WO2017191575A1 - Portable device, method for reading authentication labels and uses thereof - Google Patents

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WO2017191575A1
WO2017191575A1 PCT/IB2017/052570 IB2017052570W WO2017191575A1 WO 2017191575 A1 WO2017191575 A1 WO 2017191575A1 IB 2017052570 W IB2017052570 W IB 2017052570W WO 2017191575 A1 WO2017191575 A1 WO 2017191575A1
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WO
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dna
membrane
sample
microtube
reaction
Prior art date
Application number
PCT/IB2017/052570
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French (fr)
Portuguese (pt)
Inventor
Newton Carlos Marcial Gomes
Vanessa JESUS OLIVEIRA
Francisco José RISO DAS COSTA COELHO
António Rogério LOPES DOS SANTOS
Original Assignee
Universidade De Aveiro
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00

Definitions

  • the present disclosure relates to a portable device and method for the specific detection of molecular labels containing deoxyribonucleic acid (DNA) molecules used in the labeling, traceability and authenticity of various materials, in particular biological, non-biological and liquid media.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Each nucleotide consists of three components: a phosphate group, a sugar and a nitrogen base.
  • a phosphate group a phosphate group
  • a sugar a sugar
  • a nitrogen base a nucleotide that is a phosphate group.
  • adenine, guanine, cytosine and thymine a nucleotide that determines their order.
  • the diversity of organisms on our planet is itself a testament to the enormous capacity of DNA to encode information.
  • the coding capacity and stability of DNA molecules means that they can be used as a means of identifying and authenticating raw or industrial materials.
  • Patent document WO 2015026254 A1 describes a method of creating a DNA molecular tag that departs from natural DNA fragments and does not require sequencing for reading.
  • US 7115301 describes various methods of encapsulating DNA in a variety of ways which, in addition to protecting and stabilizing the DNA molecule from external factors (temperature, UV), allow molecules to be incorporated into a variety of media. materials and objects.
  • US8415164 B2 describes the incorporation of a DNA marker, previously linked to an up-converting phosphate, into various inks.
  • US 20140099643 A1 describes a formulation that allows the recovery of DNA markers while maintaining the integrity of the labeled material.
  • DNA-tagged materials are a major obstacle to the popularization of DNA authentication technologies.
  • DNA amplification techniques such as polymerase chain reaction (PCR)
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA eg ethidium bromide or SYBR Green
  • SYBR Green ethidium bromide
  • US 7972820 B2 discloses the use of an isothermal nucleic acid amplification technique in which the primers and target nucleic acid are immobilized on a support, however, the use of laboratory kits and equipment and methodologies is required to perform such technology. complex.
  • EP 1609874 BI describes a pathogen screening and identification chip using specific oligonucleotide probes attached to a solid support. In this example, the use of probes for hybridization makes the process more time consuming and complex.
  • US 20140295415 A1 describes various low cost membrane-based portable devices that can be used to detect nucleic acids. However, they all require manipulation of the DNA sample using a pipette.
  • DNA is incorporated into miscellaneous objects or materials and, if the authenticity or provenance of the objects or materials needs to be verified, a DNA sample is taken from the labeled material and then analyzed in the laboratory.
  • the fact that the analysis has to be done in the laboratory makes access to the code more difficult and inhibits possible attempts to falsify it.
  • object authenticity verification needs to be hour and it is not possible to send and analyze the DNA in the laboratory.
  • the present disclosure seeks to remedy this shortcoming by describing a simple method that allows rapid analysis of the labeled and on-site sample.
  • the present disclosure relates to a device and method for detecting DNAs used in the labeling of miscellaneous objects or materials, and are referred to as DNA tags.
  • a DNA sample obtained from a labeled object or material is eluted in buffer and analyzed by an appropriate device called an indicator brush.
  • Said device comprises a number of elements, including a rod, in particular a brush-shaped rod, which may comprise a color code responsible for indicating the presence of the target DNA; one or more microtubes and a cap attached to an absorbent membrane called a cap-membrane.
  • the use of the device comprises engaging the membrane cap at one end of the rod, followed by immersing the absorbent membrane in a loop isothermal enzyme amplification (LAMP) solution and adding the DNA sample to the membrane.
  • LAMP loop isothermal enzyme amplification
  • the membrane cap is then re-fitted onto the original microtube with the absorbent membrane facing into the tube.
  • the cap-membrane microtube assembly is then incubated in a thermoblock for 30-60 min at ⁇ 60 ° C. Detection of target DNA is done by colorimetric membrane evaluation by comparing control reactions.
  • the sample referred to in the present disclosure may be any material artificially labeled with a DNA, in particular with a target DNA.
  • the present disclosure is thus in the field of technologies for traceability and authentication, with application in any kind of activity where identification of DNA molecular tags or detection of DNA-labeled materials is required.
  • the present disclosure also has application in the field of molecular diagnosis and specific detection of DNA of different species of microorganisms.
  • the loop-mediated isothermal enzymatic nucleic acid amplification (LAMP) technique is an amplification technique performed at a constant temperature and no need for a thermal cycler.
  • This technique is distinct from polymerase chain reaction (PCR) technology, as with PCR technology the reaction is carried out with an alternating series of temperature steps or cycles and the use of a thermocycler is required.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Detection of the amplification product can be determined by turbidity photometry caused by an increase in the amount of magnesium pyrophosphate precipitate in a solution as a byproduct of amplification. This allows easy viewing by the naked eye, especially for larger reaction volumes, or through simple detection of approaches for smaller volumes.
  • the reaction may be followed in real time, either by measuring turbidity or fluorescence using intercalating dyes in the DNA strand. Interspersed dye molecules directly into the DNA strand can be correlated with the number of copies initially present, so the isothermal nucleic acid enzyme amplification technique can be a qualitative and / or quantitative technique.
  • the result of the analysis is colorimetric evaluation by comparison with control reactions with and without target DNA molecules.
  • This disclosure will allow rapid authentication of DNA-labeled materials at remote locations with poor laboratory infrastructure, production points and diverse goods control areas, in particular customs checkpoints and / or mobile tax action through a device, kit, which may comprise reagents suitable for performing the loop-mediated isothermal nucleic acid enzyme amplification (LAMP) technique and a method for using said device.
  • LAMP loop-mediated isothermal nucleic acid enzyme amplification
  • LAMP loop-mediated isothermal enzyme amplification
  • DNA is incorporated into miscellaneous products, objects and / or materials and if it is necessary to verify the authenticity or provenance of the objects or materials, a DNA sample of the labeled material is taken and then analyzed in the laboratory.
  • the fact that the analysis has to be done in the laboratory makes access to the code more difficult and inhibits possible attempts to falsify it.
  • checking the authenticity of objects needs to be done on time, and it is not possible to send and analyze DNA in the laboratory.
  • the present disclosure seeks to remedy this shortcoming by describing a simple method that allows for rapid sample and on-site analysis.
  • the device comprises a brush-shaped rod containing a color code indicating the presence of target DNA and a microtube and membrane-cap containing system.
  • DNA detection begins by transferring about 1 ⁇ of the sample containing> 50 fg of target DNA into TE, in particular 50-500 fg / ⁇ with the aid of an inoculation loop. 1 ⁇ on the absorbent membrane already impregnated with the LAMP reaction solution as described in the previous step. Then the membrane is incubated inside the original microtube by coupling the membrane cap over the tube.
  • the microtube-cap-membrane assembly is transferred to a thermoblock for 30-60 min at ⁇ 60 ° C. Following incubation the presence of the molecular tag or DNA target molecule is determined by colorimetric evaluation of the absorbent membrane by comparing the results containing control reactions with and without target DNA.
  • the presence of the molecular tag or DNA target molecule is determined by comparing colorimetric evaluation of results containing control reactions with and without target DNA.
  • the present disclosure relates to a portable device for detecting a deoxyribonucleic acid from a sample comprising: a stem with a first end and a second end;
  • first rod end is capable of being handled by a user and the second rod end comprises a detachable member
  • said peelable element comprises
  • a clipping element comprising two positions wherein the first position is capable of coupling the clipping element to the second end of said rod and the second position of the clipping element is capable of coupling a porous sample and polycarbonate support membrane.
  • the porosity of the polycarbonate membrane may range from 0.05-8 ⁇ , preferably 0.2-8 ⁇ , even more preferably 1-5 ⁇ .
  • the membrane of the present disclosure may comprise a coating, in particular it may comprise a polyvinylpyrrolidone (PVP) coating wherein said coating acts as a wetting agent.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the peelable elements may be disposable.
  • the porous polycarbonate membrane may be disposable.
  • the device may further comprise a reaction indicator, in particular the blue hydroxynaphtol colorimetric indicator and other cyanine family dyes.
  • the sample may be selected from the following list: packaging surface; pharmaceutical and / or food products.
  • the present disclosure also relates to a kit comprising the device described above.
  • the word "comprises” and variations of the word are not intended to exclude other technical characteristics, other components, or steps. Additional objects, advantages and features of the disclosure will become apparent to those skilled in the art upon examination of the disclosure or may be learned by the practice of disclosure.
  • the following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present disclosure.
  • the present disclosure encompasses all possible combinations of particular or preferred embodiments described herein.
  • Fig. 1 Schematic drawing of the portable DNA tag reading device now disclosed.
  • Fig. 2B Second phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
  • Fig. 1 depicts one embodiment, in particular represents a portable device capable of detecting DNA, in particular but not restricted to non-coding DNA, used to label various materials.
  • the portable device for detecting a DNA / indicator brush (1) comprises the following elements: a rod and a disposable part (2) located at one end of said device. Said detachable part (2) is called a membrane cap and is in turn coupled to a microtube, in particular a 0.2 ml microtube (2a).
  • the membrane cap of the hand held device for detecting a DNA / indicator brush comprises in turn three distinct elements, a microtube cap-clamping zone (2b), a reaction solution absorption zone and DNA sample (2c) and a clip zone to the brush body (2d).
  • the cap is clipped to the brush tip and has a standard microtube geometry for molecular biology so that its use is universal in laboratory equipment such as a thermoblock.
  • the device may further comprise a reaction indicator (3).
  • the body of the hand held DNA detector / indicator brush (1) can thus comprise a printed color code indicating whether the test result is positive or negative, and in one embodiment the test result is positive for the test. blue and negative color to purple color. These colors should appear on the absorbent membrane at the tip of the indicator brush after the isothermal LAMP loop / LAMP reaction (3).
  • fig. 2a represents the first phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
  • fig. 2b represents the second phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
  • the present disclosure comprises a mix reaction for loop-mediated isothermal enzyme amplification (LAMP).
  • LAMP reaction is mediated by 4 different primers, used to identify regions, in particular distinct sequences of the target DNA, the target DNA being fragments of the hsp65 gene of the Mycobacterium mainum organism in one of the examples of the present disclosure.
  • the target DNA is then amplified at a constant temperature of ⁇ 60 ° C for 30-60 minutes, maximum 1 hour, depending on the amount of target DNA in the sample to be analyzed without the need to perform thermal cycling traditionally used in PCR. Due to the specific nature of the action of these primers, the amount of DNA produced in LAMP is considerably higher than conventional PCR amplification.
  • the amplification reaction medium may comprise 20 mM Tris-HCl; 10 mM KCI; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 8 mM MgSO 4 ; 0.1% (v / v) Tween 20; 0.8 M betaine and 1.4 mM dNTP mixture; 0.2 ⁇ outer primer F3 and B3; 1.6 ⁇ inner primer FIP and BIP and 8U Bst DNA polymerase or other polymerases with similar function.
  • detection of target DNA amplification is done by a colorimetric indicator, in particular the blue hydroxynaphtol colorimetric indicator (3mM).
  • a colorimetric indicator in particular the blue hydroxynaphtol colorimetric indicator (3mM).
  • 3mM blue hydroxynaphtol colorimetric indicator
  • the present disclosure comprises a portable DNA detection device containing a rod in the form of a brush handle (Fig. 1), referred to herein as an indicator brush.
  • Said brush is capable of housing at one end a detachable part referred to herein as a membrane cap [Fig. 1 (2 b, c, d)] which is in turn attached to a 0.2 ml microtube [Fig. 1 (2a)].
  • the microtube-cap-membrane assembly is clipped to the brush tip.
  • the tube has a standard 0.2 ml microtube geometry typically used in molecular biology for polymerase chain reaction (PCR). This allows its use to be universal in molecular biology laboratory equipment.
  • the membrane cap peel comprises a microtube cap with two functional faces [Fig. 1 (2b, 2c and 2d)]. Where one face holds the microtube [Fig. 1 (2b)] and extends within the outer perimeter of the tube opening. Simultaneously this same membrane cap face serves to secure the polycarbonate absorbent membrane strip from the center of the inner cover face into the microtube [Fig. 1 (2c)].
  • the other side of the membrane cap extends within the tube opening perimeter opposite the microtube [Fig. 1 (2d)] and has the function of attaching the membrane cap to one end of the indicator brush shaft (Fig. 1), thus allowing its use to remove the microtube membrane cap and manipulate the absorbent membrane during sample analysis (Fig. 2A and 2B).
  • the respective membrane is able to immobilize in its pores small volumes of the reaction solution for isothermal amplification of DNA.
  • the membrane cap also has the function of sealing the membrane inside the microtube before and during the LAMP reaction (Fig. 1.2 microtube assembly membrane cap).
  • the brush body has a printed color code that indicates whether the analysis result is positive or negative. Positive for blue and negative for purple, which should appear on the absorbent membrane at the tip of the indicator brush after the LAMP reaction (Fig. 1.3).
  • the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials is characterized by a DNA tag detection methodology which may comprise 6 steps (Fig. 2A and 2B).
  • a swab may be used for removing and collecting DNA from the surface of the DNA tagged material.
  • One end of the swab is immersed in extraction buffer, in particular an extraction buffer comprising 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA at pH8, in particular in a volume of 250 ⁇ and then the buffer wetted swab may be used to obtain smears of the DNA-labeled material.
  • preparing the indicator brush for analysis may comprise several steps, namely: i) attaching the indicator brush to the microtube-cap-membrane assembly, ii) disconnecting the membrane-cap from the microtube, iii) with the aid of Transfer the LAMP solution to the absorbent membrane by soaking it in the reaction solution, the reaction solution comprising 20 mM Tris-HCI, 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 8 mM MgSO 4 , 0.1% (v / v) Tween 20, 0.8M betaine and 1.4 mM dNTP mixture, 0.2 ⁇ outer primer F3 and B3, 1.6 ⁇ inner primer FIP and BIP, 8U Bst DNA polymerase and 3 mM blue hydroxynaphtol.
  • an aliquot, in particular ⁇ 1 ⁇ of a DNA sample may be transferred with the aid of a 1 ⁇ inoculation loop onto the absorbent membrane saturated with the LAMP
  • the cap-membrane assembly may be replaced within the original microtube by coupling the cap-membrane over said tube.
  • the microtube-cap-membrane assembly may be incubated in a thermoblock for 30-60 min at ⁇ 60 ° C.
  • the incubation time and temperature to be used may vary according to the amount of target DNA molecules and primers used in each reaction protocol, respectively.
  • the presence of the molecular tag or DNA target molecule can be determined by colorimetric evaluation of the absorbent membrane by comparing the results containing control reactions with and without target DNA.
  • the detection device of the present disclosure has a low production cost
  • the absorbent membrane needs a few microliters, in particular ⁇ 5 ⁇ for sample analysis, reducing costs compared to the expense of a conventional LAMP reaction requiring 25 ⁇ -500 ⁇ .
  • DNA labeling and use of the portable device described in the present disclosure may be performed as described herein.
  • commercial Mycobacterium marinum ATCC 927 genomic DNA was used as the target DNA.
  • the hsp65 gene has been chosen as the target for amplification as it is usually used for specific identification of Mycobacterium marinum ATCC 927.
  • the high specificity of the system developed in this disclosure allows the production and reading of authentication tags containing fragments of this low risk gene. cross-contamination (false positive). This is because Mycobacterium marinum DNA only has detectable levels via LAMP only in aquatic or animal environments.
  • primers for the LAMP technique were designed to specifically amplify fragments of the hsp65 gene of the Mycobacterium marinum species.
  • the hsp65 gene target DNA sequence was amplified by LAMP using the primers described below:
  • Seq ID No: 1 F3: 5 ' -GGACCCGTACGAGAAGATC-3 ' - outer primer or forward outer primer
  • the primers Seq ID No: 1, Seq ID No: 2, Seq ID No: 3 and Seq ID No: 4 comprise 19 bases, 18 bases, 35 bases and 34 bases, respectively. All primers referred to in the mentioned example were synthesized by IBA - Life Sciences.
  • a negative control sample in which genomic DNA was replaced with water was processed identically and in parallel as a negative control.
  • the target nucleic acid produced by the LAMP technique described above was added at a final concentration of 50 ng / ml to solvent base paint. Ten microliters of paint was added to a PVC plate. After drying, a sample was taken from the plate.
  • the DNA marker reading can be performed as follows:
  • the DNA swab is then immersed in the extraction buffer at 60 ° C for 5 minutes with an interval for sample homogenization. During this incubation period, the indicator brush is prepared for analysis of the DNA sample;
  • the indicator brush is attached to the microtube-cap-membrane assembly, then the membrane cap is disconnected from the microtube.
  • the cap-bound absorbent membrane is dipped into the LAMP reaction solution.
  • the preparation of the LAMP reaction may be performed in a final reaction volume of 25 ⁇ comprising a final concentration of 2x buffer, in particular 20 mM Tris-HCI; 10 mM KCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 8 mM MgSO 4 ; 0.1% (v / v) Tween 20; 0.8 M betaine and 1.4 mM dNTP mixture; 0.2 ⁇ outer primer F3 and B3; 1.6 ⁇ inner primer FI P and BIP and 8U Bst DNA polymerase:
  • Step 6 Incubate the microtube-cap-membrane assembly in a thermoblock for 60 min at 64 ° C. Following incubation the presence of the molecular tag or DNA target molecule is determined by colorimetric evaluation of the absorbent membrane by comparing the results containing control reactions with and without target DNA.
  • nucleic acid detection can be done using the hydroxynaphtol blue dye among other dyes of the cyanine family.
  • Outer primer or backward outer primer B3 5 ' -CTCCTTGGTCTGACCTCT-3 ' [Seq ID No: 2]
  • Inner Primer or Backward Inner Primer BIP 5 ' - TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3 ' [Seq ID No: 4]

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Abstract

The present disclosure relates to a portable device for detecting deoxyribonucleic acid in a sample. The present device comprises the following components: a rod and a disposable part located at one end of the device. The disposable part, a membrane lid, is in turn coupled to a microtube, for example. The membrane lid of the portable DNA-detecting device/indicator brush in turn comprises three distinct components: a zone for clipping the lid to the microtube, a zone for absorbing the reaction solution and the DNA sample, and a zone for clipping to the brush body. The device further comprises a reaction indicator. The present disclosure also relates to a method for specifically detecting molecular labels containing deoxyribonucleic acid molecules used for labelling, tracking and verifying the authenticity of various materials, in particular biological and non-biological materials and liquid media.

Description

D E S C R I Ç Ã O  DESCRIPTION
DISPOSITIVO PORTÁTIL, MÉTODO PARA LEITURA DE ETIQUETAS DE AUTENTICAÇÃO E PORTABLE DEVICE, METHOD FOR READING AUTHENTICATION LABELS AND
SEUS USOS  YOUR USES
Domínio técnico Technical Domain
[0001] A presente divulgação refere-se a um dispositivo portátil e a um método para deteção específica de etiquetas moleculares contendo moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) utilizadas na marcação, rastreabilidade e autenticidade de diversos materiais, em particular materiais biológicos, não biológicos e meios líquidos. A presente divulgação insere-se assim, no domínio das tecnologias para rastreabilidade e autenticação, com aplicação em qualquer tipo de atividade em que seja necessário a identificação de materiais marcados com ADN. The present disclosure relates to a portable device and method for the specific detection of molecular labels containing deoxyribonucleic acid (DNA) molecules used in the labeling, traceability and authenticity of various materials, in particular biological, non-biological and liquid media. The present disclosure is thus in the field of technologies for traceability and authentication, applicable to any type of activity where identification of DNA-labeled materials is required.
Antecedentes Background
[0002] A entrada de produtos falsificados nas cadeias de abastecimento está a ganhar proporções nunca antes registadas, com consequências alarmantes nas receitas de empresas e na saúde e segurança de consumidores em todo o mundo. Existe, assim, uma necessidade crescente de tecnologias inovadoras que permitam combater a contrafação e proteger a população contra produtos contrafeitos e adulterados. Atualmente estão amplamente implementados vários sistemas de autenticação de produtos e certificação de sua origem. Os mais comuns recorrem à utilização de etiquetas adesivas com ou sem códigos de barras e etiquetas eletrónicas com identificação por radio-frequência (RFID). No entanto as várias técnicas de contrafação têm experimentado uma rápida evolução tornando desta forma vulneráveis os métodos tradicionais de autenticação. Em resposta a esse fenómeno, a utilização de ADN na autenticação de materiais diversos constitui uma alternativa inovadora e revolucionária aos métodos tradicionais. O ADN é considerado o "padrão-ouro" de testes forenses, e é uma ferramenta fundamental para a justiça criminal. O ADN é um polímero formado por nucleotídeos. Cada nucleotídeo é constituído por três componentes: um grupo fosfato, um açúcar e uma base azotada. Existem quatro tipos de nucleotídeos diferentes no ADN (adenina, guanina, citosina e timina), em que a informação codificada nos genomas de organismos vivos determina a sua ordem. A diversidade de organismos no nosso planeta é uma prova por si só da enorme capacidade do ADN de codificar informação. De fato, a capacidade codificadora e a estabilidade das moléculas de ADN faz com que estas possam ser utilizadas como forma de identificação e autenticação de matérias-primas ou industriais. The entry of counterfeit goods into supply chains is gaining unprecedented proportions, with alarming consequences for business revenues and the health and safety of consumers worldwide. There is thus a growing need for innovative technologies to combat counterfeiting and to protect the population from counterfeit and adulterated products. Several product authentication systems and certification of their origin are now widely implemented. The most common are the use of bar-coded or non-barcode adhesive labels and radio frequency identification (RFID) electronic labels. However, the various counterfeiting techniques have undergone a rapid evolution making the traditional authentication methods vulnerable. In response to this phenomenon, the use of DNA for authentication of diverse materials is an innovative and revolutionary alternative to traditional methods. DNA is considered the "gold standard" of forensic testing, and is a key tool for criminal justice. DNA is a polymer made up of nucleotides. Each nucleotide consists of three components: a phosphate group, a sugar and a nitrogen base. There are four different nucleotide types in DNA. (adenine, guanine, cytosine and thymine), where information encoded in the genomes of living organisms determines their order. The diversity of organisms on our planet is itself a testament to the enormous capacity of DNA to encode information. In fact, the coding capacity and stability of DNA molecules means that they can be used as a means of identifying and authenticating raw or industrial materials.
[0003] O documento de patente WO 2015026254 Al descreve um método de criação de uma etiqueta molecular de ADN que parte de fragmentos de ADN natural e não necessita de sequenciação para a sua leitura. Por sua vez, o documento de patente US7115301 descreve vários métodos de encapsulamento de ADN numa variedade de meios, que além de protegerem e estabilizarem a molécula de ADN face à fatores externos (temperatura, UV), permitem que as moléculas sejam incorporadas numa variedade de materiais e objetos. O documento de patente US8415164 B2 descreve a incorporação de um marcador de ADN, previamente ligado a um "up-converting phos- phor" , em várias tintas. O documento US 20140099643 Al descreve uma formulação que permite a recuperação dos marcadores de ADN mantendo a integridade do material marcado. Patent document WO 2015026254 A1 describes a method of creating a DNA molecular tag that departs from natural DNA fragments and does not require sequencing for reading. US 7115301, in turn, describes various methods of encapsulating DNA in a variety of ways which, in addition to protecting and stabilizing the DNA molecule from external factors (temperature, UV), allow molecules to be incorporated into a variety of media. materials and objects. US8415164 B2 describes the incorporation of a DNA marker, previously linked to an up-converting phosphate, into various inks. US 20140099643 A1 describes a formulation that allows the recovery of DNA markers while maintaining the integrity of the labeled material.
[0004] No entanto, a falta de um sistema de deteção expedito, simples e seguro de materiais marcados por ADN constitui o principal obstáculo para a popularização das tecnologias de autenticação por ADN. Atualmente, muitas destas técnicas de amplificação de ADN, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), necessitam de material laboratorial específico e dispendioso para a amplificação e de métodos elaborados e complexos para visualização dos produtos amplificados, como o uso de agentes fluorescentes intercalantes de ADN (como por exemplo brometo de etídio ou SYBR Green) adicionados em gel de agarose antes ou depois da eletroforese. However, the lack of an expeditious, simple and secure detection system for DNA-tagged materials is a major obstacle to the popularization of DNA authentication technologies. Today, many of these DNA amplification techniques, such as polymerase chain reaction (PCR), require expensive and specific laboratory material for amplification and elaborate and complex methods for visualizing amplified products, such as the use of intercalating fluorescent agents. DNA (eg ethidium bromide or SYBR Green) added on agarose gel before or after electrophoresis.
[0005] Outras técnicas têm vindo a ser desenvolvidas para a deteção de sequências de ácidos nucleicos amplificadas, tais como, adição de fluoróforos aos "primers" ou iniciadores para posterior deteção do produto amplificado por polarização fluorescente. Other techniques have been developed for the detection of amplified nucleic acid sequences, such as adding fluorophores to primers or primers for further detection of the amplified product by fluorescent polarization.
[0006] Também o uso de reações de hibridização de ADN-ADN através de sondas que consistem em sequências de ADN de fita simples específicas tem vindo a ser amplamente difundidas com o desenvolvimento de suportes de fácil uso. Contudo, para deteção das sequências de ADN alvo, as sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas ou moléculas quimioluminiscentes o que leva à necessidade de equipamentos dispendiosos para a deteção do resultado. Outra grande desvantagem do uso de sondas é a baixa sensibilidade da técnica e a reduzida eficácia em concentrações baixas de ADN alvo. Also the use of DNA-DNA hybridization reactions through probes consisting of specific single-stranded DNA sequences has been widespread with the development of user-friendly supports. However, for For detection of target DNA sequences, probes are labeled with radioisotopes, enzymes, or chemiluminescent molecules, leading to the need for expensive equipment to detect the result. Another major disadvantage of using probes is the low sensitivity of the technique and the low efficacy at low target DNA concentrations.
[0007] Geralmente no contexto de diagnóstico a utilização de micropipetas não é problemática, uma vez que os técnicos de saúde possuem, em regra, experiência na manipulação destes instrumentos. No contexto da autenticação, a utilização deste instrumento por um profissional não habilitado pode constituir uma barreira à deteção da etiqueta molecular. O documento de patente US 7972820 B2 divulga a utilização de uma técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos em que os iniciadores e o ácido nucleico alvo são imobilizados num suporte, contudo para execução dessa tecnologia é necessário o uso de kits e equipamento de laboratório e metodologias complexas. A patente EP 1609874 BI, descreve um chip para pesquisa e identificação de patógenos, que utiliza sondas de oligonucleótidos específicas ligadas a um suporte sólido. Neste exemplo, a utilização de sondas para a hibridização torna o processo mais moroso e complexo. O documento de patente US 20140295415 Al descreve vários dispositivos portáteis de baixo custo baseados em membranas que podem ser utilizados para detetar ácidos nucleicos. No entanto todos eles requerem a manipulação da amostra de ADN com recurso a uma pipeta. Generally in the context of diagnostics the use of micropipettes is not problematic as health care professionals are generally experienced in handling these instruments. In the context of authentication, the use of this instrument by an unqualified professional may constitute a barrier to molecular label detection. US 7972820 B2 discloses the use of an isothermal nucleic acid amplification technique in which the primers and target nucleic acid are immobilized on a support, however, the use of laboratory kits and equipment and methodologies is required to perform such technology. complex. EP 1609874 BI describes a pathogen screening and identification chip using specific oligonucleotide probes attached to a solid support. In this example, the use of probes for hybridization makes the process more time consuming and complex. US 20140295415 A1 describes various low cost membrane-based portable devices that can be used to detect nucleic acids. However, they all require manipulation of the DNA sample using a pipette.
[0008] Estes documentos ilustram o problema técnico a resolver pela presente divulgação. These documents illustrate the technical problem to be resolved by the present disclosure.
Descrição geral General description
[0009] Recentemente a utilização de ADN para marcação de produtos tem vindo a ser utilizada por várias empresas. O ADN é incorporado em objetos ou materiais diversos e, caso seja necessário verificar a autenticidade ou proveniência dos objetos ou matérias, é recolhida uma amostra do ADN do material marcado que é em seguida analisada em laboratório. O fato da análise ter que ser feita em laboratório torna mais difícil o acesso ao código e inibe possíveis tentativas de falsificação do mesmo. No entanto, em algumas áreas de atividade, a verificação da autenticidade de objetos necessita de ser feita na hora, não sendo possível o envio e análise do ADN em laboratório. A presente divulgação procura suprimir essa falha, descrevendo um método simples que permite uma análise rápida da amostra marcada e no local. Recently the use of DNA for product labeling has been used by several companies. DNA is incorporated into miscellaneous objects or materials and, if the authenticity or provenance of the objects or materials needs to be verified, a DNA sample is taken from the labeled material and then analyzed in the laboratory. The fact that the analysis has to be done in the laboratory makes access to the code more difficult and inhibits possible attempts to falsify it. However, in some areas of activity, object authenticity verification needs to be hour and it is not possible to send and analyze the DNA in the laboratory. The present disclosure seeks to remedy this shortcoming by describing a simple method that allows rapid analysis of the labeled and on-site sample.
[0010] A presente divulgação refere-se a um dispositivo e a um método para deteção de ADNs utilizados na marcação de objetos ou materiais diversos, sendo denominados de etiquetas de ADN. Uma amostra de ADN obtida de um objeto ou material marcado é eluída em tampão e analisada por um dispositivo apropriado denominado por pincel indicador. The present disclosure relates to a device and method for detecting DNAs used in the labeling of miscellaneous objects or materials, and are referred to as DNA tags. A DNA sample obtained from a labeled object or material is eluted in buffer and analyzed by an appropriate device called an indicator brush.
[0011] O referido dispositivo compreende vários elementos, entre os quais uma haste, em particular uma haste na forma de pincel, que pode compreender um código de cor responsável por indicar a presença do ADN alvo; um ou mais microtubos e ainda uma tampa ligada a uma membrana absorvente denominada tampa-membrana. Said device comprises a number of elements, including a rod, in particular a brush-shaped rod, which may comprise a color code responsible for indicating the presence of the target DNA; one or more microtubes and a cap attached to an absorbent membrane called a cap-membrane.
[0012] A utilização do dispositivo compreende o encaixe da tampa-membrana numa das extremidades da haste, seguido da imersão da membrana absorvente numa solução de amplificação enzimática isotérmica por loop (LAMP) e adição da amostra de ADN na membrana. A tampa-membrana é então encaixada novamente sobre o microtubo original com a membrana absorvente voltada para dentro do tubo. O conjunto microtubo tampa-membrana é então incubado num termobloco durante 30-60 min a ~60 °C. A deteção do ADN alvo é feita a partir da avaliação colorimétrica da membrana através da comparação de reações controlo. The use of the device comprises engaging the membrane cap at one end of the rod, followed by immersing the absorbent membrane in a loop isothermal enzyme amplification (LAMP) solution and adding the DNA sample to the membrane. The membrane cap is then re-fitted onto the original microtube with the absorbent membrane facing into the tube. The cap-membrane microtube assembly is then incubated in a thermoblock for 30-60 min at ~ 60 ° C. Detection of target DNA is done by colorimetric membrane evaluation by comparing control reactions.
[0013] A amostra referida na presente divulgação pode ser qualquer material artificialmente marcado com um ADN, em particular com um ADN alvo. The sample referred to in the present disclosure may be any material artificially labeled with a DNA, in particular with a target DNA.
[0014] A presente divulgação insere-se, assim, no domínio das tecnologias para rastreabilidade e autenticação, com aplicação em qualquer tipo de atividade em que seja necessária a identificação de etiquetas moleculares de ADN ou deteção de materiais marcados com ADN. A presente divulgação também tem aplicação na área de diagnóstico molecular e deteção especifica de ADN de diferentes espécies de microrganismos. The present disclosure is thus in the field of technologies for traceability and authentication, with application in any kind of activity where identification of DNA molecular tags or detection of DNA-labeled materials is required. The present disclosure also has application in the field of molecular diagnosis and specific detection of DNA of different species of microorganisms.
[0015] A técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos mediada por loop (LAMP) é uma técnica de amplificação realizada a uma temperatura constante e sem necessidade de recurso a um termociclador. Esta técnica é distinta da tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR), uma vez que com a tecnologia de PCR a reação é levada a cabo com uma série alternada de passos de temperatura ou ciclos e é necessário a utilização de um termociclador. The loop-mediated isothermal enzymatic nucleic acid amplification (LAMP) technique is an amplification technique performed at a constant temperature and no need for a thermal cycler. This technique is distinct from polymerase chain reaction (PCR) technology, as with PCR technology the reaction is carried out with an alternating series of temperature steps or cycles and the use of a thermocycler is required.
[0016] Com a técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos mediada por loop (LAMP) a sequência alvo é amplificada a uma temperatura constante de 60 - 65 °C, utilizando dois ou três conjuntos de iniciadores/primers/oligonucleotideos e uma polimerase com atividade de deslocamento (liberação de um ADN de fita única) elevada em adição a uma atividade de replicação. Tipicamente, 4 iniciadores diferentes são utilizados para identificar regiões distintas no gene-alvo, o que aumenta significativamente a especificidade dessa técnica. Um par adicional de iniciadores "loop" pode acelerar ainda mais a reação. Devido à natureza específica da ação destes iniciadores, a quantidade de ADN produzida em LAMP é consideravelmente mais elevada do que a amplificação baseada em PCR. With the loop-mediated isothermal enzymatic nucleic acid amplification (LAMP) technique, the target sequence is amplified at a constant temperature of 60 - 65 ° C using two or three primer / oligonucleotide sets and a polymerase with high displacement activity (single stranded DNA release) in addition to replication activity. Typically, 4 different primers are used to identify distinct regions in the target gene, which significantly increases the specificity of this technique. An additional pair of loop initiators can further accelerate the reaction. Due to the specific nature of the action of these primers, the amount of DNA produced in LAMP is considerably higher than PCR based amplification.
[0017] A deteção do produto de amplificação pode ser determinada por meio de fotometria de turvação causada por um aumento da quantidade de precipitado de pirofosfato de magnésio numa solução, como um subproduto da amplificação. Isto permite fácil visualização pelo olho nu, especialmente para os volumes de reação maiores, ou através da deteção simples de abordagens para volumes menores. A reação pode ser seguida em tempo real, quer por medição da turbidez, quer por fluorescência utilizando corantes intercalantes na cadeia de ADN. As moléculas de corante intercaladas diretamente na cadeia de ADN podem ser correlacionadas com o número de cópias inicialmente presentes, pelo que a técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos pode ser uma técnica qualitativa e/ou quantitativa. Detection of the amplification product can be determined by turbidity photometry caused by an increase in the amount of magnesium pyrophosphate precipitate in a solution as a byproduct of amplification. This allows easy viewing by the naked eye, especially for larger reaction volumes, or through simple detection of approaches for smaller volumes. The reaction may be followed in real time, either by measuring turbidity or fluorescence using intercalating dyes in the DNA strand. Interspersed dye molecules directly into the DNA strand can be correlated with the number of copies initially present, so the isothermal nucleic acid enzyme amplification technique can be a qualitative and / or quantitative technique.
[0018] A presente divulgação compreende um dispositivo e um método que permite detetar, no local, sequências de ADN específicas de etiquetas moleculares usadas na autenticação de materiais diversos. A deteção das etiquetas de ADN é feita através da técnica de amplificação enzimática isotérmica LAMP, em pequenos volumes de reagente, por exemplo entre 4-6 μΙ de volume e sem a necessidade de equipamentos sofisticados de biologia molecular. [0019] Numa forma de realização, a reação ocorre sobre uma membrana absorvente e porosa de policarbonato, de preferência uma membrana de policarbonato com uma porosidade compreendida entre 0,05-8 μιη, de preferência 0,2-8 μιη, ainda mais de preferência 1-5 μιη. Para melhores resultados, a referida membrana pode ainda compreender um revestimento de polivinilpirrolidona (PVP). The present disclosure comprises a device and method for detecting, on site, molecular tag-specific DNA sequences used in the authentication of miscellaneous materials. Detection of DNA tags is done by the LAMP isothermal enzyme amplification technique in small reagent volumes, for example between 4-6 μΙ volume and without the need for sophisticated molecular biology equipment. In one embodiment, the reaction takes place on a porous absorbent polycarbonate membrane, preferably a polycarbonate membrane having a porosity of 0.05-8 μιη, preferably 0.2-8 μιη, even more than preferably 1-5 μιη. For best results, said membrane may further comprise a polyvinylpyrrolidone (PVP) coating.
[0020] Numa forma de realização, o resultado da análise consiste na avaliação colorimétrica através da comparação com reações controle com e sem moléculas de ADN alvo. In one embodiment, the result of the analysis is colorimetric evaluation by comparison with control reactions with and without target DNA molecules.
[0021] A presente divulgação irá permitir a rápida autenticação de materiais marcados com ADN em locais remotos com pouca infraestrutura laboratorial, pontos de produção e áreas de controlo de mercadorias diversas, em particular pontos de fiscalização alfandegária e/ou ação fiscal móvel através de um dispositivo, kit, que pode compreender reagentes adequados para a realização da técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos mediada por loop (LAMP) e um método para utilização do referido dispositivo. [0021] This disclosure will allow rapid authentication of DNA-labeled materials at remote locations with poor laboratory infrastructure, production points and diverse goods control areas, in particular customs checkpoints and / or mobile tax action through a device, kit, which may comprise reagents suitable for performing the loop-mediated isothermal nucleic acid enzyme amplification (LAMP) technique and a method for using said device.
[0022] O recurso a técnicas de amplificação de ADN utilizando enzimas isotérmicas, tal como a técnica de amplificação enzimática isotérmica mediada por loop (LAMP), tem sido amplamente difundida como uma alternativa prática e relativamente fácil de executar na deteção de marcadores genéticos, em particular moléculas de ADN. Uma das grandes vantagens do LAMP é a possibilidade de monitorização rápida, por exemplo cerca de 1 hora, e em tempo real dos produtos obtidos, em particular os produtos que resultam da amplificação de fragmentos da molécula de ADN alvo através de um marcador colorimétrico e sem recurso a instrumentos de laboratório caros e cuja utilização requer experiência. Essa tecnologia requer apenas um banho de água ou banho seco, em particular um termobloco e micropipetas para manuseio das soluções de reação. Possui ainda a vantagem de ser uma tecnologia de elevada especificidade e sensibilidade. Contudo, em geral, apesar da sua simplicidade, a tecnologia LAMP tem vindo a ser utilizada sobretudo na deteção de agentes patogénicos e diagnóstico de doenças, em ambiente académico ou em ambiente hospitalar. Sendo ainda muito dependente de micropipetas automáticas e materiais para biologia molecular livres de contaminação e condições assépticas para manipulação dos reagentes (LAMP mix de reação). Além disso os reagentes para a reação de LAMP são significativamente mais caros do que os reagentes convencionais usados para amplificação por PCR. Alternativamente, com o desenvolvimento da tecnologia microfluídica, é possível a simplificação da utilização dessa tecnologia e diminuição dos custos devido à necessidade de quantidades mínimas de reagentes para amplificação enzimática de amostras de ADN. Contudo muitas destas técnicas usam sondas ou fluoróforos que necessitam posteriormente de equipamento de laboratório para leitura de resultados. Mesmo os já desenvolvidos para técnicas de amplificação de ADN utilizando enzimas isotérmicas necessitam de micropipetas, equipamentos específicos, consumíveis de biologia molecular para manipulação da amostra, em particular pontas, reagentes para extração e purificação de ADN. The use of DNA amplification techniques using isothermal enzymes, such as the loop-mediated isothermal enzyme amplification (LAMP) technique, has been widespread as a practical and relatively easy alternative to detect genetic markers, in particular. particular DNA molecules. One of the great advantages of LAMP is the possibility of rapid monitoring, for example about 1 hour, and in real time of the products obtained, in particular those products resulting from the amplification of fragments of the target DNA molecule through a colorimetric marker and without expensive laboratory instruments, the use of which requires experience. This technology requires only a water bath or a dry bath, in particular a thermoblock and micropipettes for handling reaction solutions. It also has the advantage of being a technology of high specificity and sensitivity. However, in general, despite its simplicity, LAMP technology has been used primarily for pathogen detection and disease diagnosis in the academic or hospital environment. Still being highly dependent on automated micropipettes and contamination-free molecular biology materials and aseptic conditions for reagent handling (LAMP mix of reaction). Furthermore, reagents for the LAMP reaction are significantly more expensive than conventional reagents used for PCR amplification. Alternatively, with the development of microfluidic technology, it is possible to simplify the use of microfluidic technology and reduce costs due to the need for minimal quantities of reagents for enzymatic amplification of DNA samples. However many of these techniques use probes or fluorophores that subsequently require laboratory equipment to read results. Even those already developed for DNA amplification techniques using isothermal enzymes require micropipettes, specific equipment, molecular biology consumables for sample manipulation, in particular, DNA extraction and purification reagents.
[0023] As soluções atualmente existentes requerem que o operador possua alguma experiência ou treino na manipulação de pipetas e/ou outro material sofisticado. Geralmente no contexto de diagnóstico a utilização de micropipetas não é problemática, uma vez que os técnicos de saúde possuem, em regra, experiência na manipulação destes instrumentos. No contexto da autenticação, a utilização deste instrumento por um profissional não habilitado pode constituir uma barreira à deteção da etiqueta molecular. Currently existing solutions require the operator to have some experience or training in handling pipettes and / or other sophisticated material. Generally in the context of diagnosis the use of micropipettes is not problematic, since health technicians usually have experience in manipulating these instruments. In the context of authentication, the use of this instrument by an unqualified professional may constitute a barrier to molecular label detection.
[0024] Recentemente a utilização de ADN para marcação de produtos, objetos e/ou materiais diversos tem vindo a ser utilizada por várias empresas. O ADN é incorporado em produtos, objetos e/ou materiais diversos e caso seja necessário verificar a autenticidade ou proveniência dos objetos ou matérias é recolhida uma amostra do ADN do material marcado que é em seguida analisada em laboratório. O fato da análise ter que ser feita em laboratório torna mais difícil o acesso ao código e inibe possíveis tentativas de falsificação do mesmo. No entanto, em algumas áreas de atividade, a verificação da autenticidade de objetos necessita de ser feita na hora, não sendo possível o envio e análise do ADN em laboratório. A presente divulgação procura suprimir essa falha, descrevendo um método simples que permite uma análise rápida da amostra e no local. Recently the use of DNA for marking various products, objects and / or materials has been used by various companies. DNA is incorporated into miscellaneous products, objects and / or materials and if it is necessary to verify the authenticity or provenance of the objects or materials, a DNA sample of the labeled material is taken and then analyzed in the laboratory. The fact that the analysis has to be done in the laboratory makes access to the code more difficult and inhibits possible attempts to falsify it. However, in some areas of activity, checking the authenticity of objects needs to be done on time, and it is not possible to send and analyze DNA in the laboratory. The present disclosure seeks to remedy this shortcoming by describing a simple method that allows for rapid sample and on-site analysis.
[0025] As áreas de atividade em que a presente divulgação pode ser utilizada são, por exemplo, as seguintes áreas: indústria alimentar, embalagens e farmacêutica. [0026] Na presente divulgação uma zaragatoa pode ser utilizada para recolher uma amostra, em particular uma amostra de ADN de um material marcado, em particular da superfície do material marcado. Inicialmente uma extremidade da referida zaragatoa pode ser imersa num tampão de extração, em particular um tampão de extração que compreende Tris-HCI e EDTA (TE) pH8. A zaragatoa humedecida com tampão é então usada para obtenção de um esfregaço do material marcado e em seguida o ADN removido é dissolvido em tampão TE, pré-aquecido em termobloco, em particular a 60°C e colocado durante 5 min a 60 °C. Durante o período de incubação, inicia-se a preparação do dipositivo de deteção de moléculas de ADN alvo denominado na presente divulgação como pincel indicador. O dispositivo compreende uma haste na forma de pincel contendo um código de cor indicador da presença do ADN alvo e um sistema contendo microtubo e tampa-membrana. Areas of activity in which this disclosure may be used are, for example, the following areas: food industry, packaging and pharmaceuticals. In the present disclosure a swab may be used to collect a sample, in particular a DNA sample of a labeled material, in particular from the surface of the labeled material. Initially one end of said swab may be immersed in an extraction buffer, in particular an extraction buffer comprising Tris-HCl and EDTA (TE) pH8. Buffer moistened swab is then used to obtain a smear of the labeled material and then the removed DNA is dissolved in TE buffer, preheated in thermoblock, in particular at 60 ° C and placed for 5 min at 60 ° C. During the incubation period, preparation of the target DNA molecule detection device referred to in the present disclosure as the indicator brush begins. The device comprises a brush-shaped rod containing a color code indicating the presence of target DNA and a microtube and membrane-cap containing system.
[0027] Numa forma de realização, a utilização do dispositivo inicia-se com o encaixe de uma das extremidades da haste sobre a face externa da tampa-membrana acoplada ao microtubo. Com auxílio da haste a tampa-membrana é removida e a membrana da sua face interna é então imersa na solução contendo reagentes para amplificação enzimática isotérmica do ADN (LAMP). Cerca de 4 - 6 μΙ da solução de reação de LAMP é transferida para a membrana absorvente. A reação de LAMP na presente divulgação contem iniciadores específicos para o ADN a ser detetado, em particular ADN usado na marcação do material examinado e um indicador colorimétrico, em particular azul de hidroxinaftol ou outros corantes da família das cianinas e suas combinações para deteção do fragmento de ADN amplificado. In one embodiment, the use of the device begins by engaging one end of the rod over the outer face of the membrane cap coupled to the microtube. With the aid of the rod the membrane cap is removed and the membrane of its inner face is then immersed in the solution containing isothermal DNA amplification (LAMP) reagents. About 4 - 6 μΙ of the LAMP reaction solution is transferred to the absorbent membrane. The LAMP reaction in the present disclosure contains primers specific for the DNA to be detected, in particular DNA used for labeling the examined material and a colorimetric indicator, in particular hydroxynaphtol blue or other cyanine family dyes and combinations thereof for detection of the fragment. of amplified DNA.
[0028] Numa forma de realização, a deteção de ADN inicia-se com a transferência de cerca de 1 μΙ da amostra contendo >50 fg de ADN alvo em TE, em particular 50-500 fg/μΙ com auxílio de uma alça de inoculação de 1 μΙ, sobre a membrana absorvente já impregnada com a solução de reação de LAMP, tal como descrito na etapa anterior. Em seguida a membrana é incubada dentro do microtubo original através da acoplagem da tampa-membrana sobre o tubo. In one embodiment, DNA detection begins by transferring about 1 μΙ of the sample containing> 50 fg of target DNA into TE, in particular 50-500 fg / μΙ with the aid of an inoculation loop. 1 μΙ on the absorbent membrane already impregnated with the LAMP reaction solution as described in the previous step. Then the membrane is incubated inside the original microtube by coupling the membrane cap over the tube.
[0029] Numa forma de realização, o conjunto microtubo-tampa-membrana é transferido para um termobloco durante 30-60 min a ~60 °C. Após a incubação a presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN é determinada através da avaliação colorimétrica da membrana absorvente através da comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo. In one embodiment, the microtube-cap-membrane assembly is transferred to a thermoblock for 30-60 min at ~ 60 ° C. Following incubation the presence of the molecular tag or DNA target molecule is determined by colorimetric evaluation of the absorbent membrane by comparing the results containing control reactions with and without target DNA.
[0030] A presente divulgação insere-se no domínio das tecnologias para rastreabilidade e autenticação de materiais diversos. This disclosure is in the field of technologies for traceability and authentication of miscellaneous materials.
[0031] A presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN é determinada através da avaliação colorimétrica de comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo. The presence of the molecular tag or DNA target molecule is determined by comparing colorimetric evaluation of results containing control reactions with and without target DNA.
[0032] A presente divulgação pode ser utilizada em várias áreas, por exemplo, indústria alimentar, embalagens e farmacêutica. The present disclosure may be used in various areas, for example, the food, packaging and pharmaceutical industries.
[0033] A presente divulgação diz respeito a um dispositivo portátil para deteção de um ácido desoxirribonucleico de uma amostra que compreende: uma haste com uma primeira extremidade e uma segunda extremidade; The present disclosure relates to a portable device for detecting a deoxyribonucleic acid from a sample comprising: a stem with a first end and a second end;
em que a primeira extremidade da haste é apta para ser manuseada por um utilizador e a segunda extremidade da haste compreende um elemento destacável;  wherein the first rod end is capable of being handled by a user and the second rod end comprises a detachable member;
em que o referido elemento destacável compreende wherein said peelable element comprises
um elemento de clipagem que compreende duas posições em que a primeira posição é apta para acoplar o elemento de clipagem à segunda extremidade da referida haste e a segunda posição do elemento de clipagem é apta para acoplar uma membrana porosa de policarbonato para suporte da amostra e de uma solução de amplificação enzimática isotérmica.  a clipping element comprising two positions wherein the first position is capable of coupling the clipping element to the second end of said rod and the second position of the clipping element is capable of coupling a porous sample and polycarbonate support membrane. an isothermal enzyme amplification solution.
[0034] Numa forma de realização, e para obter melhores resultados, a porosidade da membrana de policarbonato pode variar entre 0,05-8 μιη, de preferência 0,2-8 μιη, ainda de mais preferência 1-5 μιη. In one embodiment, and for best results, the porosity of the polycarbonate membrane may range from 0.05-8 μιη, preferably 0.2-8 μιη, even more preferably 1-5 μιη.
[0035] Numa forma de realização, e para obter melhores resultados, a membrana da presente divulgação pode compreender um revestimento, em particular pode compreender um revestimento de polivinilpirrolidona (PVP) em que o referido revestimento atua como agente humectante. In one embodiment, and for best results, the membrane of the present disclosure may comprise a coating, in particular it may comprise a polyvinylpyrrolidone (PVP) coating wherein said coating acts as a wetting agent.
[0036] Numa forma de realização, o revestimento de polivinilpirrolidona pode compreender uma espessura entre 0,5-1,5 μιη; de preferência aproximadamente 1 μιη. [0037] Numa forma de realização, foram testadas as seguintes membranas sem sucesso, nomeadamente uma membrana de nitrato de celulose, em particular uma membrana de nitrato de celulose com 0,45 μιη; uma membrana de fibra de vidro em particular uma membrana de fibra de vidro com 0,3 μιη de porosidade e uma membrana de vidro com 0,7 μιη de porosidade; uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF), em particular uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com 0,22 μιη; e uma membrana de filtro de celulose. In one embodiment, the polyvinylpyrrolidone coating may comprise a thickness between 0.5-1.5 μιη; preferably approximately 1 μιη. In one embodiment, the following membranes were unsuccessfully tested, namely a cellulose nitrate membrane, in particular a 0.45 μιη cellulose nitrate membrane; a fiberglass membrane in particular a 0.3 μιη porosity fiberglass membrane and a 0.7 μιη porosity glass membrane; a polyvinylidene fluoride membrane (PVDF), in particular a 0.22 μιη polyvinylidene fluoride membrane (PVDF); and a cellulose filter membrane.
[0038] Numa forma de realização, a referida membrana de policarbonato, com ou sem o revestimento de polivinilpirrolidona (PVP), pode estar apta a suportar a solução de reação e o ADN da amostra e a mediar a amplificação do referido ácido nucleico, sendo que este efeito se deve à sinergia entre o material da membrana e a porosidade da mesma. In one embodiment, said polycarbonate membrane, with or without the polyvinylpyrrolidone (PVP) coating, may be capable of supporting the reaction solution and sample DNA and mediating amplification of said nucleic acid. This effect is due to the synergy between the membrane material and its porosity.
[0039] Numa forma de realização, a amplificação do ácido nucleico é feita por amplificação enzimática isotérmica mediada por loop. In one embodiment, nucleic acid amplification is by loop-mediated isothermal enzymatic amplification.
[0040] Numa forma de realização, o dispositivo pode compreender um segundo elemento destacável apto para ser acoplado à segunda extremidade do dispositivo e envolver o elemento de clipagem, sendo que o referido segundo elemento destacável é um microtubo. In one embodiment, the device may comprise a second peelable member capable of being coupled to the second end of the device and engaging the clip element, said second peelable member being a microtube.
[0041] Numa forma de realização, os elementos destacáveis podem ser descartáveis. In one embodiment, the peelable elements may be disposable.
[0042] Numa forma de realização, a membrana porosa de policarbonato pode ser descartável. In one embodiment, the porous polycarbonate membrane may be disposable.
[0043] Numa forma de realização, o dispositivo pode compreender ainda um indicador de reação, em particular o indicador colorimétrico azul de hidroxinaftol e outros corantes da família das cianinas. In one embodiment, the device may further comprise a reaction indicator, in particular the blue hydroxynaphtol colorimetric indicator and other cyanine family dyes.
[0044] Numa forma de realização, a amostra pode ser selecionada da seguinte lista: superfície de embalagens; produtos farmacêuticos e/ou produtos alimentares. In one embodiment, the sample may be selected from the following list: packaging surface; pharmaceutical and / or food products.
[0045] A presente divulgação também diz respeito a um kit que compreende o dispositivo descrito anteriormente. [0046] Ao longo da descrição e reivindicações a palavra "compreende" e variações da palavra não têm intenção de excluir outras características técnicas, outros componentes, ou passos. Objetos adicionais, vantagens e características da divulgação irão tornar-se evidentes para os peritos na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da divulgação. Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos como forma de ilustrar, e não têm a intenção de serem limitativos da presente divulgação. Além disso, a presente divulgação abrange todas as possíveis combinações de formas de realização particulares ou preferenciais aqui descritas. The present disclosure also relates to a kit comprising the device described above. Throughout the description and claims the word "comprises" and variations of the word are not intended to exclude other technical characteristics, other components, or steps. Additional objects, advantages and features of the disclosure will become apparent to those skilled in the art upon examination of the disclosure or may be learned by the practice of disclosure. The following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present disclosure. Furthermore, the present disclosure encompasses all possible combinations of particular or preferred embodiments described herein.
Breve descrição das figuras Brief Description of the Figures
[0047] Para uma mais fácil compreensão da presente divulgação juntam-se em anexo as figuras, as quais representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente divulgação.  For an easier understanding of the present disclosure, attached are the figures, which represent preferred embodiments which, however, are not intended to limit the scope of the present disclosure.
[0048] Fig. 1: Desenho esquemático do dispositivo portátil de leitura de etiquetas de ADN agora divulgado. Fig. 1: Schematic drawing of the portable DNA tag reading device now disclosed.
[0049] Fig. 2A: Primeira fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados. Fig. 2A: First phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
[0050] Fig. 2B: Segunda fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados. Fig. 2B: Second phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
Descrição Detalhada Detailed Description
[0051] A fig. 1 representa uma forma de realização, em particular representa um dispositivo portátil apto para deteção de ADN, em particular mas não restrito a ADN não codificante, utilizado para marcar diversos materiais.  Fig. 1 depicts one embodiment, in particular represents a portable device capable of detecting DNA, in particular but not restricted to non-coding DNA, used to label various materials.
[0052] O dispositivo portátil para deteção de um ADN/pincel indicador (1) compreende os seguintes elementos: uma haste e uma peça descartável (2) localizada numa das extremidades do referido dispositivo. A referida peça destacável (2) é denominada tampa-membrana e é por sua vez acoplada a um microtubo, em particular um microtubo de 0,2 ml (2a). A tampa-membrana do dispositivo portátil para deteção de um ADN/pincel indicador compreende, por sua vez, três elementos distintos, uma zona de clipagem da tampa ao microtubo (2b), uma zona de absorção da solução de reação e amostra de ADN (2c) e uma zona de clipagem ao corpo do pincel (2d). A tampa é fixa à ponta do pincel por clipagem e tem uma geometria standard tipo microtubos para biologia molecular, de modo a que a sua utilização seja universal em equipamentos laboratoriais como um termobloco. The portable device for detecting a DNA / indicator brush (1) comprises the following elements: a rod and a disposable part (2) located at one end of said device. Said detachable part (2) is called a membrane cap and is in turn coupled to a microtube, in particular a 0.2 ml microtube (2a). The membrane cap of the hand held device for detecting a DNA / indicator brush comprises in turn three distinct elements, a microtube cap-clamping zone (2b), a reaction solution absorption zone and DNA sample (2c) and a clip zone to the brush body (2d). The cap is clipped to the brush tip and has a standard microtube geometry for molecular biology so that its use is universal in laboratory equipment such as a thermoblock.
[0053] Numa forma de realização, o dispositivo pode ainda compreender um indicador de reação (3). O corpo do dispositivo portátil para deteção de um ADN/pincel indicador (1) pode assim compreender um código de cor impresso que indica se o resultado da análise é positivo ou negativo, sendo que numa forma de realização o resultado da análise é positivo para a cor azul e negativo para a cor roxa. As referidas cores devem aparecer na membrana absorvente na ponta do pincel indicador após a reação de amplificação enzimática isotérmica por loop LAMP/reação LAMP (3). In one embodiment, the device may further comprise a reaction indicator (3). The body of the hand held DNA detector / indicator brush (1) can thus comprise a printed color code indicating whether the test result is positive or negative, and in one embodiment the test result is positive for the test. blue and negative color to purple color. These colors should appear on the absorbent membrane at the tip of the indicator brush after the isothermal LAMP loop / LAMP reaction (3).
[0054] Numa forma de realização, a fig. 2a representa a primeira fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados. In one embodiment, fig. 2a represents the first phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
[0055] Numa forma de realização, a fig. 2b representa a segunda fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados. In one embodiment, fig. 2b represents the second phase of the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials.
[0056] Numa forma de realização, a presente divulgação compreende uma reação mix para amplificação enzimática isotérmica mediada por loop (LAMP). A referida reação LAMP é mediada por 4 diferentes iniciadores, utilizados para identificar regiões, em particular sequências distintas do ADN alvo, sendo o ADN alvo, num dos exemplos da presente divulgação, fragmentos do gene hsp65 do microrganismo Mycobacterium ma- rinum. O ADN alvo é então amplificado a uma temperatura constante de ~60 °C durante 30-60 minutos, no máximo 1 hora, dependendo da quantidade de ADN alvo na amostra a ser analisada, sem a necessidade de realizar ciclos térmicos tradicionalmente usados na PCR. Devido à natureza específica da ação destes iniciadores, a quantidade de ADN produzido em LAMP é consideravelmente mais elevada do que a amplificação convencional por PCR. In one embodiment, the present disclosure comprises a mix reaction for loop-mediated isothermal enzyme amplification (LAMP). Said LAMP reaction is mediated by 4 different primers, used to identify regions, in particular distinct sequences of the target DNA, the target DNA being fragments of the hsp65 gene of the Mycobacterium mainum organism in one of the examples of the present disclosure. The target DNA is then amplified at a constant temperature of ~ 60 ° C for 30-60 minutes, maximum 1 hour, depending on the amount of target DNA in the sample to be analyzed without the need to perform thermal cycling traditionally used in PCR. Due to the specific nature of the action of these primers, the amount of DNA produced in LAMP is considerably higher than conventional PCR amplification.
[0057] Numa forma de realização, o meio de reação de amplificação pode compreender 20 mM Tris-HCI; 10 mM KCI; 10 mM (NH4)2S04; 8 mM MgS04; 0,1% (v/v) Tween 20; 0,8 M betaína e 1,4 mM de mistura de dNTP; 0,2 μΜ iniciador exterior F3 e B3; 1,6 μΜ iniciador interior FIP e BIP e 8U Bst ADN polimerase ou outras polimerases com função similar. In one embodiment, the amplification reaction medium may comprise 20 mM Tris-HCl; 10 mM KCI; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 8 mM MgSO 4 ; 0.1% (v / v) Tween 20; 0.8 M betaine and 1.4 mM dNTP mixture; 0.2 μΜ outer primer F3 and B3; 1.6 μΜ inner primer FIP and BIP and 8U Bst DNA polymerase or other polymerases with similar function.
[0058] Numa forma de realização, a deteção da amplificação do ADN alvo é feita através de um indicador colorimétrico, em particular o indicador colorimétrico azul de hidroxinaftol (3 mM). No final do tempo de incubação se ficar azul significa que foi detetado o ADN alvo. Se tiver cor roxa significa que não foi detetado ADN alvo. In one embodiment, detection of target DNA amplification is done by a colorimetric indicator, in particular the blue hydroxynaphtol colorimetric indicator (3mM). At the end of incubation time turning blue means target DNA has been detected. If it is purple it means that no target DNA was detected.
[0059] A presente divulgação compreende um dispositivo portátil para deteção de um ADN contendo uma haste na forma de um cabo de pincel (Fig. 1), denominado na presente divulgação como pincel indicador. O referido pincel é capaz de alojar em uma das extremidades uma peça destacável denominada na presente divulgação como tampa-membrana [Fig. 1 (2 b, c, d)] que é por sua vez ligada a um microtubo de 0,2 ml [Fig. 1 (2a)]. The present disclosure comprises a portable DNA detection device containing a rod in the form of a brush handle (Fig. 1), referred to herein as an indicator brush. Said brush is capable of housing at one end a detachable part referred to herein as a membrane cap [Fig. 1 (2 b, c, d)] which is in turn attached to a 0.2 ml microtube [Fig. 1 (2a)].
[0060] Numa forma de realização, o conjunto microtubo-tampa-membrana é fixo à ponta do pincel por clipagem. O tubo tem uma geometria standard tipo microtubo de 0,2 ml tipicamente usado em biologia molecular para a reação em cadeia da polimerase (PCR). Isso permite que a sua utilização seja universal em equipamentos laboratoriais para biologia molecular. In one embodiment, the microtube-cap-membrane assembly is clipped to the brush tip. The tube has a standard 0.2 ml microtube geometry typically used in molecular biology for polymerase chain reaction (PCR). This allows its use to be universal in molecular biology laboratory equipment.
[0061] Numa forma de realização, a peça destacável tampa-membrana compreende uma tampa de microtubo com duas faces funcionais [Fig. 1 (2b, 2c e 2d)]. Sendo que uma face serve de fixação ao microtubo [Fig. 1 (2b)] e estende-se dentro do perímetro externo da abertura do tubo. Simultaneamente essa mesma face da tampa-membrana serve para fixar a tira de membrana absorvente de policarbonato a partir do centro da face interna da tampa para dentro do microtubo [Fig. 1 (2c)]. A outra face da tampa- membrana estende-se dentro do perímetro de abertura do tubo em direção oposta ao microtubo [Fig. 1 (2d)] e tem a função de conectar a tampa-membrana a uma das extremidades da haste do pincel indicador (Fig. 1), permitindo assim a utilização deste para remoção da tampa-membrana do microtubo e manipulação da membrana absorvente durante a análise da amostra (Fig. 2A e 2B). A respetiva membrana é capaz de imobilizar em seus poros pequenos volumes da solução de reação para amplificação isotérmica do ADN. A tampa-membrana também tem a função de selar a membrana dentro do microtubo antes e durante a reação de LAMP (Fig. 1.2 conjunto microtubo tampa-membrana). O corpo do pincel tem um código de cor impresso que indica se o resultado da análise é positiva ou negativa. Positivo para a cor azul e negativo para a cor roxa, que deverá aparecer na membrana absorvente na ponta do pincel indicador após a reação de LAMP (Fig. 1.3). [0061] In one embodiment, the membrane cap peel comprises a microtube cap with two functional faces [Fig. 1 (2b, 2c and 2d)]. Where one face holds the microtube [Fig. 1 (2b)] and extends within the outer perimeter of the tube opening. Simultaneously this same membrane cap face serves to secure the polycarbonate absorbent membrane strip from the center of the inner cover face into the microtube [Fig. 1 (2c)]. The other side of the membrane cap extends within the tube opening perimeter opposite the microtube [Fig. 1 (2d)] and has the function of attaching the membrane cap to one end of the indicator brush shaft (Fig. 1), thus allowing its use to remove the microtube membrane cap and manipulate the absorbent membrane during sample analysis (Fig. 2A and 2B). The respective membrane is able to immobilize in its pores small volumes of the reaction solution for isothermal amplification of DNA. The membrane cap also has the function of sealing the membrane inside the microtube before and during the LAMP reaction (Fig. 1.2 microtube assembly membrane cap). The brush body has a printed color code that indicates whether the analysis result is positive or negative. Positive for blue and negative for purple, which should appear on the absorbent membrane at the tip of the indicator brush after the LAMP reaction (Fig. 1.3).
[0062] Numa forma de realização, o método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados é caracterizado por uma metodologia de deteção de etiquetas de ADN que pode compreender 6 etapas (Fig. 2A e 2B). In one embodiment, the method of detecting the target DNA molecule in labeled materials is characterized by a DNA tag detection methodology which may comprise 6 steps (Fig. 2A and 2B).
[0063] Numa forma de realização, uma zaragatoa pode ser utilizada para remoção e recolha de ADN da superfície do material marcado com a etiqueta de ADN. Uma extremidade da zaragatoa é imersa em tampão de extração, em particular um tampão de extração que compreende Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM a pH8, em particular num volume de 250 μΙ e em seguida a zaragatoa humedecida com tampão pode ser usada para obter esfregaços do material marcado com ADN. In one embodiment, a swab may be used for removing and collecting DNA from the surface of the DNA tagged material. One end of the swab is immersed in extraction buffer, in particular an extraction buffer comprising 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA at pH8, in particular in a volume of 250 μΙ and then the buffer wetted swab may be used to obtain smears of the DNA-labeled material.
[0064] Numa forma de realização, o ADN removido e aderido à zaragatoa pode ser imerso num tampão de extração, em particular um tampão de extração que compreende Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM a pH8, sendo que o referido tampão se encontra a uma temperatura de 60 °C durante 5 minutos, com um intervalo para homogeneização da amostra. Durante esse período de incubação, pode preparar-se o pincel indicador para análise da amostra de ADN. In one embodiment, the DNA removed and adhered to the swab may be immersed in an extraction buffer, in particular an extraction buffer comprising 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA at pH8, said buffer being at 60 ° C for 5 minutes, with an interval for sample homogenization. During this incubation period, the indicator brush may be prepared for analysis of the DNA sample.
[0065] Numa forma de realização, a preparação do pincel indicador para análise pode compreender várias etapas, nomeadamente: i) acoplar o pincel indicador ao conjunto microtubo-tampa-membrana, ii) desconectar a tampa-membrana do microtubo, iii) com auxílio do pincel indicador, transferir para a membrana absorvente a solução de LAMP através da imersão da mesma na solução de reação, sendo que a solução de reação pode compreender 20 mM Tris-HCI, lOmM KCI, lOmM (NH4)2S04, 8 mM MgS04, 0,1% (v/v) Tween 20, 0,8M betaína e 1,4 mM de mistura de dNTP, 0,2 μΜ iniciador exterior F3 e B3, 1,6 μΜ iniciador interior FIP e BIP, 8U Bst ADN polimerase e 3 mM azul de hidroxinaftol. [0066] Numa forma de realização, uma alíquota, em particular ~1 μΙ de uma amostra de ADN pode ser transferida com auxílio de uma alça de inoculação de 1 μΙ sobre a membrana absorvente saturada com a solução de reação de LAMP na etapa anterior. In one embodiment, preparing the indicator brush for analysis may comprise several steps, namely: i) attaching the indicator brush to the microtube-cap-membrane assembly, ii) disconnecting the membrane-cap from the microtube, iii) with the aid of Transfer the LAMP solution to the absorbent membrane by soaking it in the reaction solution, the reaction solution comprising 20 mM Tris-HCI, 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 8 mM MgSO 4 , 0.1% (v / v) Tween 20, 0.8M betaine and 1.4 mM dNTP mixture, 0.2 μΜ outer primer F3 and B3, 1.6 μΜ inner primer FIP and BIP, 8U Bst DNA polymerase and 3 mM blue hydroxynaphtol. In one embodiment, an aliquot, in particular ~ 1 μΙ of a DNA sample may be transferred with the aid of a 1 μΙ inoculation loop onto the absorbent membrane saturated with the LAMP reaction solution in the previous step.
[0067] Numa forma de realização, o conjunto tampa-membrana pode ser recolocado dentro do microtubo original através da acoplagem da tampa-membrana sobre o referido tubo. In one embodiment, the cap-membrane assembly may be replaced within the original microtube by coupling the cap-membrane over said tube.
[0068] Numa forma de realização, o conjunto microtubo-tampa-membrana pode ser incubado num termobloco durante 30-60 min a ~60 °C. O tempo e a temperatura de incubação a ser usada podem variar de acordo com a quantidade de moléculas de ADN alvo e os iniciadores usados em cada protocolo de reação, respetivamente. Após a incubação, a presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN pode ser determinada através da avaliação colorimétrica da membrana absorvente através da comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo. In one embodiment, the microtube-cap-membrane assembly may be incubated in a thermoblock for 30-60 min at ~ 60 ° C. The incubation time and temperature to be used may vary according to the amount of target DNA molecules and primers used in each reaction protocol, respectively. Following incubation, the presence of the molecular tag or DNA target molecule can be determined by colorimetric evaluation of the absorbent membrane by comparing the results containing control reactions with and without target DNA.
[0069] As vantagens técnicas da presente divulgação em relação a soluções já existentes, nomeadamente em relação aos documentos de patente US5645801, US5837466 e US6468751 BI, podem ser resumidas nos seguintes pontos: The technical advantages of the present disclosure over existing solutions, notably patent documents US5645801, US5837466 and US6468751 BI, can be summarized as follows:
(i) o dispositivo de deteção da presente divulgação tem um baixo custo de produção; (i) the detection device of the present disclosure has a low production cost;
(ii) a membrana absorvente necessita de poucos microlitros, em particular ~ 5 μΙ para análise de uma amostra, reduzindo os custos quando comparado aos gastos de uma reação de LAMP convencional que necessita de 25 μΙ-500 μΙ. (ii) the absorbent membrane needs a few microliters, in particular ~ 5 μΙ for sample analysis, reducing costs compared to the expense of a conventional LAMP reaction requiring 25 μΙ-500 μΙ.
(iii) o processo não envolve reagentes tóxicos; (iii) the process does not involve toxic reagents;
(iv) tempo de deteção relativamente baixo e que pode variar entre 30 minutos a 1 hora; (iv) relatively short detection time ranging from 30 minutes to 1 hour;
(v) a operação do dispositivo não envolve instrumentos ou equipamentos complexos e a interpretação dos resultados é evidente, podendo ser (v) the operation of the device does not involve complex instruments or equipment and the interpretation of the results is evident and may be
interpretados a "olho nú".  interpreted to the "naked eye".
(vi) dispositivo de fácil uso, não sendo necessário pessoal especializado para seu manuseamento. [0070] De seguida, são descritos alguns exemplos da presente divulgação. (vi) user-friendly device, requiring no specialized personnel for handling. The following are some examples of the present disclosure.
[0071] Numa forma de realização, a marcação com ADN e utilização do dispositivo portátil descrito na presente divulgação podem ser efetuadas como se passa a descrever. Para a produção e incorporação do marcador de ADN alvo, o ADN genómico de Mycobacterium marinum ATCC 927 comercial foi utilizado como ADN alvo. O gene hsp65 foi escolhido como alvo para a amplificação, uma vez que é usualmente utilizado para identificação específica do Mycobacterium marinum ATCC 927. A alta especificidade do sistema desenvolvido nessa divulgação permite a produção e leitura de etiquetas de autenticação contendo fragmentos desse gene com baixo risco de contaminação cruzada (falso positivo). Isso deve-se ao fato de o ADN da bactéria Mycobacterium marinum apenas apresentar níveis detetáveis via LAMP somente em ambientes aquáticos ou em animais. Portanto, seria muito pouco provável que ocorresse uma contaminação cruzada de materiais de origem industrial e afectasse o processo de leitura de etiquetas de autenticação contendo fragmentos do gene hsp65 de Mycobacterium marinum. Desta forma, foram desenhados oligonucleotidos iniciadores para a técnica LAMP que permitam amplificar especificamente fragmentos do gene hsp65 da espécie Mycobacterium marinum. A sequência de ADN alvo do gene hsp65 foi amplificada por LAMP utilizando os iniciadores descritos a seguir: In one embodiment, DNA labeling and use of the portable device described in the present disclosure may be performed as described herein. For the production and incorporation of the target DNA marker, commercial Mycobacterium marinum ATCC 927 genomic DNA was used as the target DNA. The hsp65 gene has been chosen as the target for amplification as it is usually used for specific identification of Mycobacterium marinum ATCC 927. The high specificity of the system developed in this disclosure allows the production and reading of authentication tags containing fragments of this low risk gene. cross-contamination (false positive). This is because Mycobacterium marinum DNA only has detectable levels via LAMP only in aquatic or animal environments. Therefore, cross contamination of materials of industrial origin would be very unlikely to affect the process of reading authentication tags containing fragments of the Mycobacterium marinum hsp65 gene. Thus, primers for the LAMP technique were designed to specifically amplify fragments of the hsp65 gene of the Mycobacterium marinum species. The hsp65 gene target DNA sequence was amplified by LAMP using the primers described below:
Seq ID No:l: F3: 5'-GGACCCGTACGAGAAGATC-3' - iniciador exterior ou "forward outer primer" Seq ID No: 1: F3: 5 ' -GGACCCGTACGAGAAGATC-3 ' - outer primer or forward outer primer
Seq ID No:2: 5'-CTCCTTGGTCTGACCTCT-3' - iniciador exterior ou "backward outer primer" B3 Seq ID No: 2: 5 ' -CTCCTTGGTCTGACCTCT-3 ' - Backward outer primer B3
Seq ID No:3: 5'-CGTCGTCGTGCCGTCATGAGCTGGTCAAGGAAGTT-3' - iniciador interior ou "forward inner primer" FIP Seq ID No: 3: 5 ' -CGTCGTCGTGCCGTCATGAGCTGGTCAAGGAAGTT-3 ' - FIP Inner Primer or Forward Inner Primer
Seq ID No:4: 5'-TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3' - iniciador interior ou "backward inner primer" BIP: Seq ID No: 4: 5 ' -TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3 ' - Inner Primer or "backward inner primer" BIP:
[0072] Numa forma de realização, os iniciadores Seq ID No:l, Seq ID No:2, Seq ID No:3 e Seq ID No:4 compreendem 19 bases, 18 bases, 35 bases e 34 bases, respetivamente. Todos os iniciadores referidos no exemplo mencionado foram sintetizados por IBA - Life Sciences. [0073] Numa forma de realização, uma a mostra de controlo negativo em que o ADN genómico foi substituído com água foi processada de forma idêntica e em paralelo como controlo negativo. In one embodiment, the primers Seq ID No: 1, Seq ID No: 2, Seq ID No: 3 and Seq ID No: 4 comprise 19 bases, 18 bases, 35 bases and 34 bases, respectively. All primers referred to in the mentioned example were synthesized by IBA - Life Sciences. In one embodiment, a negative control sample in which genomic DNA was replaced with water was processed identically and in parallel as a negative control.
[0074] Numa forma de realização, o ácido nucleico alvo produzido através da técnica LAMP descrita acima foi adicionado numa concentração final de 50 ng/ml a tinta de base solvente. Dez microlitros de tinta foram adicionados a uma placa de PVC. Depois de seca, foi recolhida uma amostra da placa. In one embodiment, the target nucleic acid produced by the LAMP technique described above was added at a final concentration of 50 ng / ml to solvent base paint. Ten microliters of paint was added to a PVC plate. After drying, a sample was taken from the plate.
[0075] Numa forma de realização, a leitura do marcador de ADN pode ser rea lizada da seguinte forma : In one embodiment, the DNA marker reading can be performed as follows:
• num 1^ passo: com uma zaragatoa previamente humedecida com 250 μΙ do tampão de extração, em particular Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM pH8 é recolhido o ADN (fragmentos do gene hsp65) de uma placa de PVC; • in a 1st step: with a swab previously moistened with 250 μΙ of the extraction buffer, in particular 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA pH8 DNA (hsp65 gene fragments) is collected from a PVC plate;
• num 2^ passo: a zaragatoa com o ADN é então imersa no tampão de extração a 60 °C durante 5 minutos, com um intervalo para homogeneização da amostra. Durante esse período de incubação, prepara-se o pincel indicador para análise da amostra de ADN; • in a 2 nd step: the DNA swab is then immersed in the extraction buffer at 60 ° C for 5 minutes with an interval for sample homogenization. During this incubation period, the indicator brush is prepared for analysis of the DNA sample;
• num 35 passo: o pincel indicador é acoplado ao conjunto microtubo-tampa- membrana, seguidamente desconecta-se a tampa-membrana do microtubo. A membrana absorvente ligada a tampa é mergulhada na solução de reação de LAMP. • in one step: the indicator brush is attached to the microtube-cap-membrane assembly, then the membrane cap is disconnected from the microtube. The cap-bound absorbent membrane is dipped into the LAMP reaction solution.
[0076] Numa forma de realização, a preparação da reação LAMP pode ser realizada num volume de reação final de 25 μί que compreende uma concentração final de tampão 2x, em particular 20 mM Tris-HCI; 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04; 8 mM MgS04; 0,1% (v/v) Tween 20; 0,8 M betaína e 1,4 mM de mistura de dNTP; 0,2 μΜ iniciador exterior F3 e B3; 1,6 μΜ iniciador interior FI P e BIP e 8U Bst ADN polimerase: In one embodiment, the preparation of the LAMP reaction may be performed in a final reaction volume of 25 μί comprising a final concentration of 2x buffer, in particular 20 mM Tris-HCI; 10 mM KCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 8 mM MgSO 4 ; 0.1% (v / v) Tween 20; 0.8 M betaine and 1.4 mM dNTP mixture; 0.2 μΜ outer primer F3 and B3; 1.6 μΜ inner primer FI P and BIP and 8U Bst DNA polymerase:
• num 45 passo: com uma haste de inoculação descartável, transferir uma alíquota, em particular ~1 μΙ da amostra de ADN e colocar sobre a membrana absorvente saturada com a solução de reação de LAMP na etapa anterior; • num 5^ passo: acoplar o conjunto tampa-membrana para dentro do microtubo original; • in a 45 step: with a disposable inoculation rod, transfer an aliquot, in particular ~ 1 μΙ of the DNA sample and place on the absorbent membrane saturated with the LAMP reaction solution in the previous step; • in a 5th step: couple the cap-membrane assembly into the original microtube;
• num 6^ passo: incubar o conjunto microtubo-tampa-membrana num termobloco durante 60 min a 64 °C. Após a incubação a presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN é determinada através da avaliação colorimétrica da membrana absorvente por comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo. • Step 6: Incubate the microtube-cap-membrane assembly in a thermoblock for 60 min at 64 ° C. Following incubation the presence of the molecular tag or DNA target molecule is determined by colorimetric evaluation of the absorbent membrane by comparing the results containing control reactions with and without target DNA.
[0077] Numa forma de realização, a deteção do ácido nucleico pode ser feita usando o corante azul de hidroxinaftol entre outros corantes da família das cianinas. In one embodiment, nucleic acid detection can be done using the hydroxynaphtol blue dye among other dyes of the cyanine family.
[0078] Numa forma de realização, foi adicionado inicialmente à mistura da reação LAMP 1 μΙ de corante azul de hidroxinaftol, em particular 3 mM. No final do tempo de incubação, em particular ao fim de 60 minutos, se a mistura adquirir a cor azul significa que o foi detetado o ácido nucleico alvo, se no final tiver cor roxa significa que não foi detetado ácido nucleico alvo. In one embodiment, LAMP 1 μΙ of hydroxynaphtol blue dye, in particular 3 mM, was initially added to the reaction mixture. At the end of the incubation time, particularly after 60 minutes, if the mixture turns blue it means that the target nucleic acid was detected, if at the end it is purple it means that no target nucleic acid was detected.
[0079] A presente divulgação não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral, tal como definido nas reivindicações anexas. The present disclosure is, of course, not in any way restricted to the embodiments described herein and a person of ordinary skill in the art could envisage many possibilities for modification thereof without departing from the general idea as defined in the appended claims.
[0080] As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais. The preferred embodiments described above are obviously combinable with each other. The following claims further define preferred embodiments.
LISTA DE SEQUÊNCIAS LIST OF SEQUENCES
Iniciador exterior ou "forward outer primer" F3: 5'-GGACCCGTACGAGAAGATC-3' [Seq ID No:l] Forward outer primer F3: 5 ' -GGACCCGTACGAGAAGATC-3 ' [Seq ID No: l]
Iniciador exterior ou "backward outer primer" B3: 5'-CTCCTTGGTCTGACCTCT-3' [Seq ID No:2] Outer primer or backward outer primer B3: 5 ' -CTCCTTGGTCTGACCTCT-3 ' [Seq ID No: 2]
Iniciador interior ou "forward inner primer" FIP: 5'- CGTCGTCGTGCCGTCATGAGCTGGTCAAGGAAGTT-3' [Seq ID No:3] Forward Inner Primer FIP: 5 ' - CGTCGTCGTGCCGTCATGAGCTGGTCAAGGAAGTT-3 ' [Seq ID No: 3]
Iniciador interior ou "backward inner primer" BIP: 5'- TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3' [Seq ID No:4] Inner Primer or Backward Inner Primer BIP: 5 ' - TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3 ' [Seq ID No: 4]

Claims

R E I V I N D I C A Ç Ã O CLAIM
1. Dispositivo portátil para deteção de um ácido desoxirribonucleico de uma amostra, que compreende: 1. Portable device for detecting a deoxyribonucleic acid in a sample, comprising:
uma haste com uma primeira extremidade e uma segunda extremidade; em que a primeira extremidade da haste é apta para ser manuseada por um utilizador e a segunda extremidade da haste compreende um elemento destacável;  a rod with a first end and a second end; wherein the first rod end is capable of being handled by a user and the second rod end comprises a detachable member;
em que o referido elemento destacável compreende  wherein said peelable element comprises
um elemento de clipagem que compreende duas posições, em que a primeira posição acopla o elemento de clipagem à segunda extremidade da referida haste e a segunda posição do elemento de clipagem acopla uma membrana porosa de policarbonato para suporte da amostra e de uma solução de amplificação enzimática isotérmica.  a clipping element comprising two positions, wherein the first position engages the clipping element with the second end of said rod and the second position of the clipping element engages a porous polycarbonate membrane to support the sample and an enzymatic amplification solution. isothermal.
2. Dispositivo de acordo com a reivindicação anterior em que a membrana porosa de policarbonato compreende uma porosidade entre 0,05-8 μιη, de preferência 0,2-8 μιη, ainda de mais preferência 1-5 μιη. The device of the preceding claim wherein the porous polycarbonate membrane comprises a porosity between 0.05-8 μιη, preferably 0.2-8 μιη, most preferably 1-5 μιη.
3. Dispositivo de acordo com as reivindicações anteriores em que a membrana porosa de policarbonato compreende um revestimento. Device according to the preceding claims, wherein the porous polycarbonate membrane comprises a coating.
4. Dispositivo de acordo com a reivindicação anterior em que o referido revestimento é um revestimento de polivinilpirrolidona. The device of the preceding claim wherein said coating is a polyvinylpyrrolidone coating.
5. Dispositivo de acordo com as reivindicações 3-4 em que o revestimento de polivinilpirrolidona compreende uma espessura entre 0,5-1,5 μιη, de preferência 1 μιη. A device according to claims 3-4 wherein the polyvinylpyrrolidone coating comprises a thickness of between 0.5-1.5 μιη, preferably 1 μιη.
6. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o dispositivo compreende um segundo elemento destacável apto para ser acoplado à segunda extremidade do dispositivo e envolver o elemento de clipagem. Device according to any one of the preceding claims, wherein the device comprises a second detachable element capable of being coupled to the second end of the device and surrounding the clipping element.
7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o segundo elemento destacável é um microtubo. A device according to any preceding claim wherein the second peelable element is a microtube.
8. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os elementos destacáveis são descartáveis. A device according to any preceding claim wherein the peelable elements are disposable.
9. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a membrana porosa de policarbonato é descartável. A device according to any preceding claim wherein the porous polycarbonate membrane is disposable.
10. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o dispositivo compreende ainda um indicador de reação, em particular um indicador colorimétrico de reação. A device according to any preceding claim wherein the device further comprises a reaction indicator, in particular a colorimetric reaction indicator.
11. Dispositivo de acordo com a reivindicação anterior em que o indicador de reação está compreendido na solução de amplificação enzimática isotérmica. The device of the preceding claim wherein the reaction indicator is comprised in the isothermal enzyme amplification solution.
12. Dispositivo de acordo com as reivindicações 10-11 em que o indicador de reação é um corante da família das cianinas. A device according to claims 10-11 wherein the reaction indicator is a dye of the cyanine family.
13. Dispositivo de acordo com as reivindicações 10-12 em que o corante de reação é o azul de hidroxinaftol. The device of claims 10-12 wherein the reaction dye is hydroxynaphtol blue.
14. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a amostra é selecionada da seguinte lista: superfície de embalagens, produtos farmacêuticos e/ou produtos alimentares. A device according to any preceding claim wherein the sample is selected from the following list: packaging surface, pharmaceuticals and / or food products.
15. Kit que compreende o dispositivo descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores. A kit comprising the device described in any preceding claim.
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