WO2017122368A1 - 酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法 - Google Patents

酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法 Download PDF

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史樹 谷口
敦弘 東島
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting the growth of an organism that performs oxygen-generating photosynthesis.
  • An organism that performs oxygen-generating photosynthesis excluding moss, fern, and seed plants is called an algae, and it has a microscopic size (micron unit).
  • Algae are called microalgae, and about 100,000 species live in diverse environments. In recent years, microalgae have a high ability to fix carbon dioxide by photosynthesis, a high ability to produce useful substances (eg, lipids) as raw materials for foods, pharmaceuticals, and biofuels, and can be harvested throughout the year. For these reasons, it is attracting attention as a biomass resource.
  • the production amount of useful substances by microalgae is proportional to the product of the content of useful substances contained in each microalgae and the number of individuals of microalgae.
  • the growth rate of microalgae is slow under natural conditions and the production efficiency of useful substances is low.
  • increasing the efficiency of mass culture of microalgae that is, improving the economic efficiency of the culture process has become a major issue.
  • Reijiro Nogami, Minato Wakisaka “Promotion of Spirulina Growth by Addition of Alginate Oligomer”, 17th Annual Meeting of the Marine Biotechnology Society, May 30, 2015, p. 109 Reijiro Nogami, Minato Wakisaka, “Promoting Euglena Growth by Addition of Alginate Oligomers”, Abstracts of the 16th Annual Meeting of the Marine Biotechnology Society, May 31, 2014, p. 61 Reijiro Nogami, Minato Wakisaka, CHE MAAIL Che Mohd Hakiman “Promoting Botryococcus Growth by Addition of Alginate Oligomers”, Proceedings of Annual Conference of Ecological Engineering Society 2014, p. 83-84
  • the growth rate of microalgae needs to be improved at least 2 to 3 times the current growth rate.
  • the methods described in 1 to 3 have not yet improved the growth of microalgae. For this reason, when culture conditions that can maintain a high growth rate of microalgae and can be stably cultured have been found, an inexpensive and safe effect that further promotes the growth rate of microalgae (impact on the environment is affected). There is a need for new chemical substances that are easy to use.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for promoting the growth of a living body that performs oxygen-generating photosynthesis that can be achieved by an inexpensive, safe and simple technique.
  • chlorophyll chlorophyll responsible for oxygen-generating photosynthesis has a tetrapyrrole ring structure in which four five-membered ring structures (pyrrole ring structures) of the molecular formula C 4 H 5 N are bonded with one carbon atom in between. Since it is a compound having one chlorin ring, it is hypothesized that if microalgae are cultured in a medium containing a pyrrole compound as a raw material for chlorophyll chlorophyll, photosynthesis is promoted to promote microalgae growth.
  • a pyrrole compound containing a tetrapyrrole compound obtained by bioproduction by Escherichia coli described in WO2009 / 069806 to a microalgae culture medium
  • the promotion of microalgae growth is inexpensive.
  • the inventors have found that this can be achieved by a safe and simple technique and have completed the present invention. That is, in the method for promoting the growth of a living organism that performs oxygen-generating photosynthesis according to the present invention, a culture promoter containing a pyrrole compound is added to a medium in which a living organism that performs oxygen-generating photosynthesis grows, and the medium is propagated. This is done by maintaining the conditions.
  • the pyrrole compound contained in the culture promoter is safe because it is part of the structure of the chlorolin ring of chlorophyll chlorophyll. In other words, since it is a substance that exists in nature, there is no impact on the environment. Then, the culture promoter is simply added to the culture medium of the organism that performs oxygen-generating photosynthesis, and the culture medium to which the culture promoter is added is kept under the growth conditions of the organism that performs oxygen-generated photosynthesis. Growth of organisms that perform developmental photosynthesis can be performed. As a result, it is possible to carry out mass growth of organisms that perform oxygen-generating photosynthesis by an inexpensive, safe and simple method.
  • the method for promoting the growth of an organism that performs oxygen-generating photosynthesis includes, for example, a pyrrole compound obtained by bioproduction using Escherichia coli in which the gene ypjD (b2611) cannot be expressed due to a mutation. It adds to the culture medium which micro algae which is an example of the organism which performs photosynthesis grows, and a culture medium is hold
  • the culture promoter can be produced at a low cost.
  • the microalgae (an example of algae) cultured by the method of the present invention preferably perform oxygen-generating photosynthesis and contain chlorophyll as a main photosynthesis pigment.
  • prokaryotic cyanobacteria and eukaryotics examples include gray plants, green plants, crypto algae, unequal hairy plants, hapto algae, dinoflagellates, euglena algae, chloralcion algae, chromella algae and the like.
  • the growth conditions for microalgae may be general growth conditions that have been conventionally recommended for each microalgae (conditions that allow stable growth while maintaining a high growth rate).
  • E. coli is cultured in an oligotrophic medium.
  • Escherichia coli is precultured in an appropriate medium other than the oligotrophic medium, for example, a medium such as LB medium (after culturing at a temperature of 15 to 40 ° C. for 6 to 24 hours), and the obtained preculture is obtained. It is preferable to inoculate an oligotrophic medium and perform main culture (culture at a temperature of 20 ° C. to 40 ° C. for 12 hours to 96 hours).
  • the culture conditions for E. coli may be general conditions for E. coli.
  • a poor nutrient medium e.g., deionized water in 1 liter
  • An aqueous solution in which 3.6 g of glucose and 100 mg of MgSO 4 are dissolved can be used.
  • pyrrole compounds (cultured products) such as tetrapyrrole compounds and tetrapyrrole compound precursors are discharged out of the cells from the E. coli, and the discharged pyrrole compounds are mixed in the poor nutrient medium. For this reason, the oligotrophic medium after the cultivation of E. coli is centrifuged to precipitate the suspension (aggregates of E. coli cells), and the resulting supernatant is filtered through a filter (pore size 0.22 ⁇ m). A culture promoter containing a pyrrole compound from which E. coli has been removed can be obtained.
  • concentration of the pyrrole compound in a culture promotion agent can be adjusted to arbitrary values by adjusting the moisture content in a culture promotion agent.
  • the content of the pyrrole compound in the medium (more specifically, the content of the nitrogen compound containing the pyrrole compound) in the medium when the culture promoter is added to the medium (for example, adjusted to 16 to 560 mg / liter). ) Can be done easily.
  • Euglena (NIES-48 strain) was cultured. For cultivation, add Euglena with a constant weight to 10 ml of medium injected into a 30 ml screw cap test tube, leave the screw cap test tube in an incubator, and adjust the temperature to 22 to 26 ° C. while ventilating air. The test was carried out for 35 days under a light / dark cycle condition in which the illuminance was 6000 to 6500 Lux using a white fluorescent lamp, and the lighting time and extinguishing time of the white fluorescent lamp were 12 hours each. The screw cap test tube was shaken every other day.
  • Medium is A1 (10 ml of AF-6 medium), A2 (mixture of 9 ml of AF-6 medium and 1 ml of culture accelerator), A3 (mixture of 5 ml of AF-6 medium and 5 ml of culture accelerator), And A4 (10 ml of culture accelerator).
  • the composition per liter of AF-6 medium is 140 mg NaNO 3 , 22 mg NH 4 NO 3 , 30 mg MgSO 4 .7H 2 O, 10 mg KH 2 PO 4 , 5 mg K 2 HPO 4 , CaCl 2 2H 2 O 10 mg, Fe-citrate 2 mg, Citric acid 2 mg, Biotin 2 ⁇ g, Thiamine HCl 2 ⁇ g, Vitamin B 6 10 ⁇ g, Vitamin B 12 1 ⁇ g, Na 2 EDTA ⁇ 2H 2 O 5 mg, FeCl 6 0.98 mg 6H 2 O, 180 ⁇ g MnCl 2 .4H 2 O, 52 ⁇ g ZnCl 2 , 20 ⁇ g CoCl 2 .6H 2 O, 12.5 ⁇ g Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 1 liter Distilled Water is there.
  • the content of the nitrogen compound including the pyrrole compound in the culture promoter is 560 mg / liter, which includes pyrrole compound having a porphyr
  • FIG. 1 shows the dry weight of Euglena contained in each 5 ml cell suspension collected from A1 to A4.
  • FIG. 1 shows that there is an optimum value for the dilution rate of the culture promoter contained in the medium that increases the growth rate of Euglena (content of nitrogen compound including pyrrole compound). It is not preferable to add an excessive amount of the nitrogen compound containing, which leads to an increase in the cost of the culture promoter.
  • Botryococcus (NIES-2199 strain) was cultured. For cultivation, a certain weight of Botryococcus was added to 10 ml of medium injected into a 30 ml screw cap test tube, the screw cap test tube was allowed to stand in an incubator chamber, and the temperature was adjusted to 22 to 26 while ventilating air. The test was carried out for 65 days under the conditions of a light and dark cycle using a white fluorescent lamp at a temperature of 6000 to 6500 Lux with a white fluorescent lamp lighting time and a lighting off time of 12 hours each. The screw cap test tube was shaken every other day.
  • B1 (BG11 medium is 10 ml), B3 (5 ml of BG11 medium and 5 ml culture accelerator), and B4 (10 ml culture accelerator).
  • the composition per liter of BG11 medium is 1500 mg NaNO 3 , 40 mg KH 2 PO 4 .3H 2 O, 75 mg MgSO 4 .7H 2 O, 36 mg CaCl 2 .2H 2 O, and 6 mg Ferric ammonium citrate.
  • the content of the nitrogen compound including the pyrrole compound in the culture promoter is 560 mg / liter, which includes pyrrole compound having a porphyrin ring structure of 16 mg / liter.
  • FIG. 2 shows the dry weight of Botryococcus contained in 5 ml of cell suspension collected from B1, B3, and B4.
  • FIG. 2 shows that the mediums B3 and B4 to which the culture promoter is added have a large growth rate compared to the growth rate in the case of growing on B1 (BG11 medium only). It was 23 times in the medium (B3) diluted twice, and 5 times in the medium (B4) containing only the culture accelerator.
  • FIG. 2 also shows that there is an optimum value for the dilution ratio of the culture promoter that increases the growth rate of Botryococcus (content of nitrogen compound including pyrrole compound). Adding an excessive amount of the compound is not preferable because it leads to an increase in the cost of the culture promoter.
  • Spirulina (NIES-39 strain) was cultured. For cultivation, add a certain weight of spirulina to 10 ml of medium injected into a 30 ml screw cap test tube, leave the screw cap test tube in an incubator, and adjust the temperature to 22 to 26 ° C. while ventilating air. Using a white fluorescent lamp, the illuminance was 6000 to 6500 Lux, and the white fluorescent lamp was turned on and off for 12 hours. The screw cap test tube was shaken every other day.
  • Medium is S1 (10 ml of SOT medium), S2 (mixture of 9 ml of SOT medium and 1 ml of culture promoter), S3 (mixture of 5 ml of SOT medium and 5 ml of culture promoter), and S4 (culture promoter) 10 milliliters).
  • the composition per liter of the SOT medium is NaHCO 3 16800 mg, K 2 HPO 3 500 mg, NaNO 3 2500 mg, K 2 SO 4 1000 mg, NaCl 1000 mg, MgSO 4 .7H 2 O 200 mg, CaCl 2 2H 2 O 40 mg, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 10 mg, Na 2 EDTA ⁇ 2H 2 O 80 mg, H 3 BO 3 2.86 mg, MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 2.5 mg, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O is 0.22 mg, CuSO 4 .5H 2 O is 80 ⁇ g, Na 2 MoO 4 .2H 2 O is 20 ⁇ g, and Distilled Water is 1 liter.
  • the content of the nitrogen compound including the pyrrole compound in the culture promoter is 560 mg / liter, which includes pyrrole compound having a porphyrin ring structure of 16 mg / liter.
  • FIG. 3 shows the dry weight of Spirulina contained in each 5 ml cell suspension collected from S1 to S4.
  • the culture accelerator containing a pyrrole compound was prepared using an extract from an E. coli medium (Method A), but was prepared by adjusting the amount of water using a medium from which E. coli had been removed. (Method B).
  • the method B can simplify the treatment and can be cultured at low cost, but the method A increases the content of the pyrrole compound.
  • microalgae have been described as examples of organisms that perform oxygen-generating photosynthesis. However, any organism that can be cultured in a medium and that performs oxygen-generating photosynthesis (algae that can survive in water are more preferable). It can be applied to the present invention.
  • the pyrrole compound contained in the culture promoter added to the medium is part of the chlorolin ring structure of chlorophyll chlorophyll and exists in nature. Because it is a substance, there is no impact on the environment. And the organism which performs oxygen generation type photosynthesis can be propagated by a simple method. As a result, it is possible to perform mass growth of organisms that perform oxygen-generating photosynthesis at a low cost and in a safe and simple manner without adversely affecting the natural world.

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Abstract

ピロール化合物を含む培養促進剤を、酸素発生型光合成を行う生物が生育する培地に添加し、培地を生物の増殖条件に保持する。ここで、ピロール化合物はテトラピロール化合物を含むことが好ましく、酸素発生型光合成を行う生物として藻類を用いることができる。これによって、安価、安全かつ簡便な手法により達成することが可能な酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法を提供する。

Description

酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法
本発明は、酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法に関する。
酸素発生型光合成を行う生物から、コケ植物、シダ植物、及び種子植物を除いたもの（従って、水中に存在する酸素発生型光合成を行う生物）を藻類といい、その中で顕微鏡サイズ（ミクロン単位の大きさ）の藻類は微細藻類と呼ばれ、約１０万種が多様な環境中に生息している。近年、微細藻類は、光合成による二酸化炭素固定能力が高いこと、食品、医薬品、更にバイオ燃料等の原料となる有用物質（例えば、脂質）の生産能力が高いこと、通年での収穫が可能であること等の理由から、バイオマス資源として注目されている。
ここで、微細藻類による有用物質の生産量は、個々の微細藻類に含まれる有用物質の含有量と微細藻類の個体数との積に比例する。しかしながら、自然条件下では微細藻類の増殖速度は遅く、有用物質の生産効率も低いという問題がある。このため、微細藻類による有用物質生産の実用化（商業ベースで利用）に向けては、微細藻類による有用物質の生産効率向上と微細藻類の増殖速度向上（大量培養）を人工的に図る必要があり、特に微細藻類の大量培養の効率化（即ち、培養工程の経済性改善）が大きな課題となっている。
微細藻類の大量培養による有用物質生産の実用化に向けては、微細藻類のスクリーニングや微細藻類の遺伝子組換え等の様々な取り組みが国内外において報告されている。しかしながら、スクリーニングにより増殖速度の大きな微細藻類の有望種を選抜するには長い時間と多くの費用を要するという問題がある。一方、遺伝子組換え株を屋外で培養する場合は種々の制約が伴うと共に、遺伝子組換え株が培養地外に飛散した際の環境に及ぼす影響には不明な点が多いという問題がある。
そこで、有用物質の生産効率が高いと期待されている微細藻類を用いて、その培地に増殖を促進する化学物質を添加して微細藻類を大量培養して、有用物質生産の実用化を図ることが提案されている（例えば、非特許文献１～３参照）。
野上礼次郎、脇坂港、「アルギン酸オリゴマーの添加によるスピルリナの増殖促進」、第１７回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集、２０１５年５月３０日、ｐ．１０９ 野上礼次郎、脇坂港、「アルギン酸オリゴマーの添加によるユーグレナの増殖促進」、第１６回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集、２０１４年５月３１日、ｐ．６１ 野上礼次郎、脇坂港、CHE　MAAIL　Che　Mohd　Hakiman「アルギン酸オリゴマーの添加によるボトリオコッカスの増殖促進」、２０１４年生態工学会年次大会発表論文集、ｐ．８３－８４
微細藻類の大量培養により有用物質生産の実用化を図るには、微細藻類の増殖率を、現状の増殖率に対して少なくとも２～３倍に向上させる必要があるとされており、非特許文献１～３に記載された方法では、微細藻類の増殖を更に向上させるには至っていない。このため、微細藻類の増殖速度を高位に維持し安定して培養できる培養条件が見出された際に、微細藻類の増殖速度を更に促進する作用を示す安価で安全（環境に及ぶす影響がなく）、かつ使用方法が簡便となる新たな化学物質が求められている。
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安価、安全かつ簡便な手法により達成することが可能な酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、酸素発生型光合成を担う葉緑素クロロフィルは、分子式Ｃ４Ｈ５Ｎの五員環構造（ピロール環構造）４個が炭素原子を１個ずつ挟んで結合したテトラピロール環構造の一つであるクロリン環を有する化合物であるため、葉緑素クロロフィルの原料となるピロール化合物を含む培地で微細藻類を培養すれば、光合成が促進されることによって微細藻類の増殖も促進されるとの仮設に基づき種々研究を重ねた結果、ＷＯ２００９／０６９８０６号公報に記載の大腸菌によるバイオ生産で得られたテトラピロール化合物を含むピロール化合物を微細藻類の培地に加えることにより、微細藻類の増殖の促進を安価、安全かつ簡便な手法により達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法は、ピロール化合物を含む培養促進剤を、酸素発生型光合成を行う生物が生育する培地に添加し、該培地を前記生物の増殖条件に保持することにより行っている。
本発明に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法においては、培養促進剤に含まれるピロール化合物は、葉緑素クロロフィルのクロリン環の構造の一部であるため安全である。即ち、自然界に存在している物質であるため、環境に与える影響はない。
そして、培養促進剤を酸素発生型光合成を行う生物の培地に添加し、培養促進剤が添加された培地を酸素発生型光合成を行う生物の増殖条件下に保持するだけなので、簡便な手法により酸素発生型光合成を行う生物の増殖を行うことができる。その結果、酸素発生型光合成を行う生物の大量増殖を、安価、安全かつ簡便な方法で行うことが可能になる。
実験例１におけるユーグレナの培養結果の説明図である。 実験例２におけるボトリオコッカスの培養結果の説明図である。 実験例３におけるスピルリナの培養結果の説明図である。
本発明の一実施例に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法は、例えば、遺伝子ｙｐｊＤ（ｂ２６１１）が変異により発現できなくなった大腸菌によるバイオ生産で得られたピロール化合物を、酸素発生型光合成を行う生物の一例である微細藻類が生育する培地に添加し、培地を微細藻類の増殖条件に保持する。
なお、大腸菌によるバイオ生産ではピロール化合物が安価かつ大量に得られるので、培養促進剤を安価に製造することが可能になる。
本発明の方法で培養される微細藻類（藻類の一例）は、酸素発生型光合成を行い、主要な光合成色素としてクロロフィルを含有するものが好ましく、例えば、原核生物であるラン藻類、真核生物のスーパーグループにおける灰色植物、緑色植物、クリプト藻類、不等毛植物、ハプト藻類、渦鞭毛藻類、ユーグレナ藻類、クロララクニオン藻類、クロメラ藻類等が挙げられる。
また、微細藻類の増殖条件とは、微細藻類毎に従来から推奨されている一般的な増殖条件（増殖速度を高位に維持し安定して培養できる条件）であればよい。
大腸菌は貧栄養培地中で培養する。このとき、大腸菌を貧栄養培地以外の適当な培地、例えば、ＬＢ培地等の培地中で前培養し（１５～４０℃の温度で６～２４時間培養した後）、得られた前培養物を貧栄養培地に接種して本培養（２０℃～４０℃の温度で１２時間～９６時間かけて培養）することが好ましい。大腸菌の培養条件は、大腸菌に対する一般的な条件であればよい。
なお、貧栄養培地として、例えば、脱イオン水１リットル中に、ＫＨ２ＰＯ４を９ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４を２１ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を２ｇ、クエン酸二水和物を１ｇ、グルコースを３．６ｇ、及びＭｇＳＯ４を１００ｍｇ溶解させた水溶液を使用することができる。
大腸菌の培養中に、大腸菌からはテトラピロール化合物、テトラピロール化合物前駆体等のピロール化合物（培養物）が菌体外に排出され、排出されたピロール化合物は貧栄養培地中に混入する。このため、大腸菌の培養が終了した貧栄養培地を遠心分離機にかけて懸濁物（大腸菌細胞の凝集体）を沈殿させ、得られた上澄液をフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）で濾過することにより、大腸菌が除去された状態のピロール化合物を含む培養促進剤を得ることができる。
なお、培養促進剤中の水分量を調整することにより、培養促進剤中のピロール化合物の濃度を任意の値に調整することができる。これにより、培地に培養促進剤を添加した際における培地中のピロール化合物の含有量（より詳細には、ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）の調整（例えば、１６～５６０ミリグラム／リットルに調整）が容易にできる。
実験例
以下に、微細藻類として、ユーグレナ、ボトリオコッカス、スピルリナを用いた実験例について説明する。
（実験例１）
ユーグレナ（ＮＩＥＳ－４８株）の培養を行った。培養は、３０ミリリットルのスクリューキャップ試験管内に注入した１０ミリリットルの培地に一定重量のユーグレナを加え、スクリューキャップ試験管をインキュベーター庫内に静置し、空気を通気しながら温度を２２～２６℃、白色蛍光灯を用いて照度を６０００～６５００Ｌｕｘ、白色蛍光灯の点灯時間と消灯時間をそれぞれ１２時間とする明暗サイクルの条件下で、３５日間行った。なお、スクリューキャップ試験管は、１日おきに振盪させた。
培地は、Ａ１（ＡＦ－６培地が１０ミリリットル）、Ａ２（ＡＦ－６培地９ミリリットルと培養促進剤１ミリリットルの混合物）、Ａ３（ＡＦ－６培地５ミリリットルと培養促進剤５ミリリットルの混合物）、及びＡ４（培養促進剤１０ミリリットル）の４種類である。なお、ＡＦ－６培地１リットル当たりの組成は、ＮａＮＯ３が１４０ｍｇ、ＮＨ４ＮＯ３が２２ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが３０ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４が１０ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ４が５ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが１０ｍｇ、Fe－citrateが２ｍｇ、Citric　acidが２ｍｇ、Biotinが２μｇ、Thiamine　ＨＣｌが２μｇ、VitaminＢ６が１０μｇ、VitaminＢ１２が１μｇ、Ｎａ２EDTA・２Ｈ２Ｏが５ｍｇ、ＦｅＣｌ６・６Ｈ２Ｏが０．９８ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１８０μｇ、ＺｎＣｌ２が５２μｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏが２０μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが１２．５μｇ、Distilled　Waterが１リットルである。また、培養促進剤中のピロール化合物を含む窒素化合物の含有量は５６０ｍｇ／リットルであり、その中にはポルフィリン環構造を持つピロール化合物１６ｍｇ／リットルも含まれる。
培養が終了したＡ１～Ａ４からそれぞれ５ミリリットルの細胞懸濁液をスウィネスフィルターホルダーに挿入したφ２５のＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、濾過後にＧＦ／Ｃフィルターから取り出した使用済み濾紙をシャーレ内に入れて、１０５℃の乾燥庫で５時間乾燥させた。乾燥後、使用済み濾紙を収容したシャーレをデシケータ内に移して冷却し、冷却後に使用済み濾紙を収容したシャーレの重量を測定した。そして、使用済み濾紙を収容したシャーレの重量から、予め求めておいた濾紙乾燥重量とシャーレ乾燥重量を差し引くことにより、５ミリリットルの細胞懸濁液中に存在していたユーグレナの乾燥重量を算出した。図１に、Ａ１～Ａ４より採取した５ミリリットルの細胞懸濁液中にそれぞれ含まれていたユーグレナの乾燥重量を示す。
図１に示すように、Ａ１（ＡＦ－６培地のみ）で増殖させる場合の増殖速度に対して、培養促進剤を添加したすべての培地Ａ２～Ａ４では大きな増殖速度を示すことが確認でき、培養促進剤を１０倍希釈した培地（Ａ２）では２倍、培養促進剤を２倍希釈した培地（Ａ３）では７．７倍、培養促進剤のみの培地（Ａ４）では６．７倍となった。
また、図１は、ユーグレナの増殖速度を増大させる培地中に含まれる培養促進剤の希釈率（ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）には最適値が存在することを示しており、ピロール化合物を含む窒素化合物を過剰に添加することは、培養促進剤のコスト増加につながり好ましくない。
（実験例２）
ボトリオコッカス（ＮＩＥＳ－２１９９株）の培養を行った。培養は、３０ミリリットルのスクリューキャップ試験管内に注入した１０ミリリットルの培地に一定重量のボトリオコッカスを加え、スクリューキャップ試験管をインキュベーター庫内に静置し、空気を通気しながら温度を２２～２６℃、白色蛍光灯を用いて照度を６０００～６５００Ｌｕｘ、白色蛍光灯の点灯時間と消灯時間をそれぞれ１２時間とする明暗サイクルの条件下で、６５日間行った。なお、スクリューキャップ試験管は、１日おきに振盪させた。
培地は、Ｂ１（ＢＧ１１培地が１０ミリリットル）、Ｂ３（ＢＧ１１培５ミリリットルと培養促進剤５ミリリットルの混合物）、及びＢ４（培養促進剤１０ミリリットル）の３種類である。なお、ＢＧ１１培地１リットル当たりの組成は、ＮａＮＯ３が１５００ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４・３Ｈ２Ｏが４０ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが７５ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが３６ｍｇ、Ferric　ammonium　citrateが６ｍｇ、Citric　acidが６ｍｇ、Ｎａ２EDTA－Ｍｇが１ｍｇ、Ｎａ２ＣＯ３が２０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３が２．８６ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１．８１ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏが０．２２２ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが０．３９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏが７９μｇ、Ｃｏ(ＮＯ３)２・６Ｈ２Ｏが４９μｇ、Distilled　Waterが１リットルである。また、培養促進剤中のピロール化合物を含む窒素化合物の含有量は５６０ｍｇ／リットルであり、その中にはポルフィリン環構造を持つピロール化合物１６ｍｇ／リットルも含まれる。
培養が終了したＢ１、Ｂ３、Ｂ４からそれぞれ５ミリリットルの細胞懸濁液をスウィネスフィルターホルダーに挿入したφ２５のＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、実験例１と同様の方法で、５ミリリットルの細胞懸濁液中に存在していたボトリオコッカスの乾燥重量を算出した。図２に、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４より採取した５ミリリットルの細胞懸濁液中にそれぞれ含まれていたボトリオコッカスの乾燥重量を示す。
図２に示すように、Ｂ１（ＢＧ１１培地のみ）で増殖させる場合の増殖速度に対して、培養促進剤を添加した培地Ｂ３、Ｂ４では大きな増殖速度を示すことが確認でき、培養促進剤を２倍希釈した培地（Ｂ３）では２３倍、培養促進剤のみの培地（Ｂ４）では５倍となった。
また、図２は、ボトリオコッカスの増殖速度を増大させる培養促進剤の希釈率（ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）には最適値が存在することを示しており、ピロール化合物を含む窒素化合物を過剰に添加することは、培養促進剤のコスト増加につながり好ましくない。
（実験例３）
スピルリナ（ＮＩＥＳ－３９株）の培養を行った。培養は、３０ミリリットルのスクリューキャップ試験管内に注入した１０ミリリットルの培地に一定重量のスピルリナを加え、スクリューキャップ試験管をインキュベーター庫内に静置し、空気を通気しながら温度を２２～２６℃、白色蛍光灯を用いて照度を６０００～６５００Ｌｕｘ、白色蛍光灯の点灯時間と消灯時間をそれぞれ１２時間とする明暗サイクルの条件下で行った。なお、スクリューキャップ試験管は、１日おきに振盪させた。
培地は、Ｓ１（ＳＯＴ培地が１０ミリリットル）、Ｓ２（ＳＯＴ培地９ミリリットルと培養促進剤１ミリリットルの混合物）、Ｓ３（ＳＯＴ培地５ミリリットルと培養促進剤５ミリリットルの混合物）、及びＳ４（培養促進剤１０ミリリットル）の４種類である。なお、ＳＯＴ培地１リットル当たりの組成は、ＮａＨＣＯ３が１６８００ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ３が５００ｍｇ、ＮａＮＯ３が２５００ｍｇ、Ｋ２ＳＯ４が１０００ｍｇ、ＮａＣｌが１０００ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが２００ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが４０ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏが１０ｍｇ、Ｎａ２EDTA・２Ｈ２Ｏが８０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３が２．８６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏが２．５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏが０．２２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏが８０μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが２０μｇ、Distilled　Waterが１リットルである。また、培養促進剤中のピロール化合物を含む窒素化合物の含有量は５６０ｍｇ／リットルであり、その中にはポルフィリン環構造を持つピロール化合物１６ｍｇ／リットルも含まれる。
培養を開始してから１４日経過したＳ１～Ｓ４からそれぞれ５ミリリットルの細胞懸濁液をスウィネスフィルターホルダーに挿入したφ２５のＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、実験例１と同様の方法で、５ミリリットルの細胞懸濁液中に存在していたスピルリナの乾燥重量を算出した。図３に、Ｓ１～Ｓ４より採取した５ミリリットルの細胞懸濁液中にそれぞれ含まれていたスピルリナの乾燥重量を示す。
図３に示すように、Ｓ１（ＳＯＴ培地のみ）で増殖させる場合の増殖速度に対して、
培養促進剤を１０倍希釈した培地（Ｓ２）では１．０４倍、培養促進剤を２倍希釈した培地（Ｓ３）では１．７倍となったが、培養促進剤のみの培地（Ｓ４）では増殖が見られず、個体数の減少が生じた。
このことから、ピロール化合物を培地に加えてスピルリナの増殖速度を増大させる場合、培養促進剤の希釈率（ピロール化合物を含む窒素化合物の含有量）の最適値はかなり狭い範囲に存在することが分かった。
以上、本発明を、実施例を参照して説明してきたが、本発明は何ら上記した実施例に記載した構成に限定されるものではなく、請求の範囲に記載されている事項の範囲内で考えられるその他の実施例や変形例も含むものである。
例えば、本実施例では、ピロール化合物を含む培養促進剤は、大腸菌の培地からの抽出物を用いて作製した（Ａ法）が、大腸菌を除去した培地を用い、水分量を調整することにより作製する（Ｂ法）こともできる。Ｂ法は処理の簡略化が可能で安価に培養できるが、Ａ法はピロール化合物の含有率が高くなる。
なお、本発明において、酸素発生型光合成を行う生物として微細藻類を例に挙げて説明したが、培地で培養でき酸素発生型光合成を行う生物（水中で生存可能な藻類がより好ましい）であれば、本発明に適用できる。
本発明に係る酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、培地に添加する培養促進剤に含まれるピロール化合物は、葉緑素クロロフィルのクロリン環の構造の一部であり、自然界に存在している物質であるため、環境に与える影響はない。
そして、簡便な手法により酸素発生型光合成を行う生物の増殖を行うことができる。その結果、酸素発生型光合成を行う生物の大量増殖を、安価、かつ自然界に悪影響を与えることなく、安全かつ簡便な方法で行うことが可能になる。

Claims (4)

  1. ピロール化合物を含む培養促進剤を、酸素発生型光合成を行う生物が生育する培地に添加し、該培地を前記生物の増殖条件に保持することを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
  2. 請求項１記載の酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、前記ピロール化合物はテトラピロール化合物を含むことを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
  3. 請求項１又は２記載の酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、前記生物は藻類であることを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
  4. 請求項３記載の酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法において、前記培地に含まれる前記ピロール化合物を含む窒素化合物の濃度を１６～５６０ミリグラム／リットルに調整することを特徴とする酸素発生型光合成を行う生物の増殖促進方法。
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