WO2017187941A1 - 凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法 - Google Patents

凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法 Download PDF

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幹人 加治屋
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a frozen cell clump and a method for producing a frozen cell clump.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the current MSC transplantation treatment method isolates and proliferates MSCs from patients, secures a sufficient number of cells, and temporarily freezes them. Thereafter, immediately before the transplantation operation to the patient, the cryopreserved MSC is thawed and cultured in CPC (Cell Processing Center) to process the MSC in a form of agglomerated MSC.
  • CPC Cell Processing Center
  • the MSC transplant is prepared by mixing melted MSC with artificial scaffold materials (hydroxyapatite, tricalcium phosphate apatite, polylactic acid, chitosan, atelocollagen gel, hyaluronic acid gel, etc.). And this MSC transplant is transplanted into a patient's defect
  • artificial scaffold materials hydroxyapatite, tricalcium phosphate apatite, polylactic acid, chitosan, atelocollagen gel, hyaluronic acid gel, etc.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • M KITTAKA, M KAJIYA, H SHIBA, M TAKEWAKI, K TAKESHITA, R KHUNG, T FUJITA, T IWATA, T Q NGUYEN, K OUHARA, K TAKEDA, T FUJITA, ARAT FUJITA complex can be a novel tissue engineering therapy for bone regeneration "; International Society for Cellular Therapy; Cytotherapy, 2015, 17, 860-873
  • the MSC transplants so far are manufactured after thawing the cryopreserved MSCs immediately before the transplantation operation. Since the MSC transplant is produced each time within a limited period immediately before the transplant operation, there is no guarantee that the number of cells and the cell function contained in the MSC transplant can be made uniform. For this reason, transplant surgery may be postponed when a desired MSC transplant cannot be manufactured.
  • the present invention has been made in view of the above matters, and an object of the present invention is to provide a frozen cell agglomerate that is agglomerated and can be cryopreserved, and a method for producing a frozen cell agglomerate.
  • the frozen cell agglomeration according to the first aspect of the present invention comprises: A mesenchymal stem cell is formed into a granular shape and is a frozen cell aggregate. It is characterized by that.
  • the frozen cell agglomerate is in a granular form having a diameter of 0.5 mm to 1.5 mm.
  • the frozen cell agglomerate is in a granular form having a diameter of 0.8 mm to 1.2 mm.
  • a method for producing a frozen cell conglomerate according to the second aspect of the present invention comprises: Culturing the mesenchymal stem cell in a growth medium containing a factor that causes the mesenchymal stem cell to produce collagen, Forming a granular cell cluster containing collagen produced from the mesenchymal stem cells; Cryopreserving the cell mass separated from the growth medium with a cryopreservative, It is characterized by that.
  • the method for producing a frozen cell conglomerate comprises: Culturing the mesenchymal stem cells in a growth medium containing a factor that causes the mesenchymal stem cells to produce collagen to form a cell sheet, Form a granular cell agglomeration by self-aggregation with the free periphery of the cell sheet, Cryopreserving the cell mass separated from the growth medium with a cryopreservative, It is characterized by that.
  • the mesenchymal stem cells are cultured in a culture vessel and proliferated until they become confluent,
  • the periphery of the cell sheet may be made a free edge by separating the edge of the cell sheet adhered to the peripheral wall of the culture container from the peripheral wall of the culture container.
  • a granular cell agglomerate having a diameter of 0.5 mm to 1.5 mm may be obtained using the cylindrical culture vessel of 1.5 cm 2 to 2.5 cm 2 .
  • the method for producing a frozen cell conglomerate according to the fourth aspect of the present invention comprises: Culturing and aggregating mesenchymal stem cells in growth medium, Adding a factor that produces collagen to the mesenchymal stem cells in the growth medium to form granular cell clusters containing collagen produced from the mesenchymal stem cells; Cryopreserving the cell mass separated from the growth medium with a cryopreservative, It is characterized by that.
  • Refrigerated storage may be performed without pre-freezing.
  • the MSC is frozen in an agglomerated form, so that it is not necessary to produce the MSC transplant within a limited time period immediately before the transplantation operation or the like. For this reason, the situation where a transplant operation is postponed can be prevented.
  • FIG. 2 is a photograph showing a phase contrast microscopic image of C-MSCs
  • FIG. 2 (A) is a photograph of C-MSCs that has not been cryopreserved
  • FIG. 2 (B) is a C-MSC that has been cryopreserved in a DMSO cryopreservation solution.
  • Photo of MSCs Fig. 2 (C) is a photo of C-MSCs cryopreserved at Bambanker (trade name: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Fig. 2 (D) is Cell Banker (trade name: Takara Bio Inc.) It is a photograph of C-MSCs stored frozen.
  • FIG. 2 is a photograph showing a phase contrast microscopic image of C-MSCs
  • FIG. 2 (A) is a photograph of C-MSCs that has not been cryopreserved
  • FIG. 2 (B) is a C-MSC that has been cryopreserved in a DM
  • FIG. 3 (A) is a photograph before freezing
  • FIG. 3 (B) is a partially enlarged photograph of FIG. 3 (A)
  • FIG. 3 (C) is one day after thawing
  • 3D is a partially enlarged photograph of FIG. 3C
  • FIG. 3E is a photograph 5 days after melting
  • FIG. 3F is a partially enlarged photograph of FIG. 3E.
  • FIG. 4 (A) is a photograph before freezing
  • FIG. 4 (B) is a partially enlarged photograph of FIG. 4 (A)
  • FIG. 4 (C) is a photograph one day after thawing
  • 4 (D) is a partially enlarged photograph of FIG. 4 (C)
  • FIG. 4 (E) is a photograph 5 days after melting
  • FIG. 4 (F) is a partially enlarged photograph of FIG. 4 (E).
  • FIG. 5 (A) is a photograph before freezing
  • FIG. 5 (B) is a partially enlarged photograph of FIG. 5 (A)
  • FIG. 5 (C) is a photograph one day after thawing.
  • 5 (D) is a partially enlarged photograph of FIG. 5 (C)
  • FIG. 5 (E) is a photograph 5 days after melting
  • FIG. 5 (F) is a partially enlarged photograph of FIG. 5 (E).
  • It is a graph which shows the rate of cell death of C-MSCs before freezing, and C-MSCs, cell sheets and cell spheroids after 5 days of freezing and thawing.
  • FIG. 7 (A) to (D) are photographs showing the state of C-MSCs to which collagenase was not added before cryopreservation
  • FIG. 7 (A) is a HE-stained photograph
  • FIG. 7 (B) is a TUNEL / FIG. 7 (C) is a partially enlarged photograph of FIG. 7 (B)
  • FIG. 7 (D) is an immunostained photograph
  • FIGS. 7 (E) to (H) are freezing of C-MSCs added with collagenase.
  • FIG. 7 (E) is a HE-stained photograph
  • FIG. 7 (F) is a TUNEL / DAPI-stained photograph
  • FIG. 7 (G) is a partially enlarged photograph of FIG. 7 (F)
  • FIGS. 8 (A) to (C) are photographs showing the state after 5 days of thawing after freezing C-MSCs to which no collagenase was added
  • FIG. 8 (A) is a HE-stained photograph
  • FIG. 8 (B ) Is a TUNEL / DAPI stained photograph
  • FIG. 8 (C) is a partially enlarged photograph of FIG. 8 (B)
  • FIGS. 8 (D) to (F) are 5 days after thawing after freezing storage of collagenase-added C-MSCs.
  • 8 (D) is a HE-stained photograph
  • FIG. 8 (E) is a TUNEL / DAPI-stained photograph
  • FIG. 8 (F) is a partially enlarged photograph of FIG. 8 (E).
  • 3 is a graph showing the ratio of dead cells 5 days after thawing of C-MSCs.
  • FIGS. 10 (A) to (D) are photographs showing the state before cryopreservation of cell spheroids produced without adding ascorbic acid to the medium.
  • FIG. 10 (A) is a HE-stained photograph and FIG. 10 (B).
  • FIG. 10C is a partially enlarged photograph of FIG. 10B
  • FIG. 10D is an immunostained photograph
  • FIGS. 10E to 10H are ascorbic acid in the medium.
  • FIG. 10 (E) is a photograph showing HE staining
  • FIG. 10 (E) is a photograph showing HE staining
  • FIG. 10 (F) is a photograph of TUNEL / DAPI staining
  • FIG. 10 (G) is a photograph showing FIG. 10 (G).
  • F) Partial enlarged photograph and FIG. 10 (H) are immunostained photographs.
  • FIGS. 11 (A) to (C) are photographs showing the state of cell spheroids produced without adding ascorbic acid to the medium after freezing and thawing 5 days
  • FIG. 11 (A) is a HE-stained photograph.
  • FIG. 11 (B) is a photograph of TUNEL / DAPI staining
  • FIG. 11 (C) is a partially enlarged photograph of FIG. 11 (B)
  • FIGS. 11 (D) to (F) are cells produced by adding ascorbic acid to the medium.
  • FIG. 11 (B) is a photograph of TUNEL / DAPI staining
  • FIG. 11 (C) is a partially enlarged photograph of FIG. 11 (B)
  • FIG. 11 (D) is a HE-stained photograph
  • FIG. 11 (E) is a TUNEL / DAPI-stained photograph
  • FIG. 11 (F) is a partially enlarged photograph of FIG. 11 (E). It is. It is a graph which shows the ratio of the dead cell 5 days after the melt
  • FIG. 14A is a CT photograph 4 weeks after transplanting C-MSCs into a rat calvaria
  • FIG. 14A is a photograph in which transplantation was not performed
  • FIG. 14B is a M-MSCs cryopreserved in DMSO cryopreservation solution.
  • 14 (C) is a photograph of transplanted C-MSCs cryopreserved by Cell Banker (trade name: Takara Bio Inc.), and FIG. 14 (D) is Bambaker (trade name: Wako Pure Chemical Industries Ltd.). This is a photograph of transplanted C-MSCs cryopreserved by the company.
  • FIG. 15A is a photograph showing HE-stained photographs
  • FIG. 15B is a TUNEL / DAPI stained photograph
  • FIG. 15C is a TUNEL-stained part.
  • An enlarged photograph, FIG. 15D is a partially enlarged photograph stained with TUNEL / DAPI.
  • FIG. 15A is a photograph showing HE-stained photographs
  • FIG. 15B is a TUNEL / DAPI stained photograph
  • FIG. 15C is a TUNEL-stained part.
  • FIG. 16A is a CT photograph of a rat calvaria showing the transplantation effect of C-MSCs
  • FIG. 16A is a photograph in which transplantation was not performed
  • FIG. 16B is a photograph four weeks after transplantation of C-MSCs.
  • FIG. 17A is a cross-sectional photograph of HE-stained rat calvaria showing the transplantation effect of C-MSCs
  • FIG. 17A is a photograph in which transplantation was not performed
  • FIG. 17B is a photograph four weeks after transplanting C-MSCs. It is.
  • the frozen cell agglomeration according to the present embodiment is a frozen cell agglomeration in which a plurality of mesenchymal stem cells are agglomerated and formed into a granular shape.
  • the frozen cell agglomerate may be of a size according to the form to be used.
  • a bone destruction disease such as a fracture or periodontitis
  • It is preferably a size that can be easily transplanted into a diameter of 0.5 mm to 1.5 mm, more preferably 0.8 mm to 1.2 mm.
  • the transplant refers to a form used for tissue regeneration regardless of a technique such as a form in which a bone defect site is directly implanted and used, or a form in which tissue regeneration is performed by injection into the body by injection or the like.
  • a technique such as a form in which a bone defect site is directly implanted and used, or a form in which tissue regeneration is performed by injection into the body by injection or the like.
  • Frozen cell clumps are thawed before transplant surgery and used for transplant surgery.
  • a frozen cell agglomerate retains its form after thawing and does not lose cell function.
  • the frozen cell agglomeration exhibits tissue regeneration ability by transplanting into a defective tissue.
  • the frozen cell agglomeration can be thawed by various methods such as removing the cryopreservation container containing the frozen cell agglomerate from a freezer and placing it at room temperature or in a warm bath (eg, 40 ° C. to 60 ° C.). It can be carried out.
  • the above-mentioned frozen cell agglomeration can be produced as follows. First, the collected mesenchymal stem cells are cultured in a growth medium containing a factor that causes MSC to produce collagen using a culture vessel such as a culture dish. As the mesenchymal stem cells, those collected from various tissues such as a patient's bone marrow, adipose tissue, placental tissue or umbilical cord tissue, dental pulp and the like are used.
  • the growth medium may be any medium that allows mesenchymal stem cells to grow, and a commercially available growth medium (for example, DMEM (Dulbecco's Modified a Eagle's Medium) + 10% FBS (fetal bovine serum)) may be used.
  • DMEM Denstrength Enzyme
  • FBS fetal bovine serum
  • Factors that cause MSC to produce collagen are not limited as long as they can cause MSC to produce collagen as a result. Examples include ascorbic acid, steroids such as dexamethasone, cytokines, and the like. An acid is preferred.
  • cell sheet a sheet-like cell population (hereinafter cell sheet) is formed. Then, the periphery of the cell sheet adheres to the edge of the incubator and grows until it reaches confluence.
  • the edge of the cell sheet adhered to the peripheral wall of the incubator is separated from the incubator.
  • the cell sheet can be separated from the incubator by inserting a thin rod into the inner wall of the incubator to which the edge of the cell sheet is adhered and moving the rod once along the inner wall of the incubator. As a result, the cell sheet floats.
  • This floating cell sheet is wrapped by self-aggregation. And it becomes a cluster mesenchymal stem cell conglomerate using the extracellular matrix (ECM: extracellular matrix) which a mesenchymal stem cell itself produces. In this way, a granular cell clump can be obtained.
  • ECM extracellular matrix
  • the incubator is a cylindrical one having a size of 1.5 cm 2 to 2.5 cm 2
  • cell agglomerates having a particle size of 0.5 mm to 1.5 mm can be obtained.
  • a 24-well plate having a surface area of 2 cm 2 may be used as the incubator.
  • a spheroid-shaped cell cluster when obtaining a spheroid-shaped cell cluster, it can be produced as follows.
  • MSCs When MSCs are cultured in a growth medium so as to float, the MSCs aggregate and become granular due to cell-cell adhesion. Thereafter, a substance that causes the MSC to produce collagen is added to the growth medium. As a result, MSC produces collagen, and a spheroid-shaped cell cluster containing abundant collagen as compared with normal cell spheroids is obtained.
  • the resulting MSC transplant is placed in a cryopreservation container such as a cryopreservation vial together with a cryopreservation agent and cryopreserved. In this way, a frozen transplant can be obtained.
  • a cryopreservation container such as a cryopreservation vial together with a cryopreservation agent and cryopreserved.
  • cryopreservation agent various preservation solutions for cell freezing may be used.
  • a cryopreservation solution containing 10% DMSO (Dimethyl sulfoxide), 20% FBS, 70% DMEM, a commercially available cell bank (product) Name: Takara Bio Inc.), Bambanker (trade name: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like.
  • the cryopreservation may be performed at a temperature of -70 ° C to -90 ° C, preferably -75 ° C to -85 ° C.
  • the cryopreservation can be performed by various methods such as placing the storage container in a freezer. When long-term storage for one month or longer is performed, the storage container may be placed at the above temperature for 24 hours, and then transferred to a liquid nitrogen tank ( ⁇ 196 ° C.) for storage.
  • an MSC graft using an artificial scaffold material for example, hydroxyapatite, tricalcium phosphate apatite, polylactic acid, chitosan, atelocollagen gel, hyaluronic acid gel, etc.
  • an artificial scaffold material for example, hydroxyapatite, tricalcium phosphate apatite, polylactic acid, chitosan, atelocollagen gel, hyaluronic acid gel, etc.
  • the physical properties of the artificial scaffold material change when frozen. Since it does not function as an MSC transplant after thawing, it has not been cryopreserved.
  • cell sheets and cell spheroids are available as transplants that do not use a scaffold material, but these cannot be cryopreserved because they cannot be maintained in their respective forms after freezing and thawing, as described in the examples below.
  • the frozen cell agglomeration according to the present embodiment is in a state of being cryopreserved after producing the MSC cell agglomeration, the MSC cell agglomeration is produced from the MSC separated from the patient, and its cell function And cell uniformity can be inspected in advance. And it inspects and selects only the thing of fixed quality, and is cryopreserved as a frozen cell conglomerate.
  • the MSC transplant which is a mass-controlled MSC cell cluster, can be reliably supplied on the day of transplantation, and the situation where the transplantation operation is postponed can be prevented.
  • bone marrow mesenchymal stem cells isolated from periodontitis patients are formed into MSC transplants, and are cryopreserved after examination of cell function / contamination.
  • basic periodontal treatment such as removal of infection source and reduction of inflammation required before transplantation is completed, and then the quality-controlled MSC transplant is melted on the day of transplantation and transplanted to the defective tissue.
  • Periodontal tissue regeneration can be realized.
  • MSC is considered to be a cell applicable to allogeneic transplantation. Therefore, when an MSC supply system for other transplantation such as an MSC bank is constructed, the MSC is not frozen as it is, but frozen in the form of MSC cell agglomerates so that it can be promptly used when needed by the patient. In addition, it becomes possible to perform cell preparation medical treatment that can reliably provide a good MSC cell cluster.
  • GM medium Growth medium in which 10% FBS (Biowest), 100 U / mL penicillin (Sigma), 100 ⁇ g / mL streptomycin (Sigma), and 500 ng / mL amphotericin B (Invitrogen) were added to DMEM (Sigma). Then, the collected mesenchymal stem cells were cultured. After 24 hours, non-adherent cells were removed, and the third passage cells obtained by further culturing the adherent cells were used in the following experiments.
  • MSCs were seeded on a 24-well culture plate at a rate of 7.0 ⁇ 10 4 cells / well and cultured in a growth medium (DMEM + 10% FBS) supplemented with L-ascorbic acid (50 ⁇ g / mL) for 7 hours.
  • DMEM + 10% FBS a growth medium supplemented with L-ascorbic acid (50 ⁇ g / mL) for 7 hours.
  • a cell sheet composed of an MSC / ECM complex is formed by the extracellular matrix produced by MSC itself, and the periphery of the cell sheet comes into contact with the peripheral wall of the 24-well culture plate and reaches a confluent state.
  • the periphery of the cell sheet was peeled off from the 24-well culture plate using the tip of. This caused the cell sheet to float and wrap around itself.
  • C-MSCs MSC transplants
  • C-MSCs (1 ⁇ 10 5 cells), soaked in 500 ⁇ L of cryopreservation solution, and frozen in a deep freezer at ⁇ 80 ° C. without pre-freezing using a 1.5 mL freezing vial .
  • DMSO cryopreservation solution a cryopreservation solution (hereinafter, DMSO cryopreservation solution) in which 10% DMSO, 20% FBS, and 70% DMEM are mixed, Cell banker (trade name: Takara Bio Inc.), and Bambanker (trade name: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used for each.
  • C-MSCs were immersed in a 24-well culture plate containing 500 ⁇ L normal medium (DMEM + 10% FBS) and cultured again.
  • FIG. 1 shows the result. Note that C-MSCs that were not frozen (control) were also performed, and Cell viability in FIG. 1 is shown as a relative value to the control.
  • FIG. 1 shows that C-MSCs frozen in any of the cryopreservation solutions were not significantly different from the control, and the cell survival activity of the frozen C-MSCs was higher than that in the case where freezing was not performed. It was not inferior.
  • FIG. 2 it was confirmed that cells were released from all C-MSCs. Thereby, it was confirmed that a normal function as a transplant can be exhibited.
  • FIG. 4 shows an HE-stained image of a cell sheet
  • FIG. 5 shows an HE-stained image of a cell spheroid.
  • Cell sheets and cell spheroids were prepared and used referring to “Akabane M et al., 2008, J Tissue Eng Regen Med” and “Priya R et al., 2012, Cell Tissue Res”, respectively.
  • FIG. 4 it can be seen that the morphology of the cell sheet collapses in a time-dependent manner.
  • FIG. 5 like the cell sheet, the form of the cell spheroid is decaying in a time-dependent manner.
  • the cell sheets and cell spheroids collapsed when stored frozen and cannot be used as transplants.
  • the cell sheet had a rough substrate, and the cell spheroids were formed by cell-cell adhesion with less substrate (extracellular matrix). Freezing ice crystals are thought to have damaged the morphology.
  • TUNEL assays were performed on C-MSCs before freezing, and C-MSCs, cell sheets, and cell spheroids 5 days after freezing and thawing.
  • C-MSCs can be frozen and stored even after freezing and thawing, and can be cryopreserved.
  • cell sheets and spheroids are frozen, many cell deaths occur, and cryopreservation occurs. I confirmed that I could not.
  • the C-MSCs were soaked one by one in 500 ⁇ l of DMSO cryopreservation solution and cryopreserved by the same method as described above. After 48 hours, the mixture was thawed in the same manner as described above and cultured in 500 ⁇ l of GM medium. Five days after thawing, C-MSCs were fixed with 1% formaldehyde and embedded in paraffin, and 5 ⁇ m and 20 ⁇ m sections were prepared successively. A 5 ⁇ m section was stained with HE, and the histological structure was observed with an optical microscope. 20 ⁇ m sections were stained with TUNEL using DeadEnd® Fluorometric® terminal® deoxynucleotidyl® transferase® System, and the number of dead cells was observed with a confocal laser microscope.
  • FIGS. 7 (A) to (D) and FIGS. 8 (A) to (C) show the state of the collagenase ( ⁇ ) group before cryopreservation and after 5 days of thawing
  • FIGS. H) and FIGS. 8D to 8F show the state of the collagenase (+) group before cryopreservation and 5 days after thawing.
  • a portion with high luminance (as an example, surrounded by a broken line) Represents the nucleus of dead cells.
  • FIG. 7 (D) shows that the expression level of Type I collagen decreased before cryopreservation by treating collagenase with C-MSCs. 8 (D) to (F), it was observed that the collagenase (+) group was deformed after freezing and thawing and the number of dead cells increased.
  • the collagenase ( ⁇ ) group which is a normal C-MSCs, maintained its form after freezing and thawing, and the number of dead cells was small, as seen in FIGS. 8 (A) to (C). .
  • FIG. 9 shows the cell death rate in the collagenase ( ⁇ ) group and the collagenase (+) group. From FIG. 9, a significant difference appears in the rate of cell death between the collagenase ( ⁇ ) group and the collagenase (+). From the above, in C-MSCs, it was suggested that ECM mainly composed of collagen exhibits a protective effect against freezing.
  • C-MSCs can be cryopreserved due to the protective effect of ECM, it can be cryopreserved in the form of cell spheroids as long as collagen is produced from the cells. It was verified whether it could be stored.
  • MSCs were seeded on an ultra low binding 24 well plate at a cell density of 2 ⁇ 10 5 cells / well and cultured in GM medium for 4 days to obtain cell spheroids (VC ( ⁇ ) group) composed of MSCs.
  • VC ( ⁇ ) group cell spheroids
  • cell spheroids were also prepared by adding 50 ⁇ g / ml ascorbic acid (Sigma) to GM medium after MSC aggregated during culture (VC (+) group).
  • the cell spheroids were soaked one by one in 500 ⁇ l of DMSO cryopreservation solution and frozen at ⁇ 80 ° C. using a 1.5 ml freezing vial (True line). After 48 hours, it was rapidly thawed in a constant temperature water bath set at 37 ° C., replated on a 24-well culture plate, and cultured in 500 ⁇ l GM medium.
  • the cell spheroids were thawed and fixed with 1% formaldehyde after 5 days, embedded in paraffin, and continuously sliced at 5 ⁇ m and 20 ⁇ m. A 5 ⁇ m section was stained with hematoxylin-eosin (HE staining), and the histological structure was observed with an optical microscope. 20 ⁇ m sections were stained with DeadEnd Fluorometric terminal deoxynucleotidyl transfer system (Promega) and the number of dead cells was observed with a confocal laser microscope.
  • FIGS. 11 (A) to (C) show the state of the VC ( ⁇ ) group before cryopreservation and after 5 days of thawing, and 10 (E) to (H).
  • 11 (D) to (F) show the state of the VC (+) group before cryopreservation and 5 days after thawing, respectively.
  • 10B, FIG. 10B, FIG. 11B, FIG. 10C, FIG. 10E, and FIG. 10F a portion with high luminance (a portion surrounded by a broken line as an example). Represents the nucleus of dead cells.
  • FIG. 10 (D) shows that the expression level of Type I collagen is low in the spheroids of the VC ( ⁇ ) group with no ascorbic acid added.
  • 11 (A) to (C) after freezing and thawing, the form collapsed and an increase in dead cells was observed.
  • FIG. 10 (H) high type I collagen expression was observed in the spheroids of the VC (+) group added with ascorbic acid.
  • 11 (D) to 11 (F) the shape was maintained after freezing and thawing, and the number of dead cells was small.
  • FIG. 12 shows the ratio of dead cells 5 days after thawing in the VC (+) group and the VC ( ⁇ ) group. From FIG. 12, there is a significant difference in the rate of cell death between the VC (+) group and the VC ( ⁇ ) group. From the above, it was found that even cell spheroids can be cryopreserved by producing abundant ECM.
  • C-MSCs were cultured in a normal medium (GM) and a mineralization induction medium (OIM) using a low adhesion culture dish. Then, the amount of calcium deposition in C-MSCs was quantified after 5 days and 10 days of culture.
  • GM normal medium
  • OFIM mineralization induction medium
  • CT Computerputed Tomography
  • Fig. 14 shows a CT photograph. B-regeneration is induced in C-MSCs that have been cryopreserved with any of the cryogens compared to those that were not transplanted.
  • C-MSCs were cryopreserved for 6 months using a DMSO cryopreservation solution in the same manner as described above. Then, C-MSCs were melted by the same method as described above. The C-MSCs were subjected to HE staining, TUNEL staining, and DIPI staining. The result is shown in FIG.
  • FIG. 15 shows that the morphology of C-MSCs cryopreserved for 6 months was maintained, and no marked increase in dead cells was observed.
  • FIG. 16 shows a CT photograph.
  • FIG. 17 shows a cross-sectional photograph stained with HE. It can be seen that bone regeneration is promoted in the calvaria transplanted with the C-MSCs of FIGS. 16 (B) and 17 (B) as compared to the controls of FIGS. 16 (A) and 17 (A). Therefore, it was confirmed that even if C-MSCs were cryopreserved for as long as 6 months, they could be thawed and transplanted to promote bone regeneration.
  • cryopreserved C-MSCs could be used for regenerative medicine by transplantation surgery without losing the function as a transplant even when thawed.
  • the frozen cell agglomeration according to the present invention can be used in transplantation regenerative medicine and the like.

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Abstract

凍結細胞集塊は、間葉系幹細胞が粒状に形成され、凍結状態の細胞集塊である。凍結細胞集塊の製造方法は、間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて間葉系幹細胞を培養し、間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、増殖培地から分離した細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する。

Description

凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法
　本発明は、凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法に関する。
　間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Mesenchymal stem cell）は多分化能・自己増殖能を有しており、遺伝子導入などが不要であるとともに、患者から確実に得られるため、組織再生療法に適した細胞である。
　例えば、骨折や歯周炎などの骨破壊疾患に対して、現在のＭＳＣ移植治療法では、患者からＭＳＣを分離、増殖させ、細胞数を十分に確保して一旦凍結保存しておく。その後、患者への移植手術の直前に、凍結保存しておいたＭＳＣを融解し、ＣＰＣ（Cell Processing Center）で培養してＭＳＣが集塊状の形態となったＭＳＣ移植体の形態に加工する。
　例えば、融解したＭＳＣを人工足場材料（ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムアパタイト、ポリ乳酸、キトサン、アテロコラーゲンゲル、ヒアルロン酸ゲルなど）と混和して培養することで、ＭＳＣ移植体が作成される。そして、このＭＳＣ移植体が患者の欠損組織に移植され、ＭＳＣの組織再生能を発揮させる。
　また、近年では、人工足場材料を要しないＭＳＣ移植体があり、このようなＭＳＣ移植体として、細胞シートや細胞スフェロイドのほか、細胞集塊（非特許文献１）がある。
M KITTAKA, M KAJIYA, H SHIBA, M TAKEWAKI, K TAKESHITA, R KHUNG, T FUJITA, T IWATA, T Q NGUYEN, K OUHARA, K TAKEDA, T FUJITA, H KURIHARA; "Clumps of a mesenchymal stromal cell/extracellular matrix complex can be a novel tissue engineering therapy for bone regeneration"; International Society for Cellular Therapy; Cytotherapy, 2015, 17, 860-873
　これまでのＭＳＣ移植体は、移植手術の直前に、凍結保存しておいたＭＳＣを融解してから製造されている。移植手術の直前の限られた期間内に、その都度ＭＳＣ移植体を作製することから、ＭＳＣ移植体に含まれる細胞数や細胞機能を均一にできる保証はない。このため、所望のＭＳＣ移植体を製造できなかった場合には、移植手術が延期されることがある。
　本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、集塊状で凍結保存可能な凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法を提供することにある。
　本発明の第１の観点に係る凍結細胞集塊は、
　間葉系幹細胞が粒状に形成され、凍結状態の細胞集塊である、
　ことを特徴とする。
　また、前記凍結細胞集塊が０．５ｍｍ～１．５ｍｍ径の粒状であることが好ましい。
　また、前記凍結細胞集塊が０．８ｍｍ～１．２ｍｍ径の粒状であることが好ましい。
　本発明の第２の観点に係る凍結細胞集塊の製造方法は、
　間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養し、
　前記間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
　前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
　ことを特徴とする。
　本発明の第３の観点に係る凍結細胞集塊の製造方法は、
　間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養して細胞シートを形成し、
　前記細胞シートの周囲を自由縁にして自己凝集作用によって粒状の細胞集塊を形成し、
　前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
　ことを特徴とする。
　また、培養容器にて前記間葉系幹細胞を培養してコンフルエントになるまで増殖させ、
　前記培養容器の周壁に接着した前記細胞シートの縁を前記培養容器の周壁から離間させることにより、前記細胞シートの周囲を自由縁にしてもよい。
　１．５ｃｍ２～２．５ｃｍ２の円筒状の前記培養容器を用い、０．５ｍｍ～１．５ｍｍ径の粒状の細胞集塊を得てもよい。
　本発明の第４の観点に係る凍結細胞集塊の製造方法は、
　増殖培地にて間葉系幹細胞を培養して凝集させ、
　前記増殖培地に前記間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を添加して、前記間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
　前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
　ことを特徴とする。
　予備凍結を行わずに凍結保存してもよい。
　本発明に係る凍結細胞集塊は、ＭＳＣが集塊状の形態で凍結されているので、移植手術等において、直前の限られた期間内にＭＳＣ移植体の製造を行う必要がない。このため、移植手術が延期される事態を防ぐことができる。
細胞生存活性の測定結果を示すグラフである。 図２はＣ－ＭＳＣｓの位相差顕微鏡像を示す写真であり、図２（Ａ）は凍結保存しなかったＣ－ＭＳＣｓの写真、図２（Ｂ）はＤＭＳＯ凍結保存液で凍結保存したＣ－ＭＳＣｓの写真、図２（Ｃ）はＢａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）で凍結保存したＣ－ＭＳＣｓの写真、図２（Ｄ）はＣｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）で凍結保存したＣ－ＭＳＣｓの写真である。 Ｃ－ＭＳＣのＨＥ染色像を示す写真であり、図３（Ａ）は凍結前の写真、図３（Ｂ）は図３（Ａ）の部分拡大写真、図３（Ｃ）は融解１日後の写真、図３（Ｄ）は図３（Ｃ）の部分拡大写真、図３（Ｅ）は融解５日後の写真、図３（Ｆ）は図３（Ｅ）の部分拡大写真である。 細胞シートのＨＥ染色像を示す写真であり、図４（Ａ）は凍結前の写真、図４（Ｂ）は図４（Ａ）の部分拡大写真、図４（Ｃ）は融解１日後の写真、図４（Ｄ）は図４（Ｃ）の部分拡大写真、図４（Ｅ）は融解５日後の写真、図４（Ｆ）は図４（Ｅ）の部分拡大写真である。 細胞スフェロイドのＨＥ染色像を示す写真であり、図５（Ａ）は凍結前の写真、図５（Ｂ）は図５（Ａ）の部分拡大写真、図５（Ｃ）は融解１日後の写真、図５（Ｄ）は図５（Ｃ）の部分拡大写真、図５（Ｅ）は融解５日後の写真、図５（Ｆ）は図５（Ｅ）の部分拡大写真である。 凍結前のＣ－ＭＳＣｓ、並びに、凍結して融解した５日後のＣ－ＭＳＣｓ、細胞シート及び細胞スフェロイドの細胞死の割合を示すグラフである。 図７（Ａ）～（Ｄ）は、コラゲナーゼを添加しなかったＣ－ＭＳＣｓの凍結保存前の状態を示す写真であり、図７（Ａ）はＨＥ染色写真、図７（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図７（Ｃ）は図７（Ｂ）の部分拡大写真、図７（Ｄ）は免疫染色写真、図７（Ｅ）～（Ｈ）は、コラゲナーゼを添加したＣ－ＭＳＣｓの凍結保存前の状態を示す写真であり、図７（Ｅ）はＨＥ染色写真、図７（Ｆ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図７（Ｇ）は図７（Ｆ）の部分拡大写真、図７（Ｈ）は免疫染色写真である。 図８（Ａ）～（Ｃ）は、コラゲナーゼを添加しなかったＣ－ＭＳＣｓを凍結保存して融解５日後の状態を示す写真であり、図８（Ａ）はＨＥ染色写真、図８（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図８（Ｃ）は図８（Ｂ）の部分拡大写真、図８（Ｄ）～（Ｆ）は、コラゲナーゼを添加したＣ－ＭＳＣｓの凍結保存して融解５日後の状態を示す写真であり、図８（Ｄ）はＨＥ染色写真、図８（Ｅ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図８（Ｆ）は図８（Ｅ）の部分拡大写真である。 Ｃ－ＭＳＣｓの融解５日後における死細胞の割合を示すグラフである。 図１０（Ａ）～（Ｄ）は、アスコルビン酸を培地に添加せずに製造した細胞スフェロイドの凍結保存前の状態を示す写真であり、図１０（Ａ）はＨＥ染色写真、図１０（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１０（Ｃ）は図１０（Ｂ）の部分拡大写真、図１０（Ｄ）は免疫染色写真、図１０（Ｅ）～（Ｈ）は、アスコルビン酸を培地に添加して製造した細胞スフェロイドの凍結保存前の状態を示す写真であり、図１０（Ｅ）はＨＥ染色写真、図１０（Ｆ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１０（Ｇ）は図１０（Ｆ）の部分拡大写真、図１０（Ｈ）は免疫染色写真である。 図１１（Ａ）～（Ｃ）は、アスコルビン酸を培地に添加せずに製造した細胞スフェロイドを凍結保存して融解５日後の状態を示す写真であり、図１１（Ａ）はＨＥ染色写真、図１１（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１１（Ｃ）は図１１（Ｂ）の部分拡大写真、図１１（Ｄ）～（Ｆ）は、アスコルビン酸を培地に添加して製造した細胞スフェロイドの凍結保存前の状態を示す写真であり、図１１（Ｄ）はＨＥ染色写真、図１１（Ｅ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１１（Ｆ）は図１１（Ｅ）の部分拡大写真である。 細胞スフェロイドの融解５日後における死細胞の割合を示すグラフである。 石灰化誘導培地で培養したＣ－ＭＳＣｓ内のカルシウム沈着量を示すグラフである。 ラット頭蓋冠にＣ－ＭＳＣｓを移植して４週間後のＣＴ写真であり、図１４（Ａ）が移植を行わなかった写真、図１４（Ｂ）がＤＭＳＯ凍結保存液で凍結保存したＭ－ＭＳＣｓを移植した写真、図１４（Ｃ）がＣｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）で凍結保存したＣ－ＭＳＣｓを移植した写真、図１４（Ｄ）がＢａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）で凍結保存したＣ－ＭＳＣｓを移植した写真である。 長期凍結保存して融解したＣ－ＭＳＣｓの状態を示す写真であり、図１５（Ａ）がＨＥ染色写真、図１５（Ｂ）がＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１５（Ｃ）がＴＵＮＥＬ染色した部分拡大写真、図１５（Ｄ）がＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色した部分拡大写真である。 Ｃ－ＭＳＣｓの移植効果を示すラット頭蓋冠のＣＴ写真であり、図１６（Ａ）が移植を行わなかった写真、図１６（Ｂ）はＣ－ＭＳＣｓを移植して４週間後の写真である。 Ｃ－ＭＳＣｓの移植効果を示すラット頭蓋冠のＨＥ染色断面写真であり、図１７（Ａ）が移植を行わなかった写真、図１７（Ｂ）はＣ－ＭＳＣｓを移植して４週間後の写真である。
　本実施の形態に係る凍結細胞集塊は、複数の間葉系幹細胞が集塊状に、粒状に形成された凍結状態の細胞集塊である。
　凍結細胞集塊は、使用される形態に応じた大きさであればよく、例えば、凍結細胞集塊が骨折や歯周炎などの骨破壊疾患に対する移植体として使用される場合移植手術時に欠損組織に移植しやすい大きさであることが好ましく、０．５ｍｍ～１．５ｍｍ径、より好ましくは０．８ｍｍ～１．２ｍｍ径である。
　なお、ここで移植体とは、骨欠損部位など直接埋め込まれて使用される形態のほか、注射等による体内への注入により組織再生を図る形態など、手法を問わず、組織再生に用いられる形態全般をいう。
　凍結細胞集塊は、移植手術等の前に融解されて、移植手術等に用いられる。凍結細胞集塊は、融解後もその形態を保持し、細胞機能を失うことがないので、例えば、欠損組織に移植することで組織再生能を発揮する。なお、凍結細胞集塊の融解は、凍結細胞集塊が入れられている凍結保存容器をフリーザー等から取り出し、室温に置くことや温浴（例えば、４０℃～６０℃）に置くなど種々の手法で行うことができる。
　上記の凍結細胞集塊は、以下のようにして製造することができる。まず、採取した間葉系幹細胞を培養皿等の培養器を用い、ＭＳＣにコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地で培養する。間葉系幹細胞は、患者の髄、脂肪組織、胎盤組織又は臍帯組織、歯髄等、種々の組織から採取されたものが用いられる。
　増殖培地は、間葉系幹細胞を増殖させ得る培地であればよく、一般に市販されている増殖培地（例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)＋１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum））を用いればよい。また、ＭＳＣにコラーゲンを産生させる因子は、化合物やタンパク質など、結果としてＭＳＣにコラーゲンを産生させ得るものであれば限定されず、アスコルビン酸のほか、デキサメタゾン等のステロイドやサイトカイン等が挙げられ、アスコルビン酸であることが好ましい。
　間葉系幹細胞が増殖すると、シート状の細胞集団（以下、細胞シート）が形成される。そして、細胞シートの周囲が培養器の縁に接着し、コンフルエントに達するまで増殖させる。
　次いで、培養器の周壁に接着した細胞シートの縁を培養器から離間させる。例えば、細い棒体を細胞シートの縁が接着している培養器の内壁に差し込み、培養器の内壁に沿って棒体を一周移動させることにより、細胞シートを培養器から離間させることができる。これにより、細胞シートは浮遊することになる。
　この浮遊する細胞シートは自己凝集作用により、くるまってゆく。そして、間葉系幹細胞自身が産生する細胞外マトリクス（ＥＣＭ：extracellular matrix）を利用して塊状の間葉系幹細胞集塊となる。このようにして、粒状の細胞集塊を得ることができる。
　なお、培養器は１．５ｃｍ２～２．５ｃｍ２の円筒状のものを用いると、０．５ｍｍ～１．５ｍｍの粒径の細胞集塊が得られる。培養器として、例えば、表面積２ｃｍ２の２４ウェルプレートなどを用いればよい。
　また、スフェロイド形態の細胞集塊を得る場合、以下のようにして製造することができる。増殖培地でＭＳＣが浮遊するように培養すると、細胞間接着によってＭＳＣ同士が凝集、粒状になる。その後、ＭＳＣにコラーゲンを産生させる物質を増殖培地に添加する。これによりＭＳＣがコラーゲンを産生し、通常の細胞スフェロイドに比べて、コラーゲンを豊富に含んだスフェロイド形態の細胞集塊が得られる。
　得られたＭＳＣ移植体を凍結保存剤とともに凍結用バイアル等の凍結保存用の容器に入れ、凍結保存する。このようにして凍結移植体を得ることができる。
　凍結保存剤として、種々の細胞凍結用の保存液を用いればよく、例えば、１０％ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）、２０％ＦＢＳ、７０％ＤＭＥＭを含有する凍結保存液のほか、市販のＣｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）などの凍結保存液が挙げられる。
　凍結保存は、－７０℃～－９０℃、好ましくは－７５℃～－８５℃の温度で行えばよい。また、凍結保存は、保存容器をフリーザーに置くなど、種々の手法で行うことができる。また、一ヶ月以上の長期保存を行う場合では、保存容器を上記温度に２４時間置いた後、液体窒素タンク（－１９６℃）に移して保存してもよい。
　なお、凍結保存に際し、予備凍結を行わなくてもよい。予備凍結を行わずに直接凍結保存しても、ＭＳＣ移植体の細胞組織が崩壊することはほぼない。
　なお、人工足場材料（例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムアパタイト、ポリ乳酸、キトサン、アテロコラーゲンゲル、ヒアルロン酸ゲルなど）を用いたＭＳＣ移植体では、凍結させると人工足場材料の物性が変わってしまい、融解後にＭＳＣ移植体としての機能を発揮しないため、凍結保存はなされていない。また、足場材料を用いない移植体として、細胞シートや細胞スフェロイドがあるが、これらは後述の実施例でも記すように、凍結、融解後にそれぞれの形態を維持できないため、凍結保存はできなかった。
　一方、本実施の形態に係る凍結細胞集塊については、ＭＳＣ細胞集塊を作製した後に凍結保存された状態であることから、患者から分離したＭＳＣからＭＳＣ細胞集塊を作製し、その細胞機能や細胞の均一性を事前に検査することができる。そして、検査して一定品質のもののみを選別し、凍結細胞集塊として凍結保存される。これにより、品質管理されたＭＳＣ細胞集塊であるＭＳＣ移植体を移植日当日に確実に供給することが可能になり、移植手術が延期されるという事態を防ぐことができる。
　例えば、歯周炎患者から分離した骨髄間葉系幹細胞をＭＳＣ移植体の形にし、細胞機能・異物混入などの検査を行った後に凍結保存しておく。その間に移植前に必要となる感染源除去、炎症の軽減などの歯周基本治療を済ませておき、その後、移植日当日に品質管理されたＭＳＣ移植体を融解して欠損組織に移植することで歯周組織再生が実現できる。
　更には、ＭＳＣはその低い抗原性のため、他家移植に応用可能な細胞であると考えられている。したがって、ＭＳＣバンクなどの他家移植のためのＭＳＣ供給システムが構築された場合、ＭＳＣのまま凍結するのではなく、ＭＳＣ細胞集塊の形態で凍結保存することで、患者に必要な際に速やか且つ確実に良好なＭＳＣ細胞集塊を提供できる細胞製剤医療が行えるようにもなる。
（凍結移植体の作製、融解）
　３週齢ラットの大腿骨の骨髄から間葉系幹細胞を採取した。ＤＭＥＭ（Sigma）に１０％ＦＢＳ（Biowest）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Sigma）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Sigma）、及び、５００ｎｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Invitrogen）を添加した増殖培地（以下、ＧＭ培地）にて、採取した間葉系幹細胞を培養した。２４時間後、非接着性の細胞を取り除き、接着性の細胞を更に培養して得た第三継代細胞を以下の実験に用いた。
　２４ｗｅｌｌ培養プレートに、ＭＳＣを７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で播種し、Ｌ－アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を添加した増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で７時間培養した。
　培養することにより、ＭＳＣ自身が産生した細胞外マトリクスによりＭＳＣ/ＥＣＭ複合体からなる細胞シートが形成され、そして、細胞シートの周囲が２４ｗｅｌｌ培養プレートの周壁に接してコンフルエントまで達した後、マイクロピペットの先端を使って、細胞シートの周囲を２４ｗｅｌｌ培養プレートから剥がした。これにより、細胞シートは浮遊し、自らくるまっていった。
　そして、１日培養した後、直径０．９～１．２ｍｍの粒状の細胞集塊であるＭＳＣ移植体（以下、Ｃ－ＭＳＣｓと記す）を得た。
　Ｃ－ＭＳＣｓを１塊（２×１０５ｃｅｌｌｓ）、凍結保存液５００μＬに浸漬し、１．５ｍＬ凍結バイアルを用いて、予備凍結を行わずに、－８０℃のｄｅｅｐ　ｆｒｅｅｚｅｒ内に置いて凍結した。
　凍結保存液として、１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＢＳ、７０％ＤＭＥＭを混合した凍結保存液（以下、ＤＭＳＯ凍結保存液）、Ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）、及び、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）の３種を用い、それぞれについて行った。
　４８時間凍結後、３７℃に設定した恒温水槽で急速解凍して融解し、Ｃ－ＭＳＣｓを取り出した。そして、５００μＬ通常培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を入れた２４ｗｅｌｌ培養プレートにＣ－ＭＳＣｓを浸漬し、再度培養した。
（細胞生存活性の検証）
　それぞれのＣ－ＭＳＣｓを融解した後、Ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｋｉｔを用い、細胞生存活性を測定した。図１に、その結果を示す。なお、凍結しなかったＣ－ＭＳＣｓ（コントロール）についても行い、図１のＣｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙはコントロールに対する相対値として示している。
　図１を見ると、いずれの凍結保存液で凍結させたＣ－ＭＳＣｓについても、コントロールに対して有意差はなく、凍結させたＣ－ＭＳＣｓの細胞生存活性は、凍結を行わなかった場合に比べて劣ることはなかった。
　また、それぞれについて、位相差顕微鏡像を撮影した。その結果を図２に示す。図２を見ると、全てのＣ－ＭＳＣｓから細胞が遊出してくることが確認された。これにより、移植体としての正常な機能を発揮し得ることを確認した。
（ＨＥ染色による検証）
　Ｃ－ＭＳＣｓの凍結保存前、凍結保存して融解１日後、融解５日後について、ＨＥ（Hematoxylin-Eosin）染色を行って、ＨＥ染色像を撮影し、組織形態を観察した。ＨＥ染色像を図３に示す。
　図３を見ると、凍結保存前、融解１日後、融解５日後にかけて、Ｃ－ＭＳＣｓの形態はほぼ崩れておらず、Ｃ－ＭＳＣｓを凍結保存しても細胞及び基質が残存していることがわかる。
　また、Ｃ－ＭＳＣｓに代えて、細胞シート（２×１０５ｃｅｌｌｓ）、細胞スフェロイド（２×１０５ｃｅｌｌｓ）を用い、上記と同様にＤＭＳＯ凍結保存液を使用して凍結、融解を行った。そして、これらを上記と同様に、ＨＥ染色像を撮影した。図４に細胞シートのＨＥ染色像を、図５に細胞スフェロイドのＨＥ染色像を示す。なお、細胞シート、細胞スフェロイドは、それぞれ「Akabane M et al., 2008, J Tissue Eng Regen Med」、「Priya R et al., 2012, Cell Tissue Res」を参照して作製して用いた。
　図４を見ると、細胞シートの形態は時間依存的に崩壊していることがわかる。また、図５を見ると細胞シートと同様、細胞スフェロイドの形態は時間依存的に崩壊している。
　このように、細胞シート、細胞スフェロイドについては、凍結保存すると形態が崩壊し、移植体として利用できないことがわかる。Ｃ－ＭＳＣｓと比較して、細胞シートは基質が粗であったこと、細胞スフェロイドは基質（細胞外マトリクス）が少なく細胞間接着によって形成されているものであることから、いずれも凍結保存すると、凍結による氷晶がその形態を損傷したものと考えられる。
（ＴＵＮＥＬ（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法による検証）
　また、凍結前のＣ－ＭＳＣｓ、並びに、凍結して融解した５日後のＣ－ＭＳＣｓ、細胞シート及び細胞スフェロイドについて、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。
　その結果を図６に示す。凍結前のＣ－ＭＳＣｓの細胞死の割合は１．９６％であり、凍結、融解後のＣ－ＭＳＣｓでは５．４１％であった。Ｃ－ＭＳＣｓでは凍結、融解を経ても、さほど細胞死は増えていない。一方、凍結、融解後の細胞シート及び細胞スフェロイドでは、細胞死の割合が６５．６％、及び４４．８％と非常に高く、Ｃ－ＭＳＣｓに比べて非常に高い割合となっている。
　このように、Ｃ－ＭＳＣｓでは凍結、融解を経ても、細胞死はさほど生じず、凍結保存が可能であること、一方、細胞シート及び細胞スフェロイドでは凍結させると多くの細胞死が生じ、凍結保存ができないことを確認した。
（凍結Ｃ－ＭＳＣｓにおける細胞外マトリクスの役割の検討）
　Ｃ－ＭＳＣｓにおいては、細胞シートや細胞スフェロイドと異なり、細胞から細胞外マトリクスが豊富に産生されていることから凍結保存が可能になったと考えられる。これを検証すべく、細胞外マトリクスの主成分であるコラーゲンの分解酵素を用い、以下の検証実験を行った。
　上記と同様にしてＣ－ＭＳＣｓを作製した後、Ｃ－ＭＳＣｓを凍結する直前に３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン分解酵素（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ））を１５分間作用させた（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群）。
　このＣ－ＭＳＣｓを一塊ずつＤＭＳＯ凍結保存液５００μｌに浸漬し、上記と同様の手法で凍結保存した。４８時間後に上記と同様の手法で融解し、ＧＭ培地５００μｌで培養した。Ｃ－ＭＳＣｓを解凍５日後、１％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋を行い、連続して５μｍ、２０μｍの切片を作製した。５μｍの切片をＨＥ染色し、光学顕微鏡で組織学的構造を観察した。２０μｍ切片をDeadEnd Fluorometric terminal deoxynucleotidyl transferase SystemでＴＵＮＥＬ染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて死細胞数を観察した。
　また、コントロール実験として、コラーゲン分解酵素を作用させないもの（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（－）群）も同様に行った。
　図７（Ａ）～（Ｄ）、及び、図８（Ａ）～（Ｃ）にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（－）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態を、また、図７（Ｅ）～（Ｈ）、及び、図８（Ｄ）～（Ｆ）にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態を示す。なお、図７（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｇ）、図８（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）において、輝度が高い部位（一例として、破線で囲っている部位）が死細胞の細胞核を表している。
　図７（Ｄ）を見ると、Ｃ－ＭＳＣｓをｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ処理することで、凍結保存前にＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎの発現レベルが低下したことがわかる。そして、図８（Ｄ）～（Ｆ）を見ると、このｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群は、凍結融解後に形態が崩れ、死細胞が増加することが観察された。
　一方、通常のＣ－ＭＳＣｓであるｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（－）群は、図８（Ａ）～（Ｃ）を見ると、凍結融解後もその形態を保持しており、死細胞の数も僅かであった。
　また、図９にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（－）群、及び、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群における細胞死の割合を示す。図９から、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（－）群とｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）とでは、細胞死の割合において、有意差が現れている。以上のことから、Ｃ－ＭＳＣｓでは、コラーゲンを主成分とするＥＣＭが凍結に対する保護効果を発揮していることが示唆された。
（コラーゲンを産生させて作製した細胞スフェロイド形態のＭＳＣの凍結保存の検証）
　Ｃ－ＭＳＣｓではＥＣＭの保護効果により、凍結保存が可能であることから、細胞スフェロイドの形態においても、細胞からコラーゲンが産生されていれば、凍結保存が可能であると考え、スフェロイドの形態でも凍結保存が可能か否か検証を行った。
　ＭＳＣをｕｌｔｒａ　ｌｏｗ　ｂｉｎｄｉｎｇ　２４ｗｅｌｌプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、ＧＭ培地で４日間培養することで、ＭＳＣから構成される細胞スフェロイド（ＶＣ（－）群）を得た。
　また、培養中、ＭＳＣが凝集した後に、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）をＧＭ培地に添加して培養した細胞スフェロイドも作成した（ＶＣ（＋）群）。
　凍結保存前の細胞スフェロイドの生存性およびＥＣＭとしてのＴｙｐｅＩ　Ｃｏｌｌａｇｅｎの発現をＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ染色、および免疫染色にて観察した。
　更に、細胞スフェロイドを一塊ずつＤＭＳＯ凍結保存液５００μｌに浸漬し、１．５ｍｌ凍結バイアル（Ｔｒｕｅ　ｌｉｎｅ）を用いて－８０℃で凍結した。４８時間後、３７℃に設定した恒温水槽で急速解凍後、２４ｗｅｌｌ培養プレートに再播種し、５００μｌＧＭ培地で培養した。
　細胞スフェロイドを解凍して５日後に１％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋を行い、連続して５μｍ、２０μｍの切片を作製した。５μｍの切片をヘマトキシリン－エオジン染色（ＨＥ染色）し、光学顕微鏡で組織学的構造を観察した。２０μｍ切片をＤｅａｄＥｎｄ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＴＵＮＥＬ染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて死細胞数を観察した。
　図１０（Ａ）～（Ｄ）及び図１１（Ａ）～（Ｃ）に、ＶＣ（－）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態を、また、１０（Ｅ）～（Ｈ）及び図１１（Ｄ）～（Ｆ）に、ＶＣ（＋）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態をそれぞれ示す。なお、図１０（Ｂ）、（Ｆ）、（Ｇ）、図１１（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）において、輝度が高い部位（一例として、破線で囲っている部位）が死細胞の細胞核を表している。
　図１０（Ｄ）を見ると、アスコルビン酸無添加のＶＣ（－）群のスフェロイドでは、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎの発現レベルは低い。そして、図１１（Ａ）～（Ｃ）を見ると、凍結融解後、その形態は崩れ、死細胞の増加が観察された。
　一方、図１０（Ｈ）を見ると、アスコルビン酸添加のＶＣ（＋）群のスフェロイドでは高いＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎの発現が観察された。そして、図１１（Ｄ）～（Ｆ）を見ると、凍結融解後もその形態が保持され、死細胞の数も僅かであった。
　また、図１２に、ＶＣ（＋）群及びＶＣ（－）群の融解５日後の死細胞の割合を示す。図１２から、ＶＣ（＋）群とＶＣ（－）群とでは、細胞死の割合において、有意な差が現れている。以上のことから、細胞スフェロイドにおいても、ＥＣＭを豊富に産生させておくことで、凍結保存可能であることがわかった。
（石灰分化能の検証）
　続いて、Ｃ－ＭＳＣｓの石灰化分化能について検証した。低接着培養皿を用い、通常培地（ＧＭ）及び石灰化誘導培地（ＯＩＭ）にて、それぞれＣ－ＭＳＣｓを培養した。そして、培養５日後、及び、１０日後に、Ｃ－ＭＳＣｓ内のカルシウム沈着量を定量した。
　その結果を図１３に示す。図１３を見ると、凍結、融解しなかったＣ－ＭＳＣｓと同様、凍結、融解したＣ－ＭＳＣｓは、石灰化誘導培地での培養によってカルシウム沈着量が上昇しており、石灰化分化能が失われていないことを確認した。
（骨再生の検証）
　続いて、Ｃ－ＭＳＣｓの移植による骨再生の検証を行った。ラットの頭蓋冠１．６ｍｍ径骨欠損モデルに対し、凍結保存、融解したＣ－ＭＳＣｓを移植した。
　そして、移植して４週間後にＣＴ（Computed Tomography）撮影を行い、骨再生の有無について検証した。
　図１４にＣＴ写真を示す。いずれの凍結剤で凍結保存させたＣ－ＭＳＣｓについても、移植を行わなかったものと比較して、骨再生が誘導されている。
（Ｃ－ＭＳＣｓの長期凍結保存による影響の検証）
　上記と同様の手法にて、ＤＭＳＯ凍結保存液を用い、Ｃ－ＭＳＣｓを６ヶ月間凍結保存した。そして、上記と同様の手法にて、Ｃ－ＭＳＣｓを融解した。このＣ－ＭＳＣｓのＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＩＰＩ染色を行った。その結果を図１５に示す。
　図１５から、６ヶ月凍結保存されたＣ－ＭＳＣｓにおいてもその形態は保持されており、顕著な死細胞の増加は観察されなかった。
　更に、この６ヶ月凍結保存の後に融解したＣ－ＭＳＣｓを、上記と同様の手法にて、ラット頭蓋冠欠損モデルに移植し、骨再生の有無について検証した。図１６にＣＴ写真を示す。また、図１７にＨＥ染色した断面写真を示す。図１６（Ａ）、図１７（Ａ）のコントロールに対して、図１６（Ｂ）、図１７（Ｂ）のＣ－ＭＳＣｓを移植した頭蓋冠では、骨再生が促進されていることがわかる。したがって、Ｃ－ＭＳＣｓを６ヶ月間もの長期凍結保存をしても、これを融解し、移植することで骨再生を促進させ得ることを確認した。
　以上の検証から、凍結保存されたＣ－ＭＳＣｓは、融解しても移植体としての機能を損なわず、移植手術による再生医療に利用できることを立証した。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１６年４月２７日に出願された、日本国特許出願特願２０１６－８９１８８号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願２０１６－８９１８８号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明に係る凍結細胞集塊は、移植再生医療等にて利用可能である。

Claims (9)

  1. 　間葉系幹細胞が粒状に形成され、凍結状態の細胞集塊である、
    　ことを特徴とする凍結細胞集塊。
  2. 　前記凍結細胞集塊が０．５ｍｍ～１．５ｍｍ径の粒状である、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の凍結細胞集塊。
  3. 　前記凍結細胞集塊が０．８ｍｍ～１．２ｍｍ径の粒状である、
    　ことを特徴とする請求項２に記載の凍結細胞集塊。
  4. 　間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養し、
    　前記間葉系幹細胞から産生されたコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
    　前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
    　ことを特徴とする凍結細胞集塊の製造方法。
  5. 　間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養して細胞シートを形成し、
    　前記細胞シートの周囲を自由縁にして自己凝集作用によって粒状の細胞集塊を形成し、
    　前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
    　ことを特徴とする凍結細胞集塊の製造方法。
  6. 　培養容器にて前記間葉系幹細胞を培養してコンフルエントになるまで増殖させ、
    　前記培養容器の周壁に接着した前記細胞シートの縁を前記培養容器の周壁から離間させることにより、前記細胞シートの周囲を自由縁にする、
    　ことを特徴とする請求項５に記載の凍結細胞集塊の製造方法。
  7. 　１．５ｃｍ２～２．５ｃｍ２の円筒状の前記培養容器を用い、０．５ｍｍ～１．５ｍｍ径の粒状の前記細胞集塊を得る、
    　ことを特徴とする請求項６に記載の凍結細胞集塊の製造方法。
  8. 　増殖培地にて間葉系幹細胞を培養して凝集させ、
    　前記増殖培地に前記間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を添加して、前記間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
    　前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
    　ことを特徴とする凍結細胞集塊の製造方法。
  9. 　予備凍結を行わずに凍結保存する、
    　ことを特徴とする請求項４乃至８のいずれか一項に記載の凍結細胞集塊の製造方法。
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