WO2018016393A1 - デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法 - Google Patents

デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018016393A1
WO2018016393A1 PCT/JP2017/025335 JP2017025335W WO2018016393A1 WO 2018016393 A1 WO2018016393 A1 WO 2018016393A1 JP 2017025335 W JP2017025335 W JP 2017025335W WO 2018016393 A1 WO2018016393 A1 WO 2018016393A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
preserving
composition
lactic acid
acid bacteria
deoxyribonucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/025335
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雅史 森藤
晶美 北出
深澤　朝幸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Co Ltd
Original Assignee
Meiji Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Co Ltd filed Critical Meiji Co Ltd
Publication of WO2018016393A1 publication Critical patent/WO2018016393A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/20—Milk; Whey; Colostrum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a composition for storing deoxyribonucleic acid (hereinafter referred to as “DNA”) and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method for storing DNA.
  • the present invention further relates to lactic acid bacteria products and methods of use thereof.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preserving DNA that can secure a sufficient supply amount and can keep the production cost low.
  • the composition for preserving DNA comprises a lactic acid bacterium product containing a polysaccharide (hereinafter referred to as “polysaccharide-containing lactic acid bacterium product”) as an active ingredient. That is, the polysaccharide-containing lactic acid bacteria product is used as a DNA storage composition or as one component thereof.
  • the “composition” referred to herein includes animals such as pharmaceuticals, supplements, food additives and the like, foods and drinks (excluding animals and plants themselves), and food and drink compositions (including processed foods and drinks). Included are those that can be ingested (including humans).
  • the term “preservation” as used herein means that DNA damage is suppressed or DNA damage repair is promoted.
  • the DNA storage composition according to the first aspect of the present invention can suppress DNA damage or promote DNA damage repair. That is, this DNA preserving composition can preserve DNA satisfactorily.
  • save composition is produced by lactic acid bacteria as above-mentioned. For this reason, the active ingredient of this composition for DNA preservation
  • a polysaccharide-containing lactic acid bacteria product is produced by a combination of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus and Streptococcus thermophilus.
  • the Lactobacillus delbruxii subspecies bulgaricus is specifically preferably Lactobacillus delbruxii subspecies bulgaricus OLL1247 (accession number: NITE BP-01814)
  • the thermophilus is specifically preferably Streptococcus thermophilus OLS3078 (accession number: NITE BP-01697).
  • the method according to the second aspect of the present invention is a method of using a polysaccharide-containing lactic acid bacteria product as a DNA storage composition. That is, it is to provide a polysaccharide-containing lactic acid bacteria product for use as a DNA storage composition.
  • the method for preserving DNA according to the third aspect of the present invention is a method for ingesting the above-described DNA preserving composition.
  • the intake period is preferably 1 week or longer, more preferably 2 weeks or longer, further preferably 3 weeks or longer, and particularly preferably 4 weeks or longer.
  • a composition for preserving DNA is produced by supplying a milk raw material to a lactic acid bacterium that produces a polysaccharide. That is, here, the polysaccharide-containing lactic acid bacteria product is used to produce a composition for preserving DNA.
  • FIG. 5 is a bar graph showing the abundance of 8-oxo-2'-deoxyguanosine in DNA collected from each sample according to an experimental example. It is a bar graph which shows the relative quantity of the mRNA of catalase measured using the cDNA synthesize
  • XPA xerderma pigmentmentum completion group A
  • a composition for preserving DNA is an orally ingested composition for suppressing DNA damage or promoting DNA damage repair, which is a lactic acid bacteria product containing a polysaccharide.
  • polysaccharide-containing lactic acid bacteria product is an active ingredient.
  • the polysaccharide-containing lactic acid bacteria product includes a polysaccharide-containing lactic acid bacteria fermented product (hereinafter referred to as “polysaccharide-containing lactic acid bacteria fermented product”), polysaccharide.
  • Lactic acid bacteria cultures hereinafter referred to as “polysaccharide-containing lactic acid bacteria cultures”
  • lactic acid bacteria metabolites containing polysaccharides and the like.
  • polysaccharide referred to here is a sugar chain polymer composed of saccharides such as galactose, glucose, rhamnose, mannose, N-acetylglucosamine.
  • the polysaccharides may include acidic polysaccharides to which phosphate groups are bonded.
  • the molecular weight is usually in the range of 5000 to 500,000.
  • lactic acid bacterium as used herein is a general term for microorganisms that assimilate glucose and produce lactic acid with a yield of sugar of 50% or more. It is a gram-positive staphylococci or gonococci with no motility. It has characteristics such as lack of spore formation and negative catalase. Lactic acid bacteria have been eaten all over the world through fermented milk since ancient times, and can be said to be extremely safe microorganisms.
  • lactic acid bacteria have been genus Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Wissella, Tetrageno
  • the genus is classified into 11 genera such as Tetragenococcus genus, Oenococcus genus, Enterococcus genus, Vagococcus genus and Carnobacterium genus. All of these lactic acid bacteria can be used in the embodiment of the present invention.
  • Lactobacillus delbrueckii subspices bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subspices bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus is preferably Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus OLL1247 (accession number: NITE BP-01814)
  • Streptococcus thermophilus is Streptococcus -Thermophilus (Streptococcus thermophilus) OLS3078 (accession number: NITE BP-01697) is preferable.
  • lactic acid bacteria fermented product means a culture itself obtained by fermentation with lactic acid bacteria.
  • the fermented lactic acid bacterium includes a fermented lactic acid bacterium and a processed product thereof, for example, a culture filtrate or culture supernatant obtained by sterilizing a culture (fermented lactic acid bacterium) by filtration, centrifugation, membrane separation, or the like.
  • Liquid, culture filtrate / culture supernatant, lactic acid bacteria fermented product, and the like concentrated by an evaporator or the like, pasted product, diluted product (dried, heated, reduced pressure, etc.) dried product.
  • the preparation of the treated product should be performed by combining one or more of the aforementioned treatment steps such as sterilization treatment such as filtration, centrifugation, membrane separation, precipitation, concentration, pasting, dilution, drying, etc. Can do.
  • sterilization treatment such as filtration, centrifugation, membrane separation, precipitation, concentration, pasting, dilution, drying, etc.
  • the culture medium include nonfat dry milk medium and MRS medium to which yeast extract is added.
  • the lactic acid bacteria product is a milk fermentation product, a milk culture, or a milk metabolite of the lactic acid bacteria.
  • the fermented milk product, the milk culture product, and the milk metabolite include fermented milk (yogurt) and polysaccharides.
  • Fermented milk (yogurt) is a fermented food prepared by mixing lactic acid bacteria and yeast with milk and fermenting it, and is widely eaten from the viewpoint of its deliciousness, beauty and health. Fermented milk (yogurt) can be preferably used as its supernatant.
  • This fermented milk may be added with a thickening agent such as pectin, guar gum, xanthan gum, carrageenan, processed starch, or a gelling agent, in addition to a culture solution such as skim milk powder or a whey degradation product.
  • a thickening agent such as pectin, guar gum, xanthan gum, carrageenan, processed starch, or a gelling agent
  • milk examples include animal milk such as cow milk and processed products thereof (for example, skim milk, whole milk powder, skim milk powder, spinach, casein, whey, fresh cream, compound cream, butter, buttermilk powder, cheese Etc.), vegetable milk such as soybean milk derived from soybean.
  • animal milk such as cow milk and processed products thereof (for example, skim milk, whole milk powder, skim milk powder, spinach, casein, whey, fresh cream, compound cream, butter, buttermilk powder, cheese Etc.)
  • vegetable milk such as soybean milk derived from soybean.
  • the milk may be sterilized or may not be sterilized.
  • the fermented milk raw material mix is a mixture containing raw milk and other components.
  • This fermented milk raw material mix includes raw materials commonly used in the production of fermented milk such as raw milk, water, and other optional components (eg, sugar, sugar, sweetener, sour agent, mineral, vitamin, flavor, etc.). It is obtained by warming to dissolve and mixing.
  • Raw milk may contain water, raw milk, pasteurized milk, skim milk, whole milk powder, skim milk powder, whole fat concentrated milk, skim concentrated milk, butter milk, butter, cream, cheese, and the like.
  • the raw milk may contain whey protein concentrate (WPC), whey protein isolate (WPI), ⁇ -lactalbumin ( ⁇ -La), ⁇ -lactoglobulin ( ⁇ -Lg) and the like. .
  • fermented milk undergoes processes such as raw material mix preparation process, raw material mix (heating) sterilization process, raw material mix cooling process, starter addition process, fermentation process, fermented milk cooling process, etc.
  • raw material mix preparation step raw materials are mixed (prepared).
  • raw material mix cooling step raw material mix cooling step
  • starter addition step raw material mix cooling step
  • fermentation step fermented milk cooling step
  • a commonly used medium can be used. That is, any medium can be used as long as it contains a nitrogen source, an inorganic substance and other nutrients in addition to the main carbon source.
  • a nitrogen source lactose, glucose, sucrose, fructose, starch hydrolysate, molasses, etc. can be used depending on the assimilation ability of the bacteria used.
  • organic nitrogen-containing substances such as casein hydrolyzate, whey protein hydrolyzate, ⁇ -lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin, glycomacropeptide, soybean protein hydrolyzate and the like can be used.
  • meat extract, fish extract, yeast extract and the like can be used as the growth promoter.
  • the lactic acid bacteria are preferably cultured in an anaerobic state, but are usually preferably cultured in a microaerobic state used in liquid stationary culture or the like.
  • a culture method under anaerobic conditions a known method such as a method of culturing in a carbon gas gas phase can be adopted, but other methods may be adopted.
  • the culture temperature is preferably in the range of 30 ° C. to 47 ° C., more preferably in the range of 35 ° C. to 46 ° C., and still more preferably in the range of 37 ° C. to 45 ° C. .
  • the pH of the medium during the cultivation of lactic acid bacteria is preferably maintained within the range of 6 or more and 7 or less, but may be other pH ranges as long as the pH allows the bacteria to grow.
  • the culture time for lactic acid bacteria and the like is usually preferably in the range of 1 hour to 48 hours, more preferably in the range of 1.5 hours to 36 hours, and more preferably in the range of 2 hours to 24 hours. More preferably it is.
  • Fermented milk typically has a non-fat milk solid content of 8% by weight or more, and the number of lactic acid bacteria or yeast is in the range of 10 6 / ml to 10 11 / ml.
  • composition for preserving DNA is a preparation such as pharmaceuticals, supplements and food additives, food and drink (except animals and plants themselves), and food and drink. It may take the form of a product composition (including processed food and drink).
  • the preparation is prepared as an oral preparation according to a conventional method using additives that are acceptable for formulation.
  • This preparation may take the form of solid preparations such as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, pills, sustained-release preparations, and liquid preparations such as solutions, suspensions and emulsions.
  • Additives that are acceptable for formulation include, for example, excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorants, fragrances, buffers, antioxidants, pH Examples thereof include regulators.
  • Specific examples of food additives include seasonings such as processed seasonings, flavor seasonings, and cooking mixes.
  • the food and drink and the food and drink composition are processed for human and animal food and drink, and include solutions, suspensions, emulsions, powders, and solid moldings. It is not particularly limited as long as it can be taken orally such as food.
  • foods and drinks and food and drink compositions include milk products (including processed milk), yogurts, lactic acid bacteria beverages, fermented milk, ice creams, creams, cheeses, and other dairy products;
  • milk products including processed milk
  • yogurts lactic acid bacteria beverages
  • fermented milk ice creams, creams, cheeses, and other dairy products
  • fruit juice beverages vegetable beverages, soy milk beverages, coffee beverages, tea beverages, jelly beverages, cocoa, smoothie powdered beverages and sports powdered beverages
  • fortified powdered beverages cosmetic powdered foods, powdered soups, steamed bread
  • beverages such as concentrated beverages and alcoholic beverages
  • bread products such as bread, pasta, noodles, cake mixes, fried flour and bread crumbs
  • chocolate, gum, rice cake, cookies, gummi, snacks Japanese sweets, jelly, pudding, etc.
  • Confectionery such as dessert confectionery; curry, busta sauce, potov, stew, Japanese food retort food; processed oil, butter, margarine, spread Fats and oils such as mayonnaise; Instant foods such as freeze-dried foods; Agricultural processed products such as canned agricultural products, jams and marmalades, pickles, boiled beans, cereals, miscellaneous foods; processed fishery products; processed livestock products; Frozen foods such as side dishes and fries; liquid foods, animal feeds, tablets, and cosmetics used in the oral cavity.
  • the food and drink and the food and drink composition include functional food, health and nutrition food, health food, food for specified health, functional display food, functional nutrition food, food for the sick, Also included are classifications such as infant formula, maternal or lactating infant formula, or food and drink with a disease risk reduction label.
  • the indication of disease risk reduction is the indication of food or drink that may reduce the disease risk, and is based on the standard established by the FAO / WHO Joint Food Standards Committee (Codex Committee) or Refers to the standard and is a prescribed or recognized indication.
  • arbitrary components can be added to the food and drink and the food and drink composition as necessary.
  • optional ingredients are not particularly limited, but are usually sweeteners, acidulants, vegetables, fruits and seed juices and extracts, vitamins, minerals, amino acids, etc.
  • Nutrients lactic acid bacteria (excluding essential lactic acid bacteria according to embodiments of the present invention), useful microorganisms such as bifidobacteria and propionic acid bacteria, fermented products thereof, functional sugars such as oligosaccharides, royal jelly, glucosamine , Existing functional materials such as astaxanthin and polyphenol, fragrances, pH adjusters, excipients, acidulants, colorants, emulsifiers, preservatives and the like.
  • composition for preserving DNA is preferably taken orally for at least 7 days so that the intake of the polysaccharide is 200 ⁇ g or more / day.
  • the intake of the polysaccharide is not particularly limited as long as it does not harm the human body, but considering the cost effectiveness, it is preferably in the range of 200 ⁇ g / day to 60000 ⁇ g / day, preferably 300 ⁇ g / day to 45000 ⁇ g. Is more preferably in the range of 400 ⁇ g / day to 30000 ⁇ g / day, and particularly preferably in the range of 500 ⁇ g / day to 15000 ⁇ g / day. And “mass / day or more” is synonymous with “mass / day / day”, and “mass / day or less” is synonymous with “mass / day / day”.)
  • the required doses of the above-mentioned active ingredients are based on human administration experiments, but the necessary doses to the human body from the required administration doses in animal experiments (for example, mouse experiments) using the following formula based on Food Safety Commission materials. It can also be converted into a dose.
  • (Necessary administration dose to human body (converted value)) (Necessary administration dose to animal) ⁇ (Lower female body weight: 40 kg) ⁇ (Safety factor: 100)
  • the content of polysaccharides in yogurt was measured according to the phenol sulfate method (Hodge et al., “Methods in carbohydrate chemistry”, Vol. 1, page 338 (1962)). Specifically, it is as follows.
  • the yogurt was administered at 11.3 g / kg body weight / day, and the polysaccharide extract group was administered at 70 mg / kg body weight / day.
  • the dorsal skin of hairless mice in the pre-UV irradiation water group, the pre-UV irradiation yogurt group, and the pre-UV irradiation polysaccharide extract group was collected under isoflurane anesthesia. Further, after 7 days from the start of administration of each sample, the back of the remaining group of hairless mice was irradiated with ultraviolet light at an illuminance of 0.4 mW / cm 2 for 50 seconds (GL20SE manufactured by Sankyo Electric Co., Ltd.
  • a group of hairless mice administered with water (corresponding to a comparative example) is referred to as a “control group”, and a group of hairless mice orally administered with yogurt at 11.3 g / kg body weight / day (in the examples).
  • polysaccharide extract group a group of hairless mice (corresponding to Examples) in which the polysaccharide extract was orally administered at 70 mg / kg body weight / day is referred to as “polysaccharide extract group”.
  • DNA damage marker Verification of inhibitory effect of DNA damage by active oxygen DNA was collected from the back skin of each group of hairless mice collected as described above using qiagen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) and purified. . Then, this DNA was degraded using DNase I, alkaline phosphatase, and phosphodiesterase (8-OHdG Assay Preparation Reagent Set, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Thereafter, the abundance of 8-oxo-2′-deoxyguanosine (8-OHdG), a DNA damage marker, was quantified.
  • a high performance liquid chromatography / tandem mass spectrometer (4500QTRAP, manufactured by Sciex) was used.
  • ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 ⁇ m, 2.1 mm ⁇ 100 mm, manufactured by Waters) was used.
  • 0.1% formic acid aqueous solution was used as mobile phase A
  • 0.1% formic acid methanol solution was used as mobile phase B.
  • the mobile phase composition at the start was set to mobile phase A: 100%, and after 5 minutes, the mobile phase composition was “mobile phase A: 50%, mobile phase B: 50%”.
  • the mobile phase composition was set to “mobile phase A: 1%, mobile phase B: 99%” and held for 1 minute, and the mobile phase composition was switched to mobile phase A: 100% and held for 2 minutes. did.
  • the measurement time of one sample in the high performance liquid chromatography / tandem mass spectrometer is set to 8 minutes, the flow rate of the mobile phase is set to 0.3 mL / min, the column temperature is set to 40 ° C., and electrospray ionization is used. 8-OHdG was detected in positive mode.
  • the analytical variables of the high performance liquid chromatography / tandem mass spectrometer were set as follows.
  • RNA was extracted from the back skin of each group of hairless mice collected as described above using RNeasy Mini Kit (Qiagen). Thereafter, cDNA was synthesized from the extracted total RNA using a RiverAid First Strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Thermo Fisher). Then, using ABI 7500 Fast Realtime PCR system (Applied Biosystems), the relative amount of the catalase mRNA was quantified from the cDNA and GAPDH as the endogenous gene.
  • XPA xeroda pigmentmentum complementation group A
  • the results of this experimental example are as shown in FIG. 4.
  • the relative amount of XPA mRNA which is a DNA repair protein after 24 hours and 72 hours after UV irradiation, is higher than that of the control group in the yogurt group and polysaccharide extract.
  • yogurt and polysaccharide extract were found to have an effect of promoting the repair of DNA damage caused by ultraviolet irradiation or active oxygen.
  • the symbol “*” indicates that there is a significant difference with respect to the control group at P ⁇ 0.05.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明の課題は、十分な供給量を確保することができると共に製造コストを低く抑えることができるデオキシリボ核酸保存用組成物を提供することである。　本発明に係るデオキシリボ核酸保存用組成物は、多糖体を含有する乳酸菌産生物を有効成分とする。なお、乳酸菌産生物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌と、ストレプトコッカス・サーモフィラスＯＬＳ３０７８菌との組合せによって生成されることが好ましい。

Description

デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法
　本発明は、デオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」と称する。）を保存するための組成物およびその製造方法に関する。また、本発明は、ＤＮＡを保存する方法にも関する。さらに、本発明は、乳酸菌産生物およびその使用方法にも関する。
　過去に「松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ保護剤および健康食品」が提案されている（例えば、特開２００３－２３８４２７等参照）。
特開２００３－２３８４２７号公報
　しかし、松は成木になるまでに期間が比較的長く、その供給量に限りがある。また、その抽出物を得るためには伐採等の比較的危険な作業が必要となる共に、抽出後の残りカスの処分も必要となる。このため、「松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ保護剤および健康食品」の製造コストは必然的に高くなってしまう。したがって、「松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ保護剤および健康食品」は、高価な商品となることが想定される。
　本発明の課題は、十分な供給量を確保することができると共に製造コストを低く抑えることができるＤＮＡ保存用組成物を提供することである。
　本発明の第１局面に係るＤＮＡ保存用組成物は、多糖体を含有する乳酸菌産生物（以下「多糖体含有乳酸菌産生物」と称する。）を有効成分とする。すなわち、多糖体含有乳酸菌産生物をＤＮＡ保存用組成物としてまたはその一成分として使用する。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれる。また、ここにいう「保存」とは、ＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりすることを意味する。
　本願発明者らの鋭意検討の結果、本発明の第１局面に係るＤＮＡ保存用組成物がＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりすることができることが明らかとされた。すなわち、このＤＮＡ保存用組成物は、良好にＤＮＡを保存することができる。また、このＤＮＡ保存用組成物の有効成分は、上述の通り乳酸菌によって産生される。このため、このＤＮＡ保存用組成物の有効成分は、比較的安全な作業で廃棄物を出すことなく短時間で産生することができる。このため、このＤＮＡ保存用組成物は、十分な供給量を確保することができると共に製造コストを低く抑えることができる。
　ところで、上述のＤＮＡ保存用組成物において、多糖体含有乳酸菌産生物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）とストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）との組合せによって生成されることが好ましい。なお、ここで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスは具体的にはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１８１４）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィラスは具体的にはストレプトコッカス・サーモフィラスＯＬＳ３０７８菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１６９７）であることが好ましい。
　本発明の第２局面に係る方法は、多糖体含有乳酸菌産生物をＤＮＡ保存用組成物として使用する方法である。すなわち、ＤＮＡ保存用組成物としての使用のための多糖体含有乳酸菌産生物を提供することである。
　本発明の第３局面に係るＤＮＡを保存する方法は、上述のＤＮＡ保存用組成物を経口摂取する方法である。ただし、ヒトを治療する行為を除かれる。なお、摂取期間は、１週間以上であることが好ましく、２週間以上であることがより好ましく、３週間以上であることがさらに好ましく、４週間以上であることが特に好ましい。
　本発明の第４局面に係るＤＮＡ保存用組成物の製造方法では、多糖体を産生する乳酸菌に乳原料が供給されることによってＤＮＡ保存用組成物が製造される。すなわち、ここでは、多糖体含有乳酸菌産生物が、ＤＮＡを保存するための組成物を製造するために使用される。
実験例に係る各試料から採取されたＤＮＡ中のシクロブタンピリミジンダイマーの存在量を示す棒グラフ図である。 実験例に係る各試料から採取されたＤＮＡ中の８－オキソ－２’－デオキシグアノシンの存在量を示す棒グラフ図である。 実験例に係る各試料から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて測定されたカタラーゼのｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフ図である。 実験例に係る各試料から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて測定されたｘｅｒｏｄｅｒｍａ　ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　Ａ（ＸＰＡ）のｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフ図である。
　本発明の実施の形態に係るＤＮＡ保存用組成物は、ＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりするための経口摂取組成物であって、多糖体を含有する乳酸菌産生物（以下「多糖体含有乳酸菌産生物」と称する。）を有効成分とする。以下、このＤＮＡ保存用組成物の有効成分について詳述した後、ＤＮＡ保存用組成物の形態について説明を行い、各形態における任意成分について詳述する。また、その後、さらに、ＤＮＡ保存用組成物の効率的な摂取方法やその効果についても詳述する。
　（１）多糖体含有乳酸菌産生物
　本発明の実施の形態において、多糖体含有乳酸菌産生物には、多糖体を含有する乳酸菌発酵物（以下「多糖体含有乳酸菌発酵物」という。）、多糖体を含有する乳酸菌培養物（以下「多糖体含有乳酸菌培養物」という。）、多糖体を含有する乳酸菌代謝物等が含まれる。
　なお、ここにいう「多糖体」とは、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミンなどの糖類から構成される糖鎖高分子である。この多糖体には、中性多糖体の他、リン酸基が結合した酸性多糖体が含まれてもよい。また、その分子量は、通常、５０００から５０万の範囲内である。
　また、ここにいう「乳酸菌」とは、ブドウ糖を資化して対糖収率で５０％以上の乳酸を生産する微生物の総称で、生理学的性質としてグラム陽性菌の球菌または桿菌で、運動性なし、胞子形成能なし、カタラーゼ陰性などの特徴を有しているものである。乳酸菌は古来、発酵乳等を介して世界各地で食されており、極めて安全性の高い微生物と言える。乳酸菌は現在までに、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、リューコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ワイセラ（Wissella）属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、オエノコッカス（Oenococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、バゴコッカス（Vagococcus）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属の１１属に分類されている。本発明の実施の形態ではこれら全ての乳酸菌を用いることができるが、これらの中でも、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）とストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）とを混合して用いることが特に好ましい。なお、ここにいうラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１８１４）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィラスはストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３０７８菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１６９７）であることが好ましい。ここで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ１２４７菌は、２０１４年３月６日付（受託日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１８１４として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている。また、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３０７８菌は、２０１３年８月２３日付（受託日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１６９７として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
　ここにいう「乳酸菌発酵物」とは、乳酸菌による発酵によって得られた培養物自体を意味する。そして、この乳酸菌発酵物には、乳酸菌の発酵物およびその処理物、例えば、培養物（乳酸菌発酵物）をろ過・遠心分離もしくは膜分離等で除菌して得られた培養濾液や培養上清液、培養濾液・培養上清液や乳酸菌発酵物等をエバポレーター等により濃縮した濃縮物、ペースト化物、希釈物又は（凍結、加熱、減圧など）乾燥物が含まれる。なお、処理物の調製の際は、ろ過、遠心分離、膜分離等の除菌処理、沈殿、濃縮、ペースト化、希釈、乾燥などの前述の処理工程の１つ又は複数を組み合わせて実施することができる。また、培養物用の培地としては、例えば、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地等が挙げられる。
　乳酸菌産生物は乳酸菌の乳発酵物や、乳培養物、乳代謝物であるのが特に好ましい。乳発酵物や、乳培養物、乳代謝物としては、例えば、発酵乳（ヨーグルト）や多糖体が挙げられる。発酵乳（ヨーグルト）は、乳に乳酸菌や酵母を混ぜて発酵することによって調製される発酵食品であり、その美味しさと、美容や健康面から幅広く食されている。発酵乳（ヨーグルト）は、好ましくはその上清とすることができる。この発酵乳には、脱脂粉乳や、ホエイ分解物等の培養液の他、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、カラギーナン、加工でんぶん等の増粘剤やゲル化剤が添加されていてもよい。
　乳としては、例えば、牛乳等の獣乳や、その加工品（例えば、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、れん乳、カゼイン、乳清、生クリーム、コンパウンドクリーム、バター、バターミルクパウダー、チーズ等）、大豆由来の豆乳等の植物性乳等が挙げられる。なお、乳は、殺菌処理されていてもよいし、殺菌処理されていなくてもよい。
　ところで、発酵乳の原料として、例えば、発酵乳原料ミックスと呼ばれるものが挙げられる。発酵乳原料ミックスとは、原料乳および他の成分を含む混合物である。この発酵乳原料ミックスは、例えば、原料乳、水、他の任意成分（例えば、砂糖、糖類、甘味料、酸味料、ミネラル、ビタミン、香料等）等の発酵乳の製造に常用される原料を加温して溶解し、混合することによって得られる。原料乳には、水、生乳、殺菌乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、バターミルク、バター、クリーム、チーズ等が含まれてもよい。また、原料乳には、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａ）、β－ラクトグロブリン（β－Ｌｇ）等が含まれてもよい。
　発酵乳は、従来の方法と同様に、原料ミックスの調合工程、原料ミックスの（加熱）殺菌工程、原料ミックスの冷却工程、スターターの添加工程、発酵工程、発酵乳の冷却工程等の工程を経て製造される。原料ミックスの調合工程では、原材料が混合（調合）される。なお、上述の工程では、発酵乳を製造する際に用いられる通常の条件を適宜採用すればよい。また、原料ミックスの（加熱）殺菌工程、原料ミックスの冷却工程、スターターの添加工程、発酵工程および発酵乳の冷却工程は、この順番で実施されることが好ましい。
　乳酸菌を培養するための培地としては、通常用いられる培地を使用することができる。すなわち、主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地であれば、いずれの培地も使用することができる。炭素源としては、使用菌の資化性に応じて、ラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、澱粉加水分解物、廃糖蜜等を使用することができる。窒素源としては、カゼインの加水分解物、ホエイタンパク質加水分解物、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン、グリコマクロペプチド、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。ほかに増殖促進剤としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等を使用することができる。
　乳酸菌は、嫌気状態で培養されることが好ましいが、通常、液体静置培養等で用いられる微好気状態で培養されることが好ましい。なお、嫌気状態下での培養方法には、炭素ガス気相下で培養する方法などの公知の手法を採用することができるが、他の方法が採用されてもかまわない。培養温度は一般に３０℃以上４７℃以下の範囲内であることが好ましく、３５℃以上４６℃以下の範囲内であることがより好ましく、３７℃以上４５℃以下の範囲内であることがさらに好ましい。乳酸菌培養中の培地のｐＨは、６以上７以下の範囲内に維持されることが好ましいが、菌が生育するｐＨであれば他のｐＨ範囲でもよい。乳酸菌等の培養時間としては、通常、１時間以上４８時間以下の範囲内が好ましく、１．５時間以上３６時間以下の範囲内であることがより好ましく、２時間以上２４時間以下の範囲内であることがさらに好ましい。
　発酵乳（ヨーグルト）は、典型的には、無脂乳固形分が８重量％以上であり、乳酸菌数又は酵母数が１０６個／ｍｌ以上１０１１個／ｍｌ以下の範囲内である。
　（２）ＤＮＡ保存用組成物の形態および任意成分
　本発明の実施の形態に係るＤＮＡ保存用組成物は、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の形態を採り得る。
　本発明の実施の形態において、製剤とは、製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤として調製したものである。この製剤は、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態を採り得る。製剤化のために許容され得る添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。なお、食品添加剤としては、具体的には加工調味料、風味調味料、調理ミックス等の調味料等が挙げられる。
　また、本発明の実施の形態において、飲食品および飲食品組成物とは、ヒトや動物の飲食のために加工されたものであって、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、固体成形物等の経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。飲食品および飲食品組成物の例としては、具体的には、乳飲料（加工乳を含む）、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、発酵乳、アイスクリーム類、クリーム類、チーズ類などの乳製品；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ゼリー飲料、ココア、スムージーなどの粉末飲料やスポーツ粉末飲料、栄養強化の粉末飲料、美容用の粉末食品、粉末スープ、蒸しパンのもと、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；チョコレート、ガム、飴、クッキー、グミ、スナック、和菓子、ゼリー、プリンなどのデザート菓子などの菓子類；カレー、バスタソース、ポトフ、シチュー、和風食品のレトルト食品；加工油脂、バター、マーガリン、スプレッド、マヨネーズなどの油脂類；フリーズドライ食品などの即席食品類；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル、雑炊などの農産加工品；水産加工品；畜産加工品；ピッツア、ドリア、グラタン、惣菜、フライなど冷凍食品；流動食、さらには動物の飼料、タブレット、口腔内に使用する化粧品などが挙げられる。
　なお、本発明の実施の形態において、飲食品および飲食品組成物には、機能性食品、健康栄養食品、健康食品、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳、または疾病リスク低減表示を付した飲食品のような分類のものも包含される。ここで、疾病リスク低減の表示とは、疾病リスクを低減する可能性のある飲食品の表示であって、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）の定める規格に基づいて、またはその規格を参考にして、定められた表示または認められた表示である。
　本発明の実施の形態において、飲食品および飲食品組成物には、必要に応じて、任意の成分を加えることができる。このような任意の成分としては、特段の制限はないが、通常、飲食品に配合される成分である甘味料、酸味料、野菜や果物や種実の汁やそのエキス、ビタミン、ミネラル、アミノ酸などの栄養素、乳酸菌（本発明の実施の形態に係る必須の乳酸菌を除く。）、ビフィズス菌、プロピオン酸菌などの有用な微生物やその発酵物、オリゴ糖などの機能性をもつ糖類、ローヤルゼリー、グルコサミン、アスタキサンチン、ポリフェノールなどの既存の機能性素材、香料、ｐＨ調整剤、賦形剤、酸味料、着色料、乳化剤、保存料等が挙げられる。
　＜ＤＮＡ保存用組成物の効率的な摂取方法およびその効果＞
　本発明の実施の形態に係るＤＮＡ保存用組成物は、多糖体の摂取量が２００μｇ以上／日となるように、少なくとも７日間、経口摂取することが好ましい。このＤＮＡ保存用組成物をこのように摂取することによって、ＤＮＡの損傷を有効に抑制することができると共に、ＤＮＡの損傷修復を有効に促進させることができる。
　なお、多糖体の摂取量は、人体に害を及ぼさない限り特に制限されないが、費用対効果を考慮すると、２００μｇ／日以上６００００μｇ／日以下の範囲内であることが好ましく、３００μｇ／日以上４５０００μｇ／日以下の範囲内であることがより好ましく、４００μｇ／日以上３００００μｇ／日以下の範囲内であることがさらに好ましく、５００μｇ／日以上１５０００μｇ／日以下の範囲内であることが特に好ましい（なお、「質量／日以上」の表記は「質量以上／日」の表記と同義であり、「質量／日以下」の表記は「質量以下／日」の表記と同義である。）。
　なお、上述の各有効成分の必要用量は、人体投与実験に基づくものであるが、動物実験（例えばマウス実験）における必要投与用量から食品安全委員会資料に基づく下式を用いて人体への必要投与用量に換算することもできる。
　（人体への必要投与用量（換算値））＝（動物への必要投与用量）×（女性体重下限値：４０ｋｇ）÷（安全係数：１００）
　＜実験例＞
　以下、実験例を示して本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実験例に限定されることはない。
　－実験例－
　本実験例では、紫外線の照射下における皮膚ＤＮＡ損傷および皮膚ＤＮＡ損傷修復に対する多糖体の影響を検証した。具体的には、ヘアレスマウスに紫外線を照射することによって皮膚のＤＮＡを損傷させ、この状態のヘアレスマウスに対する多糖体の影響を検証した。
　（１）ヨーグルトの調製
　１０質量％の脱脂粉乳を含む培地にラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ１２４７菌およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３０７８菌を接種した後、その培地を４３℃に保ちながら３時間発酵させた。このようにして得られたヨーグルトには、多糖体が１１０μｇ／ｇ含まれていた。
　なお、ヨーグルト中の多糖体の含有量は、フェノール硫酸法（Ｈｏｄｇｅら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，第１巻，第３３８頁（１９６２年））に従って測定した。具体的には以下の通りである。
　先ず、１０ｇのヨーグルトに１ｇのトリクロロ酢酸を加えてよく撹拌した。次に、そのトリクロロ酢酸添加ヨーグルトを１００００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件下で遠心分離処理した後、その上清を別のチューブに移した。次いで、その上清に２倍容量の９９．５％エタノールを加えてから、そのエタノール添加上清を冷凍庫で一晩放置したところ、チューブ中に沈殿物が生じていた。この沈殿物を１００００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件下で遠心分離処理した後、得られた沈殿物に超純水を３ｍＬ加えて多糖体抽出液とした。そして、５００μＬの多糖体抽出液に５００μＬのフェノール試薬（５％（ｗ/ｖ））を加えてその混合液を撹拌した後に、さらにその混合液に２．５ｍＬの濃硫酸を加えてその混合液を直ぐに１０秒間撹拌した。その後、その混合液を室温で２０分以上放置してから、分光光度計でその混合液の４９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、次の通りに対照液を調製してから、上述と同様にしてその対照液の４９０ｎｍの吸光度を測定した。５００μＬの標準グルコース溶液に５００μＬのフェノール試薬（５％（ｗ/ｖ））を加えてその混合液を撹拌した後に、さらにその混合液に２．５ｍＬの濃硫酸を加えてその混合液を直ぐに１０秒間撹拌した。その後、その混合液を室温で２０分以上放置した。
　（２）多糖体抽出物の調製
　ヨーグルトの一部を分取し、その上清に３倍量のエタノールを添加して冷凍保管した。その後、その上清を遠心分離処理したところ、沈殿物が得られた。そして、この沈殿物を凍結乾燥して多糖体抽出物を得た。なお、１１．３ｇのヨーグルト中に７０ｍｇの多糖体抽出物が含まれていた。
　（３）紫外線照射によるＤＮＡ損傷
　７２匹のヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ－１，雌，８週齢，日本エスエルシー株式会社）を４日間馴化させた後、それらのヘアレスマウスを８匹ずつの群（紫外線照射前水群、紫外線照射前ヨーグルト群、紫外線照射前多糖抽出物群、紫外線照射後２４時間水群、紫外線照射後２４時間ヨーグルト群、紫外線照射後２４時間多糖体抽出物群、紫外線照射後４８時間水群、紫外線照射後４８時間ヨーグルト群、紫外線照射後４８時間多糖体抽出物群）に分けて、各群のヘアレスマウスに水、ヨーグルトおよび多糖体抽出物（以下これらをまとめて「試料」と称することがある。）をそれぞれ皮膚採取の前日まで経口投与した。なお、ヨーグルトは１１．３ｇ／ｋｇ体重／日で投与し、多糖体抽出物群は７０ｍｇ／ｋｇ体重／日で投与した。そして、各試料投与開始から７日経過後に紫外線照射前水群、紫外線照射前ヨーグルト群、紫外線照射前多糖抽出物群のヘアレスマウスの背部皮膚をイソフルラン麻酔下採取した。また、各試料投与開始から７日経過後に残りの群のヘアレスマウスの背部に、０．４ｍＷ／ｃｍ２の照度で紫外線を５０秒間照射した（なお、紫外線照射装置として三共電気株式会社製のＧＬ２０ＳＥ（波長領域：２８０ｎｍから４００ｎｍ，ピーク波長：３０６ｎｍ）を用いた。このときの紫外線量は２０ｍＪ／ｃｍ２（＝０．４ｍＷ／ｃｍ２×５０秒）である。）。そして、この紫外線照射から２４時間経過時および７２時間経過時に各群のヘアレスマウスの背部皮膚をイソフルラン麻酔下採取した。なお、以下、説明の便宜上、水を投与したヘアレスマウス群（比較例に相当）を「コントロール群」と称し、ヨーグルトを１１．３ｇ／ｋｇ体重／日で経口投与したヘアレスマウス群（実施例に相当）を「ヨーグルト群」と称し、多糖体抽出物を７０ｍｇ／ｋｇ体重／日で経口投与したヘアレスマウス群（実施例に相当）を「多糖体抽出物群」と称する。
　（４）評価
　（４－１）紫外線によるＤＮＡ損傷の抑制効果の検証
　上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からｑｕａｇｅｎ　ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを採取して精製した。紫外線によるＤＮＡ損傷マーカーであるシクロブタンピリミジンダイマーの存在量をＥＬＩＳＡキット（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＣＰＤ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２，　コスモバイオ社製）を用いて測定した。なお、標準品として、孔牛胸腺のＤＮＡを０、２．５、５．０、７．５、１０Ｊ／ｍ２の紫外線量（紫外線波長は主に２５４ｎｍであった。）で照射したＤＮＡサンプル（ＵＶＣ-ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅｓ，コスモバイオ社製）を用いた。
　本実験例の結果は図１に示される通りであり、紫外線照射２４時間後のシクロブタンピリミジンダイマーの存在量はコントロール群に比べてヨーグルト群、多糖体抽出物群で有意に低くなった。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、紫外線照射による直接的なＤＮＡ損傷を抑制する効果が見られた。なお、図１中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
　（４－２）活性酸素によるＤＮＡ損傷の抑制効果の検証
　上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からｑｉａｇｅｎ　ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを採取して精製した。そして、ＤＮａｓｅ　Ｉ、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ　（８－ＯＨｄＧ　Ａｓｓａｙ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｓｅｔ，和光純薬工業社製）を用いてこのＤＮＡを分解した。その後、ＤＮＡ損傷マーカーである８－オキソ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）の存在量を定量した。
　なお、この定量には高速液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析計(４５００ＱＴＲＡＰ，サイエックス社製）を用いた。カラムとしてＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８（１．７μｍ，２．１ｍｍＸ１００ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。このとき、移動相Ａとして０．１％ギ酸水溶液を、移動相Ｂとして０．１％ギ酸メタノール溶液を用いた。そして、開始時の移動相の組成を移動相Ａ：１００％とし、その後５分後に移動相の組成が「移動相Ａ：５０％，移動相Ｂ：５０％」になるようにグラジエントしてから、移動相の組成を「移動相Ａ：１％，移動相Ｂ：９９％」にして１分間で保持し、さらに移動相の組成を移動相Ａ：１００％になるように切り替えて２分間保持した。ここで、高速液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析計における１試料の測定時間を８分間、移動相の流速を０．３ｍＬ／分、カラム温度を４０℃に設定し、エレクトロ・スプレー・イオン化を用いて、ポジティブモードで８－ＯＨｄＧを検出した。高速液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析計の分析変数を以下の通りに設定した。
　　　・Ｇａｓ１：８０ｐｓｉ
　　　・Ｇａｓ２：８０ｐｓｉ
　　　・ｉｏｎ　ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ（ＩＳ）：５５００Ｖ
　　　・ｔｕｒｂｏ　ｈｅａｔｅｒ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＴＥＭ）：５００℃
　　　・ｅｎｔｒａｎｃｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＥＰ）：１０Ｖ
　　　・ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＡＤ）：８ｐｓｉ
　　　・ｃｕｒｔａｉｎ　ｇａｓ（ＣＵＲ）：３０ｐｓｉ
　　　・ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＤＰ）：５５Ｖ
　　　・ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）：１８Ｖ
　　　・ｃｅｌｌ　ｅｘｉｔ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＣＸＰ）：７Ｖ
　本実験例の結果は図２に示される通りであり、いずれの時点においても、８－ＯＨｄＧの存在量はコントロール群に比べてヨーグルト群、多糖体抽出物群で有意に低くなった。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、活性酸素によるＤＮＡ損傷を抑制する効果が見られた。なお、図２中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
　（４－３）紫外線による活性酸素生成の抑制効果の検証
　上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡからＲｉｖｅｒｔＡｉｄ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。そして、ＡＢＩ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、そのｃＤＮＡおよび内在性遺伝子としてのＧＡＰＤＨからカタラーゼのｍＲＮＡの相対量を定量した。
　本実験例の結果は図３に示される通りであり、紫外線照射後２４時間後、７２時間後において抗酸化酵素であるカタラーゼのｍＲＮＡの相対量はコントロール群に比べてヨーグルト群および多糖体抽出物群で有意に増加した。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、紫外線照射による活性酸素の生成を抑制する効果が見られた。ヨーグルトおよび多糖体抽出物が紫外線照射による活性酸素の生成を抑制した結果、活性酸素により生成するＤＮＡ損傷８－ＯＨｄＧが低下したためであると考えられた。なお、図３中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
　（４－４）ＤＮＡ損傷修復促進効果の検証
　上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡからＲｉｖｅｒｔＡｉｄ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。そいｓて、ＡＢＩ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、そのｃＤＮＡおよび内在性遺伝子としてのＧＡＰＤＨからｘｅｒｏｄｅｒｍａ　ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　Ａ（ＸＰＡ）のｍＲＮＡの相対量を定量した。
　本実験例の結果は図４に示される通りであり、紫外線照射後２４時間後、７２時間後においてＤＮＡ修復たんぱく質であるＸＰＡのｍＲＮＡの相対量はコントロール群に比べてヨーグルト群および多糖体抽出物群で有意に増加した。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、紫外線照射や活性酸素により生じるＤＮＡ損傷の修復を促進する効果が見られた。なお、図４中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１６９７
ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１８１４

Claims (8)

  1. 　多糖体を含有する乳酸菌産生物を有効成分とするデオキシリボ核酸保存用組成物。
  2. 　前記乳酸菌産生物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）とストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）との組合せによって生成される
    請求項１に記載のデオキシリボ核酸保存用組成物。
  3. 　前記ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１８１４）であり、
    　前記ストレプトコッカス・サーモフィラスは、ストレプトコッカス・サーモフィラスＯＬＳ３０７８菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１６９７）である
    請求項２に記載のデオキシリボ核酸保存用組成物。
  4. 　多糖体を含有する乳酸菌産生物をデオキシリボ核酸保存用組成物として使用する方法。
  5. 　請求項１から４のいずれかに記載のデオキシリボ核酸保存用組成物を経口投与することによりデオキシリボ核酸を保存する方法（ただし、人を治療する行為を除く。）。
  6. 　デオキシリボ核酸保存用組成物としての使用のための、多糖体を含有する乳酸菌産生物。
  7. 　デオキシリボ核酸を保存するための組成物の製造のための、多糖体を含有する乳酸菌産生物の使用。
  8. 　多糖体を産生する乳酸菌に乳原料を供給してデオキシリボ核酸保存用組成物を製造する方法。
PCT/JP2017/025335 2016-07-19 2017-07-12 デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法 Ceased WO2018016393A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-141114 2016-07-19
JP2016141114A JP6849890B2 (ja) 2016-07-19 2016-07-19 デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018016393A1 true WO2018016393A1 (ja) 2018-01-25

Family

ID=60992045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/025335 Ceased WO2018016393A1 (ja) 2016-07-19 2017-07-12 デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6849890B2 (ja)
WO (1) WO2018016393A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020032100A1 (ja) * 2018-08-08 2020-02-13 株式会社明治 フィトケミカル吸収促進用組成物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57500830A (ja) * 1980-06-27 1982-05-13
WO2015137423A1 (ja) * 2014-03-14 2015-09-17 株式会社 明治 発酵乳を得るためのスタータ，低脂肪・無脂肪アイスクリーム様食品，及び低脂肪・無脂肪アイスクリーム様食品の製造方法
JP2016067248A (ja) * 2014-09-29 2016-05-09 長瀬産業株式会社 クコの実の乳酸菌発酵物、該発酵物を含む化粧品、飲食品、医薬品、並びにｄｎａ修復促進剤

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57500830A (ja) * 1980-06-27 1982-05-13
WO2015137423A1 (ja) * 2014-03-14 2015-09-17 株式会社 明治 発酵乳を得るためのスタータ，低脂肪・無脂肪アイスクリーム様食品，及び低脂肪・無脂肪アイスクリーム様食品の製造方法
JP2016067248A (ja) * 2014-09-29 2016-05-09 長瀬産業株式会社 クコの実の乳酸菌発酵物、該発酵物を含む化粧品、飲食品、医薬品、並びにｄｎａ修復促進剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAKUHEI ISAWA ET AL.: "Verifying the Ability of Yogurt Prepared with LB81 Lactic Acid Bacteria to Improve Skin Function", JOURNAL OF INTESTINAL MICROBIOLOGY, vol. 22, no. 1, 2008, pages 1 - 5, XP055423140, ISSN: 1343-0882 *
LIU, C.T. ET AL.: "Antiproliferative and anticytotoxic effects of cell fractions and exopolysaccharides from Lactobacillus casei 01", MUTAT RES, vol. 721, no. 2, 2011, pages 157 - 162, XP028369769, ISSN: 0027-5107 *
MORIFUJI, M. ET AL.: "Exopolysaccharides Isolated from Milk Fermented with Lactic Acid Bacteria Prevent Ultraviolet-Induced Skin Damage in Hairless Mice", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 18, no. 1, 13 January 2017 (2017-01-13), pages 1 - 11, XP055423149, ISSN: 1422-0067 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020032100A1 (ja) * 2018-08-08 2020-02-13 株式会社明治 フィトケミカル吸収促進用組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018012648A (ja) 2018-01-25
JP6849890B2 (ja) 2021-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5923238B2 (ja) 迷走神経活性化剤
JP5888701B2 (ja) 高タンパク質分解活性を有するラクトバチルス・ヘルベティカス菌
JP6923883B2 (ja) 栄養状態改善に使用するための組成物
EP1900285B1 (en) Fermented food containing bifidobacterium bacteria and method for producing the same
JP6894097B2 (ja) 腎性貧血改善用組成物
WO2008120221A1 (en) Yogurt related compositions containing polyphenols - resveratrol, fisetin and quercetin
CN109475583B (zh) 用于抑制红斑产生的组合物及其使用方法和制造方法、抑制红斑产生的方法、乳酸菌产物
Alhaj et al. Milk‐derived bioactive components from fermentation
JP6773562B2 (ja) スフィンゴ脂質吸収促進剤
KR20080077970A (ko) Ｇａｂａ가 함유된 발효물의 제조방법
JP7385572B2 (ja) フィトケミカル吸収促進用組成物
JPWO2018169027A1 (ja) フィトケミカル吸収促進剤
JP6849890B2 (ja) デオキシリボ核酸保存用組成物およびその製造方法、デオキシリボ核酸を保存する方法、乳酸菌産生物およびその使用方法
JP5950993B2 (ja) 迷走神経活性化剤
AU2017287987B2 (en) Cartilage regeneration facilitating composition
Bokadia et al. Unlocking the Health Potential of Goat Milk and Their Probiotic Products: A Review. 6
KR20170053793A (ko) 항산화 활성이 증가된 발효 인삼열매 추출물의 제조방법
JP6777911B2 (ja) 抗インフルエンザ薬による獲得免疫機能低下抑制用発酵乳およびその製造方法
Patel et al. Bioactive components of fermented foods
HK1262813B (en) Composition for inhibiting erythema, method of using same, method for preparing same, method for inhibiting erythema, and lactic acid bacteria product
HK1262813A1 (en) Composition for inhibiting erythema, method of using same, method for preparing same, method for inhibiting erythema, and lactic acid bacteria product
JP2017205039A (ja) 乳酸菌生残性向上剤
JP2017143799A (ja) 発酵乳飲食品
JPWO2016104665A1 (ja) ロリクリンの減少抑制・改善剤、トランスグルタミナーゼ３活性化剤および皮膚角層角化肥厚膜の形成促進・構造強化剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17830912

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17830912

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1