WO2017222302A1 - 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 포함하는 운동 수행 능력 개선 및 골다공증 치료용 조성물 - Google Patents

비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 포함하는 운동 수행 능력 개선 및 골다공증 치료용 조성물 Download PDF

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving exercise performance and treating osteoporosis, which includes a non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • Alginic acid is a seaweed polysaccharide that fills between the cell membranes of brown algae such as seaweed, Ecklonia cava, Taehwang, paddles and shellfish.
  • Alginic acid has two types of uronic acid, bD-mannuronic acid (M) and aL-guluronic acid (G), which bind 1,4-glycosidic bonds at various ratios. It is a heteropolysaccharide and has a good dietary fiber function.
  • Alginic acid has acid carboxyl group (-COOH) in its molecule.
  • the content of alginic acid by algae varies depending on the type, place, season, and region, but alginate is composed of 16-34% of the dry weight of brown algae harvested in summer.
  • Alginic acid is used as a food additive, and about 30% of the total consumption is used only as an edible processed product, so the value added is low. It is used in the pharmaceutical industry as a linear agent of tablets, and there are no known side effects as a drug. Therefore, the development of pharmaceutical raw materials through the low molecular weight of alginic acid can double the value.
  • alginic acid oligosaccharides For the production of industrially available alginic acid oligosaccharides, there are firstly a method of softening by high temperature, high pressure or radiation, and secondly, a production method using acid and alkali treatment, and a third, enzymatic production method using alginate degrading enzyme.
  • Alginate lyase an alginate lyase, breaks down the b-1,4-glycosidic bonds of alginic acid to produce products with 4,5-unsaturated non-reducing ends.
  • Alginic acid oligosaccharide is a multifunctional material and treatment of alginic acid oligosaccharide (3 mg / ml) on HepG2 cells promotes the absorption of LDL-cholesterol through the lipoprotein receptor (LDLR) (Yang et al ., 2015), and egg white albumin (ovalbumin). Asthma-induced asthma-inhibiting effects of alginate oligosaccharides have been reported in animal models that induce asthma (Bang et al ., 2015).
  • LDLR lipoprotein receptor
  • ovalbumin egg white albumin
  • gluronic acid oligosaccharides was determined by using 2-DE method, and protein body analysis showed that antioxidant, pro-inflammatory and anti-inflammatory functions were confirmed through NF-kB signal ( Xu Xu et al . 2015).
  • Alginate oligosaccharides with chromium complex have been reported to promote AMPK phosphorylation and insulin sensitization effect in C2C12 skeletal muscle cells, and to observe the pharmacokinetics of alginic acid oligosaccharides as a functional material.
  • alginate oligosaccharides in blood and urine over time after oral administration of alginic acid oligosaccharides to 5 week-old rats, and up to 2 hours in plasma and up to 6 hours in urine. As a result, it was confirmed that alginic acid oligosaccharides were absorbed in the intestine and then discharged into the urine through blood circulation (Nishikawa T et al ., 2008). Therefore, alginic acid oligosaccharides based on the above functionalities are excellent in use value as a material for ergogenic aid (ergogenic aid).
  • ergogenic aids a performance aid.
  • nutritional ergogenic aid is mainly composed of vitamins, carnitine, caffeine, antioxidants, and red ginseng, Cordyceps sinensis, prickly pear, plum, etc. among herbal medicines.
  • ergogenic aid a nutritional supplement, can help the athlete's performance, there are various side effects due to misuse and many of the ingredients are designated as prohibited drugs, making it difficult to apply in training. .
  • ergogenic aids have the function of regulating the physiology associated with dehydration, supplementation of energy supply, energy metabolism or body waste removal.
  • Caffeine is one of the most widely used drugs in the world. It is contained in coffee, tea, etc., and is involved in fat metabolism when ingested.
  • caffeine inhibits the activity of phosphodiesterase, a cAMP degrading enzyme, in the fat cells. Increasing the concentration of cAMP breaks down storage fat through phosphorylation of AMPK protein. As a result, it increases the mobilization of free fatty acids in the blood during exercise, thereby suppressing glycogen loss in the liver and muscles.
  • caffeine acts as a central nerve stimulant, which can cause headache anxiety and nervousness in sensitive people. Diuretic effects of body dehydration occur during long hours of exercise at high temperatures.
  • Bone remodeling is achieved by balancing bone formation in osteoblasts and bone resorption in osteoclasts. As age increases, bone loss increases compared to bone production, and thus, continuous bone loss causes osteoporosis.
  • most studies attempting to verify the efficacy of drugs on osteoporosis use healthy, young laboratory animals, and studies using old laboratory animals considering the causative factors are very rare. There may be differences between the efficacy.
  • PGC-1a acts as a regulator of ERRa.
  • PGC-1a activates the transcription factor ERRa to increase the expression of DNA-encoded mitochondrial proteins in the nucleus. These proteins serve to increase the cloning and expression of the mtDNA increase the mitochondrial sex Bio Genesis (Lloye M. Dillon. Et al. , 2012).
  • Intestinal ecosystems begin to inhabit microorganisms at birth, balancing beneficial and harmful bacteria, forming intestinal flora, interacting with humans, and directly or indirectly affecting human health.
  • endocrine cells are influenced by the balance of intestinal microflora, affecting immune and neuronal cells in the host through hormone release.
  • intestinal flora is imbalanced, and intestinal microorganisms cause bone-related periodontitis, arthritis, and osteoporosis (Schogor ALB. Et al. , 2014).
  • intestinal microorganisms regulate the bone mass in mice, which may affect bone resorption controlled by osteoclasts.
  • Non-Patent Document 1 Yang JH et al . Alginate oligosaccharide enhances LDL uptake via regulation of LDLR and PCSK9 expression. J Nutr Biochem . (2015) 1393-400
  • Non-Patent Document 2 MA Bang et al . Bacillus subtilis KCTC 11782BP-Produced Alginate Oligosaccharide Effectively Suppresses Asthma via T-Helper Cell Type 2-Related Cytokines. Plos One (2015) e0130510
  • Non-Patent Document 3 X Xu et al . Unsaturated guluronate oligosaccharide enhances the antibacterial activities of macrophages. FASEB (2014). 2645-2654
  • Non-Patent Document 4 C Hao et al . Insulin Sensitizing Effects of Oligomannuronate-Chromium (III) Complexes in C2C12 Skeletal Muscle Cells. Plos One (2011). e24598
  • Non-Patent Document 5 Nishikawa T et al. Detection and pharmacokinetics of alginate oligosaccharides in mouse plasma and urine after oral administration by a liquid chromatography / tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) method. Biosci Biotechnol Biochem. (2008) 2184-90
  • Non Patent Literature 6 "Effect of Endurance Training on p-AMPK, PGC-1a and irisin Expression in T2DM Rat Myocardium.” Korean Journal of Physical Education 24.2 (2015): 1049-1060.
  • Non-Patent Document 7 Wrann, Christiane D. et al . "Exercise induces hippocampal BDNF through a PGC-1a / FNDC5 pathway.” Cell metabolism 18.5 (2013): 649-659 .
  • Non-Patent Document 8 Bonnelye, E. et al .
  • the orphan nuclear estrogen receptor-related receptor a (ERRa) is expressed throughout osteoblast differentiation and regulates bone formation in vitro. J. Cell Biol . 153 (2001) 971-983.
  • Non-Patent Document 9 Laflamme, N. et al. A frequent regulatory variant of the Estrogen-Related Receptor a gene associated with BMD in French Canadian premenopausal women. J. Bone Miner. Res. 20 (2005) 938-944.
  • Non-Patent Document 10 Liu, D. et al . Estrogen stimulates estrogen-related receptor (alpha) gene expression through conserved hormone response elements. Endocrinology 144 (2003) 4894-4904.
  • Non-Patent Document 11 Stein, RA et al . Estrogen-Related Receptor a is critical for the growth of estrogen receptor negative breast cancer. Cancer Res. 68 (2008) 8805-8812.
  • Non-Patent Document 12 Bianco, S. et al . Modulating ERRa activity inhibits cell proliferation J. Biol. Chem . 284 (2009) 23286-23292.
  • Non-Patent Document 13 Lloye M. Dillon. et al . The Role of PGC-1 Coactivators in Aging Skeletal Muscle and Heart. IUBMB Life . 64 (3) (2012) 231-241.
  • Non-Patent Document 14 Rhee SH et al . Principles and clinical implications of the brain-gut-enteric microbiota axis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol . 6 (5) (2009) 306-14.
  • Non-Patent Document 15 Schogor ALB et al. Ruminal Prevotella spp. May Play an Important Role in the Conversion of Plant Lignans into Human Health Beneficial Antioxidants. PLoS ONE 9 (4) (2014).
  • Non-Patent Document 16 Sjogren, Klara, et al. The gut microbiota regulates bone mass in mice. JMBR 27.6 (2012) 1357-1367.
  • Non-Patent Document 17 Zapata et al . The Microbiota and Microbiome in Aging: Potential Implications in Health and Age-Related Diseases. JAGS 63.4 (2015) 776-781.
  • Non-Patent Document 18 Van Niel et al . Lactobacillus therapy for acute infectious diarrhea in children: a meta-analysis. Pediatrics 109 (4) (2002) 678-684.
  • Non-Patent Document 19 Forsythe, P. et al . Oral treatment with live Lactobacillus reuteri inhibits the allergic airway response in mice. AJRCCM 175 (6) (2007) 561-569.
  • Non-Patent Document 20 Mikelsaar, Marika, et al . Intestinal Lactobacillus sp. is associated with some cellular and metabolic characteristics of blood in elderly people. Anaerobe 16 (3) (2010) 240-246.
  • the present inventors sought to investigate the effectiveness of the non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides (OligoM) produced by polymanneuronic acid degradation of alginic acid degrading enzymes. As a result, the present invention was completed by confirming that the non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharides had an effect of improving exercise performance in a short time and improving osteoporosis.
  • OligoM non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides
  • Another object of the present invention to provide a composition for improving, preventing or treating osteoporosis.
  • the present invention provides a composition for improving exercise performance, comprising an unsaturated manuronic acid oligosaccharide of a non-reducing terminal as an active ingredient.
  • the present inventors sought to investigate the effectiveness of the non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides (OligoM) produced by polymanneuronic acid degradation of alginic acid degrading enzymes. As a result, it was confirmed that the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharides had an effect of improving exercise performance in a short time and improving osteoporosis.
  • OligoM non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides
  • the non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharides are alginic acid oligosaccharides in the form of polymanneuronic acid, polyguluronic acid, or polymanneuronic acid and polygluronic acid produced by the decomposition of alginic acid degrading enzyme.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide has the following formula (1) of the following example (alginic acid oligosaccharide with three sugars bound):
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide is composed of 1 to 20 sugars.
  • the non-reducing terminal unsaturated unsaturated neuronic acid oligosaccharide is composed of 1 to 18, 1 to 15, 1 to 13, 1 to 10 or 1 to 7 sugars.
  • the non-reducing terminal monounsaturated manneuronic acid oligosaccharides are 175 for 1 sugar, 351 for 2 sugars, 527 for 3 sugars, 704 for 4 sugars, 704 for 5 sugars, 880 for 6 sugars, 1056 and 7 sugars.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides are 100-5000 Da in size.
  • the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide is 100-4500 Da, 100-4000 Da, 100-3500 Da or 100-3000 Da.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharides are prepared by digesting with alginate lyase as a poly-mannuronate substrate.
  • the alginic acid lyase means an enzyme that degrades alginate composed of polyguluronic acid (polyguluronate) and polymannuronate (polymannuronate) to lower molecular weight.
  • the alginic acid lyase is AlyDW11 from an abalone intestinal strain.
  • the AlyDW11 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.
  • the AlyDW11 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention is composed of at least two sugars.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide comprises 1 to 10 manneuronic acid or gluronic acid. According to another embodiment of the invention, it comprises from 1 to 9 manneuronic acid or gluronic acid. According to another embodiment of the invention, it comprises 1 to 8 manneuronic acid or gluronic acid. According to certain embodiments of the invention, it comprises 1 to 7 manneuronic acid or gluronic acid.
  • the non-reducing terminal-unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention has a small mass value of about 18, which is the mass value of the water molecule by removing water molecules compared with the non-reducing terminal-saturated manneuronic oligosaccharides (Fig. 3).
  • the non-reducing terminal of the unsaturated manuronic acid oligosaccharide of the present invention consists of manneuronic acid and gluronic acid.
  • the ratio of manneuronic acid to gluronic acid of the non-reducing terminal unsaturated unsaturated mannuronic acid oligosaccharide is 1.2-5.0: 1. According to another embodiment of the invention, 1.2-4.5: 1. According to another embodiment of the invention, it is 1.8-4.0: 1. According to certain embodiments of the invention, 2.0-3.0: 1.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention contains manneuronic acid 1.2-5.0, 1.2-4.5, 1.8-4.0 or 2.0-3.0 times more predominantly than gluronic acid (FIG. 4).
  • non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides of the present invention are non-reducing terminal conjugated double-bonding manneuronic oligosaccharides.
  • non-reducing refers to the structure of oligosaccharides, such as anomers (hemiacetals of monosaccharides (ring formation between C-1 and C-5), hemi-metals (ring formation between C-2 and C-5) The formation of diastereoisomers in which the positions of hydrogen atoms and hydroxyl groups attached to one carbon are changed in the cyclization reaction to generate carbon).
  • conjugated double bond type refers to a structure formed by repeating a single bond and a double bond.
  • non-reducing manneuronic oligosaccharides the non-reducing terminal produced by enzymatic degradation has only one double bond.
  • Decomposition of the polymanneuron alginic acid may be carried out by acid-alkaline hydrolysis, irradiation, high temperature, high pressure, enzymes, but is not limited thereto.
  • non-reducing terminal conjugated double-bonding manneuronic oligosaccharide is prepared by treating alginate degrading enzyme with polymanneuronic acid, and has the same meaning as "non-reducing terminal-type unsaturated manuronic acid oligosaccharide".
  • exercise performance means a physical property that depends on muscle contraction.
  • the exercise performance includes, but is not limited to, running speed and endurance, strength and endurance, swimming speed and endurance, maximum muscle strength, lifting force and endurance, pulling force and endurance, throwing force and endurance, and the like.
  • exercise performance ability refers to the subject's skill with respect to strength, speed, physical strength, force, precision, or metabolic output that is maintained to achieve a desired result during exercise performance time.
  • the improvement in exercise performance of the present invention is an increase in exercise force, an increase in exercise speed and / or an increase in physical strength.
  • composition for improving exercise performance of the present invention is a composition for improving exercise performance for anaerobic exercise or aerobic exercise.
  • the exercise is an anaerobic exercise.
  • anobic exercise refers to an exercise that generates energy necessary for exercise without oxygen and converts glycogen accumulated in muscle into energy. Anaerobic exercise creates the power to generate instantaneous energy and strengthens muscles.
  • the composition exhibits a 5-20% improvement in exercise speed compared to before and after ingestion.
  • the composition exhibits 5-30% improved anaerobic power as compared to before and after ingestion.
  • oxygen-free power means the maximum amount of work per unit time that can be performed without depending on the aerobic energy supply.
  • the exercise is an aerobic exercise.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for osteoporosis improvement, prevention or treatment comprising a non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides have the same structural characteristics as the previously described non-reducing terminal monounsaturating oligosaccharides, the contents in common between the two are described in order to avoid excessive complexity of the present specification. Omit.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharides are prepared by digesting with alginate lyase as a poly-mannuronate substrate.
  • the alginic acid lyase means an enzyme that degrades alginate composed of polyguluronic acid (polyguluronate) and polymannuronate (polymannuronate) to lower molecular weight.
  • the alginic acid lyase is an alginate degrading enzyme derived from marine enteric strains.
  • the alginic acid lyase consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 6 sequence.
  • the alginic acid lyase may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 5 SEQ ID NO.
  • Non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharides which are effective ingredients of the composition of the present invention, have an osteoporosis improvement, prophylactic or therapeutic effect.
  • the osteoporosis refers to a "porous bone” due to the rapid escape of calcium, which is a component of bone, and lower bone density than normal bone, and loss of bone due to various causes such as menopause, aging, and the use of harmful drugs. It is a disease in which fractures occur easily even with a slight shock.
  • the osteoporosis is senile osteoporosis.
  • osteoporosis refers to osteoporosis due to aging.
  • the composition has the effect of increasing bone density and improving intestinal flora.
  • composition of the present invention the composition for improving, preventing or treating osteoporosis may be prepared as a pharmaceutical composition.
  • the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the above-described non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharides described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and preferably applied by oral administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are in the range of 0.001 ug / kg-100 mg / kg on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the term "comprising as an active ingredient” is meant to include an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharides described above.
  • the upper limit of the amount of the above-described non-reducing terminally unsaturated manneuronic acid oligosaccharide contained in the composition of the present invention can be carried out by those skilled in the art within an appropriate range.
  • the present invention provides a food composition for improving exercise performance or osteoporosis improvement comprising a non-reducing terminal unsaturated unsaturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • compositions comprising the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention as an active ingredient
  • a composition comprising the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention as an active ingredient
  • the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharide as an active ingredient is normally added during food preparation.
  • Ingredients include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings, and flavoring agents.
  • Examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol.
  • As the flavoring agent natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food composition of the present invention is prepared with a drink
  • in addition to the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide of the present invention citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, tofu extract, jujube extract, licorice extract And the like can be further included.
  • the present invention provides a functional food composition for improving exercise performance or osteoporosis improvement comprising a non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • composition of the present invention can be prepared as a functional food composition containing an active ingredient of the non-reducing terminal unsaturated unsaturated neuronic oligosaccharide of the present invention.
  • the composition of the present invention includes ingredients that are commonly added in food preparation, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • a flavoring agent or a natural carbohydrate in addition to the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharide as an active ingredient.
  • natural carbohydrates include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.); Disaccharides (eg maltose, sucrose, etc.); oligosaccharide; Polysaccharides (eg, dextrins, cyclodextrins, etc.); And sugar alcohols (eg, xylitol, sorbitol, erythritol, and the like).
  • natural flavoring agents eg, taumarin, stevia extract, etc.
  • synthetic flavoring agents eg, saccharin, aspartame, etc.
  • the present invention provides a method for improving exercise performance, comprising administering to the subject the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharide.
  • the present invention provides a method for improving, preventing or treating osteoporosis, comprising administering to the subject the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharide.
  • the term "administration” or “administer” refers directly to an object (subject) in need of said oligosaccharide in an effective amount for the improvement, prevention or treatment of the exercise capacity or osteoporosis of the composition comprising the oligosaccharide of the present invention. By means of administration to ensure that the same amount is formed in the body of the subject.
  • Said "effective amount for treatment" of the composition means that the content of the composition is sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to the subject to which the composition is to be administered, and therefore means to include a “prophylactically effective amount”.
  • the term "subject” includes, without limitation, human, mouse, rat, guinea pig, dog, cat, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, baboon or rhesus monkey.
  • the subject of the present invention is a human.
  • the common contents between them are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a composition for improving athletic performance and improving osteoporosis.
  • composition of the present invention has a rapid exercise performance and an improvement effect on osteoporosis due to natural aging.
  • composition of the present invention is easy to manufacture the active substance and has an economic advantage.
  • Figure 1 shows the depolymerization results for manneuronic acid (poly mannuronate, poly M, CMOS) using alginic acid degrading enzyme (TLC) using commercial alginic acid oligosaccharide (marker) as a standard.
  • Figure 2 shows the mass spectrometric results of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides (CMOS).
  • FIG 3 shows the ratio of double bonds of unsaturated non-reducing manneuronic oligosaccharides (CMOS).
  • Figure 4 shows the results of the sugar composition of the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides (CMOS) by circular dichroism spectroscopy (CD, circular dichorism) method.
  • CMOS non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides
  • Figure 5 shows the effect of AMPK-ACC phosphorylation in 3T3-L1 predifferentiation cells by treatment with non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • Figure 6 shows the mRNA expression amount of PGC-1 ⁇ according to the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM) treatment.
  • Figure 7 shows the up-regulation of TCA cycle-related proteins as a result of the obesity-induced rat muscle protein analysis.
  • Figure 8 shows the design of the exercise performance improvement of the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM).
  • Figure 9 shows the results of the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM) feeding on the improvement of the instantaneous motor speed of the adult male.
  • Figure 10 shows the results of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM) feed on the anaerobic power of the adult male.
  • OligoM non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide
  • 11 is a result showing the effect of non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM) feeding on the improvement of mouse momentum.
  • OligoM non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide
  • Figure 12 shows the amount of mRNA expression of PGC-1 ⁇ according to the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM) treatment.
  • Figure 13 shows the effect of the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide feeding on bone mineral density of the femur.
  • SDW Sterile drinking water fed group
  • OligoM non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide as drinking water fed group
  • SDW_Exer sterile drinking water feeding and exercise group
  • OFM_Exer non-reducing endless mannyu Bone mineral density by group
  • Figure 14 shows the effect of the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide feeding on bone mineral density improvement of the shin bone.
  • SDW Sterile drinking water group
  • OligoM non-reducing terminally unsaturated manneuronic acid oligosaccharides drinking water
  • SDW_Exer sterile drinking water feeding and exercise group
  • non-reducing terminal mannyu Bone mineral density is shown by group (OligoM_Exer) in which drinking water supplemented with oligosaccharide drinking water.
  • Figure 15 shows a cross-sectional image of the femur of the old mouse according to the general feed.
  • Figure 16 shows the femur cross-sectional image of the elderly rats following the normal feed and exercise.
  • Figure 17 shows a cross-sectional image of the femur of the elderly mice following the intake and exercise of non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • Figure 18 shows the intestinal flora of old mice following the ingestion of non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides (OligoM).
  • A1-M month-old
  • C1-M 1 month old
  • C17-M 17 month old mice
  • alginic acid degrading enzyme alginate degrading enzyme consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6
  • TLC Thin Depolymerization was confirmed using Layer Chromatography, and a non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide, which is a mixture of alginic acid decomposing oligosaccharides, was obtained.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide mixture was obtained using a ultrafiltration membrane system (VivaFlow 50, Sartorius) to obtain fractions of molecular weight of 3000 Da or less, and the fractions of molecular weight of 3000 Da or less were lyophilized into powder form. Store at -20 ° C until testing.
  • the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide produced by using alginic acid degrading enzyme is composed of 1-7 sugars (DP 1-7) through TLC, the spot of TLC
  • the intensity of (spot) it was confirmed that a relatively high proportion of 2-5 sugars.
  • the circular dichroism spectroscopic signal was measured by circular dichroism (CD, J-715 spectropolarimeter, JASCO) in order to measure the ratio of manneulic acid of the unsaturated non-reducing manneuronic oligosaccharide.
  • the CD signal was measured in the 190-250 nm region using a cuvet of 1 cm at room temperature, the unsaturated manneuronic oligosaccharide of the non-reducing terminal was used at a concentration of 1 mg / ml to obtain a batch CD signal.
  • the peak peak, 200 nm absorbance value
  • trough trough, 215 nm absorbance values
  • the prepared samples were purified using an ion exchange resin column (Hitrap DEAE Sepharose FF, GE Healthcare) and then lyophilized.
  • the purified non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides were dissolved in water and then injected into the UPLC / MS system for constitutive sugar analysis.
  • Ultra Performance Liquid Chromatography setup was performed using an ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 um 1.0 * 100 mm, Waters) column and solvent A (15 mM Amylamin, The linear gradient of 25 mM HFIP) and solvent B (15 mM Amylamin, 25 mM HFIP in Acetonitrile) was adjusted. The eluate separated by C18-UPLC was analyzed by mass spectrometry (Quadrupole-Time of Flight, Q-TOF, Waters).
  • Q-TOF was analyzed in ESI negative mode, with capillary and sampling cone voltages of 3 kV and 40 V, desolvation for flow rate 600 L / h, temperature 300 ° C, and source temperature It carried out at 120 degreeC conditions.
  • TOF MS data were analyzed in the scan time range of 0.5 seconds m / z 100-1300. 2 ng / ul of leucine enkephalin (554.2619 Da in ESI negative mode) was used as the loose spray for the accuracy of the assay.
  • the mass spectrometry of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides, the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharides are composed of 1-7 sugars, in particular 18 than the reported manneuronic oligosaccharide mass value As these few peaks are observed, the water molecules are removed to form oligosaccharides with conjugated double-bonds at the non-reducing ends, and predominantly present over nonconjugated carbonyl mannuronic acid oligosaccharides (NCMOS).
  • NCMOS nonconjugated carbonyl mannuronic acid oligosaccharides
  • CMOS conjugated double-bonded manneuronic oligosaccharide
  • NCMOS non-conjugated double-bonded manneuronic oligosaccharide
  • the conjugated double-bonded manneuronic oligosaccharide of the non-reducing end was found to have an average of two times more than the non-conjugated double-linked manneuronic oligosaccharide of non-reducing terminal conjugated double-linked manneuronic oligosaccharide.
  • the nonconjugated double-bond manneuronic acid oligosaccharide molecular weights are as follows: per sugar (m / z 175), disaccharide (m / z 369), trisaccharide (m / z 545), tetrasaccharide (m / z 722), Per 5 (m / z 898) per 6 (m / z 1074), per 7 (m / z 1250).
  • the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharide was named 'OligoM'.
  • PGC-1a peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1 alpha
  • PGC-1a peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1 alpha
  • AMPK peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1 alpha
  • MCF-7 cells were cultured at 37 ° C. in DMEM / F12 medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin-streptomycin (100 U / ml) and 1% bovine insulin to determine the amount of PGC-1a expression. Used as a cell model. MCF-7 cells were treated with non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides (OligoM) at a concentration of 0.1 mg / mL for 48 hours, and then cDNA was synthesized after RNA extraction according to the GeneJET RNA Purification Kit method to reduce the amount of PGC-1a expression. Confirmed by -time PCR. As shown in FIG. 6, the mRNA expression of PGC-1a was increased upon treatment of non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • OligoM non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides
  • Example 4 using protein sieve analysis technology Non-reducing Terminal Unsaturated type Manneuronic acid Oligosaccharide TCA Circuit activation verification
  • Muscle protein sieve analysis was performed to confirm the energy metabolism activation following administration of the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (OligoM) in the obese rat.
  • Rats treated with non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharides at 250 mg / kg body weight per day for 9 weeks once every 2 days were collected with lysis buffer (0 mM Tris, 2 mM EDTA, 150).
  • Cellular protein was extracted by adding NaCl, 10% Triton X-100 and 10% NP40, protease inhibitor and phosphatase inhibitor in H 2 O, pH 7.5). The extracted protein was quantitated in the same amount using DC protein quantification method, and then trypsin digestion was performed using the Tube-Gel digestion method. , MA, USA) system was used to perform proteomic analysis.
  • Ingenuity Pathway Analysis (IPA version 9.0; Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA) showed TCA cycle-related citric acid synthase (1.33 times) and aconita as shown in FIG. It was confirmed that an azetase (aconitase, 1.39 times), oxoglutarate (1.47 times), succinate dehydrogenase complex (1.35 times) and malate dehydrogenase (1.47 times) were increased. Therefore, it was confirmed that the non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides increase the expression of the TCA cycle enzyme producing NADH necessary for energy metabolism.
  • the performance of the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides was evaluated.
  • the subjects of this study were four adult males with no medical abnormalities and dietary control.
  • the experimental period was examined for the effect of the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide intake (30 minutes) on exercise performance of athletes.
  • the Wingate Anaerobic Cycle Test (WACT) was performed three times at intervals of 30 minutes to measure exercise performance (average power).
  • Ingestion of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide was ingested in total 5 g per person twice through the following method (FIG. 8). 2.5 g per person between the first test and the second test, 2.5 g per person between the second test and the third test was orally administered and for this experiment, the test participants were lodged during the experimental period and eat the same meal (Fig. 8).
  • the intermittent load exercise using the bicycle ergometer was repeated repeatedly until all-out.
  • the pedaling movement speed was lowered to 300 rpm or less for 5 seconds or more on the computer monitor of the anaerobic power measurement (Wingate test)
  • the exercise was stopped, and the time until this was measured in seconds to determine the exercise duration.
  • 30 minutes of rest set 1
  • the exercise was repeated in the same manner. The form of rest rested in the saddle of the bicycle ergometer, taking a static break.
  • the motility improvement effect of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic acid oligosaccharide was evaluated.
  • 12 mice sterilized distilled water drinking group (SDW): 6, OligoM drinking group (OligoM): 6) were studied.
  • the duration of the experiment was 18 weeks in which the non-reducing unsaturated manneuronic acid oligosaccharide intake was examined by measuring the treadmill momentum to improve the exercise ability of old rats. All rats were acclimated to the experimental cage for one week prior to the experiment for environmental adaptation.
  • free treadmill exercise was performed for fourteen weeks after the start of the experiment. All mice were freely given sterile feed and sterile drinking water. Ingestion of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides allowed free drinking water at a concentration of 200 ppm each week.
  • the present inventors provide a smoothly supplying energy source for improving the anaerobic exercise performance of the exercise supplement composition of the present invention, and can be used as an exercise supplement in an athletic event requiring a short break and high energy.
  • the composition is new invented.
  • MCF-7 cells were cultured at 37 ° C. in DMEM / F12 medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin-streptomycin (100 U / ml) and 1% bovine insulin to determine the amount of PGC-1a expression. Used as a cell model. MCF-7 cells were treated with non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides (0.1 mg / ml, OligoM) and estradiol (10 nM, E2) for 48 hours, and then cDNA was synthesized after RNA extraction according to GeneJET RNA Purification Kit. The expression level of PGC-1a was confirmed by real-time PCR. As shown in FIG.
  • the inhalation anesthesia was performed for each individual, and bone mass per volume was measured using a micro CT X-ray camera apparatus.
  • the bone density of the femur was increased in 1M OligoM, 18M OligoM and 18M OligoM Exer in non-reducing terminal-unsaturated manneuronic oligosaccharide diets and exercise in combination with non-reducing terminal-unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • FIG. 14 the bone density of the femur was increased in 1M OligoM, 18M OligoM and 18M OligoM Exer in non-reducing terminal-unsaturated manneuronic oligosaccharide diets and exercise in combination with non-reducing terminal-unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • the bone density of the shin was increased in 1M OligoM, 18M OligoM and 18M OligoM Exer in parallel with the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharide diet, and non-reducing terminal, respectively.
  • FIG. 15 shows the femur cross-sectional image of the 17-month-old mouse according to the general feed
  • FIG. 16 shows the femur cross-sectional image of the old mouse according to the general feed and exercise
  • Figure 17 shows a cross-sectional image of the femur of the elderly mice following the intake and exercise of non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • the cross-sectional image of the femoral bone intake of the non-reducing endless manneuronic acid oligosaccharides and the exercise showed an increase in trabecular, compared to the cross-sectional image of the femur in the diet.
  • Older rats were purchased at 1 month old and 17 month old male C57BL / 6J from Korea Basic Science Institute.
  • the breeding environment is 20 ⁇ 2 °C, relative humidity is 50 ⁇ 10%, and the contrast cycle is adjusted to 12 hours per day for 1 week.
  • three groups were randomly divided into the control group and the experimental group.
  • the experimental group was supplied with 0.2 mg / ml of non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharides at a concentration of 0.2 mg / ml, and the control group was fed with water only for 10 weeks.
  • the mouse was dissected, the intestinal contents were separated, 200 mg was taken, the DNA was obtained using the Fast DNA SPIN kit (for Soil kit) based on the method presented in the kit, and the concentration and purity of the extracted DNA were confirmed.
  • the DNA concentration and purity was confirmed based on the DNA band results extracted through agarose gel electrophoresis.
  • 27F forward primers (5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') and 518R reverse primers (5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') containing V1-V3 hypervariable regions that specifically bind bacteria for amplification of bacterial 16S rRNA genes in isolated DNA '-WTTACCGCGGCTGCTGG-3') initial denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, repeated amplification 30 times at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 45 seconds, and 72 ° C. for 1 minute 30 seconds, followed by QIAquick gel Purification via extraction kit (Qiagen, Germany). PCR products were subjected to pyrosequencing using the GS Junior Titanium System (Roche, Germany) sequencing system. The methods and reactions required for pyro sequencing were prepared according to the manufacturer's manual (Chunlab). , Korea).
  • the elderly rats who consumed the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides are similar to the intestinal flora of 1 month old rats, and the intake of the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharides is similar. It was confirmed that there is a difference from the intestinal flora of 17 months old rats.
  • the present inventors newly invented a composition that can be used as an osteoporosis treatment agent according to the natural aging of the osteoporosis treatment composition of the present invention promotes the activity of osteoblasts producing bone and inhibits the activity of osteoclasts. It was.
  • SEQ ID NO: 1 and 2 are the nucleotide and amino acid sequence of AlyDW11, respectively
  • SEQ ID NO: 3 and 4 are the nucleotide sequence and amino acid sequence of Aly3, respectively
  • SEQ ID NO: 5 and 6 Respectively, the nucleotide sequence and the amino acid sequence of Aly5.

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Abstract

본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)을 유효성분으로 포함하는 운동 수행 능력 개선용 조성물 및 골다공증 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 신속한 운동 수행 능력 및 자연노화에 따른 골다공증에 대한 개선 효과를 나타내며, 활성 물질의 제조가 용이하고 경제적인 이점을 갖는다.

Description

비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 포함하는 운동 수행 능력 개선 및 골다공증 치료용 조성물
본 특허출원은 2016년 06월 21일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2016-0077436호 및 2016년 07년 28일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2016-0096251호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 운동 수행 능력 개선 및 골다공증 치료용 조성물에 관한 것이다.
알긴산은 해조류인 미역, 감태, 태황, 패, 톳 등의 갈조류의 세포막 사이를 채우고 있는 해조 다당류이다. 알긴산은 b-D-만뉴론산(b-D-mannuronic acid; M) 및 a-L-글루쿠론산(a-L-guluronic acid; G)의 2종류의 우론산(uronic acid)이 각종 비율로 1,4-글리코시드 결합을 한 헤테로형의 다당류이고, 양질의 식이섬유 기능을 가진다. 알긴산은 분자 속에 우론산의 카르복시기(-COOH)가 있으므로 산의 성질을 나타낸다. 해조류별 알긴산의 함유량은 종류, 장소, 계절, 부위에 따라 다르지만 여름철에 수확한 갈조류의 경우 전체 건조중량의 16-34%가 알긴산으로 이루어져 있다. 알긴산은 전체 소비량의 약 30%가 식품첨가물로 사용되고 있고, 식용 가공품으로만 이용되고 있어 부가가치가 낮은 실정이다. 제약업계에서는 정제의 선형제 등으로 사용되며 아직까지 약물로써 부작용이 알려진 바는 없다. 따라서, 알긴산의 저분자화를 통해 의약품 원료로 개발 할 경우 그 가치를 배가 시킬 수 있다.
산업적으로 이용 가능한 알긴산 올리고당 생산을 위해서는 첫째, 고온고압 혹은 방사선으로 연화시킨 후 분리하는 방법과 둘째, 산과 알칼리 처리를 이용한 제조방법, 셋째, 알긴산 분해효소를 이용한 효소적 제조방법이 있다. 알긴산 분해효소인 알지네이트 라이아제(alginate lyase)는 알긴산의 b-1,4-글리코시드 결합을 분해하여 4,5-불포화 비환원성 말단을 갖는 산물을 생산한다. 최근에는 효소분해를 통해 생산한 알긴산 올리고당의 기능성이 우수함이 보고됨에 따라 효소적 제조에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
알긴산 올리고당은 다기능성 소재로서 HepG2 세포에 알긴산 올리고당(3 mg/ml)을 처리하면 LDL-콜레스테롤이 LDLR(lipoprotein receptor)를 통해 흡수가 촉진되고 (Yang et al., 2015), 난백알부민(ovalbumin)으로 천식을 유도한 동물모델에서 면역세포와 IgE를 감소시켜 알긴산 올리고당의 천식 억제 효과가 보고되었다(Bang et al., 2015). 최근에는 2-DE 방법을 이용하여 글루론산 올리고당의 항염증 기능을 규명하고자 하였으며, 단백질체 분석 결과 NF-kB 시그널을 통해 항산화, 전염증성(pro-inflammatory) 및 항-염증 기능이 확인된 바 있다 (Xu Xu et al. 2015). 크롬(chromium)이 복합된 알긴산 올리고당은 근육세포(C2C12 skeletal muscle cells)에서 AMPK 인산화를 촉진하며 인슐린 감작 효과가 있음이 보고되었으며, 기능성 소재로서 알긴산 올리고당의 약물동태학(pharmacokinetics)을 관찰하기 위하여 2008년 Nishikawa 연구진이 5주령 쥐에 알긴산 올리고당을 경구투여 후 시간 경과에 따른 혈액 및 소변에서의 알긴산 올리고당을 검출한 결과, 혈장에서는 경구투여 2시간 까지 검출되고, 소변에서는 6시간까지도 일정하게 검출되었다. 그 결과 알긴산 올리고당이 장에서 흡수된 후 혈액순환을 통해 소변으로 배출됨을 확인하였다(Nishikawa T et al., 2008). 따라서 위와 같은 기능성을 토대로 알긴산 올리고당은 에르고제닉 에이드(ergogenic aid)용 소재로서 이용가치가 우수하다.
스포츠에서 경기력 향상을 위하여 선수들은 경기력 향상 보조물인 에르고제닉 에이드(ergogenic aid)를 섭취한다. 현재 사용되거나 알려져있는 영양학적 에르고제닉 에이드는 주로 비타민, 카르니틴, 카페인, 항산화제제 등과 한약재 중 홍삼, 동충하초, 가시오가피, 매실 등의 성분으로 구성되어 있다. 영양학적 보조제인 에르고제닉 에이드는 선수의 경기력 측면에 도움을 줄 수 있음에도 불구하고 오남용으로 인해 다양한 부작용이 발생하며 그에 따른 성분들의 상당 부분이 금지 약물로 지정되어 있어 트레이닝 현장에서 적용하기 어려운 문제가 있다.
일반적으로 에르고제닉 에이드는 탈수 방지, 에너지 공급 보충, 에너지 대사나 체내 노폐물 제거와 관련된 생리작용을 조절해주는 기능을 가진다. 카페인의 경우 세계적으로 널리 이용되는 약물 중 하나로 커피, 홍차, 등에 함유되어 있어 섭취 시 지방대사에 관여하고, 인체내에서 cAMP 분해효소인 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase)의 활성을 억제시켜 지방세포 내 cAMP의 농도를 증가시킴에 따라 AMPK 단백질의 인산화를 통해 저장지방을 분해한다. 그 결과 운동 중 혈중 유리지방산의 동원을 증가시켜 간과 근육의 글라이코겐 손실을 억제하는 효과가 있다. 하지만 카페인의 경우 중추신경자극제로 작용하므로 민감한 사람에게는 두통 불안, 신경과민 등을 유발할 수 있으며, 이뇨작용으로 인해 고온에서 장시간 운동 시 체내탈수증을 유발하는 문제점이 발생한다.
골다공증 발생의 중요한 원인 요소 중 하나는 노령이다. 골의 재형성은 조골세포의 골 생성과 파골세포의 골 흡수 균형에 의해 이루어진다. 연령 증가에 따라 골 생성에 비해 골감소가 증가하고, 이에 따른 지속적인 골 감소는 골다공증을 유발하게 된다. 그러나 골다공증에 대한 약물의 효능을 검증하고자 하는 대부분의 연구에서는 건강하고 젊은 실험동물을 사용하고 있으며, 원인요소를 감안하는 노령의 실험동물을 사용한 연구는 매우 드물고, 실험적 연구결과와 실제 임상에서 나타날 수 있는 효능 사이에 차이가 있을 수 있다.
본 연구에서는 실제 골다공증의 발병 연령이 노령인 점을 감안하여 실험동물을 출생 후 17개월된 노령 쥐를 사용함으로써 실험적 개선을 시도하였다.
폐경 후 여성의 에스트로겐 레벨은 감소하고, 이에 따라 파골세포의 활성이 증가되며 조골세포의 활성은 증가되지 않는다. 최근 항골다공증(anti-osteoporotic)의 주요 타켓 중 하나인 ERRa(estrogen-related receptor)은 조골세포의 분화를 상승시켜 골다공증 치료제로 사용된다. ERR은 에스트로겐/엔드로겐 연관 질환에서 주요 역할을 한다. Laflamme 연구진이 2005년 성인여성을 대상으로한 다형성과 BMD의 연관성에 관한 실험에서 ERRa의 발현이 높은 BMD의 발현으로 연관된다고 주장하였다. Liu 연구진은 2003년 ERRa의 발현이 자궁의 에스트로겐을 상향-조절시키는 기능을 확인하였으며, 골에서의 ERRa의 기능은 성숙된 조골세포로의 분화와 증식을 상승시키는 리셉터로 작용한다고 보고된 바 있다(Stein, R.A. et al., 2008. Bianco, S. et al., 2009). 이 때 ERRa의 조절자로 PGC-1a이 작용하게 된다. PGC-1a은 전사 인자인 ERRa의 활성화 시켜 핵 내 DNA 코딩된 미토콘드리아 단백질의 발현을 증가시킨다. 이들 단백질들은 mtDNA의 복제와 발현을 증가시켜 미토콘드리아성 바이오제네시스를 상승시키는 역할을 한다(Lloye M. Dillon. et al., 2012).
장내 생태계는 출생과 동시에 미생물이 서식하기 시작하여 유익균과 유해균이 균형을 유지하며 장내 균총을 형성하고 인간과 공생하며 상호작용을 통해 인간의 건강에 직간접으로 영향을 미친다. Rhee SH 연구진에 따르면 내분비 세포는 장내 미생물 균 총의 균형에 따라 영향을 받아 호르몬 방출을 통하여 숙주의 면역세포와 신경세포에 영향을 미친다고 보고하였다. 특히, 노화가 진행됨에 따라 장내 균총의 불균형이 야기되고 이때 장내 미생물은 골 관련 치주염, 관절염, 골다공증을 야기한다(Schogor ALB. et al., 2014). Klara sjogren 연구진에 따르면 장내 미생물이 마우스의 골량을 조절하며, 이는 파골세포가 조절하는 골 흡수에 영향을 줄 수 있다고 보고하였다. 특히 후벽균(Firmicutes)은 노년기에 접어들면서 급격히 증가하게 되나 낮은 비율에서 항생제와 높은 상호작용을 보인다(Zapata et al., 2015). 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)의 경우 영유아들에게 발생하는 설사와 습진, 알레르기를 예방하지만, 노년기에는 염증을 유발하거나 심혈관 질환을 증가시킬 수 있다고 보고되었다(Forsythe, P. et al., 2007, Van Niel. et al., 2002, Mikelsaar et al., 2010). 건강하게 장수하려면 노년기에 프리보텔라(Prevotella) 종 등의 유익균이 많아야 하는 반면, 후벽균 및 락토바실러스 루테리 등의 균이 적은 상태로 장내 균총을 유지시켜야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Yang JH et al. Alginate oligosaccharide enhances LDL uptake via regulation of LDLR and PCSK9 expression. J Nutr Biochem . (2015) 1393-400
(비특허문헌 2) MA Bang et al. Bacillus subtilis KCTC 11782BP-Produced Alginate Oligosaccharide Effectively Suppresses Asthma via T-Helper Cell Type 2-Related Cytokines. Plos One(2015) e0130510
(비특허문헌 3) X Xu et al. Unsaturated guluronate oligosaccharide enhances the antibacterial activities of macrophages. FASEB (2014). 2645-2654
(비특허문헌 4) C Hao et al. Insulin Sensitizing Effects of Oligomannuronate-Chromium (III) Complexes in C2C12 Skeletal Muscle Cells. Plos One (2011). e24598
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본 발명자는 알긴산 분해효소의 폴리만뉴론산 분해에 의해 생성된 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)의 효용성을 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 단시간에 운동 수행 능력을 개선시키고, 골다공증을 개선시키는 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 운동 수행 능력 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 골다공증 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 운동 수행 능력 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명자는 알긴산 분해효소의 폴리만뉴론산 분해에 의해 생성된 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)의 효용성을 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 단시간에 운동 수행 능력을 개선시키고, 골다공증을 개선시키는 효과를 가짐을 확인하였다.
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 알긴산 분해효소의 분해에 의해 생성된 폴리만뉴론산, 폴리굴루로닉산, 또는 폴리만뉴론산 및 폴리글루로닉산이 혼합된 형태의 알긴산 올리고당이다.
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 다음의 일 예(3개의 당이 결합된 알긴산 올리고당)의 구조식 1을 갖는다:
[구조식 1]
Figure PCTKR2017006529-appb-I000001
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 내지 20개의 당으로 구성된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 내지 18개, 1 내지 15개, 1 내지 13개, 1 내지 10개 또는 1 내지 7개의 당으로 구성된다.
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 당인 경우에 175, 2 당인 경우에 351, 3 당인 경우에 527, 4 당인 경우에 704, 5 당인 경우에 880, 6 당인 경우에 1056, 7 당인 경우에 1232의 Z-평균 분자량(m/z)을 갖는다(도 3).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 100-5000 Da 크기이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 100-4500 Da, 100-4000 Da, 100-3500 Da 또는 100-3000 Da이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 폴리만뉴론산(poly-mannuronate) 기질로 하여 알긴산 라이아제(alginate lyase)에 의해 분해되어 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 폴리굴루론산(polyguluronate) 및 폴리만뉴론산(polymannuronate)로 구성된 알긴산(alginate)를 분해하여 저분자화 하는 효소를 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 전복 장내 균주 유래의 AlyDW11이다.
상기 AlyDW11은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 AlyDW11은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 발명의 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 은 최소 2종의 당으로 구성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1개 내지 10개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 1개 내지 9개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 1개 내지 8개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 1개 내지 7개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 비교하여 물 분자가 제거되어 물 분자의 질량값인 18 정도의 작은 질량값을 갖는다(도 3).
본 발명의 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산 및 글루론산으로 이루어져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 만뉴론산:글루론산의 비율은 1.2-5.0:1이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 1.2-4.5:1이다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 1.8-4.0:1이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 2.0-3.0:1이다.
즉, 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산을 글루론산보다 1.2-5.0, 1.2-4.5, 1.8-4.0 또는 2.0-3.0배 우세하게 포함한다(도 4).
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당이다.
본 명세서에서 용어 "비환원성"은 올리고당의 구조에 있어서, 아노머[단당류의 헤미아세탈(C-1과 C-5 사이의 고리 형성), 헤미케탈(C-2와 C-5 사이의 고리 형성)을 생성하는 고리화 반응에서 한 탄소에 붙은 수소원자와 수산화기의 위치가 바뀐 부분입체 이성질체가 생기는 현상) 탄소를 갖지 못한 성질을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "공액이중결합형"은 단일겹합과 이중결합이 반복되어 형성된 구조를 의미한다. 비환원성 만뉴론산 올리고당의 경우 효소분해로 인하여 생성된비환원성 말단이 이중결합 하나만 있는 형태이다.
상기 폴리만뉴론 알긴산의 분해는 산-알칼리 가수분해, 방사선 조사, 고온고압, 효소에 의해 실시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서의 용어 "비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당”은 폴리 만뉴론산을 알긴산 분해효소 처리하여 제조된 것으로, “비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당”과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 용어 "운동 수행"은 근육 수축에 의존적인 신체적 특성을 의미한다. 예컨대, 상기 운동 수행은 달리기 속도 및 지구력, 근력 및 지구력, 수영 속도 및 지구력, 최대 근력, 들어올리는 힘 및 지구력, 당기는 힘 및 지구력, 던지는 힘 및 지구력 등이 포함되며 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "운동 수행 능력"은 운동 수행 시간 동안 목적하는 결과를 달성할 수 있도록 유지되는 강도, 속도, 체력, 힘, 정밀도 또는 대사출력 등에 대한 대상의 기량을 의미한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 운동 수행 능력 개선은 운동 힘의 증가, 운동 속도의 증가 및/또는 체력의 증가이다.
본 발명의 운동 수행 능력 개선용 조성물은 무산소운동(anaerobic exercise) 또는 유산소운동(aerobic exercise)에 대한 운동 수행 능력 개선용 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 운동은 무산소운동이다.
본 명세서에서 용어 "무산소운동"은 운동에 필요한 에너지를 산소 없이 생성하는 운동으로 근육에 축적된 글리코겐이 분해되어 에너지로 전환되는 운동을 의미한다. 무산소운동은 순간적인 에너지를 낼 수 있는 힘을 만들며, 근육을 강화시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 섭취 전/후와 비교하여 5 내지 20% 향상된 운동 속도를 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 섭취 전/후와 비교하여 5 내지 30% 향상된 무산소성 파워를 나타낸다.
본 명세서에서 용어 "무산소성 파워"는 유산소성 에너지 공급에 의존하지 않고 수행할 수 있는 단위 시간당 최대 작업량을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 운동은 유산소운동이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 골다공증 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 앞서 기재한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당과 동일한 구조적 특징을 가지기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 폴리만뉴론산(poly-mannuronate) 기질로 하여 알긴산 라이아제(alginate lyase)에 의해 분해되어 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 폴리굴루론산(polyguluronate) 및 폴리만뉴론산(polymannuronate)로 구성된 알긴산(alginate)를 분해하여 저분자화 하는 효소를 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 해양생물 장내균주 유래 알긴산 분해 효소이다.
상기 알긴산 라이아제는 서열목록 제4서열 또는 제6서열의 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 알긴산 라이아제는 서열목록 제3서열 또는 제5서열의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 인코딩 될 수 있다..
본 발명의 조성물의 유효성분인 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 골다공증 개선, 예방 또는 치료 효과를 갖는다.
상기 골다공증은 뼈의 성분인 칼슘이 급격히 빠져나와 정상적인 뼈에 비하여 골밀도가 낮아져 "구멍이 많이 난 뼈"를 말하며, 폐경, 노화, 뼈에 해로운 약물의 사용 등의 여러 가지 원인에 의하여 뼈가 많이 손실되고 약해져 경미한 충격에도 쉽게 골절이 일어나는 질환이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골다공증은 노인성 골다공증이다.
본 명세서에서 용어 ‘노인성 골다공증’은 노화(aging)에 의한 골다공증을 의미한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 조성물은 골밀도를 증가시키고 장내 균총을 개선시키는 효과를 갖는다.
본 발명의 조성물은 골다공증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 ug/kg - 100 mg/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 상술한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 상술한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 또는 골다공증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분 포함하는 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 또는 골다공증 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분 포함하는 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 객체에 투여하는 단계를 포함하는 운동 수행 능력을 개선시키는 방법을 제공한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 경구투여한 임상 실험 결과, 객체의 운동 속도 및 파워를 증가시키는 효과를 나타내므로, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 객체에게 투여하여 운동 수행 능력을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 객체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 경구투여한 전임상 실험 결과, 객체의 골밀도 증가 및 장내 균총의 불균형 개선 효과를 나타내므로, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 객체에게 투여하여 골다공증을 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 올리고당을 포함하는 조성물의 운동능력 또는 골다공증의 개선, 예방 또는 치료를 위한 유효량을 상기 올리고당을 필요로 하는 객체(대상체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
조성물의 상기 "치료를 위한 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 따라서 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체"는 제한 없이 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는 본 발명의 대상체는 인간이다.
상기 운동 수행 능력을 개선시키는 방법, 및 골다공증의 개선, 예방 또는 치료 방법은 앞서 기재한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 또는 이를 포함하는 조성물의 유효량을 객체에 투여하여 치료하는 방법으로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 운동 수행 능력 개선용 및 골다공증 개선용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 신속한 운동 수행 능력 및 자연노화에 따른 골다공증에 대한 개선 효과를 갖는다.
(c) 본 발명의 조성물은 활성 물질의 제조가 용이하고 경제적인 이점을 갖는다.
도 1은 알긴산 분해효소를 이용하여 만뉴론산(poly mannuronate, poly M, CMOS)에 대한 디폴리머리제이션 결과를 상업용 알긴산 올리고당(marker)을 표준물질로 사용하여 TLC(Thin Layer Chromatography)로 보여준다.
도 2는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(CMOS)의 질량분석 결과를 나타낸다.
도 3은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(CMOS)의 이중결합 비율을 나타낸다.
도 4는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(CMOS)의 당 구성을 원평광 이색성 분광 측정법(CD, circular dichorism) 방법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리에 의한 3T3-L1 지방분화전 세포에서 AMPK-ACC 인산화 증진 효과를 나타낸다.
도 6은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 처리에 따른 PGC-1α의 mRNA 발현양을 나타낸다.
도 7은 비만을 유도한 랫트 근육 단백질체 분석 결과 TCA 회로 관련 단백질의 상향 조절(up-regulation)을 나타낸다.
도 8은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)의 운동수행능력 향상 실험 설계를 나타낸다.
도 9는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 급이가 성인남성의 순간운동 스피드 향상에 미치는 결과를 나타낸다.
도 10은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 급이가 성인남성의 무산소성 파워 향상에 미치는 결과를 나타낸다.
도 11은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 급이가 마우스 운동량 개선에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 12는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 처리에 따른 PGC-1α의 mRNA 발현양을 나타낸다.
도 13은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 급이가 대퇴골의 골밀도 향상에 미치는 영향을 나타낸다. 멸균 음용수를 급여한 그룹(SDW), 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 음용수로 급여한 그룹(OligoM), 멸균 음용수 급이와 운동을 병행한 그룹(SDW_Exer) 및 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 음용수 급이와 운동을 병행한 그룹(OligoM_Exer)별 골밀도를 나타낸다.
도 14는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 급이가 정강이 뼈의 골밀도 향상에 미치는 영향을 나타낸다. 멸균음용수를 급여한 그룹(SDW), 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 음용수로 급여한 그룹(OligoM), 멸균음용수 급이와 운동을 병행한 그룹(SDW_Exer) 및 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용수 급이와 운동을 병행한 그룹(OligoM_Exer)별 골밀도를 나타낸다.
도 15는 일반 사료 급이에 따른 노령쥐의 대퇴골의 단면 이미지를 나타낸다.
도 16은 일반 사료 급이 및 운동에 따른 노령쥐의 대퇴골 단면 이미지를 나타낸다.
도 17은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용 섭취와 운동에 따른 노령쥐의 대퇴골의 단면 이미지를 나타낸다.
도 18은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 음용 섭취에 따른 노령 쥐의 장내 균총을 나타낸다.
도 19는 멸균수 음용 섭취 1개월령(C1-M)과 17개월령(C17-M)쥐와 실험군인 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용 섭취에 따른 1개월령(A1-M) 및 17개월령(A17-M)의 장내균총을 나타낸다.
본 실시예에서는 0.3% 폴리만뉴론산 수용액에 알긴산 분해효소(서열목록 제2서열, 제4서열 또는 제6서열의 아미노산 서열로 이루어진 알긴산 분해 효소) 첨가 후 45℃에서 24시간 분해하고 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용하여 디폴리머리제이션(depolymerization)을 확인하였고, 알긴산 분해 올리고당 혼합물인 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 확보하였다. 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 혼합물을 한외여과막 시스템(VivaFlow 50, Sartorius)을 이용하여 분자량 3000 Da 이하의 분획물을 확보하였으며, 확보한 분자량 3000 Da 이하의 분획물은 동결건조를 통해 분말형태로 시험전까지 -20℃에 보관하였다.
도 1에 제시한 바와 같이, 알긴산 분해효소를 이용하여 생산한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 TLC를 통해 1-7당(DP 1-7)으로 구성되어 있음을 확인하였으며, TLC의 스팟(spot)의 세기(intensity)를 비교하였을 때, 상대적으로 2-5당이 높은 비율로 존재함을 확인하였다.
실시예 2: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 구성 및 구조적 특징 분석
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 만뉴론산 비율을 측정하기 위하여 원평광 이색성 분광법(circular dichroism, CD, J-715 spectropolarimeter, JASCO)을 이용하여 원평광 이색성 분광 신호를 측정하였다. 상기 CD 신호는 상온에서 1 cm의 큐벳을 이용하여 190-250 nm 영역에서 측정하였으며, 일괄성 있는 CD 시그널을 얻기 위하여 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 mg/ml 농도로 사용하였다. 만뉴론산:글루론산 구성비를 알아보기 위하여 피크(peak, 200 nm 흡광도 값) 및 트로프(trough, 215 nm 흡광도 값)를 측정하여 만뉴론산과 글루론산의 비율을 계산하였으며, 계산식은 다음과 같다:
(1) 피크/트로프 < 1, 만뉴론산/글루론산 = 2.0(피크/트로프)
(2) 피크/트로프 > 1, 만뉴론산/글루론산 = 27(피크/트로프) + 40
도 2에서 알 수 있듯이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산/글루론산 비율이 2.59(피크=3.82, 트로프=3.20)이며, 비환원성 말단의 공액이중결합형 형성으로 인하여 215 nm의 흡광도값 측정이 방해됨을 확인할 수 있었다.
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 구성당을 분석하기 위하여, 준비된 시료는 이온 교환 수지 컬럼(Hitrap DEAE Sepharose FF, GE Healthcare)을 이용하여 정제한 후 동결건조를 실시하였다. 정제된 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 물에 용해 후 UPLC/MS 시스템에 주입함으로써 구성당 분석을 수행하였다.
초고성능 액체 크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC, Waters) 설정은 ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 um 1.0 * 100 mm, Waters) 컬럼을 이용하였으며 0.4 ml/분에서 12분 동안 용매 A(15 mM Amylamin, 25 mM HFIP)와 용매 B(15 mM Amylamin, 25 mM HFIP in Acetonitrile)의 선형 구배를 조절하였다. C18-UPLC로 분리되어 나온 용리액은 질량분석기 (Quadrupole-Time of Flight, Q-TOF, Waters)로 분석하였다. Q-TOF는 ESI 네거티브 모드에서 분석하였으며, 캐필러리와 샘플링콘(sampling cone)의 전압은 각각 3 kV와 40 V, 탈용매(desolvation)는 유속 600 L/h, 온도 300℃, 소스 온도는 120℃ 조건에서 실시하였다. TOF MS 데이타는 스캔시간은 0.5 초 m/z 100-1300 범위에서 분석하였다. 분석의 정확도를 위해 모든 분석에 2 ng/ul의 로이신 엔케팔린(leucine enkephalin, ESI 네거티브 모드에서 554.2619 Da)을 락스프레이(lack spray)로 사용하였다.
도 3에서 알 수 있듯이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 질량분석 결과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1-7당으로 구성되어 있으며, 특히 기보고된 만뉴론산 올리고당 질량값 보다 18이 적은 피크들이 관찰됨에 따라 물 분자가 제거되어 비환원성 말단의 공액이중결합형이 형성된 올리고당이 형성되며 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(nonconjugated carbonyl mannuronic acid oligosaccharide, NCMOS)보다 우세하게 존재함을 알 수 있었다. 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(CMOS)과 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(NCMOS)의 비율을 나타낸 결과는 도 4에 제시되었다.
도 4와 같이, 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 보다 평균 2배 이상의 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 단당들이 존재함을 확인하였다. 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 분자량은 다음과 같다: 1당 (m/z 175), 2당 (m/z 369), 3당 (m/z 545), 4당 (m/z 722), 5당 (m/z 898) 6당 (m/z 1074), 7당 (m/z 1250).
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 'OligoM'이라고 명명하였다.
실시예 3: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 AMPK-ACC 인산화 촉진
에너지 대사에 중요한 단백질인 AMPK-ACC 인산화 촉진 여부를 확인하기 위하여 3T3-L1 지방 분화 전 세포에 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.2 mg/mL 농도로 처리 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿을 실시하여 단백질 발현 패턴을 처리 시간별로 확인하였다. 도 5에 제시한 바와 같이, AMPK, phospho-AMPKa(Thr172), ACC, phospho-ACC(Ser79) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리 시간 의존적으로 AMPK-ACC 인산화가 촉진됨을 확인하였다. 따라서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 에너지 대사에 중요한 단백질인 AMPK 인산화를 통해 활성화하여 에너지 대사를 촉진시킬 것으로 확인되었다.
PGC-1a(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1 alpha)은 AMPK 인산화를 통해 활성화되는 공활성화 인자로써 포도당 신생합성을 촉진하는 전자인자를 활성화 시킨다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 PGC-1a의 상위조절자인 AMPK의 인산화를 촉진이 확인됨에 따라 PGC-1a의 발현을 mRNA 수준에서 확인해 보고자 하였다.
MCF-7 세포는 10%의 우태아혈청, 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/ml) 및 1% 소 인슐린이 포함된 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에 배양하여 PGC-1a 발현양을 측정하기 위한 세포모델로 사용하였다. MCF-7세포에 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)을 0.1 mg/mL 농도로 48시간 처리 후 GeneJET RNA 정제 키트 방법에 따라 RNA 추출 후 cDNA를 합성하여 PGC-1a의 발현양을 실-시간 PCR로 확인하였다. 도 6에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 처리 시 PGC-1a의 mRNA 발현을 증가하였다.
실시예 4: 단백질체 분석기술을 활용한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 TCA 회로 활성화 검증
비만을 유도한 랫트에서 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 투여에 따른 에너지 대사 활성화를 확인하기 위하여 근육 단백질체 분석을 실시하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 체중 1 kg 당 250 mg 용량으로 2일에 1번 9주 동안 복강투여를 실시한 랫트의 뒷다리 근육을 채취한 후 lysis buffer (0 mM Tris, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% Triton X-100 and 10% NP40, protease inhibitor and phosphatase inhibitor in H2O, pH 7.5)를 넣고 세포질 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 DC protein 정량법을 이용하여 동량으로 정량 후 Tube-Gel digestion 방법을 이용하여 trypsin digestion을 수행 후 펩타이드 혼합물은 A nano-ACQUITY Ultra Performance LC ChromatographTM equipped with a SynaptTM HDMS System (Waters Corp., Milford, MA, USA) 시스템을 이용하여 단백질체 분석을 수행하였다.
단백질체 분석결과에 대하여 Ingenuity Pathway Analysis (IPA version 9.0; Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA) 실시한 결과 도 7에 제시한 바와 같이 TCA cycle 관련 시트르산 합성효소(citrate synthase, 1.33배), 아코니타아제(aconitase, 1.39배), 옥소글루타르산(oxoglutarate, 1.47배), 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase complex, 1.35 배), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, 1.47배)가 증가함을 확인하였다. 따라서 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 에너지 대사에 필요한 NADH를 생산하는 TCA 회로 효소의 발현을 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5: 운동수행능력 향상 실험 설계 및 방법
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)의 운동수행 향상능력에 대한 평가를 실시하였다. 본 실험의 대상은 의학적으로 이상 소견이 없고 식이 통제가 가능한 성인 남성 4명을 대상으로 하였다. 실험기간은 운동 전 단시간(30분)의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 섭취가 운동선수의 운동수행능력에 미치는 영향을 조사하였다. 30분 동안 간격을 두고 세차례 윈게이트 무산소성 능력 검사(Wingate Anaerobic Cycle Test; WACT)를 실시하여 운동수행능력(평균파워)를 측정하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 섭취는 다음과 같은 방법을 통하여 두차례에 걸쳐 1인당 총 5 g을 섭취하였다(도 8). 첫 번째 테스트와 두 번째 테스트 사이 1인당 2.5 g, 두 번째 테스트와 세 번째 테스트 사이 1인당 2.5 g을 경구투여 하였고 본 실험을 위하여 실험참가자는 실험기간 중 합숙하며 동일한 식사를 하였다(도 8).
실시예 6: 무산소성 운동수행능력 측정 방법
무산소성 운동수행능력의 판단 기준으로 평균 파워를 측정하기 위해 자전거 에르고 미터를 이용한 간헐적 부하운동을 탈진(all-out)될 때까지 반복적으로 지속시켰다. 무산소성 파워 측정 (Wingate test)의 컴퓨터 모니터 상에서 페달링 운동속도가 300 rpm 이하로 5초 이상 저하될 경우 운동을 중지시키고, 이 때까지의 시간을 초단위로 계측해서 운동지속시간으로 결정하였다. 30분 동안 휴식(1세트)한 다음 같은 방법으로 반복적인 운동을 하였다. 휴식의 형태는 자전거 에르고미터의 안장에 앉아 정적인 휴식을 하였다.
도 9에 나타난 바와 같이 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM) 경구투여 이후 실시된 두차례의 무산소성 능력테스트에서 두 번 모두 8.7% 및 13.7%의 스피드 증가가 관찰되었으며, 도 10에 나타난 바와 같이 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 경구투여 이후의 무산소성 평균파워는 각각 9.2% 및 16.8% 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 7: 운동성 향상 실험 설계 및 트레드밀 운동량 측정 방법
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 운동성 향상 효능에 대한 평가를 실시하였다. 본 실험에서는 17개월령 마우스 12마리(멸균 증류수 음용군(SDW): 6마리, OligoM 음용군(OligoM): 6마리)를 대상으로 하였다. 실험기간은 총 18주로 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올라고당 섭취가 노령 쥐의 운동능력 개선을 트레드밀 운동량 측정을 통하여 조사하였다. 실험 실시에 앞서 환경 적응을 위하여 모든 쥐를 1주일 동안 실험 케이지에 순응시켰다. 대조집단인 멸균 증류수 음용군(n=6, SDW)과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용군(n=6, OligoM)으로 구분하여 사육용 케이지에 3마리씩 넣어 사육하였다. 운동그룹의 경우 실험 시작 4주 이후부터 14주간 자유 트레드밀 운동을 실시하였다. 모든 마우스는 멸균사료 및 멸균 음용수를 자유롭게 섭취하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 섭취는 매주 200 ppm 농도의 음용수를 자유 섭취하도록 하였다.
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 자유섭취의 이후, 소형 동물용 트레드밀을 이용하여 자유롭게 운동을 할 수 있도록 하였다. 각 그룹별 트레드밀 회전수를 주별 측정하여, 개체별 총 운동 거리를 계산하였다(표 1).
weeks SDW OligoM
1 1.888982 2.641536
2 1.667214 3.815896
3 2.767784 4.39533
4 3.764986 4.341866
5 2.848022 3.777922
6 3.640014 3.735512
7 3.250758 4.327129
8 2.385186 3.838127
9 2.49025 3.987842
10 2.900418 4.370315
11 2.582273 4.456916
12 2.951631 5.369557
13 2.695062 5.608134
14 2.795259 6.029962
도 11에 나타난 바와 같이 운동 18주 경과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 식이한 OligoM 그룹에서 평균 6.0299 km/day, 멸균 증류수 음용그룹에서 평균 2.6415 km/day 운동량을 나타냈다. 따라서 OligoM 그룹에서 멸균 증류수 음용그룹 대비 일 평균 운동량이 2.28배 증가함을 확인 하였다.
따라서 상기 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 운동보충제 조성물이 무산소성 운동수행능력 향상을 위하여 에너지 공급원을 원활하게 공급해주며, 짧은 휴식시간과 높은 에너지를 요구하는 운동 경기에서 운동보충제로 활용 될 수 있는 조성물을 신규하게 발명하였다.
실시예 8: PGC-1a의 mRNA 발현 평가
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 PGC-1a의 상위조절자인 AMPK의 인산화를 촉진함이 확인됨에 따라 PGC-1a의 발현을 mRNA 수준에서 확인해 보고자 하였다.
MCF-7 세포는 10%의 우태아혈청, 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/ml) 및 1% 소 인슐린이 포함된 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에 배양하여 PGC-1a 발현양을 측정하기 위한 세포모델로 사용하였다. MCF-7세포에 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (0.1 mg/ml, OligoM)과 에스트라디올 (10 nM, E2)를 48시간 처리 후 GeneJET RNA 정제 키트 방법에 따라 RNA 추출 후 cDNA를 합성하여 PGC-1a의 발현양을 실-시간 PCR으로 확인하였다. 도 12에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 처리 하여 PGC-1a의 mRNA 발현을 확인한 결과 무처리구 대비 64배 발현을 유도하였으며 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당과 에스트라디올을 동시 처리한 경우(E2+OligoM) 128.33배 증가하여 에스트라디올 단독 처리 실험구(E2) 대비 5.8배 발현이 증가하였다. 항골다공증(anti-osteoporotic)의 주요 타켓 중 하나로 ERRa(estrogen-related receptor)은 조골세포의 분화를 상승시켜 골다공증 치료제로 사용된다. PGC-1a은 전사 인자인 ERRa의 활성화 시켜 핵 내 DNA 코딩된 미토콘드리아 단백질의 발현을 증가시킨다. ERRa의 조절자로 작용하는 PGC-1a의 발현이 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당에 의해 증가되는것을 확인하였다.
실시예 9: 골다공증 치료 실험 설계 및 방법
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 골다공증 치료 효능에 대한 평가를 실시하였다. 본 실험에서는 1개월령 마우스 12마리[자성, 대조군(1M SDW): 6마리, 실험군(1M OligoM): 6마리), 17개월령 마우스 24마리(자성, 대조군(18M SDW): 6마리, 실험군(18M OligoM): 6마리, 운동대조군(18M SDW_Exer): 6마리, 운동실험군(18M OligoM Exer): 6마리]를 대상으로 하였다. 실험기간은 총 12주로 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올라고당 섭취가 노령 쥐의 골다공증 개선에 미치는 영향을 CT 촬영을 통하여 조사하였다. 실험 실시에 앞서 환경 적응을 위하여 모든 쥐를 1주일 동안 실험 케이지에 순응시켰다. 대조집단인 증류수 음용군(n=18, SDW)과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용군(n=18, OligoM)으로 구분하여 사육용 케이지에 3마리씩 넣어 사육하였다. 운동그룹의 경우 실험 시작 4주 이후부터 8주간 자유 트레드밀 운동을 실시하였다. 모든 마우스는 멸균사료 및 멸균 음용수를 자유롭게 섭취하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 섭취는 매주 200 ppm 농도의 음용수를 자유 섭취하도록 하였다.
실시예 10: 조직형태계측학적 분석 방법
골밀도(Bone Mineral density)측정
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 자유섭취 이후, 각 개체별 흡입 마취 하여 마이크로 CT의 X선 카메라 장치를 이용하여 용적 당 골량을 측정하였다. 도 14에 나타난 바와 같이 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 식이한 1M OligoM, 18M OligoM 및 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 식이와 운동을 병행한 18M OligoM Exer에서 각각 대퇴골의 골밀도가 증가하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 식이한 1M OligoM, 18M OligoM 및 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 식이와 운동을 병행한 18M OligoM Exer에서 각각 정강이의 골밀도가 증가하였다.
도 15, 16 및 17에 나타난 바와 같이, 각 개체별 흡입 마취하여 마이크로 CT의 X선 카메라 장치를 이용하여 촬영한 대퇴골의 단면 모습이다. 도 15는 일반 사료 급이에 따른 17개월 노령쥐의 대퇴골 단면 이미지를 나타내며, 도 16은 일반 사료 급이 및 운동에 따른 노령쥐의 대퇴골 단면 이미지이다. 도 17은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용 섭취와 운동에 따른 노령쥐의 대퇴골의 단면 이미지를 나타낸다. 일반 사료 급이에 따른 대퇴골의 단면 이미지 대비 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 음용 섭취와 운동에 따른 대퇴골의 단면이미지가 섬유주(trabecular)의 증가를 나타낸다.
실시예 11: 노령 마우스에서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 투여 실험실시
노령 쥐는 생후 1개월령 및 17개월령 수컷 C57BL/6J을 한국기초과학지원연구원에서 구입하여 사육환경은 온도 20±2℃, 상대습도는 50±10%이며 명암주기는 1일 12시간으로 조절하여 1주 동안 적응 기간 후 무작위로 3 마리씩 대조구와 실험구로 나누어 그룹을 1개월령과 17개월 별 그룹을 선정하였다. 실험구는 공급하는 물에 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.2 mg/ml 농도로 공급하였으며, 대조구는 물만 공급하여 10주 동안 실험을 진행하였다. 실험 종료 후 마우스는 해부하여 장내 내용물을 분리하여 200 mg을 취하여 Fast DNA SPIN 키트(for Soil kit)를 이용하여 DNA를 키트에 제시된 방법을 토대로 순수한 DNA를 확보하고, 추출한 DNA의 농도와 순도를 확인하기 위해서 나노드롭을 활용하여 측정한 후, 아가로스겔 전기영동을 통해 추출된 DNA 밴드 결과를 토대로 DNA 농도와 순도를 확인하였다. 분리된 DNA 내 세균의 16S rRNA 유전자 증폭을 위하여 세균에 특이적으로 결합하는 V1-V3 초가변영역(hypervariable region)을 포함하는 27F 정방향 프라이머(5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 518R 역방향 프라이머(5'-WTTACCGCGGCTGCTGG-3')를 이용하여 94℃에서 5분 동안 초기 변성시키고, 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분 30초로 30회 반복하여 증폭 PCR을 수행 후 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen, Germany)를 통해 정제하였다. PCR 산물은 GS 주니어 티타늄 시스템(Roche, Germany) 염기서열분석기를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 진행하였으며 파이로시퀀싱에 필요한 방법과 반응들은 제조회사(Roche)의 매뉴얼에 따라 ㈜천연구소(Chunlab, Korea)에서 수행 하였다.
실시예 12: 노령 마우스에서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 투여 실험실시
실험 종료 후 실험동물의 내장 내용물을 수집 후 200 mg을 취하여 실시예 11에 기재된 방법대로 DNA를 분리하여 파이로시퀀싱을 실시하였다.
도 18 및 19에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 음용 섭취한 노령쥐의 경우 1개월령의 쥐의 장내 균총과 유사하며, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 음용 섭취하지 않은 17개월령의 쥐의 장내 균총과는 차이가 있음을 확인하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 투여한 쥐의 장내 균총의 경우, 노년기에 증가하는 대표 균총인 그람양성세균(Firmicutes)인 클로스트리디움(Clostridium) 속 균총과 락토바실러스 뉴테리(Lactobacillus reuteri)가 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 비음용구(대조군) 대비 낮은 비율로 존재함을 보였고, 프레보텔라(Prevotella) 종, 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) 등의 유익균의 증가를 확인하였다.
공지된 연구에 따르면, 노화가 진행됨에 따라 장내 균총의 불균형이 야기되고 이때 장내 미생물은 골 관련 치주염, 관절염, 골다공증을 야기하며, 장내 미생물이 숙주의 골량을 조절하고, 이는 파골세포가 조절하는 골 흡수에 영향을 줄 수 있다고 알려져 있다.
따라서 상기 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 골다공증 치료용 조성물이 골을 생성하는 조골세포의 활성을 촉진시켜주며 파골세포의 활성을 억제시키는 자연노화에 따른 골다공증 치료제로 활용될 수 있는 조성물을 신규 발명하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 제1서열 및 제2서열은 각각 AlyDW11의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열이고, 서열목록 제3서열 및 제4서열은 각각 Aly3의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열이며, 서열목록 제5서열 및 제6서열은 각각 Aly5의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열이다.

Claims (16)

  1. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 내지 20 단당(monosacharride)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 폴리만뉴론산을 서열목록 제2서열, 제4서열 또는 제6서열의 아미노산 서열로 이루어진 알긴산 라이아제(alginate lyase)로 분해하여 생성된 알긴산 올리고당인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 알긴산 라이아제는 서열목록 제1서열, 제3서열 또는 제5서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(Conjugated Carbonyl Manuronic Oligosaccharide; CMOS)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 산-알칼리가수 분해에 의해 생성된 알긴산 올리고당인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 방사선 조사에 의해 생성된 알긴산 올리고당인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 100-5000 Da 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 만뉴론산(mannuronate) 및 글루론산(guluronate)의 비율이 1.2-5.0:1 몰비인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 운동능력 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 운동은 무산소운동(anaerobic exercise) 또는 유산소운동(aerobic exercise)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 조성물을 객체에 투여하는 단계를 포함하는 운동 수행 능력을 개선시키는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 골다공증 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 골다공증은 노인성 골다공증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 골다공증 개선 또는 예방용 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 13 항의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 객체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 개선, 예방 또는 치료 방법.
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