WO2018034301A1

WO2018034301A1 - 抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体との併用医薬

Info

Publication number: WO2018034301A1
Application number: PCT/JP2017/029425
Authority: WO
Inventors: 暢也石井; 芽衣小野; 祥規渡邉; 順子岩▲崎▼
Original assignee: 中外製薬株式会社
Priority date: 2016-08-17
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2018-02-22
Also published as: JP2019202936A

Abstract

本発明は、癌の治療における、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との併用療法に関する。本発明は、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体を併用した際の相乗的な効果を初めて実証するものである。

Description

抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体との併用医薬

　本発明は、癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物、癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させる方法、ならびに癌を治療するための製剤を含む製品に関する。

　癌は、先進国において、死亡率の主要原因である。癌治療の目的で、多くの化学療法剤が過去50年間に開発された。化学療法剤の大半は、アルキル化剤、代謝措抗剤、アンスラサイクリン（anthracycline）、植物アルカ口イドトポイソメラーゼ阻害剤、及び抗腫蕩剤に分類することができる。これらの薬剤すべてが細胞分裂またはDNAの合成に影響し、何らかの形で機能するメカニズムを通して治療効果をもたらす。
　特定の化学療法剤の有効性は、癌の間で、患者の間で、あるいは個々の患者における時間経過により異なる。化学療法剤に曝露された癌細胞は、こうした化学療法剤に対する耐性を生じ、他の複数の抗癌剤に対しても同様に交差耐性を生じることも多い。さらに、上記の化学療法剤のメカニズムによってこれらの化学療法剤が正常細胞に与える細胞傷害の結果もたらされる副作用を制御するため、化学療法剤の用量または用法は多くの場合制約される。

　従来の化学療法剤に代わり近年癌細胞に特異的に発現する分子を標的とする分子標的薬の開発が進められている。こうした分子標的薬の登場によって従来の化学療法剤に固有の副作用が回避され癌患者のQOLに寄与する癌治療が可能となっている。こうした分子標的薬には低分子（small molecule）の薬剤のほか抗体等の高分子の薬剤も含まれる。
　抗体の薬剤としては、さまざまな悪性腫瘍で過剰発現がみられるEpidermal growth factor receptor (以下、「EGFR」)を標的とした抗体による癌の治療剤が開発されている。例えば、セツキシマブ（cetuximab：商品名Erbitux（登録商標））やパニツムマブ（panitumumab：商品名Vectibix（登録商標））はEGFR依存的な腫瘍を治療するための医薬として開発され上市されている。また、EGFRのリガンドであるEpidermal growth factor (以下、「EGF」) familyの一つであり、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、腎癌で高発現しているEpiregulinを標的とした抗体が開示されている（特許文献1、特許文献２）。

　セツキシマブに代表される抗EGFR抗体による治療と、治療対象におけるEpiregulinの発現との関係については、多くの報告がなされている。例えば、Takahashiらは、抗Epiregulin抗体による治療を受けた転移性大腸癌患者から採取した血清中のhepatocyte growth factor及びEpiregulinの発現量を分析した結果、比較的発現量の低い患者群において比較的発現量の高い患者群よりも有意な治療効果が見られることから、hepatocyte growth factor及びEpiregulinの発現が抗EGFR抗体による治療の予後不良に関連することを示唆している（非特許文献１）。また、Oliveras-Ferraros Cらは、Epiregulin と、同じくEGF familyであるAmphiregulinの高発現がセツキシマブによる治療の耐性となり得ることを示唆している（非特許文献２）。これらの結果は、抗EGFR抗体による治療に対する応答性の指標としてEpiregulinの発現量が関連していることを示唆している。
　一方、これらの開示情報とは異なり、Epiregulinの発現が抗EGFR抗体による治療に肯定的に作用することが複数の文献で示されている。例えばB Jacobsらは、EpiregulinやAmphiregulinの高発現が、セツキシマブ等の抗EGFR抗体による大腸癌治療の有意な応答性の予測となることを述べている（非特許文献３）。その他、Epiregulinの発現による肯定的な作用については、複数の論文が報告されている（非特許文献４-７）。
　しかし、上記のいずれの報告においても、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との併用効果についてのデータは示されていない。

WO2013100120 A1 WO2014208482 A1

British Journal of Cancer 2014 May 27;110(11):2716-27 Invest New Drugs 2012 Apr;30(2):846-52 J Clin Oncol. 2009 Oct 20;27(30):5068-74 J Clin Oncol. 2010 Mar 1; 28(7):1181-9 British Journal of Cancer 2011 Feb 1;104(3):488-95 Cancer discovery 2015 June;5(6):598-609 Mol Cancer Ther. 2015 Jul;14(7):1625-36

　本発明は、従来の抗体治療に代わる、より有効な癌治療法を提供することを課題とする。

　上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、抗Epiregulin抗体を抗EGFR抗体と併用することによって、抗EGFR抗体単独による処置と比べて、癌の治療において相乗的な効果を得られることを見いだし、本発明を完成した。

　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
〔１〕抗Epiregulin抗体を有効成分として含む、抗EGFR抗体と併用して癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物。
〔２〕前記抗Epiregulin抗体が、前記抗EGFR抗体と同時に投与される、〔１〕の医薬組成物。
〔３〕前記抗Epiregulin抗体が、前記抗EGFR抗体の投与前又は投与後に投与される、〔１〕の医薬組成物。
〔４〕抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体とを有効成分として含む、癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物。
〔５〕抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との配合剤である、〔４〕の医薬組成物。
〔６〕前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：２に記載のCDR1、配列番号：３に記載のCDR2、配列番号：４に記載のCDR3を有する重鎖可変領域、および配列番号：７に記載のCDR1、配列番号：８に記載のCDR2、配列番号：９に記載のCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、〔１〕～〔５〕のいずれかの医薬組成物。
〔７〕前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：１に記載の重鎖可変領域、配列番号：６に記載の軽鎖可変領域、配列番号：５に記載の重鎖定常領域、および配列番号：１０に記載の軽鎖定常領域を含む抗体である、〔１〕～〔５〕の医薬組成物。
〔８〕前記抗EGFR抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、〔７〕の医薬組成物。
〔９〕癌が大腸癌である、〔１〕～〔５〕のいずれかの医薬組成物。
〔１０〕対象に有効量の抗Epiregulin抗体を投与する工程を含む、抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させる方法。
〔１１〕前記抗Epiregulin抗体を、前記抗EGFR抗体と同時に投与する、〔１０〕の方法。
〔１２〕前記抗Epiregulin抗体を、前記抗EGFR抗体の投与前又は投与後に投与する、〔１０〕の方法。
〔１３〕対象におけるEpiregulinの発現を測定する工程と、当該測定結果にもとづき対象に前記抗Epiregulin抗体を投与する工程とを含む、〔１０〕の方法。
〔１４〕（１）抗Epiregulin抗体を含有する製剤、（２）容器、および（３）癌を治療し、または癌の再発もしくは転移を抑制するために前記抗Epiregulin抗体と少なくとも一種の抗EGFR抗体とを組み合わせて対象に投与することを示す指示書又はラベル、を含む製品。
〔１５〕前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：２に記載のCDR1、配列番号：３に記載のCDR2、配列番号：４に記載のCDR3を有する重鎖可変領域、および配列番号：７に記載のCDR1、配列番号：８に記載のCDR2、配列番号：９に記載のCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、〔１４〕の製品。
〔１６〕抗EGFR抗体を有効成分として含む、抗Epiregulin抗体と併用して癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物。
〔１７〕前記抗EGFR抗体が、前記抗Epiregulin抗体と同時に投与される、〔１６〕の医薬組成物。
〔１８〕前記抗EGFR抗体が、前記抗Epiregulin抗体の投与前又は投与後に投与される、〔１６〕の医薬組成物。
〔１９〕対象に有効量の抗EGFR抗体を投与する工程を含む、抗Epiregulin抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させる方法。
〔２０〕前記抗EGFR抗体を、前記抗Epiregulin抗体と同時に投与する、〔１９〕の方法。
〔２１〕前記抗EGFR抗体を、前記抗Epiregulin抗体の投与前又は投与後に投与する、〔１９〕の方法。
〔２２〕対象におけるEGFRの発現を測定する工程と、当該測定結果にもとづき対象に前記抗EGFR抗体を投与する工程とを含む、〔１９〕の方法。
〔２３〕（１）抗EGFR抗体を含有する製剤、（２）容器、および（３）癌を治療し、または癌の再発もしくは転移を抑制するために前記抗EGFR抗体と少なくとも一種の抗Epiregulin抗体とを組み合わせて対象に投与することを示す指示書又はラベル、を含む製品。
〔２４〕前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：２に記載のCDR1、配列番号：３に記載のCDR2、配列番号：４に記載のCDR3を有する重鎖可変領域、および配列番号：７に記載のCDR1、配列番号：８に記載のCDR2、配列番号：９に記載のCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、〔２３〕の製品。

　また、本発明は以下のものも提供する。
〔２５〕対象に有効量の抗Epiregulin抗体を投与する工程を含む、抗EGFR抗体と併用して癌を治療するまたは癌の再発もしくは転移を抑制する方法。
〔２６〕対象に有効量の抗EGFR抗体を投与する工程を含む、抗Epiregulin抗体と併用して癌を治療するまたは癌の再発もしくは転移を抑制する方法。
〔２７〕抗EGFR抗体との併用による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制において用いるための、抗Epiregulin抗体。
〔２８〕抗Epiregulin抗体との併用による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制において用いるための、抗EGFR抗体。
〔２９〕抗EGFR抗体と併用される癌の治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤の製造における、抗Epiregulin抗体の使用。
〔３０〕抗Epiregulin抗体と併用される癌の治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤の製造における、抗EGFR抗体の使用。
〔３１〕対象に有効量の抗Epiregulin抗体および抗EGFR抗体の組み合わせを投与する工程を含む、癌を治療するまたは癌の再発もしくは転移を抑制する方法。
〔３２〕癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制において用いるための、抗Epiregulin抗体および抗EGFR抗体の組み合わせ。
〔３３〕癌の治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤の製造における、抗Epiregulin抗体および抗EGFR抗体の組み合わせの使用。
〔３４〕抗Epiregulin抗体を有効成分として含む、抗EGFR抗体の抗腫瘍効果増強剤（抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させるための医薬組成物）。
〔３５〕抗EGFR抗体を有効成分として含む、抗Epiregulin抗体の抗腫瘍効果増強剤（抗Epiregulin抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させるための医薬組成物）。
〔３６〕抗EGFR抗体の抗腫瘍効果の増強（抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果の増幅）において用いるための、抗Epiregulin抗体。
〔３７〕抗Epiregulin抗体の抗腫瘍効果の増強（抗Epiregulin抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果の増幅）において用いるための、抗EGFR抗体。
〔３５〕抗EGFR抗体の抗腫瘍効果増強剤（抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させるための医薬組成物）の製造における抗Epiregulin抗体の使用。
〔３８〕抗Epiregulin抗体の抗腫瘍効果増強剤（抗Epiregulin抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させるための医薬組成物）の製造における抗EGFR抗体の使用。

　本発明者らは、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体を有効成分とする本発明の併用医薬が、抗Epiregulin抗体単独または抗EGFR抗体単独による処置と比べて、癌の治療または予防において相乗的な効果を示すことを初めて実証することに成功した。

抗Epiregulin抗体単剤もしくはセツキシマブ単剤、または抗Epiregulin抗体とセツキシマブの組み合わせの存在下で、各濃度のヒトリコンビナントEpiregulinで刺激したLIM1215ヒト大腸癌細胞の細胞培養密度を経時的に示すグラフである。グラフ中のエラーバーは、n＝3のS.D.値を示している。抗Epiregulin抗体単剤もしくはパニツムマブ単剤、または抗Epiregulin抗体とパニツムマブの組み合わせの存在下で、各濃度のヒトリコンビナントEpiregulinで刺激したLIM1215ヒト大腸癌細胞の細胞培養密度を経時的に示すグラフである。グラフ中のエラーバーは、n＝3のS.D.値を示している。抗Epiregulin抗体単剤、セツキシマブ単剤、もしくはパニツムマブ単剤、または抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体の組み合わせの存在下で、各濃度のヒトリコンビナントEpiregulinで72時間刺激したLIM1215ヒト大腸癌細胞の細胞培養密度を示すグラフである。グラフ中のエラーバーは、n＝3のS.D.値を示している。抗Epiregulin抗体単剤もしくはセツキシマブ単剤、または抗Epiregulin抗体とセツキシマブの組み合わせの存在下で、各濃度のヒトリコンビナントEpiregulinと共に6日間培養したCCK-81ヒト大腸癌細胞の生細胞数を、発色試薬を加えて吸光度を測定することにより測定したグラフである。グラフ中のエラーバーは、n＝3のS.D.値を示している。抗Epiregulin抗体、セツキシマブ、もしくはパニツムマブ、またはそれらの組み合わせの存在下で、ヒトリコンビナントEpiregulinで10分間刺激したLIM1215ヒト大腸癌細胞におけるHERファミリー受容体とその下流シグナルタンパク質のリン酸化をウエスタンブロッティング法で検出した写真である。 CXF 2172およびCXF 2067ヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルにおける、腫瘍体積の経時的な変化を示すグラフである。グラフ中のエラーバーは、n＝10のS.D.値を示している。当該モデルには、実施例３に記載されたスケジュールで抗Epiregulin抗体および/またはセツキシマブが投与された。 CXF 2172およびCXF 2067ヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルにおける、抗Epiregulin抗体および/またはセツキシマブの投与開始時の腫瘍体積を100%としたときのCXF 2172モデルにおける102日後と、CXF 2067モデルにおける45日後の各個体の相対腫瘍体積変化率を示すグラフである。 CXF 2172およびCXF 2067ヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルにおける、抗Epiregulin抗体および/またはセツキシマブの投与開始時の腫瘍体積に対して2倍の腫瘍体積になった日を腫瘍増日と定義した場合のKaplan-Meierプロットを示すグラフである。

　本発明は、抗Epiregulin抗体を有効成分として含む、抗EGFR抗体と併用して癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物に関する。また本発明は、抗EGFR抗体を有効成分として含む、抗Epiregulin抗体と併用して癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物に関する。

　本発明において、「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。

　本発明において、「抗Epiregulin抗体」または「Epiregulinに結合する抗体」は、充分なアフィニティでEpiregulinと結合することのできる抗体であって、その結果その抗体がEpiregulinを標的化したときに診断剤および／または治療剤として有用であるような抗体のことをいい、上述の特許文献１および２に記載される抗体の他、例えば開発コード；LY3016859（Eli Lilly）に示される抗体が含まれる。

　また本発明において、「抗EGFR抗体」または「EGFRに結合する抗体」は、充分なアフィニティでEGFRと結合することのできる抗体であって、その結果その抗体がEGFRを標的化したときに診断剤および／または治療剤として有用であるような抗体のことをいい、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、ネシツムマブ（Necitumumab）、フツキシマブ（Futuximab）の他、開発コード；GT-MAB 5.2-GEX（Glycotope）、MM-151（Merrimack Pharmaceuticals）、ABT-806（Abbott）、SCT-200（Sinocelltech）、GC-1118A（Green Cross）に示される抗体等が含まれる。

　本発明において、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との「併用」とは、抗Epiregulin抗体を含有する製剤と抗EGFR抗体を含有する製剤とが別々に提供され、これらの製剤が、同時に、別々に、または順次に投与されることを意味する。順次に投与されるとは、一方の抗体を含む製剤が、他方を含む製剤の投与前または投与後に投与されることを意味する。この場合には、対象における一方の抗体の残留濃度を測定することにより、その後に投与する他方の抗体の投与時期が最適化され得る。当該濃度は、対象から採取された試料を各種のクロマトグラフィー等の分離装置を用いた当業者において公知の分析方法に基づいて決定され得る。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

　また抗Epiregulin抗体を含有する製剤と抗EGFR抗体を含有する製剤の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が経口剤、非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が経口剤、非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。また、上記の医薬組成物には、さらに異なる一種以上の製剤を組み合わせてもよい。
　本発明による併用医薬は、他の化学療法、例えばFOLFIRIやFOLFOXとともに用いることができる。この場合、化学療法剤は、抗Epiregulin抗体又は抗EGFR抗体と同時に、あるいは投与前または投与後に投与されることが出来る。

　本発明において、「癌」には、例えば、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、腎癌が含まれ、大腸癌には低分化大腸癌、中分化大腸癌、高分化大腸癌が含まれる。

　別の観点においては、本発明は、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体とを有効成分として含む、癌を治療または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、抗Epiregulin抗体および抗EGFR抗体が同一医薬組成物中に共に含有される形、すなわち抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との配合剤の形で提供することができる。

　別の観点においては、本発明は、対象に有効量の抗Epiregulin抗体を投与する工程を含む、抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果（あるいは抗EGFR抗体の抗腫瘍効果または細胞増殖阻害効果）を増幅させる（増強する）方法に関する。また別の観点においては、本発明は、対象に有効量の抗EGFR抗体を投与する工程を含む、抗Epiregulin抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果（あるいは抗Epiregulin抗体の抗腫瘍効果または細胞増殖阻害効果）を増幅させる（増強する）方法に関する。
　抗EGFR抗体（抗Epiregulin抗体）による癌の治療ならびに癌の再発および転移の抑制の効果、ならびに当該抗体の抗腫瘍効果および細胞増殖阻害効果は、当業者に公知の様々な方法による評価することができ、例えば本明細書の実施例１や３に記載された方法によって評価することができる。

　ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量におけるおよび必要な期間にわたっての、量のことをいう。

　好ましくは、本発明を用いた癌の治療、または癌の再発もしくは転移の抑制は、Epiregulinを高発現している対象に対して行うことができる。Epiregulinを高発現しているとは、対象におけるEpiregulinの発現量が、他の対象群の平均よりも高いことを意味する。したがって、この観点では、本発明は、抗Epiregulin抗体を有効成分として含む、抗EGFR抗体と併用して、Epiregulinを高発現している対象の癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物に関する。また、本発明は、抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体とを有効成分として含む、Epiregulinを高発現している対象の癌を治療または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物に関する。また、本発明は、Epiregulinを高発現している対象に有効量の抗Epiregulin抗体を投与する工程を含む、抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果（あるいは抗EGFR抗体の抗腫瘍効果または細胞増殖阻害効果）を増幅させる（増強する）方法に関する。また、本発明は、対象におけるEpiregulinの発現を測定する工程と、当該測定結果にもとづきEpiregulinを高発現している対象を選定する工程と、選定された対象に前記抗Epiregulin抗体を投与する工程とを含む、抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果（あるいは抗EGFR抗体の抗腫瘍効果または細胞増殖阻害効果）を増幅させる（増強する）方法に関する。

　また別の観点においては、本発明は、（１）抗Epiregulin抗体を含有する製剤、（２）容器、および（３）癌を治療または癌の再発もしくは転移を抑制するために前記抗Epiregulin抗体と少なくとも一種の抗EGFR抗体とを組み合わせて対象に投与することを示す指示書又はラベル、を含む製品に関する。「指示書」は、医薬品の使用に関する適応症、使用法、用量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含み得る、医薬品の市販の箱の中に通常入っている指示書を指し、添付文書が含まれる。また「製品」にはキットが含まれる。

（実施例1）抗Epiregulin抗体および抗EGFR抗体による細胞増殖抑制
　ヒト大腸癌KRAS野生型培養細胞株であるLIM1215（DSファーマ）を用いて、Epiregulinによる増殖、また抗Epiregulin抗体（重鎖は、可変領域全長：配列番号1、CDR1：配列番号2、CDR2：配列番号3、CDR3：配列番号4、定常領域：配列番号5；軽鎖は、可変領域全長：配列番号6、CDR1：配列番号7、CDR2：配列番号8、CDR3：配列番号9、定常領域：配列番号10）や抗EGFR抗体(セツキシマブまたはパニツムマブ)による細胞増殖抑制活性を検討した。
　LIM1215細胞は、10%FBS、0.6 μg/mLインスリン、1 μg/mLコルチゾール、10 μM 1-チオグリセロールを含むRPMI1640培地（以下、継代用培地という。）中で継代維持した。LIM1215細胞を96ウェルプレートに播種し、各抗体 (抗Epiregulin抗体、抗EGFR抗体：セツキシマブまたはパニツムマブ)を66 nMとなるように単剤、あるいは抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との両剤を組み合わせて処理し、ヒトリコンビナントEpiregulin (R&D systems社, Cat. NO. 1195-EP-025/CF) を、0、1、100 ng/mLの濃度で用いて処理した。その後IncuCyte Zoom System^TMにて、4時間毎の各wellの細胞の培養密度をモニターする事により、継時的増殖活性を検討した。図1、図2に示すとおり、LIM1215細胞増殖は、Epiregulin濃度が0の場合は抗EGFR抗体単剤による細胞増殖抑制活性が認められた。一方、高濃度ヒトリコンビナントEpiregulin (100 ng/mL)存在下では、図1、図2に示すとおり、セツキシマブまたはパニツムマブのような抗EGFR抗体単剤による細胞増殖抑制活性は、Epiregulin濃度が0の場合と比べて減弱された。抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体を組み合わせて処理した場合は、ヒトリコンビナントEpiregulinの濃度に関わらず細胞増殖阻害を維持していた。実際、72時間後の細胞培養密度を比較すると、高濃度ヒトリコンビナントEpiregulin (100 ng/mL)条件においても、抗Epiregulin抗体を併用することでセツキシマブやパニツムマブの細胞増殖抑制活性を維持していた（図３）。

　一方、ヒト大腸癌KRAS野生型培養細胞株であるCCK-81細胞（JCRB）を用いて、ヒトリコンビナントEpiregulinによる増殖、また抗Epiregulin抗体や抗EGFR抗体による細胞増殖阻害活性を検討した。
　CCK-81細胞は、10% FBSを含むEMEM培地（以下、継代用培地という。）中で継代維持した。CCK-81細胞を96ウェルプレートに播種し、各抗体 (LIM1215細胞を処置したのと同じ抗Epiregulin抗体、抗EGFR抗体：セツキシマブまたはパニツムマブ)を66 nMとなるように単剤、あるいは抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との両剤を組み合わせて処理し、ヒトリコンビナントEpiregulin (R&D systems社, Cat. NO. 1195-EP-025/CF) を0、1、100 ng/mLの濃度で用いて処理した。細胞は37℃、5% CO_２インキュベータにて1% FBSを含むEMEM培地中で6日間培養された。培養後Cell Counting（同仁化学）の測定試薬を添加し、1時間発色を行い、マイクロプレートリーダーにより460 nmでの反応液の吸光度を測定することで細胞数を測定した。
　図４に示した通り、ヒトリコンビナントEpiregulin 100 ng/mL処理時のCCK-81細胞において、抗Epiregulin抗体やセツキシマブ単剤に比べ、両剤を組み合わせて処理した場合に強い細胞増殖の阻害活性が認められた。

（実施例2）抗Epiregulin抗体および抗EGFR抗体によるHERファミリー受容体のリン酸化と下流シグナル因子のリン酸化抑制
　ヒト大腸癌KRAS野生型培養細胞株であるLIM1215を用いて、抗Epiregulin抗体や抗EGFR抗体(セツキシマブまたはパニツムマブ)による、HERファミリー受容体のリン酸化と下流シグナル因子のリン酸化阻害活性を検討した。
　LIM1215細胞を6ウェルプレートに播種し、各抗体 (実施例１と同じ抗Epiregulin抗体、抗EGFR抗体：セツキシマブ、パニツムマブ)を66 nMとなるように単剤、あるいは抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との両剤を組み合わせて処理し、ヒトリコンビナントEpiregulin (R&D systems社, Cat. NO. 1195-EP-025/CF) を100 ng/mLの濃度で処理した。10分後に細胞を溶解し、ウエスタンブロッティング法を用いて、EGFR、HER2、HER3、ERK、AKTのリン酸化を評価した。ウエスタンブロッティングでは、NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel（サーモサイエンティフィック）を用いて泳動を行い、Trans-Turboトランスファーシステム(バイオラッド)を用いてニトロセルロース膜に転写した。転写されたニトロセルロース膜は、抗リン酸化EGFR抗体（CST: #2234）、抗EGFR抗体（サンタクルズ: sc-03）、抗リン酸化HER2抗体（CST: #6942）、抗HER2抗体（サンタクルズ: sc-284）、抗リン酸化HER3抗体（CST: 4791）、抗HER3抗体（サンタクルズ: sc-285）、抗リン酸化ERK抗体（CST: #4370）、抗ERK抗体（CST: #9102）、抗リン酸化AKT抗体（CST: #9271）、抗AKT抗体（CST: #9272）、抗GAPDH抗体（CST: #5174）と反応させた。ニトロセルロース上のバンドは、HRP標識した抗体（CST）を添加し洗浄した後、ECL（GEヘルスケア）またはECL Prime（GEヘルスケア）で発光後、ImageQuant LAS 4000（GEヘルスケア）を用いて検出した。
　図５で示された通り、ヒトリコンビナントEpiregulinによって刺激されたリン酸化HERファミリー受容体EGFR、HER2、HER3とその下流シグナルにあるリン酸化ERKとAKTは、抗EGFR抗体単剤の処理では、リン酸化状態が観察できていたのに対し、抗Epiregulin抗体を併用することで、これらのリン酸化が阻害されることを確認した。

（実施例3）in vivoモデルを用いた抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体の併用による薬効試験
　ヒト患者由来腫瘍がオスのヌードマウスの皮下に移植された腫瘍モデルを用いて、in vivoでの抗腫瘍活性を評価した。評価されたCXF 2172およびCXF 2067ヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルにおいて、実施例1と同じ抗Epiregulin抗体25 mg/kg、抗EGFR抗体セツキシマブを30 mg/kgでそれぞれ単剤または組み合わせて処理し、腫瘍体積を測定することで抗腫瘍活性を測定した。CXF 2172ヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルには、無作為割付した翌日からセツキシマブを2週間に1回腹腔内に投与し、抗Epiregulin抗体を1週間に1回尾静脈に投与した。CXF 2067ヒト大腸癌由来腫瘍モデルには、セツキシマブと抗Epiregulin抗体を無作為割付した翌日に1度だけ投与した。腫瘍体積は週に2回ノギスを用いて腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積を以下の式のとおり算出した。
　　　[腫瘍体積 (mm³) = 長径 (mm) x 短径 (mm)x 短径 (mm) x 0.5]

　図６に示したとおり、セツキシマブと抗Epiregulin抗体の組み合わせによる投与は、2つのヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルにおいて、それぞれの単剤に比べて腫瘍増殖を抑制している。その効果は、図７で示されるように、投与開始時の腫瘍体積を100%としたときの各個体の相対腫瘍体積変化率は、セツキシマブ投与群において、腫瘍が増大する傾向があるのに対して、セツキシマブと抗Epiregulin抗体の組み合わせ投与群は、過半数の個体で腫瘍消失が認められるほどの強い活性を示した。また、投与開始時の腫瘍体積に対して2倍の腫瘍体積になった日を腫瘍増日と定義し、Kaplan-Meierプロットで示した（図８）。その結果、2つのヒト大腸癌患者由来腫瘍モデルにおいて、セツキシマブ単剤に比べて、セツキシマブと抗Epiregulin抗体を組み合わせにより投与することで、腫瘍が増悪するまでの日数が大幅に延長した。

　抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体を有効成分とする本発明の併用医薬は、抗Epiregulin抗体または抗EGFR抗体を有効成分とする従来の医薬と比べて、癌の治療または予防において相乗的な効果を有する。

Claims

　抗Epiregulin抗体を有効成分として含む、抗EGFR抗体と併用して癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物。
　前記抗Epiregulin抗体が、前記抗EGFR抗体と同時に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
　前記抗Epiregulin抗体が、前記抗EGFR抗体の投与前又は投与後に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
　抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体とを有効成分として含む、癌を治療する、または癌の再発もしくは転移を抑制するための医薬組成物。
　抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との配合剤である、請求項４に記載の医薬組成物。
　前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：２に記載のCDR1、配列番号：３に記載のCDR2、配列番号：４に記載のCDR3を有する重鎖可変領域、および配列番号：７に記載のCDR1、配列番号：８に記載のCDR2、配列番号：９に記載のCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項１～５のいずれかに記載の医薬組成物。
　前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：１に記載の重鎖可変領域、配列番号：６に記載の軽鎖可変領域、配列番号：５に記載の重鎖定常領域、および配列番号：１０に記載の軽鎖定常領域を含む抗体である、請求項１～５に記載の医薬組成物。
　前記抗EGFR抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、請求項７に記載の医薬組成物。
　癌が大腸癌である、請求項１～８のいずれかに記載の医薬組成物。
　対象に有効量の抗Epiregulin抗体を投与する工程を含む、抗EGFR抗体による癌の治療または癌の再発もしくは転移の抑制の効果を増幅させる方法。
　前記抗Epiregulin抗体を、前記抗EGFR抗体と同時に投与する、請求項１０に記載の方法。
　前記抗Epiregulin抗体を、前記抗EGFR抗体の投与前又は投与後に投与する、請求項１０に記載の方法。
　対象におけるEpiregulinの発現を測定する工程と、当該測定結果にもとづき対象に前記抗Epiregulin抗体を投与する工程とを含む、請求項１０に記載の方法。
　（１）抗Epiregulin抗体を含有する製剤、（２）容器、および（３）癌を治療し、または癌の再発もしくは転移を抑制するために前記抗Epiregulin抗体と少なくとも一種の抗EGFR抗体とを組み合わせて対象に投与することを示す指示書又はラベル、を含む製品。
　前記抗Epiregulin抗体が、配列番号：２に記載のCDR1、配列番号：３に記載のCDR2、配列番号：４に記載のCDR3を有する重鎖可変領域、および配列番号：７に記載のCDR1、配列番号：８に記載のCDR2、配列番号：９に記載のCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項１４に記載の製品。