WO2018038240A1 - 金属とブロック共重合体との錯体を含むミセルを安定化させる方法および安定化されたミセル、並びにミセルからの金属の放出制御法 - Google Patents

金属とブロック共重合体との錯体を含むミセルを安定化させる方法および安定化されたミセル、並びにミセルからの金属の放出制御法 Download PDF

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transition metal
micelles
oxidized
polymer
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祐希 持田
片岡　一則
オラシオ カブラル
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公益財団法人川崎市産業振興財団
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    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing a micelle containing a complex of a metal and a block copolymer, a stabilized micelle, and a method for controlling the release of metal from the micelle.
  • Platinum complexes have been shown to be effective in cancer treatment, and cisplatin and carboplatin are on the market as anticancer agents.
  • the metal complex when the metal complex is stabilized, the metal is often not released from the formed complex, or is often not efficiently or at an appropriate rate.
  • the chloride ion ligand of cisplatin cis-diamine dichloroplatinum (II), also referred to as CDDP
  • CDDP chloride ion ligand of cisplatin
  • side chain residues such as cysteine, methionine and histidine in proteins (these are much stronger than the carboxyl anion.
  • Patent Document 1 a technique for delivering a platinum complex to cancer using micelles containing the platinum complex has also been developed (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a complex of a block copolymer comprising a poly (ethylene glycol) segment and a poly ( ⁇ -glutamic acid) segment and CDDP has a stable micelle structure, and when administered intravenously, CDDP alone Have also been shown to exhibit excellent anticancer effects.
  • Patent Document 2 discloses a micelle containing a platinum complex called dahaplatin as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for stabilizing a micelle comprising a complex of a metal and a block copolymer, a stabilized micelle, and a method for controlling the release of transition metal from the micelle.
  • the present inventors have found that micelles containing a complex of a transition metal and a block copolymer are markedly stabilized in solution (for example, blood) by oxidation treatment or heat treatment.
  • the inventors have also found that when micelles obtained by oxidation treatment are reduced, the micelles become unstable and internal transition metals are efficiently released.
  • the present inventors have also found that when ascorbic acid is used in combination with micelles stabilized by the above method, the anticancer effect of micelles increases immediately after administration of ascorbic acid, which is a reducing agent.
  • the present inventors have found that when micelles are subjected to both oxidation treatment and heat treatment, a higher stabilizing effect is exhibited than micelles subjected to single treatment.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention provides the following inventions.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol and the anionic polymer is an anionic amino acid polymer.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol
  • the anionic polymer is polyglutamic acid or polyaspartic acid
  • the transition metal complex contains oxidized platinum or oxidized copper.
  • a pharmaceutical composition comprising the micelle according to any one of (1) to (6) above.
  • a combined medicine comprising a reducing agent and the pharmaceutical composition described in (7) above.
  • the pharmaceutical composition according to (8) or the combined medicine according to (9), wherein the reducing agent is ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutical composition for use in treating cancer comprising ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, according to any one of (1) to (8) above A pharmaceutical composition for use in combination.
  • A4 The micelle according to (A3) above, wherein the anionic amino acid polymer contains glutamic acid as a monomer unit.
  • A5 Any of the above (A1) to (A4), wherein the hydrophilic polymer is polyethylene glycol, the anionic polymer is polyglutamic acid or polyaspartic acid, and the transition metal complex contains oxidized platinum or oxidized copper
  • a pharmaceutical composition comprising the micelle according to any one of (A1) to (A5) above.
  • (B1) Transition metal containing a complex of a block copolymer of a hydrophilic polymer and a polymer containing a monomer unit having a metal coordinating functional group in the side chain as a monomer unit and a transition metal or an amphoteric metal Or an amphoteric metal-containing micelle, wherein the micelle is heat-treated at a temperature of 40 ° C. to 85 ° C. during or after the formation.
  • B2 The micelle according to (B1) above, wherein the polymer containing a monomer unit having a metal coordinating functional group in the side chain is an anionic polymer.
  • (B3) The micelle according to (B2) above, wherein the anionic amino acid polymer contains glutamic acid as a monomer unit.
  • (B4) Any of the above (B1) to (B3), wherein the hydrophilic polymer is polyethylene glycol, the anionic polymer is polyglutamic acid or polyaspartic acid, and the transition metal complex contains oxidized platinum or oxidized copper.
  • the micelle described in 1. (B5) A pharmaceutical composition comprising the micelle according to any one of (B1) to (B4) above.
  • (C1) A micelle according to any one of the above (A1) to (A5), which is heat-treated at a temperature of 40 ° C. to 85 ° C. during or after the formation of the micelle.
  • (C2) A pharmaceutical composition comprising the micelle described in (C1) above.
  • FIG. 1 shows the X-ray absorption spectrum, a / b ratio, and the relative amount of tetravalent platinum (Pt (IV)) of dahaplatin-encapsulated micelles and oxidized dahaplatin-encapsulated micelles.
  • FIG. 2 shows the effect of oxidation treatment on micelle stabilization in micelles encapsulating dahaplatin with various molecules as ligands.
  • FIG. 3 shows that when oxidized transition metal complex micelles are treated with glutathione (GSH) as a reducing agent, platinum is released from the micelles and the micelles dissociate immediately after the addition of the reducing agent.
  • GSH glutathione
  • FIG. 4 shows that when an oxidized transition metal complex micelle is treated with sodium ascorbate (vitamin C sodium salt or NaAsc) as a reducing agent, platinum is released from the micelle immediately after the reducing agent is added, and the micelle is dissociated. Indicates to do.
  • FIG. 4B shows that the stability of the oxidized transition metal complex micelle is improved using a transition metal different from the transition metal of FIG. 4 and that the micelle is treated with sodium ascorbate immediately after the treatment. Shows that micelles dissociate.
  • FIG. 5 shows that sodium ascorbate (NaAsc) has a higher ability to destabilize oxidized transition metal complex micelles even though the reduction potential is lower than that of GSH, even though the reduction power is lower.
  • FIG. 6 shows the blood retention amount of oxidized dahaplatin micelles in each time after administration in blood, and the abundance of tetravalent platinum (Pt (IV)).
  • FIG. 7 shows that oxidized dahaplatin micelles have a higher maximum tolerated dose (MTD) compared to reduced dahaplatin (A), which can administer many anticancer agents and increase antitumor effects. It shows that an antitumor effect increases notably by combined use with an acid (B).
  • FIG. 7-2 shows that oxidized dahaplatin micelles exhibit stronger antitumor activity over a longer period than reduced micelles in the tumor-carrying model (upper panel).
  • FIG. 7-2 also shows that oxidized dahaplatin micelles have lower biotoxicity than the reduced form as shown by changes in mouse body weight after administration (lower panel).
  • FIG. 7-3 shows hepatotoxicity (changes in plasma GOT concentration and plasma GPT concentration) of oxidized and reduced dahaplatine micelles.
  • FIG. 7-4 shows myelotoxicity (white blood cell count, red blood cell count, and platelet count) of oxidized and reduced dahaplatine micelles.
  • FIG. 7-5 shows the stability of oxidized and reduced dahaplatin micelles in plasma (left panel) and accumulation in tumor (right panel).
  • FIG. 7-6 shows the accumulation of oxidized and reduced dahaplatin micelles in non-tumor tissues (liver, spleen, and kidney).
  • FIG. 7-7 shows the tumor accumulation selectivity (ratio of accumulation of tumor to liver, spleen, or kidney) of oxidized dachaplatin micelles and reduced dahaplatin micelles as a ratio of accumulated platinum amount.
  • FIG. 7-8 shows the AUC (0-96 hours) of the ratio of accumulation in tumors to liver, spleen, or kidney in oxidized and reduced dahaplatine micelles.
  • FIG. 8 shows micelles that have been heat-treated at 70 ° C. for 24 hours during micelle formation (hereinafter, micelles that have been heat-treated during micelle formation are referred to as “heat-treated micelles (I)”). It is a figure which shows stabilizing in comparison.
  • FIG. 9 is a diagram showing the particle diameter, polydispersity (pdl), and scattered light intensity of heat-treated micelles (I) heated at various temperatures.
  • FIG. 9-2 is a graph showing the relationship between the heating temperature during micelle formation and the average particle size, polydispersity, and scattered light intensity of micelles.
  • FIG. 10 shows the concentration ratio (A) of Pt and glutamic acid in heat-treated micelles (I) heated at various temperatures (A), the yield of incorporation of Pt into micelles (B), and the yield of incorporation of polymers into micelles (C). Indicates.
  • FIG. 10 shows the concentration ratio (A) of Pt and glutamic acid in heat-treated micelles (I) heated at various temperatures (A), the yield of incorporation of Pt into micelles (B), and the yield of incorporation of polymers into micelles (C). Indicates.
  • FIG. 10 shows the concentration ratio (A) of Pt and glutamic acid in heat-treated micelles (I) heated at various temperatures (A), the
  • FIG. 10-2 shows the concentration ratio of Pt and glutamic acid in the heat-treated micelle (I) heated at various temperatures, the uptake yield of Pt into the micelle, and the uptake yield of the polymer into the micelle.
  • FIG. 11 is a diagram showing that the heat-treated micelle (I) heated in the temperature range of 50 ° C. to 80 ° C. centering on 70 ° C. is stable for a long time.
  • FIG. 11-2 is a graph showing the relationship between the heating time and the stability of the heated micelles in solution.
  • FIG. 11-3 shows the relationship between the heating temperature during the formation of cisplatin-encapsulating micelles and the stability in solution.
  • FIG. 12 is a graph showing platinum release behavior of heat-treated micelles (I) subjected to heat treatment at a pH representative in blood and a pH representative in intracellular endosomes.
  • FIG. 12-2 shows the relationship between the stability of cisplatin-encapsulated micelles and pH.
  • FIG. 13 is a diagram showing that oxidized heat-treated micelles (I) and (II) have higher stability than oxidation-treated or heat-treated alone.
  • FIG. 14 shows the relationship between the heating temperature during micelle formation and the maximum tolerated dose (MTD).
  • FIG. 15 shows the anti-tumor effect of a heated dahaplatin micelle (heat treated micelle (I)) in a tumor-carrying model (left panel).
  • FIG. 15 also shows the side effects of the micelle administration according to the body weight of the mice administered (right panel).
  • FIG. 16 is a Kaplan-Meier curve showing the anti-tumor effect in a tumor-carrying model of heated dahaplatin micelle (heat treated micelle (I)).
  • FIG. 17 shows the hepatotoxicity of heated dahaplatine micelles (heat treated micelle (I)).
  • treatment means an intervention performed with the intention of preventing the occurrence of symptoms, suppressing development, or changing a medical condition.
  • treatment is used to mean both therapeutic and prophylactic treatment.
  • treatment is used in the sense of reducing the rate of progression of symptoms, preventing progression, reducing symptoms, and eliminating symptoms.
  • the term “subject” means a mammal, and is used, for example, to include a human subject.
  • the “transition metal” is an element belonging to Group 3 to Group 11.
  • the transition metal may have an electron configuration in which an electron orbital (usually d orbital) inside the outermost shell of the atom is partially buried.
  • an electron orbital usually d orbital
  • Transition metals can have unstable unpaired electrons in the d-orbit of the inner shell, and thus can have multiple valences.
  • amphoteric metal refers to an element belonging to Group 13 to Group 15. Examples of amphoteric metals include zinc, gallium, germanium, and antimony.
  • Transition metals can chemically bond to various atomic groups and form complexes. In the complex, the transition metal and the atomic group are bonded by a coordinate bond.
  • an atomic group that coordinates with a transition metal is called a ligand.
  • it is called ligand exchange that a ligand exchanges with another ligand.
  • dahaplatin means platinum (II) having a diaminocyclohexane ligand.
  • dahaplatin is sometimes referred to as reduced dahaplatin in order to clarify the distinction between dahaplatin and oxidized dahaplatin described later.
  • oxidized dahaplatin also referred to as “O-DACHPt” means diaminocyclohexaneplatinum (IV). Dahaplatin is known to react with carboxyl groups by ligand exchange of the complex.
  • the daplatin binds to the carboxyl group on the polymer by ligand exchange, neutralizing the charge of the polymer and changing the polymer to hydrophobic.
  • micelles of polymer and dahaplatin hereinafter also referred to as “dahaplatin micelles”, “dahaplatin-containing micelles” or “DACHPt / m” are formed.
  • the polymer can be preferably a block copolymer of polyethylene glycol (hereinafter also referred to as “PEG”) and a monomer unit having a carboxyl group.
  • a ligand means a functional group or a whole molecule which is a metal ligand.
  • the ligand means a molecule to which Pt in dahaplatin is coordinated.
  • the ligand for dahaplatin is not particularly limited, and examples thereof include Cl, NO 3 , H 2 O and AcO in addition to the diaminocyclohexane ligand.
  • the acceptable combination as a ligand for daplatin is not particularly limited.
  • a combination of Cl and NO 3 a combination of Cl and H 2 O, and a combination of AcO and AcO.
  • H 2 O and H 2 O are mentioned.
  • Dahaplatin can be coordinated with a carboxyl group (carboxylate) in the polymer by ligand exchange as described above.
  • Carboplatin refers to platinum having a 1,1-cyclobutanedicarboxylic acid ligand.
  • Carboplatin may have NH 3 as a ligand in addition to the 1,1-cyclobutanedicarboxylic acid ligand.
  • Carboplatin can coordinate with carboxyl groups (carboxylates) in the polymer by ligand exchange.
  • cisplatin means cis-diamine dichloroplatinum (II).
  • one or two of the chlorine atoms of cis-diamine dichloroplatinum (II) exchanged with the side chain of the copolymer by ligand exchange is conveniently combined with cisplatin.
  • a complex with a polymer Expressed as a complex with a polymer.
  • micelles containing such complexes are expressed as cisplatin-encapsulated micelles for convenience.
  • Cisplatin can coordinate with a carboxyl group (carboxylate) in the polymer by ligand exchange.
  • the metal complex when the metal complex is stabilized, the metal is often not released from the formed complex, or is often not efficiently or at an appropriate rate.
  • the chloride ion ligand of cisplatin cis-diamine dichloroplatinum (II), also referred to as CDDP
  • CDDP chloride ion ligand of cisplatin
  • side chain residues such as cysteine, methionine and histidine in proteins (these are much stronger than the carboxyl anion.
  • a complex of a block copolymer comprising a poly (ethylene glycol) segment and a poly ( ⁇ -glutamic acid) segment and CDDP has a stable micelle structure, and when administered intravenously, it has an excellent resistance to that of CDDP alone. It has been shown to show cancer action (WO2002 / 26241). However, if it is possible to provide micelles that have higher in vivo stability and are reduced in the risk of being decomposed in the blood and releasing a drug, it is possible to treat cancer with fewer side effects. .
  • the oxidized transition metal or amphoteric metal has an oxidized form, and can stabilize micelles (the obtained micelles are oxidized micelles or oxidized transition metal-encapsulated micelles or oxidized amphoteric substances). Called metal-encapsulated micelles).
  • the obtained micelles are oxidized micelles or oxidized transition metal-encapsulated micelles or oxidized amphoteric substances. Called metal-encapsulated micelles).
  • the obtained oxidized micelle can be reduced in a reducing environment, destabilized, and release the encapsulated drug from the micelle.
  • micelles encapsulating oxidized transition metals or amphoteric metals according to the present invention provide a drug delivery system that releases encapsulated drugs in cancer cells.
  • the oxidized micelle can release a drug encapsulated by being reduced by a reducing agent such as ascorbic acid (vitamin C) from the micelle. Therefore, the drug release of the micelle encapsulating the oxidized transition metal according to the present invention can be controlled by administering the reducing agent.
  • the present invention provides a controlled release technique for drugs contained within a drug delivery system.
  • platinum can be used as the transition metal.
  • Platinum has a valence of II in a reducing environment, but becomes an IV valent metal when exposed to an oxidizing environment.
  • the oxidized type means IV-valent platinum
  • the reduced type means II-valent platinum.
  • the oxidized micelle means a micelle containing IV valent platinum in the complex
  • the reduced micelle means a micelle containing II valent platinum in the complex.
  • the oxidized transition metal can be obtained by being oxidized, and the reduced transition metal can be obtained by being reduced.
  • platinum complex examples include so-called cisplatin (CAS number: 15663-27-1), dahaplatin, carboplatin (CAS number: 41575-94-4), and oxaliplatin (CAS number: 63121-00-6).
  • cisplatin CAS number: 15663-27-1
  • dahaplatin carboplatin
  • carboplatin CAS number: 41575-94-4
  • oxaliplatin CAS number: 63121-00-6
  • iron and copper may be used as the transition metal.
  • copper has a reduced + I value
  • an + II value is an oxidized form
  • iron has a reduced + II value and an + III value is an oxidized form.
  • Vanadium, manganese, cobalt (+ II valence is a reduced type, + III valence is an oxidized type), molybdenum, ruthenium, and palladium can be oxidized to increase the bond between the metal and the ligand. Whether the transition metal or amphoteric metal is oxidized or reduced is a relative matter, but those skilled in the art can understand that the micelle is stabilized as the valence increases. Moreover, those skilled in the art can easily determine whether the oxidation type or the reduction type.
  • a transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelle including a complex of a block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer and a transition metal or an amphoteric metal, wherein the transition metal or the amphoteric metal is an oxidized type.
  • a micelle is provided.
  • the block copolymer of the hydrophilic polymer and the anionic polymer may be a free block or a salt of the block copolymer of the hydrophilic polymer and the anionic polymer.
  • the salt include pharmaceutically acceptable salts.
  • the block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer is a block copolymer comprising a hydrophilic polymer and an anionic polymer, or a linker between the hydrophilic polymer and the anionic polymer.
  • a block copolymer having A block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer has a group (for example, a methyl group, a group that does not affect the micelle formation of the block copolymer at the end of the hydrophilic polymer side and / or the end of the anionic polymer side.
  • a methoxy group or the like may be a group (for example, a methyl group, a group that does not affect the micelle formation of the block copolymer at the end of the hydrophilic polymer side and / or the end of the anionic polymer side.
  • hydrophilic polymer block examples include polyethylene glycol, which can be used in the present invention.
  • the polyethylene glycol block is represented by — (CH 2 —CH 2 —O) n—, where n is an integer of 5 to 20,000, preferably an integer of 10 to 5,000, more preferably an integer of 40 to 500, More preferably, it can be an integer of 10 to 500.
  • hydrophilic polymer block a multi-branched polyethylene glycol, polyvinyl pyridone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyacrylamide, N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA), divinyl ether -Maleic anhydride (DIVEMA), polyoxazoline, polyphosphoric acid, polyphosphazene, and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC).
  • PVP polyvinyl pyridone
  • PVA polyvinyl alcohol
  • HPMA N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide
  • DIVEMA divinyl ether -Maleic anhydride
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • the metal coordinating functional group a carboxyl group (including a deprotonated state), an amino group (regardless of primary, secondary, tertiary, and aromatic), a thiol group (including a deprotonated state), Amides, thioamides, imines, cyano groups, urethanes, carbonyls, hydroxyl groups (including deprotonated states), thioethers (sulfides), phosphino groups, esters, thioesters, phosphate esters, sulfo groups, chelates containing the above functional groups Examples include ligands (ethylenediamine, oxalic acid, glycine, 2,2′-bipyridine, etc.), and those skilled in the art can appropriately select and use combinations of metals and metal coordinating functional groups.
  • the polymer block containing a monomer unit having a metal coordination functional group as the monomer unit is a polymer having the metal coordination functional group, such as xanthan gum, pectin, chitosan, dextran, carrageenan, guar gum, cellulose. Examples include ether, sodium carboxymethylcellulose, hyaluronic acid, albumin, and starch.
  • the polymer having a metal-coordinating functional group can be, for example, a peptide, for example, polyglutamic acid or polyaspartic acid.
  • anionic polymer examples include polymers of anionic amino acids, for example, polymers containing glutamic acid and aspartic acid such as polymers of glutamic acid and aspartic acid, polymers containing glutamic acid such as polyglutamic acid, and aspartic acid such as polyaspartic acid. And polymers containing acrylic acid, and polymers containing methacrylic acid, which can be used in the present invention.
  • the monomer unit is an integer of 2 to 20,000, preferably an integer of 2 to 5,000, more preferably an integer of 10 to 500, and further preferably an integer of 10 to 200. can do.
  • a block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer can be prepared as follows.
  • a PEG-polyglutamic acid block copolymer can be obtained by polymerizing ⁇ -benzyl-L-glutamic acid N-carboxy anhydride to PEG to deprotect the protecting group.
  • a PEG-polyaspartic acid block copolymer can be prepared in the same manner.
  • a transition metal or amphoteric metal-encapsulated micelle comprising a block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer and a transition metal or an amphoteric metal
  • transition metal-encapsulated micelle or “ The amphoteric metal-encapsulating micelle ” is obtained by a ligand exchange reaction by mixing a block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer with a transition metal complex or an amphoteric metal.
  • the block copolymer is considered to form a micelle by forming a coordination bond by ligand exchange with a transition metal complex or an amphoteric metal.
  • most of the transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelles are considered to be in a chemically bonded state different from the transition metal complex or amphoteric metal to be mixed because they are ligand-exchanged.
  • the transition metal encapsulated in the obtained micelle can be oxidized by the oxidizing agent.
  • the micelle obtained in this way is referred to as an oxidized transition metal-containing micelle.
  • the amphoteric metal encapsulated in the obtained micelle can be oxidized by the oxidizing agent.
  • the micelles thus obtained are referred to as oxidized amphoteric metal-containing micelles. Oxidized transition metal-encapsulated micelles or oxidized amphoteric metal-encapsulated micelles have increased coordination number with the block copolymer as a ligand as a result of an increase in the number of transition metal oxidations. It was considered to be resistant.
  • the oxidized transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelle of the present invention is stable from decomposition as long as it is oxidized, and the release of the encapsulated transition metal or amphoteric metal is suppressed.
  • an oxidized transition metal or amphoteric metal may be included in the micelle.
  • the transition metal encapsulated micelle is selected from the group consisting of a block copolymer of a hydrophilic polymer and an anionic polymer, and a platinum complex, such as cisplatin, dahaplatin, carboplatin, and oxaliplatin. Or a micelle obtained by mixing one or more platinum complexes.
  • the oxidized transition metal-encapsulating micelles may be obtained by further oxidizing the micelles thus obtained.
  • the oxidation of transition metal-encapsulating micelles can be performed using an oxidizing agent.
  • hydrogen peroxide can be used as the oxidizing agent, although not particularly limited.
  • a pharmaceutical composition comprising the oxidized transition metal-encapsulated micelle or oxidized amphoteric metal-encapsulated micelle of the present invention.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol
  • the anionic polymer is polyglutamic acid or polyaspartic acid
  • the transition metal complex is oxidized platinum. Contains dahaplatin or cisplatin.
  • the pharmaceutical composition containing the oxidized transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelle of the present invention can be used in combination with a reducing agent (pharmaceutically acceptable reducing agent such as ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof).
  • a reducing agent pharmaceutically acceptable reducing agent such as ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the transition metal or amphoteric metal in the oxidized transition metal encapsulated or amphoteric metal micelle can be reduced by the reducing agent, the micelle can be destabilized to release the encapsulated transition metal or amphoteric metal from the micelle.
  • a pharmaceutical composition comprising the oxidized transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelle of the present invention has a reducing agent (pharmaceutically acceptable reducing agent such as ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof) after its administration.
  • a reducing agent pharmaceutically acceptable reducing agent such as ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • the pharmaceutically acceptable salt of ascorbic acid include sodium ascorbate.
  • ascorbic acid exhibits two aspects of anticancer action and reducing action, and ascorbic acid exhibits a reducing action even at a concentration at which ascorbic acid has an anticancer action.
  • Ascorbic acid can also be used at a concentration that does not have an anticancer effect. Therefore, the pharmaceutical composition containing the oxidized transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelles of the present invention can be used in combination with a dose of ascorbic acid that does not exhibit an anticancer effect by itself.
  • a pharmaceutical composition for use in treating cancer comprising ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising the oxidized transition metal or amphoteric metal-encapsulating micelle of the present invention.
  • a pharmaceutical composition for use in combination with a pharmaceutical composition is provided.
  • Ascorbic acid is known to have an anticancer effect.
  • oxidized transition metal or oxidized amphoteric metal encapsulated in micelles is obtained from micelles. A new effect of releasing can be obtained. Since the inside of the cell is a reducing environment, these metals are reduced in the cell.
  • Ascorbic acid or a salt thereof is not particularly limited after administration of the oxidized transition metal-encapsulated micelle or oxidized amphoteric metal-encapsulated micelle of the present invention, but can be administered, for example, after 0 to 24 hours. Ascorbic acid or a salt thereof can also be administered after sufficient time has passed for the oxidized transition metal-encapsulated micelles or oxidized amphoteric metal-encapsulated micelles of the present invention to reach the cancer tissue. In this aspect, ascorbic acid or a salt thereof is, for example, 1 hour to 336 hours after, 24 to 240 hours, or 24 to 168 after administration of the oxidized transition metal-encapsulated micelle or oxidized amphoteric metal-encapsulated micelle of the present invention. Can be administered after hours.
  • a complex of a block copolymer of a hydrophilic polymer and a polymer containing a monomer unit having a metal coordinating functional group in the side chain as a monomer unit and a transition metal or an amphoteric metal is included.
  • Transition metal or amphoteric metal-encapsulated micelles wherein the micelles are heat treated at a temperature of 40 to 85 ° C. during or after formation.
  • the transition metal or amphoteric metal can be a metal listed in Table 1.
  • the hydrophilic polymer a polymer as described above can be used, and as the monomer unit, a monomer unit as described above can be used.
  • a metal as described above can be used as the transition metal or amphoteric metal.
  • the temperature of the heat treatment can be a temperature in the temperature range of 40 ° C. to 85 ° C., preferably 40 ° C. to 75 ° C., more preferably 50 ° C. to 75 ° C., and still more preferably 60 ° C. to 70 ° C. Alternatively, it can be 50 ° C to 70 ° C.
  • the heat treatment time is not particularly limited, but 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours or more, 10 hours or more, 12 hours or more, 1 day or more It may be 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, or 5 days or more.
  • the upper limit at the time of a heating can be made into less than 3 days, less than 2 days, less than 24 hours, less than 15 hours, for example.
  • the heat treatment may be performed at the time of forming the micelle or after the formation of the micelle.
  • the micelles may be heat-treated in addition to the oxidation treatment.
  • micelles can be heat treated during micelle formation and oxidized after micelle formation.
  • micelles can be heat treated and oxidized after micelle formation.
  • a complex of a block copolymer of a hydrophilic polymer and a polymer containing a monomer unit having a metal coordinating functional group in the side chain as a monomer unit and a transition metal or an amphoteric metal is included.
  • a method for producing transition metal or amphoteric metal-encapsulated micelles (or pharmaceutical preparations containing the micelles), comprising heating at 40 ° C. to 85 ° C. during or after micelle formation, or oxidizing micelles And micelles obtainable by this method are provided.
  • the transition metal or amphoteric metal may be in an oxidized form.
  • Aqueous (trans-1,2-diaminocyclohexane-N, N ′) nitrate DACHPtCl 2 (Heraeus, Germany) 200 mg is suspended in 50 ml of pure water, 59.74 mg of silver nitrate is added, and the mixture is stirred at 25 ° C. in the dark for 16 hours. did. The precipitated silver chloride was filtered and the filtrate was lyophilized to give the title complex.
  • the title complex is also referred to as [Pt II Cl (dach) (H 2 O)] (NO 3 ).
  • the micelle obtained here is referred to as an oxidized micelle.
  • oxidized micelles were obtained when cisplatin was used as the platinum complex.
  • the obtained solution was purified by dialysis and ultrafiltration to obtain heat-treated micelle (I). In addition, the above-mentioned heating is performed at the time of micelle formation.
  • heat treatment micelles II
  • micelles obtained by heat treatment at the time of micelle formation are called heat treated micelles (I)
  • micelles obtained by heat treatment after micelle formation are called heat treated micelles (II).
  • the degree of platinum oxidation can be calculated from the ratio of a to b (a / b).
  • the ratio was calculated, as shown in the upper right panel of FIG. 1, it was found that platinum was oxidized from divalent to tetravalent in both cisplatin-containing micelles and dahaplatin-containing micelles by hydrogen peroxide treatment.
  • O-DACHPt / m it was found that about 60% of the contained platinum was oxidized to tetravalent.
  • Example 2 Evaluation of Stability of Oxidized Micelles
  • the stability of oxidized micelles obtained in Example 1 was evaluated.
  • Oxidized micelles (concentration 0.050 based on platinum complex) in phosphate buffered saline (10 mM PB + 150 mM NaCl, pH 7.4, 37 ° C) mg / ml) was incubated, and the scattered light intensity (632.8 nm, 90 °, 37 ° C.) of the solution was measured continuously. The obtained scattered light intensity at each time was normalized and compared with the scattered light intensity at the start of the experiment. In the case of oxidized micelles encapsulating cisplatin, the concentration of oxidized micelles was 0.040 mg / ml on a platinum complex basis. The result was as shown in FIG.
  • Phosphate buffered saline (10 mM PB + 150 mM NaCl, pH 7.4, 37 ° C.) Dialyze 1 ml of oxidized micelles in 50 ml (micelle in dialysis membrane) The initial concentration of was 0.25 mg / ml on the basis of platinum complex), and the amount of platinum complex released into the external solution was analyzed by ICP-MS. In the case of oxidized micelles encapsulating cisplatin, the initial concentration of micelles in the dialysis membrane was 0.50 mg / ml based on the platinum complex.
  • the oxidized micelles release the platinum complex into the solution with the addition of glutathione (FIG. 3 left), while the micelles themselves dissociate with the addition of glutathione (right of FIG. 3). It became. From this, it was suggested that oxidized micelles are stable in plasma and can release platinum complexes as soon as they enter cancer cells.
  • the oxidized micelle releases the platinum complex into the solution with the addition of sodium ascorbate (VC) (right of FIG. 4), while the micelle itself contains sodium ascorbate (VC). It became clear that it dissociated with addition (FIG. 4 left). This suggests that oxidized micelles are stable in plasma and release platinum complexes when ascorbic acid is added.
  • the obtained oxidized micelle can be reduced in a reducing environment, destabilized, and release the encapsulated drug from the micelle.
  • cancer cells have a reducing environment sufficient to destabilize oxidized micelles. Accordingly, it is believed that micelles encapsulating an oxidized transition metal or amphoteric metal according to the present invention provide a drug delivery system that releases the encapsulated drug in cancer cells.
  • the solution was prepared by adding 100 equivalents of hydrogen peroxide solution to promote oxidation.
  • the stability of the micelle was estimated from the scattered light intensity as described above. After 24 hours, sodium ascorbate (VC) was added to reduce the copper sulfate complex contained in the micelle. The result was as shown in FIG. As shown in Fig. 4-2, the oxidized copper (II) complex-encapsulated micelles are stable in HEPES buffer and NaCl solution, and when the complex is reduced by addition of sodium ascorbate, the micelles become unstable and the micelles collapse. (Ie, the inner complex is released). From this result, it was clarified that the copper complex micelle has the property of stabilizing in the solution by making it into the oxidized form, destabilizing in the solution by reducing, and releasing the copper complex that is the content. . Similarly, the oxidized iron complex-encapsulated micelles prepared by the above two methods were more stable in solution than the reduced type.
  • the dissociation rate after adding ascorbic acid was faster than the dissociation rate after adding glutathione. Since ascorbic acid is considered to have a lower reducing power than glutathione, it was surprising that the dissociation rate of oxidized micelles by ascorbic acid having a lower reducing power was faster than that by glutathione.
  • Example 3 Evaluation of blood retention of oxidized micelles
  • the blood retention of oxidized micelles in vivo was evaluated.
  • Example 4 Antitumor effect of oxidized micelles
  • the antitumor effect of oxidized micelles obtained in the above examples was confirmed.
  • the antitumor effect was also confirmed when ascorbic acid was administered to dissociate micelles after administration of the oxidized micelles obtained in the above examples.
  • C26 cells 1 ⁇ 10 6 C26 cells were implanted subcutaneously in BALB / c mice. One week later, PBS (control), dahaplatin micelle 15 mg / kg, oxidized dahaplatin micelle 50 mg / kg was administered from the tail vein, and changes in tumor volume were followed every 2 days. In order to evaluate the action of high-concentration vitamin C, 4 g / kg sodium ascorbate was intraperitoneally administered on the second day after drug administration.
  • C26 cells are cancer cells provided by the National Cancer Center, and were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin-streptomycin under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. The result was as shown in FIG.
  • C26 cells were transplanted subcutaneously into BALB / c mice (6 weeks old; female). Five days later, PBS (control), oxaliplatin 15 mg / kg, dahaplatin micelle 10 mg / kg, oxidized dahaplatin micelle 10 mg / kg, oxidized dahaplatin micelle 20 mg / kg were administered via the tail vein, and the tumor The change in volume was followed. Mice whose tumor average diameter exceeded 15 mm were euthanized at that time.
  • C26 cells were provided by the National Cancer Center, and were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin-streptomycin at 5% CO2 and 37 ° C until subcutaneous implantation. . The result was as shown in FIG. 7-2.
  • oxidized dahaplatin micelles As shown in the upper panel of FIG. 7-2, oxidized dahaplatin micelles (O-DACHPt / m) exhibited a marked antitumor effect than reduced dahaplatin micelles (DACHPt / m) of the same amount, The increase in relative tumor volume was strongly suppressed. The strength of the effect was dose-dependent. As shown in the lower panel of FIG. 7-2, oxidized dahaplatin micelles had little or no effect on mouse body weight compared to oxaliplatin and reduced dahaplatine micelles. Plasma GOT and GPT concentrations were determined by conventional methods. The result was as shown in FIG. 7-3. As shown in FIG. 7-3, the oxidized dahaplatin micelle showed a lower GOT concentration and a lower GPT concentration compared to the reduced dahaplatin micelle. This showed that oxidized platinum micelles have little hepatotoxicity.
  • oxidized platinum micelles were administered from the tail vein at a dose of 5 mg / kg to BALB / c mice (6 weeks old; female). After 24 hours, 48 hours, 72 hours, and 96 hours, blood, tumor, liver, spleen, and kidney were collected, and blood was collected by centrifugation. The obtained sample was heat-treated with concentrated nitric acid, and the amount of platinum complex was quantified by ICP-MS. The results were as shown in FIGS. 7-5 to 7-8.
  • the oxidized dahaplatin micelles showed significantly higher retention in the blood after intravenous administration compared with the reduced dahaplatin micelles.
  • the accumulated amount of oxidized dahaplatin micelles remained high regardless of the passage of time, and this was reduced with the passage of time. This was in contrast to the large drop.
  • the accumulation amount by organ was significantly lower in the oxidized dahaplatin micelle than in the reduced dahaplatin micelle in each of the liver, spleen, and kidney.
  • these accumulation amounts are represented by the ratio of tumor / liver, tumor / spleen, and tumor / kidney.
  • oxidized dahaplatin micelles exhibited significantly higher tumor accumulation selectivity than reduced dahaplatin micelles.
  • 7-8 represent the area under the curve (AUC) for the tumor / liver, tumor / spleen, and tumor / kidney ratios for 96 hours. As shown in FIGS. 7-8, it was revealed that oxidized dahaplatin micelles had a higher tumor / organ accumulation ratio than reduced dahaplatin micelles.
  • oxidized platinum micelles had high stability even in vivo. This high stability was thought to be due to the fact that accumulation in organs such as the liver and kidneys decreased, that is, that clearance decreased contributed to the selectivity for accumulation in tumors. That is, micelles are less likely to be taken up by normal tissues and show accumulation selectivity due to the EPR effect against tumors.
  • the micelle when the micelle is broken, the anticancer agent is released into the blood, resulting in a decrease in the selectivity. If micelles are stable in the blood, the concentration of free anticancer drugs released in the blood will decrease, and nonspecific accumulation in non-tumors will be suppressed, resulting in improved tumor selectivity. .
  • oxidized dahaplatin micelles can be administered in large quantities due to the increased maximum tolerated dose (MTD) due to their stability. This makes it possible to obtain a high antitumor effect with low toxicity.
  • MTD maximum tolerated dose
  • By administering ascorbic acid it is considered that oxidized dahaplatin micelles were dissociated in the body and dahaplatin was released.
  • a new controlled release technique has been established in which ascorbic acid is used in combination, the oxidized micelles that stay stably in the blood are disintegrated and the antitumor effect is exhibited.
  • Example 5 Stability evaluation of heat-treated micelle
  • the stability of the heat-treated micelle (I) obtained above was evaluated in the same manner as in Example 2.
  • the micelle used was a micelle heated at 70 ° C. for 24 hours.
  • the result was as shown in FIG.
  • the micelles subjected to the heat treatment were improved in stability as compared with the micelles not subjected to the heat treatment.
  • the stabilizing effect was also confirmed in the heat treated micelle (II).
  • Example 2 the particle size, polydispersity (pdl), and scattered light intensity were measured in the same manner as in Example 1 for micelles subjected to heat treatment at various temperatures.
  • the result was as shown in FIG.
  • the particle size increased as the heating temperature increased.
  • the polydispersity did not change significantly with increasing temperature.
  • the scattered light intensity increased as the heating temperature increased.
  • all measured values showed numerical values that differed greatly from other temperatures when heated at 90 ° C. There was a possibility that abnormal micelles were generated by heating at 90 ° C. due to aggregation.
  • the amount of platinum contained ([Pt] / [Glu]) was measured by the same method as in Example 1. The result was as shown in FIG. As shown in panel A of FIG. 10, the amount of platinum contained in the obtained heat-treated micelle (I) tended to increase as the heating temperature increased. This indicates that the coordination of platinum to the carboxylate which is the side chain of glutamic acid was increased by the heat treatment. However, during heating at 90 ° C., the amount of platinum included was significantly different from the others. When the efficiency (yield) of Pt incorporation into micelles was confirmed, as shown in panel B of FIG. 10, the Pt incorporation yield decreased at 80 ° C. and 90 ° C. Further, as shown in panel C of FIG.
  • the yield of glutamic acid polymer incorporated into micelles was greatly reduced at 80 ° C. and 90 ° C. Furthermore, in the cisplatin-encapsulated micelles, the amount of platinum contained in the heat-treated micelle (I) ([Pt] / [Glu]), the uptake yield of Pt into the micelle, and the uptake yield of glutamate polymer into the micelle were also measured. The result was as shown in FIG. 10-2. As shown in FIG. 10-2, the amount of inclusion platinum tended to increase as the heating temperature increased. Further, as shown in FIG. 10-2, the yield of Pt incorporated into micelles also tended to increase as the heating temperature increased. Furthermore, the yield of polymer incorporation into micelles decreased slightly at 70 ° C., but was generally constant regardless of temperature.
  • the stability of the heat-treated micelle (I) in phosphate buffered saline was evaluated under the same conditions as in Example 2. The result was as shown in FIG. As shown in FIG. 11, the heat-treated micelle (I) tended to become stable when the temperature was high in the temperature range of 25 ° C. to 70 ° C. Compared with micelles formed at 25 ° C. or 37 ° C., the effect of improving stability was limited at 90 ° C. In particular, the effect of stabilizing micelles by heat treatment at 50 ° C. to 80 ° C. was remarkable.
  • Example 1 the solution stability of the heated cisplatin-encapsulated micelle obtained in Example 1 was evaluated. Specifically, it was heated at 25 ° C., 37 ° C., 50 ° C., or 70 ° C. for 24 hours, and the stability in the solution was evaluated by the method described in Example 2. The result was as shown in FIG. 11-3. As shown in FIG. 11-3, heating at 70 ° C. was effective for micelle stabilization even in cisplatin-encapsulated micelles.
  • Example 2 the release behavior of platinum from the heat-treated micelle (I) in phosphate buffered saline (pH 5.5 and pH 7.4) was examined. The result was as shown in FIG. As shown in FIG. 12, it was found that the heat-treated micelle (I) has higher micelle stability as the heat treatment temperature is higher, and the release of Pt is suppressed. On the other hand, as shown in the lower part of FIG. 12, the heat-treated micelle (I) produced by heating at 70 ° C. has a characteristic that it is more likely to release Pt in an environment of pH 5.5. It became clear. This indicates that the heat-treated micelle (I) prepared by heating at 70 ° C. is stable in blood (pH 7.4) and easily releases platinum in late endosomes when taken into cells. This indicates that the drug delivery system is superior in that the drug is released in the cell without releasing the drug in the blood.
  • the heat-treated platinum complex micelle is suitable as a drug that improves the amount of ligand exchange with the polymer, stabilizes the micelle, reduces cytotoxicity, and is easy to release in the intracellular environment. It became clear that it had properties.
  • mice (6 weeks old; female) were administered dachaplatin micelles prepared at 37 ° C, dahaplatin micelles prepared at 50 ° C, and dahaplatin micelles prepared at 70 ° C from the tail vein.
  • Body weight changes were followed and maximum tolerated dose was determined.
  • the result was as shown in FIG. FIG. 14 shows that mice that died show weight until the time of death, and mice that did not die show changes in body weight after administration.
  • the MTD of dahaplatin micelles prepared at 37 ° C. is at least 12 mg / kg
  • the MTD of platin micelles was shown to be at least 20 mg / kg.
  • the weight change in the MTD of dahaplatin micelles prepared at each temperature was displayed in an overlapping manner, the change in the weight change was almost the same (see FIG. 14).
  • dahaplatin micelles prepared at 37 ° C., dahaplatin micelles prepared at 50 ° C., dahaplatin micelles prepared at 70 ° C. were administered from the tail vein, and the inhibitory effect on the increase of transplanted tumors was examined. Specifically, 2 ⁇ 10 5 C26 cells were transplanted subcutaneously into BALB / c mice (6 weeks old; female).
  • C26 cells are cancer cells provided by the National Cancer Center, and were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin-streptomycin under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. The results were as shown in FIGS.
  • dahaplatin micelles prepared at 70 ° C. have less effect on mouse body weight than micelles prepared at 37 ° C. or 50 ° C., and the antitumor effect is 4 mg / kg.
  • the highest micelles prepared at 70 ° C that could be administered.
  • the MTD of dahaplatin micelles prepared at 70 ° C reached 4 mg / kg, higher than the MTD of dahaplatin micelles prepared at 37 ° C or 50 ° C, resulting in the strongest antitumor effect could get.
  • the MTD in FIG. 15 is an MTD in an administration method in which administration is performed three times every two days, and shows a value different from the MTD in FIG. 14 by single administration.
  • FIG. 15 is an MTD in an administration method in which administration is performed three times every two days, and shows a value different from the MTD in FIG. 14 by single administration.
  • Example 6 Stability of oxidized heat-treated micelles
  • the stability of micelles subjected to both oxidation treatment and heat treatment was evaluated.
  • Micelle was prepared as described in Example 1. Thereafter, heat treatment and oxidation treatment of the obtained micelle (DACHPt / m) were performed as follows.
  • Oxidized DACHPt / m (O-DACHPt / m) was obtained by mixing micelles with 100 equivalents of hydrogen peroxide and reacting at room temperature for 24 hours.
  • Heat-treated micelle (I) (H-DACHPt / m) was obtained by heating micelles at 70 ° C. for 24 hours.
  • Micelles (HO-DACHPt / m) oxidized after heat treatment were obtained by treating micelles at 70 ° C. for 24 hours, then mixing with 100 equivalents of hydrogen peroxide and reacting at room temperature for 24 hours.
  • the micelles (OH-DACHPt / m) heat-treated after the oxidation treatment were obtained by mixing micelles with 100 equivalents of hydrogen peroxide and reacting them for 24 hours, and then treating them at 70 ° C. for 24 hours.
  • the stability of micelles was evaluated by the scattered light intensity in phosphate buffered saline as described in Example 1. 0.050 mg / mL was incubated on a platinum complex basis, the scattered light intensity was measured over time, and the scattered light intensity at the start of measurement was standardized as 1. 72 hours after the start of measurement, 5 mM ascorbic acid was added. The result was as shown in FIG.
  • micelles (OH-DACHPt / m) subjected to heat treatment following oxidation treatment are oxidized micelles (O-DACHPt / m) and heat-treated micelles (I) (H-DACHPt / m). And higher stability than micelles (HO-DACHPt / m) that were subjected to heat treatment followed by oxidation treatment.
  • O-DACHPt / m oxidized micelles
  • I heat-treated micelles
  • the property of releasing Pt simultaneously with the addition was observed.
  • the heat-treated OH-DACHPt / m showed a more stable micelle structure.

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Abstract

本発明は、生体内で安定であり、がん細胞内で内包する薬剤を放出できる制御放出型ミセルを提供する。本発明はまた、前記ミセルからの薬剤の能動的放出制御技術を提供する。本発明によれば、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属錯体または両性金属錯体とから形成される遷移金属錯体内包ミセルであって、前記錯体における遷移金属または両性金属が酸化型であるミセルまたは熱処理されたミセルが提供される。本発明によれば、前記ミセルと還元剤との組合せが提供される。

Description

金属とブロック共重合体との錯体を含むミセルを安定化させる方法および安定化されたミセル、並びにミセルからの金属の放出制御法 出願の相互参照
　本願は、日本国において２０１６年８月２６日に出願された特許出願（特願２０１６－１６５２９８）の優先権の利益を享受する出願であり、その全体は引用することにより本願明細書に取り込まれるものである。
　本発明は、金属とブロック共重合体との錯体を含むミセルを安定化させる方法および安定化されたミセル、並びにミセルからの金属の放出制御法に関する。
　白金錯体は、がん処置における有効性が示され、抗がん剤としてシスプラチンやカルボプラチンが上市されている。一般的に金属錯体の安定化を図ると、形成した錯体から金属が放出されなくなるか、あるいは効率よくもしくは適当の速度で放出されなくなる場合がよくある。例えば、シスプラチン（ｃｉｓ－ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＤＤＰともいう）の塩素イオン配位子をタンパク質中のシステイン、メチオニン、ヒスチジンなどの側鎖残基（これらはカルボキシルアニオンに比べて遥かに強い求核性を有する）で交換すると、極めて安定な錯体が形成し、生理食塩水中でも、さらなる塩素イオン配位子への再交換が起こらず、ＣＤＤＰは生体内で活性を示さなくなる場合さえある。
　また、白金錯体を内包したミセルを用いて白金錯体をがんに送達する技術も開発されている（特許文献１および非特許文献１）。特に特許文献１では、ポリ（エチレングリコール）セグメントとポリ（α－グルタミン酸）セグメントを含んでなるブロック共重合体とＣＤＤＰとの錯体が、安定なミセル構造を有する上に、静脈投与するとＣＤＤＰ単体よりも優れた抗がん作用を示すことが示されている。また、特許文献２では、ダハプラチンという白金錯体を有効成分として含むミセルについて開示されている。
ＷＯ２００２／２６２４１ ＷＯ２００５／０５６６４１
H. Cabral et al., J. Control. Release 101: 223-232, 2005
　より生体内での安定性が高く、血中で分解されて薬剤を放出するリスクが低減されたミセルを提供することができれば、より副作用が少なく、がんを処置することが可能となる。本発明は、金属とブロック共重合体との錯体を含むミセルを安定化させる方法および安定化されたミセル、並びにミセルからの遷移金属の放出制御法を提供する。
　本発明者らは、遷移金属とブロック共重合体との錯体を含むミセルを酸化処理または熱処理することにより、ミセルが溶液中（例えば、血中）で顕著に安定化することを見出した。本発明者らはまた、酸化処理により得られたミセルを還元すると、ミセルが不安定化し、内部の遷移金属が効率よく放出されることを見出した。例えば、がん細胞質と同等の還元環境に上記方法で安定化したミセルを導入すると、ミセルが不安定化し、内部の遷移金属が効率よく放出されることを見出した。本発明者らはまた、アスコルビン酸と上記方法で安定化したミセルとを併用すると、還元剤であるアスコルビン酸投与直後からミセルによる抗がん作用が増大することを見出した。本発明者らはさらにまた、酸化処理と熱処理の両方にミセルを供すると、それぞれ単独処理に供したミセルよりも高い安定化効果を示すことを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
　本発明は、以下の発明を提供する。
（１）親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属との錯体を含む遷移金属内包ミセルであって、遷移金属が酸化型である、ミセル。
（２）遷移金属が白金または銅である、上記（１）に記載のミセル。
（３）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがアニオン性アミノ酸ポリマーである、上記（１）または（２）に記載のミセル。
（４）アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位として遷移金属錯体の配位子と配位子交換して遷移金属と配位結合を形成する、上記（３）に記載のミセル。
（５）アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位としてグルタミン酸を含む、上記（３）に記載のミセル。
（６）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金または酸化型銅を含む、上記（１）に記載のミセル。
（７）上記（１）～（６）のいずれかに記載のミセルを含む、医薬組成物。
（８）還元剤と併用するための、上記（７）に記載の医薬組成物。
（９）還元剤と上記（７）に記載の医薬組成物との組合せ医薬。
（１０）還元剤が、アスコルビン酸または薬学上許容されるその塩である、上記（８）に記載の医薬組成物または上記（９）に記載の組合せ医薬。
（１１）アスコルビン酸または薬学上許容されるその塩を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物であって、上記（１）～（８）のいずれかに記載の医薬組成物と併用するための、医薬組成物。
（１２）親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属との錯体を含む遷移金属内包ミセルであって、４０℃～８５℃の熱処理がなされた、ミセル。
（１３）遷移金属が白金または銅である、上記（１２）に記載のミセル。
（１４）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがアニオン性アミノ酸ポリマーである、上記（１２）または（１３）に記載のミセル。
（１５）アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位として遷移金属錯体の配位子と配位子交換して遷移金属と配位結合を形成する、上記（１４）に記載のミセル。
（１６）アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位としてグルタミン酸を含む、上記（１４）に記載のミセル。
（１７）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金または酸化型銅を含む、上記（１２）に記載のミセル。
（１８）上記（１２）～（１７）のいずれかに記載のミセルを含む、医薬組成物。
（Ａ１）親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセルであって、遷移金属または両性金属が酸化型である、ミセル。
（Ａ２）金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーがアニオン性ポリマーである、上記（Ａ１）に記載のミセル。
（Ａ３）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがアニオン性アミノ酸ポリマーである、上記（Ａ１）または（Ａ２）のいずれかに記載のミセル。
（Ａ４）アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位としてグルタミン酸を含む、上記（Ａ３）に記載のミセル。
（Ａ５）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金または酸化型銅を含む、上記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに記載のミセル。
（Ａ６）上記（Ａ１）～（Ａ５）のいずれかに記載のミセルを含む、医薬組成物。
（Ｂ１）親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセルであって、ミセルが形成時、または形成後に４０℃～８５℃の温度で加熱処理されている、ミセル。
（Ｂ２）金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーがアニオン性ポリマーである、上記（Ｂ１）に記載のミセル。
（Ｂ３）アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位としてグルタミン酸を含む、上記（Ｂ２）に記載のミセル。
（Ｂ４）親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金または酸化型銅を含む、上記（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれかに記載のミセル。
（Ｂ５）上記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに記載のミセルを含む、医薬組成物。
（Ｃ１）上記（Ａ１）～（Ａ５）のいずれかに記載のミセルであって、ミセル形成時、または形成後に４０℃～８５℃の温度で加熱処理されている、ミセル。
（Ｃ２）上記（Ｃ１）に記載のミセルを含む、医薬組成物。
図１は、ダハプラチン内包ミセルおよび酸化型ダハプラチン内包ミセルのＸ線吸収スペクトル、ａ／ｂ比、および４価白金（Ｐｔ（ＩＶ））の相対量を示す。 図２は、様々な分子をリガンドとするダハプラチンを内包させたミセルにおける、酸化処理のミセル安定化に対する効果を示す。 図３は、酸化型遷移金属錯体ミセルを還元剤としてのグルタチオン（ＧＳＨ）で処理すると、還元剤添加直後に、白金がミセルから放出されること、およびミセルが解離することを示す。 図４は、酸化型遷移金属錯体ミセルを還元剤としてのアスコルビン酸ナトリウム（ビタミンＣナトリウム塩、またはＮａＡｓｃ）で処理すると、還元剤添加直後に、白金がミセルから放出されること、およびミセルが解離することを示す。 図４－２は、図４の遷移金属とは別の遷移金属を用いて、酸化型遷移金属錯体ミセルの安定性が向上することと、当該ミセルをアスコルビン酸ナトリウムで処理すると、処理直後に、ミセルが解離することを示す。 図５は、アスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）の方がＧＳＨよりも還元電位が大きいため還元力が低いにもかかわらず、酸化型遷移金属錯体ミセルを不安定化させる能力が高いことを示す。 図６は、血中投与後の各時間における酸化型ダハプラチンミセルの血中滞留量、４価白金（Ｐｔ（ＩＶ））の存在量を示す。 図７は、酸化型ダハプラチンミセルは還元型ダハプラチンと比べて最大耐用量（ＭＴＤ）が上昇することで（Ａ）、多くの抗がん剤を投与でき、抗腫瘍効果が高まること、さらにアスコルビン酸との併用により抗腫瘍効果が顕著に高まること（Ｂ）を示す。 図７－２は、酸化型ダハプラチンミセルが、腫瘍担持モデルにおいて、還元型ミセルよりも、長期にわたって強い抗腫瘍活性を示すことを示す（上パネル）。図７－２はまた、酸化型ダハプラチンミセルは、投与後のマウスの体重変化により示される生体毒性が還元型よりも低いことを示す（下パネル）。 図７－３は、酸化型ダハプラチンミセルと還元型ダハプラチンミセルの肝毒性（血漿GOT濃度および血漿GPT濃度の変化）を示す。 図７－４は、酸化型ダハプラチンミセルと還元型ダハプラチンミセルの骨髄毒性（白血球数、赤血球数、および血小板数）を示す。 図７－５は、酸化型ダハプラチンミセルと還元型ダハプラチンミセルの血漿中での安定性（左パネル）と、腫瘍への集積性（右パネル）を示す。 図７－６は、酸化型ダハプラチンミセルと還元型ダハプラチンミセルの非腫瘍組織（肝臓、脾臓、および腎臓）への集積を示す。 図７－７は、酸化型ダハプラチンミセルと還元型ダハプラチンミセルの腫瘍集積選択性（肝臓、脾臓、または腎臓に対する腫瘍への集積性の比）を集積プラチナ量の比で示す。 図７－８は、酸化型ダハプラチンミセルと還元型ダハプラチンミセルにおける、肝臓、脾臓、または腎臓に対する腫瘍への集積性の比のＡＵＣ（０～９６時間）を示す。 図８は、ミセル形成時に７０℃２４時間の熱処理を受けたミセル（以下、ミセル形成時に熱処理を受けたミセルを「熱処理ミセル（Ｉ）」という）が生理食塩水中で熱処理を受けていないミセルと比較して安定化することを示す図である。 図９は、各種温度で加熱された熱処理ミセル（Ｉ）の粒径、多分散度（ｐｄｌ）および散乱光強度を示す図である。 図９－２は、ミセル形成時の加熱温度と、ミセルの平均粒径、多分散度および散乱光強度との関係を示す図である。 図１０は、各種温度で加熱された熱処理ミセル（Ｉ）中のＰｔとグルタミン酸との濃度比（Ａ）、Ｐｔのミセルへの取り込み収量（Ｂ）、およびポリマーのミセルへの取り込み収量（Ｃ）を示す。 図１０－２は、各種温度で加熱された熱処理ミセル（Ｉ）中のＰｔとグルタミン酸との濃度比、Ｐｔのミセルへの取り込み収量、およびポリマーのミセルへの取り込み収量を示す。 図１１は、７０℃を中心として５０℃～８０℃の温度領域で加熱された熱処理ミセル（Ｉ）が長時間安定であることを示す図である。 図１１－２は、加熱時間と溶液中での加熱型ミセルの安定性との関係を示す図である。 図１１－３は、シスプラチン内包ミセルの形成時の加熱温度と溶液中での安定性との関係を示す。 図１２は、加熱処理された熱処理ミセル（Ｉ）の、血中を代表するｐＨおよび細胞内のエンドソーム中を代表するｐＨにおける白金放出挙動を示す図である。 図１２－２は、シスプラチン内包ミセルの安定性とｐＨとの関係を示す。 図１３は、酸化処理された熱処理ミセル（Ｉ）および（ＩＩ）が酸化処理または熱処理単独よりも高い安定性を有することを示す図である。 図１４は、ミセル形成時の加熱温度と最大耐用量（ＭＴＤ）との関係を示す。 図１５は、加熱型ダハプラチンミセル（熱処理ミセル（Ｉ））の腫瘍担持モデルにおける抗腫瘍効果を示す（左パネル）。図１５はまた、当該ミセル投与による副作用を投与されたマウスの体重により示す（右パネル）。 図１６は、加熱型ダハプラチンミセル（熱処理ミセル（Ｉ））の腫瘍担持モデルにおける抗腫瘍効果を示すカプランマイヤー曲線である。 図１７は、加熱型ダハプラチンミセル（熱処理ミセル（Ｉ））の肝毒性を示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「処置」とは、症状の発生を予防する、発達を抑制する、または病状を変更することを意図して行われる介入を意味する。本明細書では、「処置」は、治療的処置および予防的処置の両方を含む意味で用いられる。本明細書では、「治療」とは、症状の進行速度を低下させる、進行を防ぐ、症状を軽減する、および症状を消失させることを含む意味で用いられる。
　本明細書では、用語「対象」とは、哺乳動物を意味し、例えば、ヒト対象を含む意味で用いられる。
　本明細書では、「遷移金属」とは、３族～１１族の元素である。遷移金属は、原子の最外殻より内側の電子軌道（通常、ｄ軌道）が途中まで埋まった電子配置を有し得る。遷移金属としては、特に限定されないが例えば、白金、銅、クロム、マンガン、コバルト、ニッケルおよびモリブデンが挙げられる。遷移金属は、内殻のｄ軌道に不安定な不対電子を有することができ、このため、複数の価数を取り得る。本明細書では、「両性金属」とは、１３族～１５族の元素をいう。両性金属としては、例えば、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、アンチモンが挙げられる。
　遷移金属は、様々な原子団と化学的に結合することができ、錯体を形成することができる。錯体中では、遷移金属と原子団とが配位結合により結合する。本明細書では、遷移金属と配位結合する原子団を配位子（リガンド）と呼ぶ。また、本明細書では、配位子が別の配位子に交換することを配位子交換という。
　本明細書では、「ダハプラチン」（「ＤＡＣＨＰｔ」ともいう）とは、ジアミノシクロヘキサン配位子を有する白金（ＩＩ）を意味する。本明細書では、ダハプラチンと後述する酸化型ダハプラチンとの区別を明確にするためにダハプラチンを還元型ダハプラチンと呼ぶこともある。本明細書では、「酸化型ダハプラチン」（「Ｏ－ＤＡＣＨＰｔ」ともいう）は、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＶ）を意味する。
　ダハプラチンは、錯体の配位子交換により、カルボキシル基と反応することが知られている。特に、カルボキシル基を有する単量体単位を含むポリマーとダハプラチンを混合すると、ダハプラチンは、ポリマー上のカルボキシル基と配位子交換により結合し、ポリマーの電荷を中和するとともにポリマーを疎水性に変え、ポリマーとダハプラチンとのミセル（以下、「ダハプラチンミセル」、「ダハプラチン内包ミセル」または「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」ともいう）が形成されることが知られている。ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」ともいう）とカルボキシル基を有する単量体単位とのブロック共重合体とすることができる。
　本明細書では、配位子（リガンド）とは、金属の配位子である官能基または分子全体を意味する。例えば、ダハプラチンの場合にはリガンドはダハプラチン中のＰｔが配位する分子を意味する。ダハプラチンの配位子としては、特に限定されないが例えば、ジアミノシクロヘキサン配位子に加えて、Ｃｌ、ＮＯ３、Ｈ２ＯおよびＡｃＯがあげられる。ダハプラチンの配位子として許容される組合せとしては、特に限定されないが例えば、ジアミノシクロヘキサン配位子に加えて、ＣｌとＮＯ３との組合せ、ＣｌとＨ２Ｏとの組合せ、ＡｃＯとＡｃＯとの組合せ、およびＨ２ＯとＨ２Ｏとの組合せが挙げられる。ダハプラチンは、上述の通り配位子交換によりポリマー中のカルボキシル基（カルボキシラート）と配位し得る。
　本明細書では、「カルボプラチン」とは、１，１－シクロブタンジカルボン酸配位子を有する白金をいう。カルボプラチンは、１，１－シクロブタンジカルボン酸配位子に加えて、ＮＨ３を配位子として有していてもよい。カルボプラチンは、配位子交換によりポリマー中のカルボキシル基（カルボキシラート）と配位し得る。
　本明細書では、「シスプラチン」とは、ｃｉｓ－ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を意味する。ただし、本明細書では、ｃｉｓ－ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の塩素原子の１つまたは２つが配位子交換により共重合体の側鎖と配位子交換したものを、便宜的にシスプラチンと共重合体との錯体と表現する。また、そのような錯体を含むミセルを、便宜的にシスプラチン内包ミセルと表現する。シスプラチンは、配位子交換によりポリマー中のカルボキシル基（カルボキシラート）と配位し得る。
　一般的に金属錯体の安定化を図ると、形成した錯体から金属が放出されなくなるか、あるいは効率よくもしくは適当の速度で放出されなくなる場合がよくある。例えば、シスプラチン（ｃｉｓ－ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＤＤＰともいう）の塩素イオン配位子をタンパク質中のシステイン、メチオニン、ヒスチジンなどの側鎖残基（これらはカルボキシルアニオンに比べて遥かに強い求核性を有する）で交換すると、極めて安定な錯体が形成し、生理食塩水中でも、さらなる塩素イオン配位子への再交換が起こらず、ＣＤＤＰは生体内で活性を示さなくなる場合さえある。しかし、ポリ（エチレングリコール）セグメントとポリ（α－グルタミン酸）セグメントを含んでなるブロック共重合体とＣＤＤＰとの錯体が、安定なミセル構造を有する上に、静脈投与するとＣＤＤＰ単体よりも優れた抗がん作用を示す（ＷＯ２００２／２６２４１）ことが示されている。
　しかしながら、より生体内での安定性が高く、血中で分解されて薬剤を放出するリスクが低減されたミセルを提供することができれば、より副作用が少なく、がんを処置することが可能となる。
　本発明によれば、酸化処理された遷移金属または両性金属は、酸化型の形態を有し、ミセルを安定化し得る（得られたミセルを酸化型ミセルまたは酸化型遷移金属内包ミセルまたは酸化型両性金属内包ミセルと呼ぶ）。理論に拘束されることを望まないが、遷移金属または両性金属の酸化数が増加すると錯体の配位子交換反応が遅くなり、遷移金属または両性金属とミセルを構成するポリマーとの配位結合が安定化されることが一因であると考えられた。一方で、得られた酸化型ミセルは、還元環境で還元されて、不安定化され、内包された薬剤をミセルから放出し得る。生体内では、がん細胞の細胞内が、酸化型ミセルを不安定化させるに十分な還元環境を有している。したがって、本発明による酸化処理された遷移金属または両性金属を内包したミセルは、がん細胞において内包した薬剤を放出する薬剤送達システムを提供する。また、上記酸化型ミセルは、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などの還元剤により還元されて内包された薬剤をミセルから放出し得る。したがって、本発明による酸化処理された遷移金属を内包したミセルは、還元剤投与によりその薬剤放出が制御され得る。このように、本発明は、薬剤送達システムと内包される薬剤の制御放出技術を提供するものである。
　本発明では、遷移金属としては、例えば、白金を用いることができる。白金は、還元環境下ではＩＩ価であるが、酸化環境にさらすとＩＶ価の金属となる。本発明では、遷移金属が白金である場合、酸化型とは、ＩＶ価の白金を意味し、還元型とは、ＩＩ価の白金を意味する。また、本発明では、遷移金属が白金である場合、酸化型ミセルとは、ＩＶ価の白金を錯体中に含むミセルを意味し、還元型ミセルとは、ＩＩ価の白金を錯体中に含むミセルを意味する。また、本明細書では、酸化型遷移金属は、酸化されることにより得られ得、還元型遷移金属は、還元されることにより得られ得る。白金錯体としては、いわゆるシスプラチン（ＣＡＳ番号：１５６６３－２７－１）、ダハプラチン、カルボプラチン（ＣＡＳ番号：４１５７５－９４－４）、およびオキサリプラチン（ＣＡＳ番号：６３１２１－００－６）が挙げられ、本発明のミセルを作製するために用いることができる。
　遷移金属としては、例えば、鉄および銅を用いてもよい。ある態様では、例えば、銅は＋Ｉ価が還元型、＋ＩＩ価が酸化型で、鉄は＋ＩＩ価が還元型、＋ＩＩＩ価が酸化型である。バナジウム、マンガン、コバルト（＋ＩＩ価が還元型、＋ＩＩＩ価が酸化型）、モリブデン、ルテニウム、およびパラジウムについても、酸化することで金属と配位子の結合が高まり得る。遷移金属または両性金属が酸化型か還元型であるかは、相対的な事項であるが、当業者であれば、価数が増加するほどミセルを安定化させるものと理解することができる。また、酸化型か還元型かは、当業者であれば容易に決定することができる。
　本発明によれば、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む遷移金属または両性金属内包ミセルであって、遷移金属または両性金属が酸化型である、ミセルが提供される。
　本発明において、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体は、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体のフリー体または塩であってもよい。塩としては、例えば、薬学上許容可能な塩が挙げられる。本明細書では、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体は、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとからなるブロック共重合体であるか、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとの間にリンカーを有しているブロック共重合体であり得る。親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体は、その親水性ポリマー側の末端および／またはアニオン性ポリマー側の末端に、ブロック共重合体のミセル化に影響しない基（例えば、メチル基、メトキシ基等）を有していてもよい。
　親水性ポリマーブロックとしては、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられ、本発明で用いることができる。ポリエチレングリコールブロックは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－で表され、ｎは、５～２０，０００の整数、好ましくは１０～５，０００の整数、より好ましくは４０～５００の整数、さらに好ましくは１０～５００の整数とすることができる。
　本発明のある態様では、親水性ポリマーブロックとして、多分岐ポリエチレングリコール、ポリビニルピリリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ジビニルエーテル－無水マレイン酸（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリオキサゾリン、ポリリン酸、ポリホスファゼン、および２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。
　金属配位性官能基としては、カルボキシル基（脱プロトン化状態を含む）、アミノ基（１級、２級、３級、芳香族を問わず）、チオール基（脱プロトン化状態を含む）、アミド、チオアミド、イミン、シアノ基、ウレタン、カルボニル、ヒドロキシル基（脱プロトン化状態を含む）、チオエーテル（スルフィド）、ホスフィノ基、エステル、チオエステル、リン酸エステル、スルホ基、上記官能基を含むキレート配位子（エチレンジアミン、シュウ酸、グリシン、２，２’－ビピリジンなど）が挙げられ、当業者であれば、金属と金属配位性官能基との組合せを適宜選択して用いることができる。
　単量体単位が金属配位性官能基を有する単量体単位を含むポリマーブロックは、上記金属配位性官能基を有する高分子、例えば、キサンタンガム、ペクチン、キトサン、デキストラン、カラギーナン、グアーガム、セルロースエーテル、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、アルブミン、およびデンプンが挙げられる。上記金属配位性官能基を有する高分子は、例えば、ペプチドであり得、例えば、ポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり得る。
　アニオン性ポリマーとしては、例えば、アニオン性アミノ酸のポリマー、例えば、グルタミン酸とアスパラギン酸とのポリマーなどのグルタミン酸とアスパラギン酸を含むポリマー、ポリグルタミン酸などのグルタミン酸を含むポリマー、ポリアスパラギン酸などのアスパラギン酸を含むポリマー、アクリル酸を含むポリマー、およびメタクリル酸を含むポリマーが挙げられ、本発明で用いることができる。これらのアニオン性アミノ酸ポリマーにおいて、単量体単位は、２～２０，０００の整数、好ましくは２～５，０００の整数、より好ましくは１０～５００の整数、さらに好ましくは１０～２００の整数とすることができる。
　親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体は、以下のように作製し得る。例えば、ＰＥＧ－ポリグルタミン酸ブロック共重合体は、ＰＥＧにγ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸Ｎ－カルボキシ無水物を重合させて、保護基を脱保護することにより得ることができる。ＰＥＧ－ポリアスパラギン酸ブロック共重合体も、同様にして作製し得る。
　本発明によれば、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む遷移金属または両性金属内包ミセル（以下、それぞれを「遷移金属内包ミセル」または「両性金属内包ミセル」という）は、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属錯体または両性金属とを混合して配位子交換反応によって得られる。混合により、前記ブロック共重合体は、遷移金属錯体または両性金属と配位子交換により配位結合を形成してミセルを形成すると考えられる。この意味で、前記遷移金属または両性金属内包ミセルの多くは、配位子交換されており、混合する遷移金属錯体または両性金属とは異なる化学結合状態にあると考えられる。
　本発明によれば、酸化剤により、得られたミセルに内包された遷移金属を酸化することができる。本明細書では、このようにして得られたミセルを酸化型遷移金属内包ミセルと呼ぶ。本発明によれば、酸化剤により、得られたミセルに内包された両性金属を酸化することができる。本明細書では、このようにして得られたミセルを酸化型両性金属内包ミセルと呼ぶ。酸化型遷移金属内包ミセルまたは酸化型両性金属内包ミセルでは、遷移金属の酸化数が増加した結果として、配位子としてのブロック共重合体との配位結合が強まり、さらなる配位子交換に対して抵抗性を有すると考えられた。また、酸化により、配位子交換が促進され、ブロック共重合体との配位結合数が増加した可能性も考えられた。そして、本発明の酸化型遷移金属または両性金属内包ミセルは、酸化型である限りにおいて分解から安定であり、内包された遷移金属または両性金属の放出が抑制される。本発明によれば、酸化型の遷移金属または両性金属をミセルに内包させてもよい。
　本発明のある特定の態様では、遷移金属内包ミセルは、親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と、白金錯体、例えば、シスプラチン、ダハプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンからなる群から選択される１つ以上の白金錯体とを混合して得られるミセルであり得る。本発明のある態様では、酸化型遷移金属内包ミセルは、このようにして得られたミセルをさらに酸化して得られたものであり得る。遷移金属内包ミセルの酸化は、酸化剤を用いて行うことができる。本発明のある態様では、酸化剤として、特に限定されないが例えば、過酸化水素を用い得る。
　本発明のある側面では、本発明の酸化型遷移金属内包ミセルまたは酸化型両性金属内包ミセルを含む医薬組成物が提供される。本発明のある態様では、酸化型遷移金属内包ミセルまたは両性金属内包ミセルにおいて、親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金を含むダハプラチンまたはシスプラチンである。
　本発明の酸化型遷移金属または両性金属内包ミセルを含む医薬組成物は、還元剤（薬学上許容される還元剤、例えば、アスコルビン酸またはその薬学上許容される塩）と併用することができる。還元剤により酸化型遷移金属内包または両性金属ミセル中の遷移金属または両性金属は還元され得るが、これにより、ミセルは不安定化して内包する遷移金属または両性金属をミセルから放出し得る。したがって、例えば、本発明の酸化型遷移金属または両性金属内包ミセルを含む医薬組成物は、その投与後に還元剤（薬学上許容される還元剤、例えば、アスコルビン酸またはその薬学上許容される塩）を投与することができる。アスコルビン酸の薬学上許容される塩としては、例えば、アスコルビン酸ナトリウムが挙げられる。
　本発明では、アスコルビン酸は、抗がん作用と還元作用の２つの側面が発揮されることにより、アスコルビン酸が抗がん作用を有する濃度においても、還元作用が発揮されることにより、単独では抗がん作用を有しない濃度においてもアスコルビン酸を用いることもできる。したがって、本発明の酸化型遷移金属または両性金属内包ミセルを含む医薬組成物は、単独では抗がん作用を発揮しない用量のアスコルビン酸と併用することができる。
　本発明のある側面では、アスコルビン酸または薬学上許容されるその塩を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物であって、本発明の酸化型遷移金属または両性金属内包ミセルを含む医薬組成物と併用するための医薬組成物が提供される。アスコルビン酸には、抗がん作用が知られているが、本発明では、アスコルビン酸の還元剤としての性質を利用して、ミセルに内包させた酸化型遷移金属または酸化型両性金属をミセルから放出させるという新しい効果を得ることが可能となる。細胞内は還元環境であることから、これらの金属は、細胞内では還元型である。
　アスコルビン酸またはその塩は、本発明の酸化型遷移金属内包ミセルまたは酸化型両性金属内包ミセル投与後、特に限定されないが例えば、０～２４時間経過後に投与することができる。アスコルビン酸またはその塩は、本発明の酸化型遷移金属内包ミセルまたは酸化型両性金属内包ミセルががん組織に行き渡るに十分な時間が経過した後に投与することもできる。この観点では、アスコルビン酸またはその塩は、例えば、本発明の酸化型遷移金属内包ミセルまたは酸化型両性金属内包ミセル投与後、１時間～３３６時間経過後、２４～２４０時間後、または２４～１６８時間後に投与することができる。
　本発明によれば、親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセルであって、ミセルが形成時、または形成後に４０～８５℃の温度で加熱処理されている、ミセルが提供される。遷移金属または両性金属は、表１に記載された金属であり得る。親水性ポリマーは、上記で説明される通りのポリマーを用いることができ、単量体単位は、上記で説明される通りの単量体単位を用いることができる。遷移金属または両性金属は、上記で説明される通りの金属を用いることができる。
　加熱処理の温度は、４０℃～８５℃の温度範囲の温度とすることができるが、好ましくは、４０℃～７５℃、より好ましくは５０℃～７５℃、さらに好ましくは６０℃～７０℃、または５０℃～７０℃であり得る。
　加熱処理の時間は、特に限定されないが、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、または５日以上とし得る。また、加熱時の上限は、例えば、３日以内、２日以内、２４時間以内、１５時間以内とし得る。
　加熱処理は、ミセルの形成時に行ってもよいし、ミセル形成後に行ってもよい。
　本発明では、ミセルは、酸化処理に加えて加熱処理されていてもよい。例えば、本発明のある態様では、ミセルは、ミセル形成時に加熱処理され、ミセル形成後に酸化処理をなされ得る。本発明のある態様では、ミセルは、ミセル形成後に、加熱処理および酸化処理がなされ得る。
　本発明によれば、親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセル（または当該ミセルを含む医薬製剤）の製造方法であって、ミセル形成時またはミセル形成後に４０℃～８５℃で加熱することを含む、または、ミセルを酸化処理することを含む方法、およびこの方法により得られるミセルが提供される。ここで、遷移金属または両性金属は、酸化型であってもよい。
　本発明では、親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセルを血中で安定化させる方法、またはその血中安定性を向上させる方法であって、ミセル形成時またはミセル形成後に４０℃～８５℃で加熱することを含む、または、ミセルを酸化処理することを含む、方法が提供される。
実施例１：酸化型遷移金属錯体含有ミセルの作製
１．ポリエチレングリコール－ポリグルタミン酸ブロック共重合体の合成
　α－メトキシ－ω－アミノポリエチレングリコール（ＮＯＦ社製）を開始剤として、γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸　Ｎ－カルボキシ無水物（中央化成社製）をＤＭＳＯ中で重合させ、得られた溶液をメタノールに対して透析し、ポリエチレングリコール－ポリ（γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート）（ＰＥＧ－ＰＢＬＧ）を得た。続いて、ＢＬＧに対して５等量の０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を反応させ、ポリエチレングリコール－ポリ（Ｌ－グルタミン酸ナトリウム）（ＰＥＧ－ＰＧｌｕ；Ｍｗ，ＰＥＧ＝１２０００；ＤＰＰＧｌｕ＝４０）を得た。
２．遷移金属錯体の合成
　本実施例では、一例としてダハプラチンを合成した。
アクアクロロ（ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ’）ニトラート
　ＤＡＣＨＰｔＣｌ２（Ｈｅｒｅａｕｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）２００ｍｇを純水５０ｍｌに懸濁し、硝酸銀５９．７４ｍｇを加え、２５℃暗所にて１６時間攪拌した。沈殿した塩化銀をフィルターろ過し、ろ液を凍結乾燥することで表題の錯体を得た。以下、表題の錯体を［ＰｔＩＩＣｌ（ｄａｃｈ）（Ｈ２Ｏ）］（ＮＯ３）とも表記する。
ビス（アセタート）（ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ’）プラチナム（ＩＩ）
　ＤＡＣＨＰｔＣｌ２　３００ｍｇを純水７５ｍｌに懸濁し、酸化銀１７５．５５ｍｇと酢酸８６．７３μｌを加え、６０℃暗所にて１６時間攪拌した。沈殿した塩化銀をフィルターろ過し、ろ液を６０℃で蒸発乾固させた。室温冷却後、エタノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄し、減圧下で乾燥させることで表題の錯体を得た。あるいは、以下、表題の錯体を［ＰｔＩＩ（ＡｃＯ）２（ｄａｃｈ）］とも表記する。
　また、以下では、上記錯体の両方を指していう場合には、ＤＡＣＨＰｔと表記する。
３－１．酸化型ミセルの調製
　上記で得られた白金錯体（ＤＡＣＨＰｔ）とＰＥＧ－ＰＧｌｕを、濃度が［Ｐｔ］＝［Ｇｌｕ］＝５ｍＭとなるように水溶液中で混合し、３７℃で１２０時間反応させた。得られた溶液は透析及び限外ろ過によって精製し、ＤＡＣＨＰｔ／ｍを得た。ここで得られたミセルは、酸化処理前のミセルと呼ぶ。続いて、ミセルの白金濃度に対して１００等量の過酸化水素を室温で反応させ、その後、透析により過剰の過酸化水素を除くことで酸化型ミセルＯ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍを得た。ここで得られたミセルは、酸化処理後のミセルと呼ぶ。
　なお、白金錯体としてシスプラチンを用いた場合も同様に酸化型ミセルが得られた。
３－２．加熱型ミセルの調製
　上記２で得られた白金錯体（ＤＡＣＨＰｔまたはシスプラチン）とＰＥＧ－ＰＧｌｕを、濃度が［Ｐｔ］＝［Ｇｌｕ］＝５ｍＭとなるように水溶液中で混合し、様々な温度（２５、３７、５０、６０、７０、８０、９０℃のいずれか）で１２０時間反応させた。得られた溶液は透析及び限外ろ過によって精製し、熱処理ミセル（Ｉ）を得た。また、前記は、ミセル形成時に加熱するものであるが、これに対して、３７℃の温度でミセルを調製した後、ミセル形成後に７０℃の温度で２４時間反応させる方法によっても熱処理ミセル（ＩＩ）を得た。本明細書では、ミセル形成時に熱処理をして得たミセルを熱処理ミセル（Ｉ）とよび、ミセル形成後に熱処理をして得たミセルを熱処理ミセル（ＩＩ）とよぶ。
４．ミセルの構造解析
粒径分布の解析
　酸化型ミセルおよび熱処理ミセル（ＩＩ）の粒径分布の解析は、２５℃の温度条件で動的光散乱装置（ＤＬＳ８０００；　大塚電子）により行った。結果は、表１－１および表１－２に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１－２に示されるように、加熱処理（７０℃、２４時間）は、ミセルの粒径を変化させないが、多分散度を小さくすることが分かる。
内包白金濃度の定量
　酸化型ミセルに濃硝酸を加えて加熱分解して残った残渣を１％ＨＮＯ３に溶解し、誘導結合プラズマ質量分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ　７７００ｘ）によって白金濃度を定量した。
白金酸化数の解析
　酸化型ミセル溶液を蒸発乾燥させ、Ｘ線吸収微細構造（ＸＡＮＥＳ）スペクトルを得た（ＳＰｒｉｎｇ－８　ＢＬ３７ＸＵビームライン）。ＸＡＮＥＳスペクトルに現れる１１．５７ｋｅＶ付近の極大吸光度（ａ）と１１．５７ｋｅＶ付近の極小吸光度（ｂ）の比（ａ／ｂ）から、酸化型ミセルに含まれる４価錯体の割合を算出した。
　結果は、図１に示される通りであった。図１の右上パネルに示されるように、ａとｂとの比（ａ／ｂ）により白金の酸化の度合いを算出することができる。比を計算すると、図１右上パネルに示されるように、過酸化水素処理によりシスプラチン含有ミセルにおいても、ダハプラチン含有ミセルにおいても、白金が２価から４価に酸化されていることが分かった。また、図１下パネルに示されるように、Ｏ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍにおいては、含有される白金の約６０％が４価に酸化されていることが分かった。
実施例２：酸化型ミセルの安定性評価
　本実施例では、実施例１により得られた酸化型ミセルの安定性を評価した。
生理条件下における酸化型ミセルの解離挙動
リン酸緩衝生理食塩水（10 mM PB + 150 mM NaCl, pH 7.4、37℃）中で酸化型ミセル（濃度は白金錯体基準で０．０５０　ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートし、溶液の散乱光強度（６３２．８　ｎｍ，　９０°，　３７℃）を経持的に測定した。得られた各時間の散乱光強度は、実験開始時の散乱光強度に対して規格化して比較した。なお、シスプラチンを内包する酸化型ミセルの場合には、酸化型ミセルの濃度は白金錯体基準で０．０４０　ｍｇ／ｍｌとした。結果は、図２に示される通りであった。
　図２に示されるように、酸化処理のなされていないミセル（Ｎｏｒｍａｌ）では、時間経過とともに相対散乱光強度（ＳＬＩ）が低下し、ミセルが解離していることが分かるが、酸化型ミセルについては、時間経過に伴う解離が観察されなかった。このことから、遷移金属錯体ミセルの解離は酸化処理によりほぼ完全に抑制できることが明らかとなった。
生理条件下における酸化型ミセルの白金錯体放出挙動
　リン酸緩衝生理食塩水（10 mM PB + 150 mM NaCl, pH 7.4、37 ℃）　５０　ｍｌ中で酸化型ミセル１ｍｌを透析し（透析膜中のミセルの初期濃度は白金錯体基準で０．２５　ｍｇ／ｍｌ）、外液に放出された白金錯体の量をＩＣＰ－ＭＳにより解析した。なお、シスプラチンを内包する酸化型ミセルの場合には、透析膜中のミセルの初期濃度は白金錯体基準で０．５０　ｍｇ／ｍｌとした。
還元条件下における酸化型ミセルの挙動
　上記と同様のリン酸緩衝生理食塩水に対して、一定時間後（０時間、７２時間後、２４０時間後）にグルタチオン（ＧＳＨ）もしくはアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）を加え、白金を還元して、ミセルの解離挙動及び白金錯体放出挙動を調べた。加えた還元剤の濃度はがん細胞内と同等の５ｍＭとした。結果は、図３および４に示される通りであった。
　図３に示されるように、酸化型ミセルは、グルタチオンの添加とともに白金錯体を溶液中に放出する（図３左）一方で、ミセル自体がグルタチオンの添加とともに解離する（図３右）ことが明らかとなった。このことから、酸化型ミセルは、血漿中では安定であり、かつ、がん細胞内に侵入したとたんに白金錯体を放出させることが可能となることが示唆された。
　また、図４に示されるように、酸化型ミセルは、アスコルビン酸ナトリウム（ＶＣ）の添加とともに白金錯体を溶液中に放出する（図４右）一方で、ミセル自体がアスコルビン酸ナトリウム（ＶＣ）の添加とともに解離する（図４左）ことが明らかとなった。このことから、酸化型ミセルは、血漿中では安定であり、かつ、アスコルビン酸を添加すると白金錯体を放出させることが示唆された。
　この結果からの考察として、遷移金属または両性金属の酸化数が増加すると錯体の配位子交換反応が遅くなり、遷移金属または両性金属とミセルを構成するポリマーとの配位結合が安定化されることが一因であると考えられた。一方で、得られた酸化型ミセルは、還元環境で還元されて、不安定化され、内包された薬剤をミセルから放出し得る。生体内では、がん細胞の細胞内が、酸化型ミセルを不安定化させるに十分な還元環境を有している。したがって、本発明による酸化処理された遷移金属または両性金属を内包したミセルは、がん細胞において内包した薬剤を放出する薬剤送達システムを提供すると考えられる。
　次に、白金錯体に変えて酸化型銅錯体、具体的には硫酸銅(II)錯体または硫酸鉄(III)錯体を内包させたミセルにおいて、緩衝液中または塩溶液中での安定性と、アスコルビン酸ナトリウムによる還元の影響を調べた。緩衝液としては、HEPES緩衝液（10mM）を用い、塩溶液としては、150mM NaCl溶液を用いた。硫酸銅（II）錯体内包ミセルまたは硫酸鉄(III)錯体内包ミセルは、以下のように調製した。
　硫酸銅（II）錯体内包ミセルは、5 mM硫酸銅(II)と実施例１で合成したPEG-PGluを、濃度が[Cu] = [Glu] = 5 mMとなるように水溶液中で混合し、室温で24時間反応させて調製した。
　硫酸鉄(III)錯体内包ミセルは、硫酸鉄(III)とPEG-PGluを、濃度が[Fe] = 2 mM、[Glu] = 5 mMとなるように水溶液中で混合し、室温で24時間反応させて調製した。また、別報として、硫酸鉄(II)とPEG-PGluを、濃度が[Fe] = 2 mM、 [Glu] = 5 mMとなるように水溶液中で混合し、室温で24時間反応させた後、100等量の過酸化水素水を加えて酸化を促進して調製した。
　ミセルの安定性は、上記の通り散乱光強度により推定した。２４時間経過後にアスコルビン酸ナトリウム（VC）を添加してミセルに内包された硫酸銅錯体を還元した。結果は図４－２に示される通りであった。図４－２に示されるように、酸化型銅(II)錯体内包ミセルは、HEPES緩衝液およびNaCl溶液中で安定であり、アスコルビン酸ナトリウム添加により錯体を還元すると不安定化してミセルが崩壊する（すなわち、内部の錯体が放出される）ことが分かった。この結果から、銅錯体ミセルは、酸化型とすることにより溶液中で安定化し、還元することにより溶液中で不安定化し、内容物である銅錯体を放出する特性を有することが明らかとなった。また、上記２通りの方法で調製した酸化型鉄錯体内包ミセルも同様に、還元型よりも溶液中で安定であった。
　これらの結果は、酸化数を相対的に増減させることにより、遷移金属または両性金属の錯体ミセルの相対的な安定度が変わることを示すものである。
　さらに、グルタチオンとアスコルビン酸とでミセルの解離速度を比較した。結果は、図５に示される通りであった。
　図５に示されるように、酸化型ミセルの溶液中での解離速度に関して、アスコルビン酸を添加した後の解離速度がグルタチオンを添加した後の解離速度よりも速かった。アスコルビン酸は、グルタチオンよりも還元力は小さいと考えられるため、還元力の小さいアスコルビン酸による酸化ミセルの解離速度が、グルタチオンによるそれよりも速かったことは意外であった。
実施例３：酸化型ミセルの血中滞留性の評価
　本実施例では、インビボにおける酸化型ミセルの血中滞留性を評価した。
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、ｎ＝３、雌、チャールズリバー社）に対して酸化型ミセルを１００　μｇ／マウスの投与量で静脈投与し、２４時間後及び４８時間後に血液を採取し、遠心分離により血漿を得た。得られた血漿サンプルの一部は濃硝酸による加熱処理の後ＩＣＰ－ＭＳで白金錯体の量を定量した。また、血漿サンプルの一部は凍結乾燥後、ＸＡＮＥＳスペクトルを測定し、白金原子の酸化数の解析を行った。結果は、図６に示される通りであった。
　図６に示されるように、投与２４時間後でも、投与したミセルの４９％が血中で検出され、投与４８時間後でも、投与したミセルの３３％が血中で検出された。また、白金錯体の価数を評価したところ、図６に示されるように、５９％のミセルが酸化型ミセル（すなわち、Ｐｔ（ＩＶ）を含有する）のに対して、２４時間後でも２８％が酸化型ミセルとして残っていた。
　なお、H. Cabral et al., J. Control. Release 101, 223, (2005)によれば、還元型ダハプラチンミセルは、投与２４時間後で２０％未満、投与４８時間で８％未満しか残存しないこと（図６参照）を考慮すると、酸化型ミセルはインビボでも血中安定性が高いことを示すものである。
実施例４：酸化型ミセルの抗腫瘍効果
　本実施例では、上記実施例で得られた酸化型ミセルの抗腫瘍作用を確認した。本実施例ではまた、上記実施例で得られた酸化型ミセル投与後に、アスコルビン酸を投与してミセルを解離させた場合の抗腫瘍作用を確認した。
　１×１０６個のＣ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植した。１週間後、ＰＢＳ（コントロール）、ダハプラチンミセル　１５ｍｇ／ｋｇ、酸化型ダハプラチンミセル　５０ｍｇ／ｋｇを尾静脈から投与し、２日ごとに腫瘍体積の変化を追った。また、高濃度ビタミンＣの作用を評価するために、薬剤投与後２日目に、４ｇ／ｋｇのアスコルビン酸ナトリウムを腹腔内投与した。Ｃ２６細胞は、国立がんセンターから提供されたがん細胞であり、１０％ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。結果は、図７に示される通りであった。
　図７のパネルＡに示されるように、ダハプラチンミセルでは１５ｍｇ／ｋｇの投与でマウスの体重が極めて大きな変化を生じ、８日で死亡したが、酸化型ダハプラチンミセルでは、５０ｍｇ／ｋｇの投与でも体重変化は小さかった。また、図７のパネルＢに示されるように、ダハプラチンミセルよりも酸化型ダハプラチンミセルを投与した方が、抗腫瘍効果が大きいことが分かった。特に、酸化型ダハプラチンミセルでは、腫瘍体積を縮小させることができた。次に、酸化型ダハプラチンミセルに続いてアスコルビン酸を投与した群では、この抗腫瘍効果が増大することも明らかとなった。
　2×105個のC26細胞をBALB/cマウス（6週齢；メス）の皮下に移植した。5日後、PBS（コントロール）、オキサリプラチン15 mg/kg、ダハプラチンミセル10 mg/kg、酸化型ダハプラチンミセル10 mg/kg、酸化型ダハプラチンミセル20 mg/kgを尾静脈から投与し、腫瘍体積の変化を追った。腫瘍の平均直径が15 mmを超えたマウスについてはその時点で安楽死させた。C26細胞は、国立がんセンターから提供されたがん細胞であり、皮下移植するまでは10%FBSと100U/mlペニシリンーストレプトマイシンを含むRPMI1640培地にて5%CO2、37℃の条件で培養した。結果は、図７－２に示される通りであった。
　図７－２の上パネルに示されるように、酸化型ダハプラチンミセル（O-DACHPt/m）は、同量の還元型ダハプラチンミセル（DACHPt/m）よりも顕著な抗腫瘍効果を奏し、相対腫瘍体積の増加を強力に抑制した。また、その効果の強さは用量依存的であった。図７－２の下パネルに示されるように、酸化型ダハプラチンミセルは、オキサリプラチンや還元型ダハプラチンミセルと比較してマウスの体重に対する影響は少ない、または観察されなかった。
　血漿GOTおよびGPT濃度を常法により決定した。その結果は図７－３に示される通りであった。図７－３に示されるように、酸化型ダハプラチンミセルでは、還元型ダハプラチンミセルと比較して低いGOT濃度及び低いGPT濃度を示した。これにより、酸化型プラチナミセルは、肝毒性をほとんど有しないことが示された。
　次に、酸化型プラチナミセルの骨髄毒性についても確認した。BALB/cマウス（6週齢；メス）に対して、PBS（コントロール） 、オキサリプラチン、ダハプラチンミセル、酸化型ダハプラチンミセルをそれぞれ10 mg/kg 尾静脈から投与した。7日後に採血し、血球計算機により白血球数、赤血球数、血小板数を算出した。結果は、図７－４に示される通りであった。図７－４に示されるように、酸化型ダハプラチンミセルは、白血球、赤血球および血小板のいずれについても、投与による大きな減少は確認されなかった。この結果は、投与によりこれらに影響するオキサリプラチンや還元型ダハプラチンミセルとは対照的な結果であった（図７－４参照）。この結果から、酸化型プラチナミセルは、骨髄毒性をほとんど有しないことが示された。
　さらに、酸化型プラチナミセルの臓器集積量を調べた。具体的には、BALB/cマウス（6週齢；メス）に対して、ダハプラチンミセルまたは酸化型ダハプラチンミセルを5 mg/kgの投与量で尾静脈から投与した。24時間後、48時間後、72時間後、96時間後に、血液、腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓を採取し、血液は遠心分離により血漿を得た。得られたサンプルは濃硝酸による加熱処理の後、ICP-MSで白金錯体の量を定量した。結果は、図７－５～７－８に示される通りであった。
　図７－５の左パネルに示されるように、酸化型ダハプラチンミセルは、静脈投与後の血中滞留性が還元型ダハプラチンミセルと比較して顕著に高いことが示された。また、図７－５の右パネルに示されるように、酸化型ダハプラチンミセルは、腫瘍に対する蓄積量が時間経過に関わらず高く維持され、これは還元型ダハプラチンミセルで時間経過と共に蓄積量が大きく低下することと対照的な結果であった。
　図７－６に示されるように、臓器別の集積量は、肝臓、脾臓、および腎臓のそれぞれにおいて、酸化型ダハプラチンミセルは、還元型ダハプラチンミセルよりも顕著に低かった。また、図７－７では、これらの集積量を腫瘍／肝臓、腫瘍／脾臓、および腫瘍／腎臓の比で表された。その結果、酸化型ダハプラチンミセルは、還元型ダハプラチンミセルよりも顕著に高い腫瘍集積選択性を示すことが明らかになった。図７－８では、上記腫瘍／肝臓、腫瘍／脾臓、および腫瘍／腎臓の比の96時間の曲線下面積（AUC）を表す。図７－８に示されるように、酸化型ダハプラチンミセルは、還元型ダハプラチンミセルよりも高い腫瘍／臓器の集積比率を有することが明らかとなった。
　このように、酸化型プラチナミセルは、生体内においても高い安定性を有した。この高い安定性は、肝臓や腎臓などの臓器への集積が低下したこと、すなわち、クリアランスが低下したことが腫瘍への集積選択性に寄与したものと考えられた。すなわち、ミセルは、正常組織には取り込まれにくく、腫瘍に対してはＥＰＲ効果による集積選択性を示す。これに対して、ミセルが壊れると抗がん剤が血中に放出され、上記選択性を低下させる結果となる。ミセルが血中において安定であれば、血中に放出されるフリーの抗がん剤濃度は低下し、非腫瘍への非特異的集積が抑えられ、結果として腫瘍選択性が向上すると考えられた。
　また、酸化型ダハプラチンミセルは、その安定性から最大耐用量（ＭＴＤ）が増大したことにより大量に投与が可能となった。これにより、低い毒性で高い抗腫瘍効果を得ることが可能となった。アスコルビン酸を投与することで、体内では、酸化型ダハプラチンミセルが解離し、ダハプラチンが放出されたと考えられる。これにより、アスコルビン酸を併用することで、血中に安定的に滞留する酸化型ミセルを崩壊させ、抗腫瘍効果を発揮させるという新しい制御放出技術が確立された。
実施例５：熱処理ミセルの安定性評価
　本実施例では、実施例２と同様の方法で、上記で得られた熱処理ミセル（Ｉ）の安定性を評価した。
　ミセルは、７０℃で２４時間加熱したミセルを用いた。結果は、図８に示される通りであった。図８に示されるように、熱処理を行ったミセルは、熱処理をしなかったミセルと比較して、安定性が向上した。安定化効果は、熱処理ミセル（ＩＩ）においても同様に確認された。
　次に、様々な温度で熱処理を加えたミセルについて、実施例１と同じように、粒径、多分散度（ｐｄｌ）および散乱光強度を測定した。その結果は、図９に示される通りであった。図９に示されるように、粒径は、加熱する温度が上昇すると大きくなった。多分散度は温度の上昇によっても大きな変化は観察されなかった。散乱光強度は、加熱する温度が上昇すると大きくなった。但し、いずれの測定値も９０℃の加熱時には、他の温度とは大きく異なる数値を示した。９０℃の加熱では、凝集などが生じ異常なミセルが発生した可能性が考えられた。
　内包白金量（［Ｐｔ］／［Ｇｌｕ］）を実施例１と同じ方法で測定した。結果は、図１０に示される通りであった。図１０のパネルＡ示されるように、得られた熱処理ミセル（Ｉ）の内包白金量は、加熱する温度が上昇すると増加する傾向を示した。このことは、加熱処理によりグルタミン酸の側鎖であるカルボキシラートに対する白金の配位が増加したことを示すものである。但し、９０℃の加熱時には、内包白金量が他とは大きく異なる値を示した。
　Ｐｔのミセルへの取り込みの効率（収量）を確認すると、図１０のパネルＢに示されるように、Ｐｔの取り込み収量は、８０℃および９０℃では低下した。また、図１０のパネルＣに示されるように、グルタミン酸ポリマーのミセルへの取り込み収量は、８０℃および９０℃で大きく低下した。
　さらにシスプラチン内包ミセルにおいても同様に、熱処理ミセル（Ｉ）の内包白金量（[Pt]/[Glu]）、Ｐｔのミセルへの取り込み収量、および、グルタミン酸ポリマーのミセルへの取り込み収量を測定した。結果は、図１０－２に示される通りであった。図１０－２に示されるように、内包白金量は、加熱する温度が上昇すると増加する傾向を示した。また、図１０－２に示されるように、Ｐｔのミセルへの取り込み収量も、加熱する温度が上昇すると増加する傾向を示した。さらに、ポリマーのミセルへの取り込み収量は、70℃で少し低下したが、温度によらず概ね一定であった。
　さらに実施例２と同じ条件で熱処理ミセル（Ｉ）のリン酸緩衝生理食塩水中での安定性を評価した。結果は、図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、熱処理ミセル（Ｉ）は、２５℃～７０℃の温度範囲では温度が高温であると安定となる傾向を示した。２５℃または３７℃で形成させたミセルと比較して、９０℃では安定性の向上効果は限定的であった。特に５０℃～８０℃の熱処理によるミセルの安定化効果は顕著であった。
　次に、加熱時間が熱処理ミセルの安定性に及ぼす影響を調べた。上記においては、２４時間加熱したミセルを用いていたが、３時間、６時間、または９時間加熱したミセルの安定性を実施例２と同じ手法で評価した。結果は、図１１－２に示される通りであった。図１１－２に示されるように、加熱時間依存的に溶液中での安定性が向上することが明らかとなった。
　また、実施例１で得られた加熱型シスプラチン内包ミセルの溶液安定性を評価した。具体的には、２５℃、３７℃、５０℃、または７０℃でそれぞれ２４時間加熱し、実施例２に記載の方法で溶液中での安定性を評価した。結果は、図１１－３に示される通りであった。図１１－３に示されるように、シスプラチン内包ミセルでも７０℃の加熱は、ミセルの安定化に対して有効であった。
　さらに実施例２と同様に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ５．５およびｐＨ７．４）中における熱処理ミセル（Ｉ）からの白金の放出挙動を調べた。結果は、図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、熱処理ミセル（Ｉ）は、熱処理温度が高温であるほどミセルの安定性が高く、Ｐｔの放出が抑制されることが分かった。一方で、図１２下に示されるように、特に、７０℃で加熱して作製した熱処理ミセル（Ｉ）は、ｐＨ５．５の環境下でよりＰｔを放出しやすい特性を有していることが明らかとなった。このことは、７０℃で加熱して作製した熱処理ミセル（Ｉ）は、血中（ｐＨ７．４）では安定であり、細胞内に取り込まれると後期エンドソーム内では白金を放出しやすいという特性を有していることを示すものであり、血中で薬物を放出せず細胞内で薬物を放出するという点で、薬物送達システムとして優れていることが分かる。
　次に、加熱型シスプラチン内包ミセルの安定性に対するｐＨの効果を確認した。結果は、図１２－２に記載される通りであった。図１２－２に示されるように、加熱温度が高いほどミセルからのシスプラチンの放出速度が遅くなることが確認された。また、図１２－２に示されるように、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４のＰｔ放出比率によれば、加熱温度が５０℃であるときにこの比率が特に大きいことが分かった。
　このように、熱処理した白金錯体ミセルは、ポリマーとの配位子交換量が向上し、ミセルを安定化させて、細胞毒性を低減する一方で、細胞内環境では放出しやすいという薬物として適した性質を有していることが明らかとなった。
　さらに、熱処理と最大耐用量（ＭＴＤ）との関係を調べた。BALB/cマウス（6週齢；メス）に対して、37℃で調製したダハプラチンミセル、50℃で調製したダハプラチンミセル、70℃で調製したダハプラチンミセルを尾静脈から投与し、マウスの体重変化を追跡し、最大耐量を決定した。結果は図１４に示される通りであった。図１４は、死亡したマウスは死亡する時点まで体重を示し、死亡しなかったマウスは投与後の体重変化を示す。図１４に示されるように、37℃で調製したダハプラチンミセルのMTDは少なくとも12mg/kgであり、50℃で調製したダハプラチンミセルのMTDは少なくとも15mg/kgであり、70℃で調製したダハプラチンミセルのMTDは少なくとも20mg/kgであることが示された。各温度で調製したダハプラチンミセルのMTDにおける体重変化を重ね併せて表示すると、ほぼおなじ体重変化の推移を示した（図１４参照）。
　さらに、37℃で調製したダハプラチンミセル、50℃で調製したダハプラチンミセル、70℃で調製したダハプラチンミセルを尾静脈から投与し、移植された腫瘍の増加に対する抑制効果を調べた。具体的には、2×105個のC26細胞をBALB/cマウス（6週齢；メス）の皮下に移植した。5日後から2日おきに3回、PBS（コントロール）、オキサリプラチン（oxaliplatin）8 mg/kg、37℃で調製したダハプラチンミセル（H37/m）3 mg/kg、50℃で調製したダハプラチンミセル（H50/m）3 mg/kg、70℃で調製したダハプラチンミセル3 mg/kg、70℃で調製したダハプラチンミセル（H70/m）4 mg/kgを尾静脈から投与し、腫瘍体積の変化を追った。腫瘍の平均直径が15 mmを超えたマウスについてはその時点で安楽死させた。C26細胞は、国立がんセンターから提供されたがん細胞であり、10%FBSと100U/mlペニシリンーストレプトマイシンを含むRPMI1640培地にて5%CO2、37℃の条件で培養した。結果は図１５および１６に示される通りであった。
　図１５に示されるように、70℃で調製したダハプラチンミセルは、マウスの体重に対する影響が、37℃または50℃で調製したミセルよりも少ないこと、及び、抗腫瘍効果は4 mg/kgを投与できた70℃で調製したミセルで最も高かった。特に70℃で調製したダハプラチンミセルではMTDが4 mg/kgに達し、37℃または50℃で調製したダハプラチンミセルのMTDである3 mg/kgよりも高く、その結果、最も強い抗腫瘍効果を得ることができた。なお、図１５のMTDは、２日おきに３回投与する投与法におけるMTDであり、単回投与による図１４のMTDとは異なる値を示す。
　図１６には、上記実験のカプランマイヤー曲線を示す。図１６に示されるように70℃で調製したダハプラチンミセルにおいて最も死亡マウス数が少なく、8匹中2匹において腫瘍が完全に消失した。
　この実験において、肝毒性を血漿GOT濃度およびGPT濃度を測定することにより推定した。すると、50℃で調製したダハプラチンミセルおよび70℃で調製したダハプラチンミセルは、37℃で調製したダハプラチンミセルよりもその肝毒性が低く、PBS投与マウスと同レベルであった。
実施例６：酸化型熱処理ミセルの安定性
　本実施例では、酸化処理と熱処理の両方に供したミセルの安定性を評価した。
　ミセルは、実施例１に記載の通り作成した。その後、得られたミセル（ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）の熱処理および酸化処理は以下の通り行った。酸化型ＤＡＣＨＰｔ／ｍ（Ｏ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）は、ミセルと１００等量の過酸化水素を混合し、室温で２４時間反応させて得た。熱処理ミセル（Ｉ）（Ｈ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）は、ミセルを７０℃で２４時間加熱して得た。熱処理後酸化処理したミセル（ＨＯ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）は、ミセルを７０℃で２４時間処理し、その後、１００等量の過酸化水素と混合して室温で２４時間反応させて得た。酸化処理後熱処理したミセル（ＯＨ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）は、ミセルと１００等量の過酸化水素とを混合して２４時間反応させ、その後、７０℃で２４時間処理して得た。
　ミセルの安定性は、実施例１に記載の通りリン酸緩衝生理食塩水中で、散乱光強度により評価した。白金錯体基準で０．０５０ｍｇ／ｍＬをインキュベートして経時的に散乱光強度を測定し、測定開始時の散乱光強度を１として標準化した。測定開始７２時間後に５ｍＭのアスコルビン酸を添加した。結果は図１３に示される通りであった。
　図１３に示されるように、酸化処理に続いて熱処理を施したミセル（ＯＨ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）は、酸化型ミセル（Ｏ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）、熱処理ミセル（Ｉ）（Ｈ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）、及び熱処理に続いて酸化処理を施したミセル（ＨＯ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍ）よりも高い安定性を示した。
　また、アスコルビン酸添加後は、添加と同時にＰｔを放出させる性質が観察された。しかし、熱処理を受けたＯＨ－ＤＡＣＨＰｔ／ｍは、より安定したミセル構造を示した。
　本実施例の結果から、熱処理と酸化処理は両方を実施することで、それぞれ単独で実施するよりもミセルの高い安定化効果を示すことが明らかとなった。特に酸化処理に続いて熱処理を実施することで、ミセルの高い安定化効果を示すことが明らかとなった。

Claims (20)

  1. 　親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属との錯体を含む遷移金属内包ミセルであって、遷移金属が酸化型である、ミセル。
  2. 　遷移金属が白金または銅である、請求項１に記載のミセル。
  3. 　親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがアニオン性アミノ酸ポリマーである、請求項１または２に記載のミセル。
  4. 　アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位として遷移金属錯体の配位子と配位子交換して遷移金属と配位結合を形成する、請求項３に記載のミセル。
  5. 　アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位としてグルタミン酸を含む、請求項３に記載のミセル。
  6. 　親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金または酸化型銅を含む、請求項１に記載のミセル。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のミセルを含む、医薬組成物。
  8. 　還元剤と併用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　還元剤と請求項７に記載の医薬組成物との組合せ医薬。
  10. 　還元剤が、アスコルビン酸または薬学上許容されるその塩である、請求項８に記載の医薬組成物または請求項９に記載の組合せ医薬。
  11. 　アスコルビン酸または薬学上許容されるその塩を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物であって、請求項１～８のいずれかに記載の医薬組成物と併用するための、医薬組成物。
  12. 　親水性ポリマーとアニオン性ポリマーとのブロック共重合体と遷移金属との錯体を含む遷移金属内包ミセルであって、４０℃～８５℃の熱処理がなされた、ミセル。
  13. 　遷移金属が白金または銅である、請求項１２に記載のミセル。
  14. 　親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがアニオン性アミノ酸ポリマーである、請求項１２または１３に記載のミセル。
  15. 　アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位として遷移金属錯体の配位子と配位子交換して遷移金属と配位結合を形成する、請求項１４に記載のミセル。
  16. 　アニオン性アミノ酸ポリマーが、単量体単位としてグルタミン酸を含む、請求項１４に記載のミセル。
  17. 　親水性ポリマーがポリエチレングリコールであり、アニオン性ポリマーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、遷移金属錯体が酸化型白金または酸化型銅を含む、請求項１２に記載のミセル。
  18. 　請求項１２～１７のいずれか一項に記載のミセルを含む、医薬組成物。
  19. 　親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセルであって、遷移金属または両性金属が酸化型である、ミセル。
  20. 　親水性ポリマーと単量体単位として金属配位性官能基を側鎖に有する単量体単位を含むポリマーとのブロック共重合体と遷移金属または両性金属との錯体を含む、遷移金属または両性金属内包ミセルであって、ミセルが形成時、または形成後に４０℃～８５℃の温度で加熱処理されている、ミセル。
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