WO2017155172A1 - 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체 - Google Patents

콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체 Download PDF

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부이티트랑
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Definitions

  • the present invention relates to a carbon point-hemoglobin complex for cholesterol detection.
  • Cholesterol is a fat produced in the liver and is distributed throughout the body. It is a precursor of steroid hormones, vitamin D, and bile, and as an important component of cell membranes, in the human body, the equilibrium properties of cholesterol are important. If the amount of cholesterol exceeds the appropriate level, the blood vessels are damaged. This can lead to cardiovascular disease.
  • Analytical methods for detecting cholesterol include electrochemical methods, thin layer chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC). However, these methods have disadvantages such as complicated procedures, slow reaction time, low selectivity and specificity. And most cholesterol sensors use cholesterol oxidants. This is expensive and has the disadvantage of easy denaturation.
  • hemoglobin is an important protein in red blood cells that carry oxygen throughout the body. It is rough spherical, has a diameter of 5.5 nm, has a molecular weight of 68,000 and contains four polypeptide chains. Each chain is bound to four Heme prosthetic groups consisting of tetrapyrrole rings chelated to Fe 2+ ions.
  • Carbon dots are carbon nanomaterials with a high fluorescence intensity and sizes of less than 10 nm, and have a chemical group on their edges and surfaces. It has the characteristics of biocompatibility, easy synthesis, non-toxicity and environmental friendliness. Therefore, these characteristics are used for biosensors and drug delivery.
  • carbon dots may have "off-on" fluorescence because of their surface structure and function. That is, when bio-compound and metal ions including a conjugate system are absorbed on the surface of the carbon spot through van der Waals bonding and chelation, the fluorescence is quenched and the fluorescence is "off", and the analyte and the metal ion If a bond is formed between them, the fluorescence is restored.
  • Zeng et al. Reported that DNA can be determined after quenching the carbon point of fluorescence and the methylene blue solution.
  • cholesterol detection based on "off-on" fluorescence using carbon dots and hemoglobin.
  • the present inventors confirmed that cholesterol can be detected by carbon point and hemoglobin through the quenching-enhance approach of carbon point fluorescence and completed the present invention.
  • the present invention is to provide a carbon point-hemoglobin complex for cholesterol detection as a technical problem.
  • the present invention is to provide a composition for detecting cholesterol comprising the carbon point-hemoglobin complex for detecting cholesterol as another problem.
  • the present invention to solve the above problems,
  • a carbon dot and a hemoglobin chelate bound to the carbon dot surface A carbon dot and a hemoglobin chelate bound to the carbon dot surface
  • carbon point-hemoglobin complexes for cholesterol detection Provided are carbon point-hemoglobin complexes for cholesterol detection.
  • composition for detecting cholesterol comprising the carbon point-hemoglobin complex.
  • optical cholesterol sensor comprising the carbon point-hemoglobin complex.
  • the carbon point-hemoglobin complex of the present invention can exhibit high selectivity for cholesterol and high detection sensitivity and fast reaction time, thereby having an effect of detecting cholesterol.
  • according to the present invention can provide a biosensor capable of detecting cholesterol simply and economically, in particular, there is an effect that can provide a biosensor capable of medical applications.
  • FIG. 1 schematically shows the fluorescence principle of the carbon point-hemoglobin complex for cholesterol detection according to the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of the dynamic light scattering (DLS) of the carbon dots according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the analysis results of the carbon point according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3a is an FT-IR spectrum
  • Figure 3b is a UV-vis spectrum for absorption, excitation-emission of the carbon point
  • Figures 3c and 3d Shows the analysis results by photoluminescence spectroscopy of carbon dots.
  • FIG. 4 is a carbon point according to an embodiment of the present invention, and other metal ions (Cu 2+ , Mg 2+ , Na + , Fe 2+ , Fe 3+ ) or bio compound (Hb, Lys, Glu, Vit. C, Urea), where F0 and F are the fluorescence intensity of the carbon point before and after adding each substance.
  • other metal ions Cu 2+ , Mg 2+ , Na + , Fe 2+ , Fe 3+
  • bio compound Hb, Lys, Glu, Vit. C, Urea
  • Figure 5 shows the analysis results according to the photoluminescence spectroscopy method of (a) carbon dots (CDs) according to an embodiment of the present invention, (b) a: CDs, b: CDs and Hb, c: CDs under ultraviolet light, respectively; / Hb shows a cholesterol solution, and (c) shows the selectivity of CDs / Hb of cholesterol and different biomolecules (urea, glucose, galactose and L-ascorbic) at the same concentration (F0 and F is the fluorescence intensity of CDs / Hb before and after adding each substance).
  • CDs carbon dots
  • FIG 6 shows the relative fluorescence intensity of the carbon point according to the concentration of hemoglobin, according to an embodiment of the present invention, wherein F0 is the fluorescence intensity of the carbon point solution before hemoglobin addition, F is the carbon point solution of the hemoglobin addition Fluorescence intensity)
  • Figure 7 shows the effect of the reaction time on the fluorescence intensity of the CDs / Hb system according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the fluorescence intensity according to the reaction time of the CDs / Hb / Cho system according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the fluorescence effect according to the pH of the CDs / Hb / Cho system according to an embodiment of the present invention (F0 is the fluorescence intensity of the CDs / Hb solution before cholesterol addition, F is the CDs / Hb after cholesterol addition Fluorescence intensity of the solution).
  • FIG. 10 shows cholesterol detection characteristics according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 10A shows a PL spectrum of a CDs / Hb solution under different concentrations of cholesterol
  • FIG. 10B shows a fluorescence intensity of a CDs / Hb / Cho solution.
  • F0 is the strength of the CDs / Hb solution before cholesterol addition
  • F is the strength of the CDs / Hb solution after cholesterol addition.
  • the present invention includes a carbon dot and hemoglobin chelate-bonded to the surface of the carbon dot, and the fluorescence of the carbon dot is quenched by the binding of the hemoglobin and reacts with cholesterol to react with the carbon.
  • a carbon point-hemoglobin complex characterized in that the fluorescence of a point is enhanced to detect cholesterol.
  • the present invention detects cholesterol by the carbon point and hemoglobin through “quenching-enhance” (off-on) of the carbon point fluorescence.
  • quenching of carbon point fluorescence is formed by the presence of hemoglobin in the carbon point solution, fluorescence of the carbon point is off, and “enhance” is formed by adding cholesterol thereto, and carbon points (CDs) To restore the fluorescence of (on).
  • hemoglobin (Hb) may be detected from 0 to 14 ⁇ M in the fluorescence disappearance process, and 56 to 800 ⁇ M of cholesterol may be detected in the recovery process of the fluorescence.
  • the cholesterol detection time according to the recovery of the fluorescence of the carbon point is 1 to 5 minutes, according to an embodiment of the present invention, the fluorescence emission balance of the carbon point-hemoglobin complex was 1 minute and 30 seconds.
  • the carbon point-hemoglobin complex of the present invention exhibits high selectivity to cholesterol, high detection sensitivity, and fast reaction time.
  • the present invention relates to a composition for detecting cholesterol including the carbon point-hemoglobin complex. .
  • the carbon point-hemoglobin complex of the present invention can detect cholesterol using quenching and recovery of fluorescence.
  • the present invention relates to an optical cholesterol sensor including the carbon point-hemoglobin complex.
  • Carbon dots are a well-known method ( Shoujun Zhu et al., Highly Photoluminescent Carbon Dots for Multicolor Patterning, Sensors, and Bioimaging, Angewandte Chemie International Edition, Volume 52, Issue 14, pages 3953-3957, April 2, 2013.) It was prepared by. Specifically, 0.4 g citric acid (CA) and 270 ⁇ l ethylenediamine (EDA) are dissolved in 80 ml of deionized water, and then the solution is placed in an autoclave and heated at 200 ° C. for 4 hours. In addition, carbon point synthesis was carried out by hydrothermal carbonization reaction. After this reaction, the reactor was naturally cooled to room temperature by water to obtain a transparent reaction product having a brown-red color. Next, carbon dots (CDs) were finally obtained using dialysis. The concentration of the finally obtained CDs solution is approximately 6.13 mg / ml.
  • the obtained CDs solution was diluted in distilled water to a concentration of 0.02 mg / ml. Then, to detect hemoglobin, hemoglobin was added to the CDs solution by concentration (50 ⁇ L, 0.02 mg / ml).
  • the fluorescence intensity was measured in an excited state of 380 nm using a fluorescence spectrophotometer.
  • the selectivity of hemoglobin detection was also tested through the addition of 8 ⁇ M of other metal ions and biocompounds at the same concentration.
  • urea glucose, galactose, L-ascorbic and cholesterol were added to the hemoglobin solution.
  • CDs Carbon Points
  • Figure 2 shows the results of the DLS, it can be seen that the size of the carbon spot is about 1.5-2nm.
  • FIG. 3a is a reference when it shows an FT-IR absorption peak at 2935-2868cm -1 result indicates a antisym and symstretching of CH, 679cm -1 is a peak bending motion of the CH (bending out-of-plane deformation)
  • the carbon dots (CDs) are small in size and have a multifunction group on the surface, they are highly compatible with conjugate compounds and have high solubility with various hydrophilic solvents.
  • the analysis was performed by using UV / vis spectroscopy and photoluminescence spectroscopy.
  • FIG. 3B shows a UV / vis spectrum.
  • the carbon point solution is transparent in normal white light but blue in the ultraviolet region of 365 nm, shows a center peak at 210 nm and 340 nm, and a shoulder peak at 250 nm.
  • 3C and 3D show the results of an analysis according to photoluminescence spectroscopy of carbon dots.
  • a wide color band from blue to yellow-green for different excitation wavelengths is shown. (color band) is shown. It is clear from this that the carbon dots are called multi-colors and can be used for cell labeling, bioimaging, and so on.
  • Figure 4 also shows the selectivity for carbon points and other metal ions (Cu 2+ , Mg 2+ , Na + , Fe 2+ , Fe 3+ ) or biocompounds (Hb, Lys, Glu, Vit.C, Urea). As shown, it was confirmed that the carbon point shows high selectivity for binding to hemoglobin in other metal ions or bio compounds.
  • Figure 5 shows the results of the analysis according to the photoluminescence spectroscopy of (a) carbon dots (CDs), (b) each containing a: CDs, b: CDs and Hb, c: CDs / Hb under ultraviolet light Cholesterol solution, and (c) selectivity of CDs / Hb of cholesterol and different biomolecules (urea, glucose, galactose and L-ascorbic) at the same concentration.
  • CDs carbon dots
  • b each containing a: CDs, b: CDs and Hb
  • c CDs / Hb under ultraviolet light Cholesterol solution
  • selectivity of CDs / Hb of cholesterol and different biomolecules urea, glucose, galactose and L-ascorbic
  • (b) shows the fluorescence changes according to different conditions (CDs, CDs and Hb, CDs / Hb and cholesterol (Cho)). Specifically, CDs and CDs / Cho showed almost similarly high fluorescence, and Hb / Cho showed little fluorescence. In addition, CDs / Hb / Cho showed stronger fluorescence than CDs / Hb, and it was confirmed that the fluorescence intensity increased after adding cholesterol to the CDs / Hb complex.
  • the fluorescence intensity decreases to about 25% of the CDs / Hb complex than the original CDs solution (CDs / Cho), but in the case of cholesterol-linked CDs / Hb / Cho The fluorescence intensity was nearly doubled compared to the CDs / Hb complex fluorescence intensity, which is about 50% less than the original CDs solution.
  • the fluorescence of the carbon dots is quenched as the fluorescence of the carbon dots and the hemoglobin form a complex, and the complex is again bound with cholesterol to enhance fluorescence.
  • cholesterol is an amphiphilic substance with both -OH and alkyl chains, and these cholesterols interact with the iron of the hemoglobin heme group, and the hemoglobin polypeptide chains absorb the hydrophobic portion to the surface through hydrophobic interactions.
  • hemoglobin binds to cholesterol, thereby restoring the fluorescence of carbon dots.
  • the reason why the fluorescence intensity of the carbon spots increased after adding cholesterol to the CDs / Hb complex in FIG. 5 is that the CDs / Hb complex has a ⁇ - ⁇ stacking between the aromatic ring of the carbon spot and the heme group of hemoglobin. Van der Waals forces) because the complex of hemoglobin and cholesterol is thermodynamically more stable than the complex of hemoglobin and carbon points.
  • the energy of hydrophobic interaction is about 40 kJ / mol
  • the energy of van der Waals action is 0.4-4.0 kJ / mol
  • the energy of hydrophobic interaction is 10 times higher than van der Waals action, so that between cholesterol and hemoglobin
  • the carbon dots can be freely released from the hemoglobin complex and the fluorescence of the carbon dots can be recovered.
  • Figure 9 shows the fluorescence effect according to the pH of the CDs / Hb / Cho system, it showed an effect in the pH range of pH 6.2 ⁇ 7.8 is distilled water. Referring to this, it can be seen that the change between the pH 6.4-7.0 in the fluorescence recovery process is minimal, it was confirmed that distilled water can be used as a medium for the bio-sensing system.
  • FIG. 10 shows cholesterol detection characteristics based on the results of FIGS. 6 to 9.
  • FIG. 10A shows PL spectra according to wavelengths when cholesterol of different concentrations were dissolved in a CDs / Hb solution. Referring to this, it was confirmed that the fluorescence intensity gradually recovered as the concentration of cholesterol was increased.
  • Figure 10b shows the fluorescence intensity of the CDs / Hb / Cho solution as a recovery factor F / F0.
  • F and F0 are the fluorescence intensity of CDs / Hb according to the presence or absence of cholesterol at 450 nm, and the logarithm of the fluorescence recovery factor F / F0 is
  • the carbon point-hemoglobin complex of the present invention was confirmed that the high selectivity for cholesterol, high detection sensitivity, fast response time, and can be applied as a simple and economical biosensor, successfully detecting cholesterol in human serum It could be confirmed. It is believed that this invention may contribute to the application of carbon dots, including the study of optical cholesterol sensors, and may be applicable to cell labeling, bioimaging, and printing.

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Abstract

본 발명은 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에 따르면 탄소 점(carbon dot) 및 상기 탄소 점 표면에 킬레이트 결합된 헤모글로빈을 포함하고, 상기 헤모글로빈의 결합으로 상기 탄소 점의 형광이 소멸(quenching)되고, 콜레스테롤과 반응하여 상기 탄소 점의 형광이 복구(enhance)되어 콜레스테롤을 검출하는 것을 특징으로 하는, 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체가 개시된다.

Description

콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체
본 발명은 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체에 관한 것이다.
콜레스테롤(Cho)은 간에서 만들어지는 지방질이고, 몸 전체에 분배되어져 있다. 이것은 스테로이드 호르몬, 비타민 D, 담즙의 전구체이고, 세포막의 중요한 구성성분으로서 인간의 신체에서, 콜레스테롤의 평형 특성은 중요하다. 콜레스테롤의 양이 적정 수준을 초과하게 되면, 혈관에 손상을 입힌다. 이는 심혈관계 질환으로 이끌 수 있다. 콜레스테롤을 탐지하기 위한 분석 방법들은 전기화학적 방법, 박막 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 있다. 그러나 이러한 방법들은 복잡한 절차, 느린 반응 시간, 낮은 선택성, 특이성(specifictiy)과 같은 단점들을 가지고 있다. 그리고 콜레스테롤 센서의 대부분은 콜레스테롤 산화제를 사용한다. 이는 비싸고, 변성이 쉽다는 단점이 있다.
한편, 헤모글로빈(Hb or Hgb)은 신체 내부 곳곳에 산소를 운반하는 적혈구에서 중요한 단백질이다. 이는 거친 구모양이고, 5.5nm의 지름을 가지며, 분자량이 68,000이고 4개의 폴리펩티드 쇄를 함유한다. 각각의 쇄는 Fe2+이온에 킬레이팅된 테트라피롤 환으로 이루어진 4개의 헴 그룹(Heme prosthetic group)에 결합된다.
또 한편, 탄소 점(Carbon dot)은 높은 형광 세기를 가지고, 10nm 이하의 사이즈를 가진 탄소 나노 물질로, 가장자리와 표면에 화학적 그룹을 가지고 있어 친수성을 띠고 있기 때문에 고분자, 단백질 등의 물질과 쉽게 결합하는 특성이 있고, 생체 적합성, 쉬운 합성방법, 무독성, 환경 친화성을 가진다. 따라서 이러한 특성을 이용하여 바이오센서, 약물방출(drug delivery)에 이용되고 있다.
특히 탄소 점은 그 표면구조와 기능 때문에 "off-on" 형광성을 가질 수 있다. 즉, 공역계 시스템을 포함하는 bio-compound와 금속이온이 반데르발스 결합 및 킬레이션을 통해 탄소 점의 표면에 흡수되면 형광성이 소멸(quenching)되어 형광이 "off"되고, 분석 물질과 금속 이온 사이에 결합이 형성되면 형광이 재복구(enhance)되는 것이다. 관련하여, Zeng et al.은 DNA가 형광의 탄소 점과 메틸렌 블루 용액을 퀀칭(quenching)시킨 후에 결정될 수 있다고 보고 한 바 있다. 그러나 탄소 점과 헤모글로빈을 사용하여 "off-on" 형광성을 기반으로 한 콜레스테롤 탐지에 대해서는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 탄소 점 형광의 quenching-enhance 접근법을 통하여 탄소 점과 헤모글로빈에 의해 콜레스테롤을 탐지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.
또한 본 발명은 상기 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 콜레스테롤 검출용 조성물을 제공하는 것을 다른 해결과제로 한다.
또한 본 발명은 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 광학 콜레스테롤 센서를 제공하는 것을 또다른 해결과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,
탄소 점(carbon dot) 및 상기 탄소 점 표면에 킬레이트 결합된 헤모글로빈을 포함하고,
상기 헤모글로빈의 결합으로 상기 탄소 점의 형광이 소멸(quenching)되고, 콜레스테롤과 반응하여 상기 탄소 점의 형광이 복구(enhance)되어 콜레스테롤을 검출하는 것을 특징으로 하는,
콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 제공한다.
또한 상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명은,
상기 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 콜레스테롤 검출용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또다른 과제를 해결하기 위한 본 발명은,
상기 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 광학 콜레스테롤 센서를 제공한다.
상기 본 발명의 탄소 점-헤모글로빈 복합체는 콜레스테롤에 대한 높은 선택성과 높은 검출 민감도 및 빠른 반응시간을 나타낼 수 있어 콜레스테롤을 검출할 수 있는 효과가 있다. 또한 본 발명에 따르면 간단하면서도 경제적으로 콜레스테롤을 검출할 수 있는 바이오센서를 제공할 수 있으며, 특히 의학적 응용이 가능한 바이오센서를 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체의 형광원리를 모식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소 점의 DLS(dynamic light scattering) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소 점의 분석결과를 나타낸 것으로 도 3a는 FT-IR 스펙트럼, 도 3b는 탄소 점의 흡수, 여기-방출에 대한 UV-vis 스펙트럼, 도 3c 및 도 3d는 탄소 점의 광발광분광법에 따른 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소 점과, 다른 금속 이온(Cu2+, Mg2+, Na+, Fe2+, Fe3+) 또는 바이오 컴파운드(Hb, Lys, Glu, Vit.C, Urea)에 대한 결합선택성을 나타낸 것이다(단, F0와 F는 각각의 물질을 첨가하기 전, 후의 탄소점의 형광 세기임)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 탄소 점(CDs)의 광발광분광법에 따른 분석결과를 나타낸 것이고, (b) 자외선 하에서 각각 a: CDs, b: CDs와 Hb, c: CDs/Hb을 포함하는 콜레스테롤 용액을 나타낸 것이며, (c) 같은 농도에서 콜레스테롤과 서로 다른 생체분자들(우레아, 글루코스, 갈락토스 및 L-아스코빅)의 CDs/Hb의 선택성을 나타낸 것이다(단, F0와 F는 각각의 물질을 첨가하기 전, 후의 CDs/Hb의 형광 세기임).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 헤모글로빈의 농도에 따른 탄소 점의 상대적 형광 세기를 나타낸 것이다(단, F0는 헤모글로빈 첨가 전 탄소 점 용액의 형광 세기, F는 헤모글로빈 첨가 후 탄소 점 용액의 형광 세기임)
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CDs/Hb 시스템의 형광 세기에 있어서 반응시간의 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 CDs/Hb/Cho 시스템의 반응 시간에 따른 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 CDs/Hb/Cho 시스템의 pH에 따른 형광 효과를 나타낸 것이다(단, F0는 콜레스테롤 첨가 전 CDs/Hb 용액의 형광 세기, F는 콜레스테롤 첨가 후 CDs/Hb 용액의 형광 세기임).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 콜레스테롤 탐지 특성을 나타낸 것으로, 도 10a는 서로 다른 농도의 콜레스테롤 하에서 CDs/Hb 용액의 PL 스펙트럼을, 도 10b는 CDs/Hb/Cho 용액의 형광세기를 나타낸 것이다(단, F0는 콜레스테롤 첨가 전 CDs/Hb 용액의 세기, F는 콜레스테롤 첨가 후 CDs/Hb 용액의 세기임).
이하 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 일 양태로서, 탄소 점(carbon dot) 및 상기 탄소 점 표면에 킬레이트 결합된 헤모글로빈을 포함하고, 상기 헤모글로빈의 결합으로 상기 탄소 점의 형광이 소멸(quenching)되고, 콜레스테롤과 반응하여 상기 탄소 점의 형광이 복구(enhance)되어 콜레스테롤을 검출하는 것을 특징으로 하는 탄소 점-헤모글로빈 복합체에 관한 것이다.
이와 같이 본 발명은 탄소 점 형광의 "quenching-enhance"(off-on)를 통하여 탄소 점과 헤모글로빈에 의해 콜레스테롤을 검출하게 된다. 구체적으로 탄소 점 형광의 "quenching"은 탄소 점 용액에 헤모글로빈이 존재함으로써 형성되고, 탄소 점의 형광은 소멸(off)하며, "enhance"는 여기에 콜레스테롤을 첨가하면서 형성되고, 탄소 점(CDs)의 형광을 복구하게 된다(on).
이 때, 상기 형광의 소멸 과정에서 헤모글로빈(Hb)은 0~14 μM까지 검출될 수 있고, 상기 형광의 복구 과정에서 56~800μM의 콜레스테롤을 검출할 수 있다.
또한 상기 탄소 점의 형광이 복구됨에 따른 콜레스테롤 검출 시간은 1~5분으로, 본 발명의 실시예에 따르면 탄소 점-헤모글로빈 복합체의 형광 발광 균형이 1분 30초인 것으로 나타났다.
이와 같이 본 발명의 탄소 점-헤모글로빈 복합체는 콜레스테롤에 대한 높은 선택성과 높은 검출 민감도, 빠른 반응시간을 나타내는 바, 다른 양태로서 본 발명은 상기 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 콜레스테롤 검출용 조성물에 관한 것이다.
또한 상기 본 발명의 탄소 점-헤모글로빈 복합체는 형광의 소멸 및 복구를 이용하여 콜레스테롤을 검출할 수 있는 바, 또다른 양태로서 본 발명은 상기 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 광학 콜레스테롤 센서에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하나 본 발명이 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
탄소 점 준비
탄소 점은 기존의 보고된 방법(Shoujun Zhu et al., Highly Photoluminescent Carbon Dots for Multicolor Patterning, Sensors, and Bioimaging, Angewandte Chemie International Edition, Volume 52, Issue 14, pages 3953-3957, April 2, 2013.)으로 제조하였다. 구체적으로, 0.4g 시트르산(Citric acid, CA)과 270μl 에틸렌디아민(Ethylene diamine, EDA)을 증류수(Deionized water) 80ml에 용해시키고, 이후 이 용액을 오토클레이브에 넣은 다음 4시간 동안 200℃의 열을 가해주어 hydrothermal carbonization 반응으로 탄소 점 합성반응을 진행하였다. 이 반응 후, 반응기는 물에 의해 자연스럽게 실온까지 냉각되고, 갈색-붉은색을 가지면서 투명한 반응생성물을 얻었다. 다음으로 투석을 이용하여 최종적으로 탄소 점(Carbon dots, CDs)을 얻었다. 최종적으로 얻어진 CDs 용액의 농도는 대략 6.13mg/ml 이다.
헤모글로빈 탐지
상기 얻어진 CDs 용액을 증류수에 희석 시켜 0.02mg/ml의 농도로 만들었다. 그리고 나서 헤모글로빈을 탐지하기 위하여, 헤모글로빈을 농도 별로 CDs 용액에 첨가하였다(50μL, 0.02 mg/ml).
그 후, 형광 세기를 형광 분광광도계(fluorescence spectrophotometer)를 이용하여 380nm의 여기 상태에서 측정하였다.
또한 헤모글로빈 탐지의 선택성은 같은 농도인 8μM의 다른 금속 이온과 바이오 컴파운드의 첨가를 통해 실험되었다.
콜레스테롤 탐지
어세이(assay)에 상기에서 제조된 CDs 용액(0.02mg/ml)의 50μL를 헤모글로빈(10μM) 용액 3mL에 첨가시켰다. 그리고 나서, 콜레스테롤 농도 별로 헤모글로빈 용액에 첨가시켰다. 형광 세기는 헤모글로빈 탐지 시험과 동일 조건에서 기록하였다.
또한 콜레스테롤 탐지의 선택성에 대해 조사하기 위해서, 우레아, 글루코스, 갈락토스, L-아스코빅 및 콜레스테롤을 헤모글로빈 용액에 첨가하였다.
상기 모든 시험은 적어도 세 번씩 반복했고, 실온에서 진행하였다.
또한, 사람의 혈청을 이용한 시험을 위하여, 혈액은 큰 분자와 단백질을 제거하기 위해서 20분간 5000 rpm으로 원심 분리하여 이용되었다.
결과
1. 탄소 점(CDs)의 구조적, 광학적 특징
탄소 점의 크기와 형태를 관찰하기 위해 동적 광산란법(Dynamic light scattering; DLS)을 이용하였다.
도 2는 DLS의 결과를 나타낸 것으로, 탄소 점의 크기는 약 1.5-2nm라는 것을 알 수 있다.
화학적인 구조의 확인을 위하여, 퓨리에 변환 적외분광법(Fourier transform infrared; FT-IR)을 사용하였다. 도 3a는 FT-IR 결과를 나타낸 것으로 이를 참고하면 2935-2868cm-1에서의 흡수 피크는 CH의 antisym과 symstretching을 나타내고, 679cm-1 피크는 CH의 굽힘 운동(bending out-of-plane deformation)을 나타내며, 1637cm-1 피크는 C=C, C=O 신축 운동을 나타내는 진동 밴드이다. 또한 C-N과 N-H 신축운동은 각각 1262cm-1, 3296-3386cm-1에서 피크를 나타내었고, 이는 탄소 점(CDs)의 표면에 아민기가 도핑(doping)되었음을 의미한다.
또한 탄소 점(CDs)은 크기가 작고, 표면에 다관능 그룹(multifunction group)을 가지고 있기 때문에, 컨쥬게이트 화합물과 높은 적합성을 가지며, 다양한 친수성 용매와 높은 용해성을 가진다. 이러한 탄소 점(CDs)의 화학적 구조와 형광발광을 확인하기 위하여, 자외선 및 가시광선 분광분석법(UV/vis spectroscopy)과 광발광분광법(photoluminescence spectroscopy)을 이용하여 분석하였다.
구체적으로 도 3b는 UV/vis 스펙트럼을 나타낸 것으로 이를 참고하면, 탄소 점 용액은 일반 백색광에서는 투명하나 365nm의 자외선 영역에서는 파란색을 나타내며, 210nm, 340nm에서 center peak를 보이고, 250nm에서 shoulder peak를 보인다. 이 때, 210nm와 250nm의 피크는 방향족 C=C 결합의 n-π*와 π*-π* 전이에 탄소 점의 광발광분광법에 따른 분석결과에 의해 나타난다. 또한 340nm부근에서의 넓은 피크는 탄소 점 표면에 있는 작용기의 n-π* 전이에 의해 나타난다(C=O, C=N 결합).
또한 도 3c 및 도 3d는 탄소 점의 광발광분광법에 따른 분석결과를 나타낸 것으로 이를 참고하면, 탄소 점의 작은 크기와 작용기를 기반으로 하여, 다른 여기 파장에 대해 파란색에서 노랑-초록까지 넓은 컬러 밴드(color band)를 나타내었다. 이로부터 탄소 점이 multi-color라고 불리며 세포 라벨링, 바이오 이미징 등에 이용될 수 있음을 분명히 확인할 수 있다.
또한 도 4는 탄소 점과 다른 금속 이온(Cu2+, Mg2+, Na+, Fe2+, Fe3+) 또는 바이오 컴파운드(Hb, Lys, Glu, Vit.C, Urea)에 대한 선택성을 나타낸 것으로, 탄소 점은 다른 금속이온이나 바이오 컴파운드에 있어서 헤모글로빈과의 결합에 대한 높은 선택성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
2. 탄소 점(CDs)과 헤모글로빈(Hb)의 복합체(CDs/Hb)의 발광 특징
또한 탄소 점(CDs)과 헤모글로빈(Hb)의 복합체의 "quenching-enhance" 형광 발광 메커니즘과, 상기 복합체를 기반으로 한 콜레스테롤 탐지를 확인하고 그 결과를 도 5 내지 도 10에 나타내었다.
구체적으로, 도 5는 (a) 탄소 점(CDs)의 광발광분광법에 따른 분석결과를 나타낸 것이고, (b) 자외선 하에서 각각 a: CDs, b: CDs와 Hb, c: CDs/Hb을 포함하는 콜레스테롤 용액을 나타낸 것이며, (c) 같은 농도에서 콜레스테롤과 서로 다른 생체분자들(우레아, 글루코스, 갈락토스 및 L-아스코빅)의 CDs/Hb의 선택성을 나타낸 것이다.
도 5(a),(b)를 참고하면 다른 조건(CDs, CDs 와 Hb, CDs/Hb 및 콜레스테롤(Cho))에 따라 바뀌는 형광발광을 보여주고 있다. 구체적으로, CDs와 CDs/Cho는 거의 유사하게 높은 형광발광을 나타내었고, Hb/Cho는 거의 형광을 나타내지 않았다. 또한 CDs/Hb에 비하여 CDs/Hb/Cho가 보다 강한 형광발광을 나타내었는 바, CDs/Hb 복합체에 콜레스테롤을 첨가한 후에, 형광세기가 증가했다는 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 헤모글로빈(Hb)이 6μM 존재할 때, 원래의 CDs 용액(CDs/Cho)보다 CDs/Hb 복합체가 약 25% 수준으로 형광세기가 감소하였으나, 콜레스테롤과 결합한 CDs/Hb/Cho의 경우에는 CDs/Hb 복합체 형광세기에 비하여 2배 가까이 향상된 형광세기를 나타내었고, 이는 원래의 CDs 용액보다는 50%정도의 감소한 형광세기이다.
또한 도 5(c)를 참고하면, 같은 농도에서 콜레스테롤과 서로 다른 생체분자들(우레아, 글루코스, 갈락토스 및 L-아스코빅)에 있어서 CDs/Hb는 특히 콜레스테롤에 현저하게 높은 선택성을 나타냄을 확인할 수 있다.
이러한 결과로부터 도 1에 나타낸 바와 같이, 탄소 점의 형광은 탄소 점과 헤모글로빈이 복합체를 형성함에 따라, 탄소 점의 형광이 소멸(quenching)되고, 상기 복합체는 다시 콜레스테롤과 결합하면서 형광이 복구(enhancing)되는 것을 분명히 확인할 수 있다. 즉, 콜레스테롤은 -OH기와 알킬 체인을 모두 가지고 있는 양친매성물질이고, 이러한 콜레스테롤은 헤모글로빈 헴 그룹의 철과 상호작용을 하며, 헤모글로빈의 폴리펩타이드 체인은 소수성 상호작용을 통하여 표면으로 소수성 부분을 흡수하게 되는 바, CDs/Hb 복합체에 있어서 헤모글로빈은 콜레스테롤과 결합하게 되고 이를 통해 탄소 점의 형광성을 복구하게 되는 것이다.
또한 이와 같이 도 5에 있어서 CDs/Hb 복합체에 콜레스테롤을 첨가한 후 탄소 점의 형광 세기가 증가한 다른 이유는, CDs/Hb 복합체는 탄소 점의 방향족 고리와 헤모글로빈의 헴 그룹 사이에 π-π stacking(반데르발스 힘)을 형성하는 바, 헤모글로빈과 콜레스테롤의 복합체가 헤모글로빈과 탄소 점의 복합체보다 열역학적으로 안정하기 때문이다. 즉, 소수성 상호작용의 에너지는 약 40 kJ/mol이고, 반데르발스 작용의 에너지는 0.4~4.0 kJ/mol로서 소수성 상호작용의 에너지가 반데르발스 작용보다 10배 더 높으므로, 콜레스테롤과 헤모글로빈 사이의 결합으로 탄소 점과 헤모글로빈 복합체로부터 탄소 점을 자유롭게 방출하여 탄소 점의 형광성을 복구할 수 있게 되는 것이다.
3. 탄소 점(CDs)과 헤모글로빈(Hb)의 복합체(CDs/Hb)의 콜레스테롤 탐지
도 6은 서로 다른 농도의 헤모글로빈을 동일한 농도의 탄소 점 용액에 용해시킨 후, 헤모글로빈의 농도에 따른 탄소 점의 상대적 형광 세기를 나타낸 것이다. 이를 참고하면, 탄소 점 용액의 농도가 0.002mg/mL를 기준으로, 헤모글로빈의 농도가 6μM일 때 형광 발광 세기가 거의 소멸되는 것으로 확인되었다.
또한 도 7은 상기 도 6의 결과를 바탕으로, 상기 농도가 0.002mg/mL인 탄소 점 용액에, 각기 다른 농도의 헤모글로빈(2 μM, 12 μM)을 첨가한 후, 탄소 점의 반응시간을 측정하여 나타낸 것이다. 이를 참고하면, CDs/Hb 복합체의 형광 발광 균형이 1분 30초에 도달하는 것을 확인할 수 있는 바, 이로부터 탐지 시간은 1분 30초임을 증명할 수 있다.
또한 도 8은 CDs/Hb/Cho 시스템의 반응 시간에 따른 형광 세기를 나타낸 것으로, 이를 참고하면 상기 도 6과 마찬가지로 CDs/Hb/Cho 시스템의 형광 발광 균형이 1분 30초에 도달하는 것을 확인할 수 있는 바, 이로부터 콜레스테롤 탐지 시간은 1분 30초임을 확인할 수 있다.
또한 도 9는, CDs/Hb/Cho 시스템의 pH에 따른 형광 효과를 나타낸 것으로, 증류수의 pH인 pH 6.2~7.8 범위에서의 효과를 나타내었다. 이를 참고하면, 형광의 복구 과정에 있어서 pH 6.4-7.0 사이에 변화가 미미하다는 것을 알 수 있는 바, 증류수를 바이오 센싱 시스템을 위한 매체로 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한 도 10은 상기 도 6 내지 도 9의 결과를 기초로 한 콜레스테롤 탐지 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 10a는 서로 다른 농도의 콜레스테롤을 CDs/Hb 용액에 용해하였을 때, 파장에 따른 PL 스펙트럼을 나타낸 것으로 이를 참고하면, 콜레스테롤의 농도가 증가됨에 따라 형광 세기가 점차 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 10b는 CDs/Hb/Cho 용액의 형광세기를 회복 인자인 F/F0로 나타낸 것이다. F와 F0는 450nm에서 콜레스테롤의 유무에 따른 CDs/Hb의 형광세기로, 형광회복인자 F/F0의 로그값은 다음과 같다.
Figure PCTKR2016009440-appb-I000001
X는 콜레스테롤 탐지 농도로서 R=0.990에서 0에서 800 μM의 범위이고, 탐지 한계(Limit of Detection)은 56 μM으로 측정되었다. 구체적으로 측정된 x 값은 각각 0, 20.6, 103.2, 206.4, 309.6, 412.8, 619.2, 722.4, 825.6 μM으로, Y축의 형광세기의 결과를 통해, X값을 측정하였고, 이를 통해, 콜레스테롤 탐지의 선형 범위는 0 ~ 800 μM으로 확인되었다. 이 때, 상기 R은 선형성을 의미하는 것으로, 도 10b에서 원점이 직선에서 벗어난 정도를 의미하며 편차가 작을수록 R의 값은 1에 가까워지는 바, R=0.990으로 확인되었음은 편차가 작음을 의미하는 것이다. 이러한 콜레스테롤 탐지 범위는, 종래 콜레스테롤 센서의 탐지 범위 및 탐지 한계와 비교하여 매우 낮은 값으로서, 본 발명의 CDs/Hb 복합체가 콜레스테롤 검출 센서로서 매우 높은 민감도를 가짐을 확인할 수 있었다.
상기 실시예의 결과로부터 본 발명의 탄소 점-헤모글로빈 복합체는 콜레스테롤에 대한 높은 선택성과 높은 검출 민감도, 빠른 반응시간, 간단하면서도 경제적인 바이오센서로서 적용가능한 것을 확인할 수 있었고, 성공적으로 인체 세럼에서 콜레스테롤을 탐지할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 본 발명은 광학적 콜레스테롤 센서의 연구를 비롯, 탄소 점의 응용에 기여할 수 있고, 세포 라벨링, 바이오 이미징, 및 프린팅에도 적용가능할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해하여야 한다.

Claims (5)

  1. 탄소 점(carbon dot) 및 상기 탄소 점 표면에 킬레이트 결합된 헤모글로빈을 포함하고,
    상기 헤모글로빈의 결합으로 상기 탄소 점의 형광이 소멸(quenching)되고, 콜레스테롤과 반응하여 상기 탄소 점의 형광이 복구(enhance)되어 콜레스테롤을 검출하는 것을 특징으로 하는,
    콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 복합체는 56~800μM의 콜레스테롤을 검출하는 것을 특징으로 하는, 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 탄소 점의 형광이 복구됨에 따른 콜레스테롤 검출 시간은 1~5분인 것을 특징으로 하는, 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 콜레스테롤 검출용 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 탄소 점-헤모글로빈 복합체를 포함하는 광학 콜레스테롤 센서.
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