WO2017171385A2 - 하이드로겔 기반 단일염기 다형성 유전형질 분석 방법 및 장치 - Google Patents

하이드로겔 기반 단일염기 다형성 유전형질 분석 방법 및 장치 Download PDF

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WO2017171385A2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • Single nucleotide polymorphisms are base modifications at specific loci in the human genome and are generally found at a rate of one per 1000 bp on average. Since monobasic polymorphism has a very important meaning as a biomarker genetically and medically in disease sensitivity and drug sensitivity, many methods for single nucleotide polymorphism genotyping have been studied.
  • single base polymorphism detection based on hydrogels allows the detection environment to be made in a two-dimensional to three-dimensional matrix, thereby increasing the probe density and increasing the sensitivity of the detection.
  • Hydrogel-based bioassay technology has been actively conducted since 10 years ago, and multiple detection of DNA fragments, miRNAs, and proteins among multiple biomarkers by fluorescence through photocrosslinking of hydrogels It is applied to biological quantitative analysis.
  • Single base polymorphisms using hydrogels include temperature-dependent detection and pH-dependent detection. Temperature-dependent detection is based on the thermodynamic difference between the two alleles that bind to the probe.At a certain temperature, only the mutant gene binds to the probe to produce fluorescence, whereas the wild gene fails to bind to the probe, resulting in fluorescence. Use inconspicuous points. (Jung, Yun Kyung, Jungkyu Kim, and Richard A. Mathies. "Microfluidic hydrogel arrays for direct genotyping of clinical samples.” Biosensors and Bioelectronics 79 (2016): 371-378) pH-dependent methods also likewise mutated and wild genes. Take advantage of the fact that the binding with a specific probe depends on the pH environment.
  • An object of the present invention is to provide a device and method capable of detecting a single nucleotide polymorphism for several types of genes simultaneously by using a hydrogel.
  • One aspect of the present invention to achieve the above object comprises a polymerase chain reaction (PCR) reaction chip comprising a plurality of hydrogel porous microparticles, at least one hydrogel porous microparticles in a single base polymorphism of the gene of analysis (SNP)
  • a first ADP (Anchored Double-labled Probe) comprising a double-labeled nucleotide (double-labeled nucleotide) consisting of a sequence complementary to the base is fixed, and at least one hydrogel porous microparticles a fluorescent chromophore
  • a second ADP comprising a double-labeled nucleotide consisting of a quencher and a sequence complementary to the wild gene to be analyzed is immobilized, a fluorophore at the 5 'end of each of the double-labeled nucleotides, and a quench at the 3' end.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Another aspect of the present invention provides a single base polymorphism (SNP) genotyping method using the single base polymorphism (SNP) genotyping apparatus.
  • the PCR reaction and the single nucleotide polymorphism (SNP) detection are performed at the same time, so that the analysis is faster and simpler than existing methods, and false information due to contamination can be minimized.
  • the present invention can be easily distinguished from the SNP inclusion of the gene of analysis using the probe (first ADP and second ADP) containing the different double-labeled nucleotides by the on / off of the fluorescent signal, such as conventional CYBR green, etc.
  • the fluorescence detection method using the dsDNA-binding dye of the remarkably excellent selectivity shows an improved sensitivity than other conventional methods.
  • hydrogel porous microparticles are used, SNPs of various types of genes may be simultaneously and multiplely detected without a separate encoding / decoding technique.
  • the use of the hydrogel porous microparticles allows the existing two-dimensional analysis to be analyzed three-dimensionally, which further improves the density and sensitivity of the probe and is suitable for biological analysis because the hydrogel has biocompatibility.
  • Figure 1 is an illustration of two types of hydrogel porous microparticles contained in the PCR reaction chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing a state in which the gene amplification is generated at the beginning of the PCR reaction according to an embodiment of the present invention is diffused into the hydrogel porous microparticles to bind to each ADP.
  • Figure 3 is a homozygous gene (Homozygous SNP) in the middle of the PCR reaction according to an embodiment of the present invention, the perfect complement with the one of the two types of ADP (luminescence) in the fluorophore (F) It is a figure which shows.
  • FIG 4 is a diagram showing that when the heterozygous gene (Heterozygous SNP) in the middle of the PCR reaction according to an embodiment of the present invention at the same time having both the mutant gene and wild gene both types of ADP luminescence in the fluorophore (F).
  • Heterozygous SNP Heterozygous SNP
  • FIG. 5 is a diagram illustrating whether fluorescence is generated as a result of real-time polymerase chain reaction using hydrogel porous microparticles containing ADP having a length of 12T as a T-spacer.
  • SNP target (+) means a case where the target gene of the ADP is put into a PCR solution of a real-time polymerase chain reaction
  • SNP target (-) means a case where the target gene of the ADP is not inserted.
  • FIG. 6 is an embodiment of the present invention using a PCR reaction chip containing a hydrogel porous microparticles (SNP target (+)) containing an ADP having a T-spacer of 30T length real-time polymerase chain reaction The result confirms whether or not fluorescence is generated.
  • SNP target (+) hydrogel porous microparticles
  • FIG. 7 is a graph illustrating fluorescence intensities according to lengths of the T-spacers identified in FIGS. 5 and 6.
  • FIG. 8A to 8C are graphs comparing the fluorescence intensity according to the molecular weight of the covalent polymer and the type of the connection part included in the ADP when preparing the hydrogel porous microparticles as an embodiment of the present invention.
  • the molecular weight size of the induction polymer is 600
  • FIG. 8B is a graph of the molecular weight size of the covalent polymer is 4000
  • FIG. 8C is comparing the fluorescence intensity according to the molecular weight of the covalent polymer and the type of the connection part included in the ADP when preparing the hydrogel porous microparticles as an embodiment of the present invention.
  • the molecular weight size of the induction polymer is 600
  • FIG. 8B is a graph of the molecular weight size of the covalent polymer is 4000
  • Figure 9 shows the comparison of the amplification efficiency according to the conditions of the annealing (annealing) step of the PCR as an embodiment of the present invention
  • Condition # 1 is 60 °C and 15 sec
  • Condition # 2 is 60 °C and 25 sec
  • Condition # 3 is 55 °C and 15 sec
  • Condition # 4 refers to 55 °C and 25 sec
  • post is a hydrogel porous microparticles
  • sol is a conventional solution of qPCR in solution.
  • An embodiment of the present invention provides a single base polymorphism (SNP) genotyping apparatus including a polymerase chain reaction (PCR) reaction chip including a plurality of hydrogel porous microparticles.
  • SNP single base polymorphism
  • PCR polymerase chain reaction
  • the at least one hydrogel porous microparticle included in the PCR reaction chip includes a double-labeled nucleotide consisting of a sequence complementary to a single nucleotide polymorphism (SNP) sequence of the gene of interest.
  • a first ADP (Anchored Double-labled Probe) is immobilized, and the second ADP including a double-labeled nucleotide consisting of a sequence complementary to the wild gene of interest may be immobilized on one or more of the other hydrogel porous microparticles.
  • a fluorescent colorant may be connected to the 5 'end of each of the double-labeled nucleotides of the first ADP and the second ADP, and a quencher may be connected to the 3' end.
  • the fluorescent color developer according to one embodiment 6-FAM (6-carboxyfluorescein), TET (tetrachlorofluorescein) and 6-HEX (6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester) It may include a dye selected from the group consisting of, and the like, the matting agent may include one selected from the group consisting of tetramethylrhodamine (TAMRA), Iowa Black TM FQ, BHQ TM and the like, but is not limited thereto.
  • TAMRA tetramethylrhodamine
  • the gene to be analyzed includes a polynucleotide such as DNA, and more specifically, may be human genomic DNA.
  • the gene to be analyzed may be a homozygous or heterozygous conjugate according to an embodiment of the genome.
  • the first ADP and the second ADP may include a connection part consisting of 1 to 72 T bases or 1 to 50 A bases, and the connection part may be fixed to the hydrogel porous microparticles.
  • the linking portion may be more specifically composed of 12 to 50 T bases or A bases.
  • the connection part provides a degree of freedom so that the first ADP and the second ADP fixed to the hydrogel porous microparticles are easily complementary to the gene to be analyzed.
  • the connecting portion consisting of the T base is referred to as a thymine spacer or a T-spacer
  • the connecting portion consisting of the A base is also referred to as an adenine spacer or an A-spacer. .
  • the T or A base included in the linking portion is less than 12, it is not easy to bind to the analyte gene, and when the T base is 72 and the A base is more than 50, the hydrogel porous microparticles ADP longer than the pore size is synthesized, so that the reaction is not smooth or ADP synthesis is impossible.
  • the first ADP and the second ADP may be physically and chemically fixed to the hydrogel porous microparticles.
  • it may be chemically immobilized by an acrylate functional group, an avidin-biotin bond, or a thiol-ene bond, but is not limited thereto if the ADP can be immobilized on the microparticle. Do not.
  • the PCR reaction chip may include two types of hydrogel porous microparticles (Hydrogel scaffold), each microparticle complementary to a single nucleotide polymorphism (SNP) sequence of the gene (Human DNA).
  • a first ADP comprising a double-labeled nucleotide consisting of a Mutant-specific sequence and a second ADP comprising a double-labeled nucleotide consisting of a wild-specific sequence complementary to the wild gene to be analyzed are immobilized.
  • the gene to be analyzed includes a single nucleotide polymorphism (SNP) sequence as an example, it is completely complementary to the double-labeled nucleotide of the first ADP, and fluoresces the color of the second ADP. Incomplete complementary binding with double label nucleotides prevents fluorescence from developing.
  • the gene to be analyzed is a wild gene that does not include a single nucleotide polymorphism (SNP) sequence, it may be incompletely complementary to the double-labeled nucleotide of the first ADP, thereby preventing the fluorescence from developing. Fluorescence is developed by full complementary binding to the double label nucleotides of.
  • Hydrogel porous microparticles according to an embodiment of the present invention is not limited as long as it is a three-dimensional structure, for example, plate-like (plate type), columnar (post type), spherical (spherical type), hemispherical (hemispherical type) and the like.
  • the hydrogel porous microparticles may have, for example, an average particle size of 10 ⁇ m to 5000 ⁇ m, and more specifically, an average particle size of 100 ⁇ m to 3000 ⁇ m.
  • the material of the hydrogel porous microparticles can be used without limitation as long as it is a polymer that can be solidified. Specifically, polyethylene glycol-diacrylate (PEG-DA) or polyacrylamide (PAAM) can be used. Hydrophilic polymers such as
  • the hydrogel porous microparticles may be a porous structure including pores.
  • the porosity of the microparticles may be 10% to 80% by volume, more specifically 20% to 70% by volume with respect to the total volume of the microparticles. If it falls outside the above range, the porosity may drop or the stability of the fine particles may become unstable.
  • Hydrogel porous microparticles as an embodiment of the present invention comprises the steps of preparing a prepolymer solution by mixing a prepolymer (pre-polymer), a povalent copolymer (porogen), a photoinitiator and purified water; Mixing the prepolymer solution with a solution comprising the first ADP or the second ADP; And after loading the mixed solution in the PCR reaction chip, it can be prepared by a manufacturing method comprising the step of molding the mixed solution to the desired shape.
  • the volume ratio of the solution containing the prepolymer solution and the nucleic acid primer may be 20 to 5: 1.
  • the term "pre-polymer” refers to a prepolymer obtained by stopping a polymerization or polycondensation reaction at an appropriate stage in order to facilitate molding of the polymer, and in the present invention, molding before solidification. It means the polymer of the state which is easy to process.
  • the solution including the first ADP or the second ADP may further include a T-spacer and / or a functional group for immobilizing the respective ADP on the microparticles. have.
  • the step of preparing the prepolymer solution may further include adjusting the size of pores formed in the microparticles by modifying the molecular weight of the pore polymer included in the solution.
  • the covalent polymer may be, for example, polyethylene glycol (PEG), and specifically, PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG12000, PEG20000, PEG35000, PEG40000 and the like (manufactured by Sigma Aldrich) can be used.
  • Single base polymorphism (SNP) genotyping efficiency may vary depending on the molecular weight of the covalent polymer.
  • the manufacturing method may further include washing the molded hydrogel porous microparticles.
  • the cleaning step may include removing ADP that is not fixed in the pores of the porous structure through cleaning, and may further include removing the covalent polymer.
  • Forming the mixed solution into a desired shape may include forming a desired shape through a mask or a mold, or forming a droplet into a desired shape by photocrosslinking. This can be produced in particles of various shapes and sizes.
  • the present invention can manufacture a plurality of hydrogel porous microparticles injected by varying the type of the first ADP and the second ADP according to the type of the gene to be analyzed when the hydrogel porous microparticles are prepared as an embodiment.
  • an analysis apparatus capable of analyzing two or more different single nucleotide polymorphisms (SNP) genotypes without a separate label in one reaction chip.
  • a plurality of hydrogel porous microparticles injected by varying the types of the first ADP and the second ADP according to the type of the gene to be analyzed may use the color of each microparticle, such as a quantum dot.
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • One embodiment of the present invention can provide a single base polymorphism genotyping method using the above-described single base polymorphism (SNP) genotyping apparatus.
  • the method comprises the steps of injecting a PCR solution containing the analyte gene, forward primer, reverse primer to the PCR reaction chip of a single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping apparatus; A PCR step of forward and backward primers included in the PCR solution to amplify the gene to be analyzed to generate a gene amplification (amplicon); Dispersing the gene amplification product into the hydrogel porous microparticles and binding the first ADP or the second ADP; And after completion of the PCR may include determining whether the fluorescent color of the hydrogel porous microparticles contained in the PCR reaction chip.
  • the forward primer or reverse primer may be a polynucleotide consisting of 10 to 50 consecutive DNA sequences, but the sequence type and sequence length of the primer may be modified without limitation depending on the gene to be analyzed.
  • the gene amplification means a PCR amplification of a polynucleotide, such as DNA or RNA, oligonucleotides.
  • the gene amplification is not limited to the number of gene amplification, and is the broadest to include all amplification of the gene, for example, may have a size of about 100-200 bp.
  • PCR polymerase chain reaction
  • qPCR quantitative polymerase chain reaction
  • Multiplex polymerase chain reaction Multiplex polymerase chain reaction
  • Real time PCR real time quantitative polymerase chain reaction
  • qPCR quantitative polymerase chain reaction
  • Multiplex PCR multiplex polymerase chain reaction
  • Real time PCR real time polymerase chain reaction
  • real-time quantitative polymerase chain reaction One or more of a real time qPCR and a real time multiplex PCR.
  • the single nucleotide polymorphism genotyping method will be described in detail with reference to FIGS. 2 to 4.
  • Figure 2 is an illustration of the initial cycle of the real-time multiplex polymerase chain reaction, the forward primer and the reverse primer contained in the PCR solution in the PCR reaction chip amplifies the nucleotide sequence around the specific monobasic polymorphism of the gene of analysis Gene amplification (amplicon) can be generated.
  • the amplification product since the amplification product has a relatively short base sequence of several hundred base pairs and several nm in size, it may diffuse into the hydrogel porous microparticles.
  • Spreading fragments may have a sequence of wild gene or variant gene (SNP) if homozygous, depending on the nature of the genome.
  • SNP wild gene or variant gene
  • Heterozygous has a sequence of wild and mutant genes at the same time.
  • the fragments diffused into the microparticles are complementarily bound to the first ADP or the second ADP according to the complementary base sequence.
  • the omnidirectional primer may bind to the gene amplification complementarily to polymerize a replication strand complementary to a single stranded fragment with the help of Taq DNA polymerase.
  • Figure 3 is an illustration of the late cycle of the real-time multiplex polymerase chain reaction for homozygous genes. Since the fragments, ie, amplifiers, which are cloned in FIG. 2 have a sequence of one of a nucleotide sequence of a mutant gene or a nucleotide sequence of a wild gene, are included in each of two types of hydrogel porous microparticles according to an embodiment of the present invention. Perfect matching with only one type of ADP, either the first ADP or the second ADP.
  • the step of the gene amplification product according to an embodiment of the present invention is diffused into the hydrogel porous microparticles and combined with the first ADP or the second ADP, so that the gene of analysis is a single nucleotide polymorphism (SNP) base.
  • Including the sequence may include full complementary binding to the double label nucleotide of the first ADP, and incomplete complementary binding to the double label nucleotide of the second ADP.
  • the gene of interest is a wild gene that does not include a single nucleotide polymorphism (SNP) sequence, it may be incompletely complementary binding with the double label nucleotide of the first ADP, and with the double label nucleotide of the second ADP. Completely complementary binding.
  • the ADP is completely complementary to the gene amplification, so that all base sequences are matched with each other, so that the forward primer is amplified and the ADP is separated.
  • the forward primer is fragmented according to the 5'-3 'nucleic acid terminal hydrolase activity of Taq DNA polymerase in a chain polymerization reaction in which a single strand fragment forms a double strand fragment.
  • fluorescence resonance energy transfer FRET
  • the fluorophore stays in the hydrogel porous microparticles because it is connected to the connecting portion, that is, thymine spacer.
  • the connecting portion that is, thymine spacer.
  • the step of confirming whether the fluorescence is developed according to an embodiment of the present invention can distinguish whether it is completely complementary or incomplete complementary binding depending on whether fluorescence is present in the hydrogel porous microparticles of the present invention.
  • the step of confirming whether the fluorescence coloration according to an embodiment of the present invention if the fluorescent color appears in the hydrogel porous microparticles to which the first ADP is fixed the gene of analysis is a single base polymorphism (SNP) base Comprising a sequence, and if the fluorescent color appears on the hydrogel porous microparticles fixed to the second ADP may include determining that the gene to be analyzed is a wild gene that does not contain a single nucleotide polymorphism (SNP) nucleotide sequence .
  • SNP single base polymorphism
  • Figure 4 is an illustration of the late cycle of the real-time multiplex polymerase chain reaction for heterozygous genes.
  • the gene of analysis may have a mutant gene and a wild gene at the same time, and thus the sequence complementary to the first ADP and the wild gene of analysis comprising a double-labeled nucleotide consisting of a sequence complementary to the SNP sequence of the gene of analysis. Fluorescence may be developed in both types of hydrogel porous microparticles including a second ADP including a double-labeled nucleotide.
  • the PCR step may include a denaturation step, an annealing step, and an elongation step.
  • the annealing step may obtain a high PCR amplification efficiency. In order to be made for 10 to 60 seconds at 50 to 70 °C.
  • a PCR reaction chip was prepared in which a plurality of hydrogel porous microparticles were loaded at different positions.
  • PEG 700DA poly (ethylene glycol) diacrylate
  • Mn 700 PEG 600 (poly (ethylene glycol); Mn 600): DNase-free water: Irgacure 1173 was mixed in a volume ratio of 20: 40: 35: 5 100 ⁇ M of CYP2C9 mutant-specific ADP was mixed in a 9: 1 volume ratio to prepare an ADP-prepolymer mixed solution.
  • ADP-prepolymer mixed solution was prepared in the same manner as above except that ADP was used, respectively, CYP2C9 wild-specific ADP, VKORC1 mutant-specific ADP and VKORC1 wild-specific ADP.
  • double-labeled nucleotides included in each ADP were purchased from IDT (Integrated DNA Technologies). At the 5 'end of each double-labeled nucleotide, i6 FAMK was used as Fluorophore at the 5' end, and Iowa Boack FQ was used as the quencher at the 3 'end.
  • the ADP-prepolymer mixed solution mixed with the four different ADPs was loaded in different positions in the PCR reaction chip.
  • the PCR reaction chip was photocrosslinked by irradiating UV (365 nm, 728 mW / cm 2 ) for 100 ms through a mask. Subsequently, the ADP in the non-crosslinked solution state was washed by injecting DNase-free water to prepare a PCR reaction chip including four post-type hydrogel porous microparticles having a total of four types of ADP. It was.
  • PCR conditions were performed to repeat 40 cycles of the first denaturation (95 ° C., 8 sec), followed by the second denaturation (95 ° C., 3 sec), annealing and elongation (60 ° C., 15 sec). It was.
  • a plurality of hydrogel porous microparticles were prepared to have different colors to prepare a PCR reaction chip loaded with the same.
  • the prepolymer mixed solution for colorless cord microparticles was prepared by mixing PEG 700DA: PEG 600: DNase-free water: Irgacure 1173 in a volume ratio of 20: 40: 35: 5.
  • the tubes containing the blue cord prepolymer solution were connected.
  • the final seventh inlet connected a tube containing one of the four ADP solutions, and the outlet of the PDMS channel connected a collection tube containing 1 ⁇ TET (Tris-EDTA-Tween) solution.
  • One of the six inlets to which the color coded polymer solution was connected and the inlet to which the ADP solution was connected were moved by applying a pressure of about 1: 3.
  • the flow time and stop time of the pressure actuator were set to about 500 ms. After setting the mask size according to the width of the PDMS channel, an exposure time was set to 100 ms and a hold time was set to 200 ms.
  • hydrogel porous microparticles in the form of discs each having the four colors were prepared through SFL (stop flow lithography), and then stored at 4 ° C.
  • CYP2C9 mutant-specific ADP has a color code
  • CYP2C9 wild-specific ADP has a red code
  • VKORC1 mutant-specific ADP has a green code
  • VKORC1 wild-specific ADP has a blue code.
  • PCR conditions were performed to repeat 40 cycles of the first denaturation (95 ° C., 8 sec), followed by the second denaturation (95 ° C., 3 sec), annealing and elongation (60 ° C., 15 sec). It was.
  • the single base polymorphism (SNP) genotyping efficiency according to the length of T-spacer, that is, the connection portion of each ADP in the hydrogel porous microparticles of the single base polymorphism (SNP) genotyping apparatus Compared.
  • PCR reaction chip included two kinds of hydrogel porous microparticles, and the two kinds of microparticles included an ADP including a double-labeled nucleotide having the following nucleotide sequence.
  • each of the ADP was to include a junction consisting of 12 or 30 T bases respectively (length of T-spacer: 12T, 30T).
  • Primer sequence information of the PCR solution included in the real-time polymerase chain reaction is as follows.
  • Reverse primer (SEQ ID NO: 3): 5'-GGT CAG TGA TAT GGA GTA GGG TCA-3 '
  • FIG. 5 shows the results of real-time polymerase chain reaction of the hydrogel porous microparticles having a T-spacer length of 12T (ADP sequence: 5Acryd / 12T / i6 FAMK / probe (27nt) / 3BHQ_1).
  • SNP target (+) when the target gene of the ADP was added to the PCR solution of the real-time polymerase chain reaction (SNP target (+)), fluorescence was developed in the hydrogel porous microparticles, and the target gene was not added. In the case of (SNP target (-)), fluorescence was not developed in the hydrogel porous microparticles.
  • FIG. 6 shows the results of real-time polymerase chain reaction of hydrogel porous microparticles having a T-spacer length of 30T (ADP sequence: 5Acryd / 30T / i6 FAMK / probe (27nt) / 3IABkFQ).
  • ADP sequence 5Acryd / 30T / i6 FAMK / probe (27nt) / 3IABkFQ
  • FIG. 7 is a graph comparing fluorescence intensities according to the lengths of the T-spacers identified in FIGS. 5 and 6, and when the length is 30T, the fluorescence color is more clearly seen, indicating that the analysis efficiency is excellent.
  • the single base polymorphism (SNP) genotyping efficiency was compared according to the pore size of the hydrogel porous microparticles of the single base polymorphism (SNP) genotyping apparatus and the length of the junction included in the ADP. .
  • 8A is a prepolymer mixed solution obtained by mixing PEG 700DA: PEG 600: DNase-free water: Irgacure 1173 in a volume ratio of 20: 40: 35: 5 (v / v), and each of the connecting portions included in ADP is 30T, Except that 50A, 50T, 72T is shown the results of real-time polymerase chain reaction using a PCR reaction chip prepared in the same manner as in [Test Example 1].
  • 30T is a connection portion consisting of 30 T bases
  • 50A is a connection portion consisting of 50 A bases
  • 50T means a connection portion consisting of 50 T bases
  • 72T means a connection portion consisting of 72 T bases.
  • 8B is a prepolymer mixed solution containing PEG 700DA: PEG4000 (50% w / v): DNase-free water: Irgacure 1173 in a volume ratio of 20: 65: 10: 5 (v / v), and includes ADP. Except that the connecting portion is 30T, 50A, 50T, 72T, respectively, shows the results of real-time polymerase chain reaction using a PCR reaction chip prepared in the same manner as in [Test Example 1].
  • FIG. 8C shows a prepolymer mixed solution containing PEG 700DA: PEG6000 (50% w / v): DNase-free water: Irgacure 1173 in a volume ratio of 18: 58: 19: 5 (v / v), and includes ADP. Except that the connecting portion is 30T, 50A, 50T, 72T, respectively, shows the results of real-time polymerase chain reaction using a PCR reaction chip prepared in the same manner as in [Test Example 1].
  • the fluorescence color development of the hydrogel porous microparticles including the mutant-specific ADP increased, and the single base polymorphism (SNP) detection efficiency also increased.
  • the length of the linkage included in the ADP increased, the degree of freedom of photocrosslinked primer was increased, and the single nucleotide polymorphism (SNP) detection efficiency was increased.
  • the number of T bases was more than a certain number, the difference in efficiency was not large.
  • PCR amplification efficiency according to PCR condition change was compared in single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping.
  • SNP single nucleotide polymorphism

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Abstract

본 발명은 분석대상 유전자의 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열에 상보적인 서열로 이루어진 이중 라벨 뉴클레오타이드 또는 분석대상 야생 유전자에 상보적인 서열로 이루어진 이중-라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 ADP(Anchored Double-labled Probe)이 고정된 복수 개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 포함하는 PCR 반응칩을 이용한 단일 염기 다형성 유전형질 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 PCR 반응 및 단일염기 다형성 검출이 동시에 수행되므로 분석이 신속하고 간편하며, 우수한 선택성과 민감도를 나타낸다. 또한, 여러 가지 종류의 유전자의 SNP를 동시에 다중으로 검출할 수 있다.

Description

하이드로겔 기반 단일염기 다형성 유전형질 분석 방법 및 장치
본 명세서에는 단일염기 다형성 유전형질 분석을 위한 장치 및 방법이 개시된다.
단일염기 다형성 (SNPs)은 인간 게놈의 특정 좌위에서의 염기 변형으로, 일반적으로 평균 1000 bp당 하나의 비율로 발견된다. 단일염기 다형성은 질병 민감도, 약물 민감도에 있어서 유전학적, 의학적으로 바이오 마커로써 매우 중요한 의미를 갖기 때문에, 단일염기 다형성 유전형질 분석을 위한 방법들이 많이 연구되어 왔다.
특히, 하이드로젤을 기반으로 하는 단일 염기 다형성 검출은 검출 환경을 2차원에서 3차원 매트릭스 내에서 이루어지게 하므로, 프로브 밀도를 증가시킴과 동시에, 검출의 민감도를 증가시킬 수 있다. 하이드로젤을 기반으로 한 바이오에세이 기술은 10년전을 기점으로 활발하게 이루어지고 있고, 하이드로젤의 광가교 (photocrosslinking)을 통해 여러 가지 종류의 바이오마커들 중 DNA 조각, miRNA, 단백질을 형광으로 다중 검출하여 생물학적 정량 분석에 응용하고 있다.
하이드로젤을 이용한 단일염기 다형성 방법에는 크게 온도-의존적 검출법과 pH-의존적 검출법이 있다. 온도-의존적 검출법은 프로브와 결합한 두 대립유전자의 열역학적 차이를 이용하여 검출해 내는 방법으로, 특정온도에서는 변이 유전자만 프로브와 결합을 하여 형광을 발색하고, 반대로 야생 유전자는 프로브와 결합하지 못하여 형광을 띄지 못하는 점을 이용한다. (Jung, Yun Kyung, Jungkyu Kim, and Richard A. Mathies. "Microfluidic hydrogel arrays for direct genotyping of clinical samples."　Biosensors and Bioelectronics　79 (2016): 371-378) pH-의존적 방법 또한 마찬가지로 변이 유전자와 야생 유전자의 특정 프로브와 결합이 pH 환경에 따라 달라지는 점을 이용한다. (Zhang, Huaibin, et al. "Genotyping by alkaline dehybridization using graphically encoded particles."　Chemistry-A European Journal　17.10 (2011): 2867-2873) 하지만, 상기 두 방법은 공통적으로 온도 및 pH의 최적화가 필요하다. 즉, 야생 유전자와 변이 유전자가 구별이 가능한 특정 온도 및 pH를 유전자마다 특이적으로 찾아주어야 하는 불편함이 있으며, 이는 곧 동시다중 검출에서 한계가 있음을 의미한다. 또한, 상기 두 방법은 민감도를 높이기 위해 검출 전에 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 통하여 검출하려는 유전자를 증폭시키지만, 중합효소연쇄반응에서 발생하는 비특이적 결합에 의한 잘못된 산물, 혹은 반응 산물을 분리하는 과정에서 수반되는 오염의 발생은 차후의 단일염기 다형성 검출에서 잘못된 정보를 발생시키는 원인이 될 수 있다.
따라서, 상술한 하이드로젤을 이용한 단일염기 다형성 검출 방법의 문제점을 극복하고 기술적인 면 그리고 비용적인 면에서 보다 효과적인 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 하이드로젤을 이용하여 동시다중으로 여러 종류의 유전자에 대한 단일염기 다형성 검출이 가능한 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 관점은 복수 개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 포함하는 PCR(Polymerase chain reaction) 반응칩을 포함하고, 하나 이상의 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에는 분석대상 유전자의 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열에 상보적인 서열로 이루어진 이중 라벨 뉴클레오타이드(double-labeled nucleotide)를 포함하는 제 1 ADP(Anchored Double-labled Probe)가 고정되어 있고, 다른 하나 이상의 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에는 형광 발색제, 소광제 및 분석대상 야생 유전자에 상보적인 서열로 이루어진 이중-라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 ADP가 고정되어 있으며, 상기 각 이중 라벨 뉴클레오타이드의 5'말단에는 형광 발색제(Fluorophore), 3'말단에는 소광제(Quencher)가 연결되어 있는, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 일 관점은 상기 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치를 이용한 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 분석 장치 및 방법은 PCR 반응 및 단일염기 다형성(SNP) 검출이 동시에 수행되므로 기존 방법들에 비해 분석이 신속하고 간편하며, 오염에 의한 잘못된 정보를 최소화할 수 있다. 본 발명은 상기 서로 다른 이중 라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 프로브(제 1 ADP 및 제 2 ADP)를 이용하여 분석대상 유전자의 SNP 포함여부를 형광신호의 On/Off로써 간단히 구분 가능할 수 있어 기존의 CYBR green 등의 dsDNA-바인딩 염료를 사용한 형광검출 이용 분석법에 비하여 현저히 우수한 선택성을 나타내며, PCR을 기반으로 하여 기존 다른 분석법보다 개선된 민감도를 나타낸다. 또한, 프로브 디자인에 따라 어닐링 온도를 비슷하게 맞춰줌으로써 여러 종류의 유전자를 동시에 같은 온도에서 검출할 수 있다. 일 실시예로서 복수 개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 이용할 경우 별도의 인코딩(encoding)/디코딩(decoding) 기술 없이도 여러 가지 종류의 유전자의 SNP를 동시에 다중으로 검출할 수 있다. 상기 하이드로젤 다공성 미세입자의 사용으로 기존의 2차원적인 분석을 3차원적으로 분석할 수 있기 때문에 더욱 개선된 프로브의 밀도와 민감도를 나타내며, 하이드로젤이 생체적합성을 가지므로 생물학적 분석에 적합하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 반응칩 내부에 포함된 2가지 종류의 하이드로젤 다공성 미세입자에 대한 예시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 반응 초기에 유전자 증폭물들이 생성되어 하이드로젤 다공성 미세입자 내부에 확산되어 들어와 각 ADP에 결합하는 모습을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 반응 중후기에 중, 동형 접합체 유전자(Homozygous SNP)의 경우 두 종류 중 한 종류의 ADP와 완전 상보적 결합(Perfect matching)하여 형광발색제(F)에서 발광되는 것을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 반응 중후기에 이형 접합체 유전자(Heterozygous SNP)가 변이 유전자와 야생 유전자를 동시에 갖는 경우 두 종류의 ADP 모두 형광발색제(F)에서 발광되는 것을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예로서 T-spacer의 길이가 12T인 ADP를 포함하는 하이드로젤 다공성 미세입자를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과 형광 발색여부를 확인한 도이다. SNP target (+)는 실시간 중합효소연쇄반응의 PCR 용액에 상기 ADP의 타겟 유전자를 넣어준 경우를 의미하고, SNP target (-)는 상기 ADP의 타겟 유전자를 넣어주지 않은 경우를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예로서 T-spacer의 길이가 30T인 ADP를 포함하는 하이드로젤 다공성 미세입자(SNP target (+))를 포함하는 PCR 반응칩을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과 형광 발색여부를 확인한 도이다.
도 7은 상기 도 5와 도 6에서 확인한 T-spacer의 길이에 따른 형광 강도를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 8A 내지 도 8C는 본 발명의 일 실시예로서 하이드로젤 다공성 미세입자 제조시 기공유도중합체의 분자량 크기와 ADP가 포함하는 연결부의 종류에 따른 형광 강도를 비교하여 그래프로 나타낸 것으로, 도 8A는 기공유도중합체의 분자량 크기가 600, 도 8B는 기공유도중합체의 분자량 크기가 4000, 도 8C는 기공유도중합체의 분자량 크기가 6000인 경우의 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예로서 PCR의 어닐링(annealing) 단계의 조건에 따른 증폭 효율을 비교하여 나타낸 것으로, Condition #1은 60℃ 및 15 sec, Condition #2는 60℃ 및 25 sec, Condition #3은 55℃ 및 15 sec, Condition #4는 55℃ 및 25 sec인 경우를 의미하며, post는 하이드로젤 다공성 미세입자, sol은 용액상태의 기존 qPCR을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 복수 개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 포함하는 PCR(Polymerase chain reaction) 반응칩을 포함하는 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치를 제공한다.
일 실시예로서 상기 PCR 반응칩에 포함되는 하나 이상의 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에는 분석대상 유전자의 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열에 상보적인 서열로 이루어진 이중 라벨 뉴클레오타이드(double-labeled nucleotide)를 포함하는 제 1 ADP(Anchored Double-labled Probe)가 고정되어 있고, 다른 하나 이상의 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에는 분석대상 야생 유전자에 상보적인 서열로 이루어진 이중-라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 ADP가 고정될 수 있다.
또한, 일 실시예로서, 상기 제 1 ADP 및 제 2 ADP의 각 이중 라벨 뉴클레오타이드의 5'말단에는 형광 발색제, 3'말단에는 소광제가 연결될 수 있다. 구체적으로, 일 실시예에 따른 상기 형광 발색제는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein) 및 6-HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester) 등으로 이루어진 군에서 선택된 염료를 포함할 수 있고, 상기 소광제는 TAMRA(tetramethylrhodamine), Iowa Black™ FQ, 및 BHQ™ 등으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예로서 상기 분석대상 유전자는 DNA와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 보다 구체적으로는 인간 게놈 DNA일 수 있다. 상기 분석대상 유전자는 일 실시예로서 유전체의 특성에 따라 동형 접합체 또는 이형 접합체일 수 있다.
또한, 일 실시예로서 상기 제 1 ADP 및 제 2 ADP는 1 내지 72개의 T 염기 또는 1 내지 50개의 A염기로 이루어진 연결부를 포함하고, 상기 연결부가 하이드로젤 다공성 미세입자에 고정된 것일 수 있다. 상기 연결부는 보다 구체적으로 12 내지 50개의 T 염기 또는 A 염기로 이루어질 수 있다. 상기 연결부는 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에 고정된 제 1 ADP 및 제 2 ADP가 분석대상 유전자와 상보적 결합을 하기에 용이하도록 자유도(Degree of Freedom)를 제공한다. 본 명세서에서 상기 T염기로 이루어진 연결부는 티민 스페이서(Thymine spacer) 또는 T-스페이서(T-spacer), 상기 A염기로 이루어진 연결부는 아데닌 스페이서(Adenine spacer) 또는 A-스페이서(A-spacer)라고도 한다. 일 실시예로서 상기 연결부에 포함된 T 또는 A 염기가 12 개 미만이면 분석대상 유전자와 결합하기에 용이하지 않으며, 상기 T 염기가 72개, 상기 A 염기가 50개 초과이면 하이드로젤 다공성 미세입자의 기공(pore) 크기보다 더 긴 ADP가 합성되어 반응이 원활하게 이루어지지 않거나, ADP 합성이 불가능하다는 문제가 있다.
일 실시예로서 상기 제 1 ADP 및 제 2 ADP는 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에 물리 화학적으로 고정된 것일 수 있다. 예를 들면 아크릴레이트 작용기, 아비딘-비오틴(Avidin-Biotin) 결합 또는 티올-엔(Thiol-Ene) 결합에 의해 화학적으로 고정된 것일 수 있으나, 상기 ADP가 상기 미세입자에 고정될 수 있다면 이에 제한되지 않는다.
상기 단일 염기 다형성 유전형질 분석 장치를 도 1을 참조로 하여 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 일 실시예로서 PCR 반응칩은 2가지 종류의 하이드로젤 다공성 미세입자(Hydrogel scaffold)를 포함할 수 있으며, 각 미세입자는 분석대상 유전자(Human DNA)의 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열에 상보적인 서열(Mutant-specific sequence)로 이루어진 이중 라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 ADP와 분석대상 야생 유전자에 상보적인 서열(Wild-specific sequence)로 이루어진 이중-라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 ADP가 고정화 되어 있다. 상기 제 1 ADP 및 제 2 ADP의 5' 말단이 하이드로젤 다공성 미세입자에 고정화되어 있으며(Gel-Bound DNA Probe), 상기 고정화된 ADP는 연결부(T-spacer)를 포함하여 보다 자유로운 움직임을 가질 수 있다. PCR 반응 전의 상기 각 이중-라벨 뉴클레오타이드에 연결된 형광 발색제(Fluorophore)와 소광제(Quencher)는 서로 가까운 거리에 위치하고 있기 때문에 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상에 의해 형광발색제의 발광이 억제되어 형광을 내지 않는다. 그러나, PCR 반응 후에는, 일 실시예로서 상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하여 형광 발색되고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와는 불완전 상보적 결합하여 형광이 발색되지 않는다. 또한, 일 실시예로서 상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하지 않는 야생 유전자이면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 불완전 상보적 결합하여 형광이 발색되지 않고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하여 형광이 발색된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 하이드로젤 다공성 미세입자는 3차원의 구조체라면 제한되지 않으며, 예를 들면 디스크와 같은 판상형(Plate type), 기둥형(post type), 구형(spherical type), 반구형(hemispherical type) 등의 형태일 수 있다. 또한, 일 실시예로서 상기 하이드로젤 다공성 미세입자는 예를 들어 평균 10 ㎛ 내지 5000 ㎛의 입경크기를 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 평균 100 ㎛ 내지 3000 ㎛의 입경을 가질 수 있다. 하이드로젤 다공성 미세입자의 재료는 고형화가 가능한 폴리머(pre-polymer)라면 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜-디아크릴레이트(Polyethylene Glycol-Diacrylate, PEG-DA) 또는 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PAAM)와 같은 친수성 폴리머를 사용할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 하이드로젤 다공성 미세입자는 공극을 포함하는 다공성(porous) 구조체일 수 있다. 일 실시예로서, 상기 미세입자의 공극율은 미세입자 총 부피에 대하여 10부피% 내지 80부피%, 보다 구체적으로 20부피% 내지 70부피%일 수 있다. 상기 범위를 벗어날 경우 다공성이 떨어지거나 미세입자의 안정도가 불안정해질 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서 상기와 같은 하이드로젤 다공성 미세입자는 프레폴리머(pre-polymer), 기공유도중합체(porogen), 광개시제 및 정제수를 혼합하여 프레폴리머 용액을 제조하는 단계; 상기 프레폴리머 용액과 상기 제 1 ADP 또는 제 2 ADP를 포함하는 용액을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합된 용액을 PCR 반응칩안에 로딩한 후, 상기 혼합된 용액을 목적하는 형상으로 성형하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 상기 프레폴리머 용액과 핵산 프라이머를 포함하는 용액의 부피비는 20 내지 5 : 1일 수 있다. 본 명세서에서 상기 "프레폴리머(pre-polymer)"란 폴리머의 성형가공을 용이하게 하기 위해 중합 또는 중축합 반응을 적당한 단계에서 정지한 예비 중합물을 의미하는 것으로, 본 발명의 경우 고형화되기 이전의 성형가공이 용이한 상태의 폴리머를 의미한다. 일 실시예로서 상기 제 1 ADP 또는 제 2 ADP를 포함하는 용액은 제 1 ADP 또는 제 2 ADP는 연결부(T-spacer) 및/또는 상기 각 ADP를 미세입자에 고정화하기 위한 작용기를 더 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 프레폴리머 용액의 제조단계는 용액에 포함된 기공유도중합체의 분자량을 변형시킴으로써 미세입자내에 형성되는 기공의 크기를 조절하는 것을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 기공유도중합체는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)을 사용할 수 있으며, 구체적으로 PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG12000, PEG20000, PEG35000, PEG40000 등(제조사: Sigma Aldrich)을 사용할 수 있다. 상기 기공유도중합체의 분자량에 따라 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석효율이 변할 수 있다.
일 실시예로서 상기 제조방법은 상기 성형된 하이드로젤 다공성 미세입자를 세정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세정 단계는 세정을 통하여 상기 다공성 구조의 기공 내부에 고정되지 않은 ADP를 제거하는 것을 포함할 수 있으며, 기공유도중합체를 제거하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 혼합된 용액을 목적하는 형상으로 성형하는 단계는 일 실시예로서 마스크 또는 형틀(mold)을 통해 목적하는 형상으로 성형하거나, 액적(droplet) 형태로 성형하여 광가교시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이를 통해 다양한 형태 및 크기의 입자로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 일 실시예로서 상기 하이드로겔 다공성 미세입자의 제조시 분석대상 유전자의 종류에 따라 제 1 ADP 및 제 2 ADP의 종류를 달리하여 주입한 복수개의 하이드로겔 다공성 미세입자를 제조할 수 있으며, 이들의 PCR 반응칩내 위치를 달리하여 구분함으로써 한 반응칩내에서 별도의 표지없이도 2종 이상의 서로 다른 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질을 분석할 수 있는 분석장치를 제공할 수 있다. 또는, 일 실시예로서 상기 분석대상 유전자의 종류에 따라 제 1 ADP 및 제 2 ADP의 종류를 달리하여 주입한 복수개의 하이드로겔 다공성 미세입자를 각 미세입자의 색상을 양자점(Quantum dot) 등을 이용하여 달리하여 제조함으로써 한 반응칩내에서 2종 이상의 서로 다른 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질을 분석할 수 있는 분석장치를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 상술된 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치를 이용한 단일 염기 다형성 유전형질 분석방법을 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치의 PCR 반응칩에 분석대상 유전자, 전방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 PCR 용액을 주입하는 단계; 상기 PCR 용액에 포함된 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 상기 분석대상 유전자를 증폭시켜 유전자 증폭물(amplicon)을 생성하는 PCR 단계; 상기 유전자 증폭물이 상기 하이드로젤 다공성 미세입자 내부로 확산되어 들어가 제 1 ADP 또는 제 2 ADP와 결합하는 단계; 및 PCR 완료후 상기 PCR 반응칩에 포함된 하이드로젤 다공성 미세입자의 형광 발색 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 10 내지 50 개의 연속 DNA 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 프라이머의 서열종류와 서열길이는 분석대상 유전자에 따라 제한 없이 변형이 가능하다. 일 실시예로서 상기 유전자 증폭물(amplicon)은 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 등의 PCR 증폭물을 의미한다. 상기 유전자 증폭물은 유전자 증폭 횟수에 제한되지 않고 유전자의 증폭물이라면 모두 포함되는 최광의이며, 예를 들어 약 100-200 bp의 크기를 가질 수 있다. 또한, 일 실시예로서 상기 PCR(중합효소 연쇄반응)은 정량 중합효소 연쇄반응(qPCR), 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR), 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(Real time qPCR) 및 실시간 다중 중합효소 연쇄반응(Real time multiplex PCR) 중 하나 이상일 수 있다.
상기 단일 염기 다형성 유전형질 분석 방법을 도 2 내지 도 4를 참조로 하여 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
도 2는 실시간 다중 중합효소 연쇄반응의 초기 싸이클의 예시도로서, PCR 반응칩 내에서 상기 PCR 용액에 포함된 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 상기 분석대상 유전자의 특정 단일염기 다형성 주변의 염기서열을 증폭시켜 유전자 증폭물(amplicon)을 생성할 수 있다. 이때 상기 증폭물은 수백 염기쌍(base pair), 수 nm크기의 비교적 짧은 염기서열을 가지므로 하이드로젤 다공성 미세입자 내부로 확산되어 들어갈 수 있다. 확산되어 들어간 절편들은 유전체의 특성에 따라 동형 접합체(Homozygous)라면 야생 유전자 또는 변이 유전자(SNP)의 서열을 가질 수 있다. 또한, 만일 이형 접합체(Heterozygous)라면 야생 유전자와 변이 유전자의 서열을 동시에 갖는다. 상기 미세입자에 확산되어 들어간 절편들은 상보적인 염기서열에 따라 제 1 ADP 또는 제 2 ADP와 상보적으로 결합된다. 또한, 상기 전방향 프라이머는 상기 유전자 증폭물과도 상보적으로 결합하여, Taq DNA 중합효소의 도움을 받아 단일 가닥 절편에 상보적인 복제 가닥을 중합할 수 있다.
도 3은 동형접합체 유전자의 경우 실시간 다중 중합효소 연쇄반응 중후기 싸이클의 예시도이다. 상기 도 2에서 복제된 절편들, 즉 증폭물들은 변이 유전자의 염기서열 또는 야생 유전자의 염기서열 중 하나의 서열을 가지므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 두 종류의 하이드로젤 다공성 미세입자에 각각 포함된 제 1 ADP 또는 제 2 ADP 중 한 종류의 ADP와만 완전결합(Perfect matching)할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 유전자 증폭물이 상기 하이드로젤 다공성 미세입자 내부로 확산되어 들어가 제 1 ADP 또는 제 2 ADP와 결합하는 단계는 상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와는 불완전 상보적 결합하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 일 실시예로서 상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하지 않는 야생 유전자이면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 불완전 상보적 결합하고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 유전자 증폭물과 완전 상보적 결합을 한 ADP는 모든 염기서열이 각각 매칭(matching)되므로, 전방향 프라이머가 증폭함과 동시에 ADP는 분리된다. 구체적으로, 전방향 프라이머가 단일가닥 절편을 형판으로 이중가닥 절편을 형성하는 연쇄중합반응에서 Taq DNA 중합효소의 5'-3' 핵산말단가수분해효소활동(Exonuclease activity)에 따라 조각나게 된다. 이 과정에서 형광발색제와 소광제의 거리가 멀어지게 되므로 FRET(fluorescent resonance energy transfer) 현상이 더 이상 발생하지 않기 때문에 형광 발색제의 형광이 발색될 수 있다. 이 때, 상기 형광발색제는 연결부 즉, 티민 스페이서와 연결되어 있기 때문에 하이드로젤 다공성 미세입자내에 머물게 된다. 반면, 상기 완전 상보적 결합을 하는 ADP가 아닌 불완전 상보적 결합(mismatching)하는 ADP, 즉 부정합 ADP의 경우에는 전방향 프라이머가 증폭됨에 따라 ADP가 Taq DNA 중합효소에 의해 분해되지 않으므로 발광하지 않는다.
상기 관점에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 형광 발색 여부를 확인하는 단계는 본 발명의 하이드로겔 다공성 미세입자에서 형광이 나타나는지에 따라 완전 상보적 결합 또는 불완전 상보적 결합여부를 구별할 수 있다. 이를 이용하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 형광 발색 여부를 확인하는 단계는 상기 제 1 ADP가 고정된 하이드로젤 다공성 미세입자에 형광 발색이 나타나면 상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하고, 상기 제 2 ADP가 고정된 하이드로젤 다공성 미세입자에 형광 발색이 나타나면 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하지 않는 야생 유전자인 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
도 4는 이형접합체 유전자의 경우 실시간 다중 중합효소 연쇄반응 중후기 싸이클의 예시도이다. 이형 접합체의 경우 분석대상 유전자가 변이 유전자와 야생 유전자를 동시에 가질 수 있기 때문에 분석대상 유전자의 SNP 염기서열에 상보적인 서열로 이루어진 이중 라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 ADP와 분석대상 야생 유전자에 상보적인 서열로 이루어진 이중-라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 ADP를 포함하는 두 종류의 하이드로젤 다공성 미세입자 모두에서 형광이 발색될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법에서 상기 PCR 단계는 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(elongation) 단계를 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 어닐링 단계는 높은 PCR 증폭효율을 얻기 위하여 50 내지 70℃에서 10 내지 60초 동안 이루어지는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
기둥 형태의 하이드로젤 다공성 미세입자를 포함하는 PCR 반응칩 제조
본 발명의 일 실시예로서, 복수개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 위치를 구별하여 로딩시킨 PCR 반응칩을 제조하였다.
먼저, PEG 700DA (poly(ethylene glycol) diacrylate; Mn 700) : PEG 600 (poly(ethylene glycol); Mn 600) : DNase-free water : Irgacure 1173 을 부피비 20 : 40 : 35 : 5 비율로 섞어준 프레폴리머 용액에 100 μM의 CYP2C9 mutant-specific ADP를 9:1 부피비로 혼합하여 ADP-프레폴리머 혼합용액을 제조하였다.
다른 일 실시예들로서, ADP를 각각 CYP2C9 wild-specific ADP, VKORC1 mutant-specific ADP 및 VKORC1 wild-specific ADP를 사용한 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 방법으로 ADP-프레폴리머 혼합용액을 제조하였다.
이때, 상기 각 ADP에 포함되는 이중 라벨 뉴클레오타이드(double-labeled nucleotide)는 IDT(Integrated DNA Technologies)사에서 구입하였다. 상기 각 이중 라벨 뉴클레오타이드의 5'말단에는 형광 발색제(Fluorophore)로 i6 FAMK, 3'말단에는 소광제(Quencher)로 Iowa Boack™ FQ를 사용하였으며, 연결부로 50개의 A염기를 갖는 A-spacer, 고정부로 아크리다이트(Acrydite)를 포함하고 있다.
그 다음, 상기 서로 다른 4종의 ADP 가 섞여 있는 ADP-프레폴리머 혼합용액을 각각 PCR 반응칩 안에 위치를 달리하여 로딩하였다. 그리고 상기 PCR 반응칩을 마스크를 통해 UV (365 nm, 728 mW/cm2) 를 100 ms 조사하여 광가교시켰다. 이후, 광가교 되지 않은 용액 상태의 ADP를 DNase-free water를 주입하여 세척하여, 총 4가지 종류의 ADP를 가지고 있는 4개의 기둥(post) 형태 하이드로젤 다공성 미세입자를 포함하는 PCR 반응칩을 제조하였다.
기둥 형태의 하이드로젤 다공성 미세입자 기반 단일염기 다형성 동시다중 실시간 중합효소연쇄반응
상기 제조된 PCR 반응칩에 용액상태의 DNA 1 μL, 20 μM 농도의 CYP2C9 specific 전방향 프라이머 0.8 μL, 20 μM 농도의 CYP2C9 specific 역방향 프라이머 0.8 μL, 20 μM 농도의 VKORC1 specific 전방향 프라이머 0.8 μL, 20 μM 농도의 VKORC1specific 역방향 프라이머 0.8 μL, DNase-free water 3.8 μL, TaqMan master mix 8 μL를 넣어주었다. 이때 상기 용액에 포함된 DNA는 일반인에서 추출한 gDNA를 사용하였으며, 상기 각 프라이머는 IDT(Integrated DNA Technologies)사에서 구입하였다.
PCR 조건은, 제1변성(predenaturation; 95℃, 8 sec) 이후, 제2변성(denaturation; 95℃, 3 sec), 어닐링 및 신장(annealing 및 elongation; 60℃, 15 sec)을 40 사이클 반복하도록 하였다.
[실시예 2]
본 발명의 일 실시예로서, 복수개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 서로 다른 색상을 띄도록 제조하여 이를 로딩시킨 PCR 반응칩을 제조하였다.
디스크 형태의 하이드로젤 다공성 미세입자 프레폴리머의 제조
먼저, 상기 [실시예 1]에서 사용된 ADP와 동일한 것으로서 각각 100 μM의 CYP2C9 mutant-specific ADP, CYP2C9 wild-specific ADP, VKORC1 mutant-specific ADP 및 VKORC1 wild-specific ADP, 총 4종의 ADP 용액을 준비하였다.
그 다음, 상기 각 ADP 용액과 1:9의 부피비를 갖고, 각각 4가지 다른 색상을 갖는 프레폴리머 혼합용액을 준비하였으며, 이때 혼합되는 각 성분의 비율은 다음과 같다.
구체적으로, 무색 코드의 미세입자를 위한 프레폴리머 혼합용액은 PEG 700DA : PEG 600 : DNase-free water : Irgacure 1173 을 부피비 20 : 40 : 35 : 5로 혼합하여 준비하였다. 다른 일 실시예들로서 빨간색, 초록색 코드의 미세입자를 위한 프레폴리머 혼합용액은 PEG 700DA : PEG 600 : acrylated-quantum dot : DNase-free water : Irgacure 1173 = 40 : 20 : 27.5 : 7.5 : 5의 부피비로 혼합하여 준비하였다. 파란색 코드의 미세입자를 위한 프레폴리머 혼합용액은 PEG 700DA : PEG 600 : acrylated-quantum dot : DNase-free water : Irgacure 1173 : blue foodcoloring = 40 : 20 : 27.5 : 6.5 : 5 : 1의 부피비로 혼합하여 준비하였다.
SFL(stop flow lithography) 를 이용한 디스크 형태의 하이드로젤 다공성 미세입자의 제조
PDMS(polydimethylsilane) 코팅된 유리기판과 7-way PDMS 몰드(mold)를 O2 플라즈마 결합(plasma bonding)시키고, 첫 번째부터 여섯 번째 7-way PDMS 주입구(inlet)까지는 상기 제조된 무색, 빨간색, 초록색, 파란색 코드의 프레폴리머 용액이 담긴 튜브를 각각 연결하였다. 마지막 일곱 번째 투입구는 상기 4종의 ADP 용액 중 하나가 담긴 튜브를 연결하고, PDMS 채널의 배출구(outlet)는 1X TET(Tris-EDTA-Tween) 용액이 담긴 수집 튜브(collection tube)를 연결하였다. 상기 색상 코드 플레폴리머 용액이 연결된 6개의 주입구 중 하나와 ADP 용액이 연결된 주입구를 약 1:3 비율로 압력을 가해 이동시켰다. 압력 조절기(Pressure actuator)에서 이동시간(flow time)과 정지시간(stop time)을 약 500 ms로 설정하였다. PDMS 채널의 폭에 맞춰 마스크 사이즈를 설정한 후, 노출시간(exposure time)을 100 ms, 유지시간(hold time)은 200 ms로 설정하였다.
그 다음, SFL(stop flow lithography)을 통하여 각각 상기 4가지 색상을 갖는 디스크 형태의 하이드로젤 다공성 미세입자를 제조한 후, 4℃에서 보관하였다. 이때, CYP2C9 mutant-specific ADP는 무색 코드, CYP2C9 wild-specific ADP는 빨간색 코드, VKORC1 mutant-specific ADP는 초록색 코드, VKORC1 wild-specific ADP는 파란색 코드를 갖도록 하였다.
디스크 형태의 하이드로젤 다공성 미세입자 기반 단일염기 다형성 동시다중 실시간 중합효소연쇄반응
상기 제조된 PCR 반응칩에 용액상태의 DNA 1 μL, 20 μM 농도의 CYP2C9 specific 업스트림 프라이머 0.8 μL, 20 μM 농도의 CYP2C9 specific 다운스트림 프라이머 0.8 μL, 20 μM 농도의 VKORC1 specific 업스트림 프라이머 0.8 μL, 20 μM 농도의 VKORC1specific 다운스트림 프라이머 0.8 μL, DNase-free water 3.8 μL, TaqMan master mix 8 μL를 넣어주었다. 이때, 상기 용액에 포함된 DNA와 각 프라이머의 서열정보는 상기 [실시예 1]에 기재된 것과 동일하다.
PCR 조건은, 제1변성(predenaturation; 95℃, 8 sec) 이후, 제2변성(denaturation; 95℃, 3 sec), 어닐링 및 신장(annealing 및 elongation; 60℃, 15 sec)을 40 사이클 반복하도록 하였다.
[시험예 1]
본 발명의 일 실시예로서 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치의 하이드로젤 다공성 미세입자에서 각 ADP가 포함하는 연결부, 즉 T-spacer의 길이에 따른 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 효율을 비교하였다.
먼저, 상기 [실시예 1]과 동일한 방법으로 준비한 PCR 반응칩을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이때 상기 PCR 반응칩은 2종의 하이드로젤 다공성 미세입자들을 포함하였으며, 상기 2종의 미세입자들은 다음의 염기서열을 갖는 이중 라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 ADP를 포함하였다.
-CYP2C9 allele 2-mutant-specific ADP (서열번호 1): 5'- GAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGA-3'
또한, 상기 각 ADP들은 각각 12개 또는 30개의 T 염기로 이루어진 연결부를 포함하도록 하였다(T-spacer의 길이: 12T, 30T).
상기 실시간 중합효소연쇄반응에 포함된 PCR 용액의 프라이머 서열정보는 다음과 같다.
-전방향 프라이머 (서열번호 2): 5'-GGA ATT GTT TTC AGC AAT GGA AAG-3'
-역방향 프라이머(서열번호 3): 5'-GGT CAG TGA TAT GGA GTA GGG TCA-3'
도 5는 T-spacer의 길이가 12T인 하이드로젤 다공성 미세입자의 실시간 중합효소연쇄반응 결과를 나타낸 것이다(ADP sequence: 5Acryd/12T/i6 FAMK/probe(27nt)/3BHQ_1). 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 실시간 중합효소연쇄반응의 PCR 용액에 상기 ADP의 타겟 유전자를 넣어준 경우(SNP target (+)) 하이드로젤 다공성 미세입자에서 형광이 발색이 되었으며, 타겟 유전자를 넣지 않은 경우(SNP target (-))에는 하이드로젤 다공성 미세입자에서 형광이 발색되지 않았다.
도 6은 T-spacer의 길이가 30T인 하이드로젤 다공성 미세입자의 실시간 중합효소연쇄반응 결과를 나타낸 것이다(ADP sequence: 5Acryd/30T/i6 FAMK/probe(27nt)/3IABkFQ). 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 실시간 중합효소연쇄반응의 PCR 용액에 상기 ADP의 타겟 유전자를 넣어준 경우 하이드로젤 다공성 미세입자에서 형광이 발색이 되었다.
도 7은 상기 도 5와 도 6에서 확인한 T-spacer의 길이에 따른 형광 강도를 비교하여 그래프로 나타낸 것으로, 30T의 길이를 갖는 경우 형광 발색이 더 뚜렷하게 나타나 분석효율이 우수함을 알 수 있다.
[시험예 2]
본 발명의 일 실시예로서 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치의 하이드로젤 다공성 미세입자의 기공크기 및 ADP가 포함하는 연결부의 길이에 따른 따른 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 효율을 비교하였다.
도 8A는 PEG 700DA : PEG 600 : DNase-free water : Irgacure 1173 을 부피비 20 : 40 : 35 : 5(v/v)로 혼합한 프레폴리머 혼합용액을 사용하고, ADP가 포함하는 연결부가 각각 30T, 50A, 50T, 72T인 것을 제외하고는 상기 [시험예 1]과 동일한 방법으로 준비한 PCR 반응칩을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 이때 상기 30T는 30개의 T염기로 이루어진 연결부, 50A는 50개의 A염기로 이루어진 연결부, 50T는 50개의 T염기로 이루어진 연결부, 72T는 72개의 T염기로 이루어진 연결부를 의미한다.
도 8B는 PEG 700DA : PEG4000(50%w/v) : DNase-free water : Irgacure 1173 을 부피비 20 : 65 : 10 : 5 (v/v)로 혼합한 프레폴리머 혼합용액을 사용하고, ADP가 포함하는 연결부가 각각 30T, 50A, 50T, 72T인 것을 제외하고는 상기 [시험예 1]과 동일한 방법으로 준비한 PCR 반응칩을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 8C는 PEG 700DA : PEG6000(50%w/v) : DNase-free water : Irgacure 1173 을 부피비 18 : 58 : 19 : 5 (v/v)로 혼합한 프레폴리머 혼합용액을 사용하고, ADP가 포함하는 연결부가 각각 30T, 50A, 50T, 72T인 것을 제외하고는 상기 [시험예 1]과 동일한 방법으로 준비한 PCR 반응칩을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
그 결과, 기공유도중합체의 분자량이 증가할수록 mutant-specific ADP를 포함하는 하이드로젤 다공성 미세입자에서의 형광 발색이 증가하여 단일 염기 다형성(SNP) 검출 효율도 증가하였다. 또한, ADP가 포함하는 연결부의 길이가 길어질수록 광가교된 프라이머의 자유도가 증가하여 단일 염기 다형성(SNP) 검출 효율이 증가하였으며, T염기 개수가 일정 개수 이상이 되면 효율차이는 크지 않았다.
[시험예 3]
본 발명의 일 실시예로서 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석시 PCR 조건 변화에 따른 PCR 증폭 효율을 비교하였다.
도 9는 어닐링 및 신장 조건이 각각 60℃ 및 15 sec(Condition #1), 60℃ 및 25 sec(Condition #2), 55℃ 및 15 sec(Condition #3), 55℃ 및 25 sec(Condition #4)인 것을 제외하고는 상기 [시험예 1]과 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 도 9에서 post는 하이드로젤 다공성 미세입자를 사용한 경우이며, sol은 비교예로서 용액상태의 기존 qPCR을 사용하여 상기 어닐링 및 신장 조건에서 실험한 결과를 의미한다.
그 결과 어닐링 및 신장 조건이 60℃ 및 15 sec(Condition #1)인 경우 가장 PCR 증폭 효율이 우수함을 확인할 수 있다.

Claims (11)

  1. 복수 개의 하이드로젤 다공성 미세입자를 포함하는 PCR(Polymerase chain reaction) 반응칩을 포함하고,
    하나 이상의 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에는 분석대상 유전자의 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열에 상보적인 서열로 이루어진 이중 라벨 뉴클레오타이드(double-labeled nucleotide)를 포함하는 제 1 ADP(Anchored Double-labled Probe)가 고정되어 있고, 다른 하나 이상의 상기 하이드로젤 다공성 미세입자에는 형광 발색제, 소광제 및 분석대상 야생 유전자에 상보적인 서열로 이루어진 이중-라벨 뉴클레오타이드를 포함하는 제 2 ADP가 고정되어 있으며,
    상기 각 이중 라벨 뉴클레오타이드의 5'말단에는 형광 발색제(Fluorophore), 3'말단에는 소광제(Quencher)가 연결되어 있는, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제 1 ADP 및 제 2 ADP는 1 내지 72개의 T 염기 또는 1 내지 50개의 A 염기로 이루어진 연결부를 포함하고, 상기 연결부가 하이드로젤 다공성 미세입자에 고정된 것인, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제 1 ADP 및 제 2 ADP는 아크릴레이트 작용기, 아비딘-비오틴(Avidin-Biotin) 결합 또는 티올-엔(Thiol-Ene) 결합에 의해 화학적으로 하이드로젤 다공성 미세입자에 고정된 것인, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광 발색제는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein) 및 6-HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소광제는 TAMRA(tetramethylrhodamine), Iowa Black™ FQ, 및 BHQ™로 이루어진 군에서 선택된 것인, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  6. 제1항에 있어서, 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하여 형광 발색되고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와는 불완전 상보적 결합하여 형광이 발색되지 않는 것인, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  7. 제1항에 있어서, 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하지 않는 야생 유전자이면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 불완전 상보적 결합하여 형광이 발색되지 않고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하여 형광이 발색되는 것인, 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석 장치의 PCR 반응칩에 분석대상 유전자, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 PCR 용액을 주입하는 단계;
    상기 PCR 용액에 포함된 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 상기 분석대상 유전자를 증폭시켜 유전자 증폭물을 생성하는 PCR 단계;
    상기 유전자 증폭물이 상기 하이드로젤 다공성 미세입자 내부로 확산되어 들어가 제 1 ADP 또는 제 2 ADP와 결합하는 단계; 및
    PCR 완료후 상기 PCR 반응칩에 포함된 하이드로젤 다공성 미세입자의 형광 발색 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자 증폭물이 상기 하이드로젤 다공성 미세입자 내부로 확산되어 들어가 제 1 ADP 또는 제 2 ADP와 결합하는 단계는
    상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와는 불완전 상보적 결합하는 것을 포함하는 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유전자 증폭물이 상기 하이드로젤 다공성 미세입자 내부로 확산되어 들어가 제 1 ADP 또는 제 2 ADP와 결합하는 단계는
    상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하지 않는 야생 유전자이면 상기 제 1 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 불완전 상보적 결합하고, 상기 제 2 ADP의 이중 라벨 뉴클레오타이드와 완전 상보적 결합하는 것을 포함하는 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 형광 발색 여부를 확인하는 단계는,
    상기 제 1 ADP가 고정된 하이드로젤 다공성 미세입자에 형광 발색이 나타나면 상기 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하고, 상기 제 2 ADP가 고정된 하이드로젤 다공성 미세입자에 형광 발색이 나타나면 분석대상 유전자가 단일 염기 다형성(SNP) 염기서열을 포함하지 않는 야생 유전자인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 단일 염기 다형성(SNP) 유전형질 분석방법.
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