WO2018004237A1 - 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물 - Google Patents

트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물 Download PDF

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WO2018004237A1
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thrombin
stem cells
derived
exosome
exosomes
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장윤실
박원순
성동경
안소윤
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Definitions

  • the present invention in the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin wounds (Skin Wound), including a exosome derived from thrombin-treated stem cells as an active ingredient, pharmaceutical preparations containing the same, and a method for preparing the same It is about.
  • the skin is the body's primary defense against disease as a protective barrier to the body, and the epidermis provides a barrier to microbial invasion.
  • the primary objectives in the treatment of wounds, burns, abrasions and other damage to the skin are rapid closure and wound healing to prevent infection.
  • Wound healing is generally a complex process that involves three stages: inflammation, proliferation, and remodeling.
  • the first step involves clotting to achieve haemostasis, and supplementation of neutrophils to destroy bacteria and necrotic tissue, followed by supplementation of macrophages.
  • angiogenesis occurs, in which endothelial cells migrate to the wound site, and at the same time fibroblasts move to the wound site to help produce granulation tissue.
  • the formation of granulation tissue allows for re-epithelialization.
  • the level of collagen production and destruction is evened, and the wound healed is slowly changed to achieve maximum strength. Wound healing can be chronic or even delayed or damaged when one of the processes fails to function properly in a timely manner.
  • Chronic wounds are defined as open wounds that require more than 8 weeks of treatment, and the damaged healing process can often be associated with diabetes complications, with severe consequences such as high limb amputation and even death. This can be done. Approximately 15% of diabetics suffer from chronic wounds that do not heal. Therefore, wounds are an important issue not only for individuals but also for society, and early treatment should reduce the risk of secondary infection.
  • ECM extra-cellular matrix
  • stem cells are known to be involved in tissue regeneration, treatment, and immune response, as well as their multipotency, and by using such characteristics to separate and culture mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, bone marrow, etc. Efforts have been made to develop a treatment for the disease.
  • cell therapeutics cannot rule out the possibility of tumorogenicity due to DNA transfer, and secondly, stem cells themselves can cause vascular obstruction or myocardial infarction. Third, cord blood and Rejection reaction due to surface antigen when transplanted (allograft) using the same allogeneic cells is a problem. Fourth, in general, cell therapeutics are difficult to manufacture and have high storage costs due to the limitation of storage transport. There is a limit.
  • Exosomes are small vesicles (approximately 30-100 nm in diameter) that are secreted from a variety of cells, and within the cells called multivesicular bodies (MVBs), rather than falling directly off the plasma membrane in an electron microscope study. Originated from specific compartments and released and secreted out of cells was observed. In other words, when fusion occurs between the polycystic body and the plasma membrane, the vesicles are released into the extracellular environment, which is called an exosome. It is not clear what molecular mechanism these exosomes are made of, but not only red blood cells, but also various immune cells and tumor cells, including B-lymphocytes, T-lymphocytes, dendritic cells, platelets, macrophages, etc. Stem cells are also known to produce and secrete exosomes in living conditions.
  • exosomes derived from stem cells contain nuclear components as well as receptors and proteins are known to play an intercellular communication role.
  • the exosomes derived from the stem cells contain a relatively small amount of animal serum compared to the stem cells may also exclude the risk of symptoms (zoonosis) due to animal serum infection.
  • cell therapy using exosomes is expected to become a new paradigm that can overcome the limitations of existing stem cell therapy.
  • Korean Patent Publication No. 2012-0133709 discloses a skin regeneration effect of exosomes obtained from skin cells, but it is completely known that exosomes derived from thrombin-treated stem cells are superior to conventional skin wound treatment. There is no bar.
  • the present inventors have conducted extensive studies to improve the treatment efficacy while overcoming the limitations of the stem cell therapeutics with respect to skin wounds, and thus, exosomes derived from stem cells, especially exosomes derived from stem cells treated with thrombin.
  • the present invention was completed by confirming that this angiogenesis and skin wound healing effect was significantly increased.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin wounds, including an exosome derived from thrombin-treated stem cells as an active ingredient.
  • the stem cells are stem selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells and multipotent stem cells It is characterized by being a cell.
  • the mesenchymal stem cells are characterized in that derived from the umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membrane or placenta.
  • the treatment of the cutaneous wound is characterized by angiogenesis due to vascular endothelial cell growth promotion.
  • the skin wound is characterized by a defect in the epidermis, dermis or subcutaneous tissue.
  • the pharmaceutical composition is characterized by being administered orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it further comprises an auxiliary component selected from the group consisting of culture medium, cytokines, growth factors and genes.
  • the exosomes are characterized by increased expression of growth factors, immunoregulatory factors, antioxidant factors or angiogenesis factors.
  • the growth factor is a brain-derived neurotropic factor (BDNF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), nerve growth factor (NGF), or vascular endothelial growth (VEGF). factor).
  • BDNF brain-derived neurotropic factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth
  • the present invention also provides a pharmaceutical formulation for preventing or treating a skin wound, containing the composition.
  • the preparation is characterized in that the injection, injection, spray, liquid or patch form.
  • the preparation is characterized in that it further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides a quasi-drug preparation for improving skin wounds, comprising an exosome derived from thrombin-treated stem cells as an active ingredient.
  • the improvement of the skin wound is characterized in that by angiogenesis (angiogenesis).
  • the exosomes are characterized by increased expression of growth factors, immunoregulatory factors, antioxidant factors or angiogenesis factors.
  • the quasi-drug preparation is in the form of an external preparation for skin selected from the group consisting of liquids, ointments, creams, sprays, patches, gels and aerosols.
  • the present invention (a) treating the thrombin after stem cell culture; (b) separating the exosomes from the culture medium of step (a); And (c) preparing a composition containing the exosomes separated in step (b) as an active ingredient.
  • the thrombin of step (a) is characterized in that contained in the medium at a concentration of 1-1000 unit / ml.
  • the exosome of step (c) is characterized in that using centrifugation.
  • the centrifugation is characterized in that it is performed for 10 minutes to 5 hours at 5,000-500,000g.
  • the present invention also provides a method for treating a skin wound, comprising administering to a subject an exosome derived from a thrombin-treated stem cell.
  • the present invention also provides the use of exosomes derived from thrombin treated stem cells for use in the preparation of an agent for preventing or treating a skin wound.
  • the cell-free preparation does not contain DNA, there is no risk of carcinogenesis and there is no cell surface antigen, so there is no problem of rejection reaction.
  • the size is very small than the cell there is no fear of causing blockage in the microvascular system during systemic administration, it is possible to reduce the manufacturing cost because it is possible to develop the drug to off the shelf product as a non-cell separation material.
  • the exosome derived from the stem cells treated with thrombin is superior to the untreated stem cells, the effect of treating skin wounds is excellent even with a small amount, thereby significantly reducing the amount of stem cells required to generate a therapeutic dose of exosomes. There is an advantage that can significantly lower the cost of therapeutic production.
  • the present invention can significantly improve the therapeutic efficacy while solving the problems of the conventional stem cell therapeutics, it can be usefully used for the treatment of skin wounds.
  • FIG. 2 is a Western blot result confirming that exosome markers CD63 and CD9 are normally expressed in thrombin-treated stem cell-derived exosomes.
  • BDNF growth factors
  • FGF growth factor
  • HGF growth factor
  • NGF growth factor
  • VEGF anti-inflammatory cytokines
  • IL-6 anti-inflammatory cytokines
  • FIG. 4A is a result of a tube formation assay showing that exosomes derived from thrombin-treated stem cells exert a concentration-dependent angiogenic effect
  • FIG. 4B is a graph quantifying them.
  • FIG. 5A is a result of a tube formation assay showing a difference in angiogenic effects depending on the type of cell from which the exosome is derived
  • FIG. 5B is a graph quantifying it.
  • Figure 6a is a result showing the skin wound healing effect on exosomes derived from thrombin-treated stem cells in an in vivo skin wound animal model
  • Figure 6b is a graph quantifying it.
  • FIG. 7 shows fibroblast exosomes derived from fibroblasts, naive MSC exosomes derived from untreated thrombin stem cells, thrombin MSC exosomes derived from thrombin treated stem cells and hypoxia in an in vivo skin wound animal model. This is a result of comparing the healing effect of skin wounds of stem cell-derived exosomes (hypoxia MSC exosome).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin wounds, including an exosome derived from thrombin-treated stem cells as an active ingredient.
  • 'stem cell' refers to a cell having an ability to differentiate into two or more different types of cells while having an autologous ability as an undifferentiated cell.
  • Stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, may be from any type of animal, including humans and non-human mammals, and is not limited to whether the stem cells are derived from adults or embryos Do not.
  • Stem cells of the present invention include embryonic stem cells or adult stem cells, preferably adult stem cells.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells or multipotent stem cells, preferably mesenchymal stem cells, but is not limited thereto. It doesn't work.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amnion, and placenta, but is not limited thereto.
  • 'umbilical cord blood means blood collected from the umbilical vein connecting the placenta and the fetus.
  • Umbilical cord blood is a naturally occurring by-product of childbirth and is much easier to collect than normal mesenchymal tissue such as bone marrow, which requires multiple surgeries. It is also easy to get.
  • cord blood-derived cells do not express histocompatibility antigen HLA-DR (class II), which is the most important cause of rejection in tissue or organ transplantation, immunity such as rejection that has been a problem during conventional transplantation The reaction can be induced or minimized, so that not only autologous umbilical cord blood but also taga-derived cord blood can be used.
  • 'exosome' refers to a small (approximately 30-100 nm diameter) vesicle of membrane structure secreted from various cells, and the vesicle is released into the extracellular environment due to the fusion of the polycystic body and the plasma membrane. Means.
  • the exosomes are naturally secreted or include those secreted artificially.
  • skin wound is meant to include defects of the epidermis, dermis or subcutaneous tissue.
  • prevention or treatment of skin wounds is meant to include the reduction, alleviation and improvement of symptoms of skin wounds, and to include a lowering the possibility of skin wounds.
  • vascular endothelial cells HUVEC
  • Angiogenesis is a phenomenon in which endothelial cells of existing blood vessels decompose, move, divide, and differentiate extracellular matrix to form new capillaries, which are essential in the physiological process of wound healing. By doing so, the effect of wound healing can be verified. That is, angiogenesis must be involved in the necessary wound healing process for the rejuvenation of wounded skin tissue.
  • inflammatory reactions occur due to necrosis of cells and destruction of blood vessels. After this inflammatory response, kallikrein, thrombin, and plasmin, together with devascularization of blood components, activation of platelets and coagulation, The same biological media goes through a series of processes.
  • stem cell function / efficacy is increased due to an increase in paracrine property, which is the main mechanism of action of stem cells, without altering cell stability such as cell viability and oxidative function. Can be enhanced. Furthermore, due to thrombin treatment, as well as enhancing the therapeutic efficacy of exosomes derived from stem cells, it is possible to increase the secretion amount of exosomes.
  • the paracrine may be increased growth factor, immunoregulatory factor, antioxidant factor or regenerative factor
  • growth factor refers to a proteinaceous bioactive substance that promotes cell division, growth, or differentiation, and is referred to as BDNF (brain-derived).
  • BDNF brain-derived
  • neurotropic factor fibroblast growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IL-6 Interleukin-6
  • vascular endothelial growth factor is a representative protein that regulates angiogenesis.
  • VEGF binds to VEGF receptors 1, 2, or 3 (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3) present in vascular endothelial cells to induce tyrosine phosphorylation of VEGF receptors (VEGFR) resulting in activation of vascular endothelial cells. This will have a significant impact on.
  • compositions of the present invention can be administered to a subject in various ways without particular limitation, for example, orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more known auxiliary ingredients having a therapeutic effect on the skin wound together with the stem cell-derived exosomes.
  • genes that are effective in treating skin wounds eg, anti-inflammatory cytokine genes, siRNAs for inflammatory cytokines or anti-sense primers
  • Expression vectors eg, cytokines (eg, interleukin-10), growth factors (eg, keratinocyte growth factor) that provide autocrine or paracrine effects, and these At least one auxiliary ingredient selected from the group consisting of a combination may be further included.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention depend on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration and can be appropriately selected by those skilled in the art. Administration of the composition may be administered once a day, may be divided several times, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the treatment of skin wounds.
  • composition of the present invention may further comprise a suitable carrier commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • a suitable carrier commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • a preservative, a painless agent, a solubilizer, or a stabilizer may be further included, and in the case of a topical administration, a base, an excipient, a lubricant, or a preservative may be further included.
  • compositions of the present invention can be administered in a dosage form, formulated in a unit dosage form suitable for administration in the body of a subject according to conventional methods in the pharmaceutical art.
  • Formulations suitable for this purpose include parenteral injectables such as injectable ampoules, injectables such as infusion bags, sprays such as aerosol preparations and the like.
  • the injection ampoule may be mixed with the injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, Ringer's solution, etc. may be used as the injection solution.
  • the infusion bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene.
  • Administration in the present invention means providing the subject with the compositions of the present invention in any suitable manner.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention depend on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration and can be appropriately selected by those skilled in the art. Administration of the composition may be administered once a day, may be administered several times, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a quasi-drug preparation for improving skin wounds, comprising an exosome derived from thrombin-treated stem cells as an active ingredient.
  • the quasi-drug preparation may be in the form of an external preparation for skin selected from the group consisting of liquids, ointments, creams, sprays, patches, gels, and aerosols, and specifically, antiseptic cleaners, shower foams, gagrins, wipes, detergent soaps, and hands. It can be used as a wash, humidifier filler, mask, ointment or filter filler composition.
  • the present invention (a) treating the thrombin after stem cell culture; (b) separating the exosomes from the culture medium of step (a); And (c) preparing a composition containing the exosomes separated in step (b) as an active ingredient.
  • the thrombin treatment concentration is sufficient to enhance the efficacy of stem cells / exosomes, and there is no particular limitation, but is preferably included in the concentration of 1-1000 unit / ml in the medium.
  • centrifugation for example, in a culture medium, centrifugation, ultrafast centrifugation, filtration by filter, gel filtration chromatography, pre-flow electrophoresis, capillary electrophoresis, using a polymer Separation may be carried out using a method such as separation and a combination thereof, preferably centrifugation / supercentrifugation.
  • centrifugation / supercentrifugation is preferably performed at 4 ° C. and 3,000-100,000 g for 10 minutes to 5 hours.
  • the medium used for cell culture in the present invention is a cell such as stem cells in vitro containing elements essential for growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, minerals, and the like. Means a mixture for growth and propagation.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI1640 DMEM / F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10)
  • DMEM / F-12 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal Essential Medium
  • G-MEM Gasgow's Minimal Essential Medium
  • IMOC Isocove's Modified Dulbecco's Medium
  • KnockOut DMEM Commercially prepared media such as, but not limited to, artificially synthesized media, and the like.
  • the present invention also provides a method for treating a skin wound, comprising administering to a subject an exosome derived from a thrombin-treated stem cell.
  • ⁇ means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle, etc. Mean mammal.
  • Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (3 ⁇ 10 5 cells) were cultured in 100 mm culture dishes (orange scientific cat # 4450200) for 1 week after dispensing. After confirming that the cells were saturated and propagated in the culture dish, the cells were replaced with MEM alpha media in which 50 unit / ml thrombin (REYON Pharmaceutical. Co., LTD) was diluted and incubated for 6 hours. .
  • the culture solution was divided into centrifuge tubes, centrifuged at 4 ° C. and 6,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube to remove cell debris. Again, the supernatant was ultracentrifuged at 4 ° C., 100,000 rpm for 2-4 hours, and then the supernatant was further removed to obtain an exosome (final concentration: 15 ⁇ g / ml).
  • the expression of known exosome markers CD63 and CD9 was verified through Western blot.
  • the exosomes obtained from the thrombin-treated stem cells normally expressed CD63 and CD9, confirming that the exosomes.
  • Example 1-1 Exosome obtained in Example 1-1 was confirmed whether the expression of growth factors or anti-inflammatory cytokines such as IL-6 was increased by the thrombin treatment.
  • the proteins in the exosomes are separated and the amount of BDNF, FGF, HGF, NGF, VEGF, IL-6 in the exosomes is determined using the Procarta immunoassay kit ( affymatrix, USA).
  • BDNF brain-derived neurotropic factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • NGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IL-6 Interleukin-6 expression was increased compared to exosomes (control, normal) obtained from the thrombin untreated stem cells.
  • thrombin treatment enhances cell regeneration, vascular regeneration, and anti-inflammatory efficacy of stem cell-derived exosomes.
  • human umbilical vein endothelial cells were cultured in Medium 200PRF medium containing Low Serum Growth Supplement (LSGS) for 12 hours, then collected by trypsin treatment, and containing 5% fetal calf serum. Resuspended in M199 medium. Growth factor reduction Matrigel was aliquoted into 250 ⁇ l each in 24 cell culture wells and polymerized in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • LSGS Low Serum Growth Supplement
  • HUVEC cells were placed in wells with polymerized matrigel at a concentration of 4 ⁇ 10 4 cells per well, and 2.5 ug / ml, 5 ug / ml, 10 of the 'exosomes derived from thrombin-treated stem cells' obtained in Example 1 were obtained. ug / ml concentration was added. After incubation in a 37 ° C. CO 2 incubator for 24 hours, the culture was photographed ( ⁇ 40) and the length of the formed tube was measured using the Image J (National Institute of Health) open program.
  • 'exosomes derived from thrombin-treated stem cells' of the present invention induces differentiation of dose-dependent vascular endothelial cells as compared to the control group (untreated group NC) Increased tube formation.
  • exosomes derived from untreated thrombin (MSC ECV)
  • exosomes derived from thrombin treated stem cells (MSC throm ECV)
  • fibroblast ECV exosomes derived from untreated thrombin
  • exosomes derived from thrombin treated fibroblast Experiments were carried out in the same manner as in Example 2-1, except that (fibroblast throm ECV) was each treated at a concentration of 10 ug / ml.
  • exosomes obtained from the thrombin-treated stem cells of the present invention, significantly improved angiogenesis compared to exosomes (MSC ECV) obtained from thrombin untreated stem cells Showed ability.
  • the exosomes obtained from fibroblast did not exhibit any angiogenic capacity regardless of the presence or absence of thrombin treatment, and thus the specific therapeutic efficacy according to the type / capacity of the cells from which the exosomes are derived (angiogenic capacity). It can be seen that this is determined.
  • a skin model was prepared by punching the skin with a 0.8 mm biopsy punch on the back of an adult rat, and then fibroblast-derived exosomes (fibroblast exosomes), thrombin-untreated stem cells-derived exosomes (naive MSC exosomes), Thrombin-treated stem cell-derived exosomes (thrombin MSC exosomes) were each mixed with 20 ug of saline, prepared in a total of 10 ul, and then applied to the wound surface.
  • fibroblast exosomes fibroblast exosomes
  • thrombin-untreated stem cells-derived exosomes thrombin-untreated stem cells-derived exosomes
  • thrombin MSC exosomes Thrombin-treated stem cell-derived exosomes
  • the exosome (thrombin MSC exosome) obtained from the thrombin-treated stem cells of the present invention the wound significantly improved compared to the exosome (naive MSC exosome) obtained from the thrombin untreated stem cells It showed a therapeutic effect.
  • the exosomes obtained from the fibroblast was found to exhibit no wound healing effect similar to the control (saline).
  • the wound control group which was damaged by punch biopsy of the skin as compared to the normal group, showed no recovery to normal skin tissue.
  • the wound control group which was damaged by punch biopsy of the skin as compared to the normal group, showed no recovery to normal skin tissue.
  • the thrombin-treated stem cell-derived exosomes (naive MSC exosome) and hypoxia pretreated stem cell-derived exosomes (hypoxia MSC exosome) showed a tendency to improve somewhat
  • thrombin-treated stem cell-derived exosomes thrombin MSC exosome
  • the therapeutic efficacy is specifically determined according to the type / capacity of the cell from which the exosome is derived.
  • the stem cell-derived exosome-based therapeutic agent treated with the thrombin according to the present invention, it is possible to remarkably improve the treatment efficacy while solving problems such as transplant rejection reaction or manufacturing cost, which is a problem of conventional stem cell therapeutics, It can be usefully used for treatment.

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Abstract

본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 이를 함유하는 약학 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀 기반 치료제에 의하면, cell-free 제제이기 때문에 발암의 위험성이 적고 이식거부 반응의 문제가 없을 뿐만 아니라, 전신 투여시 미세혈관에 폐색을 일으킬 우려가 없으며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있고, 트롬빈 처리 효과에 의해 낮은 농도의 엑소좀으로도 혈관신생 및 피부상처 치료 효과가 우수하다는 장점이 있다.

Description

트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처(Skin Wound)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 이를 함유하는 약학 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
피부는 신체를 보호하는 방어막 역할로서 질환에 대한 신체의 1차 방어선이며, 표피(epidermis)가 미생물 침입에 대한 장벽을 제공한다. 따라서 상처, 화상, 찰과상 및 피부에 대한 기타 손상의 치료에서 일차적인 목적은 감염을 예방하기 위한 신속한 봉합(closure) 및 상처 치유이다.
이때, 상처 치유는 일반적으로, 염증(inflammation), 증식(proliferation) 및 재형성(remodelling)의 3가지 단계를 수반하는 복잡한 과정이다. 첫 번째 단계는 지혈(haemostasis)을 달성하기 위한 응고(clotting), 그리고 세균 및 괴사 조직을 파괴하기 위한 호중구의 보충, 그 이후에 대식세포의 보충을 수반한다. 두 번째 단계 동안, 혈관신생(angiogenesis)이 발생하고, 이때 내피세포가 상처 부위로 이동하고, 이와 동시에 섬유아세포가 상처 부위로 이동하여 육아 조직(granulation tissue)을 생산하는데 도움을 준다. 육아 조직의 형성은 재상피화(reepithelialisation)가 일어날 수 있도록 한다. 최종 단계 동안, 콜라겐 생산과 파괴의 수준이 균등해지고, 치유된 상처는 최대 강도를 달성하기 위하여 천천히 변경된다. 상처 치유는 상기 과정 중에서 한가지라도 시기적절하게 제대로 기능하지 않을 때, 지연되거나 손상되므로 만성적인 상태까지 달할 수 있다.
만성 상처(chronic wound)는 8주 이상의 치료가 요구되는 피부가 열린 상처(open wound)로 정의되며, 손상된 치유 과정은 종종 당뇨병 합병증과 연관될 수 있는데 높은 사지 절단율과 심지어 사망 등의 심각한 결과에 이를 수 있다. 대략, 15%의 당뇨병 환자들이 치유되지 않는 만성 상처로 고통받고 있다. 따라서, 상처는 개인뿐만 아니라 사회적으로도 중요한 이슈이며, 초기에 조속히 치료해야 2차 감염의 위험을 줄일 수 있다.
효과적인 상처 치료는 세포외 매트릭스(extra-cellular matrix, ECM) 증착, 세포 증식/이동을 포함하는 복잡한 분자생물학적 이벤트를 통한 매우 조직화된 통합 조정을 필요로 한다. 만성 상처의 발생과 관련된 주요 인자 중 하나는 로컬 섬유아세포(local fibroblasts) 및 염증 세포(inflammatory cells)에 의해 분비되는 사이토카인 분비 계통의 손상이며, 이는 혈관형성(angiogenesis)의 감소를 유발시킨다.
한편, 줄기세포는 그 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등로부터 중간엽 줄기세포를 분리배양하여 다양한 질환, 증상에 대한 치료제로 개발하고자 하는 노력이 있어왔다.
그러나, 이러한 줄기세포 자체를 이용한 치료법은 다음과 같은 한계와 부작용의 문제가 있어 왔다.
첫째, 기본적으로 세포 치료제는 DNA transfer로 인한 발암(tumorogenicity) 가능성을 배제할 수 없고, 둘째, 줄기세포 자체의 큰 사이즈로 인하여 혈관 폐색(vascular obstruction)이나 심근경색을 유발할 수 있으며, 세째, 제대혈과 같은 동종세포를 사용하여 이식시(동종이식) 세포 표면항원(surface antigen)으로 인한 거부반응의 문제가 있으며, 네째, 일반적으로 세포 치료제는 제조공정이 까다롭고 보관운송에 제약이 많아 생산비용이 높다는 한계가 있다.
이와 같이, 줄기세포가 갖고 있는 원천적 한계로 인하여, 부작용을 줄이면서도 치료효과를 증진시키기 위한 방안들로서 유전자 조작을 이용한 효능개선 방법이 개발된 바 있으나, 현재까지 뚜렷한 대안은 없는 실정이다.
엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭(대략 30-100 nm의 직경)으로서, 전자현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 한다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다.
특히, 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다. 이러한 엑소좀의 특성을 고려할 때 엑소좀을 이용한 세포치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임이 될 것으로 기대된다.
이와 관련하여, 한국공개특허 제2012-0133709호에는 피부세포로부터 획득한 엑소좀의 피부 재생 효과가 개시되어 있으나, 트롬빈 처리된 줄기세포 유래의 엑소좀이 기존보다 피부 상처 치료에 우수하다는 것은 전혀 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 피부상처와 관련하여, 줄기세포 치료제가 갖는 제약을 극복하면서도 치료 효능을 개선시키기 위해 예의 연구한 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀, 특히 트롬빈으로 처리한 줄기세포에서 유래된 엑소좀이 혈관신생 및 피부상처 치유효과가 현저하게 증가한다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 트롬빈으로 처리한 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 피부상처의 치료는 혈관내피세포 성장촉진으로 인한 혈관신생(angiogenesis)에 의한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 피부상처는 표피, 진피 또는 피하조직의 결손에 의한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 엑소좀은 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 혈관신생인자의 발현이 증가되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 성장인자는 BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 함유하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처 개선용 의약외품 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 피부상처의 개선은 혈관신생(angiogenesis)에 의한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 엑소좀은 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 혈관신생인자의 발현이 증가되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 의약외품 제제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제 및 에어로졸제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 트롬빈은 배지 내에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)의 엑소좀은 원심분리를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 원심분리는 5,000-500,000g에서 10분 내지 5시간 동안 행해지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부상처 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부상처를 예방 또는 치료하는 제제를 제조하는데 사용되는 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)의 용도를 제공한다.
본 발명의 엑소좀 기반 치료제에 의하면, cell-free 제제이기 때문에 DNA가 포함되지 않아 발암의 위험성이 적고 세포 표면항원이 없어 이식거부 반응의 문제가 없다.
또한, 세포보다 size가 매우 작기 때문에 전신 투여시 미세혈관에 폐색을 일으킬 우려가 없으며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있다.
또한, 비처리 줄기세포에 비하여 트롬빈으로 처리한 줄기세포에서 유래된 엑소좀이 적은 양으로도 피부상처 치료 효과가 우수하므로, 치료적 용량의 엑소좀을 생성하기 위한 줄기세포의 요구량을 현저히 감소시켜 치료제 생산 비용을 현저하게 낮출 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명에 의하면 종래 줄기세포 치료제가 갖는 문제를 해결하면서도 치료 효능을 현저히 개선할 수 있는 바, 피부상처의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은, 줄기세포에 트롬빈 처리시 엑소좀의 분비가 활성화되는 과정을 TEM 이미지 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 2는, 트롬빈 처리된 줄기세포 유래의 엑소좀에서 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9가 정상적으로 발현되는지를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3은, 트롬빈 처리에 의해 엑소좀 내 성장인자(BDNF, FGF, HGF, NGF, VEGF), 항염증 사이토카인(IL-6) 등의 발현이 증가됨을 보여주는 면역분석 결과이다.
도 4a는, 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀이 농도 의존적으로 혈관신생효과를 발휘함을 보여주는 관 형성 어세이(tube formation assay) 결과이고, 도 4b는 이를 정량화한 그래프이다.
도 5a는, 엑소좀이 유래되는 세포의 종류에 따라 혈관신생효과에 차이가 남을 보여주는 관 형성 어세이(tube formation assay) 결과이고, 도 5b는 이를 정량화한 그래프이다.
도 6a는, in vivo 피부상처 동물모델에서 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 피부상처 치유효과를 보여주는 결과이고, 도 6b는 이를 정량화한 그래프이다.
도 7은 in vivo 피부상처 동물모델에서 fibroblast 유래의 엑소좀(fibroblast exosome), 트롬빈 미처리 줄기세포 유래의 엑소좀(naive MSC exosome), 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀(thrombin MSC exosome) 및 hypoxia 전처리 줄기세포 유래의 엑소좀(hypoxia MSC exosome)의 피부상처 치유효과를 비교한 결과이다.
본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 '제대혈'은 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 의미한다. 제대혈은 출산 시 자연적으로 발생하는 부산물로서, 여러 차례의 수술을 필요로 하는 골수 등의 일반 간엽조직보다 훨씬 채취가 용이하고, 골수 이식에 비해 제대혈 보관산업이 활성화되어 이미 인프라가 구축되어 있으므로 공여자를 구하는 것도 용이하다. 이와 더불어, 제대혈 유래 세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR(class II)이 발현되지 않는 세포이므로, 기존의 이식수술시 문제가 되었던 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어, 자가유래 제대혈은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할 수 있다.
본 발명에서 '엑소좀(exosome)'이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은(대략 30-100 nm의 직경) 소낭을 의미하며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다.
본 발명에서, '피부상처'란, 표피, 진피 또는 피하조직의 결손을 포함하는 의미이다.
본 발명에서, '피부상처의 예방 또는 치료'란, 피부상처의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 피부상처가 생길 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다. 본 발명에서는 혈관내피세포(HUVEC)에 본 발명의 '트롬빈(thrombin) 처리된 줄기세포'를 처리한 결과, 혈관내피세포의 성장이 촉진되어 혈관이 신생됨을 확인하였다.
혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관의 내피세포가 세포외 기질을 분해하고, 이동, 분열 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상으로서, 상처치유의 생리적 과정에서 필수적으로 나타나는바, 혈관신생 효과를 확인함으로써 상처치유 효과를 검증할 수 있다. 즉, 혈관신생은 상처받은 피부 조직이 재생되기 위한 필수적인 상처 회복 과정에 반드시 수반되어야 한다. 상처의 초기 단계에는 세포의 괴사와 혈관의 파괴로 인한 염증반응이 일어나게 되고, 이 염증 반응 이후에 혈액성분의 탈혈관 현상, 혈소판의 활성화 및 혈액응고와 함께, 칼리크레인, 트롬빈, 및 플라스민 등과 같은 생물학적 매개물질이 형성되는 일련의 과정을 거치게 된다.
본 발명에서, '트롬빈(thrombin) 처리된 줄기세포'는 비처리 줄기세포에 비하여 cell viability, oxidative function 등 세포 안정성에는 변화없이 줄기세포의 주된 작용기전인 paracrine property의 증가로 인하여 줄기세포 기능/효능이 강화될 수 있다. 나아가 트롬빈 처리로 인하여, 줄기세포에서 유래된 엑소좀의 치료 효능을 강화시킬 뿐만 아니라, 엑소좀의 분비량을 증가시킬 수 있다.
이때, paracrine으로는 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 재생인자가 증가될 수 있으며, 성장인자는 세포 분열이나 생장, 분화를 촉진하는 단백질성의 생리활성물질을 의미하는 것으로, BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), IL-6(Interleukin-6) 등을 포함할 수 있다. 특히, 혈관내피세포성장인자(VEGF)는 혈관형성을 조절하는 대표적인 단백질이다. VEGF는 혈관내피세포에 존재하는 VEGF 수용체 1, 2, 또는 3(VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3)과 결합하여 VEGF 수용체(VEGFR)의 타이로신 인산화를 유도하여 혈관내피세포의 활성화를 가져오며, 결국 혈관신생과정에 중요한 영향을 미치게 된다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 특별한 제한없이 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구 또는 비경구 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 함께 피부상처의 치료 효과를 갖는 공지의 보조성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 예를 들면, 피부상처 치료에 효과적인 유전자[예컨대, 항-염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine) 유전자, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)에 대한 siRNA 또는 안티-센스 프라이머(antisense primer)] 또는 이를 포함하는 발현벡터, 자가분비(autocrine) 또는 측분비(paracrine) 효과를 제공하는 사이토카인[예컨대, 인터루킨 (interleukin)-10], 성장인자[예컨대, 케라틴 형성 세포 성장인자(Keratinocyte growth factor)], 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 보조성분을 하나 이상 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 피부상처의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처 개선용 의약외품 제제를 제공한다.
본 발명에서 의약외품 제제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제 및 에어로졸제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태일 수 있으며, 구체적으로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 트롬빈 처리 농도는 줄기세포/엑소좀의 효능을 강화시키는 데 적합한 농도이면 족하고 특별한 제한은 없으나, 배지에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 엑소좀을 분리하는 방법에는 제한이 없으며, 예를 들면 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 폴리머를 이용한 분리 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리/초원심분리이다. 이때, 원심분리/초원심분리는, 4℃, 3,000-100,000g에서 10분 내지 5시간 동안 행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부상처 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 줄기세포에 트롬빈 처리에 의한 엑소좀 분비 및 효능증강 유도
1-1. 트롬빈에 의한 엑소좀 분비 유도
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(3×105개)를 100 mm 배양접시(orange scientific cat# 4450200)에 분주 후 1주일간 배양하였다. 배양접시에 세포가 포화 증식된 것을 확인한 후, 50 unit/ml 트롬빈(REYON Pharmaceutical.Co.,LTD)이 희석되어 있는 혈청프리-배양배지(MEM alpha media)로 교체하고, 다시 6시간 동안 배양하였다.
이때, 트롬빈 처리에 의해 중간엽 줄기세포에서 엑소좀의 분비가 활성화되는지 확인하기 위하여 엑소좀의 분비 과정을 TEM(Transmission Electronic Microscopy) 이미지를 통해 확인하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 트롬빈에 의한 자극이 엑소좀의 분비를 유도함을 알 수 있었다.
이후, 상기 배양액을 원심분리 튜브에 나누어 담아 4℃, 6,000 rpm에서 30분간 원심분리하였으며, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 잔여물(debris)을 제거하였다. 다시, 상기 상층액을 4℃, 100,000 rpm에서 2-4시간 동안 초원심분리한 후, 상층액을 더욱 제거하여 엑소좀을 수득하였다(최종 농도: 15 μg/ml).
이때, 수득한 산물이 엑소좀이 맞는지 확인하기 위하여, 공지의 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9(System Bioscience, Mountain View, CA, USA)의 발현을 웨스턴 블랏을 통하여 검증하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 수득한 엑소좀은 정상적으로 CD63 및 CD9를 발현하고 있었는바, 엑소좀임을 컨펌하였다.
1-2. 트롬빈에 의한 엑소좀 효능 증강
상기 실시예 1-1에서 수득한 엑소좀이 트롬빈 처리에 의하여 성장인자나 IL-6와 같은 항염증 사이토카인 등의 발현이 증가되었는지 확인하였다.
구체적으로는, 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 상기 엑소좀 막을 용해한 후, 엑소좀 내의 단백질을 분리하여 엑소좀 내 BDNF, FGF, HGF, NGF, VEGF, IL-6의 양을 Procarta immunoassay kit(affymatrix, 미국)로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리에 의해 엑소좀 내 BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), IL-6(Interleukin-6)의 발현이, 트롬빈 비처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(대조군, normal)에 비하여 증가되었음을 확인하였다.
이러한 결과는 트롬빈 처리에 의해 줄기세포 유래 엑소좀의 세포재생, 혈관재생, 항염증 효능이 증강됨을 의미하는 것이다.
실시예 2. in vitro 혈관신생 효과: 관 형성 어세이(tube formation assay)
2-1. 엑소좀 농도에 따른 효과
본 발명의 '트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀'이 혈관내피세포의 분화를 유도하여 관 형성(혈관신생)에 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위해 성장 인자 감소 마트리젤(Growth factor-reduced Matrigal, 10㎎/㎖)을 이용한 관 형성 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 인간 제대 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells; HUVECs)를 Low Serum Growth Supplement (LSGS) 포함된 Medium 200PRF 배지에서 12시간 동안 배양한 후 트립신을 처리하여 모으고 5% 우태아 혈청이 함유된 M199 배지에 재현탁하였다. 성장 인자 감소 마트리젤을 24 세포 배양 웰에 250㎕ 씩 각각 분주하고 37℃ CO2 배양기에서 중합화하였다. HUVEC 세포는 중합화된 마트리젤이 있는 웰에 웰당 4 × 104 cells의 농도로 넣고, 실시예 1에서 얻은 '트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀'을 2.5 ug/ml, 5 ug/ml, 10 ug/ml 농도별로 첨가하였다. 24시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양한 후 배양물을 사진으로 찍고(× 40), Image J (National Institute of Health) 공개 프로그램을 이용하여 형성된 튜브의 길이를 측정하였다.
그 결과, 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 '트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀'은 대조군(미처리군 NC)에 비하여 농도 의존적으로(dose-dependent) 혈관내피세포의 분화를 유도함으로서 관 형성을 증가시켰다.
2-2. 엑소좀 유래 세포별 평가
HUVEC 세포에, 트롬빈 미처리 줄기세포 유래의 엑소좀(MSC ECV), 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀(MSC throm ECV), 트롬빈 미처리 fibroblast 유래의 엑소좀(fibroblast ECV), 트롬빈 처리 fibroblast 유래의 엑소좀(fibroblast throm ECV)을 각각 10 ug/ml 농도로 처리한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 트롬빈 처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(MSC throm ECV)은, 트롬빈 미처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(MSC ECV)에 비하여 현저히 향상된 혈관생성능력을 보였다. 뿐만 아니라, fibroblast에서 수득한 엑소좀은 트롬빈 처리 유무에 관계없이 혈관생성능력을 전혀 발휘하지 못하였는바, 엑소좀이 유래되는 세포의 종류/능력에 따라 특이적으로 치료적 효능(혈관생성능력)이 결정됨을 알 수 있다.
실시예 3. in vivo 피부상처 치료 효과
모든 동물실험은 삼성생명과학연구소 실험동물위원회(Research Animal Laboratory Committee of Samsung Biomedical Research Institute, 대한민국)에 의해 승인을 받았고 기관의 가이드라인을 따랐다.
먼저, adult rat의 등부분에 0.8mm biopsy punch로 피부를 펀칭하여 피부상처 동물모델을 제작한 후, fibroblast 유래의 엑소좀(fibroblast exosome), 트롬빈 미처리 줄기세포 유래의 엑소좀(naive MSC exosome), 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀(thrombin MSC exosome) 각각을 20ug씩 생리식염수(saline)에 혼합하여 총 10ul의 제제로 제조한 후, 상처 표면에 도포하였다.
그 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 트롬빈 처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(thrombin MSC exosome)은, 트롬빈 미처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(naive MSC exosome)에 비하여 현저히 향상된 상처 치료 효과를 보였다. 뿐만 아니라, fibroblast에서 수득한 엑소좀은 대조군(saline)과 유사하게 상처 치료 효과를 전혀 발휘하지 못함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, SD-rat의 등 부위에 제모를 시행한 이후 punch biopsy로 손상을 유도한 후, fibroblast 유래의 엑소좀(fibroblast exosome), 트롬빈 미처리 줄기세포 유래의 엑소좀(naive MSC exosome), 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀(thrombin MSC exosome) 및 hypoxia 전처리 줄기세포 유래의 엑소좀(hypoxia MSC exosome) 각각을 도포한 후, 피부 회복 상태를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군(Normal)에 비하여 피부를 punch biopsy하여 손상을 준 wound control 군(WC)에서는 정상 피부 조직으로 회복되지 못한 소견을 보였고, 이는 fibroblast 유래의 엑소좀을 투여할 때도 동일한 소견을 나타내었다. 반면, 트롬빈 미처리 줄기세포 유래의 엑소좀(naive MSC exosome)과 hypoxia 전처리 줄기세포 유래의 엑소좀(hypoxia MSC exosome)에서는 다소 호전되는 경향을 나타내었고, 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀(thrombin MSC exosome)에서는 정상 조직에 가까운 피부 회복 상태를 나타내어 현저히 향상된 상처 치료 효과를 보임을 확인하였다.
상기 결과들로부터, 엑소좀이 유래되는 세포의 종류/능력에 따라 특이적으로 치료적 효능이 결정됨을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 트롬빈으로 처리한 줄기세포 유래 엑소좀 기반 치료제에 의하면, 종래 줄기세포 치료제가 갖는 문제인 이식거부 반응이나 제조단가 등의 문제를 해결하면서도 치료 효능을 현저히 개선할 수 있는바, 피부상처의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (18)

  1. 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 피부상처의 치료는 혈관내피세포 성장촉진으로 인한 혈관신생(angiogenesis)에 의한 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 엑소좀은 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 혈관신생인자의 발현이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 성장인자는 BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제 1 항의 조성물을 함유하는, 피부상처의 예방 또는 치료용 약학 제제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
  10. 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 피부상처 개선용 의약외품 제제.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 피부상처의 개선은 혈관신생(angiogenesis)에 의한 것임을 특징으로 하는, 의약외품 제제.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 엑소좀은 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 혈관신생인자의 발현이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 의약외품 제제.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 의약외품 제제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제 및 에어로졸제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태인 것을 특징으로 하는, 의약외품 제제.
  14. 하기의 단계를 포함하는, 제 1 항의 약학적 조성물의 제조방법:
    (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 트롬빈은 배지내에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 엑소좀은 원심분리를 3,000-100,000g에서 10분 내지 5시간 행함으로써 분리하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  17. 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부상처 치료방법.
  18. 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)의 피부상처 예방 또는 치료 용도.
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