WO2017155044A1 - ２次変異検出方法、及び２次変異検出キット - Google Patents

２次変異検出方法、及び２次変異検出キット Download PDF

Info

Publication number
WO2017155044A1
WO2017155044A1 PCT/JP2017/009501 JP2017009501W WO2017155044A1 WO 2017155044 A1 WO2017155044 A1 WO 2017155044A1 JP 2017009501 W JP2017009501 W JP 2017009501W WO 2017155044 A1 WO2017155044 A1 WO 2017155044A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ret
tyrosine kinase
secondary mutation
mutation
vandetanib
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/009501
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆志 河野
功一 後藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Original Assignee
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Cancer Center Japan, National Cancer Center Korea filed Critical National Cancer Center Japan
Publication of WO2017155044A1 publication Critical patent/WO2017155044A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a secondary mutation of the RET tyrosine kinase in a sample derived from a patient treated with a RET tyrosine kinase inhibitor, and a secondary mutation detection kit.
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • LADC lung adenocarcinoma
  • SKI tyrosine kinase inhibitor
  • most cancers eventually acquire resistance to targeted therapies and present major limitations to long-term clinical utility.
  • Secondary mutations in the target kinase are a major cause of drug resistance. For example, mutations that confer resistance to drugs in ALK and ROS1 kinase sterically hinder TKI binding.
  • the T790M mutation in EGFR results in resistance by increasing affinity for ATP.
  • RET kinase gene fusion positive lung cancer therapeutic effect by RET inhibitor is expected.
  • cancer cells acquire treatment resistance, there is a concern that the duration of the effect will be shortened. For this reason, it is considered that an important issue in treatment is how the molecular mechanism expresses resistance, how to understand it, and how to overcome it.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is capable of predicting or grasping treatment resistance in RET tyrosine kinase inhibitor treatment, and can impart further treatment selectivity. It is an object to provide a method for detecting a secondary mutation of a kinase and a secondary mutation detection kit.
  • a method for detecting a secondary mutation of the RET tyrosine kinase in a sample derived from a patient who has been treated with a RET tyrosine kinase inhibitor comprising the step of detecting the S904F mutation of the RET tyrosine kinase in the sample.
  • a method for detecting a secondary mutation comprising:
  • a kit for detecting a secondary mutation of the RET tyrosine kinase in a sample derived from a patient treated with a RET tyrosine kinase inhibitor, which encodes an amino acid sequence containing S904F of the RET tyrosine kinase A secondary mutation detection comprising at least one selected from the group consisting of a primer set for amplifying a gene, a probe that specifically hybridizes to the amplification product or mRNA of the gene, and an S904F-specific binding substance kit.
  • treatment resistance in RET tyrosine kinase inhibitor treatment can be predicted or grasped, and further treatment selectivity can be imparted.
  • FIG. 6 shows the deduction of the interaction between vandetanib and F735 in non-mutated RET and S904F mutant. It is the result of performing in vitro kinase assay by increasing the ATP concentration from 3.125 to 400 nM using the purified RET kinase domain of the S904F mutant and the purified non-mutated RET kinase domain. It is the result of the drug sensitivity test using the in vitro kinase assay and Ba / F3 cell in vandetanib, cabosantinib, ponatinib, lenvatinib, and alectinib.
  • the secondary mutation detection kit of the present invention is a kit for detecting a secondary mutation of the RET tyrosine kinase in a sample derived from a patient who has been treated with a RET tyrosine kinase inhibitor, and comprises SRETF of RET tyrosine kinase. At least one selected from the group consisting of a primer set for amplifying a gene encoding an amino acid sequence containing the above, a probe that specifically hybridizes to the amplification product of the gene or mRNA, and an S904F-specific binding substance.
  • RET (Rearranged Duration Transfection) tyrosine kinase is also called a RET receptor tyrosine kinase, and is a protein encoded by a gene seated at 10q11.2 in humans.
  • the polynucleotide encoding the RET tyrosine kinase protein according to the present invention is not particularly limited as long as it is derived from human. However, the 1217582-1270862th DNA in the genomic sequence specified by Genbank accession number NT — 03985.7 Examples include genes consisting of sequences.
  • the RET tyrosine kinase protein according to the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a human, and examples thereof include those consisting of an amino acid sequence encoded by the above-described gene.
  • the present inventors conducted a transcriptome sequencing of thirty cases of lung adenocarcinoma between kinesin family member 5B (KIF5B) gene and RET receptor tyrosine kinase oncogene (RET gene). In-frame fusion transcripts were identified. This fusion gene was generated by an inversion between the chromosome 10 p11 and q11 regions. This KIF5B-RET gene fusion was detected in 6/319 (2%) of Japanese lung adenocarcinoma, but all of the 6 cases where the gene fusion was detected were known as EGFR mutation, KRAS mutation and ALK fusion. Showed no oncogene-activating mutation.
  • KIF5B kinesin family member 5B
  • RET gene RET receptor tyrosine kinase oncogene
  • this fusion transcript was also present in American lung adenocarcinoma (1/80 (1%)). From these facts, it was revealed that the gene fusion is a responsible mutation (driver mutation) in canceration in a wide variety of races (see Patent Document 1). In thyroid cancer, CCDC6-RET gene fusion has been identified.
  • the target RET tyrosine kinase is preferably a RET fusion kinase.
  • the patient may be not only a human suffering from cancer but also a human suspected of suffering from cancer.
  • the “cancer” to which the method of the present invention is applied is preferably a cancer in which the expression of the RET gene is observed, and more preferably a cancer in which the expression of the fusion gene of the KIF5B gene or CCDC6 gene and the RET gene is observed.
  • cancer include skin cancer, lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer, prostate cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, spleen cancer, testicular cancer, etc., and lung cancer or thyroid gland Cancer is preferred, non-small cell lung cancer is more preferred, and lung adenocarcinoma is particularly preferred.
  • Examples of the patient-derived samples mentioned above include biological samples such as cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive fluid, sputum, alveolar / bronchial lavage fluid, urine, stool, etc .; nucleic acids obtained from these biological samples Examples include extracts (genomic DNA extracts, mRNA extracts, cDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts. Further, the sample may be subjected to formalin fixation treatment, alcohol fixation treatment, freezing treatment, or paraffin embedding treatment.
  • the RET tyrosine kinase inhibitor used for treatment is preferably a substance that directly inhibits the function of RET tyrosine kinase from the viewpoint that drug resistance is exhibited by a secondary mutation occurring in RET tyrosine kinase. More preferably, it is an ATP antagonist.
  • Such inhibitors include 4- (4-bromo-2-fluoroanilino) -6-methoxy-7- (1-methylpiperidin-4-ylmethoxy) quinazoline (generic name: Vandetanib); VEGFR, EGFR and Compound targeting RET), 4- [4- [3- [4-Chloro-3- (trifluoromethyl) phenyl] ureido] phenoxy] -N-methylpyridine-2-carboxamide (generic name: Sorafenib) ); Compounds targeting BRAF, RET, etc.), N- [2- (diethylamino) ethyl] -5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indole- 3-Ilidene) methyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide mono [(2S) -2-hydro Xisuccinate] (generic name: sun
  • the present inventors have revealed that the 2902 cytosine of the RET tyrosine kinase gene is mutated to thymine in peripheral blood derived from a patient who showed resistance to TKI. .
  • This secondary mutation occurred in the RET allele of the recurrent tumor and was confirmed to result in a serine to phenylalanine substitution (S904F) at codon 904.
  • S904F serine to phenylalanine substitution
  • the secondary mutation detection kit of the present invention is a kit that recognizes S904F of RET tyrosine kinase.
  • a primer set for amplifying a gene encoding an amino acid sequence containing S904F of RET tyrosine kinase a probe that specifically hybridizes to the amplification product or mRNA of the gene, and a S904F-specific binding substance. It contains at least one selected from the group.
  • the kit of the present invention may comprise a primer set for amplifying a gene encoding an amino acid sequence containing S904F of RET tyrosine kinase.
  • the presence or absence of secondary mutation can be evaluated by sequencing the amplification product obtained using such a primer set.
  • a plurality of primer sets including a primer set for amplifying other cancer genes or tumor suppressor genes are used to simultaneously amplify a plurality of gene regions by multiplex PCR.
  • a multi-item diagnosis including the presence or absence of the S904F mutation may be performed by a sequencer.
  • the presence or absence of mutation can also be evaluated by examining the change in the electrophoretic mobility of the amplification product obtained using such a primer set using SSCP (single-chain conformation polymorphism).
  • SSCP single-chain conformation polymorphism
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LAMP Loop-Mediated Amplificative Amplification
  • TRC Translation Reverse-Transcribation Consolidated
  • SDA String Displacement Amplification
  • TMA Transsc iption Mediated Amplification
  • SMAP Stem Amplification Process
  • RPA Recombines polymerase amplification
  • HDA Helicase-dependent amplification
  • the kit of the present invention may include a probe that specifically hybridizes to an amplification product or mRNA of a gene encoding an amino acid sequence containing S904F of RET tyrosine kinase.
  • the probe may have various chemical modifications for the purpose of improving stability, specificity during hybridization, and the like.
  • the phosphate residue may be substituted with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc.
  • at least one part may be comprised with nucleic acid analogs, such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the probe may be immobilized on a solid phase.
  • the solid phase include beads, a plate substrate, and a film.
  • the probe may be fixed to the surface of a plate-like substrate to form a microarray.
  • RNA is extracted from a cancer tissue sample, labeled with a fluorescent substance, hybridized with the microarray, and RNA bound to the probe on the microarray is detected, so that the RET tyrosine kinase gene is detected in the cancer tissue. Secondary mutations can be detected.
  • a primer set for amplifying a gene encoding an amino acid sequence containing S904F of RET tyrosine kinase and a probe that specifically hybridizes to an amplification product of a gene encoding an amino acid sequence containing S904F of RET tyrosine kinase are used.
  • the presence or absence of secondary mutation may be quantitatively evaluated by real-time PCR.
  • the kit of the present invention may comprise a specific binding substance for the RET tyrosine kinase S904F mutant protein.
  • the specific binding substance include antibodies, antibody fragments, aptamers and the like.
  • the antibody can be produced, for example, by immunizing an animal such as a mouse with the above S904F mutant protein as an antigen. Alternatively, it can be prepared by screening an antibody library such as a phage library.
  • antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like.
  • the above antibody or antibody fragment may be polyclonal or monoclonal.
  • An aptamer is a substance having a specific binding ability to a labeling substance.
  • examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • the nucleic acid aptamer having a specific binding ability to the above protein can be selected by, for example, a systematic evolution, of a ligand, a bye, an exponential enrichment (SELEX) method, or the like.
  • the peptide aptamer having a specific binding ability to the above-mentioned S904F mutant protein can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • the specific binding substance is not particularly limited as long as it can specifically bind to the above-described S904F mutant protein, and may be a commercially available one.
  • the presence of the above-mentioned S904F mutant protein can be detected by immunostaining a sliced specimen of fixed cancer tissue using the above-mentioned specific binding substance.
  • the detection of the presence of the protein may be performed by Western blotting, ELISA, or flow cytometry analysis.
  • the secondary mutation detection method of the present invention is a method for detecting a secondary mutation of the RET tyrosine kinase in a sample derived from a patient who has been treated with a RET tyrosine kinase inhibitor, wherein the RET tyrosine kinase in the sample is detected.
  • a step of detecting an S904F mutation is a method for detecting a secondary mutation of the RET tyrosine kinase in a sample derived from a patient who has been treated with a RET tyrosine kinase inhibitor, wherein the RET tyrosine kinase in the sample.
  • the detection step is not particularly limited as long as it detects the S904F mutation of RET tyrosine kinase.
  • the S904F mutation can be detected at the gene level or protein level using the secondary mutation detection kit described above. Detection of secondary mutation at the gene level can be performed by RT-PCR, DNA array analysis, Northern blotting, in situ hybridization, and the like. Detection of secondary mutations at the protein level can be performed by immunostaining, ELISA, Western blotting, flow cytometry analysis, and the like.
  • Example 1 A 57-year-old Japanese woman (hereinafter referred to as patient) was diagnosed with LADC by mediastinal lymph node metastasis by bronchoscopy and mediastinoscopy. The patient received concurrent chemotherapeutic chemotherapy with cisplatin and vinorelbine and showed a partial response. However, it caused multiple bone metastases after 2 years. This patient received second to sixth chemotherapy consisting of gefitinib, pemetrexed, docetaxel, gemcitabine, and S-1. During the sixth chemotherapy, he developed right cervical lymphadenopathy (see arrow on left in FIG. 1). That is, LADC has recurred after receiving some chemotherapy.
  • This patient is based on detection of CCDC6-RET using RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), and is a doctor-led clinical trial LURET (Lung Cancer with RET Realrangement Study 001: clinical trial registered by the inventors). Registered with. Administration of 300 mg vandetanib was started daily, and the tumor size decreased 3 months later (see the middle arrow in FIG. 1), but another cervical lymphadenopathy developed 6 months after the start of administration, and LADC recurred (See right arrow in Fig. 1).
  • 2902 cytosine is mutated to thymine only in advanced peripheral blood by sequence analysis using Sanger method in peripheral blood before treatment with vandetanib and genomic DNA and RT-PCR products obtained from advanced peripheral blood It became clear that This mutation occurred in the RET allele of the recurrent tumor and was confirmed to result in a substitution of codon 904 from serine to phenylalanine (S904F) (see FIG. 4).
  • Example 2 From the results of crystal structure analysis using a co-crystal of RET kinase formed in a complex with vandetanib, the dynamic structures of non-mutated RET and S904F mutant RET formed in a complex with vandetanib were simulated. Overlapping structures with an average of 2 nanoseconds observed in 50 ns ⁇ 15 simulations focused on F735, S / F904, and vandetanib (see FIG. 5). The results of structural analysis revealed that the glycine rich loop (GRL) in the RET kinase domain, particularly the side chain of phenylalanine 735, controls ATP binding ability.
  • GRL glycine rich loop
  • FIGS. 6-8 suggested that the RET-S904F mutation was responsible for vandetanib resistance. Moreover, when IC 50 and GI 50 values were measured in in vitro kinase assay and drug sensitivity tests using Ba / F3 cells, the RET-S904F mutant was found not only in vandetanib, but also in cabantinib, ponatinib, lenvatinib, and alectinib Resistance was shown (see FIG. 11).
  • the new conformational isomer named Intermediate is characterized by a protrusion toward the drug binding site on the side chain of GRL F735.
  • the interaction between vandetanib and F735 in non-mutated RET and S904F mutant was deduced (see FIG. 9).
  • the average structure of F735 and vandetanib generated from the simulation of 50 ns ⁇ 15 was represented by a space filling model of thick stick and collie-polling-coltan (see FIG. 9).
  • the interatomic distance between the carbon atom ⁇ in F735 and the carbon atom of the methyl group in 7bandetanib is the unmutated, open / closed isomer in the open / closed conformer.
  • the S904F mutant in the closed stereoisomer and the S904F mutant in the Intermediate stereoisomer were 14.8 ⁇ 3.88, 13.9 ⁇ 4.0 ⁇ , 5.1 ⁇ 0.9 ⁇ , respectively. .
  • the concentration of ATP was increased to 3.125 to 400 nM, and an in vitro kinase assay was performed (see FIG. 10).
  • the obtained data was applied to the Michaelis-Menten equation to calculate K m [ATP] .
  • the K m [ATP] of the unmutated RET kinase domain was 38.11 ⁇ M, and the K m [ATP] of the RET kinase domain of the S904F mutant was 27.25 ⁇ M.
  • the enzymatic kinetics of the non-mutated RET protein and the S904F mutant RET protein and the inhibition constant of vandetanib were calculated (see FIG. 12).
  • the purified S904F mutant kinase domain had a lower dissociation constant (Km [ATP] ) and a higher catalytic constant ( Kcat ) for ATP than the non-mutant.
  • Km [ATP] dissociation constant
  • Kcat catalytic constant
  • FIG. 13 shows the free energy ( ⁇ G) in the conformation of RET kinase formed into a complex with vandetanib. From the calculated free binding energy ( ⁇ G), the affinity of vandetanib for the RET kinase domain in the Intermediate conformer isomer (Intermediate in FIG. 13) may be significantly lower than the affinity in the open / closed conformer. It was suggested. This is consistent with the fact that the inhibition constant (Ki) of S904F for vandetanib is higher than that of the non-mutant (see FIG. 12).
  • FIG. 14 shows the structural differences between the non-mutant complexed with vandetanib and the S904F mutant by molecular dynamics simulation on a long time scale (1 ⁇ s).
  • the average structures of E734, F735, R770, D771, S / F904, pY905, K907, R912, and vandetanib were created by 1 ⁇ s ⁇ 3 simulations and expressed in thick stick.
  • Substitution of serine to phenylalanine at residue 904 reduced the flexibility of the activation loop containing R912.
  • the kinetic characteristics of this S904F mutant resulted in the formation of hydrogen bonds between E734-R912.
  • the Intermediate conformational isomer was generated by an allosteric structural change caused by the S904F mutation that interacts with vandetanib.
  • Intermediate conformational isomers are stabilized by this unusual hydrogen bond network.
  • the network structure of hydrogen bonds consisting of E734, D771, and R912 is important for the formation of open / closed conformational isomers, and between WT (non-mutant) and S904F mutants. It was shown to be different.
  • FIG. 15 shows the standard deviation (RMSF) of fluctuation of the main chain C ⁇ atom in residues 715 to 745 and 900 to 935 of RET complexed with vandetanib.
  • the RMSF value was calculated using a molecular dynamic orbit of 1 ⁇ s ⁇ 3.
  • the S904F mutation reduced flexibility at residues 733-735 in the glycine rich loop (GRL) in addition to reducing flexibility at residues 910-915 in the activation loop (positions are indicated by arrows). .
  • GRL glycine rich loop
  • FIG. 14 from the abnormal molecular dynamics characteristics of the S904F mutant, the side chain of F735 adjacent to E734 protrudes, thereby deforming the hydrogen bonding network and reducing the affinity for the drug.
  • RET secondary mutations in cancers arising in patients treated with RET TKI have been found for the first time.
  • the S904F mutation is a novel mutation related to drug resistance. This mutation creates new conformational isomers that mediate many allosteric effects, destabilize the binding of vandetanib and increase the affinity for ATP. In particular, new conformational isomers are thought to have occurred only when the mutant RET protein interacts with vandetanib.
  • the RET mutation found in the present invention causes a structural change only when interacting with the drug, leading to drug resistance it is conceivable that.
  • RET tyrosine kinase inhibitors are being actively developed by domestic and foreign pharmaceutical companies, and there are already several FDA approved drugs. In the future, since it is highly likely that a drug capable of overcoming treatment resistance will be found, the present invention is considered to have extremely high industrial utility value.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤治療における治療抵抗性の予測又は把握をすることができ、更なる治療選択性を付与することができるＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法、及び２次変異検出キットを提供する。本発明の２次変異の検出方法は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法であって、前記試料中のＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆ変異を検出する工程を有することを特徴とする。

Description

２次変異検出方法、及び２次変異検出キット
　本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法、及び２次変異検出キットに関する。
　チロシンキナーゼ阻害剤（以下、ＴＫＩともいう）を用いた遺伝子異常を標的とした治療は、肺腺がん（以下、ＬＡＤＣともいう）に非常に効果的である。しかしながら、大部分のがんは、最終的には標的治療に対する抵抗性を獲得し、長期間の臨床的有用性に対して主な制限を提示している。
　標的キナーゼの２次変異は、薬剤に対する抵抗性の主な原因となっている。例えば、ＡＬＫやＲＯＳ１キナーゼにおける薬剤に対する抵抗性を付与する変異は、ＴＫＩの結合を立体的に妨害している。
　その一方で、ＥＧＦＲにおけるＴ７９０Ｍ変異は、ＡＴＰに対する親和性を増加させることにより、抵抗性をもたらしている。以前、本発明者等は、１～２％のＬＡＤＣにおける、ＲＥＴキナーゼ遺伝子のがん化的融合を同定した（例えば、特許文献１参照）。甲状腺髄様がんの治療のために認可されたバンデタニブといったＴＫＩは、臨床的に有用であるため、上述した融合ＲＥＴキナーゼに関する研究は、精力的に行われている。
国際公開第２０１３／０１８８８２号
　ＲＥＴキナーゼ遺伝子融合陽性肺がんでは、ＲＥＴ阻害剤による治療効果が見込まれる。しかしながら、がん細胞が治療抵抗性を獲得すると、その効果の持続期間が短くなるものと懸念される。そのため、どのような分子機構により、抵抗性が発現し、それをいかに把握し、克服するかが治療における重要課題であると考えられる。
　 本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤治療における治療抵抗性の予測又は把握をすることができ、更なる治療選択性を付与することができる、ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法及び２次変異検出キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異としてＳ９０４Ｆを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法であって、前記試料中のＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆ変異を検出する工程を有することを特徴とする２次変異の検出方法。
［２］前記ＲＥＴチロシンキナーゼは、ＲＥＴ融合キナーゼである前記［１］に記載の２次変異の検出方法。
［３］ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異を検出するためのキットであって、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーセット、前記遺伝子の増幅産物又はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、及びＳ９０４Ｆ特異的結合物質からなる群から選ばれる少なくとも一種を含むことを特徴とする２次変異検出キット。
［４］前記ＲＥＴチロシンキナーゼは、ＲＥＴ融合キナーゼである前記［３］に記載の２次変異検出キット。
　本発明によれば、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤治療における治療抵抗性の予測又は把握をすることができ、更なる治療選択性を付与することができる。
患者の胸部におけるＣＴスキャンの結果である。放射線化学療法及び抗癌剤投与のタイミングと、その効果を対応付けた図である。 バンデタニブ治療前のリンパ節、及び進行したリンパ節をヘマトキシリン／イオシン染色した生検標本の組織学的解析の結果である。 バンデタニブ治療前のリンパ節、及び進行したリンパ節から得られたＲＴ－ＰＣＲ産物におけるサンガー法を用いたシークエンス解析の結果である。 バンデタニブ治療前の末梢血、及び進行した末梢血から得られたゲノムＤＮＡ及びＲＴ－ＰＣＲ産物におけるサンガー法を用いたシークエンス解析の結果である。 バンデタニブと複合体を形成した非変異ＲＥＴ及びＳ９０４Ｆ変異ＲＥＴの動的構造のシミュレート結果である。 細胞に導入した非変異ＣＣＤＣ６－ＲＥＴタンパク質全長、又はＳ９０４Ｆ　ＣＣＤＣ６－ＲＥＴタンパク質全長におけるイムノブロット解析の結果である。 精製したＳ９０４Ｆ変異体のＲＥＴキナーゼドメイン、及び精製した非変異ＲＥＴキナーゼドメインを用いた、酵素の動態解析の結果である。 非変異ＲＥＴタンパク質全長、又はＳ９０４Ｆ　ＲＥＴタンパク質全長を安定的に発現するＢａ／Ｆ３細胞のバンデタニブ処置後の生存率の解析結果である。 非変異ＲＥＴとＳ９０４Ｆ変異体におけるバンデタニブとＦ７３５の間の相互作用を演繹した図である。 精製したＳ９０４Ｆ変異体のＲＥＴキナーゼドメイン、及び精製した非変異ＲＥＴキナーゼドメインを用いて、ＡＴＰの濃度を３．１２５～４００ｎＭまで上昇させてｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った結果である。 バンデタニブ、カボサンチニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、アレクチニブにおけるｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ及びＢａ／Ｆ３細胞を用いた薬剤感受性試験の結果である。 非変異ＲＥＴタンパク質とＳ９０４Ｆ変異ＲＥＴタンパク質の酵素学的動態とバンデタニブの阻害定数を算出した結果である。 バンデタニブと複合体を形成したＲＥＴキナーゼのコンフォメーションにおける自由エネルギー（ΔＧ）の算出結果である。 ロングタイムスケール（１μｓ）の分子動態シミュレーションによるバンデタニブと複合体を形成した非変異体とＳ９０４Ｆ変異体の間の構造的差異を示す図である。 バンデタニブと複合体を形成したＲＥＴの７１５～７４５残基と９００～９３５残基における主鎖Ｃα原子のゆらぎの標準偏差（Ｒｏｏｔ－ｍｅａｎ－ｓｑｕａｒｅ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ；ＲＭＳＦ）を示すグラフである。
＜＜２次変異検出キット＞＞
　本発明の２次変異検出キットは、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異を検出するためのキットであって、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーセット、前記遺伝子の増幅産物又はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、及びＳ９０４Ｆ特異的結合物質からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
　ＲＥＴ（Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｄｕｒｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）チロシンキナーゼは、ＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼとも称され、ヒトにおいて１０ｑ１１．２に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。
　本発明に係るＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、特に限定されないが、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号　ＮＴ＿０３３９８５．７で特定されるゲノムの配列のうち１２１７５８２～１２７０８６２番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子が挙げられる。
　本発明に係るＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質は、ヒト由来のものであれば特に限定されないが、上述した遺伝子にコードされるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
　本発明者らは、先の出願において、３０例の肺腺がんの全トランスクリプトームシークエンシングにより、キネシンファミリーメンバー５Ｂ（ＫＩＦ５Ｂ）遺伝子とＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼがん遺伝子（ＲＥＴ遺伝子）とのインフレーム（Ｉｎ－ｆｌａｍｅ）融合転写産物を同定した。この融合遺伝子は第１０染色体ｐ１１、ｑ１１領域間の逆位によって生じるものであった。このＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ遺伝子融合は、日本人肺腺がんの６／３１９（２％）に検出されたが、当該遺伝子融合が検出された６例はいずれもＥＧＦＲ変異、ＫＲＡＳ変異、ＡＬＫ融合といった公知のがん遺伝子活性化変異を示さなかった。さらに、この融合転写産物はアメリカ人由来の肺腺がんにおいても存在していた（１／８０（１％））。これら事実から、当該遺伝子融合は、広い人種において、がん化における責任変異（ドライバー変異）であることが明らかになった（特許文献１参照）。
　また、甲状腺がんにおいては、ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ遺伝子融合が同定されている。
　このような遺伝子融合は、ＲＥＴチロシンキナーゼの恒常的な活性化をもたらすものと考えられ、このような活性化が生じている患者においては、ＲＥＴチロシンキナーゼに対する阻害剤が治療において有効性を示すものと考えられる。
　したがって、本発明の２次変異検出キットにおいて、対象とするＲＥＴチロシンキナーゼは、ＲＥＴ融合キナーゼであることが好ましい。
　本発明において患者とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法を適用する対象となる「がん」としては、ＲＥＴ遺伝子の発現が認められるがんが好ましく、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子又はＣＣＤＣ６遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の発現が認められるがんがより好ましい。
　がんとしては、皮膚がん、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がん、前立腺がん、甲状腺がん、膵がん、卵巣がん、脾臓がん、精巣がん等が挙げられ、肺がん又は甲状腺がんが好ましく、非小細胞肺がんがより好ましく、肺腺がんが特に好ましい。
　上述した患者由来の試料としては、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便等の生体試料；これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）やタンパク質抽出物が挙げられる。また、係る試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　治療に用いられるＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、ＲＥＴチロシンキナーゼに生じる２次変異により、薬剤抵抗性を示されるものであるという観点から、ＲＥＴチロシンキナーゼの機能を直接的に阻害する物質が好ましく、ＡＴＰ拮抗阻害剤であることがより好ましい。
　係る阻害剤としては、４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（一般名：バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）；ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＲＥＴを標的とする化合物）、４－［４－［３－［４－クロロ‐３－（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド］フェノキシ］－Ｎ－メチルピリジン－２－カルボアミド（一般名：ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）；ＢＲＡＦ及びＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ－［２－（ジエチルアミノ）エチル］－５－［（Ｚ）－（５－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－インドール－３－イリデン）メチル］－２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボキシアミド　モノ［（２Ｓ）－２－ヒドロキシサクシネート］（一般名：スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ－（３，３－ジメチルインドリン－６－イル）－２－（ピリジン－４－イルメチルアミノ）ニコチンアミド（一般名：モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、ＸＬ１８４／カボザンチニブ（ＸＬ１８４／Ｃａｂｏｚａｎｔｎｉｂ；ＶＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）が挙げられる。
　実施例において後述するように、本発明者らは、ＴＫＩに抵抗性を示した患者由来の末梢血において、ＲＥＴチロシンキナーゼ遺伝子の２９０２番目のシトシンがチミンに変異していることが明らかとなった。この２次変異は、再発した腫瘍のＲＥＴアレルで生じ、コドン９０４のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ９０４Ｆ）をもたらしていることが確認された。更に、ＲＥＴ－Ｓ９０４Ｆ変異がＴＫＩ抵抗性の原因であることが示唆された。
　したがって、本発明の２次変異検出キットは、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを認識するキットである。具体的には、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーセット、前記遺伝子の増幅産物又はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、及びＳ９０４Ｆ特異的結合物質からなる群から選ばれる少なくとも一種を含むものである。
（プライマーセット）
　本発明のキットは、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーセットを備えていてもよい。
　係るプライマーセットを用いて得られた増幅産物をシークエンスすることにより２次変異の有無を評価することができる。また、係るプライマーセット以外に他のがん遺伝子又はがん抑制遺伝子を増幅するためのプライマーセットを含む、複数のプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲにより複数の遺伝子領域を同時に増幅し、次世代シークエンサーによりＳ９０４Ｆ変異の有無を含む多項目診断を行ってもよい。
　また、ＳＳＣＰ（単鎖高次構造多型）を用いて、係るプライマーセットを用いて得られた増幅産物の電気泳動度の変化を調べることにより変異の有無を評価することもできる。　また、係るプライマーセットにおいて、コドン９０４の２次変異を特異的に認識するプライマーを設けることにより、増幅産物の有無により２次変異の有無を評価することができる。
　係るプライマーセットを用いた遺伝子増幅方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の他に、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が挙げられる。
（プローブ）
　本発明のキットは、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子の増幅産物又はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備えていてもよい。
　プローブは、安定性やハイブリダイゼーション時の特異性等を向上させる等の目的で、種々の化学修飾を有していてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を抑制するために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。
　プローブは固相上に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、板状基板、膜等が挙げられる。
　プローブは、例えば、板状基板の表面に固定されてマイクロアレイを形成していてもよい。この場合、例えば、がん組織試料からＲＮＡを抽出して蛍光物質で標識し、マイクロアレイとハイブリダイゼーションさせてマイクロアレイ上のプローブに結合したＲＮＡを検出することにより、がん組織中にＲＥＴチロシンキナーゼ遺伝子の２次変異を検出することができる。
　また、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーセットと、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子の増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲにより２次変異の有無を定量的に評価してもよい。
（特異的結合物質）
　本発明のキットは、ＲＥＴチロシンキナーゼＳ９０４Ｆ変異タンパク質に対する特異的結合物質を備えていてもよい。
　特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に上記のＳ９０４Ｆ変異タンパク質を抗原として免疫することにより作製することができる。又は、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
　アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。上記のタンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、上記のＳ９０４Ｆ変異タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
　特異的結合物質は、上記のＳ９０４Ｆ変異タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。
　例えば、固定したがん組織の薄切標本を上記の特異的結合物質を用いて免疫染色することにより、上記のＳ９０４Ｆ変異タンパク質の存在を検出することができる。上記のタンパク質の存在の検出は、ウエスタンブロッティング法により行ってもよいし、ＥＬＩＳＡ法により行ってもよいし、フローサイトメトリー解析等により行ってもよい。
　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料において、２次変異としてのＳ９０４Ｆ変異タンパク質の存在は、ＴＫＩに対する治療抵抗性を示唆する。
＜＜２次変異検出方法＞＞
　本発明の２次変異検出方法は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法であって、前記試料中のＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆ変異を検出する工程を有する。
　上記の検出工程は、ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆ変異を検出する工程であれば特に限定されない。例えば、上述した２次変異検出キットを用いて遺伝子レベル又はタンパク質レベルでＳ９０４Ｆ変異を検出することができる。
　２次変異の遺伝子レベルでの検出は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ解析、ノーザンブロッティング、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等により行うことができる。また、２次変異のタンパク質レベルでの検出は、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析等により行うことができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　５７才の日本人女性（以下、患者という）は、気管支鏡検査及び縦隔鏡検査で縦隔リンパ節転移によりＬＡＤＣと診断された。この患者は、シスプラチンとビノレルビンの同時放射線化学療法を受け、部分応答を示した。しかしながら、２年後に多発性骨転移を引き起こしていた。この患者は、ゲフィニチブ、ペメトレキセド、ドセタキセル、ジェムシタビン、及びＳ－１からなる２回目から６回目までの化学療法を受けた。６回目の化学療法の際、右頸部リンパ節症を発症した（図１左、矢印参照）。即ち、いくつかの化学療法を受けた後に、ＬＡＤＣを再発している。
　この患者は、ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いたＣＣＤＣ６－ＲＥＴの検出に基づき、発明者らによる医師主導臨床試験ＬＵＲＥＴ（Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ　ｗｉｔｈ　ＲＥＴ　Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ　Ｓｔｕｄｙ；臨床試験登録番号：ＵＭＩＮ００００１００９５）に登録された。
　毎日３００ｍｇバンデタニブの投与を開始して、３か月後に腫瘍サイズは縮小した（図１真中、矢印参照）ものの、投与開始６か月後に別の頸部リンパ節症を発症し、ＬＡＤＣを再発した（図１右、矢印参照）。
　バンデタニブ治療前のリンパ節、及び進行したリンパ節をヘマトキシリン／イオシン染色した生検標本の組織学的解析から、再発した腫瘍は、バンデタニブ治療前の腫瘍と同様の組織学的特徴を有していた（図２参照）。
　バンデタニブ治療前のリンパ節、及び進行したリンパ節から得られたＲＴ－ＰＣＲ産物におけるサンガー法を用いたシークエンス解析により、両者は、ＣＣＤＣ６のエクソン１がＲＥＴのエクソン１５に連結している融合ＣＣＤＣ６－ＲＥＴの転写産物を有していた（図３参照）。
　更に、バンデタニブ治療前の末梢血、及び進行した末梢血から得られたゲノムＤＮＡ及びＲＴ－ＰＣＲ産物におけるサンガー法を用いたシークエンス解析により、進行した末梢血にのみ、２９０２番目のシトシンがチミンに変異していることが明らかとなった。この変異は、再発した腫瘍のＲＥＴアレルで生じ、コドン９０４のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ９０４Ｆ）をもたらしていることが確認された（図４参照）。
［実施例２］
　バンデタニブと複合体を形成したＲＥＴキナーゼの共結晶を用いた結晶構造解析の結果から、バンデタニブと複合体を形成した非変異ＲＥＴ及びＳ９０４Ｆ変異ＲＥＴの動的構造をシミュレートした。５０ｎｓ×１５回のシミュレーションで観察された平均２ナノ秒の構造を重ね合わせ、Ｆ７３５、Ｓ／Ｆ９０４、及びバンデタニブに注目した（図５参照）。
　構造解析の結果から、ＲＥＴキナーゼドメインにおけるグリシンリッチループ（ＧＲＬ）、特にフェニルアラニン７３５の側鎖が、ＡＴＰ結合能を制御していることが明らかとなった。このＡＴＰ結合能の制御は、ＡＴＰ結合能を有するオープンフォームとＡＴＰ結合不能のクローズドフォームの２つの選択的な立体構造異性体を形成することにより行われることが明らかとなった。そして、バンデタニブと複合体を形成したＲＥＴキナーゼドメインの分子動態シミュレーション結果から、Ｓ９０４Ｆ変異体は、新規の立体構造異性体を形成することが示された（図５及び９参照）。
　次いで、非変異ＣＣＤＣ６－ＲＥＴタンパク質全長、又はＳ９０４Ｆ　ＣＣＤＣ６－ＲＥＴタンパク質全長におけるイムノブロット解析を行った。非変異ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ　ｃＤＮＡをコードする発現ベクター、及びＳ９０４Ｆ　ＣＣＤＣ６－ＲＥＴｃＤＮＡをコードする発現ベクターをそれぞれ内在性のＲＥＴを発現してないＨ１２９９肺がん細胞に導入した。このトランスフェクタントをバンデタニブに暴露した。０、０．１、０．５、１．０、５．０、又は１０μＭのバンデタニブ処理６時間後のチロシン９０５及びチロシン１０１５のリン酸化レベルを決定した（図６参照）。ＣＣＤＣ６－ＲＥＴタンパク質全量に対するリン酸化ＣＣＤＣ６－ＲＥＴタンパク質の割合を底に示す（図６参照）。
　Ｓ９０４Ｆ変異体を強制発現させた培養細胞において、融合ＣＣＤＣ６－ＲＥＴのチロシン９０５の自己リン酸化は、高濃度のバンデタニブを添加しても維持されていた。Ｓ９０４ＦのＩＣ５０は、非変異体のＩＣ５０より遥かに高く、１μＭ以上だった（図６参照）。
　精製したＳ９０４Ｆ変異体のＲＥＴキナーゼドメイン、及び精製した非変異ＲＥＴキナーゼドメインを用いて、５μＭのＡＴＰの存在下で３０分間、３連で酵素の動態解析を行った（図７参照）。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果、Ｓ９０４Ｆ変異体のバンデタニブに対するＩＣ５０は、６０８ｎＭであり、非変異体のＩＣ５０５６ｎＭより１０倍以上高かった（図７参照）。
　次いで、非変異ＲＥＴタンパク質全長、又はＳ９０４Ｆ　ＲＥＴタンパク質全長を安定的に発現するＢａ／Ｆ３細胞のバンデタニブ処置後の生存率を調べた（図８参照）。図８に示されるように、Ｓ９０４Ｆ変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞は、ＷＴを発現するＢａ／Ｆ３細胞よりバンデタニブに対して非感受性を示した。
　図６～８における結果から、ＲＥＴ－Ｓ９０４Ｆ変異がバンデタニブ抵抗性の原因であることが示唆された。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイやＢａ／Ｆ３細胞を用いた薬剤感受性試験において、ＩＣ５０、ＧＩ５０値を測定すると、ＲＥＴ－Ｓ９０４Ｆ変異体は、バンデタニブのみならず、カボサンチニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、アレクチニブにも抵抗性を示した（図１１参照）。
　図５に示されるように、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅと命名された新規立体構造異性体は、ＧＲＬのＦ７３５の側鎖の薬剤結合部位に向けた突出によって特徴づけられている。　次いで、非変異ＲＥＴとＳ９０４Ｆ変異体におけるバンデタニブとＦ７３５の間の相互作用を演繹した（図９参照）。５０ｎｓ×１５のシミュレーションから生じさせたＦ７３５とバンデタニブの平均構造をｔｈｉｃｋ　ｓｔｉｃｋとコリー－ポーリング－コルタンの空間充填モデルで表した（図９参照）。１５の軌道において観察された全ての構造を用いたところ、Ｆ７３５における炭素原子ζと７バンデタニブにおけるメチル基の炭素原子間の原子間距離は、オープン／クローズド立体構造異性体における非変異体、オープン／クローズド立体構造異性体におけるＳ９０４Ｆ変異体、及びＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ立体構造異性体におけるＳ９０４Ｆ変異体、それぞれにおいて、１４．８±３．８Å、１３．９±４．０Å、５．１±０．９Åであった。
　次いで、精製したＳ９０４Ｆ変異体のＲＥＴキナーゼドメイン、及び精製した非変異ＲＥＴキナーゼドメインを用いて、ＡＴＰの濃度を３．１２５～４００ｎＭまで上昇させてｉｎ　ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った（図１０参照）。得られたデータをミカエリス－メンテンの方程式にあてはめ、Ｋｍ［ＡＴＰ］を算出した。非変異ＲＥＴキナーゼドメインのＫｍ［ＡＴＰ］は、３８．１１μＭであり、Ｓ９０４Ｆ変異体のＲＥＴキナーゼドメインのＫｍ［ＡＴＰ］は、２７．２５μＭであった。
　更に、非変異ＲＥＴタンパク質とＳ９０４Ｆ変異ＲＥＴタンパク質の酵素学的動態とバンデタニブの阻害定数を算出した（図１２参照）。精製したＳ９０４Ｆ変異キナーゼドメインは、非変異体よりも、ＡＴＰに対してより低い解離定数（Ｋｍ［ＡＴＰ］）とより高い触媒定数（Ｋｃａｔ）を有していた。Ｓ９０４Ｆ変異体におけるＡＴＰ親和性の増加は、バンデタニブを含む多数のＡＴＰ拮抗阻害剤に対する抵抗性と一致している（図１１参照。）。
［実施例３］
　図１３に、バンデタニブと複合体を形成したＲＥＴキナーゼのコンフォメーションにおける自由エネルギー（ΔＧ）を示す。算出された自由結合エネルギー（ΔＧ）から、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ立体構造異性体（図１３中、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）におけるＲＥＴキナーゼドメインに対するバンデタニブの親和性は、オープン／クローズド立体構造異性体における親和性より顕著に低いことが示唆された。このことは、バンデタニブに対するＳ９０４Ｆの阻害定数（Ｋｉ）が非変異体のＫｉより高いことと一致している（図１２参照）。
［実施例４］
　図１４に、ロングタイムスケール（１μｓ）の分子動態シミュレーションによるバンデタニブと複合体を形成した非変異体とＳ９０４Ｆ変異体の間の構造的差異を示す。Ｅ７３４、Ｆ７３５、Ｒ７７０、Ｄ７７１、Ｓ／Ｆ９０４、ｐＹ９０５、Ｋ９０７、Ｒ９１２、及びバンデタニブの平均構造を１μｓ×３回のシミュレーションにより創出し、ｔｈｉｃｋ ｓｔｉｃｋで表した。９０４残基におけるセリンからフェニルアラニンへの置換は、Ｒ９１２を含むアクチベーションループの柔軟性を減少させた。このＳ９０４Ｆ変異体の動力学的特徴は、Ｅ７３４－Ｒ９１２間の水素結合の形成をもたらした。このように、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ立体構造異性体は、バンデタニブと相互作用するＳ９０４Ｆ変異によって引き起こされたアロステリックな構造変化によって生み出されたことが示された。Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ立体構造異性体は、この異常な水素結合ネットワークにより安定化されている。
　特に、このシミュレーションによれば、Ｅ７３４、Ｄ７７１、及びＲ９１２からなる水素結合のネットワーク構造は、オープン／クローズド立体構造異性体の形成に重要であり、ＷＴ（非変異体）とＳ９０４Ｆ変異体の間で異なっていることが示された。
［実施例５］
　図１５に、バンデタニブと複合体を形成したＲＥＴの７１５～７４５残基と９００～９３５残基における主鎖Ｃα原子のゆらぎの標準偏差（Ｒｏｏｔ－ｍｅａｎ－ｓｑｕａｒｅ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ；ＲＭＳＦ）を示す。ＲＭＳＦ値は、１μｓ×３の分子動力学的軌道を用いて計算した。Ｓ９０４Ｆ変異は、アクチベーションループ（位置は矢で示す）における９１０～９１５残基における柔軟性を減少させたことに加えて、グリシンリッチループ（ＧＲＬ）における７３３～７３５残基における柔軟性を減少させた。図１４に示されるように、Ｓ９０４Ｆ変異体の異常な分子動態の特徴から、Ｅ７３４に隣接するＦ７３５の側鎖が突出することにより、水素結合ネットワークが変形し、薬剤に対する親和性が減少している。また、バンデタニブとの共結晶構造を鋳型にして行ったシミュレーション実験では、Ｓ９０４Ｆ変異体において、グリシンリッチループや活性型ループ上に相互作用を示す変化が認められ、変異に伴ってキナーゼの安定性に変化が生じていることが示された（図示せず）。一方、ＡＴＰとの組み合わせでは変異による変化は認められなかった（図示せず）。
　本発明において、ＲＥＴ　ＴＫＩを処置された患者に生じたがんにおけるＲＥＴの２次変異が初めて見いだされた。Ｓ９０４Ｆ変異は、薬剤耐性に関連する新規の変異である。この変異は、新たな立体構造異性体を生み出し、係る立体構造異性体は、多くのアロステリック効果を仲介し、バンデタニブの結合を不安定化させ、ＡＴＰに対する親和性を増加させている。特に、新規の立体構造異性体は、変異ＲＥＴタンパク質がバンデタニブと相互作用しているときのみ生じたものと考えられる。
　よって、構造変化が薬剤不存在下でも生じている他の薬剤耐性キナーゼと異なり、本発明で見いだされたＲＥＴ変異は、薬剤と相互作用したときにのみ、構造変化をもたらし、薬剤耐性に導くものと考えられる。
　肺がんにおいて、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ遺伝子の治療抵抗性変異を検出し、陽性例に抵抗性を克服する薬剤を投与するという、検査を含めた臨床試験が進行している。このような個別化治療法は、今後多くの分子標的治療において広く行われるものと考えられる。
　本発明において見出した２次変異は、複数のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤への治療抵抗性に関わることが推察される。また、甲状腺がんの治療においても、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤が使われることを考慮すると、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いたがん個別化治療において、同様の産業上の展開が見込まれる。ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤は、国内外の製薬企業で精力的に開発が進められており、既にＦＤＡ承認薬が複数存在する。今後、治療抵抗性を克服できる薬剤が見出される可能性が高いことから、本発明は、産業上の利用価値が極めて高いものと考えられる。

Claims (4)

  1. 　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異の検出方法であって、
    　前記試料中のＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆ変異を検出する工程を有することを特徴とする２次変異の検出方法。
  2. 　前記ＲＥＴチロシンキナーゼは、ＲＥＴ融合キナーゼである請求項１に記載の２次変異の検出方法。
  3. 　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けた患者由来の試料における前記ＲＥＴチロシンキナーゼの２次変異を検出するためのキットであって、
    　ＲＥＴチロシンキナーゼのＳ９０４Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーセット、前記遺伝子の増幅産物又はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、及びＳ９０４Ｆ特異的結合物質からなる群から選ばれる少なくとも一種を含むことを特徴とする２次変異検出キット。
  4. 　前記ＲＥＴチロシンキナーゼは、ＲＥＴ融合キナーゼである請求項３に記載の２次変異検出キット。
PCT/JP2017/009501 2016-03-11 2017-03-09 ２次変異検出方法、及び２次変異検出キット Ceased WO2017155044A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-048319 2016-03-11
JP2016048319 2016-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017155044A1 true WO2017155044A1 (ja) 2017-09-14

Family

ID=59789630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/009501 Ceased WO2017155044A1 (ja) 2016-03-11 2017-03-09 ２次変異検出方法、及び２次変異検出キット

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017155044A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388680A (zh) * 2020-03-14 2021-09-14 复旦大学附属妇产科医院 上皮性卵巢癌靶点ret及其在诊断和治疗中的作用
WO2023234222A1 (ja) * 2022-06-01 2023-12-07 国立研究開発法人国立がん研究センター Ｒｅｔキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CASELLA, FRANCE SCA ET AL.: "Clinical impact of RET genetic screening of in the management of medullary thyroid carcinoma (MTC) patients: 20 years of experience", EUROPEAN THYROID JOURNAL, vol. 3, no. Suppl 1, 2014, pages 81, ISSN: 2235-0640 *
COSCI, B ET AL.: "In silico and in vitro analysis of rare germline allelic variants of RET oncogene associated with medullary thyroid cancer", ENDOCRINE-RELATED CANCER, vol. 18, 2011, pages 603 - 612, XP055421765, ISSN: 1351-0088 *
ELISEI, R ET AL.: "Not all new RET mutations show transforming activity when analyzed by in silico and in vitro assays", EUROPEAN THYROID JOURNAL, 2011, pages 98, ISSN: 2235-0640 *
ELISEI, ROSSELLA ET AL.: "Not all new RET mutations show transforming activity when analyzed by in silico and in vitro assays", ENDOCRINE SOCIETY, 2011, pages l-718, XP055421730, ISSN: 0163-769X *
GEORGE PRIYA DOSS, C. ET AL.: "In silico profiling and structural insights of missense mutations in RET protein kinase domain by molecular dynamics and docking approach", MOL. BIOSYST., vol. 10, 2014, pages 421 - 436, XP055421725, ISSN: 1742-2051 *
KNOWLES, PHILLIP P. ET AL.: "Structure and Chemical Inhibition of the RET Tyrosine Kinase Domain", J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 44, 2006, pages 33577 - 33587, XP055421767, ISSN: 1083-351X *
MOTONOBU SAITO ET AL.: "Haigan ni Okeru Driver Idenshi no Saishin Chiken", ANNUAL REVIEW KOKYUKI, 30 January 2016 (2016-01-30), pages 50 - 56 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388680A (zh) * 2020-03-14 2021-09-14 复旦大学附属妇产科医院 上皮性卵巢癌靶点ret及其在诊断和治疗中的作用
CN113388680B (zh) * 2020-03-14 2023-07-04 复旦大学附属妇产科医院 上皮性卵巢癌靶点ret及其在诊断和治疗中的作用
WO2023234222A1 (ja) * 2022-06-01 2023-12-07 国立研究開発法人国立がん研究センター Ｒｅｔキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7855659B2 (ja) 循環腫瘍ｄｎａの個別化された検出を用いる癌検出およびモニタリングの方法
Wheeler et al. Molecular features of cancers exhibiting exceptional responses to treatment
JP7256840B2 (ja) ネオモルフィックｓｆ３ｂ１変異体に関連するスプライスバリアント
Nowak et al. Detection of mismatch repair deficiency and microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma by targeted next-generation sequencing
Collins et al. Towards precision medicine in the clinic: from biomarker discovery to novel therapeutics
Uzilov et al. Development and clinical application of an integrative genomic approach to personalized cancer therapy
Crowley et al. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood
JP7189401B2 (ja) インサイチュ増幅により無細胞核酸分子を調製する方法
Li et al. Large-Scale screening and molecular characterization of EML4-ALK fusion variants in archival non–small-cell lung cancer tumor specimens using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assays
Spindler et al. The importance of KRAS mutations and EGF61A> G polymorphism to the effect of cetuximab and irinotecan in metastatic colorectal cancer
JP6254630B2 (ja) Ｒａｆ及びｍｅｋ阻害剤に対する耐性を与えるｍｅｋ１変異
US20140134158A1 (en) Kras mutations and resistance to anti-egfr treatment
JP2017516463A (ja) Ｆｇｆｒ融合体
Gang et al. Strategy to targeting the immune resistance and novel therapy in colorectal cancer
Gallant et al. Established, emerging and elusive molecular targets in the treatment of lung cancer
WO2016054627A1 (en) Biomarkers of bruton tyrosine kinase inhibitor resistance
Yang et al. Programmable One-Pot enzymatic reaction for direct fluorescence detection of Ultralow-Abundance mutations in the DNA duplex
Isaacson et al. Urothelial carcinoma with an NRF1-BRAF rearrangement and response to targeted therapy
JP7128270B2 (ja) 免疫療法に対する悪性疾患の応答性を決定するための方法
JP6858563B2 (ja) Ｂｒａｆ変異検出によるｅｇｆｒ阻害剤の効果予測
CN107148481A (zh) 用于确定患有braf‑阳性癌症的患者为braf抑制剂非响应者且为mapk/erk抑制剂响应者的工具和方法
Li et al. Molecular profiling reveals the malignant potential in solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas
US20220145403A1 (en) Method of classifying a sample based on determination of fgfr
Pezzuto et al. What information could the main actors of liquid biopsy provide?—A representative case of non-small cell lung cancer (NSCLC)
US10100366B2 (en) Methods of detecting cancers sensitive to cabozantinib

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17763384

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17763384

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP