in general, the HILIC separation mode is treated as a separation method including the ion exchange action. There are many cases. Therefore, also in this specification, description will be made with the name of the HILIC separation mode.
  • polymer filler As the polymer filler according to the present invention, at least a hydrophilic polymer into which a carboxyl group is introduced is used. In addition to a carboxyl group, a hydrophilic polymer into which a carboxyalkyl group, a sulfo group, a sulfoalkyl group or the like is introduced is used. Can be used. As the polymer filler having a carboxyl group introduced therein, a polymer filler having a carboxyl group introduced by chemical modification or coating is preferred. As the polymer filler into which such a carboxyl group is introduced, a polyvinyl alcohol resin or a polyhydroxy (meth) acrylate resin is preferable.
  • the amount of carboxyl groups introduced into the polymer filler can be adjusted by the amount of chemical modification or the amount of coating with respect to the polymer filler.
  • the amount introduced is 1.50 mmol or more per gram of filler, preferably 1.60 mmol or more, and more preferably 1.80 mmol or more.
  • the index indicating the pH when liquid chromatography measurement is performed in the HILIC separation mode is less than 1.30, and sufficient ion exchange action is achieved. Is not expressed, the amine compound may not be sufficiently retained on the column.
  • the index indicating the pH property of the surface of the polymer filler is 1.30 or more, more preferably 1.30 or more and 1.60 or less, and further preferably 1.40 or more and 1.60 or less. If the index indicating the pH property is less than 1.30, the polymer packing material does not exhibit sufficient ion exchange action. Therefore, the amine compound is added to the column in the HILIC separation mode or the mixed mode in which RP and ion exchange chromatography are combined. May not be sufficiently retained, and may be eluted. In addition, when the index indicating pH property is 1.60 or less, the ion exchange action of the polymer filler is not excessively strong, and the amine compound is sufficiently retained in the column.
  • the index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler is 1.00 or more and 1.30 or less, preferably 1.05 or more and 1.25 or less, more preferably 1.10 or more and 1.20 or less. preferable. If the index indicating hydrophilicity is less than 1.00, it indicates that uridine and 2′-deoxyuridine are not eluted based on the hydrophilic interaction, and liquid chromatography used for the HILIC column is used. Detracts from the essence of a graphic filler. On the other hand, when the index indicating hydrophilicity exceeds 1.30, the hydrophilicity of the filler is too high, and thus a mixed mode combining PR and ion exchange chromatography may not work.
  • the shape of the polymer filler is preferably a sphere having a volume average particle diameter of 1 ⁇ m to 30 ⁇ m in order to obtain sufficient strength to withstand separation pressure and high sensitivity and withstand a pressure of 1 MPa to 30 MPa.
  • a spherical shape with a particle size of 3 ⁇ m to 10 ⁇ m is more preferable.
  • the volume average particle diameter in the present invention is measured as follows using a Coulter counter method. That is, a precision particle size distribution measuring device (trade name: Multisizer 4, manufactured by Beckman Coulter, Inc.) is used as a measuring device, 25 mL of isotone (diluent) is added to 0.2 g of the polymer filler, and ultrasonic waves are added for 3 minutes. After being dispersed, the volume average particle diameter is measured at about 1000 measured numbers. In order to control the volume average particle diameter of the polymer filler within a preferable range, air classification, classification by sieving, classification using precipitation, or the like is used.
  • Examples of the method for producing a polymer filler having a carboxyl group introduced therein according to the present invention include the method described in JP-A-2007-191581. In this method, after the polyvinyl alcohol resin base material or the polyhydroxy (meth) acrylate resin base material is coated with a carboxyl group-containing water-soluble polymer, the carboxyl group-containing water-soluble polymer is crosslinked to thereby form the resin base material. Introduce a carboxyl group. The amount of carboxyl group introduced can be determined by titration.
  • the liquid chromatography packing material of the present invention is composed of a polymer packing material in which carboxyl groups are introduced in an amount of 1.50 mmol or more per gram of packing material, and an index indicating the pH property of the surface of the polymer packing material by HILIC is 1.30. Since the index indicating the hydrophilicity of the surface of the polymer filler is 1.00 or more and 1.30 or less, the analysis of amine compounds can be performed more accurately and more simply.
  • liquid chromatography column examples include a column having a cylindrical liquid chromatography housing (hereinafter abbreviated as “housing”) and a packing material filled in the housing. .
  • the liquid chromatography packing material of the present invention is used as the packing material.
  • housing The material and size of the housing are not particularly limited.
  • the housing it is preferable to use a cylindrical housing made of stainless steel or polyether ether ketone (PEEK) resin, which is generally used as a housing for liquid chromatography.
  • PEEK polyether ether ketone
  • the inner diameter is preferably 1.0 mm to 8.0 mm, and more preferably 2.0 mm to 6.0 mm. More preferably, it is 2.0 mm to 4.6 mm. If the inner diameter of the cylindrical housing is 1.0 mm or more, the liquid chromatography filler can be easily and sufficiently filled in the housing. On the other hand, if the inner diameter of the cylindrical housing is 8.0 mm or less, sufficient column performance can be obtained even during high-speed analysis. Moreover, the range of the flow rate of the mobile phase that can be measured can be widened without the column pressure becoming too high.
  • the length of the housing is preferably 35 mm to 300 mm, more preferably 35 mm to 250 mm, and still more preferably 50 mm to 250 mm. If the length of the housing is 35 mm or more, the amine compound can be sufficiently held in the column, and as a result, the amine compound can be separated. On the other hand, when the length of the housing is 300 mm or less, the column pressure does not become too high, and the amine compound can be sufficiently eluted from the column.
  • liquid chromatography column of the present invention since the liquid chromatography packing material of the present invention is packed in the housing, the analysis of amine compounds can be performed more accurately and more simply. .
  • the method for analyzing an amine compound of the present invention uses the liquid chromatography column of the present invention, and the separation mode by the liquid chromatography column is a HILIC separation mode using a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase, Alternatively, it is a mixed mode analysis method combining reverse phase chromatography (RP) and ion exchange chromatography.
  • the amine compounds include compounds having a structure in which part or all of hydrogen atoms of ammonia are substituted with organic groups such as hydrocarbon groups.
  • a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water is used.
  • the water-soluble organic solvent include alcohols such as acetonitrile, methyl alcohol, ethyl alcohol and isopropyl alcohol, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, and ethers such as tetrahydrofuran.
  • the water-soluble organic solvent is preferably at least one selected from the group consisting of acetonitrile, methyl alcohol, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, acetone, methyl ethyl ketone, and tetrahydrofuran, and more preferably acetonitrile.
  • one of these water-soluble organic solvents may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the separation mode by the liquid chromatography column is a HILIC separation mode or a mixed mode in which RP and ion exchange chromatography are combined.
  • the HILIC separation mode and the mixed mode can be selected and expressed.
  • the mobile phase can be appropriately selected according to the type of analysis target (amine compound).
  • the composition ratio (volume ratio before mixing) of the water-soluble organic solvent in the mixed solvent has a boundary of 50% to 70%.
  • a mixed mode combining RP and ion exchange chromatography appears.
  • the composition ratio (volume ratio before mixing) of the water-soluble organic solvent is made higher than the boundary, the HILIC separation mode appears. That is, the separation mode to be expressed is determined according to the type of amine compound to be analyzed, and the composition ratio (volume ratio before mixing) of the water-soluble organic solvent in the mixed solvent is determined according to the separation mode.
  • the mobile phase includes an acid such as formic acid, acetic acid, nitric acid, or ammonium formate, acetic acid at an arbitrary ratio for the purpose of adjusting the hydrophilicity level and the retention time of the sample.
  • a salt such as ammonium may be added.
  • the column flow rate during analysis is not particularly limited.
  • the column flow rate that is, the linear flow rate of the mobile phase containing the amine compound flowing in the liquid chromatography column of the present invention during the analysis of the amine compound is 1.5 cm / min to 15.0 cm / min (for example, housing When the inner diameter is 2.0 mm, the flow rate is preferably 0.05 mL / min to 0.50 mL / min), and 3.0 cm / min to 9.0 cm / min (for example, the inner diameter of the housing is 2.0 mm). In this case, the flow rate is more preferably 0.10 mL / min to 0.30 mL / min).
  • the liquid chromatography column of the present invention is used, and the separation mode by the liquid chromatography column is HILIC separation using a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase.
  • Mode or a mixed mode that combines RP and ion exchange chromatography, so that the analysis of amine compounds can be performed more accurately by appropriately selecting the HILIC separation mode and mixed mode according to the type of amine compound. And it becomes possible to carry out more simply.
  • the cation exchange action works sufficiently and the mixed mode of RP mode and ion exchange chromatography is expressed.
  • the retention coefficient of adrenaline when uracil is used as the RP indicator substance is preferably 2.0 or more, and more preferably 2.5 or more.
  • RP reverse phase chromatography
  • ion exchange chromatography ion exchange chromatography
  • one or more amine compounds can be separated and analyzed, and particularly according to the above mixed mode, only compounds such as aromatic compounds that are easily held in the RP mode, and only the RP mode. Then, it becomes possible to simultaneously measure ionic substances such as amines which are too hydrophilic and are not retained.
  • the mobile phase flow rate was 0.11 mL / min (linear flow rate: 3.3 cm / min), toluene 1000 ⁇ g / mL, theophylline 100 ⁇ g / mL, theobromine 100 ⁇ g / mL, uridine 100 ⁇ g / mL, 2-deoxyuridine 100 ⁇ g / mL.
  • an index indicating pH and an index indicating hydrophilicity were calculated.
  • the index indicating pH property was 1.24 and the index indicating hydrophilicity was 1.99, and it was confirmed that the values described in the above non-patent literature could be reproduced.
  • an index indicating pH property and an index indicating hydrophilicity were determined according to the present apparatus and measurement conditions. However, since a column having an inner diameter of 4.6 mm was used only in Comparative Example 2, the flow rate of the mobile phase was 0.55 mL / min (linear flow rate: 3.3 cm / min), and the injection amount of each test sample was 4 ⁇ L.
  • Example 1 (Production of gel and column) According to the method described in JP 2007-191581 A, a filler was introduced with 2.09 mmol of carboxyl groups per 1 g of a base material in a polyvinyl alcohol resin (particle diameter 5.0 ⁇ m) base material. 1 polymer filler (polymer filler having a carboxyl group introduced) was prepared. The amount of carboxyl groups introduced into the polyvinyl alcohol resin substrate was quantified by titration.
  • the slurry solution is injected into the housing, and water is passed from the inlet side to the outlet side of the housing to pressurize the slurry solution at 29 MPa (constant pressure) for 20 minutes.
  • a packed bed composed of a polymer filler was formed to obtain a liquid chromatography column of Example 1.
  • the index indicating the pH property and the index indicating the hydrophilicity of the filler of Example 1 were obtained.
  • the index indicating the pH property (theobromine and theophylline separation coefficient ⁇ 1 (Tb / Tp)) was 1. 44.
  • FIG. 1 shows a chromatogram when the separation factor ⁇ 1 (Tb / Tp) and the separation factor ⁇ 2 (U / 2dU) of the polymer filler of Example 1 were measured.
  • reference numeral 1 represents a toluene peak
  • reference numeral 2 represents a theophylline (Tp) peak
  • reference numeral 3 represents a 2′-deoxyuridine (2dU) peak
  • reference numeral 4 represents a uridine (U).
  • the reference numeral 5 indicates the theobromine (Tb) peak.
  • the column temperature was 40 ° C.
  • the mobile phase flow rate in the column was 0.2 mL / min (linear flow rate: 6.0 cm / min)
  • uracil t 0 indicator substance in RP mode
  • Table 1 The evaluation results of the column are shown in Table 1, and the chromatogram in the evaluation of the column of Example 1 is shown in FIG. In FIG. 2, reference numeral 1 represents a uracil peak, and reference numeral 2 represents an adrenaline peak.
  • Example 2 (Production of gel and column) Using the same polyvinyl alcohol resin base material as in Example 1 and introducing the carboxyl group by 1.76 mmol per gram of the base material in the same manner as in Example 1, the polymer filler of Example 2 (carboxyl group introduced) Polymer filler). This polymer filler was packed in the same housing as in Example 1 by the same method as in Example 1 to obtain a liquid chromatography column of Example 2. According to the above-described method, the index indicating the pH property and the index indicating the hydrophilicity of the polymer filler of Example 2 were determined. As a result, the index indicating the pH property was 1.37 and the index indicating the hydrophilicity was 1.19. It has been confirmed that it has performance as a filler for HILIC.
  • Example 1 (Column evaluation) Using the same apparatus as in Example 1 and under the same measurement conditions as in Example 1, 2 ⁇ L of a mixed sample of uracil 50 ⁇ g / mL and adrenaline 1000 ⁇ g / mL was injected to separate and analyze uracil and adrenaline. The evaluation results of the column are shown in Table 1.
  • Example 3 (Production of gel and column) Using the same polyvinyl alcohol resin substrate as in Example 1 and introducing a carboxyl group in an amount of 1.62 mmol per gram of the substrate in the same manner as in Example 1, the polymer filler of Example 3 (carboxyl group introduced) Polymer filler). This polymer filler was packed in the same housing as in Example 1 by the same method as in Example 1 to obtain a liquid chromatography column of Example 3. According to the above-described method, the index indicating the pH property and the index indicating the hydrophilic property of the polymer filler of Example 3 were determined. As a result, the index indicating the pH property was 1.33 and the index indicating the hydrophilic property was 1.19. It has been confirmed that it has performance as a filler for HILIC.
  • Example 1 (Column evaluation) Using the same apparatus as in Example 1 and under the same measurement conditions as in Example 1, 2 ⁇ L of a mixed sample of uracil 50 ⁇ g / mL and adrenaline 1000 ⁇ g / mL was injected to separate and analyze uracil and adrenaline. The evaluation results of the column are shown in Table 1.
  • Example 1 (Column evaluation) Using the same apparatus as in Example 1 and under the same measurement conditions as in Example 1, 2 ⁇ L of a mixed sample of uracil 50 ⁇ g / mL and adrenaline 1000 ⁇ g / mL was injected to separate and analyze uracil and adrenaline. The evaluation results of the column are shown in Table 1.
  • HILIC column (trade name: HILIC-1, inner diameter 4.6 mm, length 150 mm, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) packed with a diol group-introduced filler that has no carboxyl group introduced Company).
  • the index indicating the pH property and the index indicating the hydrophilic property of the diol group-introduced filler of Comparative Example 2 were determined.
  • the index indicating the pH property was 1.00
  • the index indicating the hydrophilic property was 0. It was confirmed that the index indicating hydrophilicity was lower than 1.00 even though it was a column for HILIC.
  • Example 1 Column evaluation Using the same apparatus as in Example 1, the flow rate of the mobile phase in the column was 1.0 mL / min (linear flow rate: 6.0 cm / min), and under the same measurement conditions as in Example 1, uracil 50 ⁇ g / 10 ⁇ L of a mixed sample of mL and adrenaline 1000 ⁇ g / mL was injected to separate and analyze uracil and adrenaline. The evaluation results of the column are shown in Table 1.
  • HILIC column (trade name: Amide-80, inner diameter 2.0 mm, length 150 mm, manufactured by Tosoh Corporation) filled with an amide group-introducing type filler into which no carboxyl group is introduced is used. It was. According to the method described above, the index indicating the pH property and the index indicating the hydrophilic property of the amide group-introduced filler of Comparative Example 3 were determined. As a result, the index indicating the pH property was 1.31, and the index indicating the hydrophilic property was 1. It was confirmed that it had a performance as a filler for HILIC.
  • Example 1 (Column evaluation) Using the same apparatus as in Example 1 and under the same measurement conditions as in Example 1, 2 ⁇ L of a mixed sample of uracil 50 ⁇ g / mL and adrenaline 1000 ⁇ g / mL was injected to separate and analyze uracil and adrenaline. The evaluation results of the column are shown in Table 1.
  • Example 1 (Column evaluation) Using the same apparatus as in Example 1 and under the same measurement conditions as in Example 1, 2 ⁇ L of a mixed sample of uracil 50 ⁇ g / mL and adrenaline 1000 ⁇ g / mL was injected to separate and analyze uracil and adrenaline. The evaluation results of the column are shown in Table 1.
  • the present invention is a liquid chromatography packing for analyzing amine compounds, a packing made of a polymer packing with a carboxyl group introduced therein, a liquid chromatography column packed with the packing, and the same
  • the present invention relates to a method for analyzing amine compounds, and various amine compounds can be favorably retained and separated by a HILIC separation mode or a mixed mode in which RP and ion exchange chromatography are combined. Therefore, in the present invention, amine compounds, which are important compounds contained in various substances such as pharmaceuticals, foods, fertilizers, industrial chemicals, etc., are analyzed in various industries such as research and development, quality tests, and environmental analysis. Useful for.

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Abstract

アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことを可能とする液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法を提供する。本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、カルボキシル基が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入されたポリマー充填剤からなり、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上、かつ前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であることを特徴とする。

Description

液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィーカラム、アミン類化合物の分析方法
　本発明は、液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィーカラムおよびアミン類化合物の分析方法に関する。
　本願は、２０１６年８月２９日に、日本に出願された特願２０１６－１６７０３８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　アミン類化合物は、医薬、食品、肥料、工業用薬品等の様々な物質に含まれる重要な化合物である。また、アミン類化合物は、各種工業における研究開発、品質試験等において分析の対象とされる化合物である。また、環境分野においては、水道水中に含まれる人体に悪影響を及ぼすアミン類化合物が広く分析対象となる。
　アミン類化合物の分析方法としては、一般的に液体クロマトグラフィーによる分析方法が用いられている。液体クロマトグラフィーによるアミン類化合物の分析方法としては、例えば、ＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）モードでの分析方法が広く知られている（例えば、特許文献１参照）。ＯＤＳカラムは、アミン類化合物の吸着を抑制するためのエンドキャッピング処理を行ったオクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）等のシリカゲル系充填剤が充填された分析カラムである。
　しかしながら、ＲＰモードによるアミン類化合物の分析方法では、親水性の高いアミン類化合物がカラム内にて十分に保持されないことがある。例えば、ＯＤＳカラムを用いたＲＰ法では、親水性の高いアミン類化合物がカラムに保持されない。そこで、アミン類化合物をカラム内に十分に保持させるために、１－ペンタンスルホン酸ナトリウム等のイオンペア試薬の添加が必要となる場合がある。このようにイオンペア試薬を添加すると、カラムの寿命を著しく悪化させることがある。
　また、近年、両性イオン基であるスルホベタイン基が導入されたシリカゲル充填剤が充填されたカラムを用いた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）分離モードによる分析方法も一般的に知られている。しかし、このＨＩＬＩＣ分離モードによる分析方法では、逆に疎水性の高いアミン類化合物がカラム内にて十分に保持されないという課題があった。さらに、このＨＩＬＩＣ分離モードによる分析方法では、ＲＰ用またはＨＩＬＩＣ用のシリカゲル充填剤中に残存するシラノール基により、塩基性物質であるアミン類化合物がカラム内に吸着してしまい、分析結果に悪影響を及ぼすなどの課題があった。
特開平６－１７４７０８号公報
共立出版、高速液体クロマトグラフ法、１９８６年、ｐ９３
　本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことを可能とする液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、カルボキシル基が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入され、決められたＨＩＬＩＣ分離モードによる分析方法に基づいて、表面のｐＨ性および親水性をコントロールされたポリマー粒子を充填剤に用いたカラムを用いることにより、ＨＩＬＩＣ分離モードのみでなく、ＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードも作用することにより、アミン類化合物の分離分析に十分な性能を発現するカラムが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の事項に関する。
［１］カルボキシル基を有するポリマー充填剤であって、前記カルボキシル基が前記ポリマー充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入され、
　親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上であり、かつ前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー充填剤。前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数は、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義される。また、前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は、ウリジン（Ｕ）と２’－デオキシウリジン（２ｄＵ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）で定義される。各分離係数α１，α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、保持係数ｋはいずれも、トルエンの溶出時間をｔ０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとした場合、ｋ＝（ｔ－ｔ０）／ｔ０で定義される。ただし、前記ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件としては、カラム温度が３０℃、移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
［２］前記ポリマー充填剤が、カルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂を含む［１］に記載の液体クロマトグラフィー充填剤。
［３］［１］または［２］に記載の液体クロマトグラフィー充填剤と、前記液体クロマトグラフィー充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用ハウジングと、を備える液体クロマトグラフィーカラム。
［４］［３］に記載の液体クロマトグラフィーカラムを用い、前記液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるアミン類化合物の分析方法。
［５］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である［４］に記載のアミン類化合物の分析方法。
［６］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリルである［５］に記載のアミン類化合物の分析方法。
　本発明によれば、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことを可能とする液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法を提供することができる。
実施例１のポリマー充填剤の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）および分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）を測定したときのクロマトグラムである。 実施例１の液体クロマトグラフィーカラムの評価におけるウラシルとアドレナリンのクロマトグラムである。
　以下、本発明を適用した液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法の実施の形態について説明する。
　なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
［液体クロマトグラフィー充填剤］
　本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、カルボキシル基を有するポリマー充填剤である。前記カルボキシル基が前記ポリマー充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入されることを特徴とする。また、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上であり、かつ前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下である。
（ｐＨ性を示す指数、親水性を示す指数の定義）
　ここで、本発明に係るポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数およびポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数について説明する。
　ポリマー充填剤の表面における、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数は、２０１１年に池上らによって提唱されたＨＩＬＩＣカラムの性能評価指数であり、一般的に適用可能な技術に基づく評価法によって定義される値である（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，１２１８号，２０１１年，５９０３－５９１９頁）。これらの指数は、市販されている液体クロマトグラフ分析装置（例えば、Ｎｅｘｅｒａ－ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）、Ａｇｉｌｅｎｔ　１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（アジレント・テクノロジー株式会社製）等）を用いることにより、メーカー、機種によらず再現良く得ることができる。ただし、これらの指数は、ＨＩＬＩＣ分離モードで測定される。そのＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件は、検出器として紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用い、カラム温度が３０℃、移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
　本発明におけるポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数およびポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は、ポリマー充填剤を、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍまたは内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの円筒型の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填して、液体クロマトグラフィーカラムを作製し、その液体クロマトグラフィーカラムを用いて、上記述の測定条件により求められる。また、上記の池上らの文献に基づいて、このときの移動相の線流速を３．３ｃｍ／ｍｉｎ（内径２．０ｍｍのハウジングを用いる場合、移動相の流量は０．１１ｍＬ／ｍｉｎ。内径４．６ｍｍのハウジングを用いる場合、移動相の流量は０．５５ｍＬ／ｍｉｎ。）に固定する。
　ｐＨ性を示す指数は、酸塩基相互作用を含むイオン性相互作用（イオン交換作用）に対応する充填剤表面のｐＨ性を示す指標として、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義される。ｐＨ性を示す指数が１．００以上であれば、ポリマー充填剤がアニオン性を示すためカチオン交換作用を発現する。一方、ｐＨ性を示す指数が１．００未満では、ポリマー充填剤がカチオン性を示すためアニオン交換作用を発現する。したがって、ｐＨ性を示す指数が１．００からの差が大きいほど、ポリマー充填剤に高いイオン交換性を発現させることができる。
　親水性を示す指数は、充填剤表面の水和相の厚みによる親水性基の選択性を示す指標として、ウリジン（Ｕ）と２’－デオキシウリジン（２ｄＵ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）で定義される。親水性を示す指数が１．００以上であれば、ポリマー充填剤による親水性相互作用が発現される。
　ここで、分離係数α１，α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比である。保持係数ｋはいずれも、ＨＩＬＩＣでは、カラム内に保持されずに溶出されるトルエンの溶出時間をｔ０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとした場合、ｋ＝（ｔ－ｔ０）／ｔ０で定義される。つまり、分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）＝ｋ１／ｋ２であり、ｋ１はテオブロミンの保持係数、ｋ２はテオフィリンの保持係数である。また、分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）＝ｋ３／ｋ４であり、ｋ３はウリジンの保持係数、ｋ４は２’－デオキシウリジンの保持係数である。
　なお、ＨＩＬＩＣ分離モードにおいても、ポリマー充填剤に導入されたカルボキシル基により、イオン交換作用は発現すると推定されるが、一般的にはＨＩＬＩＣ分離モードでは、イオン交換作用も包括した分離手法として扱われることが多い。そのため、本明細書においても、ＨＩＬＩＣ分離モードの名称で説明を行う。
（ポリマー充填剤）
　本発明に係るポリマー充填剤としては、少なくともカルボキシル基が導入された親水性ポリマーが用いられるが、カルボキシル基の他に、カルボキシアルキル基、スルホ基、スルホアルキル基等が導入された親水性ポリマーを用いることができる。
　カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤としては、カルボキシル基が化学修飾または被覆により導入されたポリマー充填剤が好ましい。このようなカルボキシル基が導入されたポリマー充填剤としては、ポリビニルアルコール樹脂またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂が好ましい。
　ポリマー充填剤におけるカルボキシル基の導入量は、ポリマー充填剤に対する化学修飾量または被覆量にて調節することができる。本発明の液体クロマトグラフィー充填剤が、ＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードによる十分な分析性能を得るためには、ポリマー充填剤におけるカルボキシル基の導入量が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上であり、１．６０ｍｍｏｌ以上であることが好ましく、１．８０ｍｍｏｌ以上であることがより好ましい。ポリマー充填剤におけるカルボキシル基の導入量が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ未満では、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際のｐＨ性を示す指数が１．３０未満となり、十分なイオン交換作用が発現されないため、アミン類化合物をカラムに十分に保持させることができないことがある。
　ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数は１．３０以上であり、１．３０以上１．６０以下であることがより好ましく、１．４０以上１．６０以下であることがさらに好ましい。ｐＨ性を示す指数が１．３０未満では、ポリマー充填剤が十分なイオン交換作用を発現しないため、ＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードにて、アミン類化合物がカラムに十分に保持されず溶出されてしまうことがある。また、ｐＨ性を示す指数が１．６０以下であれば、ポリマー充填剤のイオン交換作用が強くなりすぎることがなく、アミン類化合物がカラムに十分に保持される。
　ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は１．００以上１．３０以下であり、１．０５以上１．２５以下であることが好ましく、１．１０以上１．２０以下であることがより好ましい。親水性を示す指数が１．００未満では、ウリジンと２’－デオキシウリジンが親水性相互作用に基づいて、アミン類化合物が溶出していないことを示しており、ＨＩＬＩＣ用カラムに用いられる液体クロマトグラフィー充填剤としての本質を損なう。また、親水性を示す指数が１．３０を超えると、充填剤の親水性が高すぎるため、ＰＲとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードが作用しないことがある。
　ポリマー充填剤の形状は、充分な分離性能および高感度を有し、１ＭＰａ～３０ＭＰａの圧力に耐え得る強度を得るために、体積平均粒径が１μｍ～３０μｍの球状であることが好ましく、体積平均粒径が３μｍ～１０μｍの球形であることがより好ましい。
　本発明における体積平均粒径は、コールターカウンター法を用いて次のように測定される。すなわち、測定装置として精密粒度分布測定装置（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ　４、ベックマン・コールター株式会社製）を用い、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを添加し、超音波を３分間加えて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒径を測定する。ポリマー充填剤の体積平均粒径を好ましい範囲に制御するには、風力分級、ふるい分けによる分級、沈殿を利用した分級等が用いられる。
　本発明におけるカルボキシル基が導入されたポリマー充填剤の製造方法としては、例えば、特開２００７－１９１５８１号公報に記載されている方法等が挙げられる。この方法では、ポリビニルアルコール樹脂基材またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂基材をカルボキシル基含有水溶性高分子で被膜した後、カルボキシル基含有水溶性高分子を架橋させることによって、前記の樹脂基材にカルボキシル基を導入する。また、カルボキシル基の導入量は、滴定により求めることができる。
　本発明の液体クロマトグラフィー充填剤によれば、カルボキシル基が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入されたポリマー充填剤からなり、ＨＩＬＩＣによる、ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上、かつポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であるため、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことが可能となる。
［液体クロマトグラフィーカラム］
　本発明の液体クロマトグラフィーカラムは、例えば、円筒型等をなす液体クロマトグラフィー用ハウジング（以下、「ハウジング」と略す。）と、そのハウジングの内部に充填された充填剤とを備えるカラムが挙げられる。本発明の液体クロマトグラフィーカラムでは、充填剤としては、本発明の液体クロマトグラフィー充填剤が用いられる。
（ハウジング）
　ハウジングの材質および大きさは、特に限定されない。ハウジングとしては、一般的に液体クロマトグラフィー用ハウジングとして用いられているステンレス製またはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂製の円筒型ハウジングを用いることが好ましい。
　ハウジングが円筒型である場合、十分な分離性能および高い検出感度を得るためには、その内径は、１．０ｍｍ～８．０ｍｍであることが好ましく、２．０ｍｍ～６．０ｍｍであることがより好ましく、２．０ｍｍ～４．６ｍｍであることがさらに好ましい。円筒型ハウジングの内径が１．０ｍｍ以上であれば、ハウジング内に液体クロマトグラフィー充填剤を容易かつ十分に充填することができる。一方、円筒型ハウジングの内径が８．０ｍｍ以下であれば、高速分析時においてもカラム性能が十分に得られる。また、カラム圧力が高くなりすぎることがなく、測定可能な移動相の流速の範囲を広くすることができる。
　ハウジングの長さは、３５ｍｍ～３００ｍｍであることが好ましく、３５ｍｍ～２５０ｍｍであることがより好ましく、５０ｍｍ～２５０ｍｍであることがさらに好ましい。ハウジングの長さが３５ｍｍ以上であれば、アミン類化合物をカラムに十分に保持させることができ、結果として、アミン類化合物を分離することができる。一方、ハウジングの長さが３００ｍｍ以下であれば、カラム圧力が高くなりすぎることがなく、カラムからアミン類化合物を十分に溶出させることができる。
　本発明の液体クロマトグラフィーカラムによれば、本発明の液体クロマトグラフィー充填剤がハウジングに充填されたものであるため、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことが可能となる。
［アミン類化合物の分析方法］
　本発明のアミン類化合物の分析方法は、本発明の液体クロマトグラフィーカラムを用い、その液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードの分析方法である。ここで、アミン類化合物としては、アンモニアの水素原子の一部または全部を炭化水素基等の有機基で置換した構造を有する化合物を挙げることができる。
（移動相）
　本発明のアミン類化合物の分析方法における移動相としては、水溶性有機溶媒と水の混合溶媒が用いられる。
　水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、および、テトラヒドロフラン等のエーテル類等が挙げられる。これらの中でも、水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アセトニトリルであることがより好ましい。本発明のアミン類化合物の分析方法では、これらの水溶性有機溶媒の１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
（分離モード）
　本発明のアミン類化合物の分析方法では、液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、ＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるから、移動相である混合溶媒における水溶性有機溶媒と水の組成比率を調節することにより、ＨＩＬＩＣ分離モードとミックスモードとを選択して発現させることができる。
　移動相は、分析対象（アミン類化合物）の種類に応じて適宜選択することができる。通常、混合溶媒における水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）は５０％～７０％に境界がある。その境界よりも水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）を低くすると、ＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードが発現する。一方、その境界よりも水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）を高くすると、ＨＩＬＩＣ分離モードが発現する。すなわち、分析するアミン類化合物の種類に応じて、発現させたい分離モードが決まり、その分離モードに応じて、混合溶媒における水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）を決定する。
　混合溶媒における水溶性有機溶媒と水の組成比率（混合前体積比）は、通常、水溶性有機溶媒：水＝１：９９～９９：１であることが好ましく、５：９５～９５：５であることがより好ましい。
　ＨＩＬＩＣ分離モードでは、混合溶媒における水溶性有機溶媒と水との組成比率（混合前体積比）は、通常、水溶性有機溶媒：水＝５０：５０～９９：１であることが好ましく、６０：４０～９９：１であることがより好ましく、７０：３０～９５：５であることがさらに好ましく、７５：２５～９５：５であることが特に好ましい。
　ＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードでは、混合溶媒における水溶性有機溶媒と水との組成比率（混合前体積比）は、通常、水溶性有機溶媒：水＝１：９９～７０：３０であることが好ましく、１：９９～５０：５０であることがより好ましく、５：９５～５０：５０であることがさらに好ましく、１０：９０～５０：５０であることが特に好ましい。
　また、本発明のアミン類化合物の分析方法では、移動相には、親水性レベルおよび試料の保持時間を調整する目的で、任意の割合でギ酸、酢酸、硝酸等の酸、またはギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の塩を添加してもよい。
　本発明のアミン類化合物の分析方法では、分析時のカラム流速は、特に限定されない。カラム流速、すなわち、アミン類化合物の分析時において、本発明の液体クロマトグラフィーカラム内を流れるアミン類化合物を含む移動相の線流速は、１．５ｃｍ／ｍｉｎ～１５．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が２．０ｍｍの場合、流量は０．０５ｍＬ／ｍｉｎ～０．５０ｍＬ／ｍｉｎ）であることが好ましく、３．０ｃｍ／ｍｉｎ～９．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が２．０ｍｍの場合、流量は０．１０ｍＬ／ｍｉｎ～０．３０ｍＬ／ｍｉｎ）であることがより好ましい。
　本発明のアミン類化合物の分析方法によれば、本発明の液体クロマトグラフィーカラムを用い、その液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるため、アミン類化合物の種類に応じて、ＨＩＬＩＣ分離モードとミックスモードを適切に選択して、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことが可能となる。
　後述の実施例で示すように、カルボキシル基を充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入することにより、陽イオン交換作用が十分に働いてＲＰモードとイオン交換クロマトグラフィーとのミックスモードが発現するため、ＲＰモードのみでは保持が難しいアミン類を十分に保持させることができるようになる。このとき、例えば、ウラシルをＲＰ指標物質としたときのアドレナリンの保持係数は、２．０以上が好ましく、２．５以上がより好ましい。これが達成したときに、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードが機能したとみなすことができる。
　本発明のアミン類化合物の分析方法では、１つ以上のアミン類化合物を分離および分析でき、特に上記のミックスモードによれば、ＲＰモードで保持されやすい芳香族化合物等の化合物と、ＲＰモードだけでは親水性が強すぎて保持されないアミン類等のイオン性物質を1回の分析で同時に測定することも可能となる。
　以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数の妥当性評価）
　ＨＩＬＩＣによる、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数について、上記の非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，１２１８号，２０１１年，５９０３－５９１９頁）に従って文献データの妥当性確認を行った。
　カラムとしては、上記の非特許文献に記載されているＺＩＣ（登録商標）　ＨＩＬＩＣ（内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、メルク株式会社製）を用いた。上記の非特許文献に記載されているｐＨ性を示す指数は１．２０、親水性を示す指数は２．０３である。
　液体クロマトグラフ分析装置としては、Ｎｅｘｅｒａ－ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用いた。測定条件は、上記の非特許文献に従って、検出器として紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用い、カラム温度が３０℃、移動相組成が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０の比率（混合前の容積）の混合液体とした。また、移動相の流量を０．１１ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：３．３ｃｍ／ｍｉｎ）として、トルエン１０００μｇ／ｍＬ、テオフィリン１００μｇ／ｍＬ、テオブロミン１００μｇ／ｍＬ、ウリジン１００μｇ／ｍＬ、２－デオキシウリジン１００μｇ／ｍＬ（いずれも移動相に溶解）の試験サンプルを順番に１μＬ注入して溶出時間を確認した後、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を算出した。
　その結果、ｐＨ性を示す指数が１．２４、親水性を示す指数が１．９９であり、上記の非特許文献に記載されている値を再現できることが確認できた。
　以下の実施例および比較例において、本装置および測定条件により、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた。ただし、比較例２のみ内径が４．６ｍｍのカラムを用いたため、移動相の流量を０．５５ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：３．３ｃｍ／ｍｉｎ）、それぞれの試験サンプルの注入量を４μＬとした。
［実施例１］
（ゲルとカラムの作製）
　充填剤には特開２００７－１９１５８１号公報に記載されている方法に準じて、ポリビニルアルコール樹脂（粒子径５．０μｍ）基材に、カルボキシル基を基材１ｇ当たり２．０９ｍｍｏｌ導入した、実施例１のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
　なお、ポリビニルアルコール樹脂基材に導入されたカルボキシル基量を滴定により定量した。
　このポリマー充填剤０．３５ｇを、０．５ｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液１．２ｍｌに加えた後、超音波バスにて分散処理を施し、ギ酸水溶液にカルボキシル基導入充填剤が均一に分散したスラリー溶液を調製した。
　得られたスラリー溶液を用いて、円筒型であり、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製ハウジング（株式会社巴製作所製）に、上記のポリマー充填剤を充填した。
　すなわち、ハウジング内に、上記のスラリー溶液を注入し、ハウジングの入口側から出口側に向かって、水を通液することにより、スラリー溶液を２９ＭＰａ（定圧）にて２０分加圧し、ハウジング内にポリマー充填剤をからなる充填層を形成し、実施例１の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
　上述の方法に従って、実施例１の充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数（テオブロミンとテオフィリンの分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ））は１．４４、親水性を示す指数（ウリジンと２’－デオキシウリジンの分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ））は１．０９であり、ウリジンが２’ －デオキシウリジンの後に溶出されていることから、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
　実施例１のポリマー充填剤の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）および分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）を測定したときのクロマトグラムを図１に示す。なお、図１において、符号１はトルエンのピークを示し、符号２はテオフィリン（Ｔｐ）のピークを示し、符号３は２’－デオキシウリジン（２ｄＵ）のピークを示し、符号４はウリジン（Ｕ）のピークを示し、符号５はテオブロミン（Ｔｂ）のピークを示す。
（カラムの評価）
　液体クロマトグラフ分析装置としては、Ｎｅｘｅｒａ－ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用い、検出器としては、紫外検出器（ＵＶ、波長：２７５ｎｍ）を用いて、実施例１の液体クロマトグラフィーカラムの評価を行った。
　移動相としては、アセトニトリルと５０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液を、アセトニトリル：５０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液＝２０：８０（混合前体積比）の割合で混合した混合溶液を用いた。
　カラムの温度を４０℃とし、カラム内における移動相の流量を０．２ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：６．０ｃｍ／ｍｉｎ）として、ウラシル（ＲＰモードにおけるｔ０指標物質）５０μｇ／ｍＬと、アミン類化合物であるアドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に、実施例１のカラムの評価におけるクロマトグラムを図２に示す。なお、図２において、符号１はウラシルのピークを示し、符号２はアドレナリンのピークを示す。
　表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は９．０６分、アドレナリンの保持係数（ｋ＝（ｔアドレナリンの溶出時間－ｔ０指標物質の溶出時間）／ｔ０指標物質の溶出時間、にて定義される）は４．１０であり、実施例１の液体クロマトグラフィーカラムは十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能も有していることが確認できた。
［実施例２］
（ゲルとカラムの作製）
　実施例１と同じポリビニルアルコール樹脂基材を用い、かつ実施例１と同様の方法により、カルボキシル基を基材１ｇ当たり１．７６ｍｍｏｌ導入した、実施例２のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
　このポリマー充填剤を、実施例１と同じハウジングに、実施例１と同様の方法により充填し、実施例２の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
　上述の方法に従って、実施例２のポリマー充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．３７、親水性を示す指数は１．１９であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
（カラムの評価）
　実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に示す。
　表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は６．５６分、アドレナリンの保持係数は２．６３であり、実施例１と比べてアドレナリンの保持力に低下がみられたものの、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能も有していることが確認できた。
［実施例３］
（ゲルとカラムの作製）
　実施例１と同じポリビニルアルコール樹脂基材を用い、かつ実施例１と同様の方法により、カルボキシル基を基材１ｇ当たり１．６２ｍｍｏｌ導入した、実施例３のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
　このポリマー充填剤を、実施例１と同じハウジングに、実施例１と同様の方法により充填し、実施例３の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
　上述の方法に従って、実施例３のポリマー充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．３３、親水性を示す指数は１．１９であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
（カラムの評価）
　実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に示す。
　表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は６．４４分、アドレナリンの保持係数は２．５７であり、実施例１と比べてアドレナリンの保持力に低下がみられたものの、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能も有していることが確認できた。
［比較例１］
（ゲルとカラムの作製）
　実施例１と同じポリビニルアルコール樹脂基材を用い、かつ実施例１と同様の方法により、カルボキシル基を基材１ｇ当たり１．３８ｍｍｏｌ導入した、比較例１のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
　このポリマー充填剤を、実施例１と同じハウジングに、実施例１と同様の方法により充填し、比較例１の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
　上述の方法に従って、比較例１のポリマー充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．２２、親水性を示す指数は１．３６であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
（カラムの評価）
　実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に示す。
　表１の結果から、アドレナリンとウラシルが分離せずに溶出してしまった。これは、ｐＨ性を示す指数が低いため、特にイオン交換作用が発現しないことにより、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していないからであると考えられる。
［比較例２］
　市販のカラムとして、カルボキシル基が導入されていないジオール基導入型の充填剤が充填されているＨＩＬＩＣ用カラム（商品名：ＨＩＬＩＣ－１、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いた。
　上述の方法に従って、比較例２のジオール基導入型の充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．００、親水性を示す指数は０．８９であり、ＨＩＬＩＣ用カラムでありながら、親水性を示す指数が１．００よりも低いことが確認できた。
（カラムの評価）
　実施例１と同じ装置を用い、カラム内における移動相の流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：６．０ｃｍ／ｍｉｎ）としたこと以外は実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を１０μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に示す。
　表１の結果から、アドレナリンがウラシルよりも前に溶出してしまった。これは、ｐＨ性を示す指数が低いため、特にイオン交換作用が発現しないことにより、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していないからであると考えられる。
［比較例３］
　市販カラムとして、カルボキシル基が導入されていないアミド基導入型の充填剤が充填されているＨＩＬＩＣ用カラム（商品名：Ａｍｉｄｅ－８０、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、東ソー株式会社製）を用いた。
　上述の方法に従って、比較例３のアミド基導入型の充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．３１、親水性を示す指数は１．６５であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
（カラムの評価）
　実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に示す。
　表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は３．３４分、アドレナリンの保持係数は０．６７であり、わずかにアドレナリンを保持したものの、実施例１と比べて大幅にアドレナリンの保持力に低下がみられた。また、親水性を示す指標が高いため、特にＲＰ作用が発現しないことにより、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していなかった。
［比較例４］
　市販カラムとして、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数の妥当性評価に用いた、ＺＩＣ（登録商標）　ＨＩＬＩＣ（内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、メルク株式会社製）を用いた。
　上述の通り、ｐＨ性を示す指数は１．２４、親水性を示す指数は１．９９であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
（カラムの評価）
　実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
　カラムの評価結果を表１に示す。
　表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は２．９４分、アドレナリンの保持係数は０．３８であり、わずかにアドレナリン保持したものの、実施例１と比べて大幅にアドレナリンの保持力に低下がみられた。また、ｐＨ性を示す指数が低く、かつ親水性を示す指標が高いため、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明は、アミン類化合物を分析するための液体クロマトグラフィー充填剤であって、カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤からなる充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法に関するものであり、ＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードにより、各種アミン類化合物を良好に保持、分離させることができる。そのため、本発明は、医薬、食品、肥料、工業用薬品等の様々な物質に含まれる重要な化合物であるアミン類化合物を、各種工業における研究開発、品質試験、また環境分析等において分析する場合に有用となる。

Claims (6)

  1. 　カルボキシル基を有するポリマー充填剤であって、
    前記カルボキシル基が、前記ポリマー充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入され、
    　親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上であり、かつ
    前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー充填剤、
    前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数は、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義され、
    前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は、ウリジン（Ｕ）と２’－デオキシウリジン（２ｄＵ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）で定義され、
    各分離係数α１，α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、
    保持係数ｋはいずれも、トルエンの溶出時間をｔ０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとした場合、ｋ＝（ｔ－ｔ０）／ｔ０で定義され、
    ただし、前記ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件としては、
    カラム温度が３０℃であり、
    移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
  2. 　前記ポリマー充填剤が、カルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂を含む請求項１に記載の液体クロマトグラフィー充填剤。
  3. 　請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー充填剤と、
    前記液体クロマトグラフィー充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用ハウジングと、
    を備える液体クロマトグラフィーカラム。
  4. 　請求項３に記載の液体クロマトグラフィーカラムを用い、
    前記液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるアミン類化合物の分析方法。
  5. 　前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４に記載のアミン類化合物の分析方法。
  6. 　前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリルである請求項５に記載のアミン類化合物の分析方法。
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