WO2018016551A1 - アレルゲン検出方法 - Google Patents

アレルゲン検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018016551A1
WO2018016551A1 PCT/JP2017/026179 JP2017026179W WO2018016551A1 WO 2018016551 A1 WO2018016551 A1 WO 2018016551A1 JP 2017026179 W JP2017026179 W JP 2017026179W WO 2018016551 A1 WO2018016551 A1 WO 2018016551A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
allergen
seq
nos
amino acid
acid sequences
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/026179
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
友輔 関
Original Assignee
株式会社日清製粉グループ本社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日清製粉グループ本社 filed Critical 株式会社日清製粉グループ本社
Priority to KR1020197001990A priority Critical patent/KR102329725B1/ko
Priority to EP17831067.8A priority patent/EP3489677B1/en
Priority to JP2018528848A priority patent/JP6903661B2/ja
Priority to CA3031176A priority patent/CA3031176C/en
Priority to US16/318,756 priority patent/US11175271B2/en
Publication of WO2018016551A1 publication Critical patent/WO2018016551A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43509—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from crustaceans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an allergen in a sample.
  • Food allergy causes adverse symptoms such as dermatitis, asthma, gastrointestinal dysfunction, and anaphylactic shock due to an immune response caused by food.
  • food allergies There are various types of foods that cause food allergies, but shrimp, crab, wheat, buckwheat, egg, milk, and peanuts are particularly prone to allergic symptoms and severe allergic symptoms. .
  • Patent Document 1 includes ovalbumin, lysozyme, casein, lactoglobulin, high molecular weight glutenin, low molecular weight glutenin, wheat protein, rye protein, oat protein, barley protein, mustard protein, sesame protein, A peptide having a specific sequence obtained by enzymatic degradation of an allergen selected from the group consisting of macadamia nut protein, pistachio nut protein, Brazil nut protein, walnut protein, peanut protein and hazelnut protein is detected by LC-MS / MS.
  • Patent Document 2 discloses an allergen-containing composition in which an allergen-containing extract is formed from a sample composition, and the amount of allergen in the extract is measured using LC-UV / MS or LC-MS. A method for measuring quantities is described.
  • the present inventors have found that the presence of the allergen can be detected with high sensitivity by detecting the specific amino acid sequence contained in each allergen.
  • the present invention is a method for detecting an allergen in a sample comprising: Treating the sample with a proteolytic enzyme and detecting the presence or absence of an allergen-derived polypeptide in the enzyme-treated sample by analysis utilizing chromatographic separation,
  • the allergen is one or more selected from the group consisting of buckwheat, crustacean, milk, egg and peanut, Provide a method.
  • the present invention provides a highly sensitive allergen detection method capable of detecting the presence of a trace amount of allergen (especially buckwheat or crustacea) in a sample such as food.
  • the present invention provides a method for detecting an allergen in a sample.
  • one or more allergens selected from the group consisting of buckwheat, crustacean, milk, egg and peanut can be detected.
  • the allergen detected by the method of the present invention is at least one selected from the group consisting of buckwheat and crustaceans, more preferably one selected from the group consisting of buckwheat and crustaceans. More preferably, it is either buckwheat or crustacean.
  • the allergen detected by the method of the present invention comprises at least buckwheat, for example, buckwheat alone, buckwheat and crustaceans, or buckwheat, crustaceans, milk, eggs and peanuts.
  • examples of the object to be used for allergen detection include, but are not limited to, foods, cosmetics, pharmaceuticals, raw materials thereof, and devices used in the manufacturing process thereof.
  • a product obtained by subjecting these objects to normal pretreatment such as pulverization, dissolution, suspension, extraction, or a combination thereof can be used as a sample for the method of the present invention.
  • the object is an instrument, a washing liquid, a wiped specimen, or the like, or a product obtained by pulverizing, dissolving, suspending, extracting, or a combination thereof can be used as a sample for the method of the present invention.
  • the sample preparation method used in the method of the present invention is not limited to the above, and may include any method that can be used for preparing a sample for the proteolytic enzyme treatment described below.
  • the prepared sample is treated with a proteolytic enzyme.
  • the proteolytic enzyme used in the method of the present invention include trypsin, chymotrypsin, elastase, and thermolysin, preferably trypsin.
  • Treatment conditions may be appropriately selected according to the type of enzyme. For example, in the case of trypsin, an enzyme concentration of 1000 to 20000 U, 25 to 45 ° C., pH of 7 to 9 and 4 to 24 hours are preferable.
  • the enzyme treatment degrades the protein molecule of the target allergen to produce a polypeptide derived from the allergen. Therefore, if the target allergen is contained in the sample, the sample after the enzyme treatment contains a polypeptide derived from the target allergen. On the other hand, if the target allergen is not contained in the sample, the sample after the enzyme treatment does not contain a polypeptide derived from the target allergen.
  • the presence or absence of the target allergen in the sample can be determined by detecting the presence or absence of the target allergen-derived polypeptide in the sample treated with the proteolytic enzyme.
  • the degradation product of buckwheat 22 kDa protein molecule can be detected as an allergen-derived polypeptide.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of the following SEQ ID NOs: 1 to 7 is detected as an allergen-derived polypeptide.
  • VQVVGDEGR SEQ ID NO: 1 SVFDDNVQR (SEQ ID NO: 2) GQILVVPQGFAVVLK (SEQ ID NO: 3) EGLEWVELK (SEQ ID NO: 4) NFFLAGQSK (SEQ ID NO: 5) GFIVQAR (SEQ ID NO: 6) NDDNAITSPIAGK (SEQ ID NO: 7)
  • SEQ ID NO: 1 to 7 the presence or absence of any one or more of the polypeptides comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 may be detected, but preferably the presence or absence of all of these polypeptides is detected. Is done.
  • the degradation product of tropomyosin can be detected as an allergen-derived polypeptide.
  • the allergen is a crustacean
  • IQLLEEDLER (SEQ ID NO: 8) MDALENQLK (SEQ ID NO: 9) FLAEEADR (SEQ ID NO: 10) IVELEEELR (SEQ ID NO: 11) LAMVEADLER (SEQ ID NO: 12)
  • the presence or absence of any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 12 may be detected. Preferably, the presence or absence of all of these polypeptides is detected. Is done.
  • the allergen-derived polypeptide to be detected is preferably any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 and represented by SEQ ID NOs: 8 to 12 It is any one or more of polypeptides consisting of amino acid sequences, more preferably all of the polypeptides consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12.
  • the degradation product of casein or ⁇ -lactoglobulin can be detected as an allergen-derived polypeptide.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of the following SEQ ID NOs: 13 to 17 is detected as an allergen-derived polypeptide.
  • SEQ ID NOs: 13 to 15 are casein-derived polypeptides
  • SEQ ID NOs: 16 to 17 are BLG-derived polypeptides.
  • FFVAPFPEVFGK (SEQ ID NO: 13) YLGYLEQLLR (SEQ ID NO: 14) NAVPITPTLNR (SEQ ID NO: 15) VLVLDTDYK (SEQ ID NO: 16) TPEVDDEALEK (SEQ ID NO: 17)
  • the presence or absence of any one or more of the polypeptides comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 17 may be detected, but preferably the presence or absence of all of these polypeptides is detected. Is done.
  • the presence or absence of any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 15, more preferably the presence or absence of all of these polypeptides is detected, and for BLG, preferably SEQ ID NO: The presence or absence of any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by 16 to 17, more preferably the presence or absence of all of these polypeptides is detected.
  • the degradation product of ovalbumin can be detected as an allergen-derived polypeptide.
  • the allergen when the allergen is an egg, a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any of the following SEQ ID NOs: 18 to 21 is detected as an allergen-derived polypeptide.
  • YPILPEYLQCVK SEQ ID NO: 18
  • ELINSWVESQTNGIIR SEQ ID NO: 19
  • LTEWTSSNVMEER SEQ ID NO: 20
  • HIATNAVLFFGR SEQ ID NO: 21
  • the presence or absence of any one or more of the polypeptides comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 21 may be detected.
  • the presence or absence of all of these polypeptides is detected. Is done.
  • the degradation product of Ara h1-3 can be detected as an allergen-derived polypeptide.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any of the following SEQ ID NOs: 22 to 24 is detected as an allergen-derived polypeptide.
  • SEQ ID NOs: 22 to 23 are Ara h1-derived polypeptides
  • SEQ ID NO: 24 is an Ara h3-derived polypeptide.
  • DLAFPGSGEQVEK (SEQ ID NO: 22) VLLEENAGGEQEER (SEQ ID NO: 23) SPDIYNPQAGSLK (SEQ ID NO: 24)
  • the presence or absence of any one or more of the polypeptides comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 24 may be detected, but preferably the presence or absence of all of these polypeptides is detected. Is done.
  • the allergen-derived polypeptide to be detected is preferably any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 7, Any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 12, any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 17, and SEQ ID NOs: 18 to 21 Any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown, and any one or more of the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 24, more preferably shown by SEQ ID NOs: 1 to 24 All of the polypeptides consisting of amino acid sequences.
  • analysis using chromatographic separation includes liquid chromatography-mass spectrometry, such as liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (LC-TOF / MS), etc. Is mentioned.
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • LC-MS / MS is preferred because measurement accuracy (S / N ratio) is high and multiple peptides can be detected at once.
  • the chromatography used for the detection of the target allergen-derived polypeptide is preferably liquid chromatography (LC), more preferably reverse phase liquid chromatography (RPLC).
  • the LC is high performance liquid chromatography (HPLC), more preferably RP-HPLC.
  • the carrier for RPLC include a carrier having a filler in which a hydrocarbon chain (preferably an octadecyl group) is bound to silica gel or a polymer gel substrate, such as a C18 column or a C8 column.
  • the LC mobile phase (eluent) is not particularly limited as long as it can separate each target allergen-derived polypeptide individually.
  • mass spectrometry In liquid chromatography-mass spectrometry, the LC eluate is subjected to mass spectrometry (MS / MS, TOF / MS, etc.). Mass spectrometry can be performed according to normal conditions used for peptide detection using a known mass spectrometer such as a tandem quadrupole mass spectrometer or a time-of-flight mass spectrometer. For example, multiple reaction monitoring (MRM) using electrospray ionization (ESI) or atmospheric pressure chemical ionization (APCI) is preferred.
  • MRM mass spectrometry
  • each polypeptide in the eluate is separated according to mass number / charge (m / z). For example, by making a database of m / z values of the target polypeptide in advance, the presence or absence of the target polypeptide in the sample can be detected based on the measured m / z value.
  • Reference Example 1 Preparation of an allergen-containing sample 0.5 g of a sample was collected in a 15 mL disposable test tube, and 5 mL of Buffer A (Test Examples 1 to 3) or Buffer B (Test Examples 4 to 5) was added for 3 hours (Test Examples 1 to 3) or 5 hours (Test Examples 4 to 5) were extracted with shaking. The obtained reaction product was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • Example 1 Analysis of Trypsin Digested Products by LC-MS / MS 1) Trypsin digestion 1 mg of allergen molecule or 0.25 mL of the supernatant prepared in Reference Example 1 was collected in a 1.5 mL polytube and buffer A (test example) 1 to 3) or 0.25 mL of Buffer B (Test Examples 4 to 5) was added and completely dissolved. 40 mg / mL DTT (50 ⁇ L) was added to the resulting solution and incubated at 37 ° C. for 90 minutes, and then 40 mg / mL IA (50 ⁇ L) was added, followed by incubation at 37 ° C. for 30 minutes with light shielding.
  • DTT 50 ⁇ L
  • IA 50 ⁇ L
  • Test Example 1 Detection of buckwheat allergen A target allergen-derived polypeptide was detected by LC-MS / MS MRM using the 22 kDa protein (SEQ ID NO: 25) as a target allergen molecule under the conditions shown in Table 1. The results are shown in FIG.
  • Test Example 2 Detection of Crustacean Allergen A target allergen-derived polypeptide was detected by LC-MS / MS MRM using tropomyosin (SEQ ID NO: 26) as a target allergen molecule under the conditions shown in Table 2. The results are shown in FIG.
  • Test Example 3 Detection of buckwheat allergen and crustacean allergen from food composition From wheat flour to which 0.01% by weight of buckwheat or crustacean (shrimp powder) was added, an allergen-containing sample was prepared. The obtained sample was subjected to trypsin digestion, desalting and LC-MS / MS MRM according to Example 1 to detect the target allergen-derived polypeptide. As a control, similar analysis was performed using buckwheat or crustacean-free flour. The buckwheat and crustacean allergen-derived polypeptides to be detected and the conditions for LC-MS / MS analysis were the same as in Tables 1 and 2, respectively. The measurement results are shown in FIGS.
  • Test Example 4 Detection of Milk, Egg and Peanut Allergen
  • An allergen-containing sample was prepared from each of whole milk powder, whole egg powder and peanut powder according to Reference Example 1. Each sample was subjected to trypsin digestion, desalting and LC-MS / MS MRM according to 1) to 3) of Example 1 to detect the target allergen-derived polypeptide.
  • the target allergen molecules and the detected allergen-derived polypeptides for each of whole milk powder, whole egg powder and peanut powder are shown in Tables 3-5. Allergens of whole milk powder, whole egg powder and peanut powder could be detected by LC-MS / MS analysis (FIGS. 5 to 7).
  • Test Example 5 Detection of milk and peanut allergen from food composition Bread to which either whole milk powder or peanut flour was added (added bread; added amount 0.84% by mass), and bread not containing milk or peanut (no addition) Bread).
  • the additive bread and the additive-free bread were mixed to prepare a 100-fold diluted additive bread (addition amount of whole milk powder and peanut powder of 0.0084% by mass).
  • the concentration of milk or peanut allergen (peanut soluble protein containing casein and Ara h) contained in the obtained 100-fold diluted pan was measured by ELISA (lower limit of quantification 1 ppm). Table 6 shows the measurement results.
  • an allergen-containing sample was prepared from the additive-free bread and 100-fold diluted bread according to Reference Example 1.
  • the obtained sample was subjected to trypsin digestion, desalting and LC-MS / MS MRM according to Example 1 to detect the target allergen-derived polypeptide.
  • detection targets casein-derived polypeptides (SEQ ID NOs: 13 to 15) were selected for milk, and Ara h1 or h3-derived polypeptides (SEQ ID NOs: 22 to 24) were selected for peanuts.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)

Abstract

高感度なアレルゲン測定方法の提供。試料中のアレルゲンを検出する方法であって、試料をタンパク質分解酵素で処理すること、およびクロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、該アレルゲンが、ソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイからなる群より選択される１種以上である、方法。

Description

アレルゲン検出方法
　本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法に関する。
　食物アレルギーは、食物を原因とする免疫応答により、皮膚炎、喘息、胃腸管機能障害、アナフィラキシーショックなどの不利益な症状を引き起こす。食物アレルギーの原因となる食物の種類は様々であるが、特にえび、かに、小麦、そば、卵、乳および落花生の７品目は、アレルギー患者数が多く、また重篤なアレルギー症状を引き起こしやすい。
　アレルゲンとなる食品を原材料に含まない加工食品であっても、アレルゲンを含む加工食品と工場での製造ラインを共有していたり、または当該原材料の製造過程でアレルゲンを使用していたりした場合、最終製品にアレルゲンが混入している場合がある。わずかなアレルゲンの混入でも、食物アレルギーの患者にとっては危険である。食品等の試料中における微量のアレルゲンを検出することができる高感度なアレルゲン測定方法が求められている。
　高感度なアレルゲン測定方法として、特許文献１には、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、コムギタンパク質、ライムギタンパク質、カラスムギタンパク質、オオムギタンパク質、カラシナタンパク質、ゴマタンパク質、マカダミアナッツタンパク質、ピスタチオナッツタンパク質、ブラジルナッツタンパク質、クルミタンパク質、ラッカセイタンパク質およびヘーゼルナッツタンパク質からなる群より選択されるアレルゲンを酵素分解して得られる特定の配列のペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出する、試料中の上記アレルゲンを検出する方法が記載されている。特許文献２には、試料組成物からアレルゲンを含む抽出液を形成し、該抽出液中のアレルゲンの量をＬＣ－ＵＶ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳを使用して測定する、組成物中のアレルゲン含有量を測定する方法が記載されている。
特表２０１４－５２５５８８号公報 特表２０１３－５３９０３９号公報
　食品等の試料中におけるアレルゲン（特にソバまたは甲殻類）の存在を高感度に検出することが求められている。
　本発明者らは、各アレルゲンについて、それに含まれる特定のアミノ酸配列を検出することにより、当該アレルゲンの存在を高感度に検出することができることを見出した。
　したがって、本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
　試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
　クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
　該アレルゲンが、ソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイからなる群より選択される１種以上である、
方法を提供する。
　本発明は、食品等の試料中における微量のアレルゲン（特にソバまたは甲殻類）の存在を検出することができる、高感度なアレルゲン検出方法を提供する。
ソバアレルゲンのトリプシン消化物についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。 甲殻類アレルゲンのトリプシン消化物についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。 ソバアレルゲン含有小麦粉のトリプシン消化物についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。上；ソバアレルゲン無添加小麦粉、下；ソバアレルゲン添加小麦粉。 甲殻類アレルゲン含有小麦粉のトリプシン消化物についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。上；甲殻類アレルゲン無添加小麦粉、下；甲殻類アレルゲン添加小麦粉。 乳アレルゲンについてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。 卵アレルゲンについてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。 ラッカセイアレルゲンについてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。 乳添加パンにおけるカゼインについてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。 ラッカセイ添加パンにおけるAra h1またはh3についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果。
　本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法を提供する。本発明の方法によれば、ソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイからなる群より選択される１種以上のアレルゲンを検出することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法により検出されるアレルゲンは、少なくともソバおよび甲殻類からなる群より選択される１種以上であり、より好ましくはソバおよび甲殻類からなる群より選択される１種以上であり、さらに好ましくは、ソバまたは甲殻類のいずれかである。あるいは、本発明の方法により検出されるアレルゲンは、少なくともソバを含み、例えば、ソバ単独、ソバおよび甲殻類、またはソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイであり得る。
　本発明において、アレルゲン検出に供する対象物の例としては、食品、化粧品、医薬品、それらの原材料、それらの製造工程で使用する機器類、などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの対象物を、通常の前処理、例えば粉砕、溶解、懸濁、抽出等、もしくはそれらの組み合わせにかけたものを、本発明の方法の試料として用いることができる。あるいは、対象物が機器類の場合、その洗浄液やふき取り検体など、またはそれらを粉砕、溶解、懸濁、抽出等、もしくはそれらの組み合わせにかけたものを、本発明の方法の試料として用いることができる。なお、本発明の方法に用いる試料の調製方法は、上記に限定されず、次に述べるタンパク質分解酵素処理のための試料の調製に用いることができるあらゆる方法を包含し得る。
　本発明の方法においては、調製した試料を、タンパク質分解酵素で処理する。本発明の方法で用いられるタンパク分解酵素の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、テルモリシンなどが挙げられ、好ましくはトリプシンである。処理の条件は、酵素の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えばトリプシンの場合、酵素濃度１０００～２００００Ｕ、２５～４５℃、ｐＨ７～９程度で４～２４時間が好ましい。当該酵素処理は、標的のアレルゲンのタンパク質分子を分解して、該アレルゲンに由来するポリペプチドを生成する。したがって、試料中に標的のアレルゲンが含まれていれば、上記酵素処理後の試料は、標的アレルゲンに由来するポリペプチドを含む。一方、試料中に標的のアレルゲンが含まれていなければ、上記酵素処理後の試料は、標的アレルゲンに由来するポリペプチドを含まない。
　したがって、上記タンパク分解酵素で処理した試料中における標的アレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することにより、該試料中における標的アレルゲンの存在の有無を判定することができる。
　ソバについては、ソバ２２ｋＤａタンパク質分子（配列番号２５）の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンがソバの場合、下記配列番号１～７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。
　　VQVVGDEGR      （配列番号１）
　　SVFDDNVQR      （配列番号２）
　　GQILVVPQGFAVVLK（配列番号３）
　　EGLEWVELK      （配列番号４）
　　NFFLAGQSK      （配列番号５）
　　GFIVQAR        （配列番号６）
　　NDDNAITSPIAGK  （配列番号７）
本発明の方法においては、上記配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。
　カニ、エビなどの甲殻類については、トロポミオシンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンが甲殻類の場合、下記配列番号８～１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。
　　IQLLEEDLER（配列番号８）
　　MDALENQLK （配列番号９）
　　FLAEEADR　（配列番号１０）
　　IVELEEELR （配列番号１１）
　　LAMVEADLER（配列番号１２）
本発明の方法においては、上記配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。
　アレルゲンがソバおよび甲殻類の場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上であり、より好ましくは、配列番号１～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てである。
　乳については、カゼインまたはβラクトグロブリン（ＢＬＧ）の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンが乳の場合、下記配列番号１３～１７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。下記ポリペプチドのうち、配列番号１３～１５はカゼイン由来ポリペプチドであり、配列番号１６～１７はＢＬＧ由来ポリペプチドである。
　　FFVAPFPEVFGK（配列番号１３）
　　YLGYLEQLLR　（配列番号１４）
　　NAVPITPTLNR （配列番号１５）
　　VLVLDTDYK   （配列番号１６）
　　TPEVDDEALEK （配列番号１７）
本発明の方法においては、上記配列番号１３～１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。カゼインについては、好ましくは配列番号１３～１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上、より好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出され、ＢＬＧについては、好ましくは配列番号１６～１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上、より好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。
　卵については、オボアルブミンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンが卵の場合、下記配列番号１８～２１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。
　　YPILPEYLQCVK　　（配列番号１８）
　　ELINSWVESQTNGIIR（配列番号１９）
　　LTEWTSSNVMEER   （配列番号２０）
　　HIATNAVLFFGR　　（配列番号２１）
本発明の方法においては、上記配列番号１８～２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。
　ラッカセイについては、Ara h1-3の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンがラッカセイの場合、下記配列番号２２～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。下記ポリペプチドのうち、配列番号２２～２３はAra h1由来ポリペプチドであり、配列番号２４はAra h3由来ポリペプチドである。
　　DLAFPGSGEQVEK （配列番号２２）
　　VLLEENAGGEQEER（配列番号２３）
　　SPDIYNPQAGSLK （配列番号２４）
本発明の方法においては、上記配列番号２２～２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。Ara h1については、好ましくは配列番号２２～２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上、より好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出され、Ara h3については、好ましくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの有無が検出される。
　したがって、アレルゲンがソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１３～１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１８～２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号２２～２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上であり、より好ましくは、配列番号１～２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てである。
　上記タンパク分解酵素で処理した試料中における標的アレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出する手段としては、クロマトグラフィー分離を利用した分析が好適である。クロマトグラフィー分離を利用した分析としては、液体クロマトグラフィー－質量分析、例えば、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析（ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ）などが挙げられる。測定精度（Ｓ／Ｎ比）が高くかつ複数ペプチドを一度に検出できることから、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。
　本発明の方法において、標的アレルゲン由来ポリペプチドの検出に用いるクロマトグラフィーとしては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が好ましく、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）がより好ましい。また好ましくは、該ＬＣは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であり、さらに好ましくはＲＰ－ＨＰＬＣである。ＲＰＬＣ用の担体としては、シリカゲルやポリマーゲル基材に炭化水素鎖（好ましくはオクタデシル基）を結合した充填剤を有する担体、例えばＣ１８カラム、Ｃ８カラムなどが挙げられる。該ＬＣの移動相（溶離液）は、目的の各アレルゲン由来ポリペプチドを個別に分離することができるものであればよく、例えば、ギ酸水溶液（Ａ）とギ酸アセトニトリル水溶液（Ｂ）との１００：０～０：１００（体積比）グラジエント溶液が挙げられるが、これに限定されない。
　液体クロマトグラフィー－質量分析においては、上記ＬＣの溶出物を質量分析（ＭＳ／ＭＳ、ＴＯＦ／ＭＳ等）にかける。質量分析は、タンデム四重極型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置等の公知の質量分析装置を用いて、ペプチドの検出に用いられる通常の条件に従って実施することができる。例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）または大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。質量分析では、溶出物中の各ポリペプチドは、質量数／電荷（ｍ／ｚ）に従って分離される。例えば、目的のポリペプチドのｍ／ｚ値を予めデータベース化しておくことにより、測定されたｍ／ｚ値に基づいて、試料中における目的のポリペプチドの有無を検出することができる。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（試薬）
　アセトニトリル（和光純薬工業、特級、ＨＰＬＣ用）
　トリプシン（和光純薬工業、ブタ脾臓由来　生化学分析用）
　ヨードアセトアミド（ＩＡ）（和光純薬工業、生化学分析用）
　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬工業、生化学分析用）
　尿素（和光純薬工業、特級）
　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（純正化学　特級）
（緩衝液）
　Ａ：０．１ＭＤＴＴ＿０．５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＿４Ｍ尿素（ｐＨ８．２）緩衝液
　Ｂ：０．５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＿２Ｍ尿素（ｐＨ８．２）緩衝液
参考例１　アレルゲン含有試料の調製
　検体０．５ｇを１５ｍＬディスポ試験管に採取し、緩衝液Ａ（試験例１～３）または緩衝液Ｂ（試験例４～５）を５ｍＬ加え、３時間（試験例１～３）または５時間（試験例４～５）振とう抽出した。得られた反応物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収した。
実施例１　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるトリプシン消化物の分析
１）トリプシン消化
　アレルゲン分子１ｍｇまたは参考例１で調製した上清０．２５ｍＬを１．５ｍＬ用ポリチューブに採取し、緩衝液Ａ（試験例１～３）または緩衝液Ｂ（試験例４～５）を０．２５ｍＬ加えて完全に溶解させた。得られた溶液に４０ｍｇ／ｍＬ　ＤＴＴ５０μＬを加えて、３７℃で９０分間インキュベートし、次いで４０ｍｇ／ｍＬ　ＩＡ５０μＬを加えて、３７℃で３０分間、遮光化でインキュベートした。反応液に５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム６００μＬを加え、次いで１０ｍｇ／ｍＬトリプシン５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液を１００μＬ加え、３７℃で１６時間インキュベートした（ｐＨ７～９）。反応後、ＴＦＡ１０μＬを加えてトリプシンを失活させた。
２）脱塩
　ＯＡＳＩＳ　ＨＬＢ（３ｃｃ、６０ｍｇ；Ｗａｔｅｒｓ）をメタノール１ｍＬおよび水２ｍＬでコンディショニングした。これに１）で得られた反応液の全量を滴下した後、水１ｍＬで洗浄し、次いで６０％アセトニトリル１ｍＬにより溶出した。
３）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
　２）で得られた溶出物を、４０℃で窒素乾固後、２５％アセトニトリル０．２ｍＬに溶解させた。得られた溶液をフィルターろ過後、下記条件にてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭを行った。
（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置）
　　ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＮｅｘｅｒａＸ２
　　ＭＳ／ＭＳ：ＡＢＳＣＩＥＸ　ＱＴＲＡＰ５５００
（ＨＰＬＣ条件）
　カラム：Ｋｉｎｅｔｉｋ　Ｃ１８　１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径２．６μｍ
　カラム温度：５０℃
　カラム流量：０．３ｍＬ
　溶離液Ａ：０．１％ギ酸；溶離液Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル
　グラジエント：Ａ：Ｂ　９５：５（０ｍｉｎ）→４０：６０（２０ｍｉｎ）→２０：８０（５０ｍｉｎ）→９５：５（５５ｍｉｎ）→９５：５（９０ｍｉｎ）
（質量分析条件）
　イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
　極性：ポジティブ
　スプレー電圧：５５００Ｖ
　ターボヒーター温度：４５０℃
試験例１　ソバアレルゲンの検出
　２２ｋＤａタンパク質（配列番号２５）を標的アレルゲン分子として、表１に示す条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭにより標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。結果を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
試験例２　甲殻類アレルゲンの検出
　トロポミオシン（配列番号２６）を標的アレルゲン分子として、表２に示す条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭにより標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例３　食品組成物からのソバアレルゲンおよび甲殻類アレルゲンの検出
　ソバまたは甲殻類（エビパウダー）を０．０１質量％添加した小麦粉から、参考例１に従ってアレルゲン含有試料を調製した。得られた試料を、実施例１に従ってトリプシン消化、脱塩およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭにかけ、標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。対照として、ソバまたは甲殻類無添加小麦粉を用いて同様の分析を行った。検出するソバおよび甲殻類のアレルゲン由来ポリペプチド、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の条件は、それぞれ表１および表２と同じとした。測定結果を図３および４に示す。
試験例４　乳、卵およびラッカセイアレルゲンの検出
　全粉乳、全卵粉およびラッカセイ粉のそれぞれから、参考例１に従ってアレルゲン含有試料を調製した。各試料を、実施例１の１）～３）に従ってトリプシン消化、脱塩およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭにかけ、標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。全粉乳、全卵粉およびラッカセイ粉のそれぞれについての標的アレルゲン分子、および検出したアレルゲン由来ポリペプチドを、表３～５に示す。全粉乳、全卵粉およびラッカセイ粉のいずれのアレルゲンも、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で検出することができた（図５～７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
試験例５　食品組成物からの乳およびラッカセイアレルゲンの検出
　全粉乳および落花生粉のいずれかを添加したパン（添加パン；添加量０．８４質量％）、ならびに乳および落花生を含まないパン（無添加パン）を製造した。添加パンと無添加パンを混合し、１００倍希釈添加パン（全粉乳および落花生粉の添加量０．００８４質量％）を調製した。得られた１００倍希釈添加パンに含まれる乳またはラッカセイアレルゲン（カゼインおよびAra hを含むラッカセイ可溶性タンパク質）の濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した（定量下限値１ｐｐｍ）。測定結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次に、無添加パンおよび１００倍希釈添加パンから参考例１に従ってアレルゲン含有試料を調製した。得られた試料を、実施例１に従ってトリプシン消化、脱塩およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭにかけ、標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。検出対象には、乳についてはカゼイン由来ポリペプチド（配列番号１３～１５）、ラッカセイについてはAra h1またはh3由来ポリペプチド（配列番号２２～２４）を選択した。
　その結果、１００倍希釈添加パンについて、乳アレルゲン（カゼイン）およびラッカセイアレルゲン（Ara h1またはh3）のピークを十分な感度で確認することができた（図８および９）。さらに、５００倍希釈添加パンを用いての同様のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＭＲＭ測定でも、ピークのＳ／Ｎが１０以上あることが確認された。他方、無添加パンではピークは確認されなかった。したがって、本発明の方法によれば、ＥＬＩＳＡ法と同等の測定感度（定量下限値１ｐｐｍ）でアレルゲンを検出することができる。

Claims (13)

  1. 　試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
    　試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
    　クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
    　該アレルゲンが、ソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイからなる群より選択される１種以上である、
    方法。
  2. 　前記アレルゲンがソバおよび／または甲殻類である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記アレルゲンがソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイである、請求項１記載の方法。
  4. 　前記アレルゲンがソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上である、請求項１記載の方法。
  5. 　前記アレルゲンが甲殻類であり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上である、請求項１記載の方法。
  6. 　前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上である、請求項２記載の方法。
  7. 　前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１３～１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１８～２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号２２～２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上である、請求項３記載の方法。
  8. 　配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てについて存在の有無を検出する、請求項４記載の方法。
  9. 　配列番号８～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てについて存在の有無を検出する、請求項５記載の方法。
  10. 　配列番号１～１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てについて存在の有無を検出する、請求項６記載の方法。
  11. 　配列番号１～２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てについて存在の有無を検出する、請求項７記載の方法。
  12. 　前記クロマトグラフィー分離を利用した分析が液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記タンパク質分解酵素がトリプシンである請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。 
PCT/JP2017/026179 2016-07-21 2017-07-20 アレルゲン検出方法 WO2018016551A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020197001990A KR102329725B1 (ko) 2016-07-21 2017-07-20 알레르겐 검출 방법
EP17831067.8A EP3489677B1 (en) 2016-07-21 2017-07-20 Allergen detection method
JP2018528848A JP6903661B2 (ja) 2016-07-21 2017-07-20 アレルゲン検出方法
CA3031176A CA3031176C (en) 2016-07-21 2017-07-20 Allergen detection method
US16/318,756 US11175271B2 (en) 2016-07-21 2017-07-20 Allergen detection method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016142994 2016-07-21
JP2016-142994 2016-07-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018016551A1 true WO2018016551A1 (ja) 2018-01-25

Family

ID=60992602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/026179 WO2018016551A1 (ja) 2016-07-21 2017-07-20 アレルゲン検出方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11175271B2 (ja)
EP (1) EP3489677B1 (ja)
JP (1) JP6903661B2 (ja)
KR (1) KR102329725B1 (ja)
CA (1) CA3031176C (ja)
WO (1) WO2018016551A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021039147A1 (ja) 2019-08-30 2021-03-04 国立医薬品食品衛生研究所長が代表する日本国 アレルゲン検出用マーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法
JPWO2022044071A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03
WO2023190098A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 日本ハム株式会社 落花生アレルゲンの検査用キットおよび検査方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE062670T2 (hu) * 2015-12-29 2023-11-28 Sanofi Sa Eljárás földimogyoró-antigéneket tartalmazó készítmények jellemzésére
CA3150323A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 Mars, Incorporated QUANTIFICATION OF PEANUT PROTEIN IN FOOD PRODUCTS
EP4293351A1 (en) * 2021-08-27 2023-12-20 ifp Privates Institut für Produktqualität GmbH Sensitive detection of food allergens by immunoenrichment and lc-ms/ms
CN114539377A (zh) * 2022-02-25 2022-05-27 青岛海关技术中心 一种使用液相色谱-质谱检测十足目水产过敏原的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4841494B2 (ja) * 2006-12-11 2011-12-21 株式会社マルハニチロ水産 食品中タンパク質の高感度検出法
WO2012044411A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Dow Agrosciences Llc Quantification and characterization of allergens
CN103930787B (zh) * 2011-09-02 2016-12-21 Dh科技发展私人贸易有限公司 检测过敏原的系统和方法

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANSARI, P. ET AL.: "Selection of possible marker peptides for the detection of major ruminant milk proteins in food by liquid chromatography- tandem mass spectrometry", ANALYTICAL BIOANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 399, 2011, pages 1105 - 1115, XP019871620 *
CHASSAIGNE, H. ET AL.: "Proteomics-Based Approach To Detect and Identify Major Allergens in Processed Peanuts by Capillary LC-Q-TOF (MS/MS", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 55, no. 11, 2007, pages 4461 - 4473, XP055371918 *
KORTE, R. ET AL.: "New High-Performance Liquid Chromatography Coupled Mass Spectrometry Method for the Detection of Lobster and Shrimp Allergens in Food Samples via Multiple Reaction Monitoring and Multiple Reaction Monitoring Cubed", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 64, 8 July 2016 (2016-07-08), pages 6219 - 6227, XP055454285 *
LOCK, S. ET AL.: "The Detection of Allergens in Bread and Pasta by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry", FOOD & ENVIRONMENTAL, 2010, pages 1 - 5, XP055455101, Retrieved from the Internet <URL:https://sciex.com/Documents/brochures/Allergens-QTRAP4k_1830610.pdf> *
NAGAI, H. ET AL.: "Development of a Method for Crustacean Allergens Using Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry", JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL, vol. 98, no. 5, 2015, Arlington, VA , pages 1355 - 1365, XP009514171, ISSN: 1060-3271, DOI: 10.5740/jaoacint.14-248 *
NAGAI, H.: "Development of a Method for Determination of Buckwheat Allergens Using Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry", JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL, vol. 100, no. 4, 3 March 2017 (2017-03-03), Arlington, VA, pages 1051 - 057, XP009514172, ISSN: 1060-3271, DOI: 10.5740/jaoacint.11-0214 *
NAGAI, HIROYUKI: "Development of allergic substance test method using LC-MS / MS", REPORT OF GIFU PREFECTURAL RESEARCH INSTITUTE FOR HEALTH AND ENVIRONMENTAL SCIENCES, vol. 22, 2014, pages 1 - 5, XP009518417 *
RAHMAN, A.M.A. ET AL.: "Analysis of the allergic proteins in black tiger prawn (Penaeus monodon) and characterization of the major allergen tropomyosin using mass spectrometry", RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, vol. 24, 2010, pages 2462 - 2470, XP055455120 *
See also references of EP3489677A4 *
TAKAOKA, M. ET AL.: "Changes in Proteome Patterns in Buckwheat Seed under Submergence", PROCEEDING OF THE 9TH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON BUCKWHEAT, 2004, pages 95 - 98, XP055455109 *
YANO, M. ET AL.: "Purification and Properties of Allergenic Proteins in Buckwheat Seeds", AGRICULTURAL BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 53, no. 9, September 1989 (1989-09-01), pages 2387 - 2392, XP055455103 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021039147A1 (ja) 2019-08-30 2021-03-04 国立医薬品食品衛生研究所長が代表する日本国 アレルゲン検出用マーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法
KR20220052959A (ko) 2019-08-30 2022-04-28 국립의약품식품위생연구소장이 대표하는 일본국 알레르겐 검출용 마커 및 이를 사용한 알레르겐 검출 방법
JPWO2022044071A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03
WO2022044071A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03 株式会社島津製作所 質量分析制御装置、質量分析装置、質量分析方法およびプログラム
JP7405266B2 (ja) 2020-08-24 2023-12-26 株式会社島津製作所 質量分析制御装置、質量分析装置、質量分析方法およびプログラム
WO2023190098A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 日本ハム株式会社 落花生アレルゲンの検査用キットおよび検査方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3489677A4 (en) 2020-07-29
CA3031176C (en) 2024-02-13
JPWO2018016551A1 (ja) 2019-05-09
KR102329725B1 (ko) 2021-11-22
EP3489677B1 (en) 2023-01-18
JP6903661B2 (ja) 2021-07-14
US20190302081A1 (en) 2019-10-03
EP3489677A1 (en) 2019-05-29
CA3031176A1 (en) 2018-01-25
US11175271B2 (en) 2021-11-16
KR20190032377A (ko) 2019-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018016551A1 (ja) アレルゲン検出方法
Gu et al. A rapid solid-phase extraction combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for simultaneous screening of multiple allergens in chocolates
Zenezini Chiozzi et al. Purification and identification of endogenous antioxidant and ACE-inhibitory peptides from donkey milk by multidimensional liquid chromatography and nanoHPLC-high resolution mass spectrometry
Korte et al. Comprehensive peptide marker identification for the detection of multiple nut allergens using a non-targeted LC–HRMS multi-method
Mora et al. Proteomic identification of antioxidant peptides from 400 to 2500 Da generated in Spanish dry-cured ham contained in a size-exclusion chromatography fraction
Latif et al. Amino acid composition, antinutrients and allergens in the peanut protein fraction obtained by an aqueous enzymatic process
Lee et al. Determination of allergenic egg proteins in food by protein-, mass spectrometry-, and DNA-based methods
Cucu et al. MALDI based identification of soybean protein markers–Possible analytical targets for allergen detection in processed foods
Lagrain et al. Identification of intact high molecular weight glutenin subunits from the wheat proteome using combined liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry
Ogura et al. Simultaneous detection of 13 allergens in thermally processed food using targeted LC–MS/MS approach
Li et al. Comprehensive identification of short and medium-sized peptides from pixian broad bean paste protein hydrolysates using UPLC-Q–TOF–MS and UHPLC-Q exactive HF-X
Calvano et al. Proteomic analysisof food allergens by MALDI TOF/TOF mass spectrometry
CN116655740B (zh) 一种赭曲霉毒素a的抗原模拟肽及编码核酸分子和应用
Sha et al. Identification and analysis of characteristic tryptic peptides from porcine gelatin extracted with multi-stage batch processing
WO2021039147A1 (ja) アレルゲン検出用マーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法
Heick et al. Influence of sample extraction solutions on the detection of wheat proteins by mass spectrometry
Tung et al. Application of thermal stability difference to remove flammutoxin in fungal immunomodulatory protein, FIP-fve, extract from Flammulina velutipes
CN111157659A (zh) 一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法
CN109557193B (zh) 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法
Yu et al. Mass spectrometry analysis and in silico prediction of allergenicity of peptides in tryptic hydrolysates of the proteins from Ruditapes philippinarum
Li et al. A precise IDMS-based method for absolute quantification of phytohemagglutinin, a major antinutritional component in common bean
Suan Chua et al. Plant protein extraction and identification from Eurycoma longifolia by gel electrophoresis and mass spectrometry
JP2023076959A (ja) 食物性アレルゲン組成標準物質
Torii et al. Development of a rapid and reliable method to simultaneously detect seven food allergens in processed foods using LC-MS/MS
Sehgal et al. Characterization of native and denatured ricin using MALDI-TOF/MS

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018528848

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17831067

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3031176

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20197001990

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017831067

Country of ref document: EP

Effective date: 20190221