WO2017187887A1 - 尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の検出による免疫複合体関連腎炎の検出 - Google Patents

尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の検出による免疫複合体関連腎炎の検出 Download PDF

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WO2017187887A1
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intersectin
protein
mrna
epithelial cells
glomerular epithelial
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PCT/JP2017/013606
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直憲 熊谷
倫明 阿部
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国立大学法人東北大学
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting immune complex-related nephritis using urinary intersectin 1 and / or intersectin 2 as a marker.
  • Immune complex-related nephritis refers to nephritis resulting from glomerular epithelial cell damage caused by the formation and deposition of immune complexes with IgG and corresponding antigens on glomerular epithelial cells, including membranous nephropathy and lupus nephritis It is.
  • Membranous nephropathy is a disease that causes nephrotic syndrome
  • lupus nephritis is one of the symptoms of systemic lupus erythematosus (see Non-Patent Document 1).
  • Intersectin 1 Intersectin 1
  • Intersectin 2 Intersectin 2
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting immune complex-related nephritis using the degree of expression of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in urine as an index, and a detection kit therefor.
  • the present inventors diligently investigated a noninvasive detection method for immune complex-related nephritis.
  • the present inventors have found that when IgG is deposited on glomerular epithelial cells, Intersectin 1 and Intersectin 2 are expressed at that site.
  • Intersectin 1 and Intersectin 2 were examined. As a result, in the membranous nephropathy and lupus nephritis which are immune complex related nephritis, It was found that Intersectin 1 and Intersectin 2 are strongly expressed. As a result, a method for detecting immune complex-related nephritis using urinary Intersectin 1 and / or Intersectin 2 as a marker has been completed.
  • the present invention is as follows. [1] A method for detecting immune complex-related nephritis by detecting Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of a subject. [2] Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of the subject is compared to Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of patients with nephritis other than immune complex-related nephritis or healthy subjects The method according to [1], wherein the subject is evaluated as suffering from immune complex-related nephritis.
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in urine is intersectin 1 protein and / or intersectin contained in glomerular epithelial cells present in urine or exosomes derived from glomerular epithelial cells.
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein contained in exosomes derived from glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cells present in urine are detected by immunocytochemical staining, [1] to One of the methods according to [4].
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein is extracted from glomerular epithelial cells existing in urine or exosomes derived from glomerular epithelial cells, // The method according to any one of [1] to [4], wherein the intersectin 2 protein is detected. [8] The method according to [7], wherein the intersectin 1 protein and / or the intersectin 2 protein is detected by immunochromatography.
  • Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA is extracted from exosomes derived from glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cells present in urine, mRNA is amplified and Intersectin 1 mRNA and / or Alternatively, the method of any one of [1] to [4], wherein Intersectin 2 mRNA is detected.
  • Immune complex-related nephritis is detected by detecting urinary Intersectin 1 and / or Intersectin 2 comprising at least an antibody against Intersectin 1 protein and / or an antibody against Intersectin 2 protein. Kit for detection.
  • Kidney biopsy is an invasive examination, and the physical, mental, and time burdens of the patient are strong and the medical expenses cannot be ignored.
  • immune complex-related nephritis can be diagnosed by detecting Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in urine.
  • the method of the present invention can diagnose immune complex-related nephritis noninvasively, at a lower cost, more easily, and in a shorter time than conventional methods.
  • FIG. 1A shows the result of having dye
  • FIG. 2A shows the result of having dye
  • FIG. 2A shows the result of having dye
  • Renal biopsy tissues of membranous nephropathy patients (FIG. 4A), nephrosclerosis patients (FIG. 4B), minute change patients (FIG. 4C), and IgA nephropathy patients (FIG. 4D) recognize intersectin 2. It is a figure which shows the result dye
  • the present invention is a method for detecting immune complex-related nephritis using urinary Intersectin 1 (ITSN1) and / or Intersectin 2 (ISTN2) as a marker.
  • the detection includes evaluating and determining whether or not the patient suffers from immune complex-related nephritis.
  • the present invention obtains auxiliary data for diagnosing whether or not a subject suffers from immune complex-related nephritis using urinary intersectin 1 and / or intersectin 2 as a marker. It is a method to do.
  • Intersectin 1 and Intersectin 2 are multifunctional molecules that are produced intracellularly and are not secreted outside the cell. At present, the detailed pathophysiological role is unknown. Broadly speaking, Intersectin 1 has two variants, ITSN1S and ITSN1L, and Intersectin 2 has two variants, ITSN2S and ITSN2L.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding ITSN1S and the amino acid sequence of ITSN1S are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding ITSN1L and the amino acid sequence of ITSN1L are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • the base sequence of the gene encoding ITSN2S and the amino acid sequence of ITSN2S are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the base sequence of the gene encoding ITSN2L and the amino acid sequence of ITSN2L are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: It is shown in FIG.
  • Immune complex-associated nephritis refers to nephritis that results from glomerular epithelial cell damage due to the formation and deposition of immune complexes by IgG and corresponding antigens on glomerular epithelial cells, etc., and IgG is deposited on glomerular epithelial cells. It is characterized by being recognized.
  • Immune complex-related nephritis includes membranous nephropathy and lupus nephritis.
  • Membranous nephropathy is a nephropathy that causes nephrotic syndrome.
  • Lupus nephritis is a renal disease caused by systemic lupus erythematosus (SLE), and can be classified into type 1, type 2, type 3, type 4, type 5, and type 6 lupus nephritis.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 are expressed at that site.
  • expression of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in kidney cells indicates that IgG was deposited at the site, indicating morbidity of immune complex-related nephritis.
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 are expressed and produced in cells of glomerular epithelial cells (podocytes) on which IgG is deposited. However, it is not secreted extracellularly. In the present invention, it is only necessary to detect Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in glomerular epithelial cells in urine, where an increase is observed in a subject suffering from renal disease. In addition, since it is also contained in exosomes, which are membrane vesicles with a diameter of 30 to 100 nm, secreted by glomerular epithelial cells, Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in exosomes may be detected.
  • exosomes which are membrane vesicles with a diameter of 30 to 100 nm
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 is expressed in the glomerular epithelial cells of a subject suffering from immune complex-related nephritis, so in the glomerular epithelial cells or glomerular epithelium present in the urine of the subject What is necessary is just to detect the Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in the exosome derived from a cell, or Intersectin 1 (TM) mRNA and / or Intersectin 2 * mRNA.
  • TM Intersectin 1
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein is performed by extracting a protein from glomerular epithelial cells in urine or exosomes derived from glomerular epithelial cells, and Intersectin 1 protein and / or Alternatively, it can be carried out by measuring Intersectin 2 protein. Moreover, it can also carry out by the technique of immunocytochemistry.
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in the glomerular epithelial cells or Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA are extracted by crushing the cells and extracting the internal protein or mRNA.
  • a method of suspending cells in a hypotonic solution and crushing the cells by osmotic shock a method of freezing and thawing the cells and crushing the cells, a method of lysing the cell membrane with a surfactant or the like
  • Examples thereof include a method for disrupting cells by ultrasonic treatment, a method for disrupting cell membranes with enzymes, and a method for disrupting cells using a homogenizer or mixer.
  • a protease inhibitor such as PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) is added to suppress degradation of Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein, or Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA It is preferable to add an RNase inhibitor in order to suppress the decomposition of the RNase.
  • PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride
  • a known immunoassay method such as immunochromatography, ELISA, or radioimmunoassay may be used.
  • an antibody against Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein is required.
  • Anti-intersectin 1 antibody and anti-intersectin 2 antibody can be prepared as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody by a known method. That's fine.
  • Commercially available anti-intersectin 1 antibody and anti-intersectin 2 antibody can also be used.
  • Intersectin 1 has two variants, ITSN1S and ITSN1L
  • Intersectin 2 has two variants, ITSN2S and ITSN2L
  • Examples of commercially available antibodies include anti-ITSN1 sc-9948 (santa cruz), anti-ITSN1L sc-9950 (santa cruz), anti-ITSN2 sc-9952 (santa cruz), and anti-ITSN2L sc-9954 (santa cruz).
  • ITSN1 sc-9948 recognizes ITSN1S and ITSN1L
  • anti-ITSN1L sc-9950 recognizes only ITSN1L.
  • Anti-ITSN2 sc-9952 recognizes ITSN2S and ITSN2L
  • anti-ITSN2L sc-9954 recognizes only ITSN2L. Any of these antibodies can be used for detection of the intersectin 1 protein and / or the intersectin 2 protein in the present invention.
  • Intersectin 1 and Intersectin 2 exhibit the same behavior, and both may be expressed at the same time, so either one of Intersectin 1 or Intersectin 2 may be detected.
  • the antibody is labeled with an enzyme, a particulate dye, a fluorescent substance, or a radioisotope, if necessary.
  • the antibody can be labeled by a known method.
  • the measurement by the immunocytochemistry technique may be performed by preparing a specimen by fixing the collected cells or exosomes on a substrate such as a glass slide using an organic solvent such as ethanol or formalin.
  • an antibody against Intersectin 1 protein and / or an antibody against Intersectin 2 protein labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a radioisotope, etc. may be used.
  • a secondary antibody against an antibody that binds to Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein after binding an antibody against Sectin 2 protein to Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in the specimen A secondary antibody labeled with an enzyme, a fluorescent substance or the like may be used.
  • Examples of enzymes used for labeling include horseradish peroxidase and alkaline phosphatase.
  • fluorescent substances include fluorescein and rhodamine.
  • staining may be performed using a known biotin-avidin complex.
  • the particulate dye include colored polystyrene particles and metal colloid particles that can be used for immunochromatographic labeled antibodies. In immunocytochemistry, staining can be determined with a microscope or the naked eye, or an appropriate optical measuring device may be used.
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein When detecting the expression of Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein by immunocytochemistry, it is the glomerular epithelium that Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein is expressed and present. In order to confirm that the cells are cells, it is preferable to co-stain a glomerular epithelial cell marker in addition to staining of the Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein.
  • glomerular epithelial cell markers include Synaptopodin, podocalyxin, C3b receptor, PP44, Nephrin, WT1, Podocin, ZO-1, actin, ⁇ -Actini-4, CD2AP, GLEPP-1, and Nestin.
  • Staining of these markers can be performed using an antibody against a glomerular epithelial cell marker such as an anti-Synaptopodin antibody, and a commercially available antibody can be used as an antibody against a glomerular epithelial cell marker such as an anti-Synaptopodin antibody.
  • a commercially available antibody can be used as an antibody against a glomerular epithelial cell marker such as an anti-Synaptopodin antibody.
  • DAPI® (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole), Hoechst® 33342, Hoechst® 33258, 7 It is preferable to stain the cell nuclear DNA with a nuclear staining reagent such as -ADD, Propidium® Iodine, DMAO, Acridine®orange, Ethidium® bromide.
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein staining, glomerular epithelial cell marker staining, and nuclear DNA staining with a nuclear staining reagent are triple-stained in glomerular epithelial cells in urine. It can be confirmed that the tin 1 protein and / or the intersectin 2 protein are expressed.
  • an immunochromatography method is an antibody against Intersectin 1 protein and / or Intersectin that captures Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in the urine of a subject.
  • a solid support membrane having a detection region in which antibodies against two proteins are immobilized, a label that is movable on a solid support labeled with a labeling substance such as colored polystyrene particles, metal colloid particles, or an enzyme.
  • the labeled substance region having the antibody against the interactin 1 protein and / or the antibody against the interactin 2 protein, the sample pad to which the sample is added, the absorption band for absorbing the developed sample liquid, and these members are bonded together.
  • Device for immunochromatography consisting of a backing sheet for It may be performed using the.
  • a colored support such as colored polystyrene particles, metal colloid particles, enzymes, etc. is applied to a solid phase support on which an antibody against Intersectin 1 protein and / or an antibody against Intersectin 2 protein is immobilized.
  • an antibody against Intersectin 1 protein and / or an antibody against Intersectin 2 protein labeled with an appropriate labeling substance and a complex of Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein are developed and transferred onto the membrane.
  • a complex of an antibody against Intersectin 2 protein is formed on a solid support, and a signal of a labeling substance emitted from the complex (if a colored particle is used, a substance capable of binding to the substance to be detected is immobilized.
  • Urinary Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein can be detected.
  • the immunoassay can be performed at 5 to 35 ° C., preferably at room temperature, and can be determined within a few minutes after the sample is added.
  • the amount of the sample to be added is several tens ⁇ L to several hundreds ⁇ L.
  • the sample may be used after being diluted several to tens of times.
  • the immunochromatography method can be carried out at 4 ° C. to 45 ° C., preferably 20 ° C. to 40 ° C., more preferably 25 ° C. to 38 ° C., and the time from sample addition to determination is about several minutes to several tens of minutes.
  • the material of the solid support used in the immunochromatography method is not limited as long as the sample can be absorbed and developed and flowed by capillary action.
  • natural, synthetic polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, nylon, polyethersulfone, polyvinyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, polystyrene, or a mixture thereof can be used.
  • the solid support preferably has the shape of a strip of strips.
  • a reagent for extracting intersectin 1 protein and / or intersectin 2 protein of exome derived from glomerular epithelial cells in urine or glomerular epithelial cells may be included on the device for immunochromatography.
  • Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein it is not necessary to extract the Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in advance, and glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cells in the urine can be obtained simply by adding urine onto a measurement device for immunochromatography. Extraction and measurement of Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein from the exome of origin can be performed in one step.
  • the reagent for extracting Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein include surfactants and enzymes that can disrupt the cell membrane.
  • Intersectin 1 ⁇ ⁇ ⁇ mRNA and / or Intersectin 2 mRNA When detecting Intersectin 1 ⁇ ⁇ ⁇ mRNA and / or Intersectin 2 mRNA, glomerular epithelial cells in urine or exosomes derived from glomerular epithelial cells are collected as a biological sample, and Intersectin contained in the sample is collected. What is necessary is just to measure 1 mRNA and / or intersectin 2 mRNA. Measurement of mRNA may be performed by extracting mRNA from collected cells or exosomes, or may be performed by immobilizing the collected cells or exosomes on a base such as a glass slide and staining by in situ hybridization. .
  • the extracted mRNA may be measured by a known RNA measurement method such as LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method, Northern blot method or RT-PCR method.
  • a dye that binds to a nucleic acid such as SYBR (registered trademark) Green series may be used.
  • Extraction of mRNA can be performed by a known method. In-situ hybridization can be performed, for example, as described in Molecular Biology Experiment Protocol III Maruzen Co., Ltd., August 30, 1997.
  • glomerular epithelial cells When the collected cells or exosomes are fixed on a base such as a glass slide and stained by in-situ hybridization, etc., glomerular epithelial cells in addition to staining of Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA. It is desirable to co-stain the marker mRNA.
  • glomerular epithelial cell markers include Synaptopodin, podocalyxin, C3b receptor, PP44, Nephrin, WT1, Podocin, ZO-1, actin, ⁇ -Actini-4, CD2AP, GLEPP-1, and Nestin.
  • the LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method can be performed, for example, as described in WO00 / 28082.
  • a probe comprising a partial sequence complementary to the partial sequence of Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA
  • a primer is used.
  • the base sequences of Intersectin 1 and Intersectin 2 are known (SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7, etc.), and probes or primers can be designed based on known base sequence information.
  • the primer or probe is a polynucleotide that hybridizes to a fragment of Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA, and the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 30, and more preferably 15 to 25. It is.
  • a forward primer and reverse primer pair for detecting the ITSN1S variant of Intersectin a pair of a forward primer composed of the sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a reverse primer composed of the sequence represented by SEQ ID NO: 10 Can be mentioned.
  • the detection of Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein, or Intersectin 1 / mRNA and / or Intersectin 2 ⁇ mRNA in glomerular epithelial cells present in urine is performed by detecting Intersectin 1 protein and / or Alternatively, it can also be referred to as detection of glomerular epithelial cells containing Intersectin 2 protein or Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA.
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 may be detected.
  • Glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cell-derived exosomes can be separated by markers specific for glomerular epithelial cells or markers specific for exosomes, respectively.
  • markers specific to glomerular epithelial cells include the above-mentioned markers.
  • exosome markers include CD9, CD63, CD81 and the like. Specifically, an antibody against the above marker is bound to magnetic beads or nano beads, these beads and urine are mixed, and glomerular epithelial cells in urine or exosomes derived from glomerular epithelial cells are bound to the beads.
  • glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cell-derived exosomes may be recovered using magnetism or a strainer.
  • MACS registered trademark
  • Dynabeads registered trademark
  • Fab Streptamer registered trademark
  • MagniSort trademark
  • glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cell-derived exosomes can be separated from urine using FACS or a flow cytometer as an index, and concentrated.
  • FACS flow cytometer
  • the flow cytometer for example, FACSAria (manufactured by Becton Dickinson), FACS Vantage (manufactured by Becton Dickinson), FACS Calibur (manufactured by Becton Dickinson) and the like can be used.
  • exosome-separating antibody it is possible to use a technique of attaching an exosome-separating antibody to a well or tube of a well plate, putting a sample containing exosome, and separating and recovering the exosome.
  • separation and collection can be performed using tubes and plates of ExoComplete (trademark) Tube Kit and ExoComplete (trademark) 96-Well Plate Kit (Hitachi Chemical).
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 When Intersectin 1 and / or Intersectin 2 is strongly expressed in glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cell-derived exosomes in the urine of the subject, the subject has immune complex-related nephritis Can be assessed and determined to be affected. Moreover, there is a possibility that it can be evaluated and judged that immune complex-related nephritis is severe or progressing as the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 increases.
  • the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in glomerular epithelial cells or exosomes derived from glomerular epithelial cells in the urine of immune complex-related nephritis patients is measured at the protein level or mRNA level in advance.
  • Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in glomerular epithelial cells or exosomes derived from glomerular epithelial cells in urine of patients with nephritis other than immune complex-related nephritis is measured at the protein level or mRNA level. Then, a measurement value for distinguishing between the two is set as a cut-off value, and when the cut-off value is exceeded, the subject can be evaluated and judged to be suffering from immune complex-related nephritis. it can.
  • the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of the subject is the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of a nephritis patient other than immune complex-related nephritis If higher, the subject can be assessed and judged to be suffering from immune complex associated nephritis.
  • the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in glomerular epithelial cells or exosomes derived from glomerular epithelial cells in patients with immune complex-related nephritis is measured in advance at the protein level or mRNA level.
  • the subject can also be evaluated and judged to be suffering from immune complex-related nephritis. That is, when the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of the subject is higher than the expression level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of a healthy person, the subject Can be evaluated and judged to be suffering from immune complex-related nephritis.
  • the protein level or mRNA level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine of the subject represents the transition of the disease state in the same subject, that is, the same case. Therefore, not only diagnosis of immune complex nephritis but also transition of the disease state in the same subject is detected by quantifying the protein level or mRNA level of intersectin 1 and / or interactin 2 in the urine of the subject. be able to. In the same subject, the deterioration or progression of disease state can be determined by increasing or decreasing the protein level or mRNA level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in urine.
  • the urinary protein level or mRNA is changed from a case where the urinary protein is high in the acute phase to a case where the urinary protein is not high.
  • These transitions can be detected by measuring the level.
  • the protein level or mRNA level of urinary intersectin 1 and / or interactin 2 is high, and in cases where it is relieved and urinary protein is not high, it is low.
  • the present invention also includes a method for detecting the transition of immune complex nephritis in the same subject by quantifying the protein level or mRNA level of Intersectin 1 and / or Intersectin 2 in the urine, and a kit for the same. To do.
  • the subject suffers from immune complex-related nephritis (membranous nephropathy or lupus nephritis) or other renal diseases (IgA nephropathy, purpura) with no or poor immune complex involvement Pathological nephritis, ANCA-related nephritis, Goodpasture syndrome, thrombotic microangiopathy, amyloid nephropathy, Alport syndrome, thin basement membrane disease, infection-related nephropathy, minimal change nephrotic syndrome, focal segmental glomerulosclerosis, Mesangial proliferative glomerulonephritis, intraductal proliferative glomerulonephritis, membranoproliferative glomerulonephritis, crescent necrotizing glomerulonephritis, sclerosing glomerulonephritis, nephrosclerosis, tubulointerstitial nephritis)
  • systemic lupus erythematosus SLE
  • the subject suffers from either membranous nephritis or lupus nephritis among immune complex-related nephritis. Can be identified. That is, since lupus nephritis is caused by SLE, if the subject suffers from systemic lupus erythematosus, the subject's immune complex-related nephritis can be diagnosed as lupus nephritis.
  • Diagnosis of SLE can be performed in light of the “Revised Criteria” of the American Rheumatism Association, published in 1982 and revised in 1997, and measures white blood cells, red blood cells, lymphocytes, platelets, immunoglobulins, complements, etc. In addition, it can be carried out by detecting autoantibodies such as antinuclear antibodies, anti-DNA antibodies, anti-Sm antibodies, and antiphospholipid antibodies.
  • membranous nephropathy or lupus nephritis in the case of membranous nephropathy, corticosteroids, cyclosporine, immunity It can be treated by administration of globulins, ACE inhibitors, biological preparations, etc., and secondary membranous nephropathy such as malignant tumors can be examined.
  • the subject can be treated by administration of corticosteroids, cyclophosphamide, cyclosporine, tacrolimus, mycophenolate mofetil and other immunosuppressive agents, biological preparations, etc. it can.
  • the present invention includes a step of detecting immune complex-associated nephritis by detecting urinary Interctin 1 and / or Intersectin 2 by the method of the present invention, or further detecting systemic lupus erythematosus, Also included is a method comprising a series of disease detection and treatment steps comprising treating nephropathy or lupus nephritis.
  • the present invention also includes reagents and kits for detecting urinary Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein, Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA.
  • a reagent or kit for detecting Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in urine contains at least an antibody against Intersectin 1 protein and / or an antibody against Intersectin 2 protein, It may be labeled with an enzyme, a fluorescent dye, colored particles, or the like.
  • the reagent or kit may contain a reagent for extracting Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein from glomerular epithelial cells in urine or exosomes derived from glomerular epithelial cells.
  • an immunochromatography kit As a reagent or kit for detecting Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in urine, an immunochromatography kit is included, and the kit includes an immunochromatography device.
  • the reagent may be a staining reagent or a staining kit for detecting glomerular epithelial cells containing Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein in urine by a technique of immunocytochemical staining. At least an antibody against Intersectin 1 protein and / or an antibody against Intersectin 2 protein, and the antibody may be labeled with an enzyme, a fluorescent dye, a colored particle or the like. Moreover, the reagent or kit may contain a reagent for extracting Intersectin 1 protein and / or Intersectin 2 protein from glomerular epithelial cells in urine. The reagent or kit may contain an antibody against a glomerular epithelial cell marker such as Synaptopodin and a nuclear staining reagent such as DAPI.
  • a glomerular epithelial cell marker such as Synaptopodin
  • a nuclear staining reagent such as DAPI.
  • a reagent or kit for detecting Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA in urine comprises a partial sequence complementary to the partial sequence of Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA.
  • a probe or primer, the primer or probe is a polynucleotide that hybridizes to a fragment of Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA, and the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 15-25.
  • the reagent or kit is, for example, a reagent or kit for amplifying Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA.
  • the reagent or kit may contain an extractant for Intersectin 1 / mRNA and / or Intersectin 2 ⁇ mRNA, and the reagent or kit contains glomerular epithelial cells or glomerular epithelial cells present in urine.
  • a reagent or kit for extracting Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA from exosomes derived from cells, amplifying the mRNA, and detecting Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA is there.
  • Reagents or kits for detecting urinary Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 ⁇ mRNA are obtained by immobilizing collected cells or exosomes on a substrate such as a glass slide, and performing mRNA by in situ hybridization method or the like.
  • the reagent or kit includes a probe comprising a partial sequence complementary to a partial sequence of Intersectin 1 mRNA and / or Intersectin 2 mRNA.
  • the reagent or kit may contain a probe consisting of a partial sequence complementary to a partial sequence of mRNA of a glomerular epithelial cell marker such as Synaptopodin and a nuclear staining reagent such as DAPI.
  • Example 1 Immunostaining of renal pathological tissue Immunostaining of renal pathological tissue using an antibody that recognizes intersectin. Cryopreserved renal biopsy tissue was sliced into 5 ⁇ m and immunostained. The renal biopsy tissues used were renal biopsy tissues of patients with membranous nephropathy, lupus nephritis, nephrosclerosis, Minor Abnormality, and IgA nephropathy.
  • renal biopsy tissues of lupus nephritis patients renal biopsy tissues of patients diagnosed with lupus nephritis type 2 and renal biopsy tissues of patients diagnosed with lupus nephritis type 3 + 5 were also used.
  • Intersectin (ITSNs) staining was performed for the primary antibodies anti-ITSN1 sc-9948 (santa cruz), anti-ITSN1L sc-9950 (santa cruz), anti-ITSN2 sc-9952 (santa cruz), anti-ITSN2L sc-9954 ( santa cruz).
  • Intersectin 1 (ITSN1) is roughly divided into two variants, ITSN1S and ITSN1L
  • Intersectin 2 (ISTN2) has two variants, ITSN2S and ITSN2L.
  • Anti-ITSN1 sc-9948 recognizes ITSN1S and ITSN1L
  • anti-ITSN1L sc-9950 recognizes only ITSN1L.
  • Anti-ITSN2 sc-9952 recognizes ITSN2S and ITSN2L
  • anti-ITSN2L sc-9954 recognizes only ITSN2L.
  • FIGS. 1 and 2 show the staining results of both Intersectin 1 and Intersectin 2. As shown in FIGS. 1 and 2, staining of Intersectin 1 and Intersectin 2 is performed. Since no difference was found in the results, FIG. 3 and subsequent figures show the results using an antibody that recognizes Intersectin 2.
  • FIG. 1 shows the results of staining a renal biopsy tissue of a patient with membranous nephropathy using an antibody that recognizes Intersectin 1 (FIG. 1A) and an antibody that recognizes Intersectin 2 (FIG. 1B).
  • FIG. 2 shows the results of staining a renal biopsy tissue of a patient with lupus nephritis using an antibody that recognizes Intersectin 1 (FIG. 2A) and an antibody that recognizes Intersectin 2 (FIG. 2B). As shown in FIGS.
  • FIG. 3 shows intersectin 2 recognized in renal biopsy tissues of membranous nephropathy patient 1 (FIG. 3A), membranous nephropathy patient 2 (FIG. 3B) and membranous nephropathy patient 3 (FIG. 3C).
  • stained using the antibody is shown.
  • staining was observed in all patient tissues, and expression of Intersectin 2 was observed.
  • FIG. 3A shows intersectin 2 recognized in renal biopsy tissues of membranous nephropathy patient 1 (FIG. 3A), membranous nephropathy patient 2 (FIG. 3B) and membranous nephropathy patient 3 (FIG. 3C).
  • stained using the antibody is shown.
  • staining was observed in all patient tissues, and expression of Intersectin 2 was observed.
  • FIG. 3A shows intersectin 2 recognized in renal biopsy tissues of membranous nephropathy patient 1 (FIG. 3A), membranous nephropathy patient 2 (FI
  • FIG. 4 shows the renal biopsy tissues of patients with membranous nephropathy (FIG. 4A), nephrosclerosis patient (FIG. 4B), minimal change patient (FIG. 4C), and IgA nephropathy patient (FIG. 4D).
  • staining using the antibody which recognizes is shown.
  • renal biopsy tissues of patients with membranous nephropathy were strongly stained, but renal biopsy tissues of nephrosclerosis patients, minute change patients, and IgA nephropathy patients were hardly stained.
  • Intersectin 2 is expressed in the kidneys of patients with membranous nephropathy, but the expression of Intersectin 2 is weak or absent in the kidneys of patients with nephrosclerosis, patients with minimal change and IgA nephropathy. Show.
  • Example 2 Immunostaining of renal pathological tissue using antibody that recognizes intersectin (co-staining with IgG)
  • the cryopreserved renal biopsy tissue was sliced into 5 ⁇ m and immunostained.
  • co-staining was performed using an antibody recognizing Intersectin 2 and an antibody recognizing human IgG. Observation and imaging were performed in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 5 shows the result of staining a renal biopsy tissue of a patient with membranous nephropathy.
  • FIG. 5A shows the result of staining with an antibody against Intersectin 1
  • FIG. 5C shows the result of staining with an antibody against IgG
  • FIG. 5B shows the result of merging.
  • the site stained with the antibody against Intersectin 1 and the site stained with the antibody against IgG were consistent in the glomeruli.
  • immune complex-related nephritis such as membranous nephropathy and lupus nephritis, it is known that autoreactive IgG is deposited on glomerular epithelial cells.
  • FIG. 5 shows the staining when using an antibody against IgG. The results show that IgG is deposited on glomerular epithelial cells.
  • FIG. 6 shows the result of staining a renal biopsy tissue of a lupus nephritis type 2 patient
  • FIG. 7 shows the result of staining of a renal biopsy tissue of a lupus nephritis type 3 + 5 patient.
  • the site stained with the antibody against Intersectin 1 and the site stained with the antibody against IgG were identical.
  • FIGS. 8 and 9 show the results of staining a renal biopsy tissue of a minute change type (MinorMiAbnormality) patient using an antibody against Intersectin 1 and an antibody against IgG.
  • the site stained with the antibody against Intersectin 1 and the site stained with the antibody against IgG were consistent in the glomeruli.
  • FIG. 10 to 12 show the results of staining using an antibody against Intersectin 2.
  • FIG. 10 shows the result of staining renal biopsy tissue of a patient with membranous nephropathy
  • FIG. 11 shows the result of staining of renal biopsy tissue of a patient with lupus nephritis type 2
  • FIG. 12 shows the renal biopsy of a patient with lupus nephritis type 3 + 5
  • the result of staining the tissue is shown.
  • FIGS. 5 to 9 the result of staining with an antibody against Intersectin 2, the result of staining with an antibody against IgG, and the result of merging are shown.
  • the site stained with the antibody against Intersectin 2 and the site stained with the antibody against IgG were the same as when the antibody against Intersectin 1 was used.
  • FIG. 13 shows the result of staining of a renal biopsy tissue of a patient with minute change (Minor Abnormality) using an antibody against Intersectin 2
  • FIG. 14 shows the result of staining of a kidney biopsy tissue of an IgA nephropathy patient.
  • FIG. 8 As shown in FIG. 8, FIG. 9, FIG. 13 and FIG. 14, in a renal biopsy tissue of a Minor Abnormality patient and a renal biopsy tissue of an IgA nephropathy patient, The staining using the antibody against tin 2 or the antibody against IgG was very weak, but the staining was observed, and both staining sites were consistent.
  • Example 1 From the results of Example 1, it was found that in patients with immune complex-related nephritis such as membranous nephropathy and lupus nephritis, Intersectin 1 and Intersectin 2 are strongly expressed in the renal tissue. It was also found that Intersectin is expressed in glomerular epithelial cells at the same position as IgG deposited in glomerular epithelial cells.
  • Example 2 Confirmation that Intersectin is expressed in response to deposited IgG
  • Heymann nephritis and staining of renal pathological tissue were purchased from PROBETEX.
  • Heymann nephritis is an animal model in rats with human membranous nephropathy, and Heymann nephritis (Passive Heymann nephritis) develops when a disease-inducing antibody (IgG) is administered to rats.
  • the frozen kidney tissue was sliced into 5 ⁇ m and immunostained. At this time, co-staining was performed using an antibody recognizing Intersectin 1 and Intersectin 2 and an antibody recognizing sheep IgG.
  • anti-ITSN1 sc-9948 (santa cruz), anti-ITSN1L sc-9950 (santa cruz), anti-ITSN2 sc-9952 (santa cruz), anti-ITSN2L sc-9954 (santa cruz) did. Each was diluted 25 times with PBS and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 15 to 18 show anti-intersectin antibodies, anti-ITSN1 sc-9948 (santascruz), anti-ITSN1L sc-9950 (santa cruz), anti-ITSN2 sc-9952 (santa cruz), and anti-ITSN2L sc-9954, respectively.
  • staining result when using (santa cruz) is shown.
  • the site stained with the antibody against Intersectin 1 and the site stained with the antibody against IgG coincide with each other in an animal model in a rat with human membranous nephropathy.
  • expression of intersectin was observed consistent with the deposited IgG.
  • Intersectin (ITSNs) expression experiment in immortalized cultured rat podocytes (glomerular epithelial cells)
  • POD7 strain which was given by Shugo Kurihara of Juntendo University School of Medicine. did. POD7 was cultured at 37 ° C. in DMEM / F12 / 5% FBS / ITSmixture / PCG / SM / AMPHB medium.
  • FIGS. 19 to 22 show anti-intersectin antibodies, anti-ITSN1 sc-9948 (santazcruz), anti-ITSN1L sc-9950 (santa cruz), anti-ITSN2 sc-9952 (santa cruz), and anti-ITSN2L sc-9954, respectively.
  • staining result when using (santa cruz) is shown.
  • the number of stained immortalized cultured rat podocytes increases with time, and the expression of Intersectin 1 or 2 in the immortalized cultured rat podocytes is increased. An increase was observed.
  • Intersectins 1 and 2 react with autoreactive IgG in glomerular epithelial cells and are expressed in glomerular epithelial cells.
  • Intersectin expression indicates the deposition of IgG on glomerular epithelial cells.
  • Intersectin 1 and 2 can be used as markers for immune complex-related nephritis such as membranous nephropathy and lupus nephritis in which IgG is deposited on glomerular epithelial cells.
  • Urinary cells contain kidney constituent cells such as glomerular epithelial cells, and an increase in the number of these cells is observed during renal disease. .
  • exosomes that are part of cell bodies released from these cells are also included in large quantities.
  • the primary antibodies were first anti-ITSN1 sc-9948 (santa cruz), anti-ITSN1L sc-9950 (santa cruz), anti-ITSN2 sc-9952 (santa cruz), anti-ITSN2L sc- 9954 (santa cruz) was used. Each was diluted 25 times with PBS and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with PBS, the mixture was reacted with FITC-labeled anti-goat immunoglobulin rabbit antibody (Dako) diluted 25-fold with PBS as a secondary antibody at room temperature for 1 hour. After washing with PBS three times, the cells were then reacted overnight at 4 ° C.
  • Dako FITC-labeled anti-goat immunoglobulin rabbit antibody
  • Anti-Synaptopodin antibody Progen
  • Anti-Synaptopodin antibody Progen
  • Anti-Synaptopodin antibody Progen
  • the nucleus was stained with 0.1% DAPI (DOJINDO) dissolved in PBS for 20 minutes at room temperature for nuclear staining.
  • VECTASHIELD Mounting Medium VECTOR LABORATORIES
  • 23 to 25 show the results of two examples. 23 to 25, A shows the result of staining with an antibody against Intersectin, B shows the result of staining with DAPI, C shows the result of staining with an anti-Synaptopodin antibody, and D is merged. Show the image. In the staining shown in FIG. 23, anti-ITSN1L sc-9950 was used as an antibody against Intersectin, and in the staining shown in FIGS. 24 and 25, anti-ITSN2 sc-9952 was used.
  • Example 3 shows that it is possible to actually detect cells containing Intersectin 1 or 2 from the urine of patients with membranous nephropathy.
  • Example 4 Detection of ITSN1S mRNA in Urinary Exosome Membrane Nephropathy (Case 1) Patient (A), Membrane Nephropathy (Case 2) Patient (B), Chronic Renal Failure Patient (C), Alport Syndrome Patient ( The exosome was purified from 5 mL of D) urine using Invitrogen Total Exosome Isolation Reagent (from urine). Subsequently, mRNA was extracted using Invitrogen Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit, and cDNA was prepared using Invitrogen SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix. ITSN1S cDNA was amplified by PCR using the prepared cDNA.
  • the Forward primer was CATTAGCGGCAGTGTGCCAG (SEQ ID NO: 9), and the Reverse primer was CTGGGCAGTGATATGGGATAGTGG (SEQ ID NO: 10).
  • PCR amplification reaction conditions were 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute for 40 cycles.
  • the patient with membranous nephropathy (case 1) (membrane nephropathy 1) is a patient with high urinary protein in the acute phase, and the patient with membranous nephropathy (case 2) (membrane nephropathy 2) is relieved with urine
  • the patient is not high in medium protein.
  • the amplified cDNA was electrophoresed with Marker 5 of Nippon Gene and separated.
  • lanes 1, 2, 3, 4 and 5 show the cDNA prepared from Marker 5, A, the cDNA prepared from B, the cDNA prepared from C, and the cDNA prepared from D, respectively.
  • Urinary Intersectin mRNA Urine from patients with membranous nephropathy (case 1), patients with membranous nephropathy (case 2), patients with chronic renal failure (C), and patients with Alport syndrome (D) was used as a sample.
  • Case 1 Patients with membranous nephropathy (case 1) are patients with high urinary protein in the acute phase, and membranous nephropathy (case 2) is a patient who is relieved and does not have high urine protein.
  • Exosomes were purified from 5 mL of urine from each of the above four cases of patients using Invitrogen Total Exosome Isolation Reagent (from urine). Subsequently, mRNA was extracted using Invitrogen Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit, and cDNA was prepared using Invitrogen SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix or Takara Bio PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time).
  • Intersectin 1 Intersectin 1
  • Intersectin 2 Intersectin 2
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the amplified cDNA was electrophoresed with Marker 9 or Marker 10 of Nippon Gene and separated.
  • FIGS. 27 and 28 show the results of GAPDH and Intersectin 1, respectively.
  • the position indicated by the arrow in the figure is the position of each cDNA band.
  • GAPDH is used as a marker.
  • Intersectin 1 is expressed in patients with membranous nephropathy (case 1) and patients with membranous nephropathy (case 2), but is observed in patients with chronic renal failure and patients with Alport syndrome. Absent.
  • PCR amplification reaction conditions were 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute for 40 cycles.
  • the amplified cDNA was electrophoresed with Marker 9 of Nippon Gene and separated.
  • Figures 29 and 30 show the results for GAPDH and Intersectin 2, respectively.
  • the position indicated by the arrow in the figure is the position of each cDNA band.
  • GAPDH is used as a marker.
  • Intersectin 2 was strongly expressed in patients with membranous nephropathy (case 1).
  • membranous nephropathy and lupus nephritis can be detected noninvasively.

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Abstract

免疫複合体関連腎炎を検出する方法及びそのための検出キットの提供。被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出することにより、免疫複合体関連腎炎を検出する方法、及び該方法を行うためのキット。

Description

尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の検出による免疫複合体関連腎炎の検出
　本発明は、尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２をマーカーとして用いる、免疫複合体関連腎炎の検出方法に関する。
　免疫複合体関連腎炎とは、IgGと対応する抗原による免疫複合体が糸球体上皮細胞などに形成・沈着することにより糸球体上皮細胞障害から生じる腎炎をいい、膜性腎症及びループス腎炎が含まれる。膜性腎症はネフローゼ症候群の原因となる疾患であり、ループス腎炎は全身性エリテマトーデスの症状の1つである（非特許文献１を参照）。
　現在のところ、免疫複合体関連腎炎の確定診断のためには、侵襲的な腎生検を必要とする。
　インターセクチン１（Intersectin１）及びインターセクチン２（Intersectin２）は、細胞内タンパク質として存在している多機能分子であり、病態的生理的な役割は現在まで不明である（非特許文献２及び３を参照）。
Ma H, et al., Semin Nephrol. 2013 Nov;33(6):531-42. doi: 10.1016/j.semnephrol.2013.08.004. Gubar O et al., Front Endocrinol (Lausanne). 2013 Aug 27;4:109. doi: 10.3389/fendo.2013.00109. eCollection 2013. Tsyba L et al., Gene. 2011 Mar 1;473(2):67-75. doi: 10.1016/j.gene.2010.11.016. Epub 2010 Dec 9.
　本発明は、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現の程度を指標に免疫複合体関連腎炎を検出する方法及びそのための検出キットの提供を目的とする。
　本発明者らは、免疫複合体関連腎炎の非侵襲的な検出法について鋭意検討を行った。本発明者らは、免疫複合体関連腎炎において、糸球体上皮細胞にIgGが沈着すると、その部位でインターセクチン１及びインターセクチン２が発現することを見出した。
　さらに、ヒトの各種腎疾患と糸球体上皮細胞におけるインターセクチン１及びインターセクチン２の発現を調べたところ、免疫複合体関連腎炎である膜性腎症及びループス腎炎において、糸球体上皮細胞でインターセクチン１及びインターセクチン２が強発現することを見出した。その結果、尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２をマーカーとして用いる、免疫複合体関連腎炎の検出方法を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出することにより、免疫複合体関連腎炎を検出する方法。
[２]　被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２が免疫複合体関連腎炎以外の腎炎患者又は健常者の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２に対して多い場合に、被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価する、[１]の方法。
[３]　免疫複合体関連腎炎が、膜性腎症又はループス腎炎である、[１]又は[２]の方法。
[４]　尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２が、尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームに含まれるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAである、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームに含まれるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を免疫細胞化学染色により検出する、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　さらに、糸球体上皮細胞に特異的な糸球体上皮細胞マーカーを染色すると共に、核染色試薬を用いて細胞の核を染色する、[５]の方法。
[７]　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームからインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出し、免疫測定法により、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出する、[１]～[４]のいずれかの方法。
[８]　イムノクロマト法によりインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出する、[７]の方法。
[９]　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームからインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを抽出し、mRNAを増幅しインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出する、[１]～[４]のいずれかの方法。
[１０]　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームを分離した後に、糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームに含まれるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出する、[１]～[９]のいずれかの方法。
[１１]　少なくともインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を含む、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出することにより、免疫複合体関連腎炎を検出するためのキット。
[１２]　インターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を用いて、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を含む糸球体上皮細胞を免疫細胞化学染色により染色する、[１１]のキット。
[１３]　さらに、糸球体上皮細胞のマーカーに対する抗体及び核染色試薬を含む、[１２]のキット。
[１４]　イムノクロマト法用キットである、[１１]のキット。
[１５]　少なくとも、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブ又はプライマーを含む、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出するためのキット。
[１６]　インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを増幅するための、[１５]のキット。
[１７]　さらに、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの抽出試薬を含む、尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームからインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを抽出し、mRNAを増幅しインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出するための、[１５]又は[１６]のキット。
[１８]　配列番号９に表される配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に表される配列からなるリバースプライマーの対を含む、[１５]～[１７]のいずれかのキット。
　従来、免疫複合体関連腎炎の診断には、侵襲的な腎生検を行い腎病理組織学的に診断する必要があった。腎生検は侵襲的な検査であり、患者の肉体的、精神的、時間的負担も強くまた医療費負担も無視できなかった。
　本発明の方法によれば、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出することにより、免疫複合体関連腎炎を診断することができる。本発明の方法は、従来の方法より非侵襲的に、より低コストで、より簡便に、より短時間で免疫複合体関連腎炎を診断することができる。
膜性腎症患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体（図１Ａ）及びインターセクチン２を認識する抗体（図１Ｂ）を用いて染色した結果を示す図である。 ループス腎炎患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体（図２Ａ）及びインターセクチン２を認識する抗体（図２Ｂ）を用いて染色した結果を示す図である。 膜性腎症患者の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体を用いて染色した結果を示す図である。 膜性腎症患者（図４Ａ）、腎硬化症患者（図４Ｂ）、微小変化型患者（図４Ｃ）及びIgA腎症患者（図４Ｄ）の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体を用いて染色した結果を示す図である。 膜性腎症患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 ループス腎炎２型患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 ループス腎炎３+５型患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 微小変化型患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である（その１）。 微小変化型患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である（その２）。 膜性腎症患者の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 ループス腎炎２型患者の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 ループス腎炎３+５型患者の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 微小変化型患者の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 IgA腎症患者の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体及びIgGを認識する抗体を用いて共染色した結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1　sc-9948を用いたときのHeymann腎炎の腎組織の染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1L　sc-9950を用いたときのHeymann腎炎の腎組織の染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN2　sc-9952を用いたときのHeymann腎炎の腎組織の染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN2L　sc-9954を用いたときのHeymann腎炎の腎組織の染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1　sc-9948を用いたときの不死化培養ラットポドサイトの染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1L　sc-9950を用いたときの不死化培養ラットポドサイトの染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN2　sc-9952を用いたときの不死化培養ラットポドサイトの染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN2L　sc-9954を用いたときの不死化培養ラットポドサイトの染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1L　sc-9950を用いたときの膜性腎症患者の尿中インターセクチン含有細胞の染色結果を示す図である。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN2　sc-9952を用いたときの膜性腎症患者の尿中インターセクチン含有細胞の染色結果を示す図である（その１）。 抗インターセクチン抗体として、抗ITSN2　sc-9952を用いたときの膜性腎症患者の尿中インターセクチン含有細胞の染色結果を示す図である（その２）。 尿中エクソソーム中のITSN1S mRNAの検出の結果を示す電気泳動像である。 尿中エクソソーム中のGAPDH mRNAの検出の結果を示す電気泳動像である。 尿中エクソソーム中のインターセクチン１ mRNAの検出の結果を示す電気泳動像である。 尿沈渣中のGAPDH mRNAの検出の結果を示す電気泳動像である。 尿沈渣中のインターセクチン２ mRNAの検出の結果を示す電気泳動像である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は尿中インターセクチン１（ITSN1)及び／又はインターセクチン２（ISTN2)をマーカーとして用いて、免疫複合体関連腎炎を検出する方法である。ここで、検出とは、患者が免疫複合体関連腎炎に罹患しているかどうか評価し判定すること等を含む。
　さらに、本発明は、尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２をマーカーとして用いて、被験体が免疫複合体関連腎炎に罹患しているか否かを診断するための補助的データを取得するための方法である。
　インターセクチン１及びインターセクチン２は、細胞内で産生され、細胞外には分泌されない多機能分子である。現在のところ、詳細な病理的生理的な役割は不明である。大きく分けて、インターセクチン１には、ITSN1SとITSN1Lの２つのバリアントが存在し、インターセクチン２には、ITSN2SとITSN2Lの２つのバリアントが存在する。ITSN1Sをコードする遺伝子の塩基配列及びITSN1Sのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示し、ITSN1Lをコードする遺伝子の塩基配列及びITSN1Lのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示し、ITSN2Sをコードする遺伝子の塩基配列及びITSN2Sのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５及び配列番号６に示し、ITSN2Lをコードする遺伝子の塩基配列及びITSN2Lのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び配列番号８に示す。
　免疫複合体関連腎炎とは、IgGと対応する抗原による免疫複合体が糸球体上皮細胞等に形成・沈着することにより糸球体上皮細胞障害から生じる腎炎をいい、糸球体上皮細胞にIgGの沈着が認められることを特徴とする。免疫複合体関連腎炎には、膜性腎症及びループス腎炎等が含まれる。膜性腎症はネフローゼ症候群の原因となる腎症である。ループス腎炎は、全身性エリテマトーデス（SLE)に起因する腎疾患であり、１型、２型、３型、４型、５型、６型ループス腎炎に分類することができる。糸球体上皮細胞にIgGが沈着すると、その部位でインターセクチン１及び／又はインターセクチン２が発現する。その結果、腎臓細胞におけるインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現は、その部位へIgGが沈着したことを示し、免疫複合体関連腎炎への罹患を示す。
　インターセクチン１及び／又はインターセクチン２は、IgGが沈着した糸球体上皮細胞（ポドサイト）の細胞内において発現産生される。しかしながら、細胞外には分泌されない。本発明においては、腎疾患に罹患した被験体において増加が認められる尿中の糸球体上皮細胞中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出すればよい。また、糸球体上皮細胞が分泌する直径30～100nmの膜小胞であるエクソソーム中にも含まれるので、エクソソーム中におけるインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出してもよい。
　免疫複合体関連腎炎に罹患した被験体の糸球体上皮細胞において、インターセクチン１及び／又はインターセクチン２が発現するので、被験体の尿中に存在する糸球体上皮細胞中又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソーム中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出すればよい。
　インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の測定は、尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームからタンパク質を抽出し、該抽出物中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を測定することにより行うことができる。また、免疫細胞化学の手法により行うこともできる。
　糸球体上皮細胞中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの抽出方法は細胞を破砕し、内部のタンパク質又はmRNAを抽出できる方法ならば限定されないが、例えば、細胞を低張溶液に懸濁し、浸透圧ショックで細胞を破砕する方法、細胞を凍結融解し細胞を破砕する方法、界面活性剤等により細胞膜を溶解する方法、超音波処理により細胞を破砕する方法、酵素等により細胞膜を破砕する方法、ホモジナイザーやミキサーを用いて細胞を破砕する方法等が挙げられる。低張溶液、界面活性剤等は抽出試薬として用いることができる。この際、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の分解を抑えるためにPMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)等のプロテアーゼ阻害剤を添加し、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの分解を抑えるためにRNaseインヒビターを添加するのが好ましい。
　抽出したタンパク質の測定は、イムノクロマト法、ELISA、ラジオイムノアッセイ等の公知の免疫測定法（イムノアッセイ）を用いればよい。この際、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体が必要であるが、抗インターセクチン１抗体や抗インターセクチン２抗体は公知の手法によりモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体として作製すればよい。また、市販の抗インターセクチン１抗体や抗インターセクチン２抗体を用いることもできる。上記のように、大きく分けて、インターセクチン１には、ITSN1SとITSN1Lの２つのバリアントが存在し、インターセクチン２には、ITSN2SとITSN2Lの２つのバリアントが存在する。市販の抗体として、抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）等が挙げられ、抗ITSN1　sc-9948はITSN1SとITSN1Lを認識し、抗ITSN1L　sc-9950はITSN1Lのみを認識する。また、抗ITSN2　sc-9952はITSN2S及びITSN2Lを認識し、抗ITSN2L　sc-9954はITSN2Lのみを認識する。これらのいずれの抗体も本発明におけるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の検出に用いることができる。
　インターセクチン１及びインターセクチン２は同じ挙動を示し、両者が同時に発現される可能性があるので、インターセクチン１又はインターセクチン２のいずれか一方を検出してもよい。
　抗体は必要に応じて、酵素、粒子状色素、蛍光物質、放射性同位元素により標識して用いるが、抗体の標識は公知の方法により行うことができる。
　免疫細胞化学の手法による測定は、採取した細胞又はエクソソームをスライドガラス等の基板上にエタノールやホルマリン等の有機溶媒を利用して固定することにより標本を作製して行えばよい。染色は、酵素、蛍光物質、放射性同位元素等で標識したインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を用いてもよいし、インターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を標本中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質に結合させた後に、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質に結合する抗体に対する２次抗体であって酵素、蛍光物質等で標識した２次抗体を用いてもよい。標識に用いる酵素として、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が挙げられ、蛍光物質として、例えばフルオレセイン、ローダミン等が挙げられる。また、公知のビオチン-アビジン複合体を利用して染色してもよい。粒子状色素として、イムノクロマトグラフィーの標識抗体に用い得る着色ポリスチレン粒子、金属コロイド粒子等が挙げられる。免疫細胞化学において、染色は顕微鏡や肉眼で判断することもできるし、適当な光学的測定装置を用いてもよい。
　免疫細胞化学によりインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の発現を検出する場合、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質が発現し存在しているのが、糸球体上皮細胞であることを確認するために、好ましくは、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の染色に加え、糸球体上皮細胞マーカーも共染色することが望ましい。糸球体上皮細胞マーカーとして、Synaptopodin、ポドカリキシン、C3b受容体、PP44、Nephrin、WT1、Podocin、ZO-1、actin、α-Actini-4、CD2AP、GLEPP-1、Nestin等が挙げられる。これらのマーカーの染色は抗Synaptopodin抗体等の糸球体上皮細胞マーカーに対する抗体を用いて行うことができ、抗Synaptopodin抗体等の糸球体上皮細胞マーカーに対する抗体としては市販の抗体を用いることができる。また、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の染色、並びに糸球体上皮細胞マーカーの染色に加え、DAPI （4',6-diamidino-2-phenylindole）、Hoechst 33342、Hoechst 33258、7-ADD、Propidium Iodine、DMAO、Acridine orange、Ethidium bromide等の核染色試薬により細胞の核のDNAを染色することが好ましい。インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の染色、糸球体上皮細胞マーカーの染色、並びに核染色試薬による核DNAの染色の３重染色により、尿中の糸球体上皮細胞において、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質が発現していることを確認することができる。
　免疫測定法（イムノアッセイ）のうち、例えば、イムノクロマト法は、被験体の尿中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を捕捉するインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体が固相化された検出領域を有する固相支持体（メンブレン）、着色ポリスチレン粒子や金属コロイド粒子や酵素等の標識物質で標識した固相支持体上を展開し移動可能な標識したインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を有する標識物質領域、試料を添加するサンプルパッド、展開された試料液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートからなるイムノクロマト法用デバイスを用いて行えばよい。該方法においては、インターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を固相化した固相支持体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金属コロイド粒子や酵素等の適当な標識物質で標識したインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体とインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の複合体をメンブレン上に展開移動させる。この結果、固相化したインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体- インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質-標識したインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識物質のシグナル（着色粒子を用いた場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が着色される）を検出することにより、尿中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出することができる。該免疫測定方法は、５～３５℃、好ましくは室温で行うことができ、試料を添加後数分で判定することができる。イムノクロマト法において、添加する試料の量は数十μL～数百μLである。試料は数倍から十数倍に希釈して用いてもよい。イムノクロマト法は、４℃～45℃、好ましくは20℃～40℃、さらに好ましくは25℃～38℃で行うことができ、試料添加から判定までの時間は、数分から十数分程度である。イムノクロマト法で用いる固相支持体の材料は毛管現象により試料が吸収され展開流動し得るものであれば限定されない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、又はこれらの混合物を用いることができる。固相支持体は好ましくは短冊状のストリップの形状を有する。また、イムノクロマト法用デバイス上に、尿中の糸球体上皮細胞中又は糸球体上皮細胞由来のエクソームのインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出する試薬を含ませてもよい。この場合、あらかじめインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出する必要はなく、イムノクロマト法用測定デバイス上に尿を添加するだけで、尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソームからのインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質の抽出及び測定を１ステップで行うことができる。インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出する試薬としては、細胞膜を破砕し得る界面活性剤、酵素等が挙げられる。
　インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出する場合、尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームを生体試料として採取し、該試料中に含まれるインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを測定すればよい。mRNAの測定は採取した細胞又はエクソソームからmRNAを抽出して行ってもよいし、採取した細胞若しくはエクソソームをスライドガラス等の基盤上に固定し、in situ ハイブリダイゼーション法により染色して行ってもよい。あるいは、抽出したmRNAをLAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）法やノーザンブロット法やRT-PCR法等の公知のRNA測定法により測定すればよい。この際、SYBR（登録商標）Greenシリーズ等の核酸に結合する色素を用いてもよい。mRNAの抽出は公知の方法で行うことができる。in situ ハイブリダイゼーションは、例えば分子生物学実験プロトコールIII　丸善株式会社　平成９年（1997年）８月30日の記載に従って行うことができる。採取した細胞若しくはエクソソームをスライドガラス等の基盤上に固定し、in situ ハイブリダイゼーション法等により染色する際には、インターセクチン１mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの染色に加え、糸球体上皮細胞マーカーのmRNAも共染色することが望ましい。糸球体上皮細胞マーカーとして、Synaptopodin、ポドカリキシン、C3b受容体、PP44、Nephrin、WT1、Podocin、ZO-1、actin、α-Actini-4、CD2AP、GLEPP-1、Nestin等が挙げられる。また、LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification)法は、例えば、WO00/28082の記載により行うことができる。この際、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを特異的に測定するために、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブ又はプライマーを用いる。インターセクチン１及びインターセクチン２の塩基配列は公知であり（配列番号１、３、５及び７等）、公知の塩基配列情報に基づいて、プローブ又はプライマーを設計することができる。該プライマー又はプローブは、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの断片にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、塩基の数は５～50、好ましくは10～30、さらに好ましくは15～25である。例えば、インターセクチン１のITSN1Sバリアントを検出するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー対として、配列番号９に表される配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に表される配列からなるリバースプライマーの対が挙げられる。
　尿中に存在する糸球体上皮細胞中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの検出は、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを含む糸球体上皮細胞の検出ということもできる。
　なお、あらかじめ糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームを特異的に尿中から分離し、濃縮した後に、インターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出してもよい。
　糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームは、それぞれ糸球体上皮細胞に特異的なマーカー又はエクソソームに特異的なマーカーにより分離することができる。糸球体上皮細胞に特異的なマーカーとして、上記のマーカーが挙げられる。また、エクソソームのマーカーとしてCD9、CD63、CD81等が挙げられる。具体的には、磁気ビーズやナノビーズに上記のマーカーに対する抗体を結合させておき、これらのビーズと尿を混合し、尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームをビーズに結合させ、磁気やストレーナー（ふるい）を用いて糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームを回収すればよい。細胞の分離に用い得るビーズやそのようなビーズを含む分離キットとして、MACS（登録商標）テクノロジー（Miltenyl Biotec K.K.）、Dynabeads（登録商標）、Fab Streptamer（登録商標）、MagniSort（商標）Magnetic Cell Separationキット等が挙げられる。
　また、FACS又はフローサイトメーターを用いて、上記マーカーを指標に尿から糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームを分離し、濃縮することもできる。フローサイトメーターとしては例えばFACSAria(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いることができる。
　さらに、ウェルプレートのウェルやチューブにエクソソーム分離用抗体を付着させ、エクソソームを含む試料を入れ、エクソソームを分離回収する技術を利用することができる。例えば、ExoComplete（商標）Tube KitやExoComplete（商標）96-Well Plate Kit （Hitachi Chemical)のチューブやプレートを用いて分離回収することができる。
　分離した糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソームからインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを抽出してそれらを検出してもよいし、回収した糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム上のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを免疫細胞化学の手法やin situハイブリダイゼーション法により染色してもよい。
　被験体の尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム中において、インターセクチン１及び／又はインターセクチン２が強く発現している場合、該被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価し判定することができる。また、インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現量が多いほど、免疫複合体関連腎炎が重症である、あるいは進行していると評価し判断することができる可能性がある。
　なお、免疫複合体関連腎炎以外の腎炎、例えば、微小変化型（Minor Abnormality）、IgA腎症等の腎疾患でも、糸球体上皮細胞において、インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の弱い発現が認められることがある。しかしながら、免疫複合体関連腎炎で認められるインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現とは格段の差がある。従って、インターセクチン１及び／又はインターセクチン２が強発現しているときは、免疫複合体関連腎炎に起因すると判断することができる。あるいは、あらかじめ免疫複合体関連腎炎患者の尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現レベルをタンパク質レベル又はmRNAレベルで測定するとともに、免疫複合体関連腎炎以外の腎炎患者の尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現をタンパク質レベル又はmRNAレベルで測定し、両者を区別するための測定値をカットオフ値として定めておき、該カットオフ値以上になった場合に、被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価し判断することができる。すなわち、被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現レベルが免疫複合体関連腎炎以外の腎炎患者の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現レベルより高い場合に、被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価し判断することができる。また、あらかじめ免疫複合体関連腎炎患者の尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現レベルをタンパク質レベル又はmRNAレベルで測定するとともに、健常者の尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現をタンパク質レベル又はmRNAレベルで測定し、両者を区別するための測定値をカットオフ値として定めておき、該カットオフ値以上になった場合に、被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価し判断することもできる。すなわち、被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現レベルが健常者の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２の発現レベルより高い場合に、被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価し判断することができる。
　また、被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルは、同一被験体、すなわち、同一症例における病勢の推移を表す。従って、被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルを定量することにより免疫複合体腎炎の診断のみならず、同一被験体における病勢の推移を検出することができる。同一被験体においては、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルの増減により、病勢の悪化や経過を判断することができる。例えば、膜性腎症には急性期の尿中タンパク質が高い症例から軽快し尿中タンパク質が高くない症例に推移するが、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルを測定することによりこれらの推移を検出することができる。急性期の尿中タンパク質が高い症例では、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルは高く、軽快し尿中タンパク質が高くない症例では低くなる。本発明は、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルを定量し、同一被験体における免疫複合体腎炎の病勢の推移を検出する方法やそのためのキットも包含する。
　なお、本発明において、免疫複合体関連腎炎を検出するという場合、被験体が免疫複合体関連腎炎に罹患しているか否かの検出だけでなく、同一被験体における免疫複合体腎炎の病勢の推移の検出も含む。
　本発明の方法により、被験体が免疫複合体関連腎炎（膜性腎症かループス腎炎）に罹患しているのかまたは免疫複合体の関与がない又は乏しいそれ以外の腎疾患（IgA腎症、紫斑病性腎炎、ANCA関連腎炎、Goodpasture症候群、血栓性微小血管症、アミロイド腎症、アルポート症候群、菲薄基底膜病、感染症関連腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状分節性糸球体硬化症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性壊死性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎硬化症、尿細管間質性腎炎）に罹患しているのか、あるいは健常者か判断することができる。さらに被験体が全身性エリテマトーデス（SLE）に罹患しているか否かを血清学的診断により判断することにより、被験体が免疫複合体関連腎炎のうち膜性腎症及びループス腎炎のどちらに罹患しているか鑑別することができる。すなわち、ループス性腎炎はSLEに起因するので、被験体が全身性エリテマトーデスに罹患している場合は、被験体の免疫複合体関連腎炎はループス腎炎であると確定診断することができる。SLEの診断は、1982年に刊行され、1997年に改訂されたアメリカリウマチ協会の「改訂基準」に照らして行うことができ、白血球、赤血球、リンパ球、血小板、免疫グロブリン、補体等の測定に加えて、抗核抗体・抗ＤＮＡ抗体・抗Ｓｍ抗体・抗リン脂質抗体等の自己抗体を検出することにより行うことができる。
　本発明の方法及び全身性エリテマトーデスの検査により、被験体が膜性腎症又はループス腎炎に罹患していると評価、判断された場合、膜性腎症の場合は、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、免疫グロブリン、ACE阻害剤、生物学的製剤等の投与により治療することができ、また悪性腫瘍等の二次性膜性腎症の検査を行うことが出来る。また、被験体がループス腎炎と評価、判断された場合、副腎皮質ステロイドやシクロフォスファミド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル等の免疫抑制剤、生物学的製剤等の投与により治療することができる。
　尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２のタンパク質レベル又はmRNAレベルを定量し、その量の増減を、各種治療の追加を行い、投薬の減量や治療の中止の判断の指標にすることができる。
　本発明は、本発明の方法により尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の検出による免疫複合体関連腎炎を検出する工程、あるいはさらに全身性エリテマトーデスを検出する工程を含み、さらに、膜性腎症又はループス腎炎を治療する工程を含む一連の疾患の検出工程及び治療工程を含む方法も包含する。
　本発明は、尿中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質やインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出するための試薬やキットも包含する。
　尿中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出するための試薬又はキットは、少なくともインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を含み、該抗体は酵素、蛍光色素、着色粒子等で標識されていてもよい。また、該試薬又はキットは尿中の糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞由来のエクソソーム中からインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出する試薬を含んでいてもよい。
　尿中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出するための試薬又はキットとして、イムノクロマト法用キットが含まれ、該キットはイムノクロマト法デバイスを含む。
　試薬は、尿中のインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を含む糸球体上皮細胞を免疫細胞化学染色の手法により検出する染色試薬又は染色キットであってもよく、試薬又はキットは、少なくともインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を含み、該抗体は酵素、蛍光色素、着色粒子等で標識されていてもよい。また、試薬又はキットは尿中の糸球体上皮細胞からインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出する試薬を含んでいてもよい。また、該試薬又はキットはSynaptopodin等の糸球体上皮細胞のマーカーに対する抗体やDAPI等の核染色試薬を含んでいてもよい。
　尿中のインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出するための試薬又はキットは、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブ又はプライマーを含んでおり、該プライマー又はプローブは、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの断片にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、塩基の数は５～50、好ましくは10～30、さらに好ましくは15～25である。該試薬又はキットは、例えば、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを増幅するための試薬又はキットである。また、該試薬又はキットは、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの抽出試薬を含んでいてもよく、該試薬又はキットは、尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームからインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを抽出し、mRNAを増幅しインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出するための試薬、又はキットである。
　尿中のインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出するための試薬又はキットは、採取した細胞若しくはエクソソームをスライドガラス等の基盤上に固定し、in situ ハイブリダイゼーション法等によりmRNAを染色するキットも包含し、該試薬又はキットは、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブを含む。該試薬又はキットはSynaptopodin等の糸球体上皮細胞のマーカーのmRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブやDAPI等の核染色試薬を含んでいてもよい。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１　腎病理組織の免疫染色
１．インターセクチンを認識する抗体を用いた腎病理組織の免疫染色
　凍結保存された腎生検組織を、５μmに薄切し免疫染色を行った。用いた腎生検組織は、膜性腎症患者、ループス腎炎患者、腎硬化症患者、微小変化型（Minor Abnormality)患者、IgA腎症患者の腎生検組織であった。ループス腎炎患者の腎生検組織としては、ループス腎炎２型と診断された患者の腎生検組織及びループス腎炎３+５型と診断された患者の腎生検組織も用いた。
　まずインターセクチン（ITSNs）染色をそれぞれ１次抗体は抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）を使用した。インターセクチン１（ITSN1)には、大きく分けてITSN1SとITSN1Lの２つのバリアントが存在し、インターセクチン２（ISTN2)には、ITSN2SとITSN2Lの２つのバリアントが存在する。抗ITSN1　sc-9948はITSN1SとITSN1Lを認識し、抗ITSN1L　sc-9950はITSN1Lのみを認識する。また、抗ITSN2　sc-9952はITSN2S及びITSN2Lを認識し、抗ITSN2L　sc-9954はITSN2Lのみを認識する。
　それぞれPBSで２５倍に希釈し、常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後二次抗体としてPBSで２５倍希釈のFITCラベル抗ヤギイムノグロブリンウサギ抗体（Dako）で常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、PBSで２５倍希釈のGoat anti-Human IgG(H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594（ThermoFisher）と常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、VECTASHIELD Mounting Medium（VECTOR LABORATORIES）にて封入し、蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）にて観察し撮像した。
　抗ITSN1　sc-9948を用いた染色結果と抗ITSN1L　sc-9950を用いた染色結果、並びに抗ITSN2　sc-9952と抗ITSN2L　sc-9954を用いた染色結果に差異は認められなかったので、以下に示す結果は、ITSN1SとITSN1Lの両方を認識する抗ITSN1　sc-9948又はITSN2S及びITSN2Lの両方を認識する抗ITSN2　sc-9952を用いた結果である。また、以下の図１及び図２は、インターセクチン１及びインターセクチン２の両方の染色結果を示すが、図１及び図２に示すように、インターセクチン１とインターセクチン２の染色結果に差異は認められなかったので、図３以降には、インターセクチン２を認識する抗体を用いた結果を示す。
　図１に膜性腎症患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体（図１Ａ）及びインターセクチン２を認識する抗体（図１Ｂ）を用いて染色した結果を示し、図２にループス腎炎患者の腎生検組織を、インターセクチン１を認識する抗体（図２Ａ）及びインターセクチン２を認識する抗体（図２Ｂ）を用いて染色した結果を示す。図１及び２に示すように、膜性腎症患者の腎生検組織もループス腎炎患者の腎生検組織も、インターセクチン１を認識する抗体を用いて行った免疫染色でもインターセクチン２を認識する抗体を用いて行った免疫染色でも同じように染色された。図３は、膜性腎症患者１（図３Ａ）、膜性腎症患者２（図３Ｂ）及び膜性腎症患者３（図３Ｃ）の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体を用いて染色した結果を示す。図３に示すように、いずれの患者の組織においても、染色が認められ、インターセクチン２の発現が認められた。図４は膜性腎症患者（図４Ａ）、腎硬化症患者（図４Ｂ）、微小変化型患者（図４Ｃ）及びIgA腎症患者（図４Ｄ）の腎生検組織を、インターセクチン２を認識する抗体を用いて染色した結果を示す。図４に示すように、膜性腎症患者の腎生検組織は強く染色されたが、腎硬化症患者、微小変化型患者及びIgA腎症患者の腎生検組織はほとんど染色されなかった。この結果は、膜性腎症患者の腎臓ではインターセクチン２が発現するが、腎硬化症患者、微小変化型患者及びIgA腎症患者の腎臓ではインターセクチン２の発現が微弱又はないことを示している。
２．インターセクチンを認識する抗体を用いた腎病理組織の免疫染色（IgGとの共染色）　実施例１と同様に、凍結保存された腎生検組織を、５μmに薄切し免疫染色を行った。この際、インターセクチン２を認識する抗体及びヒトIgGを認識する抗体を用いて共染色を行った。観察及び撮像は実施例１と同様の方法で行った。
　図５に膜性腎症患者の腎生検組織を染色した結果を示す。図５Ａはインターセクチン１に対する抗体を用いて染色した結果を、図５ＣはIgGに対する抗体を用いて染色した結果を、図５Ｂはマージした結果を示す。図５に示すように、インターセクチン１に対する抗体を用いて染色された部位とIgGに対する抗体を用いて染色された部位は糸球体内で一致していた。膜性腎症やループス腎炎等の免疫複合体関連腎炎では、自己反応性のIgGが糸球体上皮細胞に沈着することが知られており、図５は、IgGに対する抗体を用いた場合の染色の結果はIgGが糸球体上皮細胞に沈着していることを示す。同様に、図６にループス腎炎２型患者の腎生検組織を染色した結果を示し、図７にループス腎炎３+５型患者の腎生検組織を染色した結果を示す。膜性腎症患者と同様に、インターセクチン１に対する抗体を用いて染色された部位とIgGに対する抗体を用いて染色された部位は一致していた。
　図８及び９にインターセクチン１に対する抗体及びIgGに対する抗体を用いて微小変化型（Minor Abnormality)患者の腎生検組織を染色した結果を示す。インターセクチン１に対する抗体を用いて染色された部位とIgGに対する抗体を用いて染色された部位は糸球体内で一致していた。
　図１０～図１２にインターセクチン２に対する抗体を用いた染色の結果を示す。図１０が膜性腎症患者の腎生検組織を染色した結果、図１１がループス腎炎２型患者の腎生検組織を染色した結果、図１２がループス腎炎３+５型患者の腎生検組織を染色した結果を示す。図５～９と同様に、インターセクチン２に対する抗体を用いて染色した結果、IgGに対する抗体を用いて染色した結果、及びマージした結果を示す。インターセクチン１に対する抗体を用いたときと同様にインターセクチン２に対する抗体を用いて染色された部位とIgGに対する抗体を用いて染色された部位は一致していた。
　また、図１３にインターセクチン２に対する抗体を用いて微小変化型（Minor Abnormality)患者の腎生検組織を染色した結果、図１４にIgA腎症患者の腎生検組織を染色した結果を示す。
　図８、図９、図１３及び図１４に示すように、微小変化型（Minor Abnormality)患者の腎生検組織及びIgA腎症患者の腎生検組織において、インターセクチン１に対する抗体又はインターセクチン２に対する抗体を用いた染色でも、IgGに対する抗体を用いた染色でも非常に弱いが染色が認められ、両者の染色部位は一致していた。
　実施例１の結果より、膜性腎症及びループス腎炎等の免疫複合体関連腎炎患者において、腎組織においてインターセクチン１及びインターセクチン２が強く発現していることが判明した。また、糸球体上皮細胞に沈着したIgGと同じ位置でインターセクチンが糸球体上皮細胞に発現することも判明した。
　微小変化型（Minor Abnormality)やIgA腎症等の他の腎疾患患者でもIgGと同じ位置でのインターセクチンの非常に弱い発現が認められたが、免疫複合体関連腎炎患者との染色強度の差は歴然としており、免疫複合体関連腎炎と他の腎疾患を鑑別することが可能であった。
実施例２　インターセクチンが、沈着したIgGに反応して発現することの確認
１．Heymann腎炎の作成と腎病理組織の染色（IgGとの共染色）
　Sheep Anti-Rat Fx1A Serumを用いて作成されたHeymann腎炎の凍結腎組織をPROBETEXより購入した。Heymann腎炎はヒトの膜性腎症のラットにおける動物モデルであり、疾患惹起性抗体（IgG)をラットに投与することによりHeymann腎炎（Passive Heymann nephritis）が発症する。
　同凍結腎組織を、５μmに薄切し免疫染色を行った。この際、インターセクチン１、インターセクチン２を認識する抗体及びsheep IgGを認識する抗体を用いて共染色を行った。まずITSNs染色をそれぞれ１次抗体は抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）を使用した。それぞれPBSで２５倍に希釈し、常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後二次抗体としてPBSで２５倍希釈のFITCラベル抗ヤギイムノグロブリンウサギ抗体（Dako）で常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、PBSで２５倍希釈のDonkey anti-sheep IgG IgG Alexa 594（Abcam）と常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、VECTASHIELD Mounting Medium（VECTOR LABORATORIES）にて封入し、蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）にて観察し撮像した。
　図１５～１８に、それぞれ抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、及び抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）を用いたときの染色結果を示す。
　図１５～１８に示すように、インターセクチン１に対する抗体を用いて染色された部位とIgGに対する抗体を用いて染色された部位は一致しており、ヒト膜性腎症のラットにおける動物モデルであるHeymann腎炎においても、沈着したIgGに一致してインターセクチンの発現が認められた。
２．不死化培養ラットポドサイト（糸球体上皮細胞）におけるインターセクチン（ITSNs）発現実験
　不死化培養ラットポドサイトは、順天堂大学医学部解剖学・生体構造科学講座の栗原秀剛から分与を受けたPOD7株を使用した。POD7はDMEM/F12/5%FBS/ITSmixture/PCG・SM・AMPHB培地で37℃で培養した。
　培養後、0.05%Trypsin・EDTA/PBSを用いて経代培養した。経代培養したのち、上記培地で10ng/μlに希釈したAnti-Fx1A Polyclonal Antibody（Bioss Inc）と反応させた。反応後それぞれ0時間、4時間、24時間の時点で４℃でエタノールで５分間固定した。PBSで３回洗浄後、まずITSNs染色をそれぞれ１次抗体は抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）を使用した。それぞれPBSで２５倍に希釈し、常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後二次抗体としてPBSで２５倍希釈のFITCラベル抗ヤギイムノグロブリンウサギ抗体（Dako）で常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、VECTASHIELD Mounting Medium（VECTOR LABORATORIES）にて封入し、蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）にて観察し撮像した。
　図１９～２２に、それぞれ抗インターセクチン抗体として、抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、及び抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）を用いたときの染色結果を示す。
　図１９～２２に示すように、いずれの抗体を用いた場合でも、時間を経るにつれて、染色された不死化培養ラットポドサイトは多くなり、不死化培養ラットポドサイトにおけるインターセクチン１又は２の発現の増大が認められた。
　この結果は、培養ラットポドサイトと沈着したHeymann腎炎惹起抗体（IgG)が反応し、インターセクチンが発現することを示している。
　実施例１及び２の結果より、以下のことが判明した。
　インターセクチン１及び２は、糸球体上皮細胞において自己反応性IgGに反応し糸球体上皮細胞に発現する。
　インターセクチンの発現は、糸球体上皮細胞へのIgGの沈着を示す。
　従って、インターセクチン１及び２をIgGが糸球体上皮細胞に沈着する膜性腎症やループス腎炎等の免疫複合体関連腎炎のマーカーとして使用し得る。
実施例３　尿中インターセクチン（ITSNs）含有細胞の染色
　尿には、糸球体上皮細胞等の腎臓構成細胞が含まれており、腎疾患の際にはこれらの細胞の数の増加が認められる。
　また、腎疾患の際には、腎臓構成細胞以外にも、これらの細胞から放出される細胞体の一部であるエクソソームも大量に含まれている。
　これらの、尿中細胞やエクソソームからタンパク質やmRNAを抽出することが可能であり、本実施例では、尿中の腎臓構成細胞において、インターセクチンの検出を試みた。
　２例の膜性腎症患者尿１０～２０ｍLを、４℃で７００ｇで５分間遠沈した。上清を捨てた後沈渣を１００μｌのPBSに浮遊させた。４℃で７００ｇで５分間遠沈し、上清を捨てた後沈渣を２０μｌのPBSに浮遊させプレパラートに撒き、1時間風乾した。氷温のエタノールで５分間固定した。PBSで３回洗浄後、まずITSNs染色をそれぞれ１次抗体は抗ITSN1　sc-9948（santa cruz）、抗ITSN1L　sc-9950（santa cruz）、抗ITSN2　sc-9952（santa cruz）、抗ITSN2L　sc-9954（santa cruz）を使用した。それぞれPBSで２５倍に希釈し、常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後二次抗体としてPBSで２５倍希釈のFITCラベル抗ヤギイムノグロブリンウサギ抗体（Dako）で常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、次に糸球体上皮細胞マーカーであるSynaptopodin染色のためAnti Synaptopodin抗体（Progen）と４℃でovernight反応させた。PBSで３回洗浄後PBSで２５倍希釈のAlexa FluorGoat 568 Anti-mouse IgG(H+L)antibody,highly cross-absorded（life technologies）と常温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、核染色のためPBSに溶解した0.1％DAPI（DOJINDO）と常温で20分間反応させ、核の染色を行った。PBSで３回洗浄後、VECTASHIELD Mounting Medium（VECTOR LABORATORIES）にて封入し、蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）にて観察し撮像した。
　図２３～図２５に２例の結果を示す。図２３～図２５において、Ａはインターセクチンに対する抗体を用いた染色の結果を示し、ＢはDAPI染色の結果を示し、Ｃは抗Synaptopodin抗体を用いた染色の結果を示し、Ｄはマージした像を示す。また、図２３に結果を示す染色では、インターセクチンに対する抗体として、抗ITSN1L　sc-9950を用い、図２４及び図２５に結果を示す染色では、抗ITSN2　sc-9952を用いた。各図のＤの矢印の位置に、インターセクチンに対する抗体を用いた染色、抗Synaptopodin抗体を用いた染色及びDAPI染色の３種類の染色で３重染色された細胞が存在する。
　実施例３は、膜性腎症の患者尿中から、実際にインターセクチン１又は２を含有する細胞の検出が可能であることを示す。
実施例４　尿中エクソソーム中のITSN1S mRNAの検出
　膜性腎症（症例１）患者（Ａ）、膜性腎症（症例２）患者（Ｂ）、慢性腎不全患者（Ｃ）、アルポート症候群患者（Ｄ）の尿5mLから、Invitrogen Total Exosome Isolation Reagent (from urine)を用いてエクソソームを精製した。次いで、Invitrogen Total Exosome RNA and Protein Isolation Kitを用いてmRNAを抽出し、Invitrogen SuperScriptIII First Strand Synthesis Super Mixを用いてcDNAを作製した。作製したcDNAを用いて、PCR法にてITSN1S cDNAを増幅した。ForwardプライマーはCATTAGCGGCAGTGTGCCAG（配列番号９）、ReverseプライマーはCTGGGCAGTGATATGGGATAGTGG（配列番号１０）とした。PCRの増幅反応の条件は、94℃1分間、55℃1分間、72℃1分間を40サイクル行った。
　膜性腎症（症例１）（膜性腎症１）患者は、急性期の尿中タンパク質が高い患者であり、膜性腎症（症例２）（膜性腎症２）患者は、軽快し尿中タンパク質が高くない患者である。
　増幅cDNAを、ニッポンジーンのMarker5と一緒に電気泳動し、分離した。
　結果を図２６に示す。図２６において、レーン１、２、３、４及び５は、それぞれ、Marker5、Aから調製したcDNA、Bから調製したcDNA、Cから調製したcDNA、Dから調製したcDNAを示す。
　図２６に示すように、膜性腎症（症例１）患者からの尿検体中に目的とするITSN1Sの強いバンドが認められた。
　この結果は、尿中に存在するエクソソーム中のITSN1S mRNAを検出することにより、膜性腎症等の免疫複合体関連腎炎を検出できることを示し、さらに急性期の尿中タンパク質が高い患者（膜性腎症（症例１））を良好に検出できることを示す。
実施例５　尿中インターセクチン（ITSNs）mRNAの検出
　膜性腎症（症例１）患者、膜性腎症（症例２）患者、慢性腎不全患者（Ｃ）、アルポート症候群患者（Ｄ）の尿をサンプルとして用いた。
　膜性腎症（症例１）患者は、急性期の尿中タンパク質が高い患者であり、膜性腎症（症例２）は、軽快し尿中タンパク質が高くない患者である。
１．　尿エクソソームからの検出
　上記の４症例の患者のそれぞれの尿5mLから、Invitrogen Total Exosome Isolation Reagent (from urine)を用いてエクソソームを精製した。次いで、Invitrogen Total Exosome RNA and Protein Isolation Kitを用いてmRNAを抽出し、さらに、Invitrogen SuperScriptIII First Strand Synthesis Super MixまたはタカラバイオPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いてcDNAを作製した。
　作製したcDNAを用いて、PCR法にてインターセクチン１（ITSN1）、インターセクチン２（ITSN2）及びGAPDH（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）のcDNAをそれぞれ増幅した。プライマーはタカラバイオの製品を使用しており、ITSN1がHA27745、GAPDHがHA067812、であった。PCRの増幅反応の条件は、94℃1分間、60℃1分間、72℃1分間を40サイクル行った。
　増幅したcDNAを、ニッポンジーンのMarker9またはMraker10と一緒に電気泳動し、分離した。
　図２７及び２８に、それぞれGAPDH及びインターセクチン１の結果を示す。図中矢印で示した位置がそれぞれのcDNAのバンドの位置である。GAPDHはマーカーとして用いている。
　図２８に示すように、インターセクチン１は、膜性腎症（症例１）患者及び膜性腎症（症例２）患者で発現が認められるが、慢性腎不全患者及びアルポート症候群患者では認められない。
　この結果は、尿エクソソームのインターセクチンのmRNAを検出することにより、膜性腎症等の免疫複合体関連腎炎を検出できることを示す。
２．　尿沈渣からの検出
　上記の４症例の患者のそれぞれの尿10mlを、300gで5分間遠心し尿沈渣を分離した。分離した尿沈渣を対象にタカラバイオCellAmp Direct Prep Kit for RT-PCR (Real Time) & Protein Analysisを用いてmRNAを抽出し、タカラバイオPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いてcDNAを作製した。
　作製したcDNAを用いて、PCR法にてITSN2、GAPDHのcDNAをそれぞれ増幅した。プライマーはタカラバイオの製品を使用しており、ITSN2がHA144376、GAPDHがHA067812であった。PCRの増幅反応の条件は、94℃1分間、60℃1分間、72℃1分間を40サイクル行った。
　増幅したcDNAを、ニッポンジーンのMarker9と一緒に電気泳動し、分離した。
　図２９、及び３０に、それぞれGAPDH及びインターセクチン２の結果を示す。図中矢印で示した位置がそれぞれのcDNAのバンドの位置である。GAPDHはマーカーとして用いている。
　図３０に示すようにインターセクチン２は膜性腎症（症例１）の患者で強い発現が認められた。
　この結果は、尿沈査中のインターセクチン２ mRNAを検出することにより、膜性腎症等の免疫複合体関連腎炎を検出できることを示し、さらに急性期の尿中タンパク質が高い患者を良く検出できることを示す。
　本発明により、膜性腎症やループス腎炎を非侵襲的に検出することができる。
配列番号９、１０　プライマー

Claims (15)

  1. 　被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出することにより、免疫複合体関連腎炎を検出する方法。
  2. 　被験体の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２が免疫複合体関連腎炎以外の腎炎患者又は健常者の尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２に対して多い場合に、被験体は免疫複合体関連腎炎に罹患していると評価する、請求項１記載の方法。
  3. 　免疫複合体関連腎炎が、膜性腎症又はループス腎炎である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２が、尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームに含まれるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームに含まれるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を免疫細胞化学染色により検出する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　さらに、糸球体上皮細胞に特異的な糸球体上皮細胞マーカーを染色すると共に、核染色試薬を用いて細胞の核を染色する、請求項５記載の方法。
  7. 　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームからインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を抽出し、免疫測定法により、インターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　イムノクロマト法によりインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質を検出する、請求項７記載の方法。
  9. 　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームからインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを抽出し、mRNAを増幅しインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　尿中に存在する糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームを分離した後に、糸球体上皮細胞又は糸球体上皮細胞に由来するエクソソームに含まれるインターセクチン１タンパク質及び／又はインターセクチン２タンパク質、あるいはインターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAを検出する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　少なくともインターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を含む、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出することにより、免疫複合体関連腎炎を検出するためのキット。
  12. 　インターセクチン１タンパク質に対する抗体及び／又はインターセクチン２タンパク質に対する抗体を用いて、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を含む糸球体上皮細胞を免疫細胞化学染色により染色する、請求項１１記載のキット。
  13. 　さらに、糸球体上皮細胞のマーカーに対する抗体及び核染色試薬を含む、請求項１２記載のキット。
  14. 　イムノクロマト法用キットである、請求項１１記載のキット。
  15. 　少なくとも、インターセクチン１ mRNA及び／又はインターセクチン２ mRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブ又はプライマーを含む、尿中のインターセクチン１及び／又はインターセクチン２を検出するためのキット。
PCT/JP2017/013606 2016-04-27 2017-03-31 尿中インターセクチン１及び／又はインターセクチン２の検出による免疫複合体関連腎炎の検出 WO2017187887A1 (ja)

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