WO2017170322A1 - 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物 - Google Patents

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貴之 藤田
文義 岡野
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical use as an agent for treating and / or preventing cancer of an antibody against MCEMP1 or a fragment thereof.
  • MCEMP1 Mast Cell-Expressed Membrane Protein 1
  • An object of the present invention is to identify a cancer antigen protein that is specifically expressed on the surface of a cancer cell, and to provide a use of an antibody targeting it as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer.
  • the present inventors have encoded a protein that binds to an antibody present in serum derived from a cancer-bearing organism by the SEREX method using a cDNA library derived from canine testis tissue and the serum of a dog with leukemia.
  • cDNA was obtained, and MCEMP1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 and antibodies against these MCEMP1 were prepared based on the obtained canine gene and its human, cat, and mouse homologous genes. .
  • MCEMP1 is specifically expressed in leukemia, myelodysplastic syndrome, osteosarcoma, thymoma, mastocytoma, perianal adenocarcinoma, and part of MCEMP1 protein is specific on the cell surface of these cancer cells It was found to be expressed in. And it discovered that the antibody with respect to the part which expresses on the cell surface of each cancer cell of these MCEMP1 damaged the cancer cell which expresses MCEMP1, and came to complete this invention.
  • MCEMP1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence, or seven or more consecutive amino acids
  • a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cancer comprising as an active ingredient an antibody having immunological reactivity with the fragment, or a fragment thereof.
  • a polypeptide comprising an extracellular region portion of the MCEMP1 protein which is a polypeptide comprising 7 or more consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16, or the amino acid
  • the pharmaceutical composition according to (1) comprising as an active ingredient a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with an antibody or a fragment thereof having immunological reactivity.
  • the pharmaceutical composition according to (1) or (2), wherein the cancer is a cancer that expresses MCEMP1 on the cell surface.
  • the antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • An antibody or fragment thereof having immunological reactivity with a polypeptide comprising (8) The antibody or fragment thereof according to (7), wherein the antibody is a human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, single chain antibody or multispecific antibody.
  • a combined pharmaceutical for treatment and / or prevention of cancer comprising the pharmaceutical composition according to any one of (1) to (6) and a pharmaceutical composition containing an antitumor agent.
  • MCEMP1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8, or the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence, or 7 or more consecutive amino acids
  • a method for treating and / or preventing cancer comprising administering to a subject an antibody or fragment thereof having immunological reactivity with the fragment thereof.
  • the antibody against MCEMP1 used in the present invention damages cancer cells. Therefore, the antibody against MCEMP1 is useful for the treatment and prevention of cancer.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the expression pattern in the tumor tissue of a dog of the identified canine MCEMP1 gene. It is a figure which shows the expression pattern in each human tissue and cancer cell line of the identified MCEMP1 gene.
  • Control-1 shows cytotoxic activity against U937 cells when a control polyclonal antibody is added, and shows cytotoxic activity against U937 cells when an anti-MCEMMP1-1: anti-MCEMP1 polyclonal antibody is added.
  • Control-2 cytotoxic activity against MDS92 cells when a control polyclonal antibody is added, anti-MCEMP1-2; cytotoxic activity against MDS92 cells when an anti-MCEMP1 polyclonal antibody is added.
  • the present invention relates to cancer therapeutic and / or prophylactic use of an antibody against MCEMP1 protein or a fragment thereof or a fragment thereof, preferably an antigen-binding fragment.
  • the present invention relates to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, or 80% or more (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more,
  • the MCEMP1 protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 99% or more, such as 99.5% or more, or 7 or more consecutive (7 to the total length of each sequence, preferably 7 to 150, More preferably, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, comprising as an active ingredient an antibody having immunological reactivity with a fragment thereof comprising 7 to 50 amino acids).
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of the MCEMP1 protein, which comprises 7 or more consecutive amino acid sequences represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 24 (7 to the total length of each sequence, Preferably a polypeptide comprising 7 to 40, more preferably 7 to 20, for example, 7 to 12 or 8 to 11 amino acids, or the amino acid sequence and 80% or more (preferably 85% or more) More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more) a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity, and an antibody or fragment thereof having immunological reactivity.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer.
  • the antitumor activity of an antibody or a fragment thereof against the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 or a fragment thereof used in the present invention suppresses tumor growth in cancer-bearing animals in vivo ( in vivo) or, as will be described later, whether or not tumor cells expressing the polypeptide exhibit cytotoxic activity via immune cells or complement in vitro. It can be evaluated by examining with.
  • the antitumor activity of an antibody or fragment thereof against the polypeptide of SEQ ID NO: 10 to 16 or a fragment thereof of SEQ ID NOs: 10 to 16 used in the present invention suppresses tumor growth in cancer-bearing animals in vivo (in vivo). ), Or as described later, in vitro whether or not tumor cells expressing the polypeptide exhibit cytotoxic activity via immune cells or complement. Can be evaluated.
  • nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the proteins consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 are SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, respectively. 13 and 15.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the sequence listing disclosed in the present invention is specifically expressed in the serum derived from a cancer-bearing dog by the SEREX method using a canine testis tissue-derived cDNA library and the serum of a dog with leukemia.
  • the amino acid sequence represented by 8 is the amino acid sequence of MCEMP1 isolated as the mouse homologous factor (see Example 1 described later).
  • an antibody that binds to a portion expressed on the cell surface of cancer cells in the MCEMP1 protein is preferably used.
  • the amino acid sequence consists of 7 or more consecutive amino acids), or these polypeptides and 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably
  • Examples include amino acid sequences having a sequence identity of 99% or more, and the antibodies of the present invention include all antibodies that bind to these polypeptides and exhibit antitumor activity.
  • the antibody against MCEMP1 used in the present invention may be any kind of antibody as long as it can exhibit antitumor activity.
  • the antibodies used in the present invention also include antibody fragments (eg, antigen-binding fragments such as Fab and F (ab ′) 2 ). These antibodies and fragments thereof can also be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • an antibody capable of specifically binding to MCEMP1 protein or a fragment thereof is desirable and preferably a monoclonal antibody, but a polyclonal antibody may be used as long as a homogeneous antibody can be stably produced.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferably a human antibody or a humanized antibody in order to avoid or suppress rejection.
  • “specifically binds to the MCEMP1 protein or a fragment thereof” means specifically binds to the MCEMP1 protein or a fragment thereof and does not substantially bind to other proteins.
  • the antitumor activity of an antibody that can be used in the present invention is determined by examining the suppression of tumor growth in a cancer-bearing animal in vivo, or against tumor cells that express the polypeptide in vitro as described later. Thus, it can be evaluated by examining whether or not it exhibits cytotoxic activity via immune cells or complement.
  • the subject to be treated and / or prevented from cancer in the present invention is a mammal such as a human, a pet animal, livestock, a competition animal, a laboratory animal, etc., and a preferred subject is a human.
  • the protein or fragment thereof used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody against MCEMP1 used in the present invention is a human, dog, cat, mouse, cow, horse, rat, chicken, or other animal species derived from it. Not limited. However, it is preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, a protein derived from a mammal is preferable, and a protein derived from a human is particularly preferable. For example, when MCEMP1 is human MCEMP1, human MCEMP1 protein, a partial polypeptide thereof, cells expressing human MCEMP1 and the like can be used.
  • the base sequence and amino acid sequence of human MCEMP1 and its homologue are accessed, for example, on the website of GenBank (NCBI, USA), and algorithms such as BLAST and FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873 -5877, 1993; Altschul et al., Nucleic c Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • the base sequence or amino acid sequence of these ORFs or mature portions is 70% to 100%, preferably 80% to 100%, more preferably 90% to 100%, even more preferably 95% to 100%, such as 97% to 100%, 98% to 100%, 99% to 100% or 99.5% to 100% sequence identity
  • a target is a nucleic acid or protein consisting of a sequence having sex.
  • “% sequence identity” refers to the amino acid (or base) of two sequences when they are aligned (aligned) for maximum similarity with or without gaps. The percentage (%) of the same amino acid (or base) relative to the total number.
  • the fragment of MCEMP1 protein has a length less than the total length of the protein from the amino acid length of the epitope (antigenic determinant), which is the smallest unit recognized by the antibody.
  • An epitope refers to a polypeptide fragment having antigenicity or immunogenicity in a mammal, preferably a human, and the minimum unit thereof consists of about 7 to 12 amino acids, for example, 8 to 11 amino acids, and the amino acid sequence of the MCEMP1 protein.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more.
  • polypeptide containing human MCEMP1 protein and its partial peptide can be synthesized according to chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), for example.
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • a polynucleotide encoding the polypeptide is prepared, and the polynucleotide is incorporated into an expression vector and introduced into a host cell.
  • the desired polypeptide can be obtained by producing the polypeptide in the host cell.
  • the polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is subjected to PCR using a pair of primers designed to amplify the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, using human chromosomal DNA or cDNA library as a template.
  • PCR reaction conditions can be appropriately set. For example, using a thermostable DNA polymerase (eg, Taq polymerase) and a Mg 2+ -containing PCR buffer, the reaction temperature is 94 ° C.
  • the reaction process consisting of 1 minute (elongation) at 72 ° C. for 1 minute (annealing) can be mentioned as one cycle, for example, after 30 cycles, the reaction is carried out at 72 ° C. for 7 minutes, but is not limited thereto.
  • the PCR method, conditions, etc. are described in, for example, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), J ing.
  • cDNA libraries such as humans are prepared using them.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the protein of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. Examples of such cells and tissues are derived from cancers or tumors such as bone marrow, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), leukemia, myelodysplastic syndrome, osteosarcoma, thymoma, mastocytoma, perianal adenocarcinoma, etc.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • leukemia myelodysplastic syndrome
  • osteosarcoma thymoma
  • mastocytoma thymoma
  • perianal adenocarcinoma etc.
  • the host cell may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli
  • examples of eukaryotic cells include monkey kidney cells COS1, Chinese hamster ovary cells.
  • examples include, but are not limited to, mammalian cells such as CHO, human fetal kidney cell line HEK293, mouse fetal skin cell line NIH3T3, yeast cells such as budding yeast and fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
  • the expression vector is preferably an origin, promoter, ribosome binding site, multiple cloning site, terminator, drug resistance gene, auxotrophic complementary gene, reporter gene that can replicate in the prokaryotic cell. Etc. are used.
  • Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system and the like.
  • an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is preferably used as the expression vector.
  • expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3.1, pSecTag (A, B, C), pYES2, and the like.
  • a DNA encoding the above polypeptide is incorporated into such an expression vector, and after transforming a eukaryotic host cell with the vector, the resulting transformant is cultured, and the DNA encodes. Can be expressed in eukaryotic host cells.
  • pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, a His tag (for example, (His) 6 to (His) 10), FLAG tag, myc tag
  • the polypeptide can be expressed as a fusion protein to which various tags such as HA tag and GFP are added.
  • a well-known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, microinjection, virus infection, lipofection, binding to a cell membrane-permeable peptide, etc. can be used. .
  • Isolation and purification techniques include, for example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, sonication, enzyme digestion, salting out and solvent fractional precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE. , Isoelectric focusing, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like, but are not limited thereto.
  • An antibody is usually a heteromultimeric glycoprotein comprising at least two heavy chains and two light chains.
  • another class of antibodies is an approximately 150 kDa heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains.
  • L light chain
  • H heavy chain
  • each light chain is linked to the heavy chain by one disulfide covalent bond, but the number of disulfide bonds between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes varies.
  • Each heavy and light chain also has intrachain disulfide bonds.
  • Each heavy chain has at one end a variable domain (VH region) followed by several constant regions.
  • Each light chain has a variable domain (VL region) and one constant region at the opposite end.
  • the constant region of the light chain is aligned with the first constant region of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain.
  • the variable domain of an antibody confers binding specificity on the antibody by exhibiting specific variability, in which a specific region is called a complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • the relatively conserved portion of the variable region is called the framework region (FR).
  • the complete heavy and light chain variable domains each contain 4 FRs linked by 3 CDRs.
  • the three CDRs are called CDRH1, CDRH2, and CDRH3 in that order from the N terminus in the heavy chain, and similarly called CDRL1, CDRL2, and CDRL3 in the light chain.
  • CDRH3 is most important for the binding specificity of the antibody to the antigen.
  • the CDRs of each chain are held together in a state closer to the FR region, and contribute to the formation of an antigen binding site of the antibody together with the CDR from the other chain.
  • the constant region does not directly contribute to the binding of the antibody to the antigen, but it participates in various effector functions such as antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity), phagocytosis through binding to Fc ⁇ receptors, neonates
  • FIG. 5 shows half-life / clearance rate through Fc receptor (FcRn), complement dependent cytotoxicity activity (CDC activity) through C1q component of complement cascade.
  • the anti-MCEMP1 antibody in the present invention means an antibody having immunological reactivity with the full length of MCEMP1 protein as described above or a fragment thereof.
  • immunological reactivity refers to the property of binding of an antibody and MCEMP1 antigen in vivo or in vitro, and damages (eg, kills) a tumor or tumor cell through such binding. , Suppress or retreat) function. That is, the antibody used in the present invention binds to the MCEMP1 protein and is preferably a tumor, preferably a cancer expressing the MCEMP1 protein on the cell surface (for example, leukemia, myelodysplastic syndrome, osteosarcoma, Any type of thymoma, mastocytoma, or perianal adenocarcinoma can be used.
  • antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, synthetic antibodies, multispecific antibodies (eg bispecific antibodies), human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies and the like.
  • the antibody also includes, for example, antibody fragments (eg, fragments such as Fab and F (ab ′) 2.
  • the antibody can also be any class of immunoglobulin molecule, eg, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY, or any subclass such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc.
  • the antibody may be further modified by glycosylation, acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, PEGylation, or the like.
  • the polyclonal antibody that can be used in the present invention can be obtained, for example, as follows.
  • Sera is obtained by immunizing small animals such as mice, human antibody-producing mice, and rabbits with the recombinant MCEMP1 protein expressed in microorganisms such as E. coli as a fusion protein with natural MCEMP1 protein or GST, or a partial peptide thereof.
  • This is prepared by, for example, purification by ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with MCEMP1 protein or synthetic peptide, or the like.
  • a mouse polyclonal antibody against a region expressed on the cell surface of cancer cells in the amino acid sequence of the MCEMP1 protein was prepared, and the antitumor effect was confirmed.
  • a monoclonal antibody can be obtained, for example, as follows. For example, cells that express MCEMP1 on the cell surface (such as leukemia cell line U937) are immunized by immunization with mice, the spleen is extracted from the mice, the cells are separated, and the cells are fused with mouse myeloma cells. From the obtained fused cells (hybridomas), a clone producing an antibody having a cancer cell growth inhibitory action is selected. It can be prepared by isolating a monoclonal antibody-producing hybridoma having cancer cell growth inhibitory action, culturing the hybridoma, and purifying the antibody from the culture supernatant by a general affinity purification method.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can also be produced, for example, as follows.
  • an animal is immunized with a sensitizing antigen according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Salin), physiological saline or the like and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • PBS Phosphate-Buffered Salin
  • physiological saline or the like and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Can be mentioned.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cell to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell is known from various known cell lines such as P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. 19 (1976) 6, 511-119). (Margulies.
  • DH et al., Cell (1976) 8, 405-415
  • SP2 / 0 Shulman, M. et al., Nature 19 (1978) 276, 269-270
  • FO deSt. Groth , S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21
  • S194 Travebridge, IS S J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323
  • R210 Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133 and the like are preferably used.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46. ) And the like.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used.
  • Serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preliminarily heated to about 37 ° C. is usually 30 to 60% (
  • the desired hybridoma is formed by adding at a concentration of w / v) and mixing.
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened and single-cloned.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof, and sensitized. Lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, for example, U266 (Registration No. TIB196) to obtain a hybridoma that produces a human antibody having a desired activity (for example, cell growth inhibitory activity).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. And can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells (hybridomas) by a normal screening method.
  • human antibody-producing mice for example, KM mice (Kirin Pharma / Medarex) and Xeno mice (Amgen) are known (for example, International Publication Nos. WO02 / 43478, WO02 / 092812, etc.).
  • MCEMP1 International Publication Nos.
  • WO02 / 43478 for example, International Publication Nos. WO02 / 43478, WO02 / 092812, etc.
  • spleen cells can be removed from the immunized mouse and a fully human monoclonal antibody can be produced by a fusion method with myeloma cells.
  • the antigen can be prepared according to, for example, a method using animal cells (Japanese Patent Publication No. 2007-530068), a method using baculovirus (eg, International Publication No. WO 98/46777).
  • immunization may be performed by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique (for example, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC, MONOCLONAL, ANTIBODIES, Publicized in the the United, Kingdom, BYM, MACMILLAN, PUBLISHERS, 90, LTD.
  • a gene recombination technique for example, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC, MONOCLONAL, ANTIBODIES, Publicized in the United, Kingdom, BYM, MACMILLAN, PUBLISHERS, 90, LTD.
  • V region an antibody variable region
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region. It is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • Monoclonal antibodies include human monoclonal antibodies, non-human animal monoclonal antibodies (eg, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken monoclonal antibody, etc.).
  • a monoclonal antibody can be produced by culturing a hybridoma obtained by fusion of spleen cells and myeloma cells from a non-human mammal (eg, mouse, human antibody-producing mouse, etc.) immunized with the MCEMP1 protein or a fragment thereof. .
  • a chimeric antibody is an antibody prepared by combining sequences derived from different animals, such as a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and human antibody heavy chain, light chain constant region antibody, etc. .
  • a chimeric antibody can be prepared using a known method. For example, a DNA encoding an antibody V region and a DNA encoding a human antibody C region are ligated, incorporated into an expression vector, and introduced into a host. It is obtained by producing.
  • Polyclonal antibodies include antibodies obtained by immunizing human antibody-producing animals (eg, mice) with MCEMP1 protein or fragments thereof.
  • a humanized antibody is a modified antibody also called a reshaped human antibody.
  • Humanized antibodies are constructed by transplanting CDRs of antibodies from immunized animals into the complementarity determining regions of human antibodies. The general gene recombination technique is also known.
  • oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of mouse antibody and the framework region (framework) of human antibody (FR) had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP239400, International Publication No. WO96). No. 02576). As the FR of a human antibody linked through CDR, a complementarity determining region that forms a favorable antigen binding site is selected.
  • the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato ⁇ K. et al., Cancer Research). 1993, 53: 851-856). Moreover, you may substitute by the framework area
  • variable region e.g, FR
  • constant region amino acids in the variable region or constant region may be substituted with other amino acids.
  • Amino acid substitution is, for example, less than 15, less than 10, less than 8, less than 7, less than 6, less than 5, less than 4, less than 3, less than 2, or less than 2 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 or 2 amino acids
  • the substituted antibody should be functionally equivalent to the unsubstituted antibody.
  • the substitution is preferably a conservative amino acid substitution, which is a substitution between amino acids with similar properties such as charge, side chain, polarity, aromaticity and the like.
  • Amino acids with similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), nonpolar It can be classified into sex amino acids (leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine), branched chain amino acids (threonine, valine, isoleucine), aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine).
  • basic amino acids arginine, lysine, histidine
  • acidic amino acids aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine
  • the antibody of the present invention may be a modified antibody.
  • the modified antibody include antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the substance to be bound is not limited. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • “functionally equivalent” means that the target antibody has the same biological or biochemical activity as the antibody of the present invention, specifically, a function of damaging a tumor, and is applied to humans. Sometimes refers to not essentially causing rejection. Examples of such activity include cell growth inhibitory activity or binding activity.
  • an antibody recognizing the epitope of the MCEMP1 protein recognized by the anti-MCEMP1 antibody can be obtained by a method known to those skilled in the art.
  • the epitope of the MCEMP1 protein recognized by the anti-MCEMP1 antibody is determined by an ordinary method (eg, epitope mapping), and an antibody is produced using a polypeptide having an amino acid sequence contained in the epitope as an immunogen.
  • the epitope of the antibody produced by the above method can be determined, and an antibody having the same epitope as the anti-MCEMP1 antibody can be selected.
  • epitope refers to a polypeptide fragment having antigenicity or immunogenicity in a mammal, preferably a human, and its minimum unit consists of about 7 to 12 amino acids, preferably 8 to 11 amino acids.
  • the affinity constant Ka (kon / koff) of the antibody of the present invention is preferably at least 10 7 M ⁇ 1 , at least 10 8 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 8 M ⁇ 1 , at least 10 9 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 9 M ⁇ 1 , at least 10 10 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 10 M ⁇ 1 , at least 10 11 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 11 M ⁇ 1 , at least 10 12 M ⁇ 1 , or at least 10 13 M -1 .
  • the antibody of the present invention can be conjugated with an antitumor agent.
  • the bond between the antibody and the antitumor agent is a group reactive with an amino group, carboxyl group, hydroxy group, thiol group, etc. (for example, succinate imidyl group, formyl group, 2-pyridyldithio group, maleimidyl group, alkoxycarbonyl group). , A hydroxy group, etc.).
  • antitumor agents include the following antitumor agents known in the literature, such as paclitaxel, doxorubicin, daunorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, thiotepa, busulfan, improsulfan, piperosulfan, benzodopa (benzodopa) ), Carbocone, methredopa, uredopa, uretopa, altreamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, trimethylolothramine , Camptothecin, bryostatin, calistatin ( allystatin), cryptophycin 1, cryptophycin 8, dolastatin, duocarmycin, eleuterbin, panclastatin, sarcodictin, spongestatin, chlorambucil, chloronaphazine, cholophosphamide, estram Ifosfamide, mechlore
  • the antibodies of the present invention include radioactive substances such as 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 SM, 212 Bi, 32 P, 175 Lu, 176 Lu, which are known in the literature. It is also possible to combine isotopes. It is desirable that the radioisotope is effective for tumor treatment and diagnosis.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody immunologically reactive with MCEMP1 or an antibody that specifically recognizes MCEMP1.
  • the antibody should be an antibody having a structure such that little or no rejection is avoided in the subject animal to which it is administered.
  • examples of such antibodies include human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies (eg, human-mouse chimeric antibodies), single chain antibodies, bispecific antibodies and the like when the target animal is human.
  • the heavy and light chain variable regions are derived from human antibodies, or the heavy and light chain variable regions are derived from non-human animal antibody complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3).
  • a framework region derived from a human antibody, or the variable regions of the heavy and light chains are derived from a non-human animal antibody, and the constant regions of the heavy and light chains are human antibodies. It is a recombinant antibody that is derived from. Preferred antibodies are the previous two antibodies.
  • DNA encoding a monoclonal antibody against human MCEMP1 (for example, human monoclonal antibody, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken monoclonal antibody, etc.) is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma, and this is used as a template to clone the DNA.
  • DNAs encoding the light chain variable region and heavy chain variable region of the antibody were prepared by RT-PCR, etc., and Kabat EU numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of, ImmunologicaloInterest Health Neutical Health Neutical Health , Bethesda, Md. 1)) for determining the sequence or sequences of the CDR1, CDR2, CDR3 of the variable region of the light and heavy chains based on.
  • DNA encoding each of these variable regions or DNA encoding each CDR can be obtained using a gene recombination technique (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989)) or a DNA synthesizer. Make it.
  • the human monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by immunizing a human antibody-producing animal (for example, a mouse) with human MCEMP1, and then fusing spleen cells excised from the immunized animal with myeloma cells. .
  • DNA encoding the variable region and constant region of the light chain or heavy chain derived from a human antibody is prepared as necessary using a gene recombination technique or a DNA synthesizer.
  • the CDR coding sequence in the DNA encoding the variable region of the light chain or heavy chain derived from the human antibody is derived from a non-human animal (for example, mouse, rat, chicken, etc.) corresponding thereto.
  • a humanized antibody is encoded by preparing a DNA in which the CDR coding sequence of the antibody is replaced, and ligating the resulting DNA with a DNA encoding a constant region of a light chain or heavy chain derived from a human antibody, respectively. DNA can be produced.
  • DNA encoding the light chain or heavy chain variable region of an antibody derived from an animal other than a human is used.
  • a DNA encoding a chimeric antibody can be prepared by linking with a DNA encoding a region.
  • this antibody is an antibody in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linearly linked via a linker, DNA encoding the heavy chain variable region, DNA encoding the linker And a DNA encoding a light chain variable region can be combined to produce a DNA encoding a single chain antibody.
  • each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is derived from a human antibody, or only the CDR is replaced by the CDR of an antibody derived from a non-human animal (eg, mouse, rat, chicken, etc.). Derived from human antibodies.
  • the linker is composed of 12 to 19 amino acids, and examples thereof include 15 amino acids (G4S) 3 (G.G-B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).
  • this antibody is an antibody that can specifically bind to two different epitopes, such as DNA encoding heavy chain variable region A, light chain variable region B.
  • DNA, DNA encoding heavy chain variable region B, and DNA encoding light chain variable region A are joined in this order (however, DNA encoding light chain variable region B and DNA encoding heavy chain variable region B) Are linked via a DNA encoding a linker as described above), whereby a DNA encoding a bispecific antibody can be prepared.
  • each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is derived from a human antibody, or only the CDR is replaced by the CDR of an antibody derived from a non-human animal (eg, mouse, rat, chicken, etc.). Derived from human antibodies.
  • Recombinant DNA produced as described above is incorporated into one or more appropriate vectors, introduced into host cells (eg, mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.), and (co) expressed Recombinant antibodies can be prepared (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSNITAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean. W. Goding., Monoclonal ti Antibodies: principals and ra practices.
  • the antibody preferably has a cytotoxic activity, and can thereby exert an antitumor effect.
  • a hybridoma capable of producing another human antibody or non-human animal antibody (eg, mouse antibody) against human MCEMP1 is prepared, and the monoclonal antibody produced by the hybridoma is recovered, and immunological binding to and cytotoxicity with human MCEMP1 Whether the antibody is the target antibody is determined using the activity as an index.
  • DNAs encoding the variable regions of the heavy and light chains of the target antibody were prepared from the hybridoma and sequenced as described above. Use for production.
  • the antibody of the present invention has the specificity of specifically recognizing MCEMP1, one or several (preferably 1 or 2) of the antibody, particularly in the framework region sequence and / or the constant region sequence. ) Amino acid substitutions, deletions or additions. Here, several means 2 to 5, preferably 2 or 3.
  • the present invention further provides DNA encoding the antibody of the present invention, DNA encoding the heavy chain or light chain of the antibody, or DNA encoding the variable region of the heavy chain or light chain of the antibody. .
  • complementarity determining regions (CDRs) encoded by the DNA of these sequences are regions that determine the specificity of the antibody
  • sequences that encode other regions of the antibody May be a sequence derived from another antibody.
  • other antibodies include antibodies derived from organisms other than humans, but those derived from humans are preferable from the viewpoint of reducing side effects. That is, in the above DNA, the regions encoding the heavy chain and light chain framework regions and the constant regions preferably include a base sequence encoding a corresponding amino acid sequence derived from a human antibody.
  • the DNA of the present invention can be obtained, for example, by the above method or the following method.
  • total RNA is prepared from a hybridoma related to the antibody of the present invention using a commercially available RNA extraction kit, and cDNA is synthesized by reverse transcriptase using a random primer or the like.
  • the cDNA encoding the antibody is amplified by a PCR method using oligonucleotides having conserved sequences as primers.
  • the sequence encoding the constant region can be obtained by amplifying a known sequence by the PCR method.
  • the base sequence of DNA can be determined by a conventional method by incorporating it into a sequencing plasmid or phage.
  • the antitumor effect of the anti-MCEMP1 antibody used in the present invention on the MCEMP1-expressing cancer cell is the effector cell antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) of the MCEMP1-expressing cell, or the complement-dependent cytotoxic activity (CDC) of the MCEMP1-expressing cell. Activity).
  • ADCC activity effector cell antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC complement-dependent cytotoxic activity
  • the activity of the anti-MCEMP1 antibody used in the present invention is determined by measuring the above ADCC activity or CDC activity against cancer cells expressing MCEMP1 in vitro as specifically shown in the following examples. Can be evaluated.
  • the anti-MCEMP1 antibody used in the present invention binds to the MCEMP1 protein on cancer cells and exhibits an antitumor action due to the above activity, so it is considered useful for the treatment or prevention of cancer. That is, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer comprising an anti-MCEMP1 antibody as an active ingredient.
  • the anti-MCEMP1 antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody treatment), it is preferable to use a human antibody or a humanized antibody in order to reduce immunogenicity.
  • the binding constant (affinity constant) Ka is preferably at least 10 7 M ⁇ 1 , at least 10 8 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 8 M ⁇ 1.
  • ⁇ Binding to antigen-expressing cells The ability of an antibody to bind to MCEMP1 can be identified using binding assays such as those described in the Examples, such as ELISA, Western blotting, immunofluorescence and flow cytometry analysis.
  • Antibodies recognizing MCEMP1 can be obtained by immunohistochemistry in a manner well known to those skilled in the art, tissue obtained from the patient during surgery, patient bone marrow tissue, lymph nodes or peripheral blood cells, and naturally or after transfection. Reaction with MCEMP1 from tissues obtained from animals bearing xenograft tissues inoculated with a cell line expressing E. coli using paraformaldehyde or acetone-fixed frozen sections or paraformaldehyde-embedded tissue sections Can be tested for sex.
  • antibodies that are immunologically reactive with MCEMP1 can be stained by various methods. For example, it can be visualized by reacting horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse antibody or goat anti-rabbit antibody.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition (or medicament) comprising the antibody of the present invention, that is, the above-mentioned antibody against MCEMP1 or a fragment thereof (preferably an antigen-binding fragment).
  • the pharmaceutical composition (or medicament) of the present invention usually contains an effective amount of the above-mentioned antibody against MCEMP1 or a fragment thereof (preferably an antigen-binding fragment).
  • the target of the pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cancer of the present invention is not particularly limited as long as it is a cancer (cell) expressing the MCEMP1 gene.
  • tumor and cancer refer to malignant neoplasms and are used interchangeably.
  • the subject cancer in the present invention is a cancer expressing a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, or a partial sequence thereof consisting of 7 or more consecutive amino acids, Preferably, the cancer expresses such a polypeptide on the cell surface.
  • the cancer of interest in the present invention is preferably leukemia, myelodysplastic syndrome, osteosarcoma, thymoma, mastocytoma, or perianal adenocarcinoma, and these specific cancers include, for example, acute nonlymphocytic Leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute granulocytic leukemia, chronic granulocytic leukemia, acute promyelocytic leukemia, adult T cell leukemia, leukemic leukemia, leukemia leukemia, leukemia leukemia, basophil Leukemia, blast leukemia, bovine leukemia, chronic myelocytic leukemia, cutaneous leukemia, embryonic leukemia, eosinophilic leukemia, gross leukemia, leader cell leukemia, shilling leukemia, stem cell leukemia, subleukocytic leukemia , Undifferentiated cell leukemia, hairy cell leukemia, hemoblast
  • the target animals are mammals, for example, mammals including primates, pet animals, domestic animals, sport animals, laboratory animals, etc., and humans, dogs and cats are particularly preferable.
  • the antibody used in the present invention when used as a pharmaceutical composition, it can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium or additive specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle It is conceivable to prepare a pharmaceutical preparation by combining with an appropriate combination with a preservative, a binder and the like in a unit dosage form generally accepted in pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection can be prepared in accordance with normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-60 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • Administration is oral or parenteral, preferably parenteral administration. Specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. As an example of the injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like. Further, the antibody of the present invention may be directly administered to the tumor by local administration to the tumor by injection, infusion, implantation of a sustained-release preparation or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age, weight, sex, symptoms, etc. of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, sex, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the above-mentioned cancer By administering the antibody of the present invention or a fragment thereof, or the above-mentioned pharmaceutical composition containing the same to a subject, the above-mentioned cancer, particularly a cancer expressing MCEMP1 on the cell surface, preferably leukemia, myelodysplastic syndrome, Osteosarcoma, thymoma, mastocytoma or perianal adenocarcinoma can be treated and / or prevented.
  • a cancer expressing MCEMP1 on the cell surface preferably leukemia, myelodysplastic syndrome, Osteosarcoma, thymoma, mastocytoma or perianal adenocarcinoma
  • the pharmaceutical composition (or medicament) of the present invention is administered in combination with an antitumor agent or a pharmaceutical composition (or medicament) containing an antitumor agent as exemplified above, and administered to a subject in combination.
  • a method for the treatment and / or prevention of the disease is also encompassed by the present invention.
  • the target cancer is the same as above.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention and the antitumor agent can be administered to a subject simultaneously or separately. When administered separately, any pharmaceutical composition may be earlier or later, and the administration interval, dosage, administration route and frequency of administration can be appropriately selected by a specialist.
  • a pharmaceutical composition in the form of a pharmaceutical preparation obtained by mixing the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent in a pharmacologically acceptable carrier (or medium) and preparing a formulation is also included.
  • a pharmaceutical composition in the form of a pharmaceutical preparation obtained by mixing the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent in a pharmacologically acceptable carrier (or medium) and preparing a formulation is also included.
  • a pharmaceutical compositions and dosage forms containing an antitumor agent the formulation, formulation, administration route, dose, cancer, etc. for the pharmaceutical composition and dosage form containing the antibody of the present invention The explanation can be applied.
  • the present invention provides a pharmaceutical combination for the treatment and / or prevention of cancer comprising the pharmaceutical composition of the present invention and a pharmaceutical composition comprising an antitumor agent as exemplified above, and administering the same
  • a method for treating and / or preventing cancer is also provided.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent together with a pharmacologically acceptable carrier and / or additive. To do.
  • RNA was extracted from testicular tissue of a healthy dog by acid guanidinium-phenol-chloroform method (Acid guanidinium-phenol-chloroform method), PolyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo) according to the protocol attached to the kit.
  • a dog testis cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 ⁇ g).
  • the cDNA phage library was prepared using cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit (STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit.
  • the size of the prepared cDNA phage library was 1 ⁇ 10 6 pfu / ml.
  • the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction.
  • TBS 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5
  • This filter was reacted with serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
  • the serum pretreatment method is as follows. Specifically, ⁇ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-Blue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, a buffer of 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 containing 0.5 M NaCl was added to the plate and allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E.
  • coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthcare Bio-Science) to immobilize the protein derived from E. coli / phage.
  • Serum dog serum was passed through and reacted with this protein-immobilized column, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum.
  • the serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
  • the membrane on which the treated serum and protein were blotted was washed 4 times with TBS-T (0.05% Tween20 / TBS), and then 5000 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody.
  • TBS-T 0.05% Tween20 / TBS
  • TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody.
  • Added diluted goat anti-dog IgG Goat anti-Dog IgG-h + L HRP conjugated: BETHYL Laboratories
  • reacted at room temperature for 1 hour detected by enzyme color reaction using NBT / BCIP reaction solution (Roche), and developed color Colonies corresponding to the positive reaction sites were picked from ⁇ 90 ⁇ 15 mm NZY agarose plates and dissolved in 500 ⁇ l of SM buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgClSO 4 , 50 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin pH 7.5).
  • the secondary and tertiary screening are repeated in the same manner as described above until the chromogenic positive colonies are unified, and about 10,000 phage clones that react with IgG in the serum are screened to identify one positive clone. Released.
  • phagemid host Escherichia coli prepared to have an absorbance OD 600 of 1.0 and 10 ⁇ l of the purified phage solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 ⁇ l was treated with ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml) and cultivated overnight at 37 ° C.
  • Single colonies of transformed SOLR were collected, cultured at 37 ° C. in LB medium containing ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml), and plasmid DNA having the target insert was purified using QIAGEN plasmid Miniprep Kit (Qiagen). .
  • the purified plasmid was analyzed for the full length sequence of the insert by the primer walking method using the T3 primer set forth in SEQ ID NO: 17 and the T7 primer set forth in SEQ ID NO: 18.
  • the gene sequence described in SEQ ID NO: 3 was obtained by this sequence analysis.
  • a sequence identity search program BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ was used to perform sequence identity searches with known genes. As a result, the obtained gene was found to be the MCEMP1 gene.
  • human MCEMP1 which is a human homologous factor of canine MCEMP1
  • sequence identity is 70% nucleotide sequence and 51% amino acid sequence
  • cat MCEMP1 the sequence identity is 83% nucleotide sequence and 64% amino acid sequence
  • mouse MCEMP1 which is a factor
  • sequence identity was 65% nucleotide sequence and 47% amino acid sequence.
  • the base sequence of human MCEMP1 is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2
  • the base sequence of cat MCEMP1 is SEQ ID NO: 5
  • amino acid sequence is SEQ ID NO: 6
  • base sequence of mouse MCEMP1 is SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is sequenced The number 8 is shown.
  • RT-PCR Reverse Transcription-PCR
  • the reverse transcription reaction was performed as follows. That is, total RNA was extracted from 50 to 100 mg of each tissue and 5 to 10 ⁇ 10 6 cells of each cell line using TRIZOL reagent (ThermoFisher Scientific) according to the attached protocol. Using this total RNA, cDNA was synthesized by Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (ThermoFisher Scientific) according to the protocol attached to this kit.
  • Gene pool cDNA (ThermoFisher Scientific), QUICK-Clone cDNA (Clontech) and Large-Insert cDNA Library (Clontech) were used as cDNAs for human normal tissues (brain, testis, colon, placenta).
  • the PCR reaction was performed using the obtained gene-specific primers (SEQ ID NOs: 19 and 20 for dog primers, SEQ ID NOs: 21 and 22 for human primers, and SEQ ID NOs: 23 and 24 for mouse primers) as follows.
  • Example 2 Preparation of human MCEMP1 protein (1) Cloning of full-length cDNA encoding human MCEMP1 and cDNA encoding the extracellular region of human MCEMP1
  • the full-length cDNA encoding human MCEMP1 is the gene of SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 Based on the above, cloning was performed by the following method. PCR was performed using 1 ⁇ l of cDNA derived from various tissues and cells prepared in Example 1 and confirmed to be expressed by the RT-PCR method, and two kinds of primers containing EcoRI and NotI restriction enzyme cleavage sequences (SEQ ID NOs: 25 and 26).
  • the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 0.6 kbp was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the amplification product obtained by the above PCR reaction was inserted into pcDNA3.1 (ThermoFisher Scientific) (hereinafter, human MCEMP1 / pcDNA3.1).
  • the amplification product was confirmed to be a cDNA sequence encoding human MCEMP1 by sequencing using a DNA sequencer.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 1 represents the nucleotide sequence of the human MCEMP1 gene
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of the human MCEMP1 protein.
  • the two kinds of primers were those that amplify the region encoding SEQ ID NO: 10 including the amino acid sequence of the extracellular region of the MCEMP1 protein in SEQ ID NO: 1.
  • the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 0.3 kbp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the amplification product obtained by the above PCR reaction is linked to pSecTagB (ThermoFisher Scientific) into which the cDNA encoding the mouse IgG2a Fc protein is inserted, and the human MCEMP1 extracellular region / mouse IgG2a Fc fusion protein (hereinafter, hMCEMP1ECD-mIgG2aFc) (Hereinafter referred to as pSecB-hMCEMP1ECD-mIgG2aFc). Further, it was confirmed by sequencing using a DNA sequencer that it was a cDNA sequence encoding hMCEMP1ECD-mIgG2aFc.
  • sequence represented by SEQ ID NO: 29 represents the nucleotide sequence encoding hMCEMP1ECD-mIgG2aFc
  • sequence represented by SEQ ID NO: 30 represents the amino acid sequence of hMCEMP1ECD-mIgG2aFc.
  • hMCEMP1ECD-mIgG2aFc was produced as an immunizing antigen for producing an antibody against MCEMP1.
  • the expression vector pSecB-hMCEMP1ECD-mIgG2aFc was introduced into the human fetal kidney cell line HEK293 cells by lipofection, and hMCEMP1ECD-mIgG2aFc was purified from the culture supernatant 7 days after the introduction.
  • the culture supernatant was applied to a Hi Trap Protein A HP column (GE Healthcare Bioscience), washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)), and then eluted with an elution buffer (0.1 M glycine-HCl ( Elution was performed at a pH of 2.7)).
  • the eluate was immediately neutralized by eluting it into a tube to which neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)) was added.
  • neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)
  • the buffer of the eluate obtained by the above method was replaced with a physiological phosphate buffer (Nissui Pharmaceutical) using ultrafiltration NANOSEP 10K OMEGA (PALL), and then HT Tafrin Acrodisc 0 Sterile filtration was performed at .22 ⁇ m (PALL), and this was used in the following experiments.
  • Example 3 Preparation of polyclonal antibody binding to extracellular region of MCEMP1
  • 0.1 mg of hMCEMP1ECD-mIgG2aFc prepared above was used as an antigen.
  • Mice were mixed with an equal volume of complete Freund's adjuvant (CFA) solution and administered subcutaneously to mice 4 times every 2 weeks. Thereafter, blood was collected to obtain an antiserum containing a polyclonal antibody. Furthermore, this antiserum was purified using a protein G carrier column (GE Healthcare Bioscience) to obtain a polyclonal antibody against hMCEMP1ECD-mIgG2aFc.
  • the control antibody was obtained by purifying the serum of a mouse not administered with an antigen in the same manner as described above using a protein G carrier.
  • the suspension was suspended in PBS containing 5 ⁇ l of FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody (Santa Cruz) and 95 ⁇ l of 0.1% fetal bovine serum (FBS), and allowed to stand on ice for 1 hour. After washing with PBS, the fluorescence intensity was measured with a FACS caliber from Becton Dickinson.
  • the same operation as described above was performed using the control antibody prepared in (1) above instead of the polyclonal antibody against MCEMP1, and used as a control.
  • the CHO-human MCEMP1 cells to which the anti-human MCEMP1 antibody was added showed an enhancement in fluorescence intensity of 208% compared to the control.
  • the same operation was performed on CHO-emp cells.
  • the CHO-emp cells to which the anti-human MCEMP1 antibody was added showed an increase in fluorescence intensity of 0% compared to the control.
  • the enhancement rate of the fluorescence intensity is represented by the increase rate of the average fluorescence intensity (MFI value) in each cell, and was calculated by the following calculation formula.
  • the suspension was suspended in PBS containing 5 ⁇ l of FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody (Santa Cruz) and 95 ⁇ l of 0.1% fetal bovine serum (FBS), and allowed to stand on ice for 1 hour.
  • FBS fetal bovine serum
  • the fluorescence intensity was measured with a FACS caliber from Becton Dickinson.
  • the same operation as described above was performed using the control antibody prepared in (1) above instead of the polyclonal antibody against MCEMP1, and used as a control.
  • the cells to which the anti-human MCEMP1 antibody was added all had a fluorescence intensity of 30% or higher compared to the control.
  • U937 showed an increase in fluorescence intensity of 175%, THP-1 of 123%, and MDS92 of 137%. From this, it was confirmed that the MCEMP1 protein was expressed on the cell membrane surface of the human cancer cell line.
  • the enhancement rate of the fluorescence intensity is represented by an increase rate of the average fluorescence intensity (MFI value) in each cell, and was calculated by the following calculation formula.
  • Example 4 Anti-tumor effect of a polyclonal antibody against MCEMP1 on cancer cells (ADCC activity) Next, it was examined whether a polyclonal antibody against MCEMP1 can damage tumor cells expressing MCEMP1. Evaluation was performed using a polyclonal antibody against human MCEMP1 prepared in Example 3. Human leukemia cell line U937 and myelodysplastic syndrome cell line MDS92 in which expression of MCEMP1 was confirmed were collected in 10 6 50 ml centrifuge tubes, added with 100 ⁇ Ci of chromium 51, and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • the plate was washed 3 times with RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum, and 10 3 pieces were added per well of a 96-well V-bottom plate.
  • 1 ⁇ g of the polyclonal antibody against human MCEMP1 was added, and 2 ⁇ 10 5 lymphocytes separated from the peripheral blood of the mouse were added, respectively, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours. did.
  • the amount of chromium (Cr) 51 in the culture supernatant released from the damaged tumor cells was measured, and the ADCC activity against cancer cells by a polyclonal antibody against human MCEMP1 was calculated.
  • the cytotoxic activity (ADCC activity) in FIG. 4 is obtained by mixing 10 3 cell lines incorporating the antibody against MCEMP1, mouse lymphocytes and chromium 51 used in the present invention, as described above. It is the result which showed the cytotoxic activity with respect to the leukemia cell strain computed by the following formula * by measuring the quantity of chromium 51 released
  • cultivating for a time. * Formula: Cytotoxic activity (%) chromium 51 release from U937 when adding antibody against MCEMP1 and mouse lymphocytes ⁇ chromium 51 release from target cells added with 1N hydrochloric acid ⁇ 100.
  • the antibody of the present invention is useful for the treatment and / or prevention of cancer.

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Abstract

本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。　本発明は、配列番号２～８のうち偶数の配列番号で表されるいずれかのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＣＥＭＰ１タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物等に関する。

Description

癌の治療及び／又は予防用医薬組成物
　本発明は、ＭＣＥＭＰ１に対する抗体又はそのフラグメントの癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。
　近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。それらの抗体医薬は癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の多くは複数の正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。従って、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。
　Ｍａｓｔ　Ｃｅｌｌ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＭＣＥＭＰ１）は２型の膜貫通タンパク質であり、肥満細胞特異的に細胞膜に発現していることが報告されており、肥満細胞の分化、免疫反応、アレルギー反応に関与する可能性が示唆されている（非特許文献１）。しかし、ＭＣＥＭＰ１タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
Kang Li. et al. Genomics, 86:68-75 (2005)
　本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと白血病患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得したイヌ遺伝子及びそのヒト、ネコ、マウス相同性遺伝子を基にして、配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列を有するＭＣＥＭＰ１及びそれらＭＣＥＭＰ１に対する抗体を作製した。そしてＭＣＥＭＰ１が白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫、肛門周囲腺癌に特異的に発現していること、そしてＭＣＥＭＰ１タンパク質の一部がそれら癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出した。そして、それらＭＣＥＭＰ１の各癌細胞の細胞表面に発現する部分に対する抗体が、ＭＣＥＭＰ１を発現する癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　従って、本発明は、以下の態様を含む。
(1)配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＣＥＭＰ１タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
(2)前記ＭＣＥＭＰ１タンパク質の細胞外領域部分を含むポリペプチドであって、配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、(1)に記載の医薬組成物。
(3)前記癌がＭＣＥＭＰ１を細胞表面に発現する癌である、(1)又は(2)に記載の医薬組成物。
(4)前記癌が白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫及び肛門周囲腺癌からなる群から選択される、(1)～(3)のいずれかに記載の医薬組成物。
(5)前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、(1)～(4)のいずれかに記載の医薬組成物。
(6)前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、(1)～(5)のいずれかに記載の医薬組成物。
(7)ＭＣＥＭＰ１タンパク質の細胞外領域部分を含むポリペプチドであって、配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
(8)前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、(7)に記載の抗体又はそのフラグメント。
(9)(1)～(6)のいずれかに記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
(10)配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＣＥＭＰ１タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-064035号の開示内容を包含する。
　本発明で用いられるＭＣＥＭＰ１に対する抗体は、癌細胞を障害する。従って、ＭＣＥＭＰ１に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。
同定したイヌＭＣＥＭＰ１遺伝子の、イヌの腫瘍組織での発現パターンを示す図である。 同定したＭＣＥＭＰ１遺伝子の、ヒトの各組織及び癌細胞株での発現パターンを示す図である。Ａ：ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子の、ヒトの各組織での発現パターンを示す。Ｂ：ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子の、ヒトの各癌細胞株での発現パターンを示す。 同定したマウスＭＣＥＭＰ１遺伝子の、マウスの各癌細胞株での発現パターンを示す図である。 ＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体（抗ＭＣＥＭＰ１ポリクローナル抗体）による、ＭＣＥＭＰ１遺伝子を発現する白血病細胞株（Ｕ９３７）及び骨髄異形成症候群細胞株（ＭＤＳ９２）に対する細胞障害活性を示す図である。コントロール－１：コントロールポリクローナル抗体を添加したときのＵ９３７細胞に対する細胞傷害活性、抗ＭＣＥＭＰ１－１：抗ＭＣＥＭＰ１ポリクローナル抗体を添加したときのＵ９３７細胞に対する細胞傷害活性を示す。コントロール－２；コントロールポリクローナル抗体を添加したときのＭＤＳ９２細胞に対する細胞傷害活性、抗ＭＣＥＭＰ１－２；抗ＭＣＥＭＰ１ポリクローナル抗体を添加したときのＭＤＳ９２細胞に対する細胞傷害活性を示す。
　本発明は、ＭＣＥＭＰ１タンパク質若しくはその断片に対する抗体又はそのフラグメント、好ましくは抗原結合性フラグメントの、癌の治療及び／又は予防用途に関する。
　本発明は、配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、例えば９９．５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＣＥＭＰ１タンパク質、又は連続する７個以上（７個～各配列の全長、好ましくは７個～１５０個、より好ましくは７個～５０個）のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。
　本発明はまた、ＭＣＥＭＰ１タンパク質の部分ポリペプチドであって、配列番号１０～２４のうち偶数の配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列の連続する７個以上（７個～各配列の全長、好ましくは７個～４０個、より好ましくは７個～２０個、例えば、７～１２個又は８～１１個）のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。
　本発明で用いられる配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその断片に対する抗体又はそのフラグメントの抗腫瘍活性は、担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で調べることによって、あるいは、後述するように、該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で調べることによって評価することができる。
　同様に、本発明で用いられる配列番号１０～１６のうち偶数の配列番号のポリペプチド又はその断片に対する抗体又はそのフラグメントの抗腫瘍活性は、担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で調べることによって、あるいは、後述するように、該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で調べることによって評価することができる。
　なお、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に示されている。
　本発明が開示する配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列は、イヌ精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと白血病患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして、また配列番号２で表されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ）として、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、そのネコ相同因子として、配列番号８で表されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として単離された、ＭＣＥＭＰ１のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。
　本発明では、ＭＣＥＭＰ１タンパク質の内、癌細胞の細胞表面に発現する部分に結合する抗体が好ましく用いられる。具体的には、ＭＣＥＭＰ１タンパク質の細胞外領域部分を含むポリペプチドである、配列番号１０（ヒト）、１２（イヌ）、１４（ネコ）若しくは１６（マウス）で表されるアミノ酸配列、その断片（好ましくは、それらアミノ酸配列の連続する７個以上のアミノ酸からなる）、又はこれらポリペプチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、本発明の抗体には、これらポリペプチドに結合する、かつ、抗腫瘍活性を示すすべての抗体が含まれる。
　本発明で用いられる上記ＭＣＥＭＰ１に対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は単鎖抗体（ｓｃＦＶ）などであってよい。本発明で用いる抗体はまた、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２などの抗原結合性フラグメントを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、また当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＭＣＥＭＰ１タンパク質と特異的に結合することが可能な抗体又はその断片が望ましいし、モノクローナル抗体であることが好ましいが、均質な抗体を安定に生産できるかぎり、ポリクローナル抗体であってもよい。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避若しくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。
　ここで、「ＭＣＥＭＰ１タンパク質又はその断片と特異的に結合する」とは、ＭＣＥＭＰ１タンパク質又はその断片に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。
　本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、後述するように、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
　さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物、実験動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。
　以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。
　＜抗体作製用抗原の作製＞
　本発明で用いられるＭＣＥＭＰ１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種は制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＭＣＥＭＰ１がヒトＭＣＥＭＰ１の場合、ヒトＭＣＥＭＰ１タンパク質やその部分ポリペプチド、ヒトＭＣＥＭＰ１を発現する細胞などを用いることができる。
　ヒトＭＣＥＭＰ１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）のＷｅｂサイトにアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３－５８７７，１９９３； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２， １９９７）を利用することによって入手することができる。
　本発明では、ヒトＭＣＥＭＰ１の配列番号１の塩基配列又は配列番号２のアミノ酸配列を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％～１００％、好ましくは８０％～１００％、より好ましくは９０％～１００％、さらに好ましくは９５％～１００％、例えば９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％又は９９．５％～１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで、最大の類似度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。
　ＭＣＥＭＰ１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７～１２アミノ酸、例えば８～１１アミノ酸からなり、ＭＣＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
　上記した、ヒトＭＣＥＭＰ１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼなど）及びＭｇ２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。
　また、本明細書中の配列表の配列番号１～８で表される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４、６若しくは８のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、骨髄、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫、肛門周囲腺癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織であるがこれに限定されない。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＭＣＥＭＰ１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、好ましくは、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、レポーター遺伝子等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
　宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、好ましくは、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳｅｃＴａｇ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６～（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
　宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。単離精製技術としては、例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　＜抗体の構造＞
　抗体は通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、他のクラスの抗体は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）を示す。
　＜抗体の作製＞
　本発明における抗ＭＣＥＭＰ１抗体とは、上記のようなＭＣＥＭＰ１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。
　ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で又は生体外で抗体とＭＣＥＭＰ１抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍又は腫瘍細胞を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＭＣＥＭＰ１タンパク質と結合して腫瘍、好ましくはＭＣＥＭＰ１タンパク質を細胞表面に発現している（有している）癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌などを障害することができるならば、その種類を問わない。
　抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体などを含む。抗体はまた、例えば、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２などのフラグメントを含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラスであってよく、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などである。
　抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。
　以下に、種々の抗体の作製例を示す。
　本発明で使用可能なポリクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
　天然のＭＣＥＭＰ１タンパク質、あるいはＧＳＴなどとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＭＣＥＭＰ１タンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＭＣＥＭＰ１タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。後述の実施例では、ＭＣＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列中、癌細胞の細胞表面に発現する領域に対するマウスポリクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認されている。
　本発明で使用可能な抗体の別の例がモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。例えば、ＭＣＥＭＰ１を細胞表面に発現する細胞（白血病細胞株Ｕ９３７など）をマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
　このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７９）１２３， １５４８－１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９７８）８１， １－７）、ＮＳ－１（Ｋｏｈｌｅｒ． Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７６）６， ５１１－５１９）、ＭＰＣ－１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ． Ｄ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９７６）８， ４０５－４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７８）２７６， ２６９－２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ． Ｇｒｏｔｈ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９８０）３５， １－２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ， Ｉ．Ｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． （１９７８）１４８， ３１３－３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７９）２７７， １３１－１３３）等が好適に使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８１）７３， ３－４６）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００～６０００程度）を通常３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日～数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
　ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号、同第ＷＯ０２／０９２８１２号など）。このようなマウスをＭＣＥＭＰ１タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法により完全ヒトモノクローナル抗体を作製することができる。
　抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７－５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
　さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ， Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｊａｍｅｓ， Ｗ． Ｌａｒｒｉｃｋ， ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ， １９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＭＣＥＭＰ１タンパク質又はその断片を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウスなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。
　キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
　ポリクローナル抗体には、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にＭＣＥＭＰ１タンパク質又はその断片を免疫して得られる抗体が含まれる。
　ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
　具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ； ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３， ５３： ８５１－８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。
　キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
　アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１～５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。
　本発明の抗体は抗体修飾物であってもよい。抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
　ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｇｅｎｅ １５２， ２７１－２７５、Ｚｏｌｌｅｒ， ＭＪ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． （１９８３） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００， ４６８－５００、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ９４４１－９４５６、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ， ＨＪ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３５０－３６７、Ｋｕｎｋｅｌ， ＴＡ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８２， ４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ８５， ２７６３－２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。
　上記抗ＭＣＥＭＰ１抗体が認識するＭＣＥＭＰ１タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＭＣＥＭＰ１抗体が認識するＭＣＥＭＰ１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＭＣＥＭＰ１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７～１２アミノ酸、好ましくは８～１１アミノ酸からなる。
　本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１である。
　本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２－ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。
　抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。
　あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３ＳＭ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、１７５Ｌｕ、１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。
　本発明の抗体は、好ましくは、ＭＣＥＭＰ１と免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＭＣＥＭＰ１を特異的に認識する抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのような抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト－マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。
　これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＭＣＥＭＰ１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈＥｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。
　さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＭＣＥＭＰ１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。
　ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
　キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
　単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２～１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Ｇ． －Ｂ． Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２００７， ２０（９）： ４２５－４３２）が挙げられる。
　二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。
　上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ． Ｄｅｌｖｅｓ．， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．， １９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．， ２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ； Ｊ．Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．， １９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。
　上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。
　また、ヒトＭＣＥＭＰ１に対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＭＣＥＭＰ１との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。
　さらに本発明の上記抗体は、ＭＣＥＭＰ１を特異的に認識するという特異性を有する限り、抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２～５個、好ましくは２個又は３個を意味する。
　本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。 
　これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
　本発明のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。
　本発明で用いられる抗ＭＣＥＭＰ１抗体によるＭＣＥＭＰ１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、ＭＣＥＭＰ１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）、又はＭＣＥＭＰ１発現細胞の補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）により起こると考えられる。
　従って、本発明で用いられる抗ＭＣＥＭＰ１抗体の活性は、以下の実施例に具体的に示されるように、生体外でＭＣＥＭＰ１を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。
　本発明で用いられる抗ＭＣＥＭＰ１抗体は、癌細胞上のＭＣＥＭＰ１タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＭＣＥＭＰ１抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＭＣＥＭＰ１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。
　なお、抗ＭＣＥＭＰ１抗体と癌細胞表面上のＭＣＥＭＰ１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＭＣＥＭＰ１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。従って、ＭＣＥＭＰ１タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＭＣＥＭＰ１抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１であることが望ましい。
　＜抗原発現細胞への結合＞
　抗体がＭＣＥＭＰ１に結合する能力は、実施例で述べられるような例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。
　＜免疫組織化学染色＞
　ＭＣＥＭＰ１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織、患者の骨髄組織、リンパ節又は末梢血細胞や、自然に又はトランスフェクション後にＭＣＥＭＰ１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＭＣＥＭＰ１との反応性に関して試験することができる。
　免疫組織化学染色のため、ＭＣＥＭＰ１に対して免疫学的反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ウサギ抗体を反応させることにより、可視化することができる。
　＜医薬組成物＞
　本発明は本発明の抗体、すなわち上述したＭＣＥＭＰ１に対する抗体又はそのフラグメント（好ましくは抗原結合性フラグメント）を含む医薬組成物（又は医薬）を提供する。本発明の医薬組成物（又は医薬）は通常は上述したＭＣＥＭＰ１に対する抗体又はそのフラグメント（好ましくは抗原結合性フラグメント）を有効量で含む。
　本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＭＣＥＭＰ１遺伝子を発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。
　本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
　本発明において対象となる癌としては、配列番号２、４、６若しくは８のアミノ酸配列又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくはそのようなポリペプチドを細胞表面に発現している癌である。本発明において対象となる癌は、好ましくは白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌であり、これらの特定の癌には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞性白血病、有毛状細胞性白血病、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、不応性貧血（ＲＡ）、鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、移行期ＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ－Ｔ）、前白血病及び慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨内通常型骨肉腫と亜系骨肉腫（骨内高分化型骨肉腫、円形細胞骨肉腫、表在骨肉腫、傍骨骨肉腫、骨膜骨肉腫又は表在高悪性骨肉腫）、胸腺腫、肥満細胞腫、肛門周囲腺腫、肛門周囲腺癌が包含されるが、これらに限定されない。
　また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物、実験動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。
　本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水又はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体又は添加剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って調製することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－６０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。また注射、注入、徐放製剤の埋め込み等による腫瘍への局所投与によって本発明の抗体を腫瘍に直接投与してもよい。
　また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　本発明の抗体若しくはそのフラグメント、又はそれを含む上記の医薬組成物を被験者に投与することによって上述の癌、とりわけＭＣＥＭＰ１を細胞表面に発現している癌、好ましくは、白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌を治療及び／又は予防することができる。
　さらに、本発明の医薬組成物（又は医薬）を、上で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物（又は医薬）と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。対象となる癌は上記と同じである。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、又は、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する場合、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（又は媒体）中で混合し製剤化して得られる医薬剤型の医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌等の説明を適用しうる。
　したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品及びそれを投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も提供する。また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体及び／又は添加剤とともに含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。
　実施例１　ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの同定
　（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
　健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム－フェノール－クロロホルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＲＮＡを精製した。
　この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ－ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ－ｃＤＮＡ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
　（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
　上記で作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに約２５００クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）にファージを感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ： ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｎｅｃｅ）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
　上記患犬血清としては、白血病の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｒｅ ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ－カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
　かかる処理血清とタンパク質をブロットした上記メンブレンをＴＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ－ｈ＋Ｌ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ： ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する約１００００個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。
　（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
　上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μｌ、さらにＥｘＡｓｓｉｓｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後、３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃で一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地で３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ(キアゲン）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したプラスミドは、配列番号１７に記載のＴ３プライマーと配列番号１８に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＭＣＥＭＰ１遺伝子であることが判明した。イヌＭＣＥＭＰ１のヒト相同因子であるヒトＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列７０％、アミノ酸配列５１％であり、ネコＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列８３％、アミノ酸配列６４％であり、マウス相同因子であるマウスＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列６５％、アミノ酸配列４７％であった。ヒトＭＣＥＭＰ１の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に、ネコＭＣＥＭＰ１の塩基配列を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６に、マウスＭＣＥＭＰ１の塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に示す。
　（４）各組織での遺伝子発現解析
　上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種正常組織、各種腫瘍組織及び各種癌細胞株における発現をＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行った。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により本キット添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱＵＩＣＫ－Ｃｌｏｎｅ　ｃＤＮＡ（クロンテック）及びＬａｒｇｅ－Ｉｎｓｅｒｔ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテク）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１９及び２０、ヒトプライマーは配列番号２１及び２２、マウスプライマーは配列番号２３及び２４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したｃＤＮＡサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ　ＲＡＤ）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返してＰＣＲを行った。その結果、図１に示すように、イヌＭＣＥＭＰ１遺伝子は、イヌ腫瘍組織では肥満細胞腫、肛門周囲腺癌で強い発現が見られた（図１）。ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子発現においては、健常なヒト組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方ヒト癌細胞では白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫の細胞株でヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子の強い発現が見られた（図２）。さらに、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子は、白血病、胸腺腫の細胞株で発現が検出された（図３）。
　実施例２　ヒトＭＣＥＭＰ１タンパクの作製
　（１）ヒトＭＣＥＭＰ１をコードする全長ｃＤＮＡ及びヒトＭＣＥＭＰ１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
　ヒトＭＣＥＭＰ１をコードする全長ｃＤＮＡは実施例１で取得した配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてクローニングした。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞由来ｃＤＮＡのうちＲＴ－ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２５及び２６に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はｐｃＤＮＡ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入した（以下、ヒトＭＣＥＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、その増幅産物がヒトＭＣＥＭＰ１をコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号１で表される配列はヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子の塩基配列を、配列番号２で表される配列はヒトＭＣＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
　また、配列番号１を基に、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２７及び２８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号１のうちＭＣＥＭＰ１タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列を含む配列番号１０をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＳｅｃＴａｇＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結し、ヒトＭＣＥＭＰ１細胞外領域／マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合タンパク質（以下、ｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃ）をコードする発現ベクターとした（以下、ｐＳｅｃＢ－ｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃ）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、ｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号２９で表される配列はｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードする塩基配列を、配列番号３０で表される配列はｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃのアミノ酸配列を示す。
　（２）ｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃの作製
　ＭＣＥＭＰ１に対する抗体を作製するための免疫抗原としてｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃを作製した。
　発現ベクターｐＳｅｃＢ－ｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃをヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞へリポフェクション法により導入し、導入７日後の培養上清よりｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃの精製を実施した。培養上清をＨｉ Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、結合バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム (ｐＨ ７．０)）にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ (ｐＨ ２．７)）で溶出した。溶出液は中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ (ｐＨ ９．０)）を加えたチューブに溶出することにより直ちに中和した。次に、上記方法によって得られた溶出液のバッファーを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬）に置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。 
　実施例３　ＭＣＥＭＰ１の細胞外領域に結合するポリクローナル抗体の作製
　（１）ＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体の作製
　ＭＣＥＭＰ１の細胞外領域に結合する抗体を得るために、上記で作製したｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃ０．１ｍｇを抗原として、等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、マウスの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清をプロテインＧ担体カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製し、ｈＭＣＥＭＰ１ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａＦｃに対するポリクローナル抗体を得た。また、抗原を投与していないマウスの血清を上記と同様にしてプロテインＧ担体を用いて精製したものをコントロール抗体とした。
　（２）全長ヒトＭＣＥＭＰ１定常発現細胞の樹立
　上記で作製したヒトＭＣＥＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１をＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ社）へリポフェクション法により導入し、５００μｇ/ｍｌのＧ４１８（ナカライ社）による選抜により、全長ヒトＭＣＥＭＰ１を定常的に発現するＣＨＯ細胞株を樹立した（ＣＨＯ－ヒトＭＣＥＭＰ１）。また、ＭＣＥＭＰ１をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、ＣＨＯ－ｅｍｐ）。
　（３）細胞表面上での抗原タンパクの発現解析
　次に（２）で樹立した細胞表面上に発現するＭＣＥＭＰ１特異的に（１）で作製したポリクローナル抗体が反応するかどうかを調べた。ＣＨＯ－ヒトＭＣＥＭＰ１細胞及びＣＨＯ－ｅｍｐ細胞それぞれ１０６個細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（１）で調製したＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルズ）及び９５μｌの０．１％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体の代わりに上記（１）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗ヒトＭＣＥＭＰ１抗体を添加されたＣＨＯ－ヒトＭＣＥＭＰ１細胞は、コントロールに比べて、蛍光強度が２０８％の蛍光強度の増強を示した。一方、同様の操作をＣＨＯ－ｅｍｐ細胞に対して実施した。その結果、抗ヒトＭＣＥＭＰ１抗体を添加されたＣＨＯ－ｅｍｐ細胞は、コントロールに比べて、蛍光強度が０％の蛍光強度の増強を示した。このことから、抗ヒトＭＣＥＭＰ１抗体は細胞膜表面上に発現するＭＣＥＭＰ１タンパク質特異的に結合することが明らかとなった。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。
　平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＭＣＥＭＰ１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）－（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。
　次にＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現が多く確認された白血病細胞株２種（Ｕ９３７、ＴＨＰ－１）及び骨髄異形成症候群細胞株１種（ＭＤＳ９２）について、その細胞表面上にＭＣＥＭＰ１タンパク質が発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト細胞株それぞれ１０６個細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（１）で調製したＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルズ）及び９５μｌの０．１％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体の代わりに上記（１）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗ヒトＭＣＥＭＰ１抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が３０％以上強かった。具体的には、Ｕ９３７が１７５％、ＴＨＰ―１が１２３％、ＭＤＳ９２が１３７％の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＭＣＥＭＰ１タンパクが発現していることが確認された。
　なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。
　平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＭＣＥＭＰ１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）－（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。
　実施例４　ＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
　次にＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体が、ＭＣＥＭＰ１を発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。実施例３で調製したヒトＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体を用いて評価を行った。ＭＣＥＭＰ１の発現が確認されているヒト白血病細胞株Ｕ９３７、骨髄異形成症候群細胞株ＭＤＳ９２を１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに、上記ヒトＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体を１μｇ添加し、さらにマウスの末梢血から分離したリンパ球をそれぞれ２×１０５個ずつ添加して、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム（Ｃｒ）５１の量を測定し、ヒトＭＣＥＭＰ１に対するポリクローナル抗体による癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、Ｕ９３７細胞に対して１８．１％、ＭＤＳ９２細胞に対して１７．３％のＡＤＣＣ活性が確認された（図４参照）。一方、それぞれの細胞株に対して、抗原で免疫されていないマウスの末梢血から調製したコントロール抗体（実施例３）を用いて同様の操作を行った場合、及び抗体を添加しなかった場合には、活性はほとんど認められなかった（図４参照）。従って、ＭＣＥＭＰ１に対する抗体を用いたＡＤＣＣ活性により、ＭＣＥＭＰ１を発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。
　なお、図４中の細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）は、上記のように、本発明で用いられるＭＣＥＭＰ１に対する抗体、マウスリンパ球及びクロミウム５１を取り込ませた１０３個の細胞株を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下の計算式＊により算出した白血病細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。
　＊式：細胞障害活性（％）＝ＭＣＥＭＰ１に対する抗体及びマウスリンパ球を加えた際のＵ９３７からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。
　本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (10)

  1. 　配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＣＥＭＰ１タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
  2. 　前記ＭＣＥＭＰ１タンパク質の細胞外領域部分を含むポリペプチドであって、配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記癌がＭＣＥＭＰ１を細胞表面に発現する癌である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記癌が白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫及び肛門周囲腺癌からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１～４のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 　前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 　ＭＣＥＭＰ１タンパク質の細胞外領域部分を含むポリペプチドであって、配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
  8. 　前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項７に記載の抗体又はそのフラグメント。
  9. 　請求項１～６のいずれか1項に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
  10. 　配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＣＥＭＰ１タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
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