WO2017157323A1 - 一种脂多糖结合蛋白多肽及其制药用途 - Google Patents

一种脂多糖结合蛋白多肽及其制药用途 Download PDF

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lps
binding protein
protein polypeptide
lipopolysaccharide
polypeptide
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武艺
谢展利
阳艾珍
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Suzhou University
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Suzhou University
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    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biomedical technology, and particularly relates to a 15 amino acid lipopolysaccharide binding protein polypeptide and use thereof for preparing a medicament for preventing and/or treating sepsis caused by Gram-negative bacteria. .
  • Sepsis is an acute systemic infection caused by pathogenic bacteria or conditional pathogens invading the blood circulation, producing toxins and other metabolites, clinically with chills, fever, rash, joint pain and hepatosplenomegaly. To be characterized, some may have septic shock and migratory lesions.
  • human factors When the skin and mucous membranes are damaged or purulent inflammation, bacteria are easy to invade the body; the human immune response can be divided into non-specific immune response and specific immune response, It can be divided into two aspects: cellular immunity and humoral immunity.
  • bacterial factors mainly related to the virulence and quantity of pathogenic bacteria. Pathogenic bacteria with strong virulence or a large number enter the body, which is more likely to cause sepsis.
  • LPS lipopolysaccharide
  • LPS lipopolysaccharide
  • HK plasma high molecular weight kininogen
  • DHGHKHKHGHGHGKH a highly conserved amino acid sequence in HK
  • the peptide sequence is synthesized and injected into mice by intraperitoneal injection, which can significantly improve the mortality of endotoxemia caused by LPS and inhibit the production of inflammatory factors.
  • the invention provides a lipopolysaccharide binding protein polypeptide designated DHG15, the amino acid sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the above-described lipopolysaccharide-binding protein polypeptide and one or more pharmaceutically acceptable excipients, the pharmaceutically acceptable excipients including (but not Limited to) p H regulators, osmotic pressure regulators, solubilizers, solubilizers, emulsifiers, stabilizers, preservatives, excipients, fillers, disintegrants, binders, flavoring agents, mediators, and Lubricant.
  • the pharmaceutical composition can be administered to a patient by various methods such as injection administration, nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration, oral administration, and the like.
  • the present invention provides the use of the above lipopolysaccharide-binding protein polypeptide for the preparation of a medicament for preventing and/or treating sepsis caused by Gram-negative bacilli.
  • the lipopolysaccharide-binding protein polypeptide of the present invention can be used as a single pharmaceutically active substance or in combination with other anti-sepsis drugs.
  • the anti-sepsis drug includes, but is not limited to, a cephalosporin antibiotic and a quinolone antibiotic; wherein: the cephalosporin antibiotic is selected from any one of cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime, cefoperazone; the quinolone The antibiotic is selected from any one of the group consisting of ofloxacin, ciprofloxacin, and fleroxacin.
  • the lipopolysaccharide-binding protein polypeptide DHG15 of the present invention has good solubility, and the sequence is derived from the human body's own HK protein, and is non-cytotoxic;
  • DHG15 binds to the polysaccharide chain of LPS, blocking the binding of LPS to HK protein (to dissociate or release it); at the same time, the lipid A portion of LPS is still exposed, LBP sCD14, CTBP and other lipoproteins can still be combined with it and presented to the liver for detoxification, thus providing dual protection.
  • HC heavy chain
  • LC light chain
  • 2 is a graph showing experimental results of binding of plasma HK protein to LPS.
  • FIG. 3 is a graph showing the affinity results of the binding of HK and LC to LPS.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Western Blotting identification of D4, D5 and D6 protein fragments in LC and experimental results in combination with LPS.
  • Figure 5 is a graph showing the distribution of eight polypeptide fragments on D5 and the results of experiments with LPS.
  • Figure 6 is a graph showing the results of comparison between the DHG15 polypeptide and the mutant polypeptide in inhibiting the binding of the HK light chain to the LPS.
  • FIG. 7 is a graph showing experimental results of studying the binding of LPS to plasma HK protein.
  • Figure 8 is a graph showing the results of DHG15 polypeptide improving mortality in mice caused by LPS.
  • Figure 9 is a graphical representation of the effect of DHG15 monomer on the levels of major inflammatory factors in plasma.
  • Example 1 Screening of the functional polypeptide DHG15 from plasma HK protein and detecting its binding properties.
  • HC Heavy Chain
  • LC light chain
  • the heavy and light chain proteins of HK were prepared using the Bac-to-Bac insect cell expression system, and the purified HC (55KD) and LC (35KD) proteins were identified by Wester n blotting. The results are shown in Figure 1.
  • Polymyxin-B (Sigma) into a 1.5 ml centrifuge tube, centrifuge to remove the supernatant, and wash twice with 1 ml PBS (7000 rpm, 2 min).
  • Various protein samples were incubated with the treated Polymyxin-B (4 ° C, 5 min), the supernatant was centrifuged, and washed twice with PBS.
  • the Polymyxin-B precipitate was resuspended in 60 ⁇ protein loading buffer, boiled at 100 ° C for 10 min, and 10 ⁇ was taken for Western blotting, and HK antibody (Baiqi Bio) was incubated.
  • the HK protein was coupled to the HPA chip according to the protocol of Biacore XI 00 control soft with a coupling level of 3000 RU. Set the injection time to 180 s, the dissociation time to 500 s, the regenerant to 0.1 M HC1, and the regeneration time to 120 s. Perform the test on the Biacore X100 control soft protocol.
  • the fourth domain (D4) and the fifth domain in LC were prepared using the Bac-to-Ba c insect cell expression system ( D5) and sixth domain (D6) proteins were identified by Western blotting. After incubation with D4, D5 or D6 protein using polymyxin-B microbeads, the binding to LPS was detected. Only D5 can be shared by polymyxin-B. Precipitating, suggesting that D5 is the binding site of HK and LPS, the results are shown in Figure 4.
  • the histidine-rich polypeptide can neutralize the host inflammatory response caused by LPS, while the DHG15 polypeptide of the present invention contains a large amount of histidine, so it is speculated that histidine is a combination of HK and LPS. The main amino acid. Subsequently, the histidine (H) in the DHG15 polypeptide is mutated to the same positively charged lysine.
  • the DHG15 polypeptide can inhibit the binding of the HK light chain to LPS, and after the histidine (H) is mutated to lysine (K), the mutant polypeptide cannot inhibit the HK light chain and LPS. Combine. At the same time, the use of unrelated peptides from other fragments in D 5 as a negative control suggests that histidine is the key to the binding of HK to LPS.
  • Example 2 LPS is bound to HK via a sugar chain.
  • LPS consists mainly of a sugar chain and a lipid A.
  • mice were randomized into two groups, administered by intraperitoneal injection, and a group of injections co-incubated with an unrelated polypeptide (200 g/mouse).
  • LPS control group
  • another group of LPS treatment group
  • DHG15 polypeptide 200 g/mouse
  • DHG15 affects the levels of major inflammatory factors in plasma
  • the plasma levels of major inflammatory factors were compared between control mice and DHG15 treated mice.
  • the levels of TNF-a, IL-lb, and IL-6 in the plasma of DHG15-treated mice were significantly lower than those in the control group, indicating that DHG15 was significant in the inflammatory response caused by LPS. Inhibits the level of major inflammatory factors in plasma.
  • DHG15 polypeptide can block the binding of plasma HK protein to LPS, which is beneficial for preventing the onset of sepsis caused by Gram-negative bacilli, and is beneficial for alleviating the symptoms after onset, and taking preventive measures. And the dual effect of treatment.

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Abstract

提供了一种脂多糖（LPS）结合蛋白多肽及其制药用途，该脂多糖结合蛋白多肽的氨基酸序列为DHGHKHKHGHGHGKH，其源自人体自身血浆高分子量激肽原（HK）蛋白。该脂多糖结合蛋白多肽经腹腔注射注入小鼠体内，可以降低小鼠由LPS导致的内毒素血症的死亡率，并且抑制炎症因子的产生。

Description

发明名称：一种脂多糖结合蛋白多肽及其制药用途 技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种包含 15个氨基酸的脂多糖结合蛋 白多肽及其在制备用于预防和 /或治疗由革兰氏阴性细菌引起的败血症的药物中 的用途。
背景技术
[0002] 败血症是致病菌或条件致病菌侵入血液循环中生长繁殖， 产生毒素和其他代谢 产物所引起的急性全身性感染， 临床上以寒战、 高热、 皮疹、 关节痛及肝脾肿 大为特征， 部分可有感染性休克和迁徙性病灶。 引起败血症的原因有二： 一、 人体因素： 当皮肤粘膜有破损或发生化脓性炎症吋， 细菌则容易侵入体内； 人 体的免疫反应可分为非特异性免疫反应及特异性免疫反应两种， 后者又可分为 细胞免疫与体液免疫两方面， 当机体免疫功能下降吋， 不能充分发挥其吞噬杀 灭细菌的作用， 就会引起败血症； 条件致病菌所引起的医源性感染也逐渐增多 。 二、 细菌因素： 主要与病原菌的毒力和数量有关。 毒力强或数量多的致病菌 进入机体， 引起败血症的可能性较大。
[0003] 革兰氏阴性细菌感染是导致败血症的重要原因， 其胞壁成分脂多糖 （LPS) 诱 导产生的系统性炎症和微循环障碍对败血症发生的多器官功能障碍和败血性休 克起关键作用。 脂多糖 （LPS) 是革兰氏阴性杆菌细胞壁的组成成分之一， 一般 位于细胞壁的最外层， 厚度约为 8~10nm， 具有很强的致炎作用。
[0004] 尽管目前败血症的治疗已采取抗感染、 免疫调控和支持治疗等综合措施， 但是 败血症的发病率和死亡率仍然居高不下。 究其原因， 主要是对败血症发病机理 的认识远远不足。 血液中 LPS不存在游离形式。 已知生物体具有 LPS清除机制， 包括 LBP、 sCD14、 CTBP及其它脂蛋白， 它们与 LPS的结合将其递呈给肝脏的三 种细胞 （包括枯否细胞、 肝细胞及星状细胞） ， 通过细胞内的降解排入胆汁， 而被解毒。 然而， 在发生败血症吋， 血液中的 LPS浓度居高不下， 说明 LPS借助 于与宿主蛋白的结合而逃逸了清除机制， 但迄今为止， 仍不清楚 LPS到底劫持了 哪些宿主蛋白。
技术问题
问题的解决方案
技术解决方案
[0005] 针对上述情况， 本发明首次发现： 血浆高分子量激肽原 （high molecular weight kininogen, HK) 可以通过其与 LPS中的糖链的相互作用来保持其与 LPS的高亲和 力结合， 可以作为一种新型的脂多糖结合蛋白。 本发明进一步发现： HK中的一 段高度保守的氨基酸序列 （DHGHKHKHGHGHGKH) 是其与 LPS发生特异性结 合的位点。 合成该多肽序列， 并经腹腔注射注入小鼠体内， 可以显著改善由 LPS 导致的内毒素血症的死亡率， 并且抑制炎症因子的产生。
[0006] 一方面， 本发明提供了一种脂多糖结合蛋白多肽， 将其命名为 DHG15 , 其氨基 酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示。
[0007] 另一方面， 本发明提供了一种药物组合物， 其包含上述脂多糖结合蛋白多肽和 一种或多种药学上可接受的辅料， 所述药学上可接受的辅料包括 （但不限于） p H调节剂、 渗透压调节剂、 增溶剂、 助溶剂、 乳化剂、 稳定剂、 防腐剂、 赋形剂 、 填充剂、 崩解剂、 粘合剂、 矫味剂、 矫喚剂和润滑剂。 所述药物组合物可以 通过注射给药、 鼻腔给药、 肺部给药、 透皮给药、 口服给药等多种方式施用于 患者。
[0008] 最后一方面， 本发明提供了上述脂多糖结合蛋白多肽在制备用于预防和 /或治 疗由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的药物中的用途。 在上述药物中， 本发明的 脂多糖结合蛋白多肽既可以作为单独的药效活性物质， 又可以与其他抗败血症 药物联用。 所述抗败血症药物包括 （但不限于） 头孢类抗生素和喹诺酮类抗生 素； 其中： 所述头孢类抗生素选自头孢噻肟、 头孢曲松、 头孢他啶、 头孢哌酮 中的任意一种； 所述喹诺酮类抗生素选自氧氟沙星、 环丙沙星、 氟罗沙星中的 任意一种。
发明的有益效果
有益效果 [0009] 与现有技术相比， 采用上述技术方案的本发明具有如下有益效果：
[0010] (1) 本发明的脂多糖结合蛋白多肽 DHG15具有很好的可溶性， 并且序列源自 人体自身 HK蛋白， 无细胞毒性；
[0011] (2) 经腹腔注射 DHG15后， 可以降低小鼠由 LPS导致的内毒素血症的死亡率
， 并且抑制炎症因子的产生；
[0012] (3) DHG15与 LPS的多糖链结合后， 阻断了 LPS与 HK蛋白的结合 （使其解离 或释放） ； 于此同吋， LPS中的脂质 A部分仍然暴露在外， LBP、 sCD14、 CTBP 及其它脂蛋白仍然可以与之结合， 并将其递呈至肝脏解毒， 因此具有双重保护 作用。
对附图的简要说明
附图说明
[0013] 图 1为血浆 HK蛋白中重链 （HC) 和轻链 （LC) 蛋白片段的 Western Blotting鉴 定结果图。
[0014] 图 2为研究血浆 HK蛋白与 LPS结合的实验结果图。
[0015] 图 3为 HK和 LC与 LPS结合的亲和力结果图。
[0016] 图 4为 LC中的 D4、 D5和 D6蛋白片段的 Western Blotting鉴定结果图以及与 LPS结 合的实验结果图。
[0017] 图 5为 8个多肽片段在 D5上的分布情况以及与 LPS结合的实验结果图。
[0018] 图 6为 DHG15多肽与突变多肽在抑制 HK轻链与 LPS结合方面的比较结果图。
[0019] 图 7为研究 LPS与血浆 HK蛋白结合的实验结果图。
[0020] 图 8为 DHG15多肽改善小鼠由 LPS导致的死亡率的结果示意图。
[0021] 图 9为 DHG15单体对血浆中主要炎症因子水平的影响结果示意图。
本发明的实施方式
[0022] 下面结合附图和具体实施例对本发明做出进一步的描述。 需要说明的是， 下列 实施例仅用于解释本发明的技术方案， 而并不旨在限制其保护范围。 另外， 除 非特殊说明， 下列实施例中使用各种试剂、 药品和仪器均可通过商业手段获得 [0023] 实施例一： 从血浆 HK蛋白中筛选功能性多肽 DHG15并检测其结合性能。
[0024] 血浆中的 HK蛋白共有 6个结构域， 其中第一至第三结构域 （D1~D3) 组成 HK 的重链 （Heavy
chain, HC) ， 第四至第六结构域 （D4~D6) 组成 HK的轻链 （Light chain, LC) 。 运用 Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统制备了 HK的重链与轻链蛋白， 并使用 Wester n blotting鉴定所纯化的 HC (55KD) 与 LC (35KD) 蛋白， 其结果如图 1所示。
[0025] 为了研究 HK蛋白与 LPS的结合位点， 分别将 200 ng
HK：、 HC、 LC蛋白与 LPS或 PBS孵育 （4°C， 30 min) 。 吸取 30
μΐ混匀的 Polymyxin-B (Sigma) 至 1.5 ml离心管中， 离心去上清， 1 ml PBS洗两 次 （7000 rpm， 2 min) 。 将各种蛋白样品与处理后的 Polymyxin-B孵育 （4°C， 5 min) ， 离心去上清， PBS洗两遍。 采用 60 μΐ蛋白上样缓冲液重悬 Polymyxin-B沉 淀， 100°C煮 10 min， 吸取 10 μΐ进行 Western blotting鉴定， 并孵育 HK抗体 （百奇 生物） 。
[0026] 如图 2所示， HK和 LC能够与 LPS结合， 从而被 polymyxin-B微珠共沉淀， 提示 H K可能通过 LC与 LPS结合。
[0027] 为了进一步验证上述结论， 使用 Biacore分析方法， 分别检测 HK和 LC与 LPS结 合的亲和力。 采用 pH=7.4的 Running buffer稀释 HK样品， 稀释一系列浓度至 0 nM 、 6.4 nM、 19.3 nM、 57.7 nM、 173 nM、 520 nM。 按照 Biacore XI 00 control soft 的 protocol, 将 HK蛋白偶联到 HPA芯片上， 偶联水平为 3000 RU。 设置进样吋间 为 180 s， 解离吋间为 500 s， 再生液为 0.1M HC1, 再生吋间为 120 s。 按照 Biacore X100 control soft的 protocol, 进行上机测试。
[0028] 如图 3所示， HK、 LC与 LPS均有物理性的直接结合， Kd值分别为 1.713*10 -7M 和 1.524*10 -9 M。 上述结果说明， 与 HK相比， LC与 LPS的结合力更强， 进一步提 示 LC含有 HK与 LPS直接结合的位点。
[0029] 为了进一步研究究竟是 LC中的哪一个结构域与 LPS发生了结合， 使用 Bac-to-Ba c昆虫细胞表达系统制备了 LC中的第四结构域 （D4) 、 第五结构域 （D5) 和第 六结构域 （D6) 蛋白， 并经过 Western blotting鉴定。 使用 polymyxin-B微珠与 D4 、 D5或 D6蛋白孵育后， 检测其与 LPS的结合情况， 只有 D5可以被 polymyxin-B共 沉淀下来， 提示 D5是 HK与 LPS的结合位点， 其结果如图 4所示。
[0030] 随后， 合成了 D5上的 8个多肽片段 （南京金斯瑞生物科技公司） ， 每个多肽片 段包含含 30个氨基酸。 将 8个多肽片段分别和 LPS共孵育后， 再和 LC相互作用， 然后使用同上的实验方法检测结合情况， 只有多肽 6和多肽 7可以抑制 LPS与 LC 的结合， 其结果如图 5所示。 比对多肽片段 6和 7的氨基酸序列可知， 其共有的序 歹 'J为 DHGHKHKHGHGHGKH (将其命名为 DHG15) 。
[0031] 据文献报道， 富含组氨酸的多肽可以中和由 LPS导致的宿主炎症反应， 而本发 明的 DHG15多肽中恰恰含有大量组氨酸， 因此推测组氨酸是 HK与 LPS结合的主 要氨基酸。 随后， 将 DHG15多肽中的组氨酸 （H) 突变为同样带正电荷的赖氨酸
(K) ， 即为 DKGKKKKKGKGKGKK：。 将 DHG15多肽以及突变多肽分别与 LPS 预孵育后， 使用 polymyxin-B微珠与上述混合物孵育， 经 Western blotting检测其 与 LPS的结合情况。
[0032] 如图 6所示， DHG15多肽可以抑制 HK轻链与 LPS的结合， 而将组氨酸 （H) 突 变为赖氨酸 （K) 后， 该突变多肽不能抑制 HK轻链与 LPS的结合。 同吋， 采用 D 5中其它片段的无关多肽作为阴性对照， 提示组氨酸是 HK与 LPS结合的关键。
[0033] 实施例二： LPS通过糖链与 HK结合。
[0034] LPS主要由糖链和脂质 A两部分组成， 为了检测 LPS通过其结构上的哪一部分与 HK结合， 向 96孔板的每孔中加入 2 脂质 A、 脱脂 LPS、 LPS或 BSA (内含 0.1M Na 2C0 3， pH=9.6) ， 4°C包被， 过夜。 PBS清洗孔板后， 加入 1%明胶， 37°C封 闭 l h。 PBS清洗孔板后， 各孔加入 FITC标记的 HK蛋白 （100 nM) ， 37°C孵育 1 h。 吸走液体后， 采用酶标仪检测各孔中的荧光强度 （激发光： 494 nm， 发射光 ： 518 nm) 。
[0035] 如图 7所示， 脱脂 LPS与 HK的结合能力最强， 相比于脂质 A与 HK的结合能力， 具有显著性差异， 提示 LPS上的糖链是 LPS与 HK结合的主要位点。
[0036] 实施例三： DHG15多肽的活性考察。
[0037] 为了研究 DHG15多肽能否改善由 LPS导致的小鼠死亡， 将小鼠随机分为两组， 通过腹腔注射方式进行给药， 一组注射与无关多肽 （200 g/只） 共孵育的 LPS ( 对照组） ， 另一组注射与 DHG15多肽 （200 g/只） 共孵育的 LPS (治疗组） ， 观 察两组小鼠的生存率。 结果发现， 经过 DHG15多肽处理， 可以显著改善小鼠由 L PS导致的死亡率。
[0038] 为了研究 DHG15是否会影响血浆中主要炎症因子的水平， 比较对照组小鼠和 D HG15治疗组小鼠血浆中主要炎症因子的含量。 如图 9所示， 与对照组小鼠相比， DHG15治疗组小鼠血浆中 TNF-a、 IL-lb和 IL-6的水平明显降低， 说明在由 LPS导 致的炎症反应中， DHG15可以显著抑制血浆中主要炎症因子的水平。
工业实用性
[0039] 以上结果说明， 应用 DHG15多肽可以阻断血浆 HK蛋白与 LPS的结合， 有利于 预防由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的发病， 同吋有利于缓解发病后的症状， 起到兼顾预防和治疗的双重效果。
序列表自由内容
[0040] <110>苏州大学
[0041] <120>一种脂多糖结合蛋白多肽及其制药用途
[0042] <160> 1
[0043] <170> Patentln version 3.3
[0044] <210> 1
[0045] <211> 15
[0046] <212> PRT
[0047] <213>人工序列
[0048] <220>
[0049] <223> DHG15多肽
[0050] <400> 1
[0051] Asp His Gly His Lys His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His
[0052] 1 5 10 15

Claims

权利要求书
一种脂多糖结合蛋白多肽， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0:1所示。
一种药物组合物， 其包含根据权利要求 1所述的脂多糖结合蛋白多肽 和一种或多种药学上可接受的辅料。
根据权利要求 2所述的药物组合物， 其特征在于：
所述药学上可接受的辅料包括 pH调节剂、 渗透压调节剂、 增溶剂、 助溶剂、 乳化剂、 稳定剂、 防腐剂、 赋形剂、 填充剂、 崩解剂、 粘合 剂、 矫味剂、 矫喚剂和润滑剂。
根据权利要求 2所述的药物组合物， 其特征在于：
所述药物组合物通过注射给药、 鼻腔给药、 肺部给药、 透皮给药或口 服给药方式施用于患者。
根据权利要求 1所述的脂多糖结合蛋白多肽在制备用于预防和 /或治疗 由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的药物中的用途。
根据权利要求 5所述的用途， 其特征在于：
在所述用于预防和 /或治疗由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的药物中 ， 根据权利要求 1所述的脂多糖结合蛋白多肽作为单独的药效活性物 质。
根据权利要求 5所述的用途， 其特征在于：
在所述用于预防和 /或治疗由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的药物中 ， 根据权利要求 1所述的脂多糖结合蛋白多肽与其他抗败血症药物联 用。
根据权利要求 7所述的用途， 其特征在于：
所述抗败血症药物包括头孢类抗生素和喹诺酮类抗生素。
根据权利要求 8所述的用途， 其特征在于：
所述头孢类抗生素选自头孢噻肟、 头孢曲松、 头孢他啶、 头孢哌酮中 的任意一种。
根据权利要求 8所述的用途， 其特征在于：
所述喹诺酮类抗生素选自氧氟沙星、 环丙沙星、 氟罗沙星中的任意一
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