WO2017170924A1 - 神経保護ペプチド - Google Patents

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WO2017170924A1
WO2017170924A1 PCT/JP2017/013388 JP2017013388W WO2017170924A1 WO 2017170924 A1 WO2017170924 A1 WO 2017170924A1 JP 2017013388 W JP2017013388 W JP 2017013388W WO 2017170924 A1 WO2017170924 A1 WO 2017170924A1
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peptide
sequence
seq
amino acids
terminal
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PCT/JP2017/013388
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毅 中嶋
麻実子 町田
友二郎 林
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千寿製薬株式会社
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having a neuroprotective action, a neuroprotective agent containing the peptide, and a pharmaceutical composition for treating or preventing neuropathy.
  • Nerve cells are cells that constitute the nervous system which is roughly divided into the central nervous system and the peripheral nervous system. Nerve cells are susceptible to damage due to external factors such as cerebrovascular disorders such as stroke and cerebral infarction, and internal factors such as abnormal protein accumulation, oxidative stress, and inflammation, but their regenerative capacity is low. Once a failure occurs, it can cause a significant reduction in the patient's QOL.
  • Neurodegenerative diseases with central nervous system neurodegeneration and loss include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, and optic nerve such as glaucoma. And sensory neurodegenerative diseases such as neural deafness.
  • Proline-rich protein 4 which is known to be present in tears, is a protein having an amino acid length of 134 residues and has an antibacterial action, so it is a pathogen in mucosal tissues. It has been suggested to play a defense mechanism against (Non-patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a novel peptide having a neuroprotective action and a composition for treating or preventing neuropathy containing the peptide.
  • proline-rich protein 4 PRP4
  • PRP4 proline-rich protein 4
  • the present invention therefore relates to: [1] A peptide comprising the amino acid sequence of HPPPPPFQNQQRPP (SEQ ID NO: 3) or a terminal deletion sequence thereof, wherein the terminal deletion sequence is 1) a sequence in which 1 to 8 amino acids have been deleted from the C-terminus of SEQ ID NO: 3, and / or 2) A peptide comprising a sequence in which one or two amino acids have been deleted from the N-terminus of SEQ ID NO: 3, and a peptide comprising a terminal-deleted sequence has a neuroprotective action.
  • a peptide having a neuroprotective action comprising an amino acid sequence of HPPPPPFQ (SEQ ID NO: 9), or an amino acid sequence having 1 or 2 amino acids added to the N-terminal, C-terminal, or both ends thereof.
  • a peptide having a neuroprotective action comprising the amino acid sequence of HPPPPPFQNQQ (SEQ ID NO: 6), or an amino acid sequence having 1 or 2 amino acids added to the N-terminal, C-terminal, or both ends thereof.
  • a peptide having a neuroprotective action comprising an amino acid sequence of HPPPPPFQNQQRPP (SEQ ID NO: 3), or an amino acid sequence having 1 or 2 amino acids added to the N-terminal, C-terminal, or both ends thereof.
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of HPPPPPFQNQQRPP
  • amino acid sequence having 1 or 2 amino acids added to the N-terminal, C-terminal, or both ends thereof.
  • the peptide according to any one of items 3 to 5 wherein the one or two amino acids are added to the C-terminus.
  • a neuroprotective agent comprising the peptide according to any one of items 1 to 6.
  • a neuroprotective agent comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or a peptide comprising a modified sequence thereof, wherein the modified sequence is 1) a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence, or 2) a sequence having at least 90% sequence identity to the original sequence, consisting of a modified sequence
  • a peptide is a neuroprotective agent having a neuroprotective action.
  • a neuroprotective agent comprising a peptide comprising an N-terminal, C-terminal, or amino acid sequence to which one or more amino acids are added at both ends of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the peptide is the terminal of SEQ ID NO: 2.
  • a neuroprotective agent comprising a deletion sequence and having a neuroprotective action.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing neuropathy comprising the neuroprotective agent according to any one of items 7 to 10.
  • a method for treating or preventing neuropathy comprising administering the neuroprotective agent according to items 7 to 10 to a subject suffering from neuropathy.
  • the peptide according to any one of items 1 to 6, or the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or a modification thereof, for use for treatment or prevention of neuropathy or for neuroprotection A peptide comprising the sequence or the terminal deletion sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the neurodegenerative disease is dementia, Parkinson's disease, spinocerebellar degeneration, Creutzfeldt-Jakob disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, multiple sclerosis, mad cow disease, spinal progressive muscular atrophy, Item 16.
  • the item 15 selected from the group consisting of amyotrophic lateral sclerosis, bulbar spinal muscular atrophy, glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, hearing loss, and epilepsy.
  • the peptide according to the present invention suppresses neuronal cell death, and as a result, has a neuroprotective action. For this reason, the peptide which concerns on this invention can be utilized for the treatment or prevention of a neurological disorder.
  • the peptide according to the present invention is a protein fragment present in human tears, it can be developed as a drug with low toxicity and low immunogenicity when used in a living body and low side effects.
  • the present invention relates to a peptide comprising a proline-rich protein 4 having the sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof having a neuroprotective action, or a modified sequence of those sequences.
  • such peptides are preferably isolated and / or purified peptides.
  • the isolated and / or purified peptide is intended to substantially separate only the peptide of interest, and is simply unmixed as a mixture, such as in a body fluid or after protease treatment during analysis. It is intended to be distinguished from the state peptide.
  • the peptide according to the present invention is a peptide having the sequence of SEQ ID NO: 2 or a partial sequence thereof, or a peptide consisting of a modified sequence of these sequences, and 50 to 200 It is a peptide with the amino acid length of the residue.
  • the peptide is more preferably composed of 80 to 150 amino acids, particularly preferably 90 to 140 amino acids, and is preferably composed of 100 to 140 amino acids. Is even more preferred.
  • Such a long-chain peptide may exert a neuroprotective effect as it is, but can produce a neuroprotective effect by producing a peptide according to the present invention by the action of a protease in vivo.
  • peptide (Human) Recombinant Protein catalog number: H0001127) consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) at positions 17 to 116 of proline rich protein 4 commercially available from Abnova can be used.
  • the present invention also relates to a peptide comprising the amino acid sequence of positions 17 to 116 of the amino acid sequence of proline rich protein 4 (SEQ ID NO: 1), which has a neuroprotective action.
  • a peptide may have a sequence in which any amino acid is added to the N-terminus and C-terminus of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) at positions 17 to 116 of proline-rich protein 4, but the full-length sequence (sequence It is preferred to have an amino acid corresponding to number 1).
  • the peptide comprising the amino acid sequence of positions 17 to 116 of proline rich protein 4 is the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a terminal deletion sequence thereof, wherein the terminal deletion sequence is 1) 1-16 N-terminal amino acids are deleted from the original sequence, and / or 2) 1-18 C-terminal amino acids are deleted from the original sequence,
  • a peptide consisting of a terminal deletion sequence can be said to be a peptide having a nerve action. Accordingly, such peptides are composed of 100-134 amino acids.
  • a modified sequence is a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence, and the number of substituted, deleted, or added amino acids has a neuroprotective action.
  • the range is preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, and most preferably 1. It is desirable that the amino acid to be substituted is substituted with an amino acid having the same properties.
  • the modified sequence is a sequence having a predetermined sequence identity to the original sequence, and the peptide comprising the sequence can exhibit the function or effect of the peptide comprising the original sequence. That means.
  • Predetermined sequence identity is at least about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 97%, about 98%, or about 99% sequence identity. Say.
  • the peptide having a partial sequence is not particularly limited as long as it has a neuroprotective action.
  • the partial sequence include a sequence excluding the signal sequence, an N-terminal sequence that does not contribute to activity and / or a terminal-deleted sequence from which the C-terminal sequence is removed, a sequence itself that contributes to activity, and the like.
  • the length of the partial sequence may be any length as long as it has a neuroprotective action, and has a length of, for example, 4 to 133 amino acids.
  • the invention in another aspect, in one embodiment of the invention, relates to a sequence of HPPPPPFQNQQRPP (SEQ ID NO: 3) or a sequence in which one or several amino acids have been deleted from the N-terminus, C-terminus, or both ends thereof.
  • the peptide When the C-terminal is deleted, the number of amino acids to be deleted can be arbitrarily selected from 1 to 8 within a range having a neuroprotective action. From the viewpoint of not affecting the neuroprotective action of the original peptide, the deletion of 1 to 7 amino acids is preferable, the deletion of 1 to 6 amino acids is more preferable, and the deletion of 3 or 6 amino acids is the most preferable.
  • the N-terminus 1 or 2 amino acids are deleted. From the viewpoint of maintaining a neuroprotective action, a peptide having a sequence deleted from the C-terminus is preferred. Preferred peptides according to the present invention are listed below, but are not intended to be limited to these peptides.
  • the present invention relates to a peptide consisting of the sequence of HPPPPPFQ (SEQ ID NO: 9), or a sequence in which one or several amino acids are added to the N-terminus, C-terminus, or both ends thereof. More preferably, the present invention relates to a peptide consisting of the sequence HPPPPPFQNQQ (SEQ ID NO: 6), or a sequence in which one or several amino acids are added to the N-terminus, C-terminus, or both ends thereof.
  • a peptide comprising the sequence HPPPPPFQNQQRPP (SEQ ID NO: 3), or a sequence to which one or several amino acids are added at the N-terminus, C-terminus, or both ends thereof.
  • the added amino acid may be any amino acid as long as it exerts a neuroprotective action. From the viewpoint of not affecting the neuroprotective action of the original peptide, the number of added amino acids is preferably 1 or 2 amino acids, and more preferably 1 amino acid.
  • the added amino acid may be any amino acid, but is preferably an amino acid having the same properties as the amino acid corresponding to the amino acid sequence of commercially available proline rich protein 4 (SEQ ID NO: 2).
  • the present invention also relates to a peptide comprising the sequence of HPPPPPFQNQQRPP (SEQ ID NO: 3), or a sequence with amino acids added to the N-terminus, C-terminus, or both ends thereof.
  • the amino acid added to the N terminus of SEQ ID NO: 3 is an amino acid corresponding to positions 1 to 65 of the amino acid sequence of the commercially available proline rich protein 4 peptide (SEQ ID NO: 2), and is added to the C terminus of SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid is preferably an amino acid corresponding to positions 80 to 100 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of a commercially available proline rich protein 4 peptide.
  • the peptide can also be referred to as a peptide consisting of a terminal deletion sequence of the sequence of SEQ ID NO: 2, and the terminal deletion sequence is 1 to 65, preferably 1 to 40, from the N terminus of SEQ ID NO: 2, More preferably 1-20, even more preferably 1-10 amino acid deleted sequences and / or 1-21 from the C-terminus of SEQ ID NO: 2, preferably 1-10, preferably 1-10 A sequence in which 5 amino acids have been deleted.
  • the number of amino acids added to the N-terminus of the sequence of SEQ ID NO: 3 can be arbitrarily selected from 1 to 65 as long as it has a neuroprotective action, and the addition of 1 to 30 amino acids is preferable.
  • Addition of 1 to 20 amino acids is more preferred, or addition of 1 to 10 amino acids is even more preferred, and addition of 1 to 5 amino acids is most preferred.
  • the number of amino acids added to the C-terminus of the sequence of SEQ ID NO: 3 can be arbitrarily selected from 1 to 21 within a range having a neuroprotective action, and the addition of 1 to 10 amino acids is preferable. Most preferred is the addition of 1-5 amino acids. From the viewpoint of maintaining a neuroprotective action, a peptide having a sequence added to the C-terminus is preferred.
  • a peptide consisting of the amino acid sequences 82 to 97 and 82 to 100 in the PRP4 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) is the present invention. Can be removed from.
  • amino acid having the same property is an amino acid having a side chain having the same property.
  • amino acids having non-polar side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, and tryptophan.
  • amino acids having polar side chains include serine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine,
  • amino acids having basic side chains such as cysteine include lysine, arginine, histidine and the like
  • amino acids having acidic side chains include aspartic acid and glutamic acid.
  • the peptide of the present invention has a neuroprotective action and is highly stable in vivo, particularly in the vitreous body. High in vivo stability is preferable in that it has a neuroprotective effect over a long period of time at a low dose. In particular, since it is highly stable in a vitreous solution, administration by intravitreal injection can exert a neuroprotective action for a long time in the vitreous.
  • the peptide according to the present invention can be produced by any production method. For example, it can be produced by performing solid phase synthesis or liquid phase synthesis using the Boc method or the Fmoc method.
  • a long-chain peptide containing the peptide of the present invention such as SEQ ID NO: 1 or 2 is synthesized by a host cell using a gene transfer method and purified using a polyhistidine tag or the like.
  • the peptide according to the present invention can be obtained by cleaving from the obtained long chain peptide.
  • the peptide according to the present invention includes derivatives in which the N-terminal amino group, the C-terminal carboxy group, or the functional group of the amino acid side chain is arbitrarily modified as long as the neuroprotective action is not lost.
  • the modification include addition of a protecting group to an amino group (for example, acetylation, formylation, Bocation, Fmocation), esterification of a carboxyl group (ethylation, etc.) and the like.
  • modifications that can usually occur in vivo such as phosphorylation, amidation, methylation, esterification, acetylation, etc., as well as modifications that occur during the synthesis process or that facilitate purification, such as biotinylation. Also good.
  • modification such as PEGylation may be performed for the purpose of extending the half-life of the peptide.
  • the peptide according to the present invention includes a pharmaceutically acceptable salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc.), salts with organic acids (eg, methanesulfonate, benzenesulfone, etc.). Acid salt, p-toluenesulfonate, formate, acetate, trifluoroacetate, oxalate, citrate, malonate, fumarate, maleate, tartrate, succinate, malic acid Salt) or a salt with a base (for example, ammonium salt, methylpyridinium salt, acetylpyridinium salt, etc.).
  • the peptides according to the present invention also include hydrates or solvates.
  • the neuroprotective agent according to the present invention refers to a drug having a neuroprotective action. Therefore, the neuroprotective agent can protect the nerve from damages involving damage, degeneration and / or cell death of nerve cells, and suppresses nerve cell death (apoptosis and / or necrosis), nerve cell degeneration inhibitor, nerve It can also be referred to as an agent for reducing cell stress, an agent for improving resistance to neurotoxicity, an agent for improving survival of nerve cells, and an inhibitor of abnormal protein accumulation.
  • the neuroprotective action refers to an action of protecting nerve cells from damage, degeneration, and / or cell death, and preferably means an action of protecting nerve cells from death. More specifically, neuroprotective effects include suppression of neuronal cell death (apoptosis and / or necrosis), suppression of neuronal degeneration, reduction of neuronal stress, improvement of resistance to neurotoxicity, survival of neuronal cells. It may include improvement of sex and suppression of abnormal protein accumulation.
  • nerve cells are damaged by exposure to neurotoxic substances, lack of oxygen and nutrients, and when the damage exceeds a certain level, cell death is caused. In addition, nerve cells undergo degeneration by accumulating neurotoxic substances and eventually cause cell death.
  • the peptide of the present invention suppresses cell death under hypoxic conditions, but it not only suppresses cell death but also protects against damage and degeneration of neurons in the previous stage. Has an effect. Therefore, it can be said that the peptide according to the present invention has a neuroprotective action against hypoxia-induced stress or cell death.
  • Neurotoxic substances are roughly classified into exogenous toxic substances and endogenous toxic substances. Exogenous toxic substances include chemical substances such as heavy metals, alcohol, and botulinum toxin. Known endogenous toxic substances include reactive oxygen species, neurotransmitters such as glutamic acid, and abnormal proteins. The neuroprotective action can be easily measured by those skilled in the art.
  • a medium containing a test substance drug group
  • a medium not containing a test substance control group
  • various stress conditions such as hypoxia, exposure to neurotoxic substances, nutrient depletion, and ultraviolet irradiation.
  • Nerve cells are cultured, the number of living and dead cells in the medium is measured, the ratio of the number of living cells to the total number of cells is calculated, the ratio of the number of living cells in the drug group is the ratio of the number of living cells in the control group If higher, it can be determined that the test substance has a neuroprotective action.
  • it has a protective effect equivalent to or higher than that of a positive control group compared to a positive control group to which a substance known to have a neuroprotective action, for example, IGF-1 or NGF is added.
  • a substance known to have a neuroprotective action for example, IGF-1 or NGF is added.
  • the neuroprotective action may be measured by conducting in vivo animal experiments.
  • the neuroprotective agent includes at least one peptide selected from the peptides according to the present invention.
  • the peptide contained in such a neuroprotective agent is not limited to the following, but includes, for example, a peptide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing neuropathy, comprising a therapeutically effective amount of the above peptide or neuroprotective agent.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing neuropathy comprising a therapeutically effective amount of the above peptide or neuroprotective agent.
  • the peptide, neuroprotective agent or pharmaceutical composition according to the present invention can be used in a method for treating or preventing neuropathy, and can be administered to a subject suffering from neuropathy.
  • neuropathy refers to a disease state in which the function is impaired due to degeneration / cell death of nerve cells, and includes cerebrovascular disorders and neurodegenerative diseases.
  • cerebrovascular disorders examples include hemorrhagic disorders such as cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, and cerebrovascular obstruction such as cerebral thrombosis, cerebral infarction, and cerebral circulatory insufficiency. Whether it is a hemorrhagic disorder or an obstructive disorder, nerve cells in the brain are placed in hypoxia, resulting in cell death. Therefore, for such cerebrovascular disorders, the peptide, neuroprotective agent or pharmaceutical composition according to the present invention can be administered for the purpose of treatment or prevention.
  • hemorrhagic disorders such as cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage
  • cerebrovascular obstruction such as cerebral thrombosis, cerebral infarction, and cerebral circulatory insufficiency.
  • nerve cells in the brain are placed in hypoxia, resulting in cell death. Therefore, for such cerebrovascular disorders, the peptide, neuroprotective agent or pharmaceutical composition according to the present invention can be administered for the purpose of treatment or prevention.
  • Neurodegenerative diseases include dementia, Parkinson's disease, spinocerebellar degeneration, Creutzfeldt-Jakob disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, multiple sclerosis, mad cow disease, epilepsy and other brain / central nervous degenerative diseases, spine Motor neurodegenerative diseases such as progressive amyotrophy, amyotrophic lateral sclerosis, bulbar spinal muscular atrophy, and sensory neurodegenerative diseases.
  • Sensory neurodegenerative diseases include visual, auditory, tactile, gustatory and olfactory neurodegenerative diseases, and visual degenerative diseases include glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, etc. Examples of auditory neurodegenerative diseases include deafness.
  • the peptide, neuroprotective agent or pharmaceutical composition according to the present invention is provided as a dosage form suitable for parenteral administration or oral administration, but parenteral administration is preferred from the viewpoint of use as a peptide preparation.
  • parenteral administration for example, intravenous, intraarterial, subcutaneous, topical, intraperitoneal, intramuscular, nasal, transdermal, transmucosal, intrameningeal, transrectal, intramuscular, intracerebral, intrameningeal, It can be administered by subarachnoid, intradural, epidural, eye drop, ear drop, nose drop, intraocular route.
  • Specific examples of intraocular routes include subconjunctival, subtenon, and intravitreal routes.
  • the neuroprotective agent according to the present invention can be appropriately formulated depending on its administration route, and may be any one such as eye drops, injections, powders, infusion preparations, granules, tablets, suppositories, From the viewpoint of parenteral administration, eye drops, injections, infusion preparations, powders for preparation at the time of use and the like are preferable.
  • Examples of the preparation for intraocular administration include intravitreal injection, subconjunctival injection, and subtenon injection.
  • These preparations may contain various pharmaceutically acceptable adjuvants, that is, additives such as carriers and other auxiliary agents such as stabilizers, preservatives, soothing agents and emulsifiers. It can also be used in combination with another drug having a neuroprotective effect.
  • Test Example 1 Synthesis of Peptide
  • the physiologically active peptide of the present invention used in the test described later was synthesized on a solid phase by Fmoc method using a peptide synthesizer (model: PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the analysis of the synthetic peptide was performed by mass spectrometry (MALDI TOF), and as shown in the table below, all measured values were in good agreement with the theoretical values.
  • Test Example 2 Protective effect of peptide against cell death of human neuroblastoma (SH-SY5Y cell) due to hypoxia
  • SH-SY5Y cells ATCC
  • DMEM / F12 medium Invitrogen, 11330-032
  • 10% serum Invitrogen, 10062-147
  • the medium was replaced with glucose-free DMEM medium supplemented with 100 nM peptide 1, and then the plate was replaced with Aneropac Kenki 5% (Mitsubishi Gas Chemical, A-07) In addition, it was placed in an anero pack square jar, sealed, and then cultured at 37 ° C. for induction. After culturing under hypoxia for 24 hours, the inhibition rate of cell death by the peptide was calculated by measuring the amount of LDH in the cells and the medium using LDH Cytotoxicity detection kit (Takara, MK401). In addition, 100 nM IGF-1 was used as a positive control for the experiment. IGF-1 has a protective effect against neuronal cell death (Mol. Cell Neurosci. 2011, 47 (3), 181-190).
  • Test Example 3 Protective effect of peptides against cell death of rat retinal ganglion cells (RGC) due to hypoxia
  • RRC retinal ganglion cells
  • Retinal ganglion cells were isolated by magnetic cell dispersion (MACS). Retinas were collected from neonatal rats (Slc: Sprague-Dawley 7 days old), and tissues were dispersed using a Neural Tissue Dissociation Kit (Miltenyi Biotec, 130-094-802). Subsequently, endothelial cells and microglia were removed using Retinal Ganglion Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, 130-096-209), and CD90.1 + RGC was positively selected by CD90.1 MicroBeads. The test was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee based on the Act on the Protection and Management of Animals (Law No. 105 of October 1, 1973, final revision: Law No. 38 of June 12, 2013). Received and implemented.
  • Hypoxia-induced cell death assay Hypoxia (O 2 concentration 0.1% or less) was performed by changing the medium to Neurobasal medium containing B27 supplement, 1 mM L-glutamine and each peptide, and then replacing the plate with 5% Aneropac Kenki (Mitsubishi). It was induced by placing in an aneropack square jar together with Gas Chemistry, A-07), sealing, and culturing at 37 ° C. After culturing under hypoxia for 24 hours, Calcein-AM and Ethidium homodimer (Invitrogen, L3224) were added to the medium, and the cells were stained to distinguish live and dead cells. The number of viable cells and dead cells was measured using Image Pro plus, and the survival rate was shown as “ratio of viable cell number to total cell number”.
  • Test Example 4 Protective effect of proline rich protein 4 (PRP4) against cell death of rat retinal ganglion cells (RGC) due to hypoxia Preparation and cell culture of rat retinal ganglion cells RGCs were isolated and cultured in the same manner as in Test Examples 3-1 and 2.
  • PRP4 proline rich protein 4
  • RGC retinal ganglion cells
  • Test Example 5 Stability Test of Peptide 1 in Vitreous Solution Rabbits (2) were euthanized by intravenous administration of 5 mL of pentobarbital sodium solution, and then the eyeballs were removed. Incisions were made from the equator of the eyeball, and vitreous solutions were collected from the cuts using a syringe (injection needle: 18G). The mixed vitreous solution was filtered with a cell strainer (40 ⁇ m), and the filtrate was used as a vitreous solution used for the stability test. A sample solution was prepared by mixing 600 ⁇ L of the vitreous solution and 1.2 ⁇ L of 50 mg / mL Primocin.
  • Table 9 shows the residual ratio of peptide 1 after 7 days of incubation with the vitreous solution.
  • the residual rate was determined according to the following formula: From this result, it was found that Peptide 1 is stable in the vitreous solution.
  • Formulation Example A pharmaceutical containing the peptide of the present invention as an active ingredient can be produced, for example, by the following formulation.
  • the pharmaceutical agent of the present invention will be described more specifically with formulation examples, but the present invention is not limited to these formulation examples.
  • Tablet (1) Peptide 4 40mg (2) Lactose 58mg (3) Corn starch 18mg (4) Microcrystalline cellulose 3.5mg (5) Magnesium stearate 0.5mg 1 tablet 120mg The whole amount of (1), (2) and (3), 2/3 of (4) and 1/2 of (5) are mixed and granulated. The remaining (4) and (5) are added to the granules and pressed into tablets.
  • Vitreous injection solution in 1 ml (1) Peptide 1 40 mg (2) Purified white sugar 50mg (3) Sodium chloride 2.34 mg (4) Polysorbate 80 Appropriate amount (5) Disodium hydrogen phosphate Appropriate amount (6) Sodium dihydrogen phosphate Appropriate amount (7) Sterilized purified water Appropriate amount (1) to (6) are dissolved in (7) sterile purified water. A vitreous injection solution is prepared.

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Abstract

神経保護作用を有するペプチド、当該ペプチドを含む神経保護剤及び神経障害治療、予防又は軽減用医薬組成物の提供を目的とする。プロリンリッチプロテイン４（ＰＲＰ４）の単離されたペプチド断片が、神経保護作用を有することを見いだしたことに基づく。

Description

神経保護ペプチド
　神経保護作用を有するペプチド、当該ペプチドを含む神経保護剤及び神経障害治療又は予防用医薬組成物に関する。
　神経細胞は、中枢神経系と末梢神経系に大別される神経系を構成する細胞である。神経細胞は、脳卒中、脳梗塞などの脳血管障害などの外的要因や、異常タンパク質の蓄積、酸化ストレス、炎症などの内的要因などにより障害を受けやすい一方で、その再生能が低いことから、ひとたび障害が生じると、その患者のＱＯＬを著しく低下させる要因となる。中枢神経系の神経変性および脱落を伴う神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの神経変性疾患の他に、緑内障などの視神経の変性疾患や、神経性難聴などの感覚神経変性疾患が挙げられる。
　神経科学の発展により、各種の神経保護因子が発見されてきており、神経障害の予防又は治療薬としての開発が期待される。神経変性を引き起こすフリーラジカルや興奮性アミノ酸を減少させる薬剤や、神経細胞を保護及び/又は修復することができる薬剤（例えば神経栄養因子や免疫抑制剤などのイムノフィリンリガンドなど）が神経保護作用を有することが見いだされている一方で、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ＣＤ４４やヒト脳カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＢＣＰＢ）などの生体内タンパク質が、神経保護作用を有することが見いだされてきている（特許文献１及び２）。
　一方、ヒト涙液中にはリゾチームやラクトフェリンなどの多数のタンパク質が含まれており、角膜表面の恒常性の維持に寄与している。また、涙液中にはタンパク質の分解物が含まれており、そのようなペプチド断片も様々な作用を有することが期待されている。涙液中に存在することが知られているプロリンリッチプロテイン４（Ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ４：ＰＲＰ４）は、全長１３４残基のアミノ酸長を有するタンパク質であり、抗菌作用を有することから、粘膜組織において病原体に対する防御機構を担うことが示唆されている（非特許文献１）。
特表２０１４－５１０１０１号公報 特開２０１２－２３２９５２号公報
Proteomics 2004, 4, 3953-3959
　本発明は、神経保護作用を有する新規ペプチド、並びに当該ペプチドを含む神経障害の治療又は予防用組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、プロリンリッチプロテイン４（ＰＲＰ４）及びその単離されたペプチド断片が、神経保護作用を有することを見いだし、本発明に至った。
　そこで本発明は以下のものに関する：
[１]　HPPPPPFQNQQRPP(配列番号３）のアミノ酸配列又はその末端欠失配列からなるペプチドであって、ここで末端欠失配列が、
１）配列番号３のＣ末端から１～８個のアミノ酸が欠失された配列、及び／又は、
２）配列番号３のＮ末端から１又は２個のアミノ酸が欠失された配列
からなり、末端欠失配列からなるペプチドは神経保護作用を有する、ペプチド。
［２]　欠失されるＣ末端のアミノ酸の数が１～６である、項目１に記載のペプチド。
［３]　HPPPPPFQ(配列番号９）のアミノ酸配列、或いはそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は２個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、神経保護作用を有する、ペプチド。
［４]　HPPPPPFQNQQ(配列番号６）のアミノ酸配列、或いはそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は２個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、神経保護作用を有する、ペプチド。
［５]　HPPPPPFQNQQRPP(配列番号３）のアミノ酸配列、或いはそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は２個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、神経保護作用を有する、ペプチド。
［６]　前記１又は２個のアミノ酸がＣ末端に付加された、項目３～５のいずれか一項に記載のペプチド。
［７]　項目１～６のいずれか一項に記載のペプチドを含む、神経保護剤。
［８]　配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、又はそれらの改変配列からなるペプチドを含む神経保護剤であって、ここで改変配列が、
１）元の配列に対し１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列、又は
２）元の配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
　であり、改変配列からなるペプチドは神経保護作用を有する、神経保護剤。
［９］　配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含む神経保護剤であって、当該ペプチドは配列番号２の末端欠失配列からなり、かつ、神経保護作用を有する、神経保護剤。
［１０］Ｎ末端に付加されるアミノ酸の数が１～６５であり、及び／又は
　Ｃ末端に付加されるアミノ酸の数が１～２１である、項目９に記載の神経保護剤。
[１１]　項目７～１０のいずれか一項に記載の神経保護剤を含む、神経障害の治療又は予防用の医薬組成物。
[１２]　項目７～１０に記載の神経保護剤を、神経障害を患う対象に投与することを含む、神経障害を治療又は予防する方法。
[１３]　神経障害の治療又は予防のため又は神経保護のために使用するための項目１～６のいずれか一項に記載のペプチド、又は配列番号１もしくは配列番号２の配列、又はそれらの改変配列、或いは配列番号２の末端欠失配列からなるペプチド。
[１４]　神経障害の治療薬又は予防薬の製造のための、項目１～６のいずれか一項に記載のペプチド、或いは配列番号１もしくは配列番号２の配列、又はそれらの改変配列、或いは配列番号２の末端欠失配列からなるペプチドの使用。
[１５]　前記神経障害が、神経変性疾患又は脳血管障害である、項目１１に記載の医薬組成物、項目１２に記載の方法、項目１３に記載のペプチド、又は項目１４に記載の使用。
[１６］　前記神経変性疾患が、認知症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、狂牛病、脊椎性進行性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、球脊椎性筋萎縮症、緑内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、難聴、及びてんかんからなる群から選ばれる、項目１５に記載の医薬組成物、方法、ペプチド、又は使用。
[１７]神経保護を介して、神経障害を治療又は予防するための、項目１２に記載の方法、項目１３に記載のペプチド、又は項目１４に記載の使用。
　本発明に係るペプチドは、神経細胞死を抑制し、その結果、神経保護作用を有する。このため、本発明に係るペプチドは、神経障害の治療又は予防に利用することができる。また、本発明に係るペプチドは、ヒト涙液中に存在するタンパク質の断片であるため、生体に使用した場合の毒性や免疫原性が低く、副作用の低い薬剤として開発することができる。
　本発明は、神経保護作用を有する、配列番号１の配列を有するプロリンリッチプロテイン４又はその部分配列、或いはそれらの配列の改変配列からなるペプチドに関する。好ましい態様では、かかるペプチドは、単離及び/又は精製されたペプチドであることが好ましい。単離及び/又は精製されたペプチドとは、目的のペプチドのみを実質的に分離したことを意図しており、体液中や分析の際のプロテアーゼ処理後などのように、単に混合物として未分離の状態のペプチドと区別することを意図している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　一つの局面において、本発明の一の態様では、本発明にかかるペプチドは、配列番号２の配列を有するペプチド又はその部分配列、或いはそれらの配列の改変配列からなるペプチドであり、且つ５０～２００残基のアミノ酸長のペプチドである。かかるペプチドは、例えば、８０～１５０残基のアミノ酸から構成されることがより好ましく、９０～１４０残基のアミノ酸から構成されることが特に好ましく、１００～１４０残基のアミノ酸から構成されることがさらにより好ましい。このような長鎖ペプチドは、そのまま神経保護作用を発揮してもよいが、生体内のプロテアーゼの作用により、本発明にかかるペプチドを生成することにより、神経保護作用を発揮することができる。一例として、Ａｂｎｏｖａ社より市販される、プロリンリッチプロテイン４の１７位～１１６位のアミノ酸配列（配列番号２）からなるペプチド（ＰＲＲ４ （Ｈｕｍａｎ） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ　カタログ番号: Ｈ０００１１２７）を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明のさらなる態様では、本発明は、プロリンリッチプロテイン４のアミノ酸配列（配列番号１）の１７位～１１６位のアミノ酸配列を含むペプチドであって、神経保護作用を有するペプチドにも関する。そのようなペプチドは、プロリンリッチプロテイン４の１７位～１１６位のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端及びＣ末端に、任意のアミノ酸が付加された配列を有しうるが、全長配列（配列番号１）に対応するアミノ酸を有することが好ましい。したがって、プロリンリッチプロテイン４の１７位～１１６位のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又はその末端欠失配列からなるペプチドであって、ここで末端欠失配列が、
１）元の配列に対し１～１６個のＮ末端のアミノ酸が欠失されるか、及び/又は
２）元の配列に対し１～１８個のＣ末端のアミノ酸が欠失され、
かつ末端欠失配列からなるペプチドが神経作用を有するペプチドということができる。したがって、かかるペプチドは、１００～１３４残基のアミノ酸から構成される。
　改変配列とは、元の配列に対し１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列であって、置換、欠失、又は付加されるアミノ酸の数は、神経保護作用を有する範囲で１～３個が好ましく、１又は２個がより好ましく、１個が最も好ましい。置換されるアミノ酸は、同じ性質を有するアミノ酸に置換されることが望ましい。また、改変配列とは、元の配列に対し所定の配列同一性を有する配列であって、その配列からなるペプチドが、元の配列からなるペプチドの有する機能又は効果を発揮することができる配列のことをいう。所定の配列同一性（ＢＬＡＳＴ）とは、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性のことをいう。
　部分配列を有するペプチドとしては、神経保護作用を有する限り特に限定されない。部分配列の例として、シグナル配列を除いた配列、活性に寄与しないＮ末端配列及び/又はＣ末端配列を除去した末端欠失配列、活性に寄与する配列自体などが挙げられる。部分配列の長さは、神経保護作用を有すれば任意の長さであってよく、例えば４～１３３個のアミノ酸長を有する。
　別の局面において、本発明の一の態様では、本発明は、HPPPPPFQNQQRPP(配列番号３）の配列、又はそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端から１又は数個のアミノ酸が欠失された配列からなるペプチドに関する。Ｃ末端が欠失される場合には、欠失されるアミノ酸の数は、神経保護作用を有する範囲で１～８個の中から任意に選択することができる。元のペプチドの神経保護作用に影響を与えない観点から、１～７個のアミノ酸の欠失が好ましく、１～６個のアミノ酸の欠失がより好ましく、３又は６個のアミノ酸欠失が最も好ましい。Ｎ末端が欠失される場合には、１又は２個のアミノ酸が欠失される。神経保護作用を維持する観点から、Ｃ末端から欠失された配列を有するペプチドが好ましい。本発明に係る好ましいペプチドを下記に列挙するが、これらのペプチドに限定されることを意図するものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明の別の態様では、本発明は、HPPPPPFQ(配列番号９）の配列、又はそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両端に１又は数個のアミノ酸が付加された配列からなるペプチドに関する。より好ましくは、HPPPPPFQNQQ（配列番号６）の配列、又はそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両端に１又は数個のアミノ酸が付加された配列からなるペプチドに関する。さらにより好ましくは、HPPPPPFQNQQRPP（配列番号３）の配列、又はそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両端に１又は数個のアミノ酸が付加された配列からなるペプチドに関する。付加されるアミノ酸は、神経保護作用を発揮する限り任意のアミノ酸であってよい。付加されるアミノ酸の数は、元のペプチドの神経保護作用に影響を与えない観点から、１又は２個のアミノ酸の付加が好ましく、１個のアミノ酸の付加がより好ましい。付加されるアミノ酸は、任意のアミノ酸であってよいが、市販のプロリンリッチプロテイン４のアミノ酸配列（配列番号２）に対応するアミノ酸と同じ性質を有するアミノ酸であることが好ましい。
　本発明の別の態様では、本発明は、HPPPPPFQNQQRPP(配列番号３）の配列、又はそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両端にアミノ酸が付加された配列からなるペプチドにも関する。配列番号３のＮ末端に付加されるアミノ酸は、市販のプロリンリッチプロテイン４ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）の配列の１～６５位に対応するアミノ酸であり、配列番号３のＣ末端に付加されるアミノ酸は、市販のプロリンリッチプロテイン４ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）の８０～１００位に対応するアミノ酸であることが好ましい。したがって、前記ペプチドは、配列番号２の配列の末端欠失配列からなるペプチドということもでき、かかる末端欠失配列は、配列番号２のＮ末端から１～６５個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、さらにより好ましくは１～１０個のアミノ酸が欠失された配列及び／又は配列番号２のＣ末端から１～２１個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失された配列である。配列番号３の配列のＮ末端に付加されるアミノ酸の数は、神経保護作用を有する範囲で１～６５個の中から任意に選択することができ、１～３０個のアミノ酸の付加が好ましく、１～２０個のアミノ酸の付加がより好ましく、又は１～１０個のアミノ酸の付加がさらにより好ましく、１～５個のアミノ酸の付加が最も好ましい。配列番号３の配列のＣ末端に付加されるアミノ酸の数は、神経保護作用を有する範囲で１～２１個の中から任意に選択することができ、１～１０個のアミノ酸の付加が好ましく、１～５個のアミノ酸の付加が最も好ましい。神経保護作用を維持する観点から、Ｃ末端に付加された配列を有するペプチドが好ましい。このようにアミノ酸が付加された配列のうち、ＰＲＰ４アミノ酸配列（配列番号１）中の８２～９７位及び８２位～１００位のアミノ酸配列（配列番号１２並びに配列番号１３）からなるペプチドは本発明から除くことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　同じ性質を有するアミノ酸とは、同じ性質の側鎖を有するアミノ酸である。非極性側鎖を有するアミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンなど、極性側鎖を有するアミノ酸としては、例えばセリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システインなど、塩基性側鎖を有するアミノ酸としては、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンなど、酸性側鎖を有するアミノ酸としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　一般に短いペプチドであるほど、血液脳関門又は血液網膜関門の通過性が高く、また合成が容易である。一方で、神経保護作用を担保する観点から一定の長さが必要とされる。本発明のペプチドは、神経保護作用を有するとともに、生体内、特に硝子体内における安定性が高い。生体内安定性が高いと、低い用量で長期間にわたり神経保護作用をする点で好ましい。特に硝子体溶液中において安定性が高いことから、硝子体内注射による投与することで、硝子体内において長期にわたり神経保護作用を発揮することができる。
　本発明に係るペプチドは、任意の製造方法により製造することができる。例えば、Ｂｏｃ法又はＦｍｏｃ法等を用いて固相合成又は液相合成を行うことにより製造することができる。また、別法では、配列番号１又は２のような本発明のペプチドを含む長鎖のペプチドを、遺伝子導入法を用いて宿主細胞により合成させ、ポリヒスチジンタグ等を用いて精製した後に、得られた長鎖ペプチドから切断することにより本発明に係るペプチドを取得することができる。
　本発明に係るペプチドは、神経保護作用が失われない限りにおいて、Ｎ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシ基又はアミノ酸側鎖の官能基が任意に修飾された誘導体が含まれる。修飾の例としては、アミノ基への保護基の付加（例えば、アセチル化、ホルミル化、Ｂｏｃ化、Ｆｍｏｃ化）、カルボキシル基のエステル化（エチル化など）などが挙げられる。また、通常生体内で生じうる修飾、例えばリン酸化、アミド化、メチル化、エステル化、アセチル化などの他、合成過程で生じるか、又は精製を容易にする修飾、例えばビオチン化が含まれてもよい。また、ペプチドの半減期を延長する目的で、ＰＥＧ化などの修飾が行われてもよい。
　本発明に係るペプチドは、医薬上許容される塩が含まれる。医薬上許容される塩としては、無機酸との塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機酸との塩（例えば、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩等）、又は塩基との塩（例えば、アンモニウム塩、メチルピリジニウム塩、アセチルピリジニウム塩等）が挙げられる。本発明に係るペプチドは、水和物、又は溶媒和物も含まれる。
　本発明にかかる神経保護剤は、神経保護作用を有する薬剤のことをいう。したがって、神経保護剤は、神経細胞の損傷、変性及び／又は細胞死を伴う障害から神経を保護することができ、神経細胞死（アポトーシス及び/又はネクローシス）抑制剤、神経細胞変性抑制剤、神経細胞ストレス軽減剤、神経細胞毒性抵抗性の改善剤、神経細胞の生存性の改善剤、異常タンパク質蓄積抑制剤ということもできる。
　本明細書において、神経保護作用とは、神経細胞をその損傷、変性、及び／又は細胞死から保護する作用のことをいい、好ましくは神経細胞死から保護する作用をいう。より具体的には、神経保護作用には、神経細胞死（アポトーシス及び/又はネクローシス）の抑制、神経細胞変性の抑制、神経細胞ストレスの軽減、神経細胞毒性の抵抗性の向上、神経細胞の生存性の向上、異常タンパク質蓄積抑制などが含まれてもよい。神経細胞は、物理的な損傷の他、神経毒性物質に対する暴露、酸素や栄養物質の欠乏により損傷を受け、損傷が一定のレベルを超えると細胞死が引き起こされる。また、神経細胞は、神経毒性物質を蓄積することで変性を受け、最終的に細胞死が引き起こされる。本発明のペプチドが低酸素条件下における細胞死を抑制することが実施例に示されているが、単に細胞死の抑制のみならず、その前段階の神経細胞の損傷や変性に対しても保護効果を有する。したがって、本発明に係るペプチドは、低酸素誘導性のストレス又は細胞死に対する神経保護作用を有すると言うことができる。神経毒性物質は、外因性の毒性物質と内因性の毒性物質に大別される。外因性の毒性物質として、重金属や、アルコール、ボツリヌス毒素などの化学物質が挙げられる。内因性の毒性物質としては、活性酸素種、グルタミン酸などの神経伝達物質、異常タンパク質などが知られている。神経保護作用は、当業者であれば容易に測定することができる。一例として、各種ストレス、例えば低酸素負荷、神経毒性物質への暴露、栄養枯渇、紫外線照射などの条件下で、被験物質を含む培地（薬物群）又は被験物質を含まない培地（対照群）で神経細胞を培養し、培地中の生存細胞数と死細胞数を測定し、全細胞数に対する生存細胞数の割合を算出し、薬物群の生細胞数の割合が対照群の生細胞数の割合より高い場合に、被験物質が神経保護作用を有すると判断することができる。より好ましい態様では、神経保護作用を有することが知られている物質、例えばＩＧＦ－１やＮＧＦなどを添加した陽性対照群と比較し、陽性対照群と同等又はそれ以上の保護作用を有するか否かにより測定することができる。別の例としてはin vivoの動物実験を行うことで神経保護作用を測定してもよい。
　神経保護剤は、本発明に係るペプチドから選ばれる少なくとも１のペプチドを含む。このような神経保護剤に含まれるペプチドとしては、以下のものに限定されないが、例えば配列番号１～１１からなる群から選ばれる配列のペプチドが挙げられる。
　別の局面において、本発明は、上記のペプチド又は神経保護剤の治療有効量を含む、神経障害の治療又は予防用の医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物を、神経障害を患っている患者に対して投与することで、神経障害を治療することができるし、或いは神経障害を患う可能性のある患者に対し投与することで、神経障害を予防することができる。また、「治療」とは、障害又は疾患が発症した際にそれらの状態の悪化を防止し、それらの状態を現状維持、軽減又は消退させることをいい、「予防」とは障害又は疾患の発症をその発症前に防止することをいう。
　本発明に係るペプチド、神経保護剤又は医薬組成物は、神経障害の治療又は予防方法において使用することができ、神経障害を患う対象に投与することができる。このような神経障害とは、神経細胞の変性・細胞死に起因して、その機能が損なわれる病態をいい、脳血管障害及び神経変性疾患が含まれる。
　脳血管障害としては、出血性の障害、例えば脳出血、くも膜下出血と、脳血管の閉塞による障害、例えば脳血栓、脳梗塞、脳循環不全症などが挙げられる。出血性障害及び閉塞性障害のいずれの障害であっても、脳内の神経細胞は低酸素状態に置かれ、細胞死を生じる。したがって、こうした脳血管障害に対して、本発明に係るペプチド、神経保護剤又は医薬組成物は、治療又は予防の目的で投与することができる。
　神経変性疾患としては、認知症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、狂牛病、てんかんなどの脳・中枢神経変性疾患、脊椎性進行性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、球脊椎性筋萎縮症などの運動神経変性疾患、及び知覚神経変性疾患が挙げられる。知覚神経変性疾患としては、視覚、聴覚、触覚、味覚及び嗅覚神経の変性疾患が挙げられ、視覚変性疾患としては、緑内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症などが挙げられ、聴覚神経変性疾患としては、難聴などが挙げられる。
　本発明にかかるペプチド、神経保護剤又は医薬組成物は、非経口投与又は経口に適する剤形として提供されるが、ペプチド製剤として使用される観点から非経口投与が好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、局所、腹腔内、筋肉内、経鼻、経皮、経粘膜、髄膜内、経直腸、筋肉内、脳内、髄膜内、くも膜下、硬膜内、硬膜外、点眼、点耳、点鼻、眼内の経路で投与することができる。眼内経路としては、さらに具体的に、結膜下、テノン嚢下、硝子体内の経路が挙げられる。本発明にかかる神経保護剤は、その投与経路に応じて適宜剤形することができ、例えば点眼剤、注射剤、粉末剤、輸液製剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよいが、非経口投与する観点では、点眼剤、注射剤、輸液製剤、用時調製用の粉末剤等が好ましい。眼内投与用の製剤として、例えば硝子体内注射剤、結膜下注射剤、及びテノン嚢下注射剤が挙げられる。また、これらの製剤は製薬上許容される種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。また、神経保護効果を有する別の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
試験例１：ペプチドの合成
　後述の試験に用いた本発明の生理活性ペプチドは、ペプチドシンセサイザー（モデル：PSSM-8　島津製作所製）を用いてＦｍｏｃ法により固相合成された。合成ペプチドの分析は質量分析（MALDI TOF）によって行い、下記表に示すように、いずれの測定値も理論値によく一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
試験例２：低酸素によるヒト神経芽細胞腫（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞）の細胞死に対するペプチドの保護効果
１．細胞培養
　ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞（ATCC社）を１０％血清（Invitrogen, 10062-147）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen, 11330-032）で、３７℃、５％ＣＯ2条件下で維持培養を行った。
２．低酸素誘導細胞死アッセイ
　細胞を９６ウェルプレート (Iwaki, 3860-096)に、２×１０4個／１００μＬ/ウェルの密度で播種し、翌日に、培地を１％血清と１０μＭ レチノイン酸（Wako, 302-79-4）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し、２日間分化培養した。低酸素 (Ｏ2濃度０．１％以下)は、培地を１００ｎＭのペプチド１を添加したグルコース不含のＤＭＥＭ培地に交換した後、プレートをアネロパック・ケンキ５％(三菱ガス化学, A-07)とともにアネロパック角形ジャーに入れ、密閉後、３７℃で培養することにより誘導した。低酸素下で２４時間培養後、LDH Cytotoxicity detection kit(Takara, MK401)を用いて、細胞と培地中のLDH量を測定することにより、ペプチドによる細胞死の抑制率を算出した。また、実験の陽性コントロールとして、１００ｎＭのＩＧＦ－１を利用した。ＩＧＦ－１は、神経細胞死に対する保護効果を有する（Mol. Cell Neurosci. 2011, 47 (3), 181-190）。
３．試験結果
　下記表に示すように、１００ｎＭのペプチド１は、低酸素による神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死を有意に抑制した。この結果から、涙液中で同定されたプロリンリッチプロテイン４の部分配列であるペプチド１は、神経保護効果を示すことが判明した。その抑制率は、既存の神経成長因子であるＩＧＦ－１以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
試験例３：低酸素によるラット網膜神経節細胞(ＲＧＣ)の細胞死に対するペプチドの保護効果
１．ラット網膜神経節細胞の調製
　網膜神経節細胞の単離は、磁気細胞分散法 (MACS)により行った。新生児ラット (Slc: Sprague-Dawley 7日齢)から網膜を採取し、Neural Tissue Dissociation Kit (Miltenyi Biotec社，130-094-802)を用いて、組織を分散した。続いて、Retinal Ganglion Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec社, 130-096-209)を用いて、内皮細胞およびミクログリアの除去を行い、CD90.1 MicroBeadsによりCD90.1+ RGCのポジティブセレクションを行った。当該試験は、動物の愛護及び管理に関する法律（昭和４８年１０月１日法律第１０５号、最終改正：平成２５年６月１２日法律第３８号）等に基づく動物実験倫理委員会の承認を受けて実施した。
２．細胞培養
　単離したＲＧＣを、B27 supplement (Invitrogen, 0080085-SA)、１ｍＭ　Ｌ－グルタミン(Gibco, 25030)、５０ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ(Peprotech, 250-02)、５０ｎｇ／ｍＬ ＣＮＴＦ (Peprotech, 450-50)及び５μＭ　Forskolin (Sigma, F6886)を含むNeurobasal medium (Gibco社，12348-017) に懸濁した後、ポリ-Ｄ-リシン/ラミニンでコートされた９６ウェルプレート(Corning, 354596)に５×１０3個／１００μＬ／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2下で３日間培養した。
３．低酸素誘導細胞死アッセイ
　低酸素（Ｏ2濃度０．１％以下）は、培地をB27 supplement、１ｍＭ　Ｌ－グルタミンおよび各ペプチドを含むNeurobasal mediumに交換した後、プレートをアネロパック・ケンキ５％（三菱ガス化学, A-07)とともにアネロパック角形ジャーに入れ、密閉後、３７℃で培養することにより誘導した。低酸素下で２４時間培養後、培地にCalcein-AMと Ethidium homodimer (Invitrogen社，L3224) を添加し、細胞を染色することにより、生細胞および死細胞を判別した。生細胞と死細胞の数は、Image Pro plusを用いて計測し、生存率は、「全細胞数に対する生細胞数の割合」で示した。
４．試験結果
　下記表に示すように、ペプチド１～４は、低酸素による細胞死を有意に抑制した。この結果から、ペプチド４は、活性を有する最小単位の配列であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
試験例４　低酸素によるラット網膜神経節細胞(ＲＧＣ)の細胞死に対するプロリンリッチプロテイン４(ＰＲＰ４)の保護効果
１．ラット網膜神経節細胞の調製・細胞培養
　試験例３－１および２と同様の方法でＲＧＣの単離・培養を行った。
２．低酸素誘導細胞死アッセイ
　ペプチド５は、配列番号２の配列を有する市販のＰＲＰ４(Abnova, H00011272-Q01)を用いた。ペプチド５の評価は、試験例３－３と同様の方法で実施した。
３．試験結果
　下記表に示すように、ペプチド５は、低酸素による細胞死を有意に抑制した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
試験例５　硝子体溶液中でのペプチド１の安定性試験
　ウサギ（２匹）にペントバルビタールナトリウム溶液５ｍＬを静脈内投与して安楽死させた後、眼球を摘出した。眼球の赤道部から切り込みを入れ、切り口からシリンジ（注射針：１８G）を用いて、それぞれ硝子体溶液を採取した。混合した硝子体溶液をセルストレーナー（４０μｍ）でろ過し、そのろ液を安定性試験に使用する硝子体溶液とした。硝子体溶液６００μＬと５０ｍｇ／ｍＬのＰｒｉｍｏｃｉｎ１．２μＬを混合し、試料溶液とした。試料溶液２７０μＬと１ｍＭペプチド１水溶液３０μLを混合し、検体とした。検体を３７℃でインキュベートした。７日後、検体３０μＬを採取し、１Ｎ酢酸２００μＬと混合した後、１００℃で１0分間煮沸し、分析サンプルとした。分析サンプルを測定まで－２０℃で凍結保存した。融解後、４℃で２０分間遠心処理（１５０００×g）を行い、各サンプル中のペプチド１の濃度を液体クロマトグラフィーで分析した。得られた面積値から外部標準法にて濃度を算出した。液体クロマトグラフィーの分析条件は以下のとおりである。
＜液体クロマトグラフフィーの分析条件＞
　移動相Ａ：１０％アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸
　移動相Ｂ：６０％アセトニトリル＋０．０９５％リフルオロ酢酸
　グラジエント分析：Ｂ conc. ０～５０％１５ ｍｉｎ
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム：YMC-Pack ODS-AQ S-3 μm，12 nm 150 × 4.6 mm I.D. AQ12S03-1546WT
　システム：島津ＬＣ－２０Ａ
　カラムオーブン：４０℃
　硝子体溶液とのインキュベーション７日後のペプチド１の残存率を表９に示した。残存率は、下記の計算式に従って求めた：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　この結果により、ペプチド１は硝子体溶液中で安定であることがわかった。
製剤例
　本発明のペプチドを有効成分として含有する医薬は、例えば、次のような処方によって製造することができる。製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
１．カプセル剤
（１）ペプチド１ 　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）ラクトース 　　　　　　　　　　　　７０ｍｇ
（３）微結晶セルロース 　　　　　　　　　　９ｍｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム 　　　　　　１ｍｇ
１カプセル 　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍｇ
　（１）、（２）、（３）の全量、および（４）の１／２を混和した後、顆粒化する。これに残りの（４）を加えて全体をゼラチンカプセルに封入する。
２．錠剤
（１）ペプチド４ 　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）ラクトース 　　　　　　　　　　　　５８ｍｇ
（３）コーンスターチ 　　　　　　　　　　１８ｍｇ
（４）微結晶セルロース 　　　　　　　　３．５ｍｇ
（５）ステアリン酸マグネシウム 　　　　０．５ｍｇ
１錠 　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍｇ
（１）、（２）、（３）の全量、（４）の２／３および（５）の１／２を混和した後、顆粒化する。残りの（４）および（５）をこの顆粒に加えて錠剤に加圧成型する。
３．硝子体注射液
 　１ｍｌ中
（１）ペプチド１　　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）精製白糖　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
（３）塩化ナトリウム　　　　　　　　　２．３４ｍｇ
（４）ポリソルベート８０　　　　　　　　　適量
（５）リン酸水素二ナトリウム　　　　　　　適量
（６）リン酸二水素ナトリウム　　　　　　　適量
（７）滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　適量
　（１）～（６）を、（７）滅菌精製水に溶解して硝子体注射液を調製する。

Claims (13)

  1. 　HPPPPPFQNQQRPP(配列番号３）のアミノ酸配列又はその末端欠失配列からなるペプチドであって、ここで末端欠失配列が、
    １）配列番号３のＣ末端から１～８個のアミノ酸が欠失された配列、及び／又は、
    ２）配列番号３のＮ末端から１又は２個のアミノ酸が欠失された配列
    からなり、末端欠失配列からなるペプチドは神経保護作用を有する、ペプチド。
  2. 　欠失されるＣ末端のアミノ酸の数が１～６である、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　HPPPPPFQ(配列番号９）のアミノ酸配列、或いはそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は２個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、神経保護作用を有する、ペプチド。
  4. 　HPPPPPFQNQQ(配列番号６）のアミノ酸配列、或いはそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は２個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、神経保護作用を有する、ペプチド。
  5. 　HPPPPPFQNQQRPP(配列番号３）のアミノ酸配列、或いはそのＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は２個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、神経保護作用を有する、ペプチド。
  6. 　前記１又は２個のアミノ酸がＣ末端に付加された、請求項３～５のいずれか一項に記載のペプチド。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチドを含む、神経保護剤。
  8. 　配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、又はそれらの改変配列からなるペプチドを含む神経保護剤であって、ここで改変配列が、
    １）元の配列に対し１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列、又は
    ２）元の配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
    　であり、改変配列からなるペプチドは神経保護作用を有する、神経保護剤。
  9. 　配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、又は両端に１又は複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含む神経保護剤であって、当該ペプチドは配列番号２の末端欠失配列からなり、かつ、神経保護作用を有する、神経保護剤。
  10. 　Ｎ末端に付加されるアミノ酸の数が１～６５であり、及び／又は
    　Ｃ末端に付加されるアミノ酸の数が１～２１である、請求項９に記載の神経保護剤。
  11. 　請求項７～１０のいずれか一項に記載の神経保護剤を含む、神経障害の治療又は予防用の医薬組成物。
  12. 　前記神経障害が、神経変性疾患又は脳血管障害である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　前記神経変性疾患が、認知症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、狂牛病、脊椎性進行性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、球脊椎性筋萎縮症、緑内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、難聴、及びてんかんからなる群から選ばれる、請求項１２に記載の医薬組成物。
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